• Identificación y definición del problema Identificación y definición del problema

• Diseño del procedimiento experimentalDiseño del procedimiento experimental

• Ejecución del experimento y recopilación de datosEjecución del experimento y recopilación de datos

• Análisis de los datos experimentalesAnálisis de los datos experimentales

• Propuesta de solución al problemaPropuesta de solución al problema

““Concentración de paracetamol en un comprimido de Kitadol®”Concentración de paracetamol en un comprimido de Kitadol®”

Propiedades Métodos instrumentales

Emisión de radiación Espectroscopía de emisión (rayos X, UV, Visible) fluorescencia, fosforescencia.

Absorción de radiación Espectrofotometría, fotometría, resonancia magnética nuclear

Dispersión de radiación Turbidimetría, nefelometría

Refracción de radiación Refractometría, interferometría

Potencial eléctrico Potenciometría, cronopotenciometría

Carga eléctrica Culombimetría

Corriente eléctrica Polarografía, amperometría

El instrumento transforma la información relacionada con las propiedades físicas o químicas del analito en información factible de ser manipulada e interpretada.

Lo primero a realizar es definir con claridad la naturaleza del problema analítico, para ello se debe contestar:

I. ¿Qué exactitud se requiere?

II. ¿De cuanta muestra se dispone?

III. ¿En qué intervalos de concentraciones está el analito?

IV. ¿Qué componentes de la muestra interfieren?

V. ¿Cuáles son las propiedades físicas y químicas de la matriz?

VI. ¿Cuántas muestras hay que analizar?

Los criterios cuantitativos de funcionamiento de los instrumentos que se deben considerar para decidir si un determinado método instrumental es o no adecuado, son los siguientes:

I. Precisión

II. Exactitud

III. Sensibilidad

IV. Límite de detección

V. Intervalo de concentración

VI. Selectividad

VII. Robustez

10 µL

3 mL

1 mL 1 mL

¿Cómo saber si se ha ¿Cómo saber si se ha cometido algún error?cometido algún error? Replicas o repeticionesReplicas o repeticiones

Cualquier error por el que una medición o resultado es siempre demasiado alto o demasiado bajo, los resultados erróneos son siempre en el mismo sentido. Su origen se puede identificar (afecta a la exactitud).

Cualquier error por el cual algunas mediciones o resultados son muy altos o bajos , caen a ambos lados del valor medio (afecta a la precisión).Se manifiestan cuando un sistema de medición se utiliza a su máxima sensibilidad. Se debe a numerosas variables no controladas que son parte inevitable de toda medición física o química, no se pueden identificar o medir con certeza.

La frecuencia de distribución que presenta una curva gaussiana tiene las siguientes características:

-El resultado que se observa con mayor frecuencia es la media del conjunto

de los datos

-Los resultados se agrupan de forma simétrica alrededor del valor medio

-Es más frecuente encontrar pequeñas divergencias respecto al valor medio

central que grandes divergencias

-En ausencia de errores sistemáticos, la media de un conjunto de datos

grandes se aproxima al valor verdadero

Los errores sistemáticos son de tres tipos: INSTRUMENTALES, PERSONALES Y DEL

MÉTODO

INSTRUMENTALES:

-Deriva en los circuitos eléctricos

-Fugas en sistemas de vacío

-Efecto de la temperatura en detector

-Errores de calibración en los medidores,

pesas y equipos volumétricos

Corrección mediante calibración periódica de los equiposCorrección mediante calibración periódica de los equipos

PERSONALES: se introducen en una medida como consecuencia de los criterios que debe adoptar el analista

-Color de una disolución en el punto final de una valoración

-La intensidad relativa de dos haces de luz

-Leer un indicador alto de forma persistente

-Ceguera al color, etc

MÉTODO: aparecen como consecuencia del comportamiento químico o físico no ideal de los reactivos y de las reacciones en las que se basa un análisis

-Reacciones lentas e incompletas

-Pérdidas por volatilidad, adsorción del analito sobre sólidos, etc

VALIDACIÓN DEL MÉTODOVALIDACIÓN DEL MÉTODO

E = Xi - Xt

Donde xi es el valor aceptado como real y xt el valor medido. El signo + o – se mantiene para expresar si el valor medido es mayor o menor al real.

E = xi - Xt / Xt x 100

Para conocer la exactitud de los resultados obtenidos es necesario realizar Para conocer la exactitud de los resultados obtenidos es necesario realizar

análisis de estándares.análisis de estándares.

Para medir el nivel de interferencia de la matriz, es necesario analizar un blanco.Para medir el nivel de interferencia de la matriz, es necesario analizar un blanco.

Problemática: Determinar el contenido de mercurio en el aguaProblemática: Determinar el contenido de mercurio en el agua

Decidir cómo obtener una muestra para su análisis depende de:Decidir cómo obtener una muestra para su análisis depende de:

- Tamaño del lote del que se ha de tomar la muestraTamaño del lote del que se ha de tomar la muestra

- El estado físico de la fracción de muestra que se ha de analizarEl estado físico de la fracción de muestra que se ha de analizar

- Las características químicas del material que se ha de analizar Las características químicas del material que se ha de analizar

““La toma de la muestra va ligado directamente al método de análisis”La toma de la muestra va ligado directamente al método de análisis”

Si la muestra no es representativa los resultados del análisis no Si la muestra no es representativa los resultados del análisis no

reflejarían con exactitud su contenido en la muestra.reflejarían con exactitud su contenido en la muestra.

La mayoría de los materiales de los cuales se toman muestras son La mayoría de los materiales de los cuales se toman muestras son

heterogéneos. heterogéneos.

El muestreo debe ser a tiempos regulares y fijo en forma y métodoEl muestreo debe ser a tiempos regulares y fijo en forma y método

Apilar y dividir en cuartosApilar y dividir en cuartos

Muestreo en etapas: permite conocer mejor las características de Muestreo en etapas: permite conocer mejor las características de

distribución del analito en la matriz.distribución del analito en la matriz.

““Muestreo jerárquico múltiple”Muestreo jerárquico múltiple”

““el establecimiento de la evidencia documental de que un el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidosestablecidos”.”.

El proceso de validación contempla varias fases que se deben llevar a El proceso de validación contempla varias fases que se deben llevar a cabo para conocer las características de fiabilidad del método, que cabo para conocer las características de fiabilidad del método, que son las que demuestran la capacidad de un método analítico para son las que demuestran la capacidad de un método analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de validaciónvalidación

Los métodos analíticos están sometidos a interferencias químicas y Los métodos analíticos están sometidos a interferencias químicas y físicas que contribuyen a la incertidumbre del análisis. físicas que contribuyen a la incertidumbre del análisis. Cuando el método está libre de estas interferencias se puede decir que Cuando el método está libre de estas interferencias se puede decir que es robusto.es robusto.La robustez de un método garantiza que este pueda ser utilizado en La robustez de un método garantiza que este pueda ser utilizado en distintas condiciones en diversas matrices.distintas condiciones en diversas matrices.

Variable Bajo Alto Óptimo

% ACN* en la fase móvil (v/v) 4.0 6.0 6.0

Flujo (mL min-1) 0.6 1.0 0.7

pH 2.2 2 6 2.6

Identificar cuales son los factores que tienen mayor influencia

Método ultravioleta para determinar fosforo en suero

Fosfato + ion molibdato = complejo inorgánico molibdato fosfóricoʎ= 340 nm

Analistas

Tiempo y temperatura de

reacción

Almacenamiento

Técnica manual o automatizada

Método ultravioleta para determinar melatonina en cápsulas

Mediciones a 307 nm, solución de 30 µg/mL

Soluciones de pH 3-5

50°C – 4°C

La precisión es la medida de la dispersión de los datos entorno a un valor central y puede expresarse como rango, desviación estándar o varianza.Por lo general se divide en dos categorías: repetibilidad y reproducibilidad. i. Repetibilidad: precisión de un análisis en el que la única fuente de

variación es el análisis de muestras repetidas

ii. Reproducibilidad: precisión obtenida cuando se comparan los resultados de distintas muestras, distintos análisis o distintos métodos.

Precisión

Repetibilidad

Precisión intermedia

Instrumental

Del método

Reproducibilidad

La precisión se ve afectada por los errores aleatorios, como se distribuyen aleatoriamente en torno al valor central, los errores positivos y negativos tienden a compensarse, siempre que el número de mediciones sea suficientemente grande.

Nº de inyección Área (mvolts* seg)

1 54493

2 55358

3 55401

4 55447

5 56001

6 55691

Promedio 55399

DE 505

DER% 0.91

Extracto 1

Extracto 2

Extracto 3

Extracto 4

Extracto 5

S CV%

Área promedio

2488,8 2203,1 2413,5 2137,3 2203,4 152,6 6,67

tr 12,185 12,185 12,183 12,182 12,182 0,0015 0,012

5 extractos a un nivel de sobrecarga de 0,8 ppm

5 extractos a un nivel de sobrecarga de 0,8 ppm en dos días distintos

Día 1 Día 2

Promedio 2289,2 2624,3

S 152,6 191,8

CV% 6,67 7,31

CV% 6,98

La exactitud es una medida de la proximidad entre la medida de tendencia central y la verdad o el valor esperado. Los errores que afectan a la exactitud de un análisis se llaman sistemáticos y se caracterizan por una desviación sistemática en relación con el valor verdadero, es decir, todas las medidas individuales son demasiado pequeñas o demasiado grandes.

Sobrecarga µg mLSobrecarga µg mL-1-1 Recuperación %Recuperación % DER%DER%

300300 94± 4.24 4.51

600600 85± 0.71 0.84

900900 90± 0.71 0.79

Es la medida de la capacidad para diferenciar pequeñas variaciones en la concentración del analito.La definición cuantitativa de sensibilidad para la IUPAC es “sensibilidad de calibrado”, es decir la pendiente de la curva de calibración a la concentración en estudio.

S = mc + Sbl

Sensibilidad

Sensibilidad de calibración

Pendiente de la curva

Sensibilidad analítica

LD y LC

Se define como la mínima masa de analito que se puede detectar para un nivel de confianza dado.Este límite depende de la relación entre la magnitud de la señal analítica y el valor de las fluctuaciones estadísticas de la señal del blanco.Según IUPAC es la menor concentración o cantidad absoluta de un analito que produce una señal significativamente mayor que la que se obtiene con un blanco.

I. Método del error típicoII. Método de la inspección visualIII. Método de la desv. St. del blanco

Se define como la menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud razonables en las condiciones establecidas y se expresa en unidades de concentración.

Límite de detección (LOD): 3 * Sbl / m

Límite de cuantificación (LOQ): 10 * Sbl / m

Se define como el intervalo desde la concentración más pequeña a la que se puede realizar una medida cuantitativa hasta la concentración a la que la curva de calibrado se desvía de la linealidad.

Independiente de la apariencia lineal de la recta es conveniente evaluar los estimadores de regresión es un intervalo de confianza dado:

• Del coeficiente de regresión (r) : se determina para evaluar el ajuste al modelo lineal propuesto

• De la pendiente (m): se determina como parámetro de sensibilidad

• De la ordenada en el origen (b): para evaluar la proporcionalidad de la función analítica, que la recta pase por el origen y que cualquier desviación pueda adjudicarse únicamente a un error aleatorio.

Este parámetro se refiere a la propiedad del método de producir una señal medible debida solo a la presencia del analito, libre de interferencias de otros componentes, en la matriz de la muestra.

Indica el grado de ausencia de interferencias con otras especies que contiene la matriz de la muestra.

Estos compuestos pueden ser excipientes de un fármaco, productos de degradación, subproductos o productos laterales de síntesis de una droga, metabolitos del mismo analito en un fluido biológico, etc.

DON

Blanco de matriz de trigo

DON

Muestra de trigo naturalmente contaminada con deoxinivalenol

DON

HT-2

T-2

Muestra de trigo con tres toxinas de Fusarium DON, HT-2 y T-2

En productos farmacéuticos se evalúan las rutas de degradación con el fin de realizar un ensayo de degradación artificial:

• Termólisis (por calentamiento de la droga a una t° fija)• Hidrólisis (por calentamiento a reflujo con agua durante 1 hora)• Hidrólisis alcalina (por calentamiento a reflujo con NaOH 1 N por 1 hora)• Hidrólisis ácida (por calentamiento a reflujo con HCl 1 N por 1 hora)• Fotólisis (por exposición de la droga y una solución de ella a radiación UV o luz directa)• Oxidación (calentamiento a baño maria de una solución de la droga con gotas de agua oxigenada o burbujeo de hidrógeno)

“+ pureza“

nm

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

mA

U

0

2

4

Alimento extruido Ascorbil 2-monofosfato

Consiste en una disminución o aumento de la respuesta instrumental del analito debido a la presencia de otros componentes.El efecto matriz provoca un error sistemático proporcional, es decir, dependiente de la concentración de analito en la muestra.

Además de los parámetros de calidad se deben considerar las siguientes características:

1.- Velocidad

2.- Facilidad y comodidad

3.- Habilidad del operador

4.- Costo y disponibilidad del equipo

5.- Costo por muestra.

La exactitud de la estandarización depende de la calidad de los reactivos y del material de vidrio que se utilicen para preparar los estándares.

- Elevada purezaElevada pureza

- Composición conocidaComposición conocida

- Estable a temperatura ambienteEstable a temperatura ambiente

- Ser posible de secar en estufaSer posible de secar en estufa

Pesar X gPesar X g

Solución de concentración Solución de concentración conocidaconocida

- reactivo cuya pureza hay que establecer por comparación con un patrón reactivo cuya pureza hay que establecer por comparación con un patrón

primarioprimario

- Aquella estandarización que utiliza un solo patrón con una cantidad conocida de Aquella estandarización que utiliza un solo patrón con una cantidad conocida de

analitoanalito

K = K = S S refref

C C ss

- Cualquier incertidumbre del valor de K aumenta la incertidumbre de la Cualquier incertidumbre del valor de K aumenta la incertidumbre de la

concentración del analitoconcentración del analito

- Se prefiere la Se prefiere la estandarización con varios puntosestandarización con varios puntos

La mayoría de los métodos instrumentales requieren de una calibración, proceso que implica relacionar la señal analítica medida con la concentración del analito. Los tres métodos más utilizados son:

I. Curvas de calibradoII. Método de la adición estándarIII. Método del patrón interno

• Se requieren varios estándares de concentraciones conocidas del analito de interés.• Se requiere un blanco que contenga los componentes de la muestra original excepto el analito.• Se representa una gráfica de respuesta del instrumento v/s concentración del analito.

Este método se utiliza para muestras complejas en las cuales la matriz puede interferir de manera importante.Se adicionan diferentes volúmenes de una disolución patrón a varias alícuotas de la muestra del mismo tamaño.El valor del volumen en la intersección de la línea recta con el eje x es el volumen del reactivo estándar equivalente a la cantidad de analito en la muestra.

Un patrón interno es una sustancia que se añade a todas las muestras, blancos y patrones de calibrado en una cantidad fija.

Concentración analito/Cst.int.

área

ana

lito/

área

st.

int. Está ausente en la

muestra Se añade en

concentración fija y conocida

Este método sirve para compensar algunos errores aleatorios o sistemáticos.

• Si el estándar interno y el analito responden proporcionalmente a los errores instrumentales y fluctuaciones del método, la razón entre las señales es independiente de las fluctuaciones.• La mayor dificultad es encontrar un estándar interno adecuado, con señal reproducible y que genere una señal similar a la del analito.

• Dígitos de una cantidad medida, incluyendo todos los dígitos conocidos y un dígito cuya magnitud no se conoce con seguridad.

• Son importantes ya que reflejan la incertidumbre de la medida.

• Repasar las reglas para realizar redondeos de cifras significativas en los cálculos

Las cifras significativas indican el error con el cual se midió una determinada magnitud.

• Todas las cifras distintas de cero son significativas• Los ceros a la derecha o entre dos cifras distintas de cero son significativos• Los ceros a la izquierda NO son significativos

• Cuando la cifra siguiente a la que se va a conservar es menor a 5, la cifra que se conserva queda inalterada.

23,4533 23,4523,4533 23,45 • Cuando la cifra siguiente a la que se va a conservar es 5 o mayor a 5, la cifra que se conserva se debe aumentar en una unidad.

23,4567 23,4623,4567 23,46

Cuando un problema tiene varios datos el resultado final debe expresarse con

la misma cantidad de cifras significativas del dato que tenga menor cantidad

de cifras significativas.

Si se obtienen resultados parciales, en los mismos se debe dejar por lo menos

una cifra significativa más de las que se necesita tener en el resultado final.

16.00 1.007 1.00718.014 18.0118.01

El resultado de una adición/sustracción no puede tener más dígitos significativos a la derecha del punto decimal que el término que menos contenga.

[(0.958)x 1 x (6.0221367 x 1022 ](18.01)

3

4

8

El resultado de una multiplicación/división tiene tantas cifrassignificativas como el factor quemenos tenga