Introduction aux puces à ADN Vincent BARRA ISIMA / LIMOS UMR CNRS 6158 Campus des Cézeaux 63177 AUBIERE

Introduction aux puces à ADN

Vincent BARRA

ISIMA / LIMOS UMR CNRS 6158

Campus des Cézeaux 63177 AUBIERE

www.isima.fr/vbarra

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Introduction Biologie Puces Analyse Applications Conclusion

Applications – détermination des familles de gènes co-régulés, – recherche de systèmes de régulation, …

Domaines – Pharmacologie– médecine – environnement…

Mesure du niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes simultanément

Puces à ADN

BiologieNanotechnologie

Chimie Traitement d’images

Bioinformatique

Introduction (1/3)

Introduction

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Puces perles

*****

GeneChip Affymetrix

Puces ADNc

Membrane NylonSAGE

DifférentesTechnologies

CGHAgilent: Puces à jet d’encre

Introduction (2/3)

Introduction

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Puces ADNc

Principe : technique d'hybridation.

Introduction (2/3)

Introduction

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Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionIntroduction

Eléments de biologie

Les puces à ADN

Analyse des données issues des puces à ADN

De la cellule à l’ADN De l’ADN au génomeDu génome au transcriptome

Introduction (3/3)

Principe Préparation du matériel biologiqueAcquisition d’une image de puce à ADN

Traitement d’imagesAnalyse des données

Quelques applications

Etudes comparatives de transcriptomesAgriculture

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Eléments de biologie moléculaire

Biologie

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De la cellule à l’ADN

Biologie

8


Dogme central de la biologie moléculaire

ADN ARN ProtéineTranscription

Traduction

Rép

licat

ion

Transcription inverse

Biologie

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Elements de biologie moléculaire

Biologie

Transcription

Traduction

Synthèse de protéines

ADNARNm ARNt

Acides aminés

ARNm

codon

Membrane nucléaire

Anticodon

ARN

polymérase

Nucléotides ARN

ARNr

Ribosome

Chaîne polypeptide

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Ribonucléotides libres

Transcription

Biologie

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Copie du gène en ARN = ARNm

L'ARNm se détache et la molécule d'ADN se referme

Transcription

Biologie

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La synthèse de la protéine (assemblage des acides aminés) se fait au niveau des ribosomes

Biologie

Traduction

Pour synthétiser la protéine, il faut :

• ARNm = information (la recette)

• Ribosome = machine à assembler les acides aminés

• Acides aminés = pièces de construction

• ARNt (ARN de transfert) = molécules qui transportent les acides aminés du cytoplasme au ribosome où ils sont assemblés en protéine.

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Traduction

Biologie

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•La maturation des protéines a lieu dans le Reticulum endoplasmique et l ’appareil de Golgi

• Modifications chimiques de la protéine (glycosylation, mérystylation, phosphorylation….)

• La maturation est indispensable à la fonctionnalité des protéines

Biologie

Hélice

Hélice

Feuillet Feuillet

Traduction

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La protéine assemblée se replie pour former une structure tridimensionnelle précise

Biologie

Traduction

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Insuline

Hémoglobine

Biologie

Traduction

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Acétylcholinestérase

Hélices alpha

Feuillets bêta

Biologie

Traduction

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1. Structure

2. Régulation du métabolisme

3. Mouvement

4.Transport de molécules

5. Immunité

6. Transport membranaire

7. Métabolisme (les enzymes)

Biologie

Traduction

Principales fonctions des protéines

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1. Structure


3. Mouvement


5. Immunité



Biologie

Traduction


20


1. Structure


3. Mouvement


5. Immunité



Biologie

Traduction


21


1. Structure


3. Mouvement


5. Immunité



Biologie

Traduction


22


1. Structure


3. Mouvement


5. Immunité



Biologie

Traduction


Anticorps IGE

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1. Structure


3. Mouvement


5. Immunité



Biologie

Traduction


24


1. Structure


3. Mouvement


5. Immunité



Biologie

Traduction


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Dogme central de la biologie moléculaire

ADN ARN ProtéineTranscription

Traduction

Rép

licat

ion

Transcription inverse

Les puces à ADN permettent de mesurer globalement le niveau d’expression de l’ARNm

Protéine

Transcription

Traduction

Ribosome

ADN

ARNmARNr ARNt

Biologie

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Intérêts et applications

Biologie

• Etude de la dynamique du transcriptome

• Recherche et action de médicaments

• Recherche de mutations

• Oncologie

• Environnement et agriculture

• …

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Les puces à ADN

Puces

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Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionPuces

Etapes d’une expérience utilisant des puces à ADN

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Etude de cas

• On cherche à déterminer les gènes d’un organisme activés ou réprimés en conditions particulières

• On suppose disposes de deux types de cellules pour cet organisme :

des cellules de contrôle

des cellules représentative du phénomène étudié (pathologie, cycle cellulaire, stress hydrique, stress anaérobique,…)

• Exemple : croissance d’une levure en conditions aérobie/anaérobie

• Utilisation courante des puces à ADN

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Préparation des cibles (1/2)

On laisse croître les cellules dans les deux conditions

Ajustement des transcriptomes pour survivre

Centrifugation

On purifie

On isole les ARNm

Tampon d'extraction

On dilue

On facilite l’extraction

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Préparation des cibles (2/2)

On ôte l’ARNm et on le place dans des nouveaux tubes

Mélange

La soupe est prête !

Conversion ARNm/ADNc

Marquage R/V

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Préparation des sondes

On dépose des milliers de séquence d’ADNc (sondes) sur un support de verre de petite taille.

– Les sondes doivent être spécifiques d’un gène– Chaque dépôt est la transcription inverse d’un ARNm

que l’on souhaite mesurer

Puces

Les sondes sont déposées par un robotspotteur

70 mm20 mm

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Hybridation

Puces

Hybridation

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Acquisition de l’image de puce (1/3)

• Acquisition à l’aide d’un scanner deux couleurs : détection différentielle de la fluorescence des cibles aérobies/anaérobies présentes sur le support• Amplification du signal par des tubes photomultiplicateurs• Construction d’une image en fausses couleurs

Puces

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Exemple

Excitation laser vert

Excitation laser rouge

Puces

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Exemple

Gène aérobique Gène anaérobique

Gène exprimé dans les deux conditions

Puces

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Puces

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Schéma récapitulatif

Puce à ADN

excitation

laser 1laser 2

émission

Tableau N*P

Analyse et normalisation d’images

Hybridation

Sondes

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Analyse des données

Analyse

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Analyse des données

Adressage

Segmentation

Quantification

Extraction de

connaissances

Impact considérable sur l’interprétation biologique des données

Analyse

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Queues de comètes

Débordement des puitsMauvais rapport S/BSuperpositon

–Segmentation signal/fond et débruitage

–Extraction et normalisation de l’information

–Recherche des centres de spots

Problèmes :

Traitement d’images

Analyse

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Introduction Biologie Puces Analyse Applications ConclusionAnalyse


Localisation des spots

Méthodes algorithmiques Méthodes géométriques

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Extraction des gènes d’intérêt

Quels sont les gènes dont la variation d’intensité est significative ?

Analyse de données/extraction de connaissances

Quantification

Intensités en rouge et vert

Intensités en rouge et vert corrigées du bruit de fond

…

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Analyse de données

Objectifs

A partir de la liste des gènes ayant une variation significatives par rapport à l’expérience :

• Trouver les gènes ayant une variation recherchée

• Regrouper les gènes ayant des variations similaires

• Trouver les gènes expliquant les variations d’autres gènes

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Classification hiérarchique :– Calcul d’une matrice de similarité entre gènes

– Regroupement des deux gènes les plus proches

– Remplacement des deux gènes par un gène moyen

– Processus itératif

Construction d’un arbre phylogénique représentant

une hiérarchie de groupes de gènes

Une des premières méthodes utilisées

Analyse de données

Analyse

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Analyse de données

Exemple : Extrait du génome de la

levure du boulanger

Saccharomyces cerevisiae

Clustering hiérarchique

Analyse

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Algorithme des nuées dynamiques

Analyse de données

Initialisation Classification Mise à jour des centres

Analyse

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Réseaux de neurones

8 groupes 8 groupes stables stables

Analyse de données

Analyse

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Représentation des données

Problèmes– Visualiser les résultats de l’analyse du transcriptome à l’échelle du génome

entier– Intégrer les résultats pour répondre aux interrogations.

Deux types de méthodes– Organisation de la liste des gènes visualisation des résultats– Représentations quantitatives vue globale de l’effet des expériences

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Tableau résumant les expressions de chaque gène

Représentation en fausses couleurs Induction du gène par une échelle (noir/rouge) Répression du gène par une échelle (noir/vert)

Peu lisible

Pas d’inclusion des intensités

+ intensité moyenne des gènes + éléments cis régulateurs dans les promoteurs


Analyse

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Localisation chromosomique des gènesLocalisation chromosomique des gènes

Analyse


GraphiqueGraphique mettant en valeur l’effet observé à l’échelle du génomemettant en valeur l’effet observé à l’échelle du génome

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Utilisation de méthodes issues du data mining : exemple de la mise en évidence de relations entre objets

Calcul de similaritésCalcul de similaritésRéseau de pointsRéseau de points

Carte stableCarte stable

Exemple d’applicationExemple d’application

Carte aléatoireCarte aléatoire

Analyse


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Incorporation d’autres informations– Fonctionnelles (banques de données)– Expertes (biologistes..)

Comparaison des résultats obtenus avec ce qui est déjà connu

Analyse


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Quelques applications

Applications

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Applications des puces à ADN

Applications

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Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes

Applications

Le transcriptome = population des ARNm exprimés par un organisme à un instant donné. résulte d’un équilibre entre la synthèse et la dégradation des ARNm varie en fonction des conditions intra- et extra-cellulaires. offre une représentation dynamique de l’état de la cellule et des processus biologiques en cours.

L’analyse du transcriptome permet d’établir le « profil d’expression » de chaque gène considéré, c’est-à-dire la variation de son niveau d’expression selon un ou plusieurs paramètres (temps, type cellulaire, etc.).

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Applications

De nombreuses études ont été réalisées dans différents organismes afin d’identifier les gènes co-régulés dans certaines réponses cellulaires spécifiques.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, études de la variation transcriptionnelle des gènes :

• au cours du cycle cellulaire mitotique• au cours de la méiose et de la sporulation• en réponse à la transition de la fermentation anaérobie à la respiration• en réponse aux lésions de l’ADN provoquées par des irradiations ou des agents génotoxiques• etc.

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Applications

• La comparaison de divers transcriptomes de mutants, de types cellulaires ou de tissus donnés permet également de prédire la fonction de gènes non caractérisés et d’élucider des réseaux de régulation de voies biochimiques complexes.

• l’analyse du transcriptome permettant de caractériser l’état de la cellule, l’utilisation de puces à ADN dans un objectif de diagnostic est en développement.

distinguer des types de cancers non différentiables par d’autres méthodes recherche et la validation de substances thérapeutiques en permettant l’identification de nouveaux gènes cibles et la caractérisation de la réponse cellulaire à un traitement.

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Applications

• Analyse de mutations : cribler des gènes caractérisés par leur polymorphisme. La diversité génétique d’une population peut être explorée et la relation entre le génotype et le phénotype, de gènes et de groupes de gènes peuvent ainsi être mis à jour.

• Analyse des mutations des gènes codant pour deux enzymes du virus du SIDA (Gen-Chip HIV, Affymetrix) • détection des mutations génétiques liées à certains cancers du colon et du sein (Leti, Grenoble)• détection des mutations de l’exon 11 du gène BRCA1, responsable du cancer héréditaire du sein et de l’ovaire (Hacia et al, Affymetrix)• …

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Applications des puces à ADN – agriculture

Genoplante

Programme fédérateur de génomique végétale qui associe en France la recherche publique (INRA, CIRAD, IRD, CNRS) et les principales sociétés privées impliquées dans l'amélioration et la protection des cultures ( Biogemma, Bayer Cropscience, Bioplante).

ObjectifsDécouvrir des gènes utiles : amélioration des plantes raisonnée et découverte de nouvelles molécules agro-chimiques plus respectueuses de l'environnement.Etude des espèces "modèles : étude d'Arabidopsis et du riz permettra pour avancer dans la connaissance des autres plantes cultivées.

ExempleDétermination des processus biologiques et moléculaires améliorant la tolérance au froid

du blé

Applications

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Applications des puces à ADN – agriculture

Applications

Leader, Journal of Cereal Science, 41, pp 149.163, 2005

Etude des gènes activés après bourgeonnement

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Conclusion

Il est maintenant possible d’analyser l’expression de milliers de gènes en parallèle et à haut débit. Révolution technologique Changement d’échelle de la recherche biologique

Domaine plurisiciplinaire

Applications multiples

Conclusion

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Conclusion

Conclusion

Quel avenir pour les biopuces ?

Les possibilités des puces à ADN sont inversement proportionnelles à leurs tailles.

• ARN artificiels capables de remplacer des anticorps monoclonaux

• Accès aux immuno-analyses simultanées du même prélèvement pour le diagnostic moléculaire des maladies infectieuses la recherche sur les résistances aux antibiotiques.

• Mise au point imminente de puces de polymorphismes dont les applications seront des plus nombreuses:

Etude de la diversité génétique dans le cadre de la génétique des populations Etablissement de cartes génétiques affinées Recherche accélérée sur les maladies à origine génétique (dépistage, facteurs de risque...)

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Conclusion

Conclusion

Et bientôt…la transformation des puces en laboratoires (CEA)

Dépôt de l’échantillon

Puce à ADN

• Détection, en moins d'une heure, les agents infectieux présents dans un échantillon de sang ou de salive • Détection de l'éventuelle présence d'une trentaine de micro-organismes en même temps

Traitement de l’échantillon

Documents

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