INSULIN REKOMBINAN

SEKOLAH TINGGI FARMASI INDONESIA

Disusun Oleh :

LINDA ARIANTI LESTARI (A01020066)

RHENCISKA RUTH (A01020079)

RIZA WERNAWATI (A01020068)

ARLIJA TULUS J. (A01020044)

ANDRI

BIOTEKNOLOGI

2013

PENGERTIAN

Insulin adalah suatu hormon polipetida yang diproduksi dalam sel-sel β kelenjar Langerhaens pankreas. Insulin berperan penting dalam regulasi kadar gula darah (kadar gula darah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit seperti diabetes mellitus tergantung insulin (diabetes tipe 1).

FUNGSI INSULIN

Dapat menstimulasi trasport glukosa (juga asam amino, ion K, dan nutrient lain) ke dalam sel

Dapat menstimulasi jalur biosintesis intraseluler (anabolic pathway) seperti sintesis glikogen

Menghambat jalur katabolisme (pemecahan molekul besar menjadi molekul yang lebih kecil) seperti proses glikogenolisis yaitu pemecahan glikogen menjadi glukosa yang berakibat kadar glukosa darah naik

Menstimulasi sintesis DNA dan protein

JALUR METABOLISME INSULINInsulin akan memacu berbagai macam ekspresi gen melalui pengaktifan berbagai macam gen, sintesis DNA dan produksi protein. Secara umum insulin dapat mengontrol jalur metabolisme melalui : Menginduksi deposporilasi beberapa enzim

regulator yang berperan dalam jalur anabolisme maupun katabolisme

Menginduksi regulasi level transkripsi dari beberapa gen yang mengkode enzim metabolic

MOLEKUL INSULIN

Insulin terdiri dari 51 asam amino. Molekul insulin disusun oleh 2 rantai polipeptida A dan B yang dihubungkan dengan ikatan disulfida. Rantai A terdiri dari 21 asam amino dan rantai B terdiri dari 30 asam amino

SITE-SITE PADA INSULIN

Ada site-site pada insulin yang rentan terhadap degradasi oleh suatu enzim seperti carboxypeptidase A, leucin aminopeptidase, trypsin, dan Glu C. Glu C adalah suatu enzim mikrobial yang diproduksi oleh bakteri Staphylococcus. Glu C memotong insulin pada 4 tempat. Site tempat pengenalan enzim tripsin yaitu pada asam amino glisin dan arginin

PERBEDAAN SUSUNAN ASAM AMINO PADA INSULIN

Insulin bervariasi dari satu organisme ke organisme lainnya, namun hal ini tidak membedakan aktivitasnya. Misal, insulin pada manusia, babi, dan sapi mempunyai perbedaan dalam susunan asam aminonya, tapi aktivitasnya tetap sama

Tabel 1 Perbedaan susunan asam amino pada insulin manusia, babi (pork), dan sapi (beef)

Spesies

A8 A10 B28 B29 B30

Manusia

Thr Ile Pro Lys Thr

Babi Thr Ile Pro Lys AlaSapi Ala Val Pro Lys Ala

PERBEDAAN SUSUNAN ASAM AMINO PADA INSULIN

Insulin manusia dan insulin babi hanya beda 1 asam amino yaitu pada B30, sedangkan insulin manusia dan insulin sapi beda 3 asam amino yaitu pada A8, A10, dan B30 sehingga pemakaian insulin babi kurang imunogenik dibandingkan insulin sapi. Tapi masalahnya, 1 babi yang diekstraksi insulinnya hanya cukup untuk 1 orang selama 3 hari padahal saat ini ada ± 60 juta orang di dunia yang menderita diabetes tergantung insulin dan diduga meningkat 5-6 % per tahunnya. Maka dari itu sekarang banyak dikembangkan teknologi rekombinan untuk mendapatkan insulin.

TEKNOLOGI DNA REKOMBINANTeknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

KEUNTUNGAN METODE REKOMBINAN

Dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya.

Teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.

Reliability Of Supply (Keandalan Pasokan/Persediaan)

Eliminsi risiko kehadiran patogen dari hewan Cost effective (Efektif Biaya)

PERANGKAT TEKNOLOGI DNAPerangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: Enzim Restriksi digunakan untuk memotong DNA Enzim DNA Ligase digunakan untuk menyambung DNA Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau

mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis

dan untuk menyisipkan penanda. Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen

DNA yang telah diklonkan. Enzim Traskripsi Balik digunakan untuk membuat DNA

berdasarkan RNA. Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen

DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar.

PENDEKATAN DNA REKOMBINANBerdasarkan mekanisme bakteri, perangkat bakteri, dan beberapa teknik diatas, DNA rekombinan dapat dibuat paling tidak melalui tiga pendekatan, yaitu: Mengestraksi DNA total suatu organisme,

memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, memilih fragmen yang dikendaki, mengklonkan fragmen yang telah terpilih,

Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, mengklonkan semua fragmen DNA pada vektor yang sesuai, menguji setiap klon untuk mendapatkan gen yang diinginkan,

Sintesis gen atau fragmen DNA yang diinginkan secara langsung dan mengklonkan gen atau fragmen DNA hasil sintesis.

TAHAPAN DNA REKOMBINAN

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah Isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon Pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen

dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk

menghasilkan molekul DNA rekombinan, Transformasi sel inang menggunakan molekul DNA

rekombinan Reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang Analisis DNA rekombinan

PRODUKSI INSULIN DENGAN TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Ada 2 cara produksi insulin dengan teknologi DNA rekombinan. Proses pembuatan insulin menggunakan β-

galaktosidase Proses pembuatan insulin menggunakan

proinsulin

INSULIN MENGGUNAKAN β-Galaktosidase

Pembuatan insulin menggunakan bantuan β-galaktosidase membuat rantai A dan B secara terpisah. Ingat, terpisah dulu baru nanti digabungkan. Awalnya, gen yang menyandi baik rantai A dan rantai B digabung dengan gen β-galaktosidase. β-galaktosidase ini digunakan sebagai promotor, dengan hanya IPTG (suatu analog laktosa) maka gen β-galaktosidase akan tersintesis. Gen rantai A maupun rantai B yang berada didekatnya, tentu juga akan tersintesis. Ini adalah cara bagaimana gen rantai A tersintesis menjadi protein A.

Bila gen β-galaktosidase bertemu dengan inducer yaitu IPTG, maka gen ini akan tersintesis. Metionin dan rantai A maupun B yang berada didekatnya akan ikut tersintesis, proses selanjutnya, sama seperti menggunakan laktose operon (Ingat, fungsi lac sama dengan β-galaktosidase).

INSULIN MENGGUNAKAN β-Galaktosidase

Pada tahap terakhir, rantai A dan B akan digabungkan menggunakan proses oksidasi. Proses oksidasi Rantai A dan B dioksidasi, bila tidak terbentuk protein yang diinginkan maka direduksi kembali. Proses oksidasi-reduksi ini memakan waktu dan tidak efisien. Maka supaya benar-benar dihasilkan insulin dengan cara yang mudah, dilakukan teknik rekombinan yang kedua.

INSULIN MENGGUNAKAN PROINSULIN

Seperti kita ketahui bahwa proinsulin akan langsung diubah menjadi insulin oleh enzim proteoltik (menguntungkan dan efektif) dengan cara : mRNA proinsulin diubah menjadi cDNA proinsulin

menggunakan enzim reverse transcriptase. Diperlukan juga sintesis kodon untuk menyandi protein.

Kemudian cDNA dan kodon metionin di ligase bersama plasmid. Sebelumnya, di depan cDNA proinsulin ada gen β-galaktosidase.

Di dalam gen E. Coli ini akan tersintesis menjadi protein yaitu peptida A, C (suatu fragmen internal) dan B (ingat peptida A, C, dan B adalah proinsulin, tanpa rantai C disebut insulin).

CNBr akan memeotong met dan memisahkan antara β-galaktosidase dan proinsulin

Proinsulin diubah secra enzimatik oleh enzim proteolitik menjadi insulin.

INSULIN MENGGUNAKAN PROINSULIN

Terima Kasih….