Upload
hoangtruc
View
216
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Introduktion till laborationBiokemi 1
Annica Blissing
IFM – Biochemistry
2
Laborationen sträcker sig över flera tillfällen
Isolering, gelfiltrering, absorbansmätning och påvisande av sulfat
Provberedning, SDS-PAGE, pipettkalibrering, gelinfärgning
Dataanalys och diskussion kring resultat
Rapport
Upplägg
3
Tillfälle 1
Väl införstådd med teorin
Plan för utförandet
Tillfälle 2
Väl införstådd med teorin
Plan för utförandet
Beräknat provvolym till SDS-PAGE
Tillfälle 3 – analys och diskussion
All insamlad data
Repeterat teorin inför diskussion
Förberedelser
Alltså VAD och VARFÖR
Vi hjälper er med HUR!
4
Teori inför laborationen
5
Inom biokemi vill man i princip alltidseparera komponenter i en lösning.
Olika separationskriterier
Isolera och rena hemoglobin
centrifugering och utsaltning
gelfiltrering
Kontrollera renhet och bestämmamolekylvikt med SDS-PAGE
Separationstekniker
6
4 subenheter
kvartärstruktur
Hemoglobin
7
Hemoglobin
8
Samma osmotiska trycki och utanför cellen
Semipermeabelt membranErytrocyt
Porer och kanaler
joner H2O
DiffusionNa+
Na+
K+
Na+
Na+
K+
K+K+
Na+
K+
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Erytrocyter
9
Osmos
Diffusion från högre koncentration till lägre koncentration, tills koncentrationsgradienten är utjämnad.
10
Isoton lösning0.9% NaCl
Hyperton lösning> 0.9% NaCl
Hypoton lösning< 0.9% NaCl
[NaCl] ↓
[NaCl] ↑
H2O
H2O
H2OH2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
Lysering
11
Proteiner har laddningar på ytan
löslighet
neutralisera laddningarna
Olika sammansättningav laddningar på ytan
faller ut vid olikasaltkoncentrationer
Separation med av-seende på löslighet
(NH4)2SO4
löslighet
tillsätt “motladdningar” tills proteinets laddningar
neutraliserats
Utsaltning
12
Större molekyler får inte plats – vandrar runt gelkornen
Separation med avseende på storlek och form.
Size exclusionchromatography
Tvärbundenglukospolymerer
Små molekyler går in i gelkornen
lång vandrings-sträcka kortare vandrings-
sträcka
Gelfiltrering
13
14
Absorbans280 nm
Volym (ml)
fraktioner
Kromatogram
baslinjeseparation
Voidvolym
15
Separation med avseende på storlek och form.
Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig som att
de hade högre molekylvikt
Gelfiltrering
CalmodulinPDB molecule of the month Aug 2003http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=44
16
Gelfiltrering
Hydrodynamisk radie
svårare att ta sigin i gelkornen än globulära partiklar
globulär
separation trotssamma molekylvikt!
Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig
som att de vore större
17
störst går först
Omvänd sil
Separation med avseende på storlek och form.
Gelfiltrering
separationskriterier
18
Laddad partikel rör sigmot pol i elektriskt fält
polyakrylamidgel
tredimensionelltnätverk
jmf elektrolys
Gelelektrofores
Proteiner har laddningar på ytan
19
Tredimensionelltnätverk
Bestämd porstorlek
Separation med avseende på storlek
Stora molekyler retarderas Små molekyler passerar lättare
Minst går först
bisakrylamid
Polyakrylamidgelelektrofores
20
Polyakrylamidgelelektrofores
21
Proteinbanden färgasmed coomassie
visualisera
Polyakrylamidgelelektrofores
22
MEN formen påverkar migrationen!
Kan ha samma form menolika laddningar på ytan
Nativ struktur påverkar migrationen
Lösning: denaturera!
form
laddning
Polyakrylamidgelelektrofores
23
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
disulfidbryggor och primärstruktur intakta
bryter icke-kovalenta bindningar
Sekundär Tertiär Kvartär
denaturering
negativnettoladdning
Alla peptidkedjor fårsamma form och laddning
SDS bindertill proteiner
β-mercaptoetanol
24
Alla peptidkedjor sammaladdning och form
––
–– – – – –
–––––––
–
Molekylviktsbestämning
Renhetsbedömning
Samma elektroforetiska mobilitet
Separation endast m a p storlek
SDS-PAGE
25
Molekylviktsbestämning
Log molekylvikt
Vandringslängd (mm)
Mät vandringslängder
Log-diagram
SDS-PAGE
Exempelrapport på kurshemsidan!
Referensproteiner medkända molekylvikter
26
0 10 20 30 40 50 60
3.9
4.1
4.3
4.5
4.7
4.9
5.1
5.3
5.5f(x) = -0.02x + 5.37
Log-diagram
SDS-PAGE
vandringslängd (mm)
Loga
ritm
erad
mol
ekyl
vikt
Använd för att räknaut molekylvikten
27
0 10 20 30 40 50 60
3.9
4.1
4.3
4.5
4.7
4.9
5.1
5.3
5.5f(x) = -0.02x + 5.37
Log-diagram
SDS-PAGE
vandringslängd (mm)
Loga
ritm
erad
mol
ekyl
vikt
28
Viktigt!
Molekylvikten säger INGENTING om provets renhet!
Hur avgör man renheten?
29
Ett band = en molekylvikt
Ofta en sorts protein
Ett band = rent protein
Renhetsbedömning
SDS-PAGE
30
MEN vissa proteiner kanuppvisa fler än ett band
Kom ihåg:
Hb har 4 subenheter
Hb:s subenheter väger lika~ 16 000 g/mol
Så är inte alltid fallet!
⇒ endast ett band på gelen!
Renhetsbedömning
31
Nativt protein
–– – – – – – –
–––––––
–
SDS-PAGE
Denaturerat protein
Jämförelse
Nativt protein
PAGE
storlek storlek storlek
form form
laddning
CalmodulinPDB molecule of the month Aug 2003http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?
momID=44
Gelfiltrering
32
Absorbans280 nm
Volym (ml)
Använda gelfiltrering förmolekylviktsbestämning?
Kända referensproteiner påsamma sätt som SDS-PAGE
Jämförelse
Referensproteinermed samma form!
33
Isolering och rening av hemoglobin
34
Kom i tid
Kom förberedd
Labbar börjar med genomgång och kort förhör
Närvaro förutsättning för att få labba!
Obligatorisk närvaro
Hela labpasset
Meddela förhinder till handledare i god tid
Rapportera närvaro efter avslutat labtillfälle
Gör vid varje labtillfälle!
Laborationer på Biokemi 1
Förväntas hakoll på läget
Meddela oss direktom något händer!
35
1.5 ml helblod
500 g, 15 min
Tvätt 0.9% NaCl
500 g, 10 min
Hemolys H2O
Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4
1000 g, 15 min
Lös pellet, 3 delar H2O
1000 g, 10 min
Supernatantenkastas
Supernatantenkastas
Pelletenkastas
Supernatantenkastas
36
H2O
1.5 ml helblod
500 g, 15 min
Tvätt 0.9% NaCl
500 g, 10 min
Hemolys H2O
1000 g, 15 min
Lös pellet, 3 delar H2O
1000 g, 10 min
Supernatantenkastas
Supernatantenkastas
Pelletenkastas
Supernatantenkastas
Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4
pellet
37
H2O
1.5 ml helblod
500 g, 15 min
Tvätt 0.9% NaCl
500 g, 10 min
Hemolys H2O
1000 g, 15 min
Lös pellet, 3 delar H2O
1000 g, 10 min
Supernatantenkastas
Supernatantenkastas
Pelletenkastas
Supernatantenkastas
Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4
38
0.5 ml
Viktigt att gelytan är rak!Gelen får aldrig torrläggas!
Gelen ekvilibrerad
jämviktad
anpassadebuffertförhållanden
Ekvilibreringslösninggenom kolonnen
Gelfiltrering för attseparera (NH4)2SO4 från Hb
från utfällningen
39
A = ε · c · l
Lambert-Beers lag
Absorbansmätning
ε = molära absorptiviteten
ε = 14480 M-1 cm-1 l = 1 cm
c = koncentrationen i molar
Om A > 1 måste provet spädas
I0 I
l
40
41
Påvisa sulfatjoner
En droppe Ba(NO3)2
OBS! Inte till toppfraktionen!
Högst koncentration Hb
Giftigt! anvisadplats
skyddsutrustning
till SDS-PAGE
42
Kromatogram konstruerat avForskarskolans elever 2011
43
Separation!
sulfatjonerhemoglobin
44
Utbyte
0.5 ml supernatant
absorbansvärden
koncentration
massa ellersubstansmängd
hemoglobin
45
Rapporten
46
47
Inledning
Syfte och utförlig teori
Utförande
Beskriv tillvägagångssätt
Passiv form!
Håll isär utförande och teori!
Riskanalys
Akrylamid
Resultat
Redovisas tydligt
Rådata, beräkningar, figurer/bilder, tabeller...
Diskussion
Diskutera resultaten
Felkällor och hur de har påverkat resultatet
Jämförelse GF + SDS-PAGE
Utförlig och komplett rapport!
Rapporten
48
Examination
En rapport för alla tillfällen
Tänk på helheten!
Enligt riktlinjer
+ punkterna i handledningen
Copy – paste oacceptabelt
Se baksidan på försättsbladet
5 arbetsdagar
Gäller även returer
Elektronisk inlämning
3 rättningar
Track changes aktiverat
Fullständig!
Saknas något ⇒ retur
“right-first-time”
Rapporten
49
Tips inför rapporten
Skriv inledning och utförande så snart som möjligt
Se det som förberedelse
Skriv resultat och diskussion så snart som möjligt
Se även “Redovisning” i kompendiet!
Checka av att allt är med
Passa på att fråga oss på schemalagd tid
Vi svarar gärna!
Utanför schemalagd tid jobbar vi med annat
Säkrast: e-mail
Använd allt tillgängligt material!
Föreläsningsanteckningar
Kursboken
Labhandledningen
50
Tillfälle 1 – gelfiltrering
Väl införstådd med teorin
Plan för utförandet
Tillfälle 2 – SDS-PAGE
Väl införstådd med teorin
Plan för utförandet
Beräknat volym Hb
Tillfälle 3 – analys och diskussion
All insamlad data
Funderat på förväntad molekylvikt
Förberedelser
Alltså VAD och VARFÖR
Vi hjälper er med HUR!
51
Vi ses på lab!
Annica Blissing Amelie Wallenhammar Mikaela Eliasson