Instrucciones  para  hacer  las  graficas  y  estadísticas  de  los  datos  de  RT-­‐PCR  en  el  programa  “Graph  Pad  Prism”    con  un  diseño  de  2  variables  independientes    

1. Abrir  el  “Excel  Spreadsheet”  que  tiene  los  datos  con  el  calculo  de    “Fold  Change”.                                            

2. Abrir  el  programa  Prism  y  seleccionar  los  siguientes  parametros:    a. En    “New  Table  &  Graph”  escoge  “Grouped”      b. En  “Enter/import  data:”  escoge  la  2da  opción  y  entra  el  numero  de  replicas  biológicas  del  

grupo  con  mayor  cantidad  de  muestras;    c. En  “Use  sample  data”  ,  no  escoger  nada.  d. Terminar  esta  parte  seleccionando  “Create”  

                                       

     

3. En  el  “Spreedsheet”  ,  nombra  las  filas  y  columnas  separando  cada  variable  independiente  de  la  siguiente  manera:      

a. En  las  filas  1  y  2  escribe  “Control”  y  “Pum  RNAi”  respectivamente.    b. En  la  1ra  columna  (Group  A)  escribe  “No  Deprivación  de  sueno”.  c. En  la    2da  columna  (Group  B)  escribe  “Deprivación  de  sueno”.  

                               

4. Ve  al  programa  Excel  y  copia    los  valores  de  “Fold  change”  del  grupo  control.                                                        

5. Vuelve  al  programa  GraphPad  Prism,  pon  el  cursor  en  primera  celda  de  la  izquierda  (A:Y1)  y  selecciona  “Paste  Transpose”  bajo  “Edit”  para  pegar  los  datos  en  la  fila  1  “  Control”,  y  la  columna  1  “No  Deprivación  de  sueno”  .    

                               

6. Repite  el  paso  #  5  hasta  que  tengas  los  4  grupos  en  sus  respectivas  filas  y  columnas.                      

7. Para  hacer  análisis  estadístico  utilizando  “Two-­‐Way  ANOVA”  comienza  presionando  el  botón  de  “Analyze”.  Una  vez  lo  presiones,  saldrá  una  ventana,  y  por  la  forma  en  que  están  arreglados  los  datos,  la  opción  de  Two-­‐Way  ANOVA  ya  estará  seleccionada  

                                     

8. Presiona  “OK”  y  en  la  ventana  que  sale  selecciona  los  siguientes  parámetros:  a. En  “Experimental  design”,  escoge  la  opción  #1.  b. En  “Factor  names”  escribe  el  nombre  de  tus  variables  independientes  según  el  arreglo  de  

tus  datos:  Columnas=Deprivación  de  sueno,  Filas  (rows)=  Pum  RNAi  c. Sigue  al  próximo  paso  antes  de  darle  a  “OK”  

                                         

9. Selecciona  el  Tab  de  “Multiple  comparisons"  y  escoge  la  3ra  opción.  Todavía  no  presiones  “OK”.                                                  

10. Presiona  el  tab  de    “Options”  y  escoge  los  siguientes  parámetros  (ver  imagen):                                        

11. Al  presionar  “OK’,  3  reportes  sobre  las  estadísticas  de  sus  datos  serán  generados:    1)  Tabular  results;  2)Multiple  comparisons  and  ;  3)  Narrative  results.        

                                                           

12. Ahora,  bajo  el  tab  de  “Graphs”  presiona  “Data  1”  para  ver  la  grafica  de  tus  datos.  En  la  ventana  que  se  abrirá,  selecciona  el  tipo  de  grafica  deseado  (barra,  línea,  etc),  asegúrate  que  “Mean  with  SEM”  este  seleccionado    y  presiona  “OK”.      

                                     

13.  En  la  grafica,  póngale  nombre  a  los  ejes,  titulo  con  el  nombre  del  gen  asignado,  escoja  los  colores  que  desee  y  todos  los  detalles  estéticos  que  prefieran.  Este  programa  provee  gran  flexibilidad  de  cambiar  las  graficas  a  su  estilo.  Toque  botones  y  explore  que  puede  hacer  para  cambiar  lo  que  quiera.  El  siguiente  es  un  ejemplo  básico:  

 

             

14. Estadística  sobre  el  efecto  de  la  deprivación  de  sueno  en  la  exprecion  del  gen  asignado:    a. Primero  valla  al  Post  hoc  analysis  o  “Multiple  comparsisons”  para  ver  el  efecto  de  

deprivación  de  sueño  en  cada  grupo.  En  este  ejemplo  la  deprivación  no  afecto  significativamente  la  expresión  del  gen  de  interés  en  el  control,  ni  en  las  mocas  con  Pum  RNAi.    

                                   

b. Añada  “brackets”  encima  de  las  barras  comparando  el  efecto  de  la  deprivación  de  sueño  y  póngale  “ns”  encima  al  bracket  si  no  es  significativo,  y  asterisco  *  si  la  diferencia  es  significativa.  Los  círculos  rojos  señalan  las  teclas  necesarias  para  añadir  el  bracket  y  el  texto.  En  este  ejemplo  hay  “ns”  en  cada  comparación  ya  que  no  hubo  significancia.    

                                               

15. Estadística  sobre  la  interacción  entre  el    efecto  de  la  deprivación  de  sueño  y  el  Pum  RNAi  en  la  expresión  del  gen  asignado:    

a. Valla  a  los  “Tabular  results”  y  verifique  el  p-­‐value  de  la  interaccion  para  ver  si  la  combinación  de  deprivación  de  sueno  y  el  Pum  RNAi  tiene  efectos  diferentes  de  cada  factor  por  individual.  En  este  ejemplo,  la  interacción  tampoco  es  significativa.    

                                           

b. Añada  un  “bracket”  encima  de  las  barras  tal  como  en  la  imagen  a  continuación  y  y  póngale  “ns”  encima  al  bracket  si  no  hay  significancia,  y  asterisco  *  si  hay  significancia.    Esta  es  la  grafica  que  utilizara  en  su  presentación.    

                                         

16. Lea  los  “Narrative  results”  generados  durante  el  análisis  estadístico  para  que  pueda  entender  mejor  la  estadística  y  la  interpretación  del  Two-­‐Way  ANOVA.