Introdução à Proteômica: técnicas e aplicações · • The analysis • involves the systematic separation, identification, ... Late embriogenesis protein Polifenoloxidase

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Leonardo C. Alves Centro de Bio. Mol. Eng. Genética Pós graduação Gen. Bio. Molecular - UNICAMP

Introdução à Proteômica: técnicas e aplicações

1 gene

>1 mRNA “splicing”

edição

>>1 proteína modificações

pós-tradução

>>>1 função

Hoje

1 gene

1 mRNA

1 proteína

1 função

Dogma Central da Biologia Molecular

Transcrição

Tradução

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Genômica Funcional

Estudo da regulação dos genes, suas funções bioquímicas e fisiológicas, e interação entre genes

associados a diferentes processos biólógicos

! Transcriptoma: soma de todos os transcritos (mRNAs)

! Proteoma: soma de todas as proteínas

! Metaboloma: soma de todos os metabólitos

! Genoma: soma de todos os genes de um organismo

Genoma Sistemas complexos

Proteoma

Separação proteínas Transcriptoma

Biologia estrutural

Diferenças de expressão entre células do mesmo

tecido

Combinar partes para interpretar o sistema

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Vogel e Marcotte 2012

Correlação mRNA—proteína

40%

Eventos pós-transcricionais são

importantes

Relação muda de acordo com posição no tecido

Proteína-mRNA Tende para o lado das

proteínas (glicólise) Tende para lado dos

mRNAs (fotoss)

Proteína-mRNA Tende para o lado das

proteínas (fotoss) Tende para o lado dos

mRNAs (glicólise)

Ponnala et al. 2014 Plant J.

Proteômica

Em 1996

“Caracterização em larga escala do conjunto de proteínas expressas

(proteoma) em uma célula ou tecido”

WILKINS et al., 1996

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Proteômica: aplicações gerais - Identificação de proteínas presentes no proteoma

- Análise de expressão diferencial temporal e espacial de proteínas

- Mapas protéicos em diferentes condições - padrões

- Caracterização de modificações pós-traducionais: fosfo - Proteômica (biologia) estrutural raio X: selecionar alvos

http://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/viewer

Genes

Transcritos

Proteínas

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Proteômica de Plantas

Molassiotis et al. (2013) Proteomics

Proteômica de Plantas

Desenvolv tecido

Sensor de Ca2+

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•  Atenção recente: qualidade $$

Proteômica de Plantas: Frutos

Ambiente Controle genético

Bioquímica Fisiologia Expressão proteínas

Mudanças temporais

Carboidratos e lignificação

Expansão/divisão celular

Energia

Resposta a stress

oxidativo

Resposta a patógenos


•  Desenvolvimento do pêssego Lignificação x sabor adocicado Melhoramento poderia favorecer acúmulo de açúcares ao invés de lignificação.

Síntese de carboidratos

Lignificação

Hu et al. (2011)

Piruvato desidrogenase

Glicólise, TCA

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Firmeza da polpa: $$ SAM sintase receptor de etileno

Polpa firme

Marondedze e Thomas (2012) Appl. Biochem. Biotecnol.

Frio Proteção contra defeitos

Calcineurina B sinaliza LT stress

Yun et al (2012) J. Exp. Bot.

LT = stress Inibição de proteínas glicólise e Krebs

Sanchez-Bel et al (2012) J. Prot.

Proteômica em termos práticos: eletroforese 2D

•  Proteômica •  The analysis •  involves the systematic separation, identification, •  and quantification of many proteins simultaneously •  from a single sample. Two-dimensional •  electrophoresis is used in this technique •  due to its unparalleled ability to separate thousands •  of proteins simultaneously. Two-dimensional •  electrophoresis is also unique in its ability •  to detect post- and co-translational modifications, •  which cannot be predicted from the •  genome sequence. Applications of 2-D electrophoresis •  include proteome analysis, cell differentiation, •  detection of disease markers, monitoring •  therapies, drug discovery, cancer research, •  purity checks, and microscale protein •  purification. New mass spectrometry techniques •  have been developed that allow rapid •  identification and characterization of very •  small quantities of peptides and proteins extracted •  from single 2-D spots.

2-D

- Separa >1500 spots

- Boa em detectar MPTs

- Detectar marcadores de doenças

-Purificar proteínas

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Eletroforese 2D: baseada em 2 parâmetros –  Separação e visualização das proteínas –  Separação por carga e massa

SDS-PAGE

Expressão diferencial

Eletroforese 2D: maior resolução

1D + -

pH 4 pH 7

Coffea arabica fruto

Peso m

olecular

2D

97 Kda

66 Kda

30 Kda

20 Kda

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Estes processos devem atingir os seguintes objetivos:

-Quebrar interações macromoleculares incluindo todas as interações não covalentes e as pontes dissulfeto -Prevenir modificações nas proteínas -Manter as proteínas em solução durante a 2D-PAGE

Redução DTT

Alquilação IAM

1ª Dimensão -Alto poder de resolução e possibilidade de determinação do ponto isoelétrico -Proteínas são anfotéricas: + / - / 0

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Voltagens altas para garantir o posicionamento das proteínas (7000 V!!)

Corrente baixa 1mA – 10mA

Ampholytes: o gradiente de pH é formado sob ação de um campo elétrico.

Tamponam a região perto do PI

Gradiente de pH é essencial

- Acrilamida com radicais tamponantes “Immobilines”

CH = CH–C–NH–R2O

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Faixas de pH e resolução

Várias!

2ª Dimensão

•  Transição da 1D para a 2D: mudança nos princípios e condições eletroforéticas

•  Equilíbrio com SDS, IOD e DTT " desnatura, inibe agregação e mantém estado reduzido

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Eletroforese usual

2ª Dimensão

SDS-PAGE:

- Horizontal - SDS desnatura as proteínas, mascarando-as com carga negativa. - Separação baseada no tamanho.

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Coloração

DIGE – Differential Gel Electroforesis

-Permite correr duas amostras no mesmo gel

-Alta resolução

Alíquotas 10x menores Evita variação por problemas na eletroforese

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ImageMaster 2D Platinum PDQuest Progenesis Decodon CAROS!!!! IMaster R$34 mil Versões free sem algumas funções Melanie Viewer 7.0

Detecção e Análise das Imagens


Detecção de spots

Match de imagens

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Expressão diferencial = %Vol

1124

1130

Digestão com tripsina

-Excisão dos spots de interesse

-Digestão com tripsina

Queratina

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Espectrometria de Massas

Matrix Assisted Laser Dessorption/Ionization Time

Of Flight

Liquid Chromatography

fentomol a picomol

MALDI-TOF-MS Nobel Química 2002 Koichi Tanaka

ESI-LC-MS

Arte de medir a relação massa-carga dos íons

Espectrômetro de massas: esquema básico

premierbiosoft.com

Placa com amostras

Coluna-HPLC

MALDI (amostras fase

sólida)

Electrospray (ams em solução)

TOF

Quadrupolo

Ion trap

Ion

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Espectrometria de Massas MALDI-TOF

MALDI

TOF

http://www.shimadzu.com.br/analitica/produtos/biotech/axima.shtml


ESI-LC-MS " HPLC com massas como detector Preparação amostras mais rápida e simples

Electrospray ionization

Alta voltagem

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ESI-LC-MS " HPLC com massas como detector Pode ser mais rápido e simples

Electrospray ionization


ESI-LC-MS " HPLC com massas como detector Pode ser mais rápido e simples

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Bioinformática

•  Identificação de proteínas •  MASCOT, NCBI, BLASTp e PepSeq •  Peptide Mass Fingerprinting

Bancos de dados

teóricos de DNA e

proteínas

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Modificações pós-traducionais

Glicosilação

http://www.piercenet.com/method/protein-glycosylation

Prots ligadas à membrana Secretadas Ret Endo monitora status do folding proteico Facilita entrega para o destino correto

Endoglicanase

Modificações pós-traducionais

Fosforilação Sacarose fosfato sintase

http://planetorbitrap.com/phosphorylation#.U8W8x_ldVu4

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Proteômica e desenvolvimento do café

Desenvolvimento do café

•  Brasil: líder em produção (35%) •  U$$15,4 bi -- ~135 milhões sacas

•  Bebida x qualidade Ciência!!

O Lavrador de Café Portinari, 1939

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•  Duas variedades: ! tamanho ! estágios de maturação Síntese de etileno: climatérico MS " Expressão mais cedo em Ipr59 SAM-sintase " presença a partir de 90 DAF IPR59 Gdo

Proteômica: Desenvolvimento do café

Budzinski et al (2011)

IPR59 IPR59 Graúdo

MS

MS

MS

SAM Fruto: produção e reserva de precursores para síntese de etileno já no início da

maturação

Diferença entre as duas cultivares Maior tempo de enchimento do

perisperma

Alves et al. (em prep)

Proteômica: Desenvolvimento do café •  Desenvolvimento celular -  Inibidor de xilanase similar à quitinase (CLXIP) -  Actina e actina 7 Ipr59 início da maturação Evitar demasiada degradação da parede celular Expressas em rápido desenvolvimento celular


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Proteômica: Desenvolvimento do café •  Detoxificação ROS/resposta a stress Ascorbato peroxidase Late embriogenesis protein Polifenoloxidase Aldeído desidrogenase Lacase Cisteína peroxiredoxina


Stress oxidativo Seca Crescimento e involução perisperma

OBRIGADO [email protected]

Centro de Bio. Mol. Eng. Genética Pós graduação Gen. Bio. Molecular - UNICAMP

Luis Filipe Pereira - IAPAR Cesar Martins – IB/UNESP Guilherme Valente – FCA/UNESP Renato Vicentini - UNICAMP

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Introdução à Proteômica: técnicas e aplicações · • The analysis • involves the systematic separation, identification, ... Late embriogenesis protein Polifenoloxidase