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Intrinsische Substratproteine der Transglutaminase von ... · PDF file Berichterstatterin: Prof. Dr. Felicitas Pfeifer Mikrobiologie, TU Darmstadt 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Hans-Lothar

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  • Intrinsische Substratproteine der Transglutaminase Intrinsische Substratproteine der Transglutaminase Intrinsische Substratproteine der Transglutaminase Intrinsische Substratproteine der Transglutaminase

    von von von von Streptomyces mobaraensisStreptomyces mobaraensisStreptomyces mobaraensisStreptomyces mobaraensis::::

    Identifizierung und Charakterisierung

    vom Fachbereich Biologie der

    Technischen Universität Darmstadt

    zur

    Erlangung des akademischen Grades eines

    Doctor rerum naturalium

    genehmigte

    DISSERTATION

    vorgelegt von

    Dipl.-Biol. Susan Schmidt

    aus Großröhrsdorf

    1. Berichterstatterin: Prof. Dr. Felicitas Pfeifer

    Mikrobiologie, TU Darmstadt

    2. Berichterstatter: Prof. Dr. Hans-Lothar Fuchsbauer

    Biochemie, Hochschule Darmstadt

    3. Berichterstatter: Prof. Dr. Ralf Kaldenhoff

    Botanik, TU Darmstadt

    Tag der Einreichung: 13.06.2008

    Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2008

    Darmstadt 2008

    D17

  • Die vorliegende Arbeit wurde von November 2004 bis Juni 2008 am Fachbereich

    Chemie- und Biotechnologie der Hochschule Darmstadt unter Leitung von Prof. Dr. Hans-

    Lothar Fuchsbauer in Kooperation mit Frau Professor Dr. Felicitas Pfeifer vom Institut für

    Mikrobiologie und Genetik der Technischen Universität Darmstadt angefertigt.

    Aus der vorliegenden Arbeit hervorgegangene Veröffentlichungen: Patentanmeldungen: FuchFuchFuchFuchsbauer, H.sbauer, H.sbauer, H.sbauer, H.----L., Schmidt, S. & Pfeifer, F.L., Schmidt, S. & Pfeifer, F.L., Schmidt, S. & Pfeifer, F.L., Schmidt, S. & Pfeifer, F.,,,, Strukturmodulatoren von Proteinen, Deutsche Patentanmeldung 10 2007 044 296.5 (17.09.2007). FuchFuchFuchFuchsbauer, Hsbauer, Hsbauer, Hsbauer, H....----L., Schmidt, SL., Schmidt, SL., Schmidt, SL., Schmidt, S. & Pfeifer, F.,. & Pfeifer, F.,. & Pfeifer, F.,. & Pfeifer, F., Transglutaminasesubstrat mit Inaktivierungsaktivität für Serin- und Metalloproteasen sowie antibiotischen Eigenschaften, Deutsche Patentanmeldung 10 2007 045 627.3 (24.09.2007). FuchFuchFuchFuchsbauer, H.sbauer, H.sbauer, H.sbauer, H.----L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Adolf, F. L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Adolf, F. L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Adolf, F. L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Adolf, F. & Mainusch, M.& Mainusch, M.& Mainusch, M.& Mainusch, M., , , , Transglutaminasesubtrat mit Inaktivierungsaktivität für Metalloproteasen sowie antibiotischen Eigenschaften, Deutsche Patentanmeldung 10 2007 047 038.1 (01.10.2007). FuchFuchFuchFuchsbauer, H.sbauer, H.sbauer, H.sbauer, H.----L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Mainusch, M., Jüttner, L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Mainusch, M., Jüttner, L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Mainusch, M., Jüttner, L., Sarafeddinov, A., Schmidt, S., Mainusch, M., Jüttner, N., Bleischwitz, N., Bleischwitz, N., Bleischwitz, N., Bleischwitz, M. & Kaldenhoff, R.M. & Kaldenhoff, R.M. & Kaldenhoff, R.M. & Kaldenhoff, R., , , , Transglutaminasesubtrat mit Inaktivierungsaktivität für Cystein- und Serinproteasen sowie antibiotischen Eigenschaften, Deutsche Patentanmeldung 10 2007 048 423.3 (09.10.2007). Publikationen: Schmidt, S., Adolf, F. &Schmidt, S., Adolf, F. &Schmidt, S., Adolf, F. &Schmidt, S., Adolf, F. & Fuchsbauer, Fuchsbauer, Fuchsbauer, Fuchsbauer, H.H.H.H.----L. (2008). L. (2008). L. (2008). L. (2008). The transglutaminase activating metalloprotease inhibitor from Streptomyces mobaraensis is a glutamine and lysine donor substrate of the intrinsic transglutaminase. FEBS Lett. 582582582582, 3132-3138. Sarafeddinov, A., Schmidt, S., AdolfSarafeddinov, A., Schmidt, S., AdolfSarafeddinov, A., Schmidt, S., AdolfSarafeddinov, A., Schmidt, S., Adolf, F., Mainusch, M., Bender, A. & Fuchsbauer, H., F., Mainusch, M., Bender, A. & Fuchsbauer, H., F., Mainusch, M., Bender, A. & Fuchsbauer, H., F., Mainusch, M., Bender, A. & Fuchsbauer, H.----L. L. L. L. (2008). (2008). (2008). (2008). A novel transglutaminase substrate from Streptomyces mobaraensis triggers autolysis of neutral metalloproteases. Manuscript.

  • Inhaltsverzeichnis

    I

    InhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnis

    1.1.1.1. ZusammenfassungZusammenfassungZusammenfassungZusammenfassung....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................1111

    2.2.2.2. EinleitungEinleitungEinleitungEinleitung ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................2222

    2.1 Streptomyceten .............................................................................................................2

    2.2 Bakterielle Transglutaminasen ................................................................................. 10 2.2.1 Vorkommen ..................................................................................................................................10 2.2.2 Aktivierung der bakteriellen Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis ....................13 2.2.3 Charakteristika und Katalysemechanismus der bakteriellen Transglutaminase von

    Streptomyces mobaraensis .........................................................................................................16

    2.3 Substrate der bakteriellen Transglutaminase.......................................................... 20 2.3.1 Nachweismethoden für Transglutaminase-Substrate................................................................20 2.3.2 Substrate und Anwendung der Transglutaminase von Streptomyceten...................................21

    2.4 Zielsetzungen der Arbeit ............................................................................................ 23

    3.3.3.3. Material und MethodenMaterial und MethodenMaterial und MethodenMaterial und Methoden............................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 25252525

    3.1 Material ....................................................................................................................... 25 3.1.1 Mikroorganismen .........................................................................................................................25 3.1.2 Feinchemikalien und Lösungsmittel ...........................................................................................25 3.1.3 Verbrauchsmaterialien und Kits..................................................................................................27 3.1.4 Enzyme, Peptide und Proteine.....................................................................................................28 3.1.5 Materialien für chromatographische Verfahren .........................................................................28 3.1.6 Antikörper und Seren ...................................................................................................................28

    3.2 Geräte ......................................................................................................................... 29 3.2.1 Kultivierung der Mikroorganismen..............................................................................................29 3.2.2 Chromatographische Verfahren ..................................................................................................29 3.2.3 Konzentrierung von Proteinlösungen..........................................................................................29 3.2.4 Bestimmung von Proteinkonzentration und Enzymaktivität......................................................30 3.2.5 Elektrophoretische und immunchemische Verfahren................................................................30

    3.3 Methoden zur Kultivierung ........................................................................................ 31 3.3.1 Nährmedien ..................................................................................................................................31 3.3.2 Kultivierung von Streptomyces mobaraensis auf Agarmedium ...............................................32 3.3.3 Kultivierung von Streptomyces mobaraensis in Flüssigmedium .............................................32 3.3.4 Herstellung von Sporensuspension ............................................................................................33 3.3.5 Ermittlung der Lebendkeimzahl einer Sporensuspension.........................................................33 3.3.6 Stammkonservierung ...................................................................................................................33

    3.4 Bestimmung der Enzymaktivität von Transglutaminase ......................................... 34 3.4.1 Prinzip und Reagenzien .....................................................

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