Interchapeter B : 핵산 생물공학 기술 (part A)

Recombinant DNA techniques

- 전기영동 - 제한효소 - 클로닝 - 대장균을 이용한 단백질 대량생산

DNA 분리기술 : Agarose Gel Electrophoresis (수평형)

_

+

DNA is negatively

charged from the

phosphate backbone

Visualize DNA with ethidium

bromide – fluoresces orange

ONLY when bound to DNA

Agarose mesh

•DNA : •e/m 대략 일정 -분자량 작은 것이 빨리 이동 (분자 체: sieve)

EtBr stained DNA

한천 : 해초에서 얻어지는 고분자물질의 다당체. 0.6 ∼ 0.8%에서는 반고체로, 1.0%이상에서는 단단하게 존재. Agarose : 한천은 주로 전기적으로 중성인 agarose와 이온성인 agaropectin으로 구성되어 있다. 이 한천 중에서 agarose만 추출된 것. DNA 전기영동 젤의 재료.

1 2 3 4 1

10 kb

10 kb

1 2 3 4 1

Eco R1

3 kb 7 kb

2

Eco R1

3 kb 7 kb

10 kb

1 2 3 4 1

2

PstI

4 kb 6 kb

4 kb 6 kb

PstI

3

Eco R1

3 kb 7 kb

10 kb

1 2 3 4 1

2

PstI

4 kb 6 kb

4 kb 6 kb

PstI

3

6 kb

PstI Eco R1

3 kb 1 kb

4

DNA electrophoresis: PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis : 수직형

큰 DNA (수천 b(bp) 이상 ) : agarose gel 작은 DNA (수백 이하도 가능) : PAGE

제한 효소 (Restriction Enzymes)

1) Phage virus 와 bacteria의 상호작용에서 발견.

2) Bacteria는 DNA의 특정순서 (restriction site)를 절단할 수 있는

restriction enzyme을 생산.

3) 숙주세포 (bacteria)는 자신의 DNA를 methylation 시켜

(절단이 될 수 없게 하고, 침입한 virus (phage)의 DNA는 절단하여 퇴치 시킴.

(*바이러스의 DNA는 메틸화 되어있지 않다.)

4) 효소인식자리는 일반적으로 palindromic (회문) 구조이다.

외부 물질 (viral DNA) 절단->바이러스 퇴치 자기 DNA ( bacteria DNA) 보호

박테리오 파아지(virus)의 E. coli 공략

플라크(plaque) 형성 : 하얀 점 박테리아가 죽은 곳(virus에 의해)

바이러스 운반체에 의한 인간 DNA 단편의 cloning

인간 DNA는 Virus DNA에 삽입되어 cloning 된다.

Eco RI Restriction Enzyme

• First restriction enzyme from Escherichia coli, so Eco R1

Single stranded “nick”

Single Stranded Nicks in DNA

Hydrolysis of

this ester bond

H2O

P

O

O OH

O-

OH

Phosphodiester 결합 절단

Restriction Enzyme Recognition Sites

Restriction sites are general palindromic (회문구조):

“Able was I, ere, I saw Elba”

Bam H1 site: 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’

Restriction Enzyme Recognition Sites

BglII 5’ A-G-A-T-C-T

T-C-T-A-G-A 5’

Sau3A 5’ G-A-T-C

C-T-A-G 5’

BamHI 5’ G-G-A-T-C-C

C-C-T-A-G-G 5’

Frequency of cutting of recognition enzymes

Sau 3A (GATC) cuts (¼ )(¼ )(¼ )(¼ ) = once every 256 base pairs

(assuming G/C = A/T, which is often does not)

BamH1 (GGATCC) cuts (¼ )(¼ )(¼ )(¼ )(¼ )(¼ ) = once every ~4Kb

HindII (GTPyPuAC) cuts (¼ )(¼ )(½ )(½ )(¼ )(¼ ) = once every ~1Kb

5’ overhang (EcoRI) 5’-GAATTC-3’ 5’-G-OH PO

4-AATTC-3’

3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAA-PO4 HO-G-5’

“Sticky” ends (접착말단)

5’ overhang (SmaI) 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC-OH PO

4-GGG-3’

3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG-PO4 HO-CCC-5’

“Blunt” ends (평활말단 : 직선 cut)

3’ overhang (PstI) 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA-OH PO

4-G-3’

3’-GACGTC-5’ 3’-G-PO4 HO-ACGTC-5’

+

+

+

EcoRI

5’-------G A-A-T-T-C--------3’

3’-------C-T-T-A-A G--------5’

RsaI Rhodopseuomonas sphaeroides

5’-------G-T A-C--------3’

3’-------C-A T-G--------5’

Human DNA cleaved with EcoRI Corn DNA cleaved with EcoRI

5’-C-G-G-T-A-C-T-A-G-OH 3’-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-PO

4

PO4-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’

HO-G-T-C-G-A-T-G-C-5’

Ligation of compatible sticky ends

+

5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A-G A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’ 3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A G-T-C-G-A-T-G-C-5’

Complementary base pairing

+ DNA Ligase, + ATP

recombinant DNA molecule

5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’ 3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-T-C-G-A-T-G-C-5’

플라스미드 (Plasmid) vectors

• 세균 유전자와는 상관없이 복제되는 원형 DNA.

외부 DNA 전달에 사용.

• high copy ( > 100 per cell); low copy (1-25 per cell).

• 특징:

- Origin of replication (Ori)

- Antibiotic resistance (marker)—항생제 저항성)

- Multiple cloning site (LacZ reporter 포함하기도 함)

LacZ 유전자 : 색깔선택

재조합 DNA와 클로닝 (cloning)

클론 (clone) : 생물체, 세포, 바이러스, 또는 DNA 분자에 있어서 유전적으로 동일한 집단. 클로닝(cloning) : 클론을 얻는 행위

박테리아

Plasmid 박테리아 게놈

Ampr

origin of replication

(Ori)

LacZ

reporter

multiple cloning site

pUC18 (~3 kb)

Can insert DNA fragments up to ~ 20kb in plasmids

Plasmids

http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_18.php

lacZ gene이 발현하게 되면

β-galactosidase를 생산하여

X-gal이 포함된 배지에서는

X-gal을 분해하여 파란색

colony를 형성.

Cloning into a Bacterial Plasmid Vector

Plasmid를 사용한 Bacterial Transformation

E. Coli cell

Amp (-)

chromosome

Permeablize membrane

with Ca2+ and heat shock

Ampr

E. Coli cell

Ampr + plasmid

Select for growth in the presence of ampicillin

특정 Plasmid DNA의 E. coli에 의한 증폭

환상 DNA의 종류 (plasmid DNA) -폐환상 DNA (ccDNA) : 절단 부위가 없다. →말단 부위가 없으므로 분자 내의 변화에 의해 비틀린 구조를 갖는다. - 개환상 DNA (ocDNA) : 2본의 분자 사슬 중의 어느 한쪽에 절단 부위를 갖는다.

특정 Plasmid DNA 형태의 정제

특정 Plasmid DNA 형태의 정제 CsCl내에서 EtBr의 존재 하에 DNA를 원심 분리 EtBr의 역할 -ds DNA의 염기쌍과 염기쌍의 틈새에 끼어 들어가는 성질이 있다. -ds DNA에 들어가는 EtBr양은 DNA의 형태에 따라 다르다. *폐환상 DNA는 적고 개환상과 직쇄상 DNA는 많다. 말단을 갖는 ds DNA 에는 EtBr이 염기쌍의 겹쳐있는 틈새로 들어 가기 때문. 분리 원리 -EtBr와 결합하면 DNA 밀도는 낮아진다. -플라스미드 DNA는 크기가 작고 폐환상(그리고 일부는 개환상+직선상)으로 되어 있어 떠 있고, 염색체 DNA는 크므로 바닥에 침전됨 (버림).

cDNA Affinity tag T7 promoter

Expression of genes in E. coli

Induce expression with IPTG

TAA ATG

NH4

Purify fusion protein

via affinity tag

• Common affinty tags are be 6X-His & GST – both protein will bind reversibly

with high affinty and specificty to a particular chromatography resin

Needs to be in frame

His- & GST- affinity tags

재조합 인슐린의 생산 ( A + B chain): 성숙한 형태로 결합된 인슐린을 얻는 것이 목표. A와 B 사슬을 따로 만들어 합침. -베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 암호하는 대장균 유전자에 각자 삽입. - 단백질 발현 . - 정제 +혼합. 활성 인슐린 생산

대장균을 이용한 단백질 대량생산 인슐린

제10장 : 핵산 생물공학 기술 : Part B

-형질전환 생물체 : transgenic mouse -DNA 라이브러리 (library) *외부 DNA 삽입여부 검사 (amp/ b-gal) * cDNA & genomic library *library에서 원하는 클론 찾기 -PCR (중합효소 연속반응: polymerase chain reaction) -유전자 지도작성 (genetic map) *서던 흡착 (southern blotting) *chromosome walking (염색체 걷기) *제한효소단편 다형현상 (RFPL) (restriction fragement-length polymorphism) -DNA sequencing (핵산의 염기서열 결정)

DNA/RNA의 정제

알카리 처리 –RNA 제거

Plasmid prep. : Kit

형질전환 생물체 : transgenic mouse

Microinjection vs particle bombardment

DNA Libraries

…collections of cloned DNA fragments,

– genomic,

– cDNA (coding sequences).

Genomic vs cDNA library

hemoglobin 단백질의 유전자를 찾고자 하면…

• isolate red blood cells,

– red blood cells make lots of hemoglobin, thus the mRNA is enriched for hemoglobin sequences,

• construct a cDNA library,

• isolation of hemoglobin clones is facilitated,

– genomic: ~1 of 1,000,000 clones,

– cDNA from red blood cells: 1 of 3 clones.

cDNA Libraries

…provide a ‘snap-shot’ of the genes expressed in

a particular cell, at a particular time, or under

specific condition, (특정단백질이 많으면

mRNA도 많다!) …however, do not provide

regulatory sequences!!!.

…DNA synthesized from an mRNA template

with the enzyme reverse transcriptase.

cDNA Construction in vitro

cDNA

DNA 라이브러리 (library) : cDNA & genomic

*외부 DNA 삽입여부 검사 (amp/ b-gal) * cDNA library

cDNA library (특정 조직 등)

Construction of cDNA

Construction of a Genomic l Library (전체)

Construction of a Genomic l Library & library에서 원하는 클론 찾기

library에서 원하는 클론 찾기 (2)

Plaque purification

Primary plaque lifts

Probe = partial cDNA for

TAF60 from Arabidopsis

50,000 plaques/plate

l gt10

library에서 원하는 클론 찾기 (계속…)

library에서 원하는 클론 찾기 (계속…)

Kary B. Mullis

USA

La Jolla, CA, USA

1944

The Nobel Prize in Chemistry 1993 "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR)

method"

1993 - Kary B. Mullis

프라이머 (Primer)?

DNA가 합성될 때 3′-OH를 제공하여

폴리뉴클레오티드 사슬이 신장하는 출발점으로

작용하는 올리고뉴클레오티드 사슬

Polymerase chain reaction (PCR)

1. DNA의 증폭에 사용.

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

95oC, 1 min

5’ 3’

3’ 5’

5’ 5’ 프라이머

접합

냉각: 2 min

DNA pol 1.5 min

DNA 사슬연장

5’

3’

5’ 5’

2. 제한효소인식 자리나

돌연변이를 도입하는 경우에도 사용.

5’ 3’

3’ 5’

5’

5’

프라이머에

제한효소 인식자리 부착 BamH1

cycle 1

Polymerase chain reaction (PCR)

cycle 2

Polymerase chain reaction (PCR)

2. 제한효소인식 자리나

돌연변이를 도입하는 경우에도 사용. (계속…)

Polymerase chain reaction (PCR)은 DNA의 특정부위 유전자를 증폭하기 위하여 사용되는 기술이다. 이 기술은 질병 유발 바이러스나 박테리아, 사망한 사람 혹은 범죄자의 유전자 감식 및 유전자 순서 결정등에 사용될 수 있다. PCR을 사용하기 위해서는 관심대상 DNA의 양끝 DNA

순서를 알아야 하나, 그 사이 (중간) DNA 배열은 몰라도 사용이 가능하다. PCR을 시작하기 위해서는 미량의 DNA 만 필요하며 보통 20 cycle로 증폭이 된 경우, 2~3 시간내에 최초 DNA의 약 백만배 (220)로 복제된다. PCR에 사용될 수 있는 미량의 DNA의 예로서, 사람의

타액 약 0.1 microliter (ul)에도 PCR의 개시에 충분한 구강세포들 (구강세포들 안에는 DNA 가 있다)이 있어 특정인의 유전자 감식에 사용될 수 있다. 공룡시대인 약 8천만년전에 형성 호박(amber)에 같힌 공룡흡혈 모기피의 DNA 소량에서도 공룡의 유전자를 증폭시키려고 노력을 하고 있고, 약 4만년전에 멸종한 맘모스의 유전자의 증폭, 그리고 고대 미이라에서 축출된 DNA에서 고대인 유전자의 확인 등등은 PCR의 출현으로서 가능하게 된 일들이다.

PCR

PCR (중합효소 연속반응: polymerase chain reaction)

염색체의 지도작성

유전자 지도 (위치)

물리적 지도 (제한효소 site)

유전+물리 지도

southern

인간 염색체의 모식도 : 질병관련 유전자를 보여줌.

유전자 지도작성 (genetic map) :

서던 흡착 (southern blotting)

특정 DNA 조각을 탐지하는 기술

Southern Blot

Melting and Renaturation of DNA

Renaturation driven by homologous base pairing

Will also hybridize with a radiolabeled 5’-ACGGCTA-3’ “probe”.

Western blot is similar in

concept to northern, except

use polyacrylamide and run

out proteins

단백질 탐색

염색체 걷기 (chromosome walking)에 의한 유전자 지도 작성

1. A primer that matches the beginning of the DNA to sequence is used to synthesize a short DNA strand adjacent to the unknown sequence, starting with the primer.

2. The new short DNA strand is sequenced.

3. The end of the sequenced strand is used as a primer for the next part of the long DNA sequence.

제한효소단편 다형현상 (RFLP)

(restriction fragment-length polymorphism)

RFLP(restriction fragment

length polymorphism)는

1980년 데이비드

보스테인(David

Bostein)과 그의

동료들이

제한효소(restriction

endonuclease)로

가계지도를 작성하던 중

처음 발견되었다.

그들은 DNA 상의 특정

부위에 점

돌연변이(point

mutation)가 생겨

제한효소로 절단하였을

때 나타나는 절편들의

길이가 개인마다

다양하게 나타나는

현상을 관찰하였다.

국어로

제한효소절편길이다형성으로 번역하기도 한다.

이 지역의 질병과는

연관이 없이 개인차를

나타내는 표지로 사용될

수 있다.

제한효소단편 다형현상 (RFLP) : 친자감별

(restriction fragment-length polymorphism)

부 모 자식

우측 그림에서 모친(M), 자식(C), 그리고 가능한 두 명의 아빠 (F1, F2)의 DNA fingerprinting이 보여져 있다 . 진짜 아빠는 누구일까?

친자감식 (Paternity Testing)

오른쪽엔 일곱명의 범죄용의자의 DNA의 multilocus DNA 부분의 "fingerprints" 가 보여져 있다. 범죄현장에서 발견된 혈흔에서 체취 된 DNA를 PCR로 증폭한 후 Southern으로 분석한 결과이다.

범인은 누구이겠는가? 단 현장에서 체취된 DNA는 중앙에 보여져 있다

DNA 법과학 (DNA Forensics): 범인 감식

DNA sequencing (핵산의 염기서열 결정)

Cycle Sequencing Chain Termination

Template

ddNTPs dNTPs

Lots of each sized fragment are produced, each with a specific

florescent base on the end.base

etc.

Another Template

DNA Sequencing

NTP, dNTPs and ddNTPs

ddNTPs

DNA Sequencing

C G G G C G T

Sequence 5’ to 3’

Reading a DNA Sequencing Gel

DNA sequence 읽어보기 연습

Fluorescent ddNTPs

Plus: a preponderance of dNTPs

Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes

Each different ddNTP is coupled to a different colored fluorescent dye

ddTTP is red; ddGTP is black etc.