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INTRODUÇÃO À QUÍMICA
ALIMENTAR
Paulo Figueiredo
To my father...
Índice
Capítulo 1 – Nomenclatura em Química Orgânica 1
Capítulo 2 – Reactividade Química 10
Capítulo 3 – Ligações Químicas 14
Capítulo 4 – Cinética Química 17
Capítulo 5 – Qualidade dos Dados Analíticos 20
Capítulo 6 – Amostragem 24
Capítulo 7 – Proteínas 26
Capítulo 8 – Lípidos 41
Capítulo 9 – Hidratos de Carbono 58
Capítulo 10 – Água 70
Capítulo 11 – Vitaminas e Minerais 79
Capítulo 12 – Aditivos Alimentares 90
Capítulo 13 – Contaminantes Alimentares 94
Capítulo 14 – Aromas 102
Capítulo 15 – Técnicas de Separação 105
Capítulo 16 – Métodos Espectrométricos 126
Capítulo 17 – Ensaios Imunológicos 146
Capítulo 18 – Métodos de Análise em Biotecnologia 152
Bibliografia 156
Introdução à Química Alimentar 2009
1
Capítulo 1
Nomenclatura em Química Orgânica
A química orgânica estuda os compostos que contêm átomos de carbono
(Tabela 1.1). Apesar de existir um grande número de compostos orgânicos,
estes são constituídos por uma relativamente pequena quantidade de partes
semelhantes, combinadas de diversos modos, o que nos permite compará-los
entre si. Estas partes são denominadas grupos funcionais. A identificação
destes grupos funcionais e a capacidade de prever a reactividade de uma
molécula, tendo como base as propriedades dos seus grupos funcionais, são
uma das pedras basilares da química orgânica.
Tabela 1.1
Compostos orgânicos
Hidrocarbonetos Álcoois Éteres, aldeídos e cetonas Ácidos carboxílicos e ésteres Aminas e amidas Compostos aromáticos
Grupos funcionais são átomos, iões ou grupos de átomos específicos com
propriedades consistentes, caracterizados por possuirem uma composição
elementar e ligações específicas, as quais conferem uma dada reactividade à
molécula que os contém. Os principais grupos funcionais podem ser
encontrados na Tabela 1.2.
Um átomo de carbono saturado encontra-se ligado a 4 outros átomos e é
designado como tetravalente. Hidrocarbonetos insaturados possuem uma ou
mais ligações duplas (alcenos) ou triplas (alcinos) entre átomos de carbono.
As moléculas orgânicas podem exibir diversos tipos de isomerismo.
Isómeros conformacionais são formados por rotação das ligações simples C-C.
Estereoisómeros são moléculas com o mesmo padrão de ligações, mas cujos
átomos possuem diferentes arranjos espaciais. Existem 2 tipos de
estereoisómeros: enantiómeros e diastereómeros. Enantiómeros são como
imagens no espelho um do outro. Diastereómeros são isómeros que não são
imagens espelhadas um do outro.
Introdução à Química Alimentar 2009
Tabela 1.2
Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo
Álcool Hidroxilo ROH
Metanol
Aldeído Aldeído RCHO
Acetaldeído
Alcano Alquilo RHn
Metano
Alceno Alcenilo R2C=CR2
Etileno
Introdução à Química Alimentar 2009
Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo
Alcino Alcinilo RCɼCR’ Acetileno
Amida Carboxamida RCONR2
Acetamida
Aminas
Amina primária
RNH2 Metilamina
Amina secundária
R2NH
Dimetilamina
Amina terciária
R3N
Trimetilamina
Introdução à Química Alimentar 2009
Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo
Compostos azo Azo RN2R’
Alaranjado de
metilo
Ácido carboxílico Carboxilo RCOOH
Ácido acético
Éter Éter ROR’
Éter dietílico
Éster Éster RCOOR’
Butirato de etilo
Haleto de alquilo Haleto RX Cloroetano
Introdução à Química Alimentar 2009
Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo
Cetona Cetona RCOR’
Metil etil cetona
Peróxido Peroxi ROOR
Peróxido de di-tert-butilo
Derivados do benzeno
Fenilo RC6H5 Cumeno
Fosfato Fosfato ROP(=O)(OH)2
Gliceraldeído 3-fosfato
Tiol Sulfidrilo RSH
Mercaptoetanol
Introdução à Química Alimentar 2009
6
Diz-se que os enantiómeros possuem quiralidade, ou seja não têm um
plano de simetria, não podendo ser sobrepostos à sua imagem no espelho.
Num composto orgânico, qualquer átomo ligado a 4 átomos ou cadeias
diferentes pode ser considerado quiral.
Fig. 1.1 – Enantiómeros.
A configuração dos compostos orgânicos pode ser descrita segundo três
nomenclaturas, a actividade óptica, a configuração relativa (mais antigas e em
desuso) e a configuração absoluta.
Os isómeros ópticos recebem a designação (+) ou (-) consoante fazem
rodar o plano da luz polarizada no sentido dos ponteiros do relógio (+) ou no
sentido contrário (-). Também são utilizadas as designações dextrorotatório
para o isómero (+) e levorotatório para o (-).
A configuração relativa usa o gliceraldeído (o açúcar mais simples) como
modelo e designa as moléculas que rodam o plano da luz no sentido dos
ponteiros do relógio como D e as que a rodam no sentido contrário como L. De
notar que não existe relação entre as notações (+)/(-) e D/L, pois esta última
apenas refere se a estereoquímica do composto está relacionada com o
enantiómero dextrorotatório ou levorotatório do gliceraldeído.
Fig. 1.2 – Configurações relativas do gliceraldeído.
No caso dos aminoácidos existe uma regra empírica que facilita a
atribuição da designação D ou L. Se os substituintes COOH, R, NH2 e H
estiverem dispostos à volta do carbono quiral no sentido contrário ao dos
ponteiros do relógio, teremos um D-aminoácido; no caso contrário um L-
aminoácido (Figura 1.3).
Introdução à Química Alimentar 2009
7
Fig. 1.3 – Configurações relativas da alanina.
Na nomenclatura de configuração absoluta, os centros quirais são
designados R ou S, de acordo com um sistema em que é atribuída uma ordem
de prioridades aos seus substituintes, baseada no seu nº atómico. Deste modo,
não existe qualquer relação fixa com as duas outras nomenclaturas.
Fig. 1.4 – Notação R/S.
A nomenclatura R/S só se aplica no caso de ligações simples. Para o caso
de ligações duplas carbono-carbono, utiliza-se a notação cis/trans ou,
preferencialmente, a mais recente E-/Z-.
Fig. 1.5 – Alcenos com configurações cis/trans.
No caso de os dois átomos de carbono terem substituintes idênticos
(Figura 1.5) a designação cis corresponde a Z e a trans a E. Já no caso de os
substituintes serem diferentes, isso nem sempre corresponde à verdade. A
nomenclatura cis/trans apenas deverá ser utilizada se ambos os átomos de
carbono numa ligação dupla tiverem um átomo de H como substituinte.
Na Figura 1.6 está exemplificada a aplicação da nomenclatura E/Z.
Dividindo a ligação dupla em duas metades, atribuem-se prioridades (baseadas
no nº atómico) a cada par de substituintes. No caso de os substituintes com
Introdução à Química Alimentar 2009
8
igual ordem de prioridade serem simétricos relativamente ao corte imaginário, a
ligação será designada Z e se não forem simétricos E.
Fig. 1.6 – Aplicação da notação E-/Z- a alcenos.
De uma forma simples, considera-se que dois estereoisómeros são
diastereómeros se apenas um centro quiral diferir entre eles. Se uma molécula
tiver apenas um carbono assimétrico (estereocentro), ela exibirá duas formas
que serão imagens espelhadas uma da outra. Se a molécula tiver dois carbonos
assimétricos, existirão quatro configurações possíveis, sendo impossível que as
quatro sejam todas imagens no espelho umas das outras. Ou seja, quanto
maior o número de centros quirais numa molécula, mais provável é a existência
de confórmeros diferentes, e portanto de diastereómeros. O número de
confórmeros possíveis numa molécula quiral é 2n, onde n indica o nº de centros
quirais
Fig. 1.7 – Diastereómeros.
Os compostos aromáticos são um conjunto de moléculas estáveis, devido
ao total preenchimento e baixa energia dos seus orbitais ligantes, possuindo
4n+2 electrões . As ligações electrónicas estão dispostas numa forma cíclica.
A aromaticidade pode ser definida como uma propriedade química em que
um anel conjugado de ligações não saturadas, pares de electrões ou orbitais
vazias exibem uma estabilidade superior à resultante apenas do efeito de
conjugação. Tal é devido à capacidade que os electrões têm de circular por
todos os átomos, os quais estão ligados por ligações simples e duplas
alternadas. Estas ligações podem ser consideradas como híbridos de ligações
simples e duplas, sendo todas idênticas entre si.
Introdução à Química Alimentar 2009
9
A aromaticidade é regulada pela regra de Hückel, a qual diz que uma
molécula, para ser considerada aromática, terá que possuir um nº par de
electrões deslocalizados, mas esse número não poderá ser múltiplo de 4. A
regra indica que uma molécula aromática terá 4n+2 electrões , em que n =
0,1,2,3,…
Fig. 1.8 – Exemplos de moléculas aromáticas. Compostos cíclicos,
com 4n+2 electrões (n = 1, 2, 3, ...).
Introdução à Química Alimentar 2009
10
Capítulo 2
Reactividade Química
Existem diversos mecanismos de reacções com compostos orgânicos,
nomeadamente adição, eliminação, substituição e rearranjos. Muitas delas
ocorrem em alimentos antes ou durante o seu processamento.
Numa reacção de adição, 2 moléculas combinam-se para formar uma
única molécula maior. Existem dois tipos de adição: electrofílica e nucleofílica.
Uma adição nucleofílica é uma reacção em que existe a remoção de uma
ligação pela criação de duas novas ligações covalentes. Habitualmente, os
compostos aos quais é feita a adição possuem ligações carbono-carbono duplas
ou triplas.
Fig. 2.1 – Reacção de adição electrofílica.
Na adição nucleofílica, a ligação é removida pela criação de duas novas
ligações covalentes pela adição de um nucleófilo (substância doadora de um
par de electrões ligantes, numa ligação química). As reacções de adição
nucleófila estão limitadas a moléculas com ligações múltiplas carbono-carbono
ou carbono com outro átomo.
Fig. 2.2 – Reacção de adição nucleofílica.
O oposto de uma reacção de adição é uma reacção de eliminação. Nestas
reacções dois substituintes são removidos de uma molécula. A reacção pode
dar-se num único passo (E2) ou em dois passos (E1).
A eliminação bimolecular (E2) resulta na formação de uma ligação e os
dois grupos de partida (habitualmente um hidrogénio e um halogénio) terão
que ser coplanares. Neste caso, a quebra das ligações carbono-hidrogénio e
carbono-halogénio dá-se num único passo.
Introdução à Química Alimentar 2009
11
Fig. 2.3 – Exemplo de uma reacção de eliminação E2.
Na eliminação unimolecular E1 ocorre em primeiro lugar um passo de
ionização em que a quebra da ligação carbono-halogénio dá lugar à formação
de um carbocatião. No passo seguinte dá-se a desprotonação do carbocatião.
Fig. 2.4 – Exemplo de uma reacção de eliminação E1.
Numa reacção de substituição, um grupo funcional de uma molécula é
substituído por um outro grupo. Podem existir diversos tipos de substituição,
sendo as mais relevantes a substituição nucleofílica e a electrofílica.
A substituição nucleofílica pode por sua vez ser alifática ou aromática,
conforme a natureza da molécula que sofre a substituição. Neste tipo de
reacção, um nucleófilo liga-se a um átomo com carga positiva ou parcialmente
positiva. Este átomo (electrófilo) faz parte de um grupo de saída. Existem dois
possíveis mecanismos numa substituição nucleofílica, SN1 e SN2, em que 1 e 2
representam a ordem da cinética reaccional. Numa reacção SN2, a adição do
nucleófilo e a eliminação do grupo de saída ocorrem em simultâneo. Uma
reacção SN1 ocorre em dois passos.
Numa reacção de substituição electrofílica, um electrófilo desloca um
outro substituinte, frequentemente um hidrogénio. Este tipo de substituição é
característico de compostos aromáticos, embora também possa ocorrer em
compostos alifáticos. Neste tipo de reacção, é um composto electrofílico que
desloca um grupo funcional, podendo a reação ocorrer em dois passos (SE1) ou
num único passo (SE2). No mecanismo SE1, o substrato primeiro forma um
carbanião e um resíduo orgânico com carga positiva. Segue-se uma rápida
Introdução à Química Alimentar 2009
12
recombinação do carbanião com o electrófilo. No mecanismo SE2 existe um
único estado de transição, no qual coexistem a nova ligação e a antiga.
Fig. 2.5 – Exemplo de substituição nucleofílica.
Fig. 2.6 – Sequência de passos numa substituição electrofílica.
Existe um terceiro tipo de reacções de substituição, importante na química
alimentar, a substituição radicalar, a qual envolve uma sequência de 2 ou 3
passos. No 1º passo, a iniciação, é criado um radical livre. No passo final, ou
terminação, o radical reage com outra espécie radical, parando a cadeia
reaccional. No caso de a reacção não terminar, o radical continua a reagir,
originando novos radicais, disponíveis para novas reacções. Este passo
intermédio é designado propagação.
Introdução à Química Alimentar 2009
13
Fig. 2.7 – Mecanismo de reacção numa substituição radicalar.
Quando uma molécula orgânica sofre uma alteração, de modo a originar
um seu isómero estrutural, essa reacção é designada rearranjo.
Fig. 2.8 – Exemplo de uma reacção de rearranjo.
Introdução à Química Alimentar 2009
14
Capítulo 3
Ligações Químicas
As ligações químicas são responsáveis pelas interacções de atracção
entre átomos e moléculas. O conceito de ligação química está associado à
partilha de electrões entre os átomos participantes na ligação. Os electrões
sofrem uma atracção electromagnética dos núcleos atómicos, devido à
diferença de cargas eléctricas. Na formação de ligações químicas, alguns
electrões deslocam-se parcialmente de um átomo para outro(s). Esta
deslocação é favorecida por uma redução do estado de energia, causada por
um rearranjo das cargas, resultando numa redução da distância média entre os
electrões de todos os átomos ligados e os seus núcleos. A transferência de
carga provocada pelo movimento dos electrões, origina uma atracção
electromagnética entre os átomos participantes na ligação. É a esta força
atractiva entre átomos que se chama ligação química.
As ligações químicas podem ser divididas em covalentes e iónicas. Nas
primeiras, há uma partilha de electrões entre os átomos; nas segundas, um
conjunto de átomos possui um excesso de electrões, enquanto o outro tem
uma deficiência de electrões, havendo uma transferência de electrões entre
núcleos atómicos. Numa ligação iónica existe uma atracção electrostática entre
átomos ionizados.
Fig. 3.1 – Ligações químicas.
Introdução à Química Alimentar 2009
15
A teoria da ligação de valência diz que uma ligação química se forma
quando dois electrões de valência, nos seus respectivos orbitais atómicos,
colaboram para manter dois núcleos juntos, devido a um efeito de redução da
energia do sistema. Esta teoria baseia-se em 6 princípios:
1. A ligação entre um par de electrões forma-se devido à interacção entre
um electrão desemparelhado em cada um dos átomos.
2. Os spins dos electrões têm que ser opostos.
3. Uma vez emparelhados, os electrões não poderão participar noutra
ligação.
4. A transferência electrónica envolve apenas uma função de onda por cada
átomo.
5. Os electrões disponíveis no mais baixo nível energético formam as
ligações mais fortes.
6. Entre dois orbitais atómicos, aquele que consegue uma maior
sobreposição com um orbital de outro átomo formará a ligação mais
forte, a qual tenderá na direcção do orbital concentrado.
Fig. 3.2 – Ligação de valência em BF3: 3 orbitais sp2 do átomo de
Boro sobrepostos a 3 orbitais p, um por cada átomo de
Flúor.
Uma teoria alternativa, para explicar a natureza das ligações químicas, é a
teoria dos orbitais moleculares, a qual utiliza uma combinação linear de orbitais
atómicos para formar orbitais moleculares, os quais cobrem a totalidade da
molécula. Nesta teoria, os orbitais moleculares são divididos em orbitais
ligantes, anti-ligantes e não ligantes. Se os electrões de um orbital tiverem
maior probabilidade de se encontrar entre os núcleos atómicos que noutra
posição qualquer, o orbital será ligante. No caso contrário, o orbital molecular
será anti-ligante. Os orbitais ligantes reforçam a ligação e os anti-ligantes
enfraquecem-na. Num orbital não ligante, os electrões encontram-se em
orbitais mais próximos do núcleo e não influenciam a força da ligação química.
Introdução à Química Alimentar 2009
16
Fig. 3.3 – Orbitais moleculares na molécula de hidrogénio (H2).
As duas teorias são hoje em dia consideradas complementares.
As ligações covalentes e iónicas são ligações intramoleculares. As ligações
formadas entre duas ou mais moléculas são designadas ligações
intermoleculares. Exemplos comuns em química dos alimentos são interacções
entre dipolos e ligações de hidrogénio.
Introdução à Química Alimentar 2009
17
Capítulo 4
Cinética Química
A cinética química descreve a dependência da velocidade das alterações
químicas em função de condições como a concentração dos reagentes, a
temperatura, o pH e a força iónica. A velocidade da alteração é habitualmente
representada como dependente das concentrações dos reagentes elevadas a
uma potência.
velocidade = k[A]x[B]y (4.1)
Em 4.1, k é a constante de velocidade. A ordem da reacção (x+y) é igual
ao nº de moléculas envolvidas no passo mais lento (o que determina a
velocidade) da reacção. Em química alimentar, a generalidade das reacções são
descritas por cinéticas de ordem 0 ou 1. Numa sequência de reacções, é o
passo limitante que habitualmente determina a ordem da cinética. A velocidade
de uma reacção é influenciada pelo estado físico dos reagentes e suas
concentrações, pela temperatura à qual ocorre e pela presença ou não de
catalisadores.
Reacções ácidas, formação de sais e permutas iónicas são reacções
rápidas. Pelo contrário, quando são formadas ligações covalentes ou grandes
moléculas, as reacções tendem a ser lentas. Quando os reagentes estão no
mesmo estado, o movimento térmico coloca-os em contacto mas, quando estão
em diferentes fases, a reacção está limitada pela interface existente entre os
reagentes.
Segundo a teoria das colisões, as moléculas têm que colidir para reagirem.
Nessa perspectiva, quanto maior a concentração dos reagentes, maior a
frequência das colisões entre si. A frequência das colisões também aumenta
com a temperatura. No entanto, existe uma mais importante dependência
cinética da temperatura, dado que a energia térmica de uma molécula aumenta
com a temperatura. Desse modo, ao aumentar a temperatura, aumenta o teor
de moléculas de reagente com energia suficiente para reagir, ou seja energia
mais elevada que a energia de activação (Ea).
A energia de activação, expressa pela equação de Arrhenius (4.2) indica
que a constante de velocidade (k) depende da temperatura T (em graus
Introdução à Química Alimentar 2009
18
Kelvin). Nesta equação, A é o factor de frequência e R a constante universal
dos gases.
lnak
E RTA
(4.2)
A velocidade de uma reacção químicapode ser alterada através da
utilização de substâncias chamadas catalisadores. Um catalisador é uma
substância que modifica o estado de transição de uma reacção, de modo a
reduzir a energia de activação, aumentando a velocidade da reacção, mas não
sendo consumido por esta.
Fig. 4.1 – Diferenças na energia de activação de uma reacção na
ausência (——) e na presença (----) de um catalisador.
Enquanto a cinética química descreve a velocidade das reacções químicas,
a termodinâmica química determina a extensão dessas reacções. Numa reacção
reversível, alcança-se o equilíbrio químico quando as velocidades das reacções
directa e inversa são iguais e as concentrações de reagentes e produtos deixam
de variar. De uma forma geral, a variação de energia livre (G) de uma reacção
determina a ocorrência de uma transformação química e a cinética descreve a
velocidade dessa reacção. Uma reacção pode ser fortemente exotérmica e ter
uma variação de entropia positiva, mas na prática não ocorre porque é
demasiado lenta. Se um reagente tiver capacidade de originar dois produtos
diferentes, será formado o que for termodinamicamente mais estável, excepto
em circunstâncias especiais, caso em que se diz que a reacção está sob
controlo cinético.
A energia livre de Gibbs é a energia, associada a uma reacção química,
que pode ser utilizada para produzir trabalho. É definida pela equação (4.3) em
que G é a variação na energia livre de Gibbs, H é a variação de entalpia, T a
temperatura absoluta e S a variação em entropia. Quando G < 0 a reacção é
Introdução à Química Alimentar 2009
19
espontânea, se G > 0 a reacção é não espontânea e se G = 0 estamos em
condições de equilíbrio (nem a reacção directa nem a inversa são favorecidas).
G = H – TS (4.3)
A expressão 4.4 relaciona a constante de equilíbrio com a energia livre de
Gibbs. G0 representa a energia livre de Gibbs no equilíbrio.
0G
RTeqK e
(4.4)
Introdução à Química Alimentar 2009
20
Capítulo 5
Qualidade dos Dados Analíticos
É necessária uma atitude crítica relativamente aos resultados analíticos,
de modo a compreender o seu significado e as suas limitações. A precisão
depende do método utilizado e só pode ser melhorada até um certo ponto. Para
obter um compromisso aceitável entre a qualidade dos resultados e o tempo do
analista, é necessário conhecer a natureza e origem dos erros produzidos. Tal é
possível através do uso de métodos estatísticos, tornados mais úteis devido à
utilização conjunta de técnicas informáticas. Esta manipulação de dados é
designada por quimiometria.
Definem-se de seguida alguns conceitos básicos da quimiometria:
Exactidão (accuracy) – proximidade de uma medida ou resultado
ao seu verdadeiro valor. Expressa em termos de erro.
Erro – a diferença entre o resultado verdadeiro e o resultado
medido. Deve ser expresso como erro absoluto, a diferença real
entre o verdadeiro valor e o valor medido, nas mesmas unidades.
Por vezes apresentado como erro relativo, ou seja uma
percentagem do valor medido relativamente ao verdadeiro.
Média – média aritmética de um conjunto de medidas (replicadas).
Precisão – a variabilidade de uma medida. Pode ser expressa em
termos absolutos ou relativos. O desvio padrão é o melhor
indicador da precisão.
Desvio padrão () – calculado a partir da expressão 5.2 em que xi é
um resultado medido, N é o número de replicadas e x é a média
dessas replicadas. Para um elevado número de amostras usa-se N
e para um pequeno número (30 ou menos) usa-se N-1.
2
1
1 N
i
i
xN
(5.1)
2
1
1
1
N
i
i
s x xN
(5.2)
Desvio padrão relativo (coeficiente de variação) – usado para
comparar precisões.
Introdução à Química Alimentar 2009
21
100sCV
x
(5.3)
Variância – é o quadrado do desvio padrão. A sua utilidade prática
advém do facto de os valores serem aditivos.
2 2 2 2
x y z x y zs s s s (5.4)
Fig. 5.1 – Ilustração dos conceitos de excatidão e precisão. a) boa
exactidão e boa precisão; b) boa precisão e má
exactidão; c) boa exactidão e má precisão; d) má
exactidão e má precisão.
Consoante a sua origem, os erros podem ser classificados como
determinados ou indeterminados. Os primeiros podem ser quantificados e
corrigidos; os segundos são aleatórios, não podendo ser quantificados. Os erros
têm como habitual origem: o operador, o equipamento ou o método. Podem
ser detectados pela análise de brancos ou de padrões ou ainda análises
independentes, utilizando métodos diferentes ou alternativos.
Na avaliação da qualidade dos dados analíticos é importante conhecer a
sensibilidade e o limite de detecção do equipamento. A sensibilidade está
relacionada com a dimensão da variação do equipamento em resposta à
variação na concentração do composto. Dá indicação da variação que se pode
fazer na composição da amostra até ser notada uma alteração na resposta do
equipamento. O limite de detecção é o menor incremento detectável com um
determinado grau de confiança (geralmente 1%).
Para avaliar a qualidade dos métodos utilizados e dos resultados obtidos
deve proceder-se a uma análise estatística desses resultados. Um número
mínimo de vinte e cinco replicadas deve ser usado, de modo a obter uma
amostra estatisticamente representativa. Como este número é difícil de atingir,
quer do ponto de vista prático, quer económico, terão que ser utilizados
métodos estatísticos eficazes com menor número de dados.
Os resultados são apresentados com um certo número de algarismos
significativos. Num número, todos os algarismos conhecidos com rigor mais o
primeiro algarismo incerto, constituem os algarismos significativos desse
Introdução à Química Alimentar 2009
22
número. Por exemplo, numa medida de 1.0421 g, com rigor de 0.0001 g, há
cinco algarismos significativos. Se a medida fosse de 0.0421 g, teríamos três
algarismos significativos, para o mesmo rigor, pois o 0 só é considerado
significativo quando faz parte do número. Quando um resultado é obtido por
adição ou subtracção de dois valores, os algarismos significativos são
determinados a partir das incertezas absolutas. Considere-se a adição de
155.50.1 e 0.0850.001, cujo resultado é 155.585. A incerteza surge no
quarto algarismo, portanto o resultado deveria ser apresentado como 155.6. No
caso do resultado ser obtido a partir de uma multiplicação ou divisão, os
algarismos significativos são determinados a partir da incerteza relativa do valor
menos rigoroso. Nos dois valores anteriores, 0.085 tem a maior incerteza
relativa (12 ppm), logo o produto 155.5 x 0.085 = 13.3275 tem um desvio
absoluto de 13.3275 x 0.012 = 0.16. Aqui a incerteza aparece no terceiro
algarismo e o resultado deveria ser apresentado como 13.3.
Em análise quantitativa exige-se que uma medida analítica exiba uma
proporcionalidade rigorosa e fiável relativamente à composição da amostra.
Para estabelecer essa proporcionalidade, é necessário efectuar procedimentos
de calibração. Numa calibração simples, é preparada uma gama de padrões,
contendo diversas concentrações do analito em estudo. Estes padrões são
analisados segundo um método padrão e é obtida uma curva de calibração
sinal vs. quantidade do analito. A partir deste gráfico podem interpolar-se os
valores das amostras desconhecidas.
Fig. 5.2 – Exemplo de uma curva de calibração.
Uma boa curva de calibração deverá ser linear numa gama alargada de
concentrações. Idealmente deverá passar pela origem, mas não é obrigatório
que tal aconteça.
Introdução à Química Alimentar 2009
23
O coeficiente de correlação r define o ajuste dos dados a uma linha recta.
É dado por
2 2
i i
i i
x x y yr
x x y y
(5.5)
O valor de r deverá ser o mais próximo possível de +1.000 ou -1.000,
valores que correspondem a uma correlação perfeita.
O coeficiente de determinação r2 dá uma melhor percepção do ajuste dos
dados.
Introdução à Química Alimentar 2009
24
Capítulo 6
Amostragem
Dada a impossibilidade de analisar todos os componentes de um dado
lote para avaliar a sua qualidade ou outros parâmetros, é seleccionada uma
parte do todo e considera-se que esta porção é representativa da totalidade do
produto. A obtenção de uma porção, ou amostra, representativa do todo, é
designada por amostragem e a quantidade total da qual foi retirada a amostra
é chamada população.
Os dois objectivos primários da amostragem são o cálculo do valor médio
de uma característica e determinar se esse valor médio respeita as
especificações definidas no plano de amostragem.
As regras para amostragem em alimentos específicos estão delineadas em
guias como Official Methods of Analysis da AOAC International, de modo a
poderem ser executadas pelos analistas em condições que validem os dados
obtidos.
Uma população ideal seria uniforme e idêntica em todas as circunstâncias,
designando-se por homogénea. A amostragem em tal população é simples,
podendo uma amostra ser tirada aleatoriamente, sendo os dados obtidos
sempre representativos do todo. No entanto, a maioria das populações são
heterogéneas, tendo a amostragem que ter tal facto em consideração.
A amostra deve ser retirada de diversos locais numa população, para
garantir a sua representatividade. Para líquidos deve agitar-se antes de retirar a
amostra. Para sólidos, devem retirar-se amostras de vários pontos.
O tamanho óptimo de uma amostra, para obter representatividade, pode
ser determinado através de análise estatística, usando o teste de t. O tamaho
da amostra depende da exactidão requerida.
Se o tamanho de partícula da amostra for demasiado grande para a
análise pretendida, ele terá de ser reduzido. A amostra poderá ser dividida em
quartos e serem utilizados os dois quartos opostos.
Muitas amostras requerem trituração para assegurar uma análise mais
rigorosa. Existem diversos instrumentos para triturar alimentos, adaptados aos
diversos tipos de amostras. A trituração de amostras húmidas pode provocar
Introdução à Química Alimentar 2009
25
perca de humidade e alterações químicas. A congelação ou a secagem das
amostras pode reduzir estas percas e devem ser efectuadas sempre que
possível. Por outro lado, o processo de trituração não deverá provocar
aquecimento da amostra e o contacto da amostra com superfícies metálicas
deverá ser evitado, se a amostra se destinar à análise de minerais.
Um mau armazenamento das amostras pode também ser um factor de
erro para os dados analíticos obtidos. As amostras devem estar protegidas dos
factores ambientais (humidade, ar, luz, calor) que as possam afectar. Em
alguns casos poderão ser utilizados conservantes para proteger amostras de
alimentos.
Muitos alimentos contêm enzimas, as quais podem causar degradação dos
componentes a analisar. Por esse motivo, a actividade enzimática deve ser
eliminada ou controlada antes da análise, através de métodos seleccionados de
acordo com as características do alimento. Os métodos mais comuns são
desnaturação e inactivação das enzimas a temperatura elevada ou limitação da
sua actividade por congelação, podendo também ser utilizada a alteração do pH
ou adição de agentes redutores no caso das enzimas com actividade oxidante.
Os alimentos com teor elevado de gordura apresentam maiores
dificuldades para preparação de amostras. A sua trituração é difícil, requerendo
frequentemente prévia congelação e os lípidos insaturados são sensíveis à
oxidação, necessitando armazenamento em vácuo ou sob atmosfera de azoto.
Poderão ser-lhes adicionados antioxidantes, desde que não interfiram com a
análise.
Introdução à Química Alimentar 2009
26
Capítulo 7
Proteínas
As proteínas são grandes moléculas orgânicas, compostas por
aminoácidos ligados entre si. Estas ligações peptídicas (Fig. 7.1) são formadas
entre os grupos carboxilo e amino de dois aminoácidos adjacentes. Dos cerca
de 500 aminoácidos encontrados na natureza, apenas 20 aminoácidos
diferentes são capazes de formar proteínas. A composição em aminoácidos de
uma proteína determina o valor biológico desta, de onde a importância do
desenvolvimento de métodos analíticos que permitam a identificação dos
aminoácidos resultantes da hidrólise de uma proteína.
10 ou 11 destes 20 aminoácidos não são sintetizados pelo organismo
humano, sendo apenas adquiridos através da dieta, daí resultando a sua
classificação como aminoácidos essenciais.
Fig. 7.1 – Reacção de condensação entre 2 aminoácidos,
originando uma ligação peptídica.
As diferentes características químicas destes aminoácidos (Fig. 7.2) estão
na base da estrutura tridimensional das proteínas e da sua função. A estrutura
das proteínas pode ser classificada como:
primária – uma sequência de aminoácidos
secundária – estruturas regularmente repetidas estabilizadas por
ligações de hidrogénio. Adoptam a conformação de hélice alfa ou
folha beta
terciária – formação de um núcleo hidrofóbico, estabilizado por
pontes salinas, ligações de hidrogénio, pontes bissulfito e
modificações pós-translacionais
quaternária – interacções entre várias proteínas
Em função da sua estrutura, as proteínas podem ser classificadas como
fibrosas ou globulares (Fig. 7.3). As proteínas fibrosas, apenas encontradas em
animais, são insolúveis em água devido à sua estrutura secundária e possuem
Introdução à Química Alimentar 2009
27
funções de armazenamento ou usadas em tendões, músculos e ossos. As
proteínas globulares são hidrossolúveis, devido a possuirem estrutura terciária e
desempenham diversas funções nos organismos, entre as quais hormonal e
enzimática.
Fig. 7.2 – Estruturas químicas dos 20 aminoácidos componentes
das proteínas.
As proteínas sofrem desnaturação quando expostas a temperaturas
elevadas, alterações de pH, de força iónica ou de solvente e ainda a
manipulações intensas, como por exemplo durante o processamento de alguns
alimentos. A desnaturação proteica consiste na perca da sua estrutura.
Introdução à Química Alimentar 2009
28
Fig. 7.3 – Estruturas proteicas.
A análise de proteínas nos alimentos é relevante para a correcta
rotulagem das embalagens, para a investigação das suas propriedades
funcionais e para a determinação da sua actividade biológica. Existem métodos
analíticos que podem ser aplicados quando se pretende determinar o teor
proteico total, o teor de uma dada proteína, o teor proteico durante o
isolamento e purificação de uma dada proteína, o teor de azoto não proteico, a
composição em aminoácidos e o valor nutritivo de uma proteína.
O método de Kjeldahl permite determinar o teor de azoto orgânico total
de um alimento. Todos os compostos orgânicos são digeridos com ácido
sulfúrico, na presença de catalisadores e o azoto orgânico total é convertido em
sulfato de amónio. O material digerido é neutralizado com uma base e destilado
numa solução de ácido bórico. Os aniões borato formados são titulados com
uma solução padrão de ácido, obtendo-se o teor de azoto na amostra. Este
Introdução à Química Alimentar 2009
29
resultado pode ser relacionado com o teor proteico na amostra, através de um
factor de conversão.
As amostras usadas têm que ser trituradas e homogeneizadas. A digestão
é feita com auxílio de catalisadores e resulta na formação de sulfato de amónio.
O carbono e o hidrogénio presentes são convertidos em CO2 e H2O.
Proteína ɹ (NH4)2SO2 (7.1)
Depois de diluir o material digerido com água, adiciona-se tiossulfato de
sódio em meio básico, para neutralizar o ácido sulfúrico. A amónia formada é
destilada numa solução de ácido bórico, contendo indicadores.
(NH4)2SO4 + 2NaOH ɹ 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O (7.2)
NH3 + H3BO3 ɹ NHŸ + H2BO„ (7.3)
O ião borato (quantidade proporcional à de azoto) é titulado com uma
solução padrão de HCl, permitindo calcular o número de moles de N na
amostra, o qual é igual ao número de moles de NH3, que por sua vez é igual ao
de HCl.
H2BO„ + H+ ɹ H3BO3 (7.4)
Deve ser feito um branco para subtrair o teor de azoto dos reagentes
daquele da amostra.
Vol. ácido corrigido 14 g N%N = N HCl x x x 100
peso da amostra (g) mol (7.5)
Nesta fórmula N HCl é a concentração de HCl em mol.L-1, o volume de ácido
corrigido corresponde ao volume de HCl gasto para titular a amostra menos o
gasto para titular o branco e 14 é a massa atómica do azoto.
Utiliza-se um factor de correcção para converter a percentagem de azoto
em percentagem de proteína. Como a maioria das proteínas contém 16% de
azoto, normalmente esse factor é de 6.25 (100/16=6.25). Estão publicados
factores de conversão específicos para diversos alimentos, encontrando-se
alguns dos quais expressos na Tabela 7.1.
Este é um método aplicável a todo o tipo de alimentos, barato e exacto
mas algo lento e requer manipulação de reagentes corrosivos.
O método de Kjeldahl tem sofrido modificações que permitem um
aumento da sua eficácia e também uma automação ou semi-automação das
medidas e também a sua utilização para medir teores na ordem dos g.
Introdução à Química Alimentar 2009
30
Tabela 7.1
Alimento Factor
Ovos ou carne 6.25 Lacticínios 6.38 Trigo 5.70 Outros cereais e oleaginosas 6.25 Amêndoas 5.18 Amendoins 5.46 Coco 5.30
Um método alternativo, que também mede o azoto orgânico total, é o de
Dumas. Neste processo, as amostras são pesadas e introduzidas num reactor
de combustão. O azoto libertado é medido num cromatógrafo gasoso que lhe
está anexo. O método de Dumas também se aplica a todos os alimentos, mas é
mais rápido e permite automação, tendo ainda a vantagem de não utilizar
reagentes perigosos. Para calcular o teor proteico dos alimentos é necessário
recorrer aos mesmos factores de conversão usados no método de Kjeldahl.
O teor proteico pode também ser determinado através da espectroscopia
no infravermelho, tendo por base o princípio de que diferentes grupos
funcionais numa amostra absorvem radiação a diferentes frequências. No caso
das proteínas utilizam-se as bandas de absorção características das ligações
peptídicas (6.47 m, 3300-3500 nm, 2080-2220 nm e 1560-1670 nm),
permitindo calcular a concentração proteica. Este método é aplicável a uma
vasta gama de alimentos e as análises são rápidas, mas tem a desvantagem de
requerer uma calibração prévia do equipamento, que poderá ser demorada.
O método do biureto é um processo químico que permite determinar a
concentração de proteínas num alimento, baseado no princípio de que
substâncias contendo ligações peptídicas reagem com iões Cu2+ em meio
básico. A absorvância da cor produzida pode ser medida a 540 nm e a sua
intensidade é prporcional à concentração de proteínas na amostra.
O reagente do biureto (inclui sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio
e potássio, usado para estabilizar os iões Cu2+ em meio básico) é adicionado a
uma solução da proteína e após estabilização durante 15-30 minutos à
temperatura ambiente mede-se a absorvância relativamente a um branco do
reagente. No caso de a mistura reaccional não se apresentar límpida é
necessário efectuar uma centrifugação ou filtração da mesma, antes de ler a
absorvância. Para obter a concentração proteica é necessário obter
previamente uma curva padrão, usando para o efeito albumina do soro bovino
(BSA).
Introdução à Química Alimentar 2009
31
Fig. 7.4 – Método do biureto. À direita água com reagente do
biureto; à esquerda alteração de cor produzida quando
se adiciona o reagente a uma proteína.
Este método pode ser usado para determinar concentrações de proteínas
em cereais, carnes e soja e como método qualitativo em rações para animais.
Este é um dos métodos mais simples para análise de proteínas, sendo
mais barato e mais rápido que o de Kjeldahl e tem poucos interferentes. As
principais desvantagens são uma menor sensibilidade que outros métodos e
necessidade de pelo menos 2-4 mg de proteína. Para utilizar como método
quantitativo é necessário comparar os valores obtidos com uma curva padrão.
O método de Lowry é um procedimento que combina a reacção do biureto
com a redução do reagente de Folin-Ciocalteau por resíduos de tirosina e
triptofano das proteínas. Forma-se uma cor azulada que pode ser medida a
750 nm (elevada sensibilidade para baixas concentrações de proteína) ou a
500 nm (baixa sensibilidade para elevadas concentrações de proteína).
As proteínas a determinar são inicialmente diluídas para garantir uma
gama de absorvâncias apropriada, de seguida é-lhes adicionada uma solução
de tartarato de sódio e potássio e carbonato de sódio. Após incubar 10 minutos
à temperatura ambiente, adiciona-se uma solução de sulfato de cobre-tartarato
de sódio e potássio-hidróxido de sódio, deixando-se de novo à temperatura
ambiente durante 10 minutos. Adiciona-se o reagente de Folin-Ciocalteau,
sendo a mistura incubada a 50 ºC durante 10 minutos. Lê-se a absorvância a
650 nm (modificação do método original) e comparam-se os valores obtidos
com os de uma curva padrão obtida com BSA.
É um método muito sensível e mais específico que a maioria dos outros e
é bastante rápido, no entanto apenas funciona com proteínas previamente
extraídas do alimento e pode ser afectado pela presença de interferentes como
sejam alguns açúcares, lípidos e tampões.
Introdução à Química Alimentar 2009
32
O método de Bradford é outro método colorimétrico para determinação do
teor proteico, baseado na mudança de cor de um reagente (azul brilhante de
Coomassie) de vermelho para azul, quando se liga a proteínas. O seu máximo
de absorvância muda de 465 nm para 595 nm e a intensidade a este último
comprimento de onda é proporcional à concentração de proteína na amostra.
Este método, tal como outros semelhantes, tira partido da natureza
anfotérica das proteínas. Quando a solução que contém a proteína é acidificada
a um pH inferior ao valor do seu ponto isoeléctrico (pI) o pigmento forma uma
ligação electrostática.
Para efectuar a determinação de proteínas por este método, o pigmento é
dissolvido em 95% de etanol e acidificado com 85% de ácido fosfórico, sendo
de seguida adicionado a soluções contendo a proteína e um padrão (BSA). Lê-
-se a absorvância a 595 nm contra um branco do reagente e a concentração da
proteína é calculada a partir da curva padrão para a BSA.
O método de Bradford é muito usado em purificação de proteínas, devido
à sua rapidez, sensibilidade e existência de poucos interferentes. Alterações ao
procedimento original permitem a determinação de g de proteínas.
A capacidade que as proteínas possuem de reduzir iões Cu2+ a iões Cu+ é
utilizada no método do ácido bicinchoninico (BCA) para a sua determinação
quantitativa. O reagente BCA (sal de sódio do BCA, carbonato de sódio, NaOH e
sulfato de cobre) é adicionado à solução de proteína, deixa-se incubar a 37 ºC
durante 30 minutos (ou à temperatura ambiente durante 2 h ou ainda a 60 ºC
durante 30 minutos) e lê-se a absorvância a 562 nm contra um branco do
reagente. A quantificação é feita a partir de uma curva padrão obtida com BSA.
O método pode ser adaptado para medir g. A sua principal desvantagem
reside no facto de outros compostos com capacidade de reduzir o cobre
(açúcares redutores, …) poderem interferir.
As proteínas exibem uma forte absorvância a 280 nm, devido à presença
dos aminoácidos triptofano e tirosina. Como o teor destes aminoácidos nas
proteínas dos alimentos é razoavelmente constante, a absorvância a 280 nm
pode ser usada para calcular a concentração de proteínas, através da lei de
Beer. Como a composição das diversas proteínas é diferente, é necessário
conhecer o seu coeficiente de extinção molar, de modo a determinar a sua
concentração.
Para proceder à análise, as proteínas têm que ser dissolvidas num tampão
ou numa base, sendo aplicável com maior eficácia a proteínas previamente
extraídas dos alimentos. Pode sofrer interferências da presença de ácidos
Introdução à Química Alimentar 2009
33
nucleicos, os quais também absorvem a 280 nm. É um método rápido e
relativamente sensível. Não destruindo a amostra, pode utilizar-se a proteína
para posteriores análises.
A maioria das técnicas utilizadas para separação de proteínas explora as
diferenças em tamanho, solubilidade e carga, as características de adsorção e a
afinidade biológica para outras moléculas.
A separação por precipitação explora as diferenças de solubilidade das
proteínas. Estas são determinadas pelo tipo e carga dos aminoácidos
componentes. As proteínas podem ser selectivamente precipitadas alterando o
pH, força iónica, constante dieléctrica, ou temperatura. Este é um processo
habitualmente utilizado nas fases iniciais de uma sequência de purificação e
apresentam maiores vantagens quando se trabalha com grandes quantidades
de material.
Sais neutros podem ser usados para aumentar a força iónica do meio e
precipitar proteínas. O mais usado é o sulfato de amónio, sendo alternativas
NaCl, KCl ou outros. Este processo é designado salting out e desenrola-se em
dois passos. Primeiro adiciona-se (NH4)2SO4 numa concentração ligeiramente
inferior à necessária para precipitar a proteína (quando a solução é
centrifugada, as proteínas menos solúveis são precipitadas, enquanto a
proteína de interesse permanece em solução) e depois adiciona-se (NH4)2SO4
até perfazer uma concentração imediatamente superior à necessária para
precipitar a proteína de interesse (quando a solução é centrifugada, a proteína
precipita e as outras mais solúveis permanecem no sobrenadante).
O ponto isoeléctrico (pI) de uma proteína corresponde ao pH ao qual uma
proteína em solução não possui carga. As proteínas formam agregados e
precipitam a esse valor devido à não existência de repulsão electrostática entre
elas. Como as proteínas possuem diferentes valores de pI, podem ser
separadas ajustando o pH da solução.
A solubilidade de uma proteína a um dado pH e força iónica depende da
constante dieléctrica da solução. Esta propriedade serve de base à separação
de proteínas por fraccionamento em misturas de água e solventes orgânicos. A
adição de solventes miscíveis com água (etanol, acetona) reduz a constante
dieléctrica da água e reduz a solubilidade da maioria das proteínas.
Muitas proteínas desnaturam e precipitam quando aquecidas ou
submetidas a valores de pH muito altos ou muito baixos. As proteínas que são
estáveis a temperaturas elevadas ou a valores extremos de pH podem ser
separadas das restantes.
Introdução à Química Alimentar 2009
34
A cromatografia de adsorção é usada na separação de proteínas, tendo
por base a diferente afinidade das proteínas para a fasee estacionária ou para o
eluente. As cromatografias de afinidade e de permuta iónica usam esta
propriedade para separar proteínas.
A cromatografia de permuta iónica é a técnica de separação de proteínas
mais utilizada, sendo usadas sobretudo resinas aniónicas (com carga positiva).
A proteína de interesse é adsorvida à resina sob condições tampão (força iónica
e pH) que maximizem a afinidade da proteína para a resina. As restantes
proteínas, tendo cargas diferentes, não são adsorvidas. As proteínas que ficam
ligadas à resina são depois eluídas por alteração gradual do pH ou da força
iónica do eluente.
Na cromatografia de afinidade, a proteína é separada numa fase
estacionária contendo um ligando covalentemente ligado ao suporte sólido. Os
ligandos usados incluem inibidores enzimáticos, substratos enzimáticos,
coenzimas, anticorpos e alguns pigmentos. A proteína é eluída sob condições
tampão (pH, força iónica, temperatura e concentração proteica) que
maximizem a ligação da proteína ao ligando. As restantes proteínas e outras
moléculas que não se ligam ao ligando são eluídas. No final, a proteína ligada
será eluída da coluna alterando as condições de pH, temperatura ou
concentração do sal ou do ligando no tampão usado como eluente.
Fig. 7.5 – Separação de proteínas utilizando a cromatografia de
afinidade.
Esta técnica é muito eficaz na separação de proteínas, mas apresenta a
desvantagem da necessidade de utilização de fases estacionárias caras.
Introdução à Química Alimentar 2009
35
Diversos métodos cromatográficos para separação de proteínas foram
adaptados para utilização em sistemas de HPLC.
As proteínas podem ser separadas com base no seu raio de Stokes, o raio
médio da proteína em solução, o qual depende da conformação da proteína.
Uma das técnicas que tem em conta essa propriedade para separar
proteínas é a diálise. São utilizadas membranas semi-permeáveis, as quais
apenas permitem a passagem de pequenas moléculas. Coloca-se uma solução
contendo a proteína num tubo de diálise, o qual é colocado num grande volume
de água ou de tampão, sob agitação suave. Os solutos de baixo peso molecular
saem para fora do tubo, enquanto o tampão entra. Este método é simples mas
demorado (12 h ou mais).
Fig. 7.6 – Separação de proteínas utilizando o processo de diálise.
Um processo alternativo e mais rápido passa pela utilização de
membranas de ultrafiltração, estando a sua utilização quase restrita a
laboratórios de investigação.
A cromatografia de exclusão molecular é outra técnica utilizada para
separação de proteínas, esta baseada no seu tamanho. Uma solução contendo
a proteína elui através de um suporte sólido poroso. As moléculas maiores que
os poros são excluídas, atravessando rapidamente a coluna. As moléculas de
menores dimensões são retidas nos poros, eluindo muito lentamente. Moléculas
de tamanhos intermédios interagem parcialmente com o suporte e eluem a
tempos intermédios. Deste modo, a ordem de eluição segue a diminuição do
tamanho da molécula.
Existem suportes com diversas dimensões de poro, podendo ser utilizados
para fraccionar eficazmente proteínas.
Introdução à Química Alimentar 2009
36
Esta técnica também pode ser utilizada para calcular pesos moleculares de
proteínas, fazendo eluir em conjunto proteínas de peso desconhecido e padrões
de peso molecular conhecido. Um gráfico do volume de eluição para cada
proteína em função do logaritmo do seu PM dá uma recta.
A electroforese permite separar proteínas a partir de uma mistura
complexa, por migração diferencial destas através de uma matriz sólida, à qual
é aplicado um campo eléctrico. A técnica mais utilizada para separar proteínas é
a electroforese de zona e os géis de poliacrilamida, as matrizes mais utilizadas.
A separação depende da fricção da proteína na matriz e da sua carga, de
acordo com:
tensão aplicada x carga da moléculaMobilidade =
fricção da molécula (7.6)
Uma proteína apresenta carga negativa se o pH da solução for superior ao
seu pI e carga positiva se o pH for inferior ao seu pI. A dimensão da carga e a
tensão aplicada determinarão a extensão da migração da proteína num campo
eléctrico. Quanto mais alta a tensão aplicada e mais forte a carga da proteína,
maior a migração. A migração também depende do tamanho e forma da
molécula, ou seja do raio de Stokes da proteína. Um aumento do raio de Stokes
origina um aumento da fricção e uma redução da mobilidade. Deste modo, as
proteínas mais pequenas tendem a migrar mais rapidamente. Finalmente, uma
redução no tamanho do poro do gel provoca uma redução na mobilidade.
Fig. 7.7 – Separação de proteínas por electroforese em gel.
Na electroforese não desnaturante, as proteínas são separadas na sua
forma nativa com base na carga, tamanho e forma da molécula. Na
electroforese com desnaturação (ou SDS-PAGE), utiliza-se um gel de
poliacrilamida e um detergente aniónico (dodecil sulfato de sódio - SDS) para
separar proteínas com base no seu tamanho. As proteínas, depois de reagir
com um agente redutor (adicionado en conjunto com o detergente), ligam-se
Introdução à Química Alimentar 2009
37
ao SDS e adquirem carga negativa, sendo depois separadas em função do seu
tamanho. Adiciona-se habitualmente um corante (azul de bromofenol) à
solução contendo a proteína. Sendo uma molécula pequena, o corante migra à
frente das proteínas e permite seguir o andamento da migração. Após concluída
esta, o gel é corado de maneira a permitir a visualização das bandas das
proteínas. A mobilidade relativa de cada proteína é calculada por comparação
com a do corante.
m
distância percorrida pela proteína=
distância percorrida pelo coranteR (7.7)
O peso molecular pode ser determinado por esta via, relacionando o Rm
de uma proteína com os Rm de proteínas padrão, de PM conhecido. Traça-se
um gráfico dos logaritmos dos PM dos padrões em função dos seus Rm e usa-se
esse gráfico para extrapolar os PM das proteínas desconhecidas.
A focagem isoeléctrica é uma modificação da electroforese em que as
proteínas são separadas, de acordo com a sua carga, num campo eléctrico
aplicado a um gel, no qual se produziu um gradiente de pH. As proteínas
migram para o local em que o pH do gel iguala o seu pI. Esta é uma das
técnicas de separação de proteínas com melhor resolução.
Fig. 7.8 – Princípio de separação de proteínas por focagem
isoeléctrica.
A focagem isoeléctrica e o SDS-PAGE podem ser combinados na
electroforese em duas dimensões, muito útil para separar misturas muito
complexas de proteínas. As proteínas são primeiro separadas por focagem
Introdução à Química Alimentar 2009
38
isoeléctrica, com base na sua carga, sendo depois separadas por SDS-PAGE,
segundo os seus tamanho e forma.
Fig. 7.9 – Electroforese em duas dimensões de proteínas.
A electroforese capilar partilha dos mesmos princípios que a electroforese
convencional, quando aplicada à separação de proteínas. A principal diferença é
a utilização de um tubo capilar no lugar de um gel. O principal factor de
separação é o fluxo electroosmótico gerado no interior do tubo.
O sistema (Fig. 7.10) é composto por um tubo capilar, dois reservatórios
com tampões, uma fonte eléctrica e um detector. As proteínas, depois de
separadas são analisadas por detectores de absorção electrónica (os mais
comuns), fluorescência ou condutividade eléctrica, semelhantes aos utilizados
em HPLC.
Fig. 7.10 – Esquema de um equipamento de electroforese capilar.
Introdução à Química Alimentar 2009
39
Existem três variantes de electroforese capilar, aplicadas à separação de
proteínas: electroforese capilar de zona, electroforese capilar com SDS e
focagem isoeléctrica capilar.
A electroforese capilar de zona é semelhante à electroforese em gel
clássica, exceptuando que as proteínas são separadas no interior de tubos
capilares cheios com um tampão do pH desejado. a parede interna do capilar
possui carga negativa e atrai catiões do tampão para formar uma dupla camada
iónica na interface entre o capilar e o tampão. Quando se aplica um campo
eléctrico, esses catiões são atraídos para o cátodo e “puxam” as outras
moléculas na mesma direcção. Isto permite que catiões, aniões e moléculas
neutras sejam separadas numa única “corrida”. O fluxo elctroosmótico pode ser
controlado por alteração do pH ou da força iónica do tampão.
Na electroforese capilar com SDS as proteínas são desnaturadas e
dissociadas na presença de SDS e de um agente redutor, sendo depois
separadas no capilar.
A focagem isoeléctrica capilar usa um gradiente de pH no interior do
capilar para separar as proteínas.
A análise de aminoácidos é usada para determinar quantitativamente a
composição em aminoácidos de uma proteína. A proteína é primeiro hidrolisada
para libertar os aminoácidos, os quais são depois separados por métodos
cromatográficos e quantificados. As técnicas cromatográficas usadas são a
permuta iónica, RP-HPLC e GC.
A hidrólise é habitualmente feita na presença de HCl 6N durante 24 h,
mas como os aminoácidos não têm um comportamento homogéneo nestas
condições, é necessário proceder a alguns procedimentos especiais para
prevenir a ocorrência de erros na determinação.
O triptofano é completamente destruído durante a hidrólise, sendo
necessário proceder a uma hidrólise alcalina seguida de cromatografia para o
quantificar.
Os aminoácidos metionina, cisteína, treonina e serina são
progressivamente destruídos durante a hidrólise, portanto a duração desta
influenciará os resultados obtidos. As percas de treonina e serina podem ser
calculadas por hidrólise das amostras durante três períodos diferentes (24, 48 e
72 h, por exemplo). Pode ser feita uma compensação para a destruição de
aminoácidos por extrapolação para o tempo zero, considerando que a
degradação segue uma cinética de 1ª ordem. A cisteína e a cistina podem ser
Introdução à Química Alimentar 2009
40
convertidas em ácido cístico, mais estável, o qual é depois hidrolisado e
cromatografado.
Asparagina e glutamina são convertidos quantitativamente em ácido
aspártico e ácido glutâmico, respectivamente, não podendo ser quantificados.
Isovalina e leucina são hidrolisados mais lentamente, sendo por isso os
seus valores calculados a partir de um hidrolisado com 72 h e, finalmente, a
tirosina pode sofrer oxidação.
A separação por cromatografia de permuta iónica utiliza um gradiente de
pH e força iónica e pós-derivatização com nihidrina, para produzir formas
coradas, as quais podem ser medidas espectrofotometricamente. Em RP-HPLC,
a derivatização é feita antes da entrada na coluna, com feniltiocarbamil (ou
outros compostos) e a quantificação é feita por um detector de absorção
electrónica.
A quantificação de cada aminoácido é feita com a ajuda de um padrão
interno. Este padrão interno é, habitualmente, um aminoácido não encontrado
nos alimentos, como a norleucina.
Introdução à Química Alimentar 2009
41
Capítulo 8
Lípidos
Os lípidos podem ser descritos como substâncias solúveis em solventes
orgânicos e incluem gorduras, óleos, ceras, colesterol, esteróis e as quatro
vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K). Os termos gorduras e óleos são usados
para descrever triacilgliceróis, respectivamente no estado sólido e no estado
líquido. Devido ao seu elevado grau de saturação, os triacilgliceróis de origem
animal tendem a ser sólidos, equanto que os provenientes de peixes e plantas
tendem a ser óleos.
Fig. 8.1 – Exemplos de diversos lípidos.
Os triacilgliceróis são formados por uma molécula de glicerol esterificada
com três ácidos gordos. Estes três ácidos gordos podem ser todos diferentes,
todos iguais ou dois iguais e um diferente. O comprimento das cadeias dos
ácidos gordos existentes nos triacilgliceróis naturais é variável, embora as
estruturas com 16, 18 e 20 carbonos sejam as mais frequentes. Nos animais e
nas plantas, os ácidos gordos possuem número par de átomos de carbono, mas
alguns microrganismos são capazes de sintetizar ácidos gordos com número
ímpar. Esta é a razão pela qual nos ruminantes se encontram ácidos gordos
com número ímpar de átomos de carbono, pois as bactérias existentes no
rúmen são capazes de os produzir.
Introdução à Química Alimentar 2009
42
Fig. 8.2 – Estruturas de ácidos gordos saturados (lineares) e
insaturados.
Os ácidos gordos são ácidos carboxílicos com cadeias alifáticas mais ou
menos longas, as quais podem ser saturadas ou insaturadas. Nos ácidos gordos
insaturados, as ligações duplas (insaturações) podem ocorrer em configuração
cis ou trans. Nos ácidos gordos cis, as cadeias exibem uma curvatura,
restringindo a liberdade conformacional da molécula. Quanto maior o número
de ligações cis, menor a flexibilidade. Já nos ácidos gordos trans, não se
verifica esse efeito conformacional e as moléculas adoptam configurações
semelhantes às dos ácidos gordos saturados.
Fig. 8.3 – Ácido oleico nas configurações cis e trans.
Na natureza, a maioria dos ácidos gordos ocorre na configuração cis. Nos
alimentos, uma fracção pode ocorrer em configuração trans devido ao
processamento dos alimentos, como por exemplo na operação de hidrogenação
que está na origem da produção de gorduras sólidas a partir de óleos
alimentares.
Introdução à Química Alimentar 2009
43
Existem diversos sistemas de nomenclatura para os ácidos gordos
insaturados:
nome comum – nomes habitualmente utilizados, não obedecendo a
qualquer sistematização. Ex: ácido oleico
nome IUPAC – a contagem começa na ponta ácido carboxílico e as
ligações duplas são designadas cis/trans ou E/Z. Nomenclatura
sistemática. Ex: ácido (9Z)-octadec-9-enoico
nomemclatura x – cada ligação dupla é indicada por x, o que
indica que a ligação dupla se encontra na xª ligação carbono-
carbono, contando a partir da ponta do ácido carboxílico. Cada
ligação dupla é precedida pela designação cis ou trans. Ex: ácido
cis-9-octadecenoico
nomenclatura n-x (-x) – indica que a ligação dupla está situada na
xª ligação carbono-carbono, contando a partir da cauda alifática. A
notação é muito comum na literatura, mas a IUPAC dá
preferência à notação n. Ex: -9, n-9
números de lípidos – na nomenclatura C:D, C designa o :número de
átomos de carbono e D o número de ligações duplas. Ex: 18:1
O corpo humano é capaz de sintetizar todos menos dois dos ácidos gordos
de que necessita. Estes dois, o ácido linoleico e o ácido -linolénico,
considerados ácidos gordos essenciais, encontram-se amplamente distribuídos
em óleos vegetais.
Os fosfolípidos são semelhantes aos triacilgliceróis, com a excepção de
que um dos grupos hidroxilo do glicerol está ligado a um grupo fosfato, o qual
por sua vez se encontra ligado a um outro grupo orgânico (Fig. 8.1).
Os ácidos gordos insaturados podem sofrer ataques por parte de agentes
oxidantes levando à formação de flavours desagradáveis. Frequentemente, a
oxidação ocorre através de reacções radicalares, nas quais se formam
compostos intermédios, denominados hidroperóxidos, os quais se degradam a
aldeídos e cetonas voláteis, que são os responsáveis pelo forte flavour final.
O teor lipídico total de um alimento é habitualmente determinado a partir
de métodos de extracção com solventes orgânicos. A polaridade dos solventes
influencia a solubilidade dos lípidos e a quantificação dos mesmos. Para além
destes métodos, outros baseados nas propriedades químicas e físicas, são
utilizados para a determinação do teor em gordura dos alimentos.
A preparação da amostra para análise de lípidos depende do alimento e
dos lípidos presentes. Por tal razão, não existe um método único para a
extracção de todos os tipos de lípidos em todos os alimentos. Um factor em
Introdução à Química Alimentar 2009
44
comum é a necessidade de preparar a amostra sob uma atmosfera inerte de
azoto e a baixa temperatura, para minimizar reacções químicas, tais como a
oxidação. Outros passos comuns, que contribuem para a eficácia do método
analítico, são a remoção da água, a redução do tamanho de partícula e a
separação dos lípidos ligados a proteínas e/ou hidratos de carbono.
Uma parte significativa dos lípidos em certos alimentos (lacticínios, pão,
farinha e produtos cárneos) está ligada a proteínas e hidratos de carbono,
impedindo a sua eficaz extracção com solventes não polares. Antes da
extracção, tais alimentos devem ser sujeitos a uma hidrólise ácida, de modo a
quebrar ligações covalentes e iónicas. A amostra pode ser pré-digerida com HCl
3 N, a refluxo durante 1 h e pode adicionar-se etanol e hexametafosfato para
facilitar a separação dos lípidos dos restantes componentes, antes da extracção
daqueles por solvente.
Os requisitos de um solvente para extracção de gorduras são uma elevada
capacidade de dissolver lípidos e baixa ou nula para proteínas, aminoácidos e
hidratos de carbono. O solvente a usar deve evaporar rapidamente e não deixar
resíduos, possuir um ponto de ebulição relativamente baixo e não ser
inflamável nem tóxico, tanto no estado líquido como no gasoso. Deve ainda ser
não higroscópico e barato. Sendo difícil encontrar um solvente ideal, que
preencha todos estes requisitos, opta-se pelo uso habitual de éter etílico e éter
de petróleo, existindo ainda as alternativas de hexano e pentano.
O éter etílico é um melhor solvente para gorduras que o éter de petróleo,
mas é relativamente caro, apresenta maior risco de explosão e de incêndio, é
higroscópico e forma peróxidos. O éter de petróleo é uma mistura de
compostos (principalmente pentano e hexano) e é mais hidrofóbico que o éter
etílico. É selectivo para lípidos mais hidrofóbicos, é mais barato, menos
higroscópico e menos inflamável que o éter etílico.
Utiliza-se frequentemente uma combinação de dois ou três solventes, para
optimizar a extracção. É necessário utilizar uma razão solvente/soluto adequada
para maximizar a extracção de lípidos dos alimentos.
O método de Goldfish é um processo de extracção contínua por solvente,
em que um solvente quente flui continuamente sobre a amostra contida num
recipiente de cerâmica. O teor de gordura é obtido a partir da perca de peso da
amostra ou por pesagem da gordura removida. Um método contínuo é mais
rápido e eficaz que um semi-contínuo, mas pode resultar numa extracção
incompleta.
O cálculo da gordura é obtido a partir da equação 8.1
Introdução à Química Alimentar 2009
45
Peso de gordura = (proveta + gordura) - proveta (8.1)
e a percentagem de gordura com base no peso seco por
gordura na amostra/g% Gordura = x 100
amostra seca/g (8.2)
Fig. 8.4 – Um extractor de Goldfish.
O método de Soxhlet é um exemplo de processo de extracção semi-
-contínua, em que o solvente se acumula no recipiente de extracção durante 5-
-10 minutos, envolvendo completamente a amostra, e depois é recirculado para
o balão de aquecimento. O teor de gordura é medido a partir do peso da
amostra inicial subtraindo a gordura perdida ou por pesagem da gordura
removida.
Fig. 8.5 – Um extractor de Soxhlet.
Introdução à Química Alimentar 2009
46
Este é um método mais lento que o de Goldfish, mas permite uma
extracção mais completa da gordura. No caso de amostras com mais de 10%
de água, estas terão que ser previamente secas até atingirem um peso
constante (~5 h). O cálculo do teor de gordura é também efectuado a partir da
equação 8.2.
O método de Mojonnier para extracção de gordura por solventes é um
processo descontínuo em que a extracção é realizada com uma mistura de éter
etílico e éter de petróleo num balão chamado de Mojonnier. A gordura extraída
é seca até peso constante e exprime-se em percentagem por peso.
Fig. 8.6 – Extracção em balão de Mojonnier.
Este método tem a vantagem de não exigir remoção prévia de humidade
da amostra e aplica-se quer a alimentos líquidos quer a sólidos, mas requer a
preparação diária de um branco de água destilada em duplicado, para efectuar
os cálculos. O teor de gordura é dado por
peso prato + gordura - peso prato - peso médio do resíduo do branco% Gordura = 100 x
peso amostra
(8.3)
Existem dois métodos que utilizam interacções entre o solvente e a
amostra a pressões e temperaturas elevadas, a extracção por fluidos
supercríticos (SFE) e a extracção acelerada por solvente (ASE). Estes métodos
apresentam a característica de reduzir o consumo de solventes orgânicos, com
o consequente benefício ambiental. No caso de SFE, é completamente
eliminado o uso de solventes orgânicos perigosos, sendo substituídos por um
solvente inerte e não tóxico, como o CO2. Quando submetido a condições de
temperatura e pressão elevadas e ultrapassa o seu ponto crítico, passa a exibir
propriedades de fluido supercrítico. Neste estado, a sua densidade facilita a
extracção de gorduras, e as suas propriedades semelhantes às de um gás
facilitam a sua remoção do extracto, no finnal da extracção. A sua densidade
Introdução à Química Alimentar 2009
47
pode ser alterada por variação da pressão e/ou temperatura, aumentando a
selectividadde para componentes específicos.
Fig. 8.7 – Diagrama de fases de uma substância, ilustrando o
estado supercrítico.
Na extracção por fluidos supercríticos, a gordura extraída é precipitada,
após separação do solvente, seca e quantificada como percentagem de gordura
por peso da amostra. O teor em gordura é obtido através de
peso gordura + recipiente - peso recipiente% Gordura = x 100
peso amostra seca (8.4)
Um extractor supercrítico pode ser acoplado a um cromatógrafo gasoso,
permitindo uma rápida e eficaz separação e quantificação dos componentes da
gordura extraída.
Fig. 8.8 – Diagrama de um extractor supercrítico.
Introdução à Química Alimentar 2009
48
O método ASE não elimina completamente a necessidade de solventes
orgânicos, mas reduz significativamente o seu consumo. A extracção de
gordura ocorre a temperaturas muito superiores à do ponto de ebulição do
solvente usado, aumentando a solubilidade e a difusão dos lípidos da amostra
para o solvente, encurtando o tempo de extracção e a quantidade de solvente.
Fig. 8.9 – Funcionamento de um extractor ASE.
A extracção pode funcionar em modos estático ou dinâmico, usando um
solvente não polar. No modo estático, a extracção dá-se sem fluxo de solvente
para o exterior, enquanto que em modo dinâmico, solvente fresco flui
continuamente através da amostra. O solvente é separado, por evaporação, da
gordura e esta é seca e pesada para quantificação. Esta é feita a partir da eq.
8.4. Os resultados são comparáveis aos obtidos por extracção em Soxhlet, com
menor dispêndio de tempo e solvente.
A extracção em modo dinâmico é mais rápida, mas usa mais solvente; o
modo estático usa menos solvente mas é mais lento. A combinação dos dois
métodos produz melhores resultados globais e é frequentemente utilizada.
A extracção de lípidos pode também ser feita por métodos que não
utilizam solventes, quer químicos quer instrumentais.
No método de Babcock, adiciona-se H2SO4 à amostra, num recipiente
apropriado (garrafa de Babcock). O ácido digere as proteínas, produz calor e
liberta a gordura. A gordura é isolada por centrifugação e adição de água
quente e é medida volumetricamente na parte graduada da garrafa de
Babcock, mas o resultado é expresso como percentagem de gordura por peso
da amostra.
O método não é capaz de determinar fosfolípidos nem é aplicável a
alimentos contendo açúcar ou chocolate.
Introdução à Química Alimentar 2009
49
Fig. 8.10 – Exemplos de garrafas de Babcock.
O método de Gerber é semelhante ao de Babcock, mas utiliza ácido
sulfúrico e álcool amílico. O ácido digere as proteínas e hidratos de carbono,
liberta a gordura e liquefá-la devido ao calor gerado. Este método é mais
simples e rápido que o de Babcock. O álcool amílico impede a queima dos
hidratos de carbono, permitindo um uso mais amplo.
Um outro método químico é o método do detergente, em que este reage
com as proteínas formando um complexo, levando à quebra de emulsões e à
libertação da gordura. A amostra é pipetada para uma garrafa de Babcock e
adiciona-se um detergente aniónico, o qual dispersa a camada proteica que
estabiliza a gordura, para a libertar. De seguida adiciona-se um detergente não
iónico para separar a gordura dos restantes componentes. A gordura é medida
volumetricamente e expressa como percentagem.
O índice de refracção é característico para cada tipo de gordura, variando
os valores com o grau e tipo de insaturação e teor de gordura. A gordura é
extraída com um solvente (bromonaftaleno), e o índice de refracção do
solvente é comparado com os índices de refracção da solução com a gordura
extraída e da gordura, segundo a equação 8.5, em que V é o volume de
bromonaftaleno, d a densidade da gordura, n o índice de refracção da gordura,
n1 o índice de refracção do bromonaftaleno, n2 o índice de refracção da solução
extraída e W o peso da amostra.
1 2
2
( )% Gordura = 100 x
( )
Vd n n
W n n
(8.5)
Comparativamente com os métodos anteriores, os métodos instrumentais
são, em geral, rápidos, não destrutivos, exigem pouca preparação da amostra e
Introdução à Química Alimentar 2009
50
consomem poucos reagentes. No entanto, alguns equipamentos são caros e é
frequente a necessidade de curvas de calibração.
A ressonância magnética nuclear (NMR) pode ser usada para medir lípidos
de forma não destrutiva. É um método rápido e exacto, que permite um
elevado grau de automação. Na quantificação e caracterização de lípidos em
alimentos usa-se o NMR de baixa resolução, em que se obtém informação
sobre a intensidade do sinal e tempo de relaxação da amostra sujeita ao campo
magnético aplicado. Estes dados podem ser usados para determinar a
quantidade de lípidos, o teor de lípidos sólidos e líquidos teores de água e óleo
presentes.
O NMR é aplicado no modo pulsado, em que o campo magnético é
aplicado durante períodos muito curtos. Nesta modalidade, os sinais dos
núcleos 1H dos diversos componentes dos alimentos podem ser distinguidos
através das suas relaxações nucleares. Os núcleos em fases sólidas relaxam
muito rapidamente, enquanto que os protões em fases líquidas relaxam muito
devagar. A intensidade dos sinais é proporcional ao número de núcleos de
hidrogénio, ou seja ao teor de hidrogénio. Esta intensidade pode ser convertida
em teor de óleo, usando métodos de calibração. Esta técnica permite medir
teores de água e de óleo, teor de gorduras sólidas e razão sólido/líquido.
A utilização de espectrometria de NMR exige que as amostras estejam a
temperatura constante, já que é uma técnica cujo sinal varia com a
temperatura.
A absorção de raios X é um método rápido, que tem sido usado para
análise de lípidos em carnes. Baseia-se no facto de que a absorção de raios X é
maior em carne magra do que em carne gorda. A quantificação é feita por
comparação com curva padrão obtida a partir de uma extracção com solvente.
A medição da constante dieléctrica pode ser usada para determinar o teor
lípidico de um alimento, tendo por base o princípio de que a constante dielétrica
varia com o teor de óleo. Os valores medidos são comparados com os obtidos a
partir de uma curva de calibração, preparada a partir de uma extracção com
solventes.
As gorduras originam uma absorção a 5.73 m, cuja intensidade é
proporcional à concentração de gorduras na amostra. A espectroscopia de
infra-vermelho é usada para determinar o teor de gorduras em alimentos,
tendo por base essa propriedade, podendo o método ser utilizado durante o
processamento dos alimentos, já que se trata de uma técnica não destrutiva.
Introdução à Química Alimentar 2009
51
As medidas de ultra-sons também são não destrutivas e podem ser
usadas para determinar a composição de diversos alimentos, baseadas no facto
de que os vários componentes possuem diferentes propriedades acústicas. As
medidas são efectuadas a partir de modelos empíricos ou teóricos.
O teor de óleo nas oleaginosas pode ser determinado a partir da medida
da densidade das sementes e estabelecendo uma correlação entre esse valor e
o medido para o teor de gordura através de um método de extracção por
solventes.
Por motivos de rotulagem, nutricionais ou outros é frequente haver
necessidade de medir não apenas o teor em gordura total de um alimento mas
também de caracterizar a sua composição lipídica. Parâmetros como o teor de
colesterol, de ácidos gordos saturados e insaturados e mesmo o tipo de ácidos
gordos presente são importantes para determinar a conservabilidade de um
produto e influem no seu processamento.
As amostras utilizadas para caracterização de óleos e gorduras devem ser
preparadas sob condições que evitem a sua oxidação (exposição a calor, luz ou
ar) e a presença de água e devem apresentar-se límpidas, sem sedimentos.
A refractometria é uma das técnicas utilizadas para caracterizar gorduras,
trabalhando a 20 ºC com óleos e às temperaturas a que as restantes gorduras
se apresentam fluidas. O índice de refracção, para além de permitir uma análise
qualitativa, devido a possuir um valor específico para cada substância, é
proporcional à saturação do ácido gordo, podendo ser usado para medir o grau
de saturação. Este método apresenta as desvantagens de ser influenciado pela
presença de ácidos gordos livres, pela oxidação dos ácidos gordos e ser
dependente da temperatura.
Existem diversos métodos que permitem medir o ponto de fusão de uma
gordura, com o objectivo de determinar a sua composição, sendo todos eles
algo subjectivos quanto ao valor medido e, portanto, relativamente pouco
rigorosos.
O índice de iodo é uma medida do grau de insaturação. Define-se como a
quantidade (em peso) de iodo absorvida por 100 g de amostra. Quanto maior a
insaturação, mais iodo é absorvido, ou seja quanto maior o índice de iodo,
maior o grau de insaturação.
Uma amostra de óleo ou gordura é dissolvida num solvente apropriado e
é-lhe adicionada uma quantidade conhecida de iodo (ou outro halogéneo). Dá-
se uma adição às ligações duplas (8.6). Adiciona-se uma solução de iodeto de
potássio para reduzir o excesso de ICl e produzir iodo livre (8.7). Este iodo livre
Introdução à Química Alimentar 2009
52
é depois titulado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio, usando
amido como indicador, o qual muda de azul para incolor (8.8).
ICl(excesso) + R-CH=CH-R ɹ R-CHI-CHCl-R + ICl (8.6)
ICl + 2KI ɹ KCl + KI + I2 (8.7)
I2 + amido + 2Na2S2O3 ɹ 2NaI + amido + Na2S4O6 (8.8)
O índice de iodo é calculado a partir da equação 8.9, em que B é o
volume de titulante usado para titular um branco, S o volume de titulante para
a amostra, N a concentração de Na2S2O3 (mol/1000 mL), W o peso da amostra
e 126.9 a massa de iodo (g/mol).
x x126.9Índice de iodo x100
B S N
W
(8.9)
O índice de saponificação mede a quantidade de base necessária para
saponificar uma determinada quantidade de óleo ou gordura. A gordura é
tratada com uma base degradando-a em glicerol e ácidos gordos. O índice de
saponificação é expresso como a quantidade de KOH necessária para
saponificar 1 g de amostra. Este índice é uma medida do peso molecular médio
dos triacilgliceróis presentes na amostra. Se este valor médio for dividido por 3,
dá um peso molecular médio aproximado para os ácidos gordos presentes. Na
prática, quanto menor o índice de saponificação, maior a cadeia dos ácidos
gordos.
Uma solução alcoólica com KOH em excesso é adicionada à amostra,
aquecendo-se para saponificar a gordura. O KOH que não reage é titulado com
HCl, usando fenolftaleína como indicador e o índice é calculado através da
equação 8.10, onde B é o volume de titulante para o branco, S o volume de
titulante para a amostra, N a concentração de HCl (mmol/mL), W o peso da
amostra e 56.1 a massa de KOH (mg/mmol).
x x56.1Índice de saponificação x100
B S N
W
(8.10)
As medidas de acidez das gorduras geralmente reflectem a quantidade de
ácidos gordos hidrolisados dos triacilgliceróis. A percentagem em peso de um
dado ácido gordo designa-se ácido gordo livre (FFA – free fatty acid) e o índice
de acidez define-se como a quantidade de KOH necessária para neutralizar os
ácidos livres presentes em 1 g de óleo ou gordura. A percentagem de FFA é
frequentemente referida a ácido oleico e calcula-se a partir de uma amostra de
Introdução à Química Alimentar 2009
53
gordura fluida à qual são adicionados etanol a 95% e o indicador fenolftaleína.
Após titulação com NaOH, o valor é calculado usando
(como oleico) x x 282
% FFA = x 100V N
W (8.11)
em que V é o volume de NaOH usado para titular, N a concentração de NaOH,
W o peso da amostra e 282 o peso molecular do ácido oleico.
Numa gordura bruta, este valor é uma estimativa da quantidade de óleo
que será perdida durante a refinação. Numa gordura refinada, um índice de
acidez elevado indica uma incorrecta refinação ou degradação da gordura após
armazenamento ou utilização. No caso de os ácidos libertados serem voláteis, o
valor de FFA pode ser uma medida da rancidez hidrolítica.
A percentagem de gorduras sólidas numa amostra pode ser determinada
por NMR. A proporção de gorduras sólidas em alimentos (margarinas, cremes
para barrar, ...) tem importância no que se relaciona com as suas propriedades
funcionais, tais como a textura.
As gorduras podem sofrer processos de degradação, originando a
produção de sabores e aromas indesejados, globalmente designados por ranço.
A rancidez das gorduras pode provir da lipólise (rancidez hidrolítica) ou da
oxidação lipídica (rancidez oxidativa).
A lipólise designa a hidrólise dos triacilgliceróis. Quando os ácidos gordos
que os compõem possuem cadeias curtas, a lipólise resulta na formação de
compostos voláteis, frequentemente caracterizados por aromas desagradáveis.
A oxidação lipídica (ou autoxidação) ocorre através de um mecanismo com
radicais livres, o qual origina a produção de hidroperóxidos, que por sua vez
sofrem degradação com produção de diversos produtos, incluindo aldeídos,
cetonas, ácidos orgânicos e hidrocarbonetos.
Existem diversos métodos que permitem a quantificação da oxidação
lipídica em alimentos, a maioria dos quais requer a extracção de lípidos antes
de efectuar a análise.
O índice de peróxidos é um método titrimétrico, que parte do pressuposto
que todos os compostos reactivos são peróxidos ou produtos análogos
resultantes da oxidação lipídica. A amostra é dissolvida numa mistura de ácido
acético e isooctano, à qual é adicionado um excesso de KI. O iodeto reage com
os peróxidos, libertando iodo. Esta solução é titulada com tiossulfato de sódio,
usando amido como indicador.
Introdução à Química Alimentar 2009
54
ROOH + KI ɹ ROH + KOH + I2 (8.12)
I2 + amido(azul) + 2Na2S2O3 ɹ 2NaI + amido(incolor) + Na2S4O6 (8.13)
O índice de peróxidos é então calculado a partir da equação 8.14, em que
S é o volume de titulante usado para a amostra, B o volume de titulante para o
branco, N a concentração de tiossulfato de sódio, W o peso da amostra e 1000
o factor de conversão de g para kg.
( ) x Índice de peróxidos = x 1000
S B N
W
(8.14)
Como este índice mede um produto transiente de oxidação (os peróxidos
formados sofrem, também eles, degradação para formar outros produtos)
quando se obtém um valor baixo, tal pode significar quer um início quer um
estado adiantado de oxidação. Para distinguir entre os dois, deve medir-se o
índice de peróxido em função do tempo, durante um certo período.
Um valor de 0 indica uma gordura de elevada qualidade e um valor
superior a 20 corresponde a uma gordura de má qualidade.
Uma desvantagem na aplicação deste método a alimentos é a necessidade
de uma amostra de 5 g de gordura ou óleo.
O índice de p-anisidina calcula a quantidade de aldeídos e insaturados,
formados como produtos secundários de oxidação de óleos e gorduras. Estes
aldeídos reagem com a p-anisidina formando um composto corado, podendo
ser medido espectrofotometricamente. O índice é obtido multiplicando por 100
o valor da absorvância a 350 nm, de uma solução contendo 1 g de óleo diluído
para 100 mL de isooctano e p-anisidina.
O índice totox indica a oxidação total de uma amostra através dos índices
de peróxidos e de p-anisidina:
Índice totox = índice de p-anisidina + 2 x índice de peróxidos (8.15)
Este índice totox aumenta continuamente ao longo da oxidação.
Os compostos orgânicos voláteis (VOCs) presentes nas gorduras e óleos
estão associados ao seu flavour, qualidade e susceptibilidade à oxidação.
Incluem-se neste grupo os produtos secundários da oxidação lipídica,
responsáveis pelos sabores e aromas desagradáveis das gorduras e óleos
oxidados. Entre os compostos habitualmente medidos incluem-se pentano,
pentanal, hexanal e 2,4-decadienal. A medição, por GC, do hexanal no espaço
de cabeça é uma indicação da extensão da oxidação. Os detectores
habitualmente utilizados são o de ionização de chama (FID) ou de massa (MS)
Introdução à Química Alimentar 2009
55
e a quantidade de hexanal formada é calculada a partir da área do respectivo
pico.
Este método apresenta a vantagem de não exigir prévia extracção de
lípidos.
O ensaio do ácido tiobarbitúrico (TBA) mede um outro produto secundário
da oxidação dos lípidos, o malonaldeído. Baseia-se na reacção de malonaldeído
com o TBA para produzir um composto colorido, o qual é medido
espectrofotometricamente. Como a reacção não é específica para o
malonaldeído, os resultados são por vezes apresentados como medida de
substâncias reactivas com TBA (TBARS). O ensaio pode ser feito directamente
com o alimento, mas este sofre habitualmente uma destilação prévia, para
eliminar interferentes e só depois se faz reagir o destilado com o TBA.
A absorvância da solução é medida a 530 nm e os valores são
convertidos, usando uma curva padrão, a mg de malonaldeído por kg de
amostra. Alternativamente, o teor de malonaldeído pode ser medido através de
uma análise do destilado por HPLC.
O malonaldeído também é um produto transiente da oxidação, mas o
ensaio do TBA apresenta melhores correlações com a avaliação sensorial da
rancidez que o índice de peróxido.
As ligações duplas dos lípidos passam de não conjugadas a conjugadas
quando sofrem oxidação. Os compostos com ligações duplas conjugadas
apresentam absorções características, podendo essa propriedade ser utilizada
para identificar a existência de oxidação numa amostra.
As amostras líquidas são pesadas e diluídas para um volume que permita
obter um valor de absorvância entre 0.1 e 0.8. A absorvância é então medida a
232 nm (dienos conjugados) e 270 nm (trienos conjugados) contra um branco
do solvente.
O método dos dienos e trienos conjugados permite seguir as primeiras
fases de uma oxidação, não existindo uma boa correlação em etapas mais
adiantadas.
A estabilidade de um alimento relativamente à oxidação pode ser
determinada através de ensaios acelerados, os quais provocam artificialmente a
rápida oxidação por exposição das amostras ao calor, oxigénio, catalisadores
metálicos, luz ou enzimas. Estes ensaios partem da condição de que as
reacções que ocorrem nestas condições artificiais são as mesmas que ocorrem
em condições normais.
Introdução à Química Alimentar 2009
56
Um destes ensaios usa um forno a cerca de 60 ºC, no qual é colocado o
óleo ou a gordura. O ensaio permite simular condições de armazenamento, mas
num período muito mais curto. Actualmente designa-se por ensaio em forno de
armazenamento e é uma actualização do ensaio em forno de Schaal.
Um outro método mede o tempo necessário para que o oxigénio comece a
desaparecer de um sistema fechado. Designado por bomba de oxigénio, este
método usa um contentor hermeticamente fechado, ligado a um medidor de
pressão. A amostra é colocada no seu interior e adiciona-se O2 até alcançar
uma pressão de ~690 kPa (100 psi). De seguida, coloca-se o contentor num
banho de água a ferver. Mede-se o tempo que demora a atingir uma queda
brusca de pressão, correspondente à rápida absorção de O2 pela amostra.
A fracção lipídica, presente num alimento, pode ser caracterizada pela sua
composição em ácidos gordos, mono, di e triacilgliceróis, fosfolípidos, esteróis,
pigmentos e vitaminas lipossolúveis. A cromatografia gasosa é ideal para a
análise de lípidos, podendo ser utilizada para determinar a composição em
ácidos gordos totais, distribuição e posição dos ácidos gordos, estabilidade e
oxidação, detecção de adulterações e antioxidantes. Quando combinada com a
espectrometria de massa, a cromatografia gasosa permite a identificação dos
compostos separados. A cromatografia líquida (HPLC) também tem aplicações
na análise de lípidos e a cromatografia em camada fina (TLC) usa-se em
ensaios de rotina devido à sua simplicidade e baixo custo.
O perfil em ácidos gordos de um alimento é determinado após extracção
dos lípidos e análise do extracto em GC capilar. Para aumentar a volatilidade, os
triacilgliceróis e os fosfolípidos são saponificados e os ácidos gordos livres
resultantes são esterificados, formando ésteres metílicos (FAMEs).
Fig. 8.11 – Reacção de formação de ésteres metílicos de um ácido
gordo, em meio básico.
A maioria das gorduras e óleos naturais extraídos das plantas contém
apenas ligações duplas cis (não conjugadas), mas os extraídos de fontes
animais podem conter pequenas quantidades de ligações duplas trans. Estas
ligações trans também podem resultar de processos como a oxidação,
Introdução à Química Alimentar 2009
57
extracção, aquecimento e hidrogenação. A determinação de isómeros trans
pode ser efectuda por GC, mas também por espectrometria de infra-vermelho.
A concentração de ácidos gordos trans pode ser medida a partir da
absorção a 966 cm-1. Para obter um espectro de IV, a amostra terá que estar
no estado líquido e os ácidos gordos terão que ser convertidos nos respectivos
ésteres metílicos. Usa-se elaidato de metilo como padrão externo, para calcular
o teor em compostos trans.
Os métodos cromatográficos, HPLC e GC, são as técnicas mais recentes
utilizadas para determinar mono, di e triacilgliceróis.
Para quantificar colesterol num alimento, é necessário saponificar os
lípidos extraídos da amostra. O colesterol, que fica na fracção não saponificada,
é extraído e derivatizado para formar éteres trimetilsililados, que serão
analisados por GC.
No caso de alimentos cárneos e congelados, não é necessária a prévia
extracção da gordura, podendo saponificar-se directamente a amostra.
Os produtos de oxidação do colesterol podem se quantificados por GC,
HPLC ou TLC.
Introdução à Química Alimentar 2009
58
Capítulo 9
Hidratos de carbono
Designa-se por hidrato de carbono qualquer composto orgânico de
fórmula (CH2O)n com n ≥ 3. Quimicamente, os hidratos de carbono são
aldeídos ou cetonas, com diversos grupos hidroxilo ligados. Os hidratos de
carbono simples, que não podem ser hidrolisados a açúcares mais simples são
chamados monossacáridos.
Fig. 9.1 – -D-glucopiranose, um monossacárido.
Os monossacáridos são classificados de acordo com três características: a
posição do grupo carbonilo, o número de átomos de carbono e a quiralidade.
Se o grupo carbonilo é um aldeído, o monossacárido designa-se por aldose; se
o grupo carbonilo for uma cetona, o monossacárido será uma cetose. Os
açúcares simples com valores n de 3, 4, 5 e 6 são designados por trioses,
tetroses, pentoses e hexoses. Cada átomo de carbono com um OH substituinte,
exceptuando o primeiro e o último carbonos, são assimétrcos podendo exibir
configurações R ou S.
A nomenclatura D ou L tem em conta a orientação do carbono assimétrico
mais afastado do grupo carbonilo. Numa projecção de Fischer, se o grupo
hidroxilo está à direita da molécula, o açúcar será D e no caso oposto será L.
Os grupos aldeído ou cetona de um monossacárido reagem
reversivelmente com um grupo hidroxilo de outro átomo de carbono, formando
um anel heterocíclico. Se o anel tiver cinco membros é uma furanose e se tiver
seis uma piranose. Na forma cíclica, o átomo de carbono do grupo carbonilo
(carbono anomérico) torna-se um centro quiral com duas conformações
possíveis: o átomo de oxigénio pode ficar acima ou abaixo do plano do anel,
Introdução à Química Alimentar 2009
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originando dois possíveis anómeros. Num anómero , o grupo OH do carbono
anomérico fica situado no lado oposto do anel relativamente ao grupo CH2OH;
num anómero , o CH2OH fica no mesmo lado do plano do anel relativamente
ao hidroxilo do carbono anomérico.
Fig. 9.2 – A azul está representado o átomo de carbono mais
afastado do grupo carbonilo (vermelho). Como o OH
está à direita, este é um açúcar D.
Fig. 9.3 – Anómeros e da glucose.
Nos açúcares simples, o grupo aldeído do carbono 1 pode sofrer uma
hidrogenação, resultando na formação de um álcool polihidroxilado ou poliol.
Alguns destes compostos ocorrem na natureza, podendo também ser
produzidos industrialmente. Estes compostos possuem menor teor calórico, são
melhor tolerados por diabéticos e não provocam formação de cáries,
comparativamente com os açúcares “normais”.
Os monossacáridos podem ligar-se uns aos outros, formando
oligossacáridos ou polissacáridos. A ligação covalente entre dois
monossacáridos designa-se ligação peptídica. Os oligossacáridos mais simples
são os dissacáridos, como a lactose ou a sacarose.
A sacarose não possui um carbono anomérico, sendo considerado um
açúcar não redutor. Pelo contrário, a maioria dos monossacáridos e dissacáridos
como a lactose têm capacidade de reduzir Cu2+ a Cu+ (teste de Fehling) sendo
designados açúcares redutores.
Introdução à Química Alimentar 2009
60
Fig. 9.4 – Sacarose, o dissacárido mais abundante na natureza.
A partir de dez unidades monoméricas, os hidratos de carbono são
habitualmente designados polissacáridos. Alguns dos polissacáridos mais
importantes na natureza são o amido, a celulose e o glicogénio. O amido é uma
mistura dos polissacáridos amilose e amilopectina em diferentes proporções. A
celulose é um polímero linear de unidades de D-glucose ligadas por ligações
(1ɹ4).
Fig. 9.5 – Cadeia de celulose, evidenciando as ligações de
hidrogénio formadas entre as unidades D-glucose.
O equivalente do amido nos animais é o glicogénio, também um
polissacárido de glucose com funções de armazenamento.
A pectina é um heteropolissacárido estrutural, encontrado nas plantas
terrestres. A sua estrutura difere de planta para planta, nas diferentes partes
das plantas e mesmo durante o desenvolvimento das plantas.
Como os hidratos de carbono possuem uma elevada gama de
solubilidades, os métodos de preparação de amostra para a sua análise são
também variados.
Introdução à Química Alimentar 2009
61
Fig. 9.6 – Esquema mostrando a estrutura fortemente ramificada
do glicogénio.
Para analisar os hidratos de carbono na maioria dos alimentos, efectua-se
um primeiro passo de secagem (pode servir para determinar o teor de
humidade). Após secagem, a amostra é finamente triturada e faz-se a
extracção dos lípidos por Soxhlet, usando uma mistura 95:5 v/v
clorofórmio/metanol. A extracção da fracção lipídica facilita a mais completa
extracção de hidratos de carbono.
Os produtos alimentares contêm frequentemente substâncias que
interferem com as medidas de mono e oligossacáridos presentes. Por essa
razão, a amostra, depois de seca e sujeita à extracção da fracção lipídica, é
extraída a quente com 80% de etanol, na presença de carbonato de cálcio para
neutralizar alguma acidez. Os hidratos de carbono são solúveis em solventes
polares, mas outros componentes dos alimentos (polissacáridos, proteínas, ...)
são insolúveis em etanol quente a 80%. O passo de extracção é repetido, de
modo a ssegurar uma completa extracção dos mono e oligossacáridos.
O extracto ainda conterá outras substâncias, para além dos hidratos de
carbono. Como estes são neutros e aquelas possuem carga, os contaminantes
podem ser removidos por técnicas de permuta iónica.
Introdução à Química Alimentar 2009
62
A solução etanólica contendo o extracto é sujeita a secagem, num
evaporador rotativo a 45 – 50 ºC e o resíduo resultante é dissolvido num
volume conhecido de água, para posterior análise.
A determinação do teor total em hidratos de carbono pode ser feita
tirando partido da reacção característica dos hidratos de carbono com ácidos
fortes. Nestas condições (o efeito pode ser reforçado a temperatura elevada)
produzem-se diversos furanos, os quais podem condensar entre si ou com
outros produtos, originando substâncias de cor castanha e preta. Entre estes
outros produtos que reagem com os furanos, contam-se os compostos
fenólicos. O método mais utilizado para determinar hidratos de carbono totais é
a condensação com o fenol em meio de ácido sulfúrico (método do fenol/ácido
sulfùrico). Este método é simples, rápido, sensível, rigoroso e específico para
hidratos de carbono. Prepara-se uma solução com os hidratos de carbono a
determinar e um branco com água. Adiciona-se uma solução aquosa de fenol,
mistura-se e adiciona-se ácido sulfúrico. A solução fica com uma cor amarelo-
-alaranjada e a sua absorvância é medida a 490 nm.
O método do fenol e outros usados para medir o teor de açúcares
redutores não envolvem reacções estequiométricas, dependendo a extensão da
reacção da estrutura do açúcar. Por este motivo, é necessária a utilização de
curvas de calibração, frequentemente com D-glucose.
O método mais utilizado para determinar teores de açúcares redutores é o
método de Somogyi-Nelson. Este e outros métodos semelhantes podem ser
usados em conjunto com métodos enzimáticos para determinar oligo e
polissacáridos. Os métodos enzimáticos usam hidrolases específicas para
converter oligo e polissacáridos em monossacáridos ou unidades repetitivas de
oligossacáridos, os quais podem ser medidos pelos métodos usados para
determinar açúcares redutores.
O método de Somogyi-Nelson baseia-se na redução de Cu2+ a Cu+ pelos
açúcares redutores. Os iões Cu+, por sua vez, reduzem um complexo de
arsenomolibdato em ácido sulfúrico. A redução deste complexo origina uma cor
azul intensa e estável, a qual pode ser medida espectrofotometricamente a
520 nm, contra um branco de água. Como a reacção não é estequiométrica,
tem que usar-se uma curva de calibração para quantificar os açúcares
redutores.
Existem outros métodos baseados na redução, em meio alcalino, de Cu2+
a Cu+. Nestas condições, o Cu+ precipita na forma de Cu2O, de cor vermelho-
-tijolo. O método de Munson-Walker é um deles, podendo o precipitado ser
medido por gravimetria, por titulação com tiossulfato de sódio, por titulação
com permanganato de potássio, por titulação na presença de azul de metileno
Introdução à Química Alimentar 2009
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(método de Lane-Eynon) e por electrólise. Todas estas variantes requerem a
utilização de curvas de calibração, devido à especificidade de reacção de cada
açúcar.
Em geral, é conveniente identificar cada hidrato de carbono presente e
determinar as suas concentrações, para o que será necessário optar por outros
métodos.
HPLC é o método mais eficaz para a análise de oligo e monossacáridos,
podendo também ser usado para análise de polissacáridos, após hidrólise
destes.
Como os hidratos de carbono possuem pKa elevados (12-14) em soluções
com pH alcalino alguns grupos hidroxilo dos hidratos de carbono são ionizados,
permitindo a separação em colunas de permuta aniónica. A sequência de
eluição é geralmente alditóis, monossacáridos, dissacáridos e oligossacáridos de
maior cadeia. A cromatografia de permuta aniónica é habitualmente utilizada
em conjunto com detectores electroquímicos.
As resinas de permuta catiónica podem ser usadas em alternativa,
invertendo-se aqui a ordem de separação. A maior eficácia destas colunas está
na separação de monossacáridos.
HPLC também pode ser usada em fase normal para análise de hidratos de
carbono. Usando fases estacionárias com grupos amino e fases móveis
acetonitrilo/água conseguem separar-se os hidratos de carbono na ordem
monossacáridos, alditóis, dissacáridos e outros oligossacáridos. Alguns açúcares
reagem com os grupos amino e a fase estacionária vai perdendo eficácia,
embora modificações recentes na fase estacionária permitam a regeneração da
mesma.
As colunas de fase reversa mostram alguma eficácia na separação de
mono, di e trissacáridos, mas os monossacáridos tendem a coeluir com baixos
tempos de retenção.
A detecção em HPLC de hidratos de carbono pode ser feita por índice de
refracção, detectores electroquímicos ou por derivatização pré e pós-coluna.
Os detectores de índice de refracção podem ser aplicados a todos os
hidratos de carbono e apresentam uma resposta linear numa ampla gama de
concentrações, mas não são compatíveis com a utilização de gradientes.
Os detectores de amperometria pulsada são utilizados em cromatografia
de permuta aniónica e permitem a detecção quer de açúcares redutores quer
de não redutores.
Introdução à Química Alimentar 2009
64
A derivatização dos hidratos de carbono pré-coluna ou pós-coluna permite
aumentar a sensibilidade de detecção por detectores de absorção electrónica
ou de fluorescência.
A cromatografia gasosa permite a análise quantitativa e qualitativa de
hidratos de carbono, com a limitação de que estes têm que sofrer uma
derivatização (em dois passos) para serem convertidos em compostos voláteis.
A detecção é habitualmente efectuada por detectores de ionização de chama
(FID).
O processo de derivatização é diferente para açúcares neutros e para
amostras contendo ácidos urónicos.
Vários métodos enzimáticos têm sido empregues para a determinação de
hidratos de carbono, em particular do amido. Estes métodos apresentam a
vantagem de serem frequentemente específicos para a substância a ser
estudada.
É recomendado que as amostras destinadas a serem determinadas por
métodos enzimáticos sofram um tratamento prévio que permita a quebra de
emulsões, precipitação de proteínas e absorção de cores. Este tratamento de
Carrez envolve a adição de hexacianoferrato de potássio (K4[Fe(CN)6]), seguida
da adição de sulfato de zinco (ZnSO4) e de hidróxido de sódio (NaOH).
Na determinação enzimática de D-glucose, esta é quantitativamente
oxidada pela enzima glucose oxidase a D-glucono-1,5-lactona e H2O2. O
peróxido de hidrogénio reage com um pigmento na presença de peroxidase e
origina a formação de um composto corado, o qual é medido
espectrofotometricamente, permitindo a quantificação da D-glucose.
O único método de confiança para determinação do teor total em amido
baseia-se na conversão total de amido em D-glucose por enzimas (amilases) e
posterior determinação da D-glucose por uma enzima específica.
Este método apresenta problemas de quantificação com o amido
resistente (amido e produtos de degradação do amido que resistem à digestão
no intestino delgado). Existem quatro tipos de amido resistente: a) amido preso
em matrizes alimentares, fisicamente inacessível a amilases; b) amido que
resiste à hidrólise enzimática devido à natureza dos seus grãos (amido de
batata, ...); c) amido que recristalizou após gelatinização (ex: batatas cozidas e
arrefecidas); d) amido que foi estruturalmente modificado, de maneira a torná-
-lo menos susceptível à digestão.
O problema causado pelo amido resistente pode ser, em parte,
solucionado por dispersão do amido em DMSO (dimetil sulfóxido) e posterior
Introdução à Química Alimentar 2009
65
conversão quantitativa em D-glucose por tratamento com -amilase,
conseguindo-se assim a despolimerização e solubilização do amido.
Fig. 9.7 – Determinação enzimática da D-glucose.
Para determinar o amido total, uma amostra é finamente triturada,
colocada num tubo de ensaio e é-lhe adicionado etanol a 80%. Adiciona-se
DMSO e agita-se vigorosamente. Aquece-se em água a ferver, retira-se do
banho e adiciona-se uma solução de -amilase. Agita-se bem e volta a colocar-
-se no banho de água. Ao fim de 5 minutos, o tubo é levado a 50 ºC, adiciona-
-se tampão de acetato de sódio (pH 4.5) e amiloglucosidase. Agita-se e incuba-
-se a 50 ºC. De seguida, o conteúdo do tubo é transferido para um balão
volumétrico, ajustando-se o volume com água destilada. Após agitação
vigorosa, retiram-se alíquotas, adiciona-se uma mistura de glucose
oxidase/peroxidase (reagente GOPOD) e incuba-se a 50 ºC. Finalmente, mede-
-se a bsorvância da amostra contra um branco do reagente GOPOD.
Utilizam-se glucose e um amido com baixo teor de proteínas e lípidos
como padrões, após determinação dos respectivos teores de humidade.
Não existe um método oficial para determinação de pectina, mas existem
alguns métodos publicados, baseados na sua precipitação com etanol, em
alimentos em que é o único polissacárido presente.
O ácido D-galacturónico é um elemento constante na composição das
pectinas (frequentemente mais de 80%). As ligações dos ácidos urónicos são
difíceis de hidrolisar sem degradação da molécula, pelo que os métodos que
utilizam hidrólise ácida e cromatografia não são aplicáveis à análise de pectinas.
Introdução à Química Alimentar 2009
66
Um dos métodos usados faz saponificação da amostra em NaOH, seguida
da sua acidificação e adição de Ca2+, para precipitar a pectina. O pectato de
cálcio precipitado é recolhido, lavado, seco e pesado.
Define-se fibra dietética como a soma dos componentes não digeríveis de
um alimento. Na sua maioria é composta de polissacáridos (celulose,
hemiceluloses e lenhina). A fibra dietética é composta por uma parte de fibra
solúvel e outra de fibra insolúvel. A fibra insolúvel é composta por celulose,
celulose microcristalina usada como aditivo alimentar, lenhina, hemiceluloses
presas na matriz linhocelulósica e amido resistente. Os restantes polissacáridos,
incluindo diversas hemiceluloses, a maioria da pectina e a maioria das
gomas/hidrocolóides compõem a fibra solúvel.
O teor em fibra dietética de um alimento pode ser calculado por dois
processos: gravimétrico e químico. Nos métodos gravimétricos, os hidratos de
carbono digeríveis, lípidos e proteínas são removidos por catálise enzimática ou
solubilizados selectivamente. A parte não digerida ou não solubilizada é filtrada
e pesada. Nos métodos químicos, os hidratos de carbono digeríveis são
removidos por digestão enzimática e os componentes da fibra hidrolisados em
meio ácido. De seguida, medem-se os monossacáridos libertados, considerando
que o seu teor corresponde ao teor de fibra.
Todos os métodos usados para determinação de fibras incluem um passo
de aquecimento a 80-130 ºC (10 min a 3 h) para gelatinizar os grânulos de
amido, tornando-os passíveis de ser hidrolisados. Só o amido resistente não
será hidrolisado.
As medidas de fibra requerem que as amostras sejam secas e finamente
trituradas e funcionam melhor em amostras com menos de 10% de lípidos.
Quando a amostra possui um teor lipídico superior, os lípidos são removidos por
extracção com éter de petróleo ou hexano. A amostra é depois seca em estufa
de vácuo a 70 ºC e triturada.
As amostras não sólidas com menos de 10% de fibra devem ser
analisadas após liofilização. Se tiverem mais de 10% de fibra, forem
homogéneas, com tamanho de partícula suficientemente pequeno para permitir
uma remoção eficaz de hidratos de carbono digestíveis e de proteína e
possuirem um baixo teor de lípidos, podem ser analisadas sem secagem.
Entre os métodos gravimétricos inclui-se o método para determinação de
fibra bruta. Este é um método antigo, que foi utilizado até à década de 1970
para determinar o teor de fibra em alimentos para humanos. A fibra bruta é
determinada por extracção sequencial da amostra com H2SO4 1.25% e NaOH
1.25%. O resíduo insolúvel é recolhido por filtração, seco, pesado e incinerado,
Introdução à Química Alimentar 2009
67
de modo a corrigir para a eventual contaminação por minerais. Este método
não tem em conta as hemiceluloses, pectinas e gomas/hidrocolóides, já que
estes são solubilizados e removidos.
Os métodos com detergentes ácido e neutro foram desenvolvidos para
obter uma determinação mais correcta de fibra. O método com detergente
ácido mede a lenhina e a celulose e o método com detergente neutro mede
lenhina, celulose e hemiceluloses. Nenhum destes métodos permite medir
pectinas ou gomas. No entanto, como os componentes não medidos estão
geralmente presentes em muito pequenas quantidades, estes métodos são
aceites para analisar rações para animais.
O método gravimétrico de referência para medir fibras em alimentos para
consumo humano faz a medida das fibras total, solúvel e insolúvel. Este método
usa amostras secas, livres de lípidos e trituradas. As amostras são digeridas
com -amilase, glucoamilase e protease, para remover amido e proteínas. A
fibra insolúvel é recolhida por filtração e a fibra solúvel é precipitada por adição
de etanol a 78% e depois recolhida por filtração. Este resíduo é lavado com
etanol e acetona, seco na estufa e pesado. De seguida é analisado para
verificar da existência de proteína e cinzas [fibra = peso do resíduo - (peso de
proteínas + peso das cinzas)].
Para determinar os teores de fibra solúvel e insolúvel, depois do
tratamento com glucoamilase, filtra-se a mistura sobre Celite (ajuda a filtração).
A fibra insolúvel, retida no filtro, é lavada com água e o filtrado será a fibra
solúvel. Para a precipitar, adiciona-se etanol a 95% e água. Após filtrado, o
precipitado será lavado com etanol a 78%.
No final, o resíduo de fibra (total, insolúvel ou solúvel) é lavado com
etanol a 95% e acetona, seco em estufa e pesado. O teor de fibra tem que ser
corrigido para a presença de proteínas e minerais complexados com
constituintes das paredes celulares. Pode determinar-se o teor de amido
resistente suspendendo o resíduo em KOH 2M. A base vai solubilizar o amido
resistente, o qual é depois digerido com glucoamilase (após ajuste do pH a um
valor entre 4.0 e 4.7). A glucose libertada é determinada por via enzimática ou
colorimétrica.
Durante todo este procedimento experimental, é necessário preparar
brancos dos reagentes em duplicado, de modo a efectuar os cálculos (Fig. 9.8).
Introdução à Química Alimentar 2009
68
Fig. 9.8 – Determinação dos teores de fibra total, insolúvel e
solúvel.
1 2 = 2
R RB
P A
(9.1)
1 2
1 2
2%Fibra = x 100
2
R RP A B
m m
(9.2)
Nas equações 9.1 e 9.2, B é o valor do branco, P o da proteína, A o das
cinzas, m1 e m2 são os pesos das amostras em duplicado e R1 e R2 os pesos dos
resíduos, também em duplicado. A fibra total é igual à soma da fibra insolúvel
com a fibra solúvel.
A fibra total também pode ser determinada directamente por pesagem do
produto de digestão com glucoamilase, após adição de etanol a 95%, aquecido
a 60 ºC e seguindo o procedimento usado para determinação da fibra solúvel.
Nos métodos químicos, o teor em fibra é dado pela soma de todos os
monossacáridos não provenientes do amido mais a lenhina. Os monossacáridos
podem ser medidos por métodos colorimétricos ou cromatográficos (HPLC, GC).
A soma das hexoses, pentoses e ácidos urónicos dá o teor total em
polissacáridos.
O principal método químico para determinação de fibra é o método
Englyst-Cummings, no qual o amido é gelatinizado e digerido por enzimas. Os
restantes polissacáridos são hidrolisados com ácido sulfúrico. Os açúcares
neutros são determinados por cromatografia e os ácidos urónicos por
colorimetria. Em alternativa, todos os monossacáridos podem ser medidos por
colorimetria.
Introdução à Química Alimentar 2009
69
No método Englyst-Cummings, as amostras são misturadas com DMSO e
aquecidas em água a ferver, de modo a gelatinizar o amido. O amido será
digerido com pululanase e a proteína com pancreatina. A digestão do amido
será completada pela adição de glucoamilase. A fibra será precipitada pela
adição de etanol a 100% seguida de refrigeração. Por centrifugação separa-se
o resíduo de fibra. Segue-se a lavagem da fibra com, sucessivamente, etanol, a
85% (2 vezes), etanol a 100% e acetona, em cada caso seguida de
centrifugação. O resíduo final é seco e os polissacáridos presentes são
hidrolisados por incubação em H2SO4 concentrado a 35 ºC, posteriormente
diluído para 2 M e a mistura aquecida em água a ferver durante 1 h. A fracção
hidrolisada é usada para análise de açúcares, uma parte para determinação
cromatográfica dos açúcares neutros e a restante para determinação de ácido
urónico por colorimetria. O peso de fibra é dado pela soma dos açúcares
neutros com o ácido urónico.
Estes métodos são usados para determinar teores de fibra total. Quando
se pretende determinar o teor de fibra insolúvel, substitui-se o etanol absoluto
por um tampão de pH 7 e a fibra hidrossolúvel é extraída por aquecimento,
durante 30 min, da mistura digerida em água a ferver. A fibra insolúvel é
separada por centrifugação, lavada, seca e hidrolisada com ácido. O teor em
fibra solúvel será obtido por subtracção do teor de fibra insolúvel da fibra total
(fibra solúvel = fibra total – fibra insolúvel).
É possível determinar o teor em celulose na fibra total se não se efectuar
o passo de hidrólise com H2SO4 concentrado, passando directamente para a
hidrólise dos restantes polissacáridos com H2SO4 2 M. O peso dos
monossacáridos resultantes desta hidrólise é igual ao peso dos polissacáridos
não celulósicos e o teor em celulose é dado por fibra total – polissacáridos não
celulósicos.
Introdução à Química Alimentar 2009
70
Capítulo 10
Água
A água é a molécula mais abundante na superfície terrestre e é o
principal constituinte de muitos alimentos. Influencia directamente a sua
degradação e a sua textura. É o meio em que ocorrem diversas reacções
químicas e é um reagente nos processos hidrolíticos. É uma estrutura molecular
simples. Cada átomo de hidrogénio está ligado covalentemente ao átomo de
oxigénio através de um par de electrões partilhados. O oxigénio possui ainda
um outro par de electrões não partilhados.
A água é uma molécula polar, ou seja possui uma distribuição desigual da
sua densidade electrónica. A molécula possui uma carga negativa parcial (-)
perto do átomo de oxigénio, devida a um par de electrões não partilhados e
cargas positivas parciais (+) junto dos átomos de hidrogénio.
Fig. 10.1 – Representação esquemática do dipolo formado por
uma molécula de água.
A molécula da água possui uma estrutura tetraédrica ligeiramente
deformada. Cada molécula de água está coordenada com quatro outras
moléculas de água através de ligações de hidrogénio.
A estrutura da água é desestabilizada pela solubilização de sais ou
moléculas com grupos polares e/ou hidrofóbicos.
Esta estrutura tridimensional fortemente organizada está na base de
muitas das propriedades invulgares da água, tais como a sua grande
estabilidade e elevados pontos de fusão e ebulição.
Introdução à Química Alimentar 2009
71
A molécula de água pode sofrer uma auto-ionização, com a formação dos
iões H3O+ e OH-.
2H2O Ý H3O+ + OH- (10.1)
Fig. 10.2 – Estrutura tetraédrica de moléculas de água, ligadas
por pontes de hidrogénio.
Sendo um processo reversível, pode definir-se uma constante de
equilíbrio, K ’w.
+ -
3'
2
H O OH
H OwK
(10.2)
Como [H2O] é constante, pode escrever-se Kw=[H3O+][OH-]=10-14. Daqui
deriva o conceito de pH=-log[H3O+].
A água afecta a conservabilidade dos alimentos, não devido ao seu teor
mas sim à sua actividade. A actividade da água (aw) define-se como a pressão
de vapor da água acima de uma dada substância dividida pela pressão de vapor
da água pura, à mesma temperatura e varia entre 0 e 1.
0
w
Pa
P (10.3)
Na prática, a actividade da água descreve a quantidade de água em
equilíbrio disponível para a hidratação de uma dada substância. Um valor igual
a 0 indica a total ausência de moléculas de água livre disponíveis, enquanto que
um valor de 1 indica água pura.
A relação entre o teor de água e a actividade da água é indicada pelas
isotermas de sorção da substância. Estas apresentam uma forma sigmóide, com
Introdução à Química Alimentar 2009
72
pequenas variações conforme a estrutura física, a composição química, a
temperatura e a capacidade de retenção de água do alimento. Quando
aw < 0.3, estamos na zona de absorção primária, onde as moléculas de água
poderão estar ligadas a pontos de absorção primários (-COOH) que por sua vez
se ligam a outras moléculas de água por pontes de hidrogénio. Para valores de
aw entre 0.4 e 0.8, existe a possibilidade de reacções químicas e enzimáticas
rápidas, devido ao aumento da concentração dos reagentes. Nesta zona, o
crescimento de microrganismos é nulo ou muito rduzido. Acima de 0.9, as
reacções químicas e enzimáticas podem ver a sua velocidade reduzida pela
baixa concentração dos reagentes e haverão condições para crescimento
microbiano.
Fig. 10.3 – Isotermas de sorção, mostrando as três diferentes
zonas.
O teor de humidade nos alimentos apresenta grandes variações,
dependendo do alimento. Em função dessa variedade, são também vários os
métodos disponíveis para a sua determinação. Dependendo da forma em que a
água se encontra no alimento (livre, adsorvida ou água de hidratação) o
método escolhido poderá medir mais ou menos da humidade presente.
Durante a preparação duma amostra para determinação do seu teor em
humidade, será necessário minimizar percas ou ganhos de humidade
acidentais: reduzindo a exposição atmosférica; minimizando aquecimento por
fricção durante a trituração da amostra; reduzindo o volume do espaço de
cabeça no recipiente de armazenamento, para minimizar as percas por
equilíbrio da humidade com o ambiente; reduzindo variações de temperatura.
Os métodos mais simples para determinação do teor de humidade
baseiam-se na secagem em estufa e medição da perca de peso. Nestes
Introdução à Química Alimentar 2009
73
métodos, a quantidade de humidade medida depende do tipo de estufa usada,
das condições no interior da estufa, do tempo e da temperatura de secagem.
Estes métodos têm por base o ponto de ebulição da água que é inferior aos da
generalidade dos outros componentes alimentares. No entanto, alguns desses
componentes degradam a 100 ºC, como o caso dos hidratos de carbono,
libertando água (10.4). A água determinada nestes casos será sobreavaliada
relativamente ao verdadeiro valor.
C6H12O6 ɹ 6C + 6H2O (10.4)
Outras reacções, como por exemplo a hidrólise da sacarose (10.5), reduzem o
teor de humidade medido.
Sacarose + H2O ɹ Glucose + Frutose (10.5)
Outros problemas, embora menos sérios, resultam da perca de componentes
voláteis, contribuindo para a perca de peso da amostra. Por outro lado, pode
ocorrer ganho de peso devido à oxidação de ácidos gordos insaturados e de
outros compostos.
Existem três tipos de estufas usadas para determinação do teor de
humidade, estufas de convecção, com ventilação forçada e de vácuo. As
estufas de convecção são as menos precisas, já que podem existir variações de
temperatura no seu interior de ~10 ºC. Nas estufas de ventilação forçada essa
variação é inferior a 1 ºC. As estufas de vácuo têm pequenas variações de
temperatura no seu interior e a vantagem de eliminar a humidade interior.
Fazendo a secagem sob pressão reduzida, é possível obter, num prazo mais
curto, uma mais completa remoção de água e voláteis sem decomposição da
amostra.
Os recipientes utilizados para secagem de amostras são de diversas
formas e materiais, podendo ter tampa ou não. As tampas impedem a perca de
material durante o aquecimento. Sempre que possível, é aconselhável o uso de
material descartável. Estes recipientes devem ser sempre manipulados com o
auxílio de pinças, de modo a não deixar dedadas (iriam influir no peso) e
devem ser sempre bem secos em estufa antes de serem utilizados.
Introdução à Química Alimentar 2009
74
Fig. 10.4 – Estufa de vácuo, utilizada na determinação de
humidade.
Alguns alimentos tendem a formar crostas ou a aglomerar quando secos,
conduzindo a resultados errados. Para impedir que tal suceda, mistura-se areia
seca e previamente pesada.
Usando estes métodos, os teores de humidade e de sólidos totais são
calculados por
peso da amostra húmida - peso da amostra seca%Humidade = x 100
peso da amostra húmida (10.6)
peso da amostra seca%Sólidos totais = x 100
peso da amostra húmida (10.7)
As amostras são secas durante um dado período de tempo e depois
pesadas ou, em alternativa, são feitas secagens e pesagens sucessivas até
serem obtidas duas medidas seguidas idênticas.
A secagem por micro-ondas permite uma determinação rápida e precisa
do teor de humidade. Os modelos mais recentes permitem um controlo da
temperatura e alguns vêm equipados com uma balança no interior, permitindo
seguir a perca de água durante a secagem. Alguns equipamentos combinam a
secagem por micro-ondas com o efeito do vácuo, permitindo medições muito
rápidas. A amostra tem que ser uniforme e colcada no centro do aparelho de
modo a assegurar uma secagem uniforme e completa.
Fig. 10.5 – Medidor de humidade por micro-ondas.
Uma alternativa para secagem rápida de alimentos é a secagem por
radiação infra-vermelha.
O teor de humidade em alimentos pode ser determinado por destilação,
usando técnicas directas ou por refluxo. A humidade de um alimento é
Introdução à Química Alimentar 2009
75
codestilada com um solvente de ponto de ebulição superior e que seja imiscível
com a água.
Os métodos por destilação provocam menor degradação térmica dos
alimentos do que a secagem em estufa a temperaturas mais elevadas. A
destilação por refluxo é mais utilizada que a destilação directa.
A destilação por refluxo usa um solvente menos denso que a água (o mais
utilizado é o tolueno). O aquecimento leva à formação de uma emulsão, na
forma de vapor, de água em tolueno. Quando o vapor sobe, dá-se condensação
e a inversão da emulsão, com tolueno disperso na água. Ao arrefecer, a
turvação vai desaparecendo lentamente. O processo é repetido até não se
conseguir destilar mais água e o volume desta é medido.
Fig. 10.6 – Montagem para destilação por refluxo da humidade de
um alimento.
O método de Karl Fischer é um processo químico para determinação do
teor de humidade, particularmente adaptado a alimentos que produzem
resultados de má qualidade quando aquecidos ou submetidos a vácuo. Este
método tem por base a reacção de redução de iodo por SO2 na presença de
água.
2H2O + SO2 + I2 ↓ C5H2SO4 + 2HI (10.8)
O método foi modificado de modo a incluir metanol e piridina num sistema
que permita a dissolução do iodo e SO2:
C5H5N.I2 + C5H5N
.SO2 + C5H5N + H2O ↓ 2C5H5N.HI + C5H5N
.SO3 (10.9)
Introdução à Química Alimentar 2009
76
C5H5N.SO3 + CH3OH ↓ C5H5N(H)SO4
.CH3 (10.10)
O I2 em excesso que não reage com a água pode ser visualmente
determinado. O ponto de viragem é vermelho-acastanhado e pode também ser
determinado, com maiores sensibilidade e rigor, por potenciometria.
Fig. 10.7 – Titulador de Karl Fischer para determinação do teor de
humidade.
No método de Karl Fischer, adiciona-se directamente o reagente de Karl
Fischer (KFR) se a humidade na amostra estiver acessível. No caso de não estar
acessível, é necessário extraí-la primeiro com um solvente apropriado (metanol,
…). Esse extracto será depois titulado com o reagente de Karl Fischer.
Antes de efectuar o cálculo do teor de humidade numa amostra, é
necessário determinar a equivalência de humidade no reagente de Karl Fischer
(KFReq). Este valor representa a quantidade equivalente de humidade que reage
com 1 mL de reagente de Karl Fischer. Como o valor de KFReq varia com o
tempo, a padronização terá que ser verificada antes de cada utilização. O valor
de KFReq pode ser determinado com padrões de água, água em metanol ou
tartarato de sódio. Com tartarato de sódio, o valor de KFReq é dado por:
2 2 4 4 6 2eq
36 g H O/mol Na C H O 2H O x x 1000 =
230.08 g/mol x
SKFR
A
(10.11)
em que S é o peso do tartarato de sódio e A o volume de reagente necessário
para a titulação do tartarato de sódio.
Uma vez conhecido o valor de KFReq, determina-se o teor de humidade
usando a equação 10.12:
Introdução à Química Alimentar 2009
77
eq
2
KFR x %H O = x 100
sK
S (10.12)
em que Ks é o volume de reagente usado para titular a amostra e S o peso da
amostra.
O teor de humidade em alimentos pode ainda ser determinado através de
métodos físicos, como sejam os métodos electroquímicos, a hidrometria, a
refractometria, a espectrometria de IV e a medição do ponto de congelação.
Os métodos electroquímicos baseiam-se na medida da constante
dielétrica, que é mais elevada na água que na maioria dos outros solventes e
na medida da condutividade, que aumenta com o teor de humidade na
amostra. Nestes métodos há necessidade de calibrar os instrumentos com
padrões.
Em alimentos que contenham mais de 30 – 35 % de humidade não é
possível utilizar métodos electroquímicos.
A hidrometria mede a densidade com picnómetros, hidrómetros ou a
balança de Westphal.
A refractometria é usada para medir teores de humidade em produtos
líquidos ricos em açúcar e em leite condensado. Como todos os compostos
possuem um índice de refracção, a refractometria pode ser usada para
identificação de compostos, comparando o valor medido com os da literatura. O
índice de refracção varia com a concentração do composto, permitindo calcular
teores de humidade, mas também com a temperatura e o comprimento de
onda, pelo que se terá que trabalhar em condições controladas.
A utilização da espectrometria de IV na determinação do teor de
humidade baseia-se na existência de bandas de absorção a 1400 – 1450 nm e
1920 – 1950 nm, características do estiramento dos OH da água.
O ponto de congelação da água é utilizado para determinar o teor de
humidade no leite. Este valor varia entre -0.503 ºC e -0.541 ºC, sendo a média
-0.517 ºC. A determinação do ponto de congelação permite identificar
adulterações por adição de água e é feita através da fórmula seguinte, em que
T é o ponto de congelação da amostra:
2
0.517 - %H O adicionada = x 100
0.517
T (10.13)
No caso de se pretender determinar se um alimento é perecível, a
medição do teor de humidade não dá uma boa indicação, pois a água associa-
Introdução à Química Alimentar 2009
78
-se de diferentes formas com os alimentos. A água mais fortemente ligada não
está disponível para o crescimento microbiano, ao contrário da menos ligada. O
cálculo da actividade da água (aw) é uma melhor indicação dessa
disponibilidade da água para crescimento microbiano.
Introdução à Química Alimentar 2009
79
Capítulo 11
Vitaminas e minerais
As vitaminas são compostos orgânicos existentes em pequenas
quantidades nos alimentos, mas essenciais como nutrientes. São habitualmente
separadas em lipossolúveis (A, D, E e K) e hidrossolúveis. No ser humano são
encontradas as 4 lipossolúveis e 9 hidrossolúveis (8 vitaminas B e vitamina C).
Tabela 11.1
Nome genérico Designação química
Vitamina A Retinóides (retinol, retinóides, carotenóides)
Vitamina B1 Tiamina
Vitamina B2 Riboflavina
Vitamina B3 Niacina, niacinamida
Vitamina B5 Ácido pantoténico
Vitamina B6 Piridoxina, piridoxamina, piridoxal
Vitamina B7 Biotina
Vitamina B9 Ácido fólico, ácido folínico
Vitamina B12 Cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina
Vitamina C Ácido ascórbico
Vitamina D Ergocalciferol, colecalciferol
Vitamina E Tocoferóis, tocotrienóis
Vitamina K Filoquinona, menaquinonas
Designa-se por vitamina um composto que não é sintetizado em suficiente
quantidade pelo organismo, tendo que ser obtido através da alimentação.
As vitaminas são classificadas quanto às suas actividades biológica e
química, não quanto à sua estrutura. Por exemplo, o termo vitamina A é usado
para designar os compostos retinal, retinol e diversos carotenóides.
As vitaminas possuem diversas funções bioquímicas, incluindo hormonal
(ex. vitamina D), antioxidante (ex. vitamina E) e reguladora (ex. vitamina A). a
maioria das vitaminas (ex. complexo B) funciona como precursores de
Introdução à Química Alimentar 2009
80
coenzimas, participando no metabolismo. Nalguns casos (ex. biotina), as
próprias vitaminas funcionam como coenzimas, caso do ácido fólico.
OH
CH3
CH3CH3CH3 CH3
O
CH3
CH3CH3CH3 CH3
CH3
CH3CH3CH3 CH3
CH3 CH3
CH3
CH3 CH3
Retinol
Retinal
-Caroteno
Fig. 11.1 – Três dos compostos habitualmente designados por
vitamina A.
Os teores em vitaminas podem ser determinados segundo três
estratégias: ensaios biológicos em seres humanos e animais, ensaios
microbiológicos e ensaios físico-químicos.
Os ensaios biológicos apenas serão utilizados se não existir uma outra
alternativa.
Como algumas vitaminas são sensíveis à luz, ao oxigénio, ao calor e a
alterações de pH, deverão ser tidas precauções adequadas na preparação e
armazenamento das amostras.
Em geral, os métodos de análise de vitaminas requerem a sua prévia
extracção do alimento. Os métodos de extracção são quase sempre específicos
para cada vitamina e envolvem tratamentos com ácidos, bases, solventes,
enzimas ou aplicação de calor. Em particular, para:
ácido ascórbico – extracção a frio com ácido metafosfórico/ácido
acético;
vitaminas B1 e B2 – ebulição (ou autoclave) em ácido seguida de
tratamento enzimático;
niacina – aquecimento em autoclave em ácido (produtos não
derivados de cereais) ou em base (cereais);
vitaminas A, E ou D – extracção em solvente orgânico,
saponificação e nova extracção com solvente orgânico. Adicionam-
-se antioxidantes, para impedir oxidações.
Introdução à Química Alimentar 2009
81
A análise das vitaminas lipossolúveis pode exigir a sua saponificação.
Os ensaios microbiológicos estão limitados às vitaminas hidrossolúveis. O
crescimento de um dado microrganismo numa amostra contendo a vitamina a
analisar é comparado com o seu crescimento em meio contendo quantidades
conhecidas dessa vitamina. O crescimento pode ser medido em termos de
turbidez, produção de ácido, gravimetria ou respiração. Existem métodos
microbiológicos oficiais para análise de niacina e folato.
Os métodos químicos permitem analisar um maior número de vitaminas:
A, E, C, B1 e B2.
A vitamina A é sensível à radiação UV, ar e outros agentes oxidantes,
temperaturas elevadas e humidade, pelo que é necessário trabalhar com
equipamento adequado, sob condições não oxidantes e a temperatura
controlada. O único método considerado rigoroso para determinação de
vitamina A é a cromatografia líquida (HPLC).
A amostra é primeiro saponificada (após adição de pirogalol, que vai servir
de antioxidante) depois a vitamina A é extraída com um solvente orgânico e
concentrada, seguindo-se a determinação por HPLC. A cromatografia permite
separar os isómeros trans-retinol e cis-retinol e as respectivas determinações
são feitas a partir das equações abaixo.
TT
ST
x x DF
-retinol =
AW
Atrans
V (11.1)
CC
SC
x x DF
-retinol =
AW
Acis
V (11.2)
AT é a área do pico de trans-retinol na amostra, AC é a área do pico de cis-
retinol na amostra, AST e ASC as áreas dos picos dos padrões de trans e cis-
retinol, respectivamente, WT e WC os pesos de amostra, DF o factor de diluição
e V o volume da amostra.
A vitamina E encontra-se nos alimentos sob oito formas diferentes, os
tocoferóis , , e e os quatro tocotrienóis correspondentes (, , e ).
A análise de vitamina E é feita em HPLC de fase normal, com detecção por
fluorescência, com excitação a 290 nm e leitura da emissão a 330 nm.
Dependendo da origem da amostra, os procedimentos analíticos diferem,
fazendo-se, para a generalidade dos alimentos, uma saponificação sob refluxo,
na presença de pirogalol, seguida por uma extracção com hexano e injecção no
Introdução à Química Alimentar 2009
82
cromatógrafo. No caso de margarinas e outras gorduras vegetais sólidas,
dissolve-se a amostra em hexano, adiciona-se MgSO4 para remover a água,
filtra-se e injecta-se o filtrado em HPLC. Os óleos são dissolvidos em hexano e
directamente injectados no HPLC.
Fig. 11.2 – As oito formas de vitamina E encontradas nos
alimentos.
A quantificação da vitamina E é feita recorrendo ao método do padrão
externo.
A vitamina C (ácido L-ascórbico e ácido L-dehidroascórbico) é muito
susceptível a degradação oxidativa, sobretudo a pH elevado e na presença de
Fe3+ e Cu2+. Deste modo, a sua análise deverá realizar-se a baixo pH e na
presença de um agente quelante. A oxidação suave do ácido ascórbico resulta
na formação de ácido dehidroascórbico, o qual pode ser reconvertido em ácido
ascórbico por reacção com agentes redutores.
A determinação de vitamina C pode ser feita por dois métodos diferentes,
um titrimétrico e outro com análise por espectroscopia de fluorescência.
No método titrimétrico, o ácido ascórbico é oxidado a ácido
dehidroascórbico por um indicador corado. No final da titulação, o indicador em
excesso é rosado em meio ácido e poderá ser quantificado por absorção
electrónica a 545 nm. O cálculo do teor em ácido ascórbico (mg por g ou mL de
amostra) é feito usando a equação 11.3, em que C é o peso de ácido ascórbico
por mL de indicador, V o volume de indicador usado para titular a amostra
diluída, DF o factor de diluição e WT o peso da amostra.
DFteor em ácido ascórbico = x x
WTC V (11.3)
Introdução à Química Alimentar 2009
83
O método microfluorimétrico mede tanto o ácido ascórbico como o ácido
dehidroascórbico. Após oxidação do ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico,
faz-se reagir este com o-fenilenodiamina, formando um composto fluorescente,
o qual é medido com excitação a 356 nm e emissão a 440 nm. Para compensar
a possível existência de interferentes é necessário preparar um branco com
ácido bórico antes da adição da solução de o-fenilenodiamina.
O cálculo do teor em ácido ascórbico (mg por g ou mL) é dado pela
equação 11.4, em que A e C são as intensidades de fluorescência da amostra e
do padrão, respectivamente, B e D são as intensidades de fluorescência dos
brancos da amostra e do padrão, respectivamente, S é a concentração do
padrão, DF o factor de diluição e WT o peso da amostra.
DFteor em ácido ascórbico = x x
WT
A BS
C D
(11.4)
A medição do teor em vitamina B1 baseia-se na medida da fluorescência
da sua forma oxidada, o tiocromo. Como o tiocromo é sensível à luz, todos os
passos a seguir à oxidação devem ser feitos ao abrigo da luz forte. A própria
tiamina (vitamina B1) é sensível ao calor, sobretudo em meio alcalino, pelo que
o procedimento deve ser efectuado com rapidez.
A tiamina é oxidada por K2Fe(CN)6 e a leitura do tiocromo é feita com
excitação a 365 nm e emissão a 435 nm. É preparado um branco para corrigir
para a presença de interferentes e a quantificação é feita com recurso a
padrões da vitamina, usando a fórmula seguinte:
b o
b p
- 25teor em tiamina = x x x
Std - Std WT
S S VC
A V (11.5)
S e Sb são as intensidades de fluorescência da amostra e do branco da amostra,
respectivamente, Std e Stdb são as intensidades de fluorescência do padrão e
do branco do padrão, respectivamente, C é a concentração do padrão, A é o
volume da alíquota usada, 25 o volume final eluído, Vp o volume que atravessa
a coluna cromatográfica, Vo, o volume de diluição da amostra original e WT o
peso da amostra. O teor em vitamina B1 é expresso em mg/g.
A determinação da vitamina B2 (riboflavina) segue também um método
fluorimétrico. A riboflavina é oxidada por KMnO4 e o produto formado é
doseado por fluorescência, com excitação a 440 nm e leitura de emissão a
565 nm. É necessário ter atenção à sensibilidade da vitamina B2 à radiação UV.
Para calcular o teor em riboflavina (mg/g) usa-se a fórmula:
- CS DFteor em riboflavina = x x
- WT
A C
B A V (11.6)
Introdução à Química Alimentar 2009
84
A e C são as intensidades de fluorescência da amostra contendo água e
hidrossulfito de sódio (redutor), respectivamente, B é a intensidade de
fluorescência da amostra contendo o padrão da vitamina, CS a concentração do
padrão, V o volume da amostra usada na medida de fluorescência, DF o factor
de diluição e WT o peso da amostra.
Os minerais são os constituintes que permanecem, sob a forma de
cinzas, após a combustão de tecidos vegetais e animais. Podem ser divididos
em elementos essenciais, microelementos e ultra-microelementos. Os
elementos essenciais são Na, K, Ca, Mg, Cl e P e possuem essa designação
devido a serem necessários na dieta humana em teores superiores a 50 mg/dia.
Os microelementos (Fe, I, F, Zn, Se, Cu, Mn, Cr, Mo, Co, Ni) são necessários
em concentrações inferiores a 50 mg/dia. O seu papel biológico é variado (em
vitaminas, enzimas e outras proteínas) e a sua deficiência resulta em problemas
metabólicos.
A deficiência nos elementos Al, As, Ba, Bi, B, Br, Cd, Cs, Ge, Hg, Li, Pb,
Rb, Sb, Si, Sm, Sn, Sr, Tl, Ti e W parece estar associada a alguns problemas de
saúde, mas não estando completamente estabelecidas relações causa/efeito
nem as dosagens requeridas, sabendo-se apenas serem muito baixas.
Os elementos essenciais e os microelementos exibem diversas actividades,
como sejam eléctrólitos, constituintes de enzimas e constituintes estruturais de
ossos e dentes.
Os teores em minerais nos alimentos variam durante o seu processamento
e a sua absorção pelo organismo depende da presença de outros compostos
(proteínas, péptidos, aminoácidos, polissacáridos, açúcares, lenhina, fitina e
ácidos orgânicos) que a eles se ligam, aumentando ou reduzindo a sua
absorção.
A análise de minerais em alimentos pode ser feita por diversos processos,
sendo em geral necessário extrair os minerais previamente da amostra. Um dos
principais problemas existentes, na preparação de uma amostra para análise de
minerais, é a existência de contaminação causada pelo equipamento, pelo que
deverão, sempre que possível, ser utilizados materiais não metálicos.
O ligando etilenodiaminatetraacetato (EDTA) forma complexos com
diversos iões minerais, permitindo a sua utilização em titulações
complexométricas para análise de minerais. Os pontos finais das titulações
podem ser determinados usando outros quelantes, com constantes de
Introdução à Química Alimentar 2009
85
coordenação menores que o EDTA (menor afinidade para os iões) e que
originam cores diferentes nos estados livre e complexado.
Fig. 11.3 – Complexo formado entre Ca2+ e EDTA.
A principal aplicação deste método é na análise de cálcio e magnésio para
determinação da dureza da água, mas também é utilizado para determinar o
teor de cálcio em vegetais e outros alimentos em que os teores de magnésio e
fósforo são baixos.
A titulação por precipitação está na origem de métodos utilizados pela
indústria alimentar na determinação de minerais.
O método de Mohr para determinação de cloretos é um deles e baseia-se
na formação de um sólido de cor laranja (cromato de prata) após o ião prata,
proveniente do nitrato de prata adicionado, ter complexado todo o cloreto
disponível.
Ag+ + Cl- ɹ AgCl (11.7)
2Ag+ + CrO4
2- ɹ Ag2CrO4 (11.8)
Fig. 11.4 – Método de Mohr. Titulação antes (esquerda) e após
(direita) a formação do precipitado.
Uma das aplicações do método de Mohr é na determinação de sal em
alimentos.
Introdução à Química Alimentar 2009
86
No método de Volhard, um excesso de uma solução padrão de nitrato de
prata é adicionada a uma solução de uma amostra contendo cloreto. O excesso
de prata é depois titulado com uma solução padrão de tiocianato de potássio ou
amónio, usando Fe3+ como indicador. FeSCN é vermelho, permitindo identificar
a existência de SCN- não ligado a Ag+. A quantidade de prata, que precipita
com o cloreto presente na solução da amostra, é calculada por subtracção do
excesso de prata do total originalmente adicionado.
Ag+ + Cl- ɹ AgCl (11.9)
Ag+ + SCN- ɹ AgSCN (11.10)
SCN- + Fe3+ ɹ FeSCN (11.11)
A reacção 11.10 permite determinar a quantidade de prata não
complexada com o cloreto.
Os métodos colorimétricos utilizam compostos que, após reacção com a
substância a determinar, formam produtos coloridos. Existem vários destes
compostos capazes de reagir selectivamente com diversos minerais. O produto
de reacção colorido é solúvel e pode ser quantificado por espectroscopia de
absorção electrónica, utilizando a lei de Lambert-Beer. A quantificação é
habitualmente efectuada com recurso a uma curva de calibração feita com
padrões.
De modo a ter o mineral livre de interferentes, é necessário proceder a
uma prévia incineração da amostra, obtendo assim as suas cinzas, a partir das
quais se solubiliza o mineral a determinar.
Os métodos colorimétricos são geralmente muito específicos, podendo ser
executados sem separação dos diversos minerais existentes nas cinzas e, em
muitos casos, permitem obter uma precisão semelhante à da absorção atómica.
Foram desenvolvidos diversos eléctrodos para medidas selectivas de
vários aniões e catiões (brometo, cálcio, cloreto, fluoreto, potássio, sódio e
sulfito). Estes eléctrodos selectivos de iões permitem determinar a actividade
iónica, a qual pode ser considerada próxima da concentração dos iões medidos.
Esta aproximação só é válida em condições de baixas concentrações e força
iónica controlada.
A relação entre a actividade iónica e a concentração é dada por
A = C (11.12)
Introdução à Química Alimentar 2009
87
O coeficiente de actividade () varia em função da força iónica, o que justifica a
utilização de tampões para ajuste da força iónica nas amostras e nos padrões.
A eficácia destes eléctrodos é afectada pela presença de interferentes,
sobretudo por iões com carga e tamanho semelhantes aos que se pretende
determinar. Como também a temperatura afecta a resposta dos eléctrodos, é
necessário trabalhar a temperatura constante.
A concentração do ião de interesse pode ser calculada através de uma
curva de calibração, da adição de um padrão ou por determinação do ponto
final de uma titulação. O método de adição de padrão é usado quando existe
um número pequeno de amostras, não permitindo o desenvolvimento de uma
curva de calibração. Os eléctrodos selectivos podem ser usados para determinar
o ponto final de uma titulação, usando compostos que formam precipitados ou
complexos fortes com o ião a analisar.
Define-se como cinza o resíduo inorgânico que resulta da combustão ou
total oxidação da matéria orgânica de um alimento. Existem dois tipos de
procedimentos para análise de cinzas, o método das cinzas secas, usado
sobretudo para determinação do teor em cinzas e análise de alguns minerais
específicos e o método das cinzas húmidas (oxidação) que serve de preparação
para a análise de diversos minerais. Os alimentos secos não requerem qualquer
preparação prévia, mas os restantes necessitam uma secagem antes da
obtenção das suas cinzas. Os alimentos ricos em gordura poderão ter que
sofrer uma prévia extracção de lípidos, para além da secagem.
As cinzas secas são obtidas numa mufla capaz de atingir 500 – 600 ºC. A
água e os compostos voláteis são vaporizados e os compostos orgânicos
degradados, na presença de oxigénio do ar, a CO2 e óxidos de azoto. A maioria
dos minerais é convertida em óxidos, sulfatos, fosfatos, cloretos e silicatos.
Alguns elementos (Fe, Se, Pb e Hg) podem ser parcialmente volatilizados, pelo
que este método não é adequado se se pretende analisar os componentes
individuais de uma amostra.
Para determinar a composição mineral de um alimento recorre-se ao
método das cinzas húmidas. Neste método, as substâncias orgânicas são
oxidadas por ácidos, agentes oxidantes ou combinações de ambos. Os minerais
são solubilizados sem volatilização.
As amostras podem provir de outras determinações que necessitam de
usar material seco. A maioria do material vegetal deverá ser seco em duas
etapas, primeiro a 55 ºC e depois a uma temperatura superior, de modo a
impedir a interferência da lenhina. Se as amostras vegetais tiverem um teor de
humidade inferior a 15% não é necessário secá-las previamente.
Introdução à Química Alimentar 2009
88
Alguns alimentos requerem tratamentos adicionais, antes da obtenção das
cinzas, devido a terem elevados teores de gordura ou humidade (salpicos,
dilatação) ou açúcares (formação de espuma) o que impede a perca de
amostra. Carnes, açúcares e compotas deverão ser secos num banho de vapor
ou com uma lâmpada de infra-vermelhos. Adicionam-se uma ou duas gostas de
azeite (que não produz cinzas) para permitir a saída de vapor à medida que se
vai formando uma crosta na amostra.
As cinzas secas são obtidas por incineração a 525 ºC ou mais, existindo
diversos tipos de recipientes para o efeito. A escolha do material de que estes
são feitos depende da natureza da amostra. Os de quartzo são resistentes a
ácidos e halogéneos, mas não a bases, a temperaturas elevadas. Os de Vycor
são estáveis a 900 ºC, mas os de Pyrex apenas até 500 ºC. Recipientes de
porcelana possuem propriedades semelhantes às dos de quartzo, mas tendem
a quebrar com variações bruscas de temperatura. Devido ao seu baixo preço,
são frequentemente os escolhidos. Os recipientes de aço são resistentes a
ácidos e a bases e são baratos, mas podem originar contaminações com crómio
e níquel. A platina é provavelmente o melhor material, mas é muito cara.
Existem também recipientes descartáveis, de fibra de quartzo, os quais
suportam temperaturas até 1000 ºC e, sendo porosos, permitem rápidos
aquecimento e arrefecimento.
Após incineração, os recipientes devem ser arrefecidos num exsicador,
antes de pesados. O teor em cinzas será calculado a partir de:
peso após incineração - peso do cadinho% cinza = x 100
peso da amostra x coeficiente de matéria seca (11.13)
em que:
% sólidoscoeficiente de matéria seca =
100 (11.14)
No método das cinzas húmidas, não existe um único ácido capaz de,
completa e rapidamente, oxidar um material orgânico. É frequente utilizar
combinações de ácidos: nítrico, sulfúrico/peróxido de hidrogénio, perclórico.
São usadas diferentes combinações para diferentes tipos de amostra. Como o
ácido perclórico, embora muito eficaz, é de utilização mais perigosa, existe uma
tendência para substituí-lo.
Quer o método das cinzas secas, quer o das cinzas húmidas podem ser
realizados em aparelhos de micro-ondas, reduzindo o tempo de preparação de
amostra a alguns minutos. A obtenção de cinzas húmidas pode ser feita em
recipiente aberto ou fechado, sendo que neste último podem ser aplicadas
Introdução à Química Alimentar 2009
89
pressão e temperatura elevadas, o que aumenta a eficácia do sistema.
Concretamente, pode ser utilizado apenas ácido nítrico para a digestão,
tornando o processo mais seguro.
As muflas por micro-ondas, usadas para obtenção de cinzas secas, são
muito mais rápidas que as muflas convencionais (até 97% mais rápidas) já que
conseguem operar a temperaturas até 1200 ºC.
Para além das cinzas secas e húmidas, existem outros tipos de métodos
com cinzas aplicáveis à análise de alimentos:
cinzas solúveis e insolúveis, aplicadas a frutos;
cinzas insolúveis em ácido, para determinação de contaminantes
insolúveis em ácido;
alcalinidade das cinzas, para distinguir entre cinzas de frutos e
legumes (alcalinas) e de carnes e alguns cereais (ácidas);
cinzas sulfatadas, aplicadas a açúcares, xaropes e corantes.
Introdução à Química Alimentar 2009
90
Capítulo 12
Aditivos Alimentares
Aditivos alimentares são substâncias adicionadas, em pequenas
quantidades, aos alimentos, intervindo na sua produção, processamento,
embalagem e/ou armazenamento. Habitualmente, os aditivos ou as substâncias
resultantes da sua degradação permanecem nos alimentos, embora por vezes
sejam removidos durante o processamento.
Podem usar-se aditivos para:
alterar o valor nutritivo de um alimento – vitaminas, minerais,
aminoácidos e seus derivados, mas também espessantes,
emulsificantes, edulcorantes, etc. para certos tipos de dietas;
alterar as propriedades sensoriais de um alimento – corantes,
aromatizantes e potenciadores de sabor são usados para corrigir
percas sensoriais durante o processamento e armazenamento dos
alimentos. Estabilizantes, antioxidantes e outros compostos
também podem ser usados para impedir essas percas;
aumentar o tempo de prateleira de um alimento – aditivos para
proteger contra a degradação microbiana e agentes que impedem
ou retardam alterações químicas ou físicas, tais como reguladores
de pH e espessantes;
alterar o valor prático de um alimento – compostos usados para
permitir a produção de alimentos de preparação culinária mais fácil
e mais rápida.
Os aditivos alimentares e os seus produtos de degradação não poderão
ser tóxicos nas concentrações em que são utilizados. A sua utilização é
regulamentada, embora essa regulamentação varie um pouco de país para
país. No entanto, há correntemente um esforço de harmonização internacional,
baseada simultaneamente nos conhecimentos de toxicologia e nas
necessidades tecnológicas modernas.
Na Europa, é atribuído um nº E aos aditivos alimentares aprovados. Essa
aprovação é atribuída apenas após uma avaliação da segurança do aditivo nas
condições de utilização pretendidas.
Introdução à Química Alimentar 2009
91
São apresentadas de seguida algumas das principais propriedades dos
aditivos alimentares.
12.1 Potenciadores de sabor
São compostos que intensificam o aroma de um alimento, embora eles
próprios não exibam aroma nem gosto, nas concentrações utilizadas. O seu
efeito é intensificar e acelerar a percepção do aroma.
Encontram-se neste grupo aditivos como o glutamato monosódico e o
maltol.
12.2 Substitutos do açúcar
Encontram-se neste grupo as substâncias que são usadas como
edulcorantes, mas que são metabolizados sem a influência da insulina. Alguns
exemplos são os álcoois de açúcar ou polióis, sorbitol, xilitol e manitol.
12.3 Edulcorantes
São compostos naturais ou sintéticos que transmitem uma sensação de
doçura, possuindo pouco ou nenhum valor nutricional. Não se incluem neste
grupo os hidratos de carbono.
12.4 Conservantes
São sobretudo compostos com actividade antimicrobiana, cujo uso se
destina a substituir ou complementar processos físicos de eliminação da
microflora contaminante dos alimentos. Tem havido pouca evolução nas
substâncias utilizadas, pois é difícil encontrar compostos simultaneamente com
largo espectro antimicrobiano, baixa toxicidade e custo razoável. A maioria
destes são ácidos fracos, como os ácidos sórbico, benzóico, propiónico e acético
e seus derivados. Também utilizados para este efeito são o SO2 e os sulfitos,
nitritos e nitratos.
12.5 Antioxidantes
A oxidação lipídica pode ser retardada pela remoção do oxigénio ou pela
adição de antioxidantes. Estes são, na maioria, compostos fenólicos (naturais
ou sintéticos) e são mais eficazes se usados em simultâneo com um agente
quelante. Os antioxidantes mais importantes são os tocoferóis, ésteres do ácido
ascórbico, ésteres do ácido gálico, BHT (butilhidroxitolueno) e BHA
(butilhidroxianisole). Os agentes quelantes contribuem para a estabilização das
Introdução à Química Alimentar 2009
92
cores, aromas e texturas, devido à sua capacidade para se ligarem a iões
metálicos, os quais actuam como catalisadores da oxidação de gorduras.
Diversos constituintes dos alimentos possuem essa capacidade, tais como os
ácidos carboxílicos e polifosfóricos, os aminoácidos, péptidos, proteínas e
porfirinas.
12.6 Agentes tensioactivos
Os agentes tensioactivos, naturais e sintéticos, são usados no
processamento de alimentos quando é necessária a redução da sua tensão
superficial, como por exemplo na produção e estabilização de dispersões. Estas
dispersões incluem emulsões, espumas, aerossóis e suspensões. Em todos os
casos existem duas fases distintas, uma externa e contínua e outra interna e
descontínua, a fase dispersa.
12.7 Substitutos de gorduras
Compostos que se destinam a substituir as gorduras tradicionais, devido
ao elevado valor energético destas. No entanto, nenhum dos substitutos
consegue preencher todas as funções das gorduras. Os substitutos podem ser
divididos em dois grupos, os naturais (miméticos das gorduras) e os sintéticos
(substitutos das gorduras).
Reduzindo o tamanho de partícula das proteínas a 0.1 – 3 m dá-lhes
uma textura cremosa, permitindo a sua utilização na substituição de gorduras
em alimentos que não requeiram exposição a temperaturas elevadas (gelados,
sobremesas, etc.).
Alguns oligossacáridos, que se dissolvem completamente em água quente,
podem ser obtidos a partir do amido. Após arrefecimento destas soluções,
obtém-se um gel, cuja textura é semelhante à dos óleos alimentares, podendo
ser usados como substitutos da gordura em margarinas, por exemplo.
12.8 Espessantes, gelificantes e estabilizantes
Diversos polissacáridos e seus derivados provocam um aumento de
viscosidade, a formação de géis e a estabilização de emulsões, espumas e
suspensões. Estes compostos também são inibidores da cristalização (produtos
de confeitaria, gelados, etc.) e são usados para encapsular aromas, em
alimentos desidratados.
A gelatina é uma proteína com actividade gelificante, usada em diversos
alimentos.
Introdução à Química Alimentar 2009
93
12.9 Humectantes
Alguns polióis, como o glicerol e o sorbitol, possuem propriedades
higroscópicas específicas, o que possibilita a sua utilização como humectantes,
isto é agentes que retêm a textura e suavidade de um alimento, impedindo
também a cristalização.
Introdução à Química Alimentar 2009
94
Capítulo 13
Contaminantes Alimentares
Os alimentos podem sofrer contaminação por compostos tóxicos de
diversas proveniências:
Poluentes derivados da queima de combustíveis fósseis, de
radionuclídeos ou de emissões originadas em processos industriais
(microelementos tóxicos, PAHs, dioxinas, etc.).
Componentes do material de embalagem, detergentes,
desinfectantes, etc.
Metabolitos tóxicos produzidos por microrganismos.
Resíduos de produtos usados na protecção de culturas.
Resíduos originados na criação de aves e de gado (medicamentos e
aditivos usados em rações).
Outros contaminantes podem ser formados no próprio alimento ou no
aparelho digestivo, devido a reacções de alguns ingredientes e aditivos
alimentares, caso das nitrosaminas.
Entre os contaminantes mais relevantes contam-se os microelementos
arsénico, mercúrio, chumbo e cádmio. Relativamente aos radionuclídeos, os
radioisótopos 137Cs e 90Sr contam-se entre os mais perigosos.
A actividade tóxica microbiana é atribuída às enterotoxinas produzidas por
bactérias. Estes compostos são maioritariamente proteínas com actividade
antigénica e muito venenosas. Contam-se entre estas as toxinas produzidas por
Clostridium botulinum, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus.
Também os fungos produzem toxinas alimentares, designadas por
micotoxinas. As mais estudadas e tóxicas são as aflatoxinas produzidas pelo
género Aspergillus spp. A aflatoxina B1 é o mais forte carcinogénico conhecido.
Estas toxinas provêm principalmente dos frutos e frutos secos, sendo os
pistachios uma das fontes mais importantes.
Os produtos utilizados na protecção de culturas compreendem os
herbicidas, fungicidas e insecticidas, mas também outros pesticidas menos
frequentemente utilizados e ainda os reguladores do crescimento das plantas.
Introdução à Química Alimentar 2009
95
Os alimentos de origem vegetal podem ser directamente contaminados
devido ao tratamento das plantas ou por absorção a partir do solo, a partir da
atmosfera ou a partir de locais de armazenamento previamente tratados. Os
alimentos de origem animal são contaminados devido a ingestão, por parte do
animal, de alimentos contendo agentes de limpeza ou por contacto dos animais
com materiais tratados, com medicamentos ou por ingestão de rações contendo
material vegetal desinfectado.
Fig. 13.1 – Estrutura da aflatoxina B1, produzida por Aspergillus
spp.
Diversos medicamentos, como antibióticos, antihelmínticos e
coccidiostáticos são habitualmente usados no tratamento de animais, podendo
esse uso resultar em contaminação alimentar.
Os bifenilos policlorados (PCBs) são misturas complexas de substâncias
usadas em diversas indústrias que, devido à sua ampla utilização, entram em
contacto com os alimentos. Sendo muito persistentes e lipossolúveis tendem a
acumular em alimentos gordos. Acresce que estes compostos podem produzir,
por combustão, dioxinas fortemente tóxicas. Devido a estes factos, a sua
produção e aplicação encontram-se interditas.
A queima de matéria orgânica como madeira, óleo ou carvão resulta em
reacções de pirólise e na formação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(PAHs), com efeito carcinogénico. Estes compostos podem contaminar os
alimentos, quer através dos processos de preparação dos mesmos, quer
através de transporte pela atmosfera. Sendo compostos lipossolúveis, tendem a
acumular em tecidos gordos.
O nitrato provém principalmente dos alimentos de origem vegetal, mas
também de alguma carne e peixe, enquanto que o nitrito é originário,
sobretudo, de carne e produtos cárneos curados. A toxicidade do nitrato deriva
da sua oxidação a nitrito, causada por bactérias.
As nitrosaminas e nitrosamidas são potentes carcinogénicos, provenientes
de alimentos curados ou sujeitos a temperaturas elevadas.
Introdução à Química Alimentar 2009
96
As dioxinas, dibenzo-p-dioxinas policloradas e dibenzofuranos policlorados,
ocorrem associados a diversos produtos clorados e bromados. Também podem
ser formadas por processos térmicos, na presença de compostos halogenados.
São compostos que se concentram na fase gorda dos alimentos (ex. leite) e de
toxicidade variável.
Existem diversos métodos analíticos para determinação de resíduos de
pesticidas, podendo ser quantitativos (resíduo único ou multi-resíduos), semi-
-quantitativos ou ainda qualitativos (Tabela 13.1).
Tabela 13.1
Quantitativo Semi-quantitativo ou qualitativo
Multi-resíduos GC TLC HPLC Inibição enzimática
Resíduo único GC HPLC Ensaios imunológicos
Os métodos multi-resíduos são usados para detectar e medir diversos
resíduos numa variedade de alimentos. São suficientemente rigorosos para
permitir boas estimativas de teores de resíduos para muitos pesticidas, aos
níveis (ou mesmo abaixo) legalmente permitidos.
Estes métodos utilizam passos de preparação da amostra, extracção,
eliminação de interferentes (cleanup), separação cromatográfica e quantificação
com a ajuda de detectores muito selectivos. Nenhum destes métodos é capaz
de detectar todos os resíduos de pesticidas em todos os tipos de plantas. Na
prática, representam um compromisso entre o número de resíduos que podem
ser detectados, a gama de alimentos em que podem ser empregues e os níveis
de resíduos que podem ser medidos.
Os métodos de resíduo único envolvem os mesmos passos que os para
multi-resíduos, mas com cada passo optimizado para o resíduo de interesse. O
seu objectivo é medir um único analito e, frequentemente, os seus principais
metabolitos e produtos de transformação com importância toxicológica.
Os métodos quantitativos seguem os passos gerais de preparação da
amostra, extracção, eliminação de impurezas, separação, detecção e
quantificação. A escolha do método a utilizar depende das propriedades da
amostra e do analito de interesse e dos equipamentos analíticos disponíveis. É
conveniente dividir os alimentos em quatro grupos, segundo os seus teores em
gordura e humidade: 1) humidade elevada, gordura baixa (frutos e legumes);
Introdução à Química Alimentar 2009
97
2) humidade e gordura elevadas (carnes); 3) humidade e gordura baixas
(frutos secos); 4) humidade baixa, gordura elevada (grãos de cacau).
Os pesticidas encontram-se distribuídos à superfície das plantas, de um
modo não uniforme. Os frutos e legumes frescos não devem ser lavados antes
da análise e apenas deverão ser removidas as partes externas danificadas.
Quando as partes externas dos vegetais não são habitualmente consumidas,
estas são removidas antes da análise. Deve ter-se cuidado com alguns
pesticidas que podem ser degradados pela trituração ou pela maceração da
amostra, durante a sua preparação.
A extracção é habitualmente feita com um solvente orgânico (acetonitrilo
ou acetona) sendo adicionado um sal anidro (NaCl ou Na2SO4) para absorver
água. Noutros casos, pode ser adicionada uma pequena quantidade de água
para facilitar a purificação do extracto numa subsequente partição contra outro
solvente orgânico. No final, o solvente é separado da fracção sólida por
filtração.
O extracto obtido é, frequentemente, submetido a uma purificação parcial
(cleanup) antes dos passos de separação e quantificação. Neste passo tenta
eliminar-se os interferentes, podendo usar-se métodos cromatográficos
(adsorção ou exclusão molecular). Mais recentemente, foram introduzidas
técnicas alternativas, com menor consumo de solventes e uma maior rapidez de
execução. A extracção em fase sólida (SPE) usa uma pequena quantidade de
um material de empacotamento, contido em pequenas colunas ou em discos, o
qual permite purificar, concentrar ou derivatizar os analitos antes do passo de
separação cromatográfica. A microextracção em fase sólida (SPME) envolve a
utilização de uma fibra revestida com um polímero adsorvente, a qual é imersa
num extracto aquoso ou colocada no espaço de cabeça de um recipiente
contendo a amostra, de modo que os analitos difundem para o revestimento da
fibra. Após atingir o equilíbrio, a fibra é transferida para o injector de um GC e
os analitos sofrem uma desorção térmica para o interior da coluna. A extracção
com solvente assistida por micro-ondas também permite reduzir o tempo de
extracção e a quantidade de solvente utilizada. Tal deve-se à utilização de
temperaturas superiores aos pontos de ebulição dos solventes. A extracção
acelerada com solventes utiliza pequenas quantidades de solventes
convencionais a temperatura e/ou pressão elevadas.
Por vezes é útil ou necessário derivatizar os analitos para facilitar a sua
separação e detecção. Esta derivatização é habitualmente efectuada antes da
entrada na coluna cromatográfica (derivatização pré-coluna) mas pode também
ser feita após saída da coluna (derivatização pós-coluna). Esta técnica tem
Introdução à Química Alimentar 2009
98
aplicação limitada aos métodos de resíduo único ou àqueles que determinam
um pequeno grupo de resíduos com estrutura química semelhante.
A cromatografia gasosa é a técnica mais utilizada para separação e
determinação de pesticidas. Existem processos descritos para colunas de
empacotamento e capilares, bem como para colunas megabore, as quais
possuem características intermédias entre as de empacotamento e as capilares.
A maioria dos pesticidas contém heteroátomos (outros que não C, H e O) na
sua estrutura, o que é explorado pelos detectores que respondem a esses
átomos: de chama (FID) para detecção de S e P, de captura electrónica (ECD)
e de condutividade para halogéneos, S e N, térmiónico (TID) para N e P. A
espectrometria de massa (MS) é um método fortemente selectivo para
identificação e quantificação de pesticidas.
Os componentes separados em GC são comparados com padrões, com
base nos respectivos tempos de retenção e frequentemente os seus tempos de
retenção são referidos relativamente ao do padrão interno, clorpirifos. Este
composto contém átomos de P, S, N e Cl, para além de C, H e O, o que permite
a sua detecção em todos os detectores usados em GC.
Fig. 13.2 – Estrutura do pesticida clorpirifos.
A aplicação de cromatografia HPLC à análise de pesticidas restringe-se aos
analitos que não são suficientemente voláteis ou não possuem estabilidade
térmica que lhes permita ser analisados por GC. Uma vantagem desta técnica é
a não necessidade de um passo de eliminação de interferentes tão extenso. A
detecção é normalmente feita por absorção electrónica ou por fluorescência. Os
compostos que não são naturalmente fluorescentes, são derivatizados, quer pré
quer pós-coluna.
Os ensaios imunológicos utilizam anticorpos com elevadas afinidade e
especificidade para o pesticida a analisar. Estes métodos são simples, rápidos e
relativamente baratos e têm aplicação analítica se a interacção entre o
anticorpo e o pesticida puder ser detectada e, preferivelmente, quantificada.
Uma das principais desvantagens dos ensaios imunológicos relaciona-se com o
carácter não polar dos pesticidas, que os tornam pouco solúveis nos tampões
aquosos habitualmente enpregues nestes ensaios.
Introdução à Química Alimentar 2009
99
As análises semi-quantitativas e qualitativas são, em geral, capazes de
detectar um número limitado de resíduos de pesticidas semelhantes entre si.
São também designados por métodos de varrimento, já que são capazes de
analisar um grande número de amostras, num tempo relativamente curto.
Enquanto os métodos semi-quantitativos permitem uma estimativa de uma
gama de concentrações para um resíduo, os métodos qualitativos detectam a
presença de um resíduo acima de determinado valor. Estes são métodos
rápidos, simples e baratos, que utilizam sobretudo as técnicas de TLC, inibição
enzimática e ensaios imunológicos.
Apesar das suas limitações, a cromatografia em camada fina (TLC) é
usada como método semi-quantitativo de varrimento para um grupo limitado de
pesticidas. Uma melhoria na capacidade de resolução pode ser conseguida por
HPTLC.
A obtenção de uma amostra representativa da distribuição de micotoxinas
num alimento é particularmente difícil. Os métodos analíticos empregues para a
sua análise podem ser quantitativos ou de varrimento. Os métodos não
quantitativos incluem o uso de mini-colunas e de TLC.
As mini-colunas tiram partido da fluorescência natural das aflatoxinas
zearalenona e ocratoxina A. São usadas pequenas colunas cromatográficas em
vidro (diâmetro interno de 4 – 6 mm) contendo diversas substâncias
adsorventes, disponíveis comercialmente, capazes de detectar as citadas
micotoxinas. Após um passo inicial de cleanup, o extracto é adicionado ao topo
da coluna e depois eluído com diversos solventes. No passo final, o analito é
eluído da camada superior do adsorvente para um nível inferior contendo
Florisil®. Quando submetido a uma luz de 365 nm, o analito exibe
fluorescência.
A utilização preliminar de placas de TLC permite a análise simultânea de
várias amostras. A utilização de TLC em duas dimensões permite a obtenção de
resultados de maior confiança, mas com uma redução na quantidade de
amostras analisadas por placa.
Os métodos quantitativos para análise de micotoxinas seguem os mesmos
passos gerais que os indicados para os pesticidas, com pequenas diferenças. A
técnica mais popular para separação de micotoxinas é o HPLC e a maioria
destes compostos é detectada por espectroscopia de absorção electrónica ou
de fluorescência.
Os métodos bioquímicos usados para determinação de micotoxinas têm
sofrido grandes desenvolvimentos, existindo actualmente processos de análise
Introdução à Química Alimentar 2009
100
para diversos destes contaminantes que recorrem a ensaios rádio-imunológicos
(RIA) e a ensaios imunoenzimáticos (ELISA).
Fig. 13.3 – Análise de aflatoxinas por TLC.
Uma técnica mais recente, para o isolamento de aflatoxinas a partir de
matrizes biológicas, faz uso de anticorpos ligados covalentemente a uma matriz
de agarose, contida numa coluna descartável de plástico. O material de
empacotamento da coluna adsorve selectivamente as aflatoxinas, sendo estas
depois libertadas da coluna com a ajuda de um solvente orgânico polar. Este
método de cromatografia de imunoafinidade com anticorpos monoclonais
permite um cleanup mais eficaz que os métodos mais tradicionais.
Fig. 13.4 – Esquema ilustrativo de um ensaio rádio-imunológico.
Introdução à Química Alimentar 2009
101
Fig. 13.5 – Cromatograia de imunoafinidade com anticorpos
monoclonais, aplicada ao isolamento de micotoxinas.
O crescimento de microrganismos, num meio de cultura transparente,
pode ser seguido pelo aumento da turvação do meio ou, em alternativa, se
colocado num meio de cultura sólido, forma-se uma zona de inibição de
crescimento ao redor do agente inibidor de crescimento. Esta é uma forma
comum de detecção de agentes inibidores em alimentos.
Fig. 13.6 – Ensaio de inibição de crescimento microbiano.
As determinações quantitativas de resíduos de medicamentos seguem
também os passos de preparação de amostra e isolamento dos analitos de
interesse indicados para os outros contaminantes atrás mencionados. O método
mais utilizado para a separação e quantificação de resíduos de medicamentos é
a cromatografia em HPLC. Este método tem a vantagem de não exigir uma
preparação de amostra muito complexa. Actualmente, existem alguns
procedimentos capazes de analisar resíduos múltiplos de antibióticos.
Introdução à Química Alimentar 2009
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Capítulo 14
Aromas
As substâncias com aroma são compostos voláteis reconhecidos pelos
receptores olfactivos. Estão referenciados mais de 7000 compostos voláteis em
cerca de 450 alimentos, mas apenas um pequeno número destes (5%) é
relevante para o aroma. Aqueles cuja concentração está abaixo do limiar
sensorial de percepção não são reconhecidos como aromas.
Podem existir alterações aos aromas dos alimentos causadas por reacções
enzimáticas ou não enzimáticas. Alterações não enzimáticas de aromas, à
temperatura ambiente, apenas se verificam após armazenamento prolongado
do alimento. Essa alteração deve-se à peroxidação lipídica, à reacção de
Maillard e à degradação de aminoácidos (degradação de Strecker) com ela
relacionada. Estes processos são acelerados durante o processamento térmico
dos alimentos.
Os compostos voláteis mais relevantes formados por reacções não
enzimáticas são carbonilos, piranonas, furanonas, tióis, tioéteres, dissulfuretos
e trissulfuretos, tiazóis, pirróis, piridinas, pirazinas, aminas e fenóis.
Fig. 14.1 – Estruturas de uma piranona (1) e de uma furanona
(2), compostos formados por reacções não
enzimáticas.
Outros aromas podem ser formados a partir de reacções enzimáticas
originadas na alteração dos tecidos do alimento (corte ou trituração de frutos e
vegetais, por exemplo). Também existem aromas formados por intervenção
indirecta de proteínas, como nos casos de formação de aminoácidos por
hidrólise de proteínas ou formação de açúcares a partir de polissacáridos. Estes
compostos são depois convertidos em voláteis por reacções não enzimáticas. O
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Introdução à Química Alimentar 2009
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pão, a cerveja e o chá são exemplos de alimentos em que ocorre este
fenómeno.
Fig. 14.2 – Estruturas de um tiazole (1) e de uma pirazina (2),
compostos formados por reacções não enzimáticas.
Entre os compostos mais importantes formados por via enzimática
contam-se os carbonilos, álcoois, hidrocarbonetos, ésteres, lactonas, terpenos,
compostos sulfurados, pirazinas, escatol e p-cresol.
Fig. 14.3 – Estruturas de um terpeno (1) e do escatol (2),
compostos formados por reacções enzimáticas.
Aromas defeituosos podem provir de susbtâncias estranhas ao alimento,
por perca de compostos voléteis relevantes, ou alterações nas concentrações
relativas dos compostos voláteis.
A intensidade e qualidade dos aromas depende também da interacção
com outros constituintes dos alimentos, nomeadamente lípidos, proteínas e
hidratos de carbono.
Aditivos aromatizantes, naturais e sintéticos, têm sido utilizados com os
objectivos de substituir aromas naturais caros ou pouco intensos e de
compensar as percas de aromas verificadas durante o processamento dos
alimentos.
Entre os aditivos naturais, a larga maioria provém de material vegetal, nas
formas de óleos essenciais, extractos e destilados. Os compostos sintéticos
podem ser idênticos aos naturais, derivados dos naturais ou estritamente
sintéticos.
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Introdução à Química Alimentar 2009
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Capítulo 15
Técnicas de Separação
Para analisar compostos individuais numa mistura complexa é necessário
isolá-los e concentrá-los. Para esse efeito existem diversas técnicas, ditas
separativas. Estas técnicas exploram diferenças nas propriedades físico-
-químicas entre os diferentes componentes de uma mistura. As propriedades
mais úteis para essa finalidade são a volatilidade, solubilidade, carga, tamanho
da molécula, forma e polaridade.
A maioria das técnicas de separação depende da transferência selectiva de
materiais entre duas fases imiscíveis. As técnicas mais utilizadas e os sistemas
de fases a elas associados estão resumidos na tabela 15.1.
Tabela 15.1
Técnica Sistema de fases
Extracção por solventes Líquido-líquido Extracção em fase sólida Líquido-sólido Cromatografia gasosa Gás-líquido
Gás-sólido Cromatografia líquida Líquido-líquido
Líquido-sólido Cromatografia em camada fina Líquido-sólido
Líquido-líquido Cromatografia de permuta iónica Líquido-sólido Cromatografia de exclusão molecular Líquido-líquido Cromatografia com fluidos supercríticos
Fluido supercrítico-líquido ou sólido
Electroforese Líquido Electrocromatografia capilar Líquido-sólido
A extracção por solventes permite a transferência selectiva de materiais
em pequenas quantidades (g – g) entre duas fases líquidas imiscíveis,
baseada na diferença de solubilidades.
A separação pode ser efectuada em regime descontínuo, em âmpolas de
decantação, mas também em contínuo, utilizando um sistema de refluxo. O
primeiro é o método mais simples, em que as duas fases são agitadas na
âmpola, até se alcançar um equilíbrio e depois deixa-se em repouso até
Introdução à Química Alimentar 2009
106
separação das fases. O soluto pode ser quantitativamente transferido numa
única extracção ou serem necessárias várias extracções.
Fig. 15.1 – Âmpola de decantação utilizada em extracção
descontínua por solventes.
Na extracção em contínuo, destila-se o solvente orgânico contido num
balão, seguindo-se a sua condensação e passagem através da fase aquosa,
regressando ao balão para ser reciclado.
Fig. 15.2 – Montagens para extracção em contínuo por solventes.
(a) Solvente mais leve que a água; (b) Solvente mais
pesado que a água.
A extracção por solventes é habitualmente utilizada para isolar uma
determinada espécie química, antes da sua quantificação e, menos
Introdução à Química Alimentar 2009
107
frequentemente, para concentração de muito pequenas quantidades. A
aplicação mais vulgar é a concentração e determinação de metais e compostos
orgânicos. Outra das suas vantagens é a aplicabilidade a uma vasta gama de
amostras e concentrações. Uma das principais desvantagens é a necessidade
de utilizar elevadas quantidades de solventes orgânicos; outra desvantagem é
uma fraca resolução de misturas de substâncias orgânicas.
A extracção em fase sólida (SPE) é utilizada para transferir selectivamente
materiais em muito pequenas quantidades ( sub-g – mg) entre um sorvente
sólido e uma fase líquida. A eficiência da separação depende das diferentes
afinidades relativas para as duas fases, baseadas na adsorção, no tamanho ou
na carga do composto.
Esta técnica tem aplicação crescente numa purificação prévia da amostra
antes de uma análise cromatográfica e em pré-concentração de quantidades
diminutas de analitos. Tende a substituir, com vantagem, a extracção por
solventes.
A principal desvantagem da extracção em fase sólida prende-se com a
reduzida eficiência de algumas fases sólidas. O método alternativo,
microextracção em fase sólida, apresenta dificuldades de calibração e
replicabilidade.
A extracção em fase sólida pode ser executada em diversos suportes.
Entre os mais frequentemente utilizados contam-se os tubos de seringa de
polipropileno, nos quais o sorvente é retido por discos de polietileno.
Fig. 15.3 – Extracção em fase sólida, usando como suporte tubos
de seringa.
Introdução à Química Alimentar 2009
108
Em alternativa podem usar-se discos de fibra de vidro ou PTFE, nos quais
estão embebidas as partículas de sorvente, ou ainda pontas de pipetas de
plástico, cheias com pequenas esferas de sorvente.
A extracção em fase sólida pode ser completa ou parcialmente
automatizada, de modo a aumentar a quantidade de amostras processadas,
mas também a precisão e o rigor.
Fig. 15.4 – Sistema automatizado para extracção em fase sólida.
A microextracção em fase sólida (SPME) é uma variante que permite a
determinação de quantidades reduzidas de analitos em amostras líquidas ou
gasosas, através da concentração destas em fibras ópticas revestidas com uma
camada de uma substância polimérica, usada como fase estacionária em
cromatografia gasosa. Deste modo, a fibra pode ser directamente inserida num
cromatógrafo gasoso.
Todas as técnicas cromatográficas têm por base o mesmo princípio: a
variação na velocidade de migração de diferentes componentes de uma
amostra, através de uma fase estacionária, sob a influência de uma fase móvel.
A velocidade de migração varia devido a diferenças nas razões de distribuição
entre as fases.
Durante uma separação cromatográfica, as moléculas do soluto movem-se
continuamente entre as fases móvel e estacionária. Enquanto permanecem na
fase móvel, são empurradas por esta, mas permanecem quase estacionárias
enquanto estão na fase estacionária. A velocidade de migração de cada soluto é
assim determinada pela proporção de tempo em que permanece na fase móvel.
As separações cromatográficas podem ser classificadas segundo quatro
diferentes mecanismos de sorção: adsorção à superfície, partição, permuta
iónica e exclusão.
Introdução à Química Alimentar 2009
109
Fig. 15.5 – Princípio de funcionamento da microextracção em
fase sólida.
No mecanismo de adsorção à superfície, as polaridades relativas do soluto
e da fase estacionária sólida determinam a velocidade do movimento do soluto
através de uma coluna ou de uma superfície.
Se a fase estacionária for constituída por um suporte sólido inerte
revestido à superfície por um líquido, o movimento do soluto será determinado
apenas pela sua solubilidade relativa nas duas fases, ou pela sua volatilidade,
se a fase móvel fôr um gás. Este mecanismo é designado por partição.
Fig. 15.6 – Diagramas dos mecanismos de separação
cromatográfica por adsorção e por partição.
Introdução à Química Alimentar 2009
110
Os mecanismos de adsorção e partição podem ocorrer em simultâneo,
sendo a contribuição de cada um deles determinada pelas naturezas das fases
estacionária e móvel, do suporte sólido e do soluto.
Na separação por permuta iónica, a fase estacionária é um polímero sólido
permeável, ao qual estão ligados grupos carregados e contra-iões móveis, os
quais podem permutar com os iões do soluto, transportados pela fase móvel.
O processo de exclusão não é um verdadeiro processo de sorção, pois os
solutos ficam permanentemente na fase móvel. A separação dá-se devido à
diferente difusão dos solutos através de uma fase estacionária inerte mas
porosa. Esta é habitualmente um gel, com pequenos poros, através dos quais
apenas moléculas pequenas conseguem passar, sendo retardadas no
atravessamento da coluna. Moléculas maiores são excluídas e atravessam
livremente a coluna.
Fig. 15.7 – Diagramas dos mecanismos de separação
cromatográfica por permuta iónica e por exclusão.
Um gráfico da concentração do soluto na fase móvel em função da sua
concentração na fase estacionária, a temperatura constante, deveria ser linear
e o perfil de concentração simétrico. Em sistemas não ideais ocorrem
distorções, designadas por tailing e fronting. A ocorrência destes efeitos é
indesejável, pois conduz a más separações e quantificações imprecisas. O
fenómeno de tailing tem tendênccia a ocorrer em processos de adsorção,
enquanto que o de fronting ocorre mais frequentemente em mecanismos de
partição. A causa mais frequente de ambos é uma sobrecarga da coluna com
amostra em excesso.
A velocidade de um soluto é dada pelo seu coeficiente de distribuição.
fase estacionária
fase móvel
CD
C (15.1)
Introdução à Química Alimentar 2009
111
Este indica que, quanto maior D, mais lento será o progresso do soluto
através do sistema cromatográfico.
Fig. 15.8 – Isotermas de sorção e perfis de concentração em
cromatografia. (a) Isoterma linear; perfil Gaussiano.
(b) Isoterma curva; tailing. (c) Isoterma curva;
fronting.
Em cromatografia em coluna, mede-se o volume de retenção (VR) definido
como o volume que atravessa a coluna entre o momento de aplicação da
amostra no seu topo e a saída do soluto no outro extremo. VM é o volume de
fase móvel na coluna (designado por volume morto) e k é o factor de retenção,
directamente proporcional a D.
R M MV V kV (15.2)
Para um fluxo F constante de fase móvel
R RV Ft (15.3)
No caso de o fluxo ser conhecido, o tempo de retenção tR pode ser usado
como medida de VR.
Nas cromatografias em papel e em camada fina, o processo de separação
é parado numa fase em que os componentes separados ficam no suporte, sob
a forma de manchas. A velocidade do soluto pode ser medida pelo factor de
retenção, Rf.
distância percorrida pelo centro da mancha do soluto
distância percorrida pela frente da fase móvelfR (15.4)
Introdução à Química Alimentar 2009
112
As distâncias são medidas a partir do ponto de aplicação da amostra. Rf
tem uma relação inversa com D.
Numa análise cromatográfica ideal, os componentes de uma mistura
deveriam estar completamente separados uns dos outros no mais curto período
de tempo possível. O desempenho de um processo cromatográfico pode ser
avaliado pela sua eficiência e resolução e pela assimetria dos picos.
A largura de uma banda ou pico é uma medida da eficiência do processo,
e a resolução é determinada pela capacidade de resolver picos de componentes
com valores de tR ou Rf semelhantes.
Fig. 15.9 – Exemplo de um cromatograma e respectivos
parâmetros.
A eficiência da separação, numa coluna, está relacionada com o tempo de
retenção e a largura do pico e é dada pelo número de pratos teóricos, N. O
modelo dos pratos teóricos considera transferências sucessivas entre as quais
se estabelece um equilíbrio termodinâmico. Cada volume assim definido é um
prato teórico.
LN
H (15.5)
Introdução à Química Alimentar 2009
113
Fig. 15.10 – Diagrama ilustrativo do modelo dos pratos teóricos.
Nesta equação, L é o comprimento da coluna e H a altura equivalente de
cada prato teórico. Considerando que um pico representa uma distribuição
aproximadamente Gaussiana, a eficiência pode ser dada por
2
16 rtNl
(15.6)
em que l representa a largura do pico na base. Alternativamente, como é
frequentemente mais fácil medir a largura a meio do pico, lh/2, pode usar-se a
equação 15.7 para determinar a eficiência.
2
2
5.54 r
h
tN
l
(15.7)
A resolução, RS, de uma coluna mede a capacidade de separar dois
solutos e é medida a partir do cromatograma, relacionando a separação entre
dois picos adjacentes com a média da sua largura.
2B A
r rs
A B
t tR
l l
(15.8)
Fig. 15.11 – Ilustração do conceito de resolução. WA e WB são as
larguras dos picos, correspondentes às notações lA e lB.
Introdução à Química Alimentar 2009
114
É aceite que um valor de RS ≥ 1.5 é indicativo de uma boa separação.
A resolução de uma coluna pode também ser dada pela expressão 15.9,
em que N é o número de pratos teóricos para o segundo soluto, kB o seu factor
de retenção e o factor de separação, ou selectividade.
1
4 1
BS
B
kNR
k
(15.9)
' '
' '
B
A
r B
r A
t k
t k (15.10)
A largura de um pico é determinada pela difusão total do soluto, durante o
seu movimento através do sistema cromatográfico e pela velocidade de
transferência de massa entre as duas fases. Os dois efeitos são
interdependentes e complexos. Tratando-se de efeitos cinéticos , a sua
influência na eficiência é determinada pela velocidade da fase móvel através do
sistema.
Fig. 15.12 – Efeitos da difusão e transferência de massa na
largura do pico. (a) Perfis de concentração do soluto
no início da separação. (b) Perfis de concentração do
soluto após atravessar parte do sistema.
A chamada equação de van Deemter é usada para definir eficiência em
termos cinéticos. A é o termo anisotrópico, que traduz a existência de vários
trajectos possíveis e reflecte a homogeneidade da fase estacionária. O seu
efeito é minimizado pela redução do tamanho da partícula, mas aumenta com o
comprimento da coluna. u representa a velocidade linear da fase móvel. O
termo B/u representa a difusão longitudinal e reflecte a difusão das moléculas
de soluto na fase móvel, causada por gradientes locais de concentração. A
difusão através da fase estacionária também contribui para este termo, o qual
apenas é significativo para fluxos reduzidos e aumenta com o comprimento da
coluna. É um termo inversamente proporcional ao fluxo. C.u é o termo que
representa a transferência de massa e resulta do tempo que as moléculas de
Introdução à Química Alimentar 2009
115
soluto demoram a deslocar-se entre as duas fases. Tem em conta os factos de
que: moléculas colocadas no centro do fluxo avançam mais rapidamente que as
restantes; a fase estacionária não tem uma forma regular, o que provoca
diferenças na retenção das moléculas. O efeito deste termo é mínimo para
pequenos diâmetros de partícula e aumenta com o fluxo e o comprimento da
coluna.
.B
H A C uu
(15.11)
Fig. 15.13 – Eficiência como função da velocidade da fase móvel e
efeito de cada termo da equação de van Deemter.
Da análise do gráfico da Fig. 15.13 pode concluir-se que: a separação é
máxima para H mínimo; B domina para u baixos e C domina para u elevados; a
difusão é muito menos significativa em cromatografia líquida (HPLC); A é
menor em cromatografia líquida, pelo que Hmin é cerca de 10 vezes menor que
em cromatografia gasosa e obtém-se para valores de u cerca de 10 vezes
inferiores; os picos tendem a alargar mais em cromatografia gasosa que em
cromatografia líquida.
O coeficiente de distribuição dos solutos, D, depende da temperatura, pelo
que a escolha da temperatura de operação tem um enorme efeito sobre a
separação cromatográfica. Um aumento na temperatura causa uma diminuição
em D e um correspondente decréscimo no tempo de retenção. Assim, um
aumento de temperatura torna a cromatografia mais rápida mas tal pode ter
como consequência uma pior resolução, pelo que terá sempre que se procurar
um compromisso entre ambos.
A eluição com gradiente é um procedimento em que as condições de
eluição da amostra variam progressivamente, de modo a acelerar o processo.
Para tal pode alterar-se a composição da fase móvel, aumentar a temperatura
Introdução à Química Alimentar 2009
116
ou o fluxo. O efeito é uma mais rápida eluição dos componentes no final da
cromatografia e uma melhoria no perfil de eluição.
Na cromatografia em fase gasosa (GC), a separação dos componentes é
conseguida por vaporização da amostra numa fase móvel gasosa, através de
uma coluna contendo uma fase estacionária líquida (cromatografia gás-líquido)
ou sólida (cromatografia gás-sólido). Os componentes da amostra migram com
velocidades dependentes do ponto de ebulição, da solubilidade ou da adsorção.
Na cromatografia gás-líquido (GLC) o processo dominante é a partição,
enquanto na cromatografia gás-sólido, a adsorção é o principal processo de
separação. Em ambos os casos, as amostras terão que ser voláteis e
termicamente estáveis à temperatura de trabalho.
Fig. 15.14 – Diagrama de um cromatógrafo gasoso.
Os gases mais frequentemente utilizados na fase móvel são o azoto, hélio
e hidrogénio, sendo a escolha feita em função do tipo de coluna
(empacotamento ou capilar) utilizada, do preço e do detector utilizado. Hélio e
hidrogénio são preferidos para colunas capilares, já que se adaptam melhor a
fluxos mais elevados.
A introdução da amostra no cromatógrafo pode ser realizada por diversas
técnicas:
injecção em split – uma válvula desvia a maior parte da amostra
injectada para a atmosfera, passando apenas 2% ou menos para a
coluna. No caso de amostras com componentes tendo pontos de
ebulição muito diferentes, estes tendem a ser separados em
Introdução à Química Alimentar 2009
117
diferentes proporções, o que constitui uma limitação da técnica.
Esta técnica de injecção só é aplicável quando não se pretende
uma sensibilidade elevada, já que a maioria da amostra não é
analisada.
injecção em splitless – amostra colocada no injector a uma
temperatura inferior ao ponto de ebulição do componente mais
volátil, sendo depois aquecida de modo a eluir sequencialmente os
componentes. A técnica só se aplica no caso de todos os
componentes da amostra possuirem pontos de ebulição
relativamente elevados.
injecção on-column – permite a introdução directa de amostras
líquidas muito pequenas no topo da coluna fria. Esta técnica reduz
o risco da decomposição de compostos termo-sensíveis.
Fig. 15.14 – Diagrama de um injector em split para coluna
capilar.
A coluna pode ser feita de aço inoxidável, vidro ou quartzo, tendo de 1 m
a 100 m de comprimento e um diâmetro interno entre 0.1 mm e 3 mm. A
coluna é colocada num forno, cuja temperatura pode ser controlada, operando
em condições isotérmicas (temperatura constante durante a separação) ou de
gradiente (temperatura sobe durante a separação).
As colunas de empacotamento são mais curtas e mais grossas e
fabricadas em aço inoxidável ou vidro. Em GLC são preenchidas com um sólido
Introdução à Química Alimentar 2009
118
inerte e poroso, que serve de suporte a uma fase estacionária líquida ou semi-
-líquida. Para utilização em GSC, as colunas têm uma fase estacionária sólida.
Estas colunas são mais baratas que as capilares, mas possuem menor eficiência
de resolução.
Fig. 15.15 – Diagrama de um injector on-column.
Nas colunas capilares a fase estacionária líquida reveste ou está ligada à
parede interior do tubo de quartzo. O exterior da coluna pode ser revestido com
alumínio ou um polímero plástico, para protecção. A sua maior resolução é fruto
de um muito maior número de pratos teóricos.
O detector deverá responder a modificações na composição do gás que
emerge da coluna, à medida que os solutos vão eluindo. Um detector ideal
deveria: responder rapidamente à presença de um soluto; dar uma resposta
linear numa vasta gama de concentrações; possuir uma elevada sensibilidade;
ser estável. Apesar de existirem mais de doze tipos de detectores disponíveis
para GC, apenas aqueles que usam a condutividade térmica, ionização de
chama e captura electrónica são frequentemente usados.
Compostos não voláteis ou termo-sensíveis podem ser derivatizados para
aumentar a sua volatilidade ou estabilidade. Compostos com grupos funcionais
Introdução à Química Alimentar 2009
119
hidroxilo, carbonilo e amino podem ser feitos reagir com reagentes adequados,
de modo a converter esses grupos polares em derivados menos polares e mais
voláteis (metilo, trimetilsililo ou trifluoroacetilo). Entre os compostos mais
frequentemente sujeitos a derivatização para análise em GC contam-se os
ácidos gordos, hidratos de carbono, fenóis e aminoácidos.
A identificação dos compostos separados em cromatografia gasosa pode
ser efectuada por comparação dos seus tempos de retenção com padrões, por
recolha e posterior análise com outras técnicas ou hifenando outros métodos
com o GC, através de uma interface.
Uma dessas técnicas hifenadas é a espectrometria de massa. A principal
dificuldade em juntar estes dois métodos é o facto de que o espectrómetro de
massa trabalha a baixa pressão enquanto o gás saído do cromatógrafo vem à
pressão atmosférica. No entanto, a evolução tecnológica permite que hoje em
dia esta seja uma das técnicas mais relevantes para identificação de compostos
em GC.
Uma outra é a junção da espectroscopia de Infra-vermelho com a
cromatografia gasosa, embora a sua menor sensibilidade contribua para um
reduzido sucesso da técnica.
A quantificação dos compostos é conseguida por integração dos picos no
cromatograma, sendo que a área do pico é directamente proporcional à
concentração do soluto. Para que tal método possa ser utilizado, é necessário
que as condições de operação sejam padronizadas e que sejam conhecidos os
factores de resposta dos detectores.
Se os componentes de uma mistura forem todos idênticos e forem todos
detectados, pode determinar-se o teor em percentagem de cada um deles
área do componente %
área total de todos os componentes
xx (15.12)
Esta fórmula só será válida se a sensibilidade do detector for a mesma
para todos os componentes. Caso contrário, a resposta para cada componente
terá que ser determinada com o recurso a padrões. Neste caso, as áreas
determinadas serão multiplicadas pelos factores de correcção obtidos.
Podem usar-se dois métodos de quantificação por adição de padrão:
padrão interno – adiciona-se uma quantidade conhecida do padrão
à amostra, antes de esta ser cromatografada. Calcula-se a razão
das áreas do pico do padrão sobre a do pico do componente e
converte-se esta razão no peso do componente através de uma
Introdução à Química Alimentar 2009
120
curva de calibração previamente preparada. O padrão interno
deverá ter um tempo de retenção próximo do dos componentes a
determinar, mas com uma boa separação. Deverá ainda estar
presente na mesma gama de concentrações.
adição de padrão – se estiver disponível uma amostra pura do
componente a determinar, essa amostra poderá ser
cromatografada antes e após a adição de uma quantidade
conhecida do componente puro. O seu teor na amostra é obtido a
partir da razão das áreas dos picos nos dois cromatogramas.
Em cromatografia líquida (LC) e mais em particular em cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) é possível separar componentes de misturas
em quantidades entre g e g por passagem da mesma através de uma coluna
contendo uma fase estacionária sólida. A fase móvel é um líquido a pressão
elevada. A separação dos componentes é baseada nas diferenças de afinidade
para as fases móvel e estacionária devido a propriedades de adsorção, tamanho
e carga.
Em cromatografia líquida clássica são utilizadas colunas à pressão
atmosférica, com as desvantagens de más separações e longo tempo de
operação. Uma melhor separação pode ser conseguida usando fases
estacionárias com menor diâmetro de partícula e uma redução no tempo de
análise é conseguida usando fluxos mais elevados e trabalhando a pressões
superiores. A técnica de HPLC é mais versátil que GC, já que não se limita a
compostos voláteis e termo-estáveis e também as fases móveis e estacionárias
são mais diversificadas.
Fig. 15.16 – Diagrama de um cromatógrafo HPLC.
Introdução à Química Alimentar 2009
121
Em HPLC, a injecção é quase sempre realizada através de uma válvula, a
qual permite uma elevada reprodutibilidade. As colunas mais vulgares são
fabricadas em aço inoxidável. A grande versatilidade de fases estacionárias
disponíveis permite tirar partido de todos os mecanismos cromatográficos de
separação.
Em HPLC, a escolha de uma fase móvel adequada é crucial para a
eficiência da separação. Quando o sistema funciona em fase normal (fase
estacionária polar – fase móvel não polar) a capacidade de eluição aumenta
com o aumento da polaridade do solvente, enquanto que em fase reversa (fase
estacionária não polar – fase móvel polar) a capacidade de eluição diminui com
o aumento de polaridade do solvente. É frequente que a utilização de misturas
de mais que um solvente produza melhores resultados que a utilização de um
único solvente.
Quando se trabalha com um único solvente ou uma mistura de solventes
com composição fixa, diz-se que se trata de operação em condições isocráticas
e quando essas condições variam designa-se por eluição com gradientes.
O detector ideal em HPLC deverá apresentar as mesmas características
que para GC, nomeadamente resposta rápida e reprodutível para os solutos,
resposta linear para uma ampla gama de concentrações, elevada sensibilidade
e estabilidade. Os detectores mais vulgares são os de absorção electrónica e de
índice de refracção. Outros detectores mais sensíveis, mas mais específicos são
os de fluorescência e condutividade eléctrica. Existem outros ainda, mas com
aplicação mais limitada.
De modo semelhante à GC, a análise qualitativa em HPLC é feita por
comparação dos dados de retenção. A recolha de componentes isolados para
posterior análise por outras técnicas (IV, MS, NMR) é fácil de realizar, mas os
métodos hifenados tendem a sobrepor-se a essa prática. A análise quantitativa
também é efectuada de modo semelhante à indicada para GC.
A interface entre um HPLC e um detector de espectrometria de massa
também coloca algumas dificuldades, existindo diversas soluções possíveis e
também diversos processos de ionização dos componentes separados em HPLC.
Uma variante de HPLC, designada por cromatografia iónica, foi
desenvolvida para a separação de iões inorgânicos e também de alguns
orgânicos. Para tal, são utilizadas colunas de permuta iónica e os iões são
detectados através da sua condutividade ou, em alternativa, por espectroscopia
de absorção electrónica.
Introdução à Química Alimentar 2009
122
Para separar aniões, a coluna tem uma fase estacionária de permuta
aniónica, com iões HCO„. Para a análise de catiões, utilizam-se resinas
catiónicas na forma de H+.
A cromatografia com fluidos supercríticos é uma técnica mais recente, a
qual utiliza um fluido supercrítico como fase móvel. Para atingir o estado
supercrítico, o solvente é sujeito a elevadas temperatura e pressão, o que
provoca alterações na sua densidade, viscosidade e coeficiente de difusão. O
solvente mais utilizado é o CO2. A aparelhagem utilizada tem por base
elementos usados em GC e HPLC. Para optimizar a separação é frequente
utilizar gradientes de pressão. Podem ser utilizados detectores típicos de GC,
como os de ionização de chama, ou de HPLC, como os de UV ou de
fluorescência.
Em cromatografia com fluidos supercríticos também são utilizados
detectores hifenados, tais como IV e MS.
A cromatografia em camada fina (TLC) utiliza camadas finas de uma fase
estacionária aplicadas sobre suportes de vidro, plástico ou alumínio. Quando
um solvente atravessa essa superfície, por capilaridade, provoca o
arrastamento dos componentes de uma dada mistura com diferentes
velocidades, dependendo das suas propriedades de solubilidade, adsorção,
tamanho ou carga. A distância percorrida é medida ou as manchas produzidas
são removidas para posterior análise por métodos espectrométricos.
Fig. 15.17 – Exemplo de um cromatograma em TLC.
Os materiais utilizados para fase estacionária em cromatografia em
coluna, de permuta iónica ou de exclusão, também podem ser usados em TLC.
A fase móvel é escolhida, sobretudo, com base em experiência prévia.
Introdução à Química Alimentar 2009
123
A identificação de componentes pode ser feita apenas com base nos
valores de Rf, comparando-os com os de padrões, analisados em condições
idênticas. Em alternativa, as manchas podem ser removidas da placa e
analisadas por métodos qualitativos. A análise quantitativa só pode ser
efectuada em circunstâncias particulares e nunca é muito rigorosa.
Um processo semelhante à cromatografia é a separação por exclusão
molecular. Utiliza-se um gel que separa os componentes segundo o seu peso
molecular e a sua forma. Os poros do gel excluem moléculas maiores que um
certo tamanho crítico, permitindo a difusão através do gel das menores. As
moléculas maiores saem mais rapidamente, enquanto as restantes eluem a
velocidades dependentes do seu grau de permeação através do gel. Existem
géis hidrofílicos e hidrofóbicos, permitindo a separação de uma vasta gama de
compostos.
Um outro método de separação com crescente aplicação na química
alimentar é a electroforese. O mecanismo de separação baseia-se na migração
diferencial de substâncias com carga, através de uma superfície ou de uma
coluna, devido à acção de um gradiente de potencial. A velocidade de migração
depende do tamanho, carga e forma da molécula.
A electroforese tradicional é realizada sobre suporte de papel, acetato de
celulose ou géis poliméricos. Mais recentemente foi introduzida a electroforese
capilar que se efectua em tubos capilares de sílica.
Na electroforese tradicional, a amostra é colocada no centro do suporte e
os componentes são separados em manchas individuais. A detecção é
efectuada através de reagentes reveladores, os quais permitem visualizar o
electroferograma obtido.
Fig. 15.18 – Princípio de operação da separação por
electroforese.
Introdução à Química Alimentar 2009
124
A mobilidade das substãncias é afectada pela temperatura, pH e força
iónica, pelo que é necessário controlar estes parâmetros, de modo a obter
resultados reprodutíveis e comparáveis.
Duas variantes desta técnica são a focagem isoeléctrica e a imuno-
-electroforese. A primeira complementa a separação por gradiente de potencial
com gradientes de pH e de densidades; a segunda utiliza interacções
específicas antigene-anticorpo.
Na electroforese capilar, aplica-se uma tensão de corrente mais elevada e
detectores semelhantes aos usados em HPLC (absorção electrónica,
fluorescência, ...), o que origina a obtenção de perfis semelhantes aos picos
cromatográficos, embora mais estreitos. Nesta versão da electroforese, a
introdução da amostra faz-se pelo extremo do tubo oposto ao do detector, por
via hidrodinâmica ou electrocinética. No primeiro caso, a amostra é introduzida
no tubo por gravidade, pressão positiva ou vácuo; no segundo, a amostra entra
por efeito de uma diferença de potencial aplicada.
Fig. 15.19 – Métodos de operação em electroforese capilar. (a),
(b) e (c) – Hidrodinâmica. (d) – Electrocinética.
A electrocromatografia capilar é uma técnica híbrida entre a electroforese
capilar e HPLC. Utiliza colunas de elctroforese capilar empacotadas com fase
estacionária típica de HPLC e um tampão de pH > 4. Estabelece-se um fluxo
electroosmótico do tampão, devido à aplicação de uma corrente eléctrica, em
direcção ao extremo catódico do capilar. Esta técnica apresenta as vantagens
Introdução à Química Alimentar 2009
125
de uma maior eficiência e menor consumo de solvente que HPLC e maior
facilidade em ligar um detector de espectrometria de massa.
Introdução à Química Alimentar 2009
126
Capítulo 16
Métodos Espectrométricos
Todas as técnicas espectrométricas dependem da absorção ou emissão
de radiação electromagnética e das variações de energia associadas, em
sistemas atómicos ou moleculares. As variações de energia estão associadas
aos níveis discretos de energia atribuídos a átomos e moléculas. As transições
entre esses níveis energéticos permitem obter informação quantitativa e
qualitativa sobre as espécies químicas.
A radiação electromagnética tem carácter ondulatório, mas as suas
absorção e emissão possuem uma natureza quântica. Uma onda pode ser
caracterizada em termos de frequência (), comprimento () e amplitude (A). A
energia é proporcional à frequência da radiação e inversamente proporcional ao
comprimento de onda.
Fig. 16.1 – Representação esquemática de uma onda
electromagnética.
A frequência e o comprimento de onda estão relacionados pela expressão
c
(16.1)
em que c é a velocidade de propagação da onda no vácuo (2.998x108 ms-1).
A teoria quântica considera a radiação como um fluxo de fotões (ou
quanta) que se deslocam no espaço a velocidade constante (c). A energia de
um fotão é dada por
Introdução à Química Alimentar 2009
127
E h (16.2)
em que h é a constante de Planck (6.6x10-34 Js).
A energia total de um átomo ou de uma molécula inclui diversas
contribuições: do interior do núcleo (energia nuclear), de interacções entre
electrões e o núcleo (energia electrónica), dos spins electrónico e nuclear, dos
movimentos rotacionais e vibracionais das moléculas e da translacção de
átomos ou moléculas através do espaço. Todas estas formas de energia,
excepto a translaccional, são descontínuas. Para cada forma de energia, um
átomo ou molécula podem existir em níveis discretos de energia, definidos por
números quânticos e de acordo com uma formulação matemática. A dimensão
das várias formas de energia e as diferenças entre os níveis adjacentes são
muito diferentes. Os níveis energéticos que um átomo ou uma molécula podem
ocupar, em condições ambientes, são determinados pelas regras da teoria
quântica e pela equação de Maxwell-Boltzmann (16.4). Estes são designados
por níveis do estado fundamental, os de maior energia são chamados níveis do
estado excitado.
Fig. 16.2 – Níveis energéticos electrónico, vibracional e rotacional
(escala não real).
Quando uma substância é irradiada com radiação electromagnética, a
energia dos fotões incidentes pode ser transferida para os seus átomos e
moléculas, obrigando-os a passar do estado fundamental para um estado
excitado. Este processo de absorção pode ser traduzido pela equação
2 1E E E h (16.3)
Introdução à Química Alimentar 2009
128
em que E1 e E2 são os dois níveis de energia. A energia absorvida é
rapidamente perdida por colisões, permitindo que o sistema reverta para o
estado fundamental. Se, em alternativa, a energia for reemitida, o processo
designa-se por fluorescência.
Fig. 16.3 – Ilustração dos processos de absorção (esquerda) e de
emissão de fluorescência (direita).
A informação que pode ser obtida sobre estas transições de energia, é
apresentada sob a forma de espectros, representações gráficas do grau de
absorção ou da intensidade de emissão da radiação, em função da frequência,
comprimento de onda ou número de onda. As riscas espectrais resultantes de
transições em átomos ou moléculas no estado gasoso são estreitas, tal como
aquelas originadas em transições de spin nuclear ou electrónico. Já os
espectros de absorção molecular nas regiões do ultra-violeta, vísivel e infra-
vermelho apresentam conjuntos de riscas não completamente resolvidas
(bandas) devido às colisões entre as moléculas do soluto e do solvente e a
limitações instrumentais.
As populações relativas de cada nível energético, ou seja as proporções do
analito que os ocupam, têm uma influência directa nas intensidades das riscas e
são determinadas pelo espaçamento dos níveis e pela temperatura. Estas
relações são definidas pela equação de Maxwell-Boltzmann.
2 2
1 1
expn g E
n g kT
(16.4)
n1 e n2 são o número de espécies nos estados de energia E1 e E2, separados
por E, g1 e g2 são factores estatísticos, k é a constante de Boltzmann
(1.38x10-23 JK-1) e T é a temperatura.
Introdução à Química Alimentar 2009
129
A partir desta equação, verifica-se que os espectros de absorção nas
regiões do UV, visível e IV resultam sempre e unicamente de transições a partir
do estado fundamental.
A análise quantitativa em espectrometria é possível devido à existência de
uma proporcionalidade directa entre a intensidade de uma risca ou banda e o
número de átomos ou moléculas envolvidos na transição. Informação
qualitativa sobre a composição e estrutura de uma amostra é obtida através da
posição e intensidades relativas das riscas ou bandas do espectro.
Apesar de bastante diferentes entre si, os aparelhos usados em
espectrometria possuem três elementos característicos:
gerador de radiação com frequência apropriada às variações de
energia pretendidas na amostra;
análise do espectro produzido por essa radiação, de modo a obter
informação qualitativa;
medição da intensidade da radiação nas frequências seleccionadas,
para obtenção de informação quantitativa.
As técnicas de espectrometria atómica permitem análise quantitativa e
qualitativa, dado que produzem espectros caracterizados por riscas estreitas,
cujos comprimentos de onda são característicos de cada elemento e cujas
intensidades são proporcionais ao número de átomos associados à transição.
Tratando-se de técnicas muito sensíveis, a sua principal utilização é na
análise elementar de compostos em baixas concentrações.
De acordo com a teoria quântica, os electrões de um átomo ocupam
orbitais segundo um conjunto de quatro números quânticos, cujos valores
permitidos (Tabela 16.1) são determinados por regras matemáticas. Os
electrões tendem a ocupar as orbitais com a mais baixa energia possível,
seguindo o princípio de exclusão de Pauli, o qual diz que num átomo não
existem dois electrões que possam ser definidos pelo mesmo conjunto de
valores para os quatro números quânticos n, l, ml e s. As formas e energias dos
orbitais são determinadas pelos valores dos números quânticos e por efeitos
interelectrónicos.
A espectrometria de emissão atómica baseia-se na emissão de radiação
electromagnética nas regiões do UV e do vísivel a partir de átomos e de iões,
após excitação electrónica. É utilizada para a detecção de minerais em
pequenas quantidades e para análise quantitativa de metais, sobretudo em
Introdução à Química Alimentar 2009
130
amostras sólidas. Embora a precisão seja moderada, esta técnica é bastante
usada devido à rapidez de processamento dos resultados obtidos.
Tabela 16.1
Número quântico Símbolo Parâmetro Valores permitidos
principal n distância radial inteiro de 1 a ∞ secundário l ângulo inteiro de 0 a (n-1) magnético ml ângulo inteiro de 0 a ±1
spin s spin ±½
Uma alternativa mais recente a esta técnica faz uso de plasma gasoso a
alta temperatura ou de um laser como fontes de excitação, o que permite uma
maior precisão quer na análise quantitativa quer na qualitativa. As principais
desvantagens da espectrometria de emissão por plasma são a necessidade de
dissolução da amostra e o preço elevado do equipamento.
Fig. 16.4 – Diagrama de níveis de energia para o átomo de sódio.
Os níveis estão identificados pelo número quântico
principal n, pelo número quântico de orbital l e pelo
número quântico de spin s.
A excitação por plasma induzido também pode ser acoplada à
espectrometria de massa, dando origem a uma técnica designada por ICP-MS
(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry), com a qual se pode obter
informação qualitativa por separação dos iões atómicos formados e quantitativa
por medição da corrente iónica gerada. A amostra é introduzida por um
Introdução à Química Alimentar 2009
131
nebulizador, vaporização com laser ou aquecimento eléctrico e os iões
produzidos são analizados no espectrómetro de massa. É utilizada na análise de
elementos em baixas concentrações (ppb), embora sofra de uma precisão nem
sempre elevada e seja uma técnica cara.
Fig. 16.5 – Esquema de um espectrómetro de emissão atómica.
A espectrometria de absorção atómica baseia-se na absorção de radiação
electromagnética, nas regiões do UV e do vísivel, por átomos. As resultantes
alterações na estrutura electrónica são medidas, de modo a obter informação
quantitativa. A detecção faz-se a partir da passagem de radiação característica
de um dado elemento através do vapor atómico da amostra. Este vapor é
produzido por aspiração de uma solução para uma chama ou por evaporação a
partir de uma superfície aquecida por corrente eléctrica. É uma técnica muito
utilizada para determinação quantitativa de metais em baixas concentrações
(0.1-100 ppm) e com uma razoável precisão. A absorção medida é proporcional
à concentração do elemento na amostra.
Fig. 16.6 – Esquema de um sistema ICP-MS.
As principais limitações desta técnica são a necessidade de uma amostra
líquida e a necessidade de uma lâmpada de detecção para cada elemento.
Introdução à Química Alimentar 2009
132
Fig. 16.7 – Esquema de um espectrómetro de absorção atómica.
As medidas quantitativas podem ser realizadas com o recurso a curvas de
calibração previamente preparadas ou através da adição de padrão, sendo
necessário que a resposta instrumental seja linear na gama de concentrações
considerada.
Na espectrometria de fluorescência atómica detecta-se a radiação de
fluorescência característica emitida pelo vapor atómico de um analito, após a
sua irradiação com radiação UV/vísivel. Na prática, esta técnica está limitada ao
elemento volátil Hg e a outros que podem ser tornados voláteis (As, Se, Te, Bi,
Cd). Tem uma sensibilidade na gama das ppb e é razoavelmente precisa.
A intensidade da emissão de fluorescência é directamente proporcional à
concentração dos átomos, mas é reduzida devido a colisões entre os átomos
excitados e outras espécies (extinção de fluorescência).
Na espectroscopia de emissão de raios X, observa-se radiação emitida por
transições envolvendo electrões K e L. Fazem-se medidas qualitativas a partir
dos comprimentos de onda e quantitativas a partir das intensidades das
emissões. É uma técnica que permite a análise não destrutiva de amostras
sólidas ou líquidas, mas com uma sensibilidade e precisão não muito elevadas.
As transições electrónicas nas camadas internas de um átomo envolvem
variações de energia consistentes com a absorção ou emissão de radiação com
elevada energia (baixo comprimento de onda). Tal conduz à obtenção de
espectros simples e característicos dos elementos presentes.
Introdução à Química Alimentar 2009
133
Fig. 16.8 – Um electrão
da esfera K é ejectado do
átomo por uma fonte
externa de excitação
(raios X) criando uma
vaga. Um electrão das
camadas L ou M ―salta‖
para preencher a vaga.
Ao fazê-lo emite um raio
X característico do
elemento, produzindo
uma vaga nas camadas L
ou M e assim
sucessivamente.
As técnicas de espectrometria molecular são mais variadas e
completas quanto à informação analítica que proporcionam. Incluem
contribuições de movimentos translaccionais, rotacionais e vibracionais a partir
de electrões que ocupam os orbitais moleculares e de spins nucleares. A
separação entre os níveis quânticos de energia varia na ordem
electrónica vibracional rotacional spin nuclearE E E E
os níveis translaccionais não estão incluidos, pois são demasiado próximos, não
permitindo a sua quantização.
Introdução à Química Alimentar 2009
134
Em análise, existem três técnicas com maior relevo: espectrometria no
ultra-violeta e vísivel (electrónica), espectrometria no infra-vermelho
(vibracional) e espectrometria de ressonância magnética nuclear (spin nuclear).
A espectrometria de massa fornece informação estrutural semelhante, mas é
uma técnica destrutiva que funciona segundo princípios diferentes.
Os métodos quantitativos baseados na absorção de radiação
electromagnética envolvem a medida da radiação transmitida pela amostra, a
qual é proporcional à concentração da espécie que absorve a radiação, na
amostra. Esta relação é descrita pela lei de Beer-Lambert.
0logI
A clI
(16.5)
I0 e I são, respectivamente, as intensidades das radiações incidente e
transmitida, A a absorvância, c a concentração da espécie que absorve a
radiação, l é a espessura do meio que absorve a radiação (na prática, o trajecto
óptico da cuvette) e é uma constante designada por coeficiente de absorção
molar.
O valor de depende da natureza da espécie e do comprimento de onda
da radiação incidente. A absorvância está relacionada com a fracção de
radiação transmitida (transmitância, T) pela espécie, de acordo com
1logA
T (16.6)
A absorvância é uma propriedade aditiva, pelo que, a um dado
comprimento de onda, a absorção total de uma solução contendo vários
componentes que absorvem radiação é dada por
1 1 2 2 ...totalA c l c l (16.7)
considerando que não existem interacções entre as espécies.
Para aplicar a lei de Beer-Lambert, deve preparar-se previamente uma
recta de calibração da absorvância de diversos padrões em função da sua
concentração. Esta recta deverá passar pela origem e ter um declive igual a l.
As medidas de absorvância são habitualmente feitas no valor máximo da curva,
de modo a minorar erros.
A lei de Beer-Lambert é aplicável apenas a soluções diluídas e a radiação
monocromática. Para concentrações elevadas (~>0.01 M) ocorrem desvios.
Se se quiser analisar apenas uma substância, obtêm-se bons resulatados
com um simples fotómetro. Quando aplicada na zona do vísivel, esta técnica é
Introdução à Química Alimentar 2009
135
denominada colorimetria. Nesta técnica simples não é válida a lei de Lambert-
Beer e não existe compatibilidade entre equipamentos diferentes. Devido a
estas limitações é mais frequente a utilização da espectrofotometria.
A espectrometria no ultra-violeta e vísivel resulta da absorção de radiação
nessas regiões do espectro, a qual origina alterações na estrutura electrónica
de iões e moléculas. É uma técnica apenas válida para amostras em solução e
com dificuldades de aplicação em misturas não previamente separadas.
A absorção de radiação nas regiões vísivel e ultra-violeta origina transições
electrónicas entre os orbitais moleculares e, devido às relativamente elevadas
variações de energia, ocorrem simultaneamente variações nas energias
vibracional e rotacional. À temperatura ambiente, todas as moléculas estarão
no estado electrónico fundamental e, provavelmente, no nível vibracional mais
baixo. A absorção de energia provoca transições para qualquer nível vibracional
no primeiro estado excitado. Devido às interacções entre as moléculas do soluto
e as do solvente, não são observadas riscas, mas sim bandas largas. Estas
bandas são caracterizadas pela posição do seu máximo de absorvância (max) e
correspondente absorptividade molar. Para moléculas poliatómicas e complexos
metálicos, o espectro pode ter diversas bandas, resultantes de diversas
transições electrónicas e estruturas vibracionais e rotacionais associadas.
De acordo com a teoria dos orbitais moleculares, a interacção entre
orbitais atómicos conduz à formação de orbitais moleculares ligantes e anti-
-ligantes. Estes podem ser dos tipos ou . Existem ainda orbitais moleculares
não ligantes n, ocupados por electrões que não participam na ligação.
Fig. 16.9 – Formas, energias relativas dos orbitais moleculares e
transições possíveis entre eles.
Introdução à Química Alimentar 2009
136
Na maioria dos compostos orgânicos, os orbitais ligantes e não ligantes
estão preenchidos e os anti-ligantes desocupados. As transições de menor
energia (bandas no vísivel e UV próximo) são aquelas entre orbitais não
ligantes e orbitais anti-ligantes, n↓*. As transições n↓* e ↓* possuem
energias semelhantes entre si e dão origem a bandas a comprimentos de onda
superiores. As transições ↓* ocorrem a menos de 200 nm e têm pouca
utilidade analítica. Os hidrocarbonetos saturados que são transparentes nas
zonas do vísivel e UV próximo são bons solventes para esta técnica. As bandas
mais intensas são produzidas pelas transições ↓* e ↓*, enquanto as
resultantes de transições n↓* e n↓* são mais fracas.
Moléculas não saturadas (cromóforos) são responsáveis pelas absorções
n↓* e ↓* adequadas a análise quantitativa, já que produzem bandas nas
zonas do vísivel e UV próximo.
A espectrometria no ultra-violeta e vísivel é usada em análise quantitativa,
por comparação das absorvâncias de padrões com as das amostras, a um dado
comprimento de onda. Esta é a principal aplicação desta técnica, podendo
mesmo ser aplicada a misturas não muito complexas, devido à propriedade
aditiva das absorvâncias. Outras aplicações desta espectrometria incluem a
determinação da estabilidade termodinâmica ou cinética de compostos, para
estudos fundamentais ou com objectivos analíticos.
A absorção de radiação electromagnética na zona do UV/vísivel é seguida
pela relaxação dos estados excitados para o estado fundamental,
maioritariamente através de diversos processos não radiativos (relaxação
vibracional, conversão interna e cruzamento inter-sistemas). A
fotoluminescência é um outro tipo de relaxação em que radiação de menor
energia que aquela originalmente absorvida é reemitida após a relaxação
vibracional. A fluorescência e a fosforescência são duas formas de
fotoluminescência, com aplicação analítica.
Um espectro de emissão de fluorescência resulta de transições entre o
nível vibracional de menor energia do primeiro estado excitado e diversos níveis
vibracionais do estado fundamental (Fig. 16.10). O espectro resultante é
aproximadamente uma imagem reflectida do espectro de absorção, mas
deslocado para um comprimento de onda superior devido à perca inicial de
energia, causada pela relaxação vibracional. Poucos compostos são capazes de
relaxar por fluorescência. Quase só as moléculas orgânicas rígidas e estruturas
aromáticas o fazem. A intensidade da emissão de fluorescência depende do
rendimento quântico (F) o qual varia entre zero (não há fluorescência) e um
Introdução à Química Alimentar 2009
137
(todas as moléculas no estado excitado relaxam por fluorescência). O
rendimento quântico é influenciado por factores estruturais da molécula e pela
natureza do solvente usado.
Fig. 16.10 – Processos de relaxação a partir dos estados
excitados.
Existe uma relação linear entre a concentração C de um composto
fluorescente e a intensidade da emissão IF,
02.303F FI I Cl (16.8)
Se a intensidade da radiação incidente I0 e l forem constantes e a absorvância
baixa (i. e. concentração do analito reduzida) tem-se
FI kC (16.9)
Introdução à Química Alimentar 2009
138
A fluorimetria é menos usada que a espectroscopia de absorção devido ao
limitado número de compostos naturalmente fluorescentes. No entanto, muitos
destes compostos podem ser derivatizados de modo a obter substâncias
fluorescentes, permitindo a sua análise. A sua utilização predominante é em
análise quantitativa, sendo mais sensível que a espectroscopia de absorção.
A espectrometria no infravermelho (IV) baseia-se na absorção de radiação
electromagnética na região do infravermelho, o que provoca alterações na
energia vibracional das moléculas. Pode ser aplicada à identificação e análise
estrutural de moléculas orgânicas, sendo menos usada que as duas técnicas
anteriores para fins quantitativos. Aplica-se quer a amostras sólidas, quer a
líquidas.
Uma molécula é capaz de absorver energia apenas se não existir variação
no momento dipolar durante uma vibração. A quase totalidade das moléculas
poliatómicas preenche este requisito.
A espectrometria no IV apresenta dificuldades na análise de misturas e
requer cuvettes especiais para análise de amostras aquosas.
A complexidade dos espectros de infravermelho permite a sua utilização
na identificação de compostos desconhecidos e na investigação de pormenores
estruturais. Os espectros são utilizados de modo empírico, por comparação com
padrões e com valores encontrados na literatura.
Fig. 16.11 – Espectro de IV do formaldeído, H2C=O, mostrando as
absorções características.
A absorção de radiação electromagnética na região das frequências de
rádio dá origem a variações na orientação do spin nuclear num campo
magnético, dando origem à espectrometria de ressonância magnética nuclear
Introdução à Química Alimentar 2009
139
(NMR). Esta técnica permite a identificação e análise estrutural de compostos
orgânicos e estudos cinéticos, sobretudo a partir da análise de núcleos de 1H e 13C. Também apresenta potencial para estudos quantitativos, embora seja
raramente utilizada para tal fim. As suas principais limitações são a
complexidade da técnica, o elevado custo do equipamento e a necessidade de
utilizar solventes deuterados para a apalicação mais vulgar dos núcleos de 1H.
Fig. 16.12 – Esquema geral de um espectrómetro de NMR.
As variações de energia estão associadas à orientação do eixo nuclear no
espaço, relativamente a um campo magnético externo aplicado.
Todos os núcleos atómicos possuem um número atómico de spin I, o qual
pode ser 0, ½ ou 1. Apenas aqueles com valor diferente de zero originam um
espectro de NMR. Como o núcleo possui uma carga, ao girar sobre o seu eixo
produz um dipolo magnético ao longo do eixo. O núcleo também possui um
momento angular I e, em cada isótopo, os valores relativos de I e
determinam a frequência de absorção de energia. A sensibilidade da técnica
também é determinada pelo valor de . 1H possui a mais elevada sensibilidade
relativa e 12C e 16O são inactivos devido possuirem I=0.
Na presença de um campo magnético aplicado, o vector do momento
pode apenas assumir um número limitado de orientações espaciais. Isto é, a
sua componente na direcção desse campo será um integral ou um semi-integral
2πz I
hmI (16.10)
Iz representa a dimensão do componente do momento angular na direcção do
campo z, mI = 0, ±½, ±1, ±×, ... e h é a constante de Planck. O número total
de valores para mI, o número quântico magnético, é dado por 2I+1.
Introdução à Química Alimentar 2009
140
A energia de interacção entre um núcleo e o campo magnético aplicado B
é dada por
γ2π
I
hE m B (16.11)
em que é a razão giromagnética.
μγ z
z
I
(16.12)
Num núcleo 1H ou 13C I é ½, portanto mI só pode ter valores ±½ o que
origina dois níveis de energia ou estados de spin.
Fig. 16.13 – Níveis de energia para 1H ou 13C.
Pode demonstrar-se que a frequência de absorção é directamente
proporcional à força do campo magnético aplicado. Na prática, os espectros são
obtidos fazendo variar a frequência da radiação com um campo magnético
constante ou vice-versa. Quando os núcleos dissipam energia, voltando para
um nível inferior, emitem um sinal que é tratado pelo equipamento, originando
bandas estreitas (mais largas no caso de sólidos).
Os espectros de NMR de 1H e 13C exibem habitualmente vários sinais de
absorvância, cada qual correspondente a um núcleo ou grupo de núcleos, cuja
posição no espectro depende do ambiente químico que rodeia o núcleo. Esta
característica é medida pelo desvio químico. Cada um dos sinais produzidos
pode sofrer desdobramentos, causados por interacções com núcleos vizinhos.
Outra informação que se pode tirar de um espectro está relacionada com o
facto de que a área de cada pico é directamente proporcional ao número de
núcleos responsáveis pelo sinal, permitindo a utilização desta técnica em
análise quantitativa.
De acordo com a teoria, todos os protões (núcleos 1H) absorvem energia
com o mesmo valor do campo magnético aplicado. No entanto, o campo
sentido por um dado núcleo difere em grandeza do campo aplicado, devido ao
efeito de blindagem dos electrões vizinhos. Devido às diferenças de blindagem
que os protões sofrem em diferentes ambientes químicos, estes absorvem a
Introdução à Química Alimentar 2009
141
valores diferentes do campo aplicado. Estas diferenças de absorção são
designadas desvios químicos.
Os electrões que rodeiam um núcleo criam um pequeno campo magnético
localizado, oposto ao campo aplicado. A dimensão do campo oposto é
proporcional à densidade electrónica, a qual é determinada, por sua vez, pelas
electronegatividades dos núcleos vizinhos. Quanto mais electronegativo for o
átomo ao qual está ligado o protão, menor a blindagem e menor será o campo
magnético aplicado necessário para alcançar a condição de ressonância. Os
desvios químicos são medidos em unidades de frequência (Hz) relativamente a
um padrão, sendo o tetrametilsilano (TMS) o mais usado para este efeito. Na
prática, o desvio químico é expresso em unidades adimensionais , resultantes
da divisão da frequência do sinal pela frequência de operação do aparelho.
Multiplicando o valor de por 106, obtêm-se valores entre 0 e 15 para a maioria
dos protões orgânicos, vindo assim os desvios químicos expressos em ppm.
O efeito de desdobramento de sinal pode ser explicado a partir do
exemplo simples da molécula C2H6. Considerando dois protões HA e HX ligados a
átomos de carbono adjacentes, possuindo diferentes desvios químicos. O
campo sentido por HA aumenta ou diminui ligeiramente devido aos dois spins
permitidos de HX (up ↑ e down →). Deste modo, o pico de HA divide-se num
dobleto, com intensidades 1:1. O efeito é recíproco e os dois estados de spin de
HA causam a divisão do pico de HX num dobleto. O espaço entre cada dobleto é
designado por constante de acoplamento JAX, medido em Hz. Esta constante é
independente do campo aplicado.
De uma forma mais geral, o número de picos num multipleto é
determinado pelo número de protões no grupo adjacente n e é igual a n+1.
Geralmente, protões ligados ao mesmo átomo de carbono e aqueles ligados a
átomos adjacentes mas possuindo o mesmo desvio químico, são considerados
equivalentes e não sofrem desdobramento de sinal. As excepções a esta regra
não serão aqui consideradas.
Fig. 16.14 – Exemplo do desdobramento de sinais em 1H-NMR de
C2H6.
As intensidades dos picos num multipleto seguem o triângulo de Pascal e
são resultado da distribuição estatística das várias combinações possíveis dos
dois estados de spin para os protões do grupo adjacente.
Introdução à Química Alimentar 2009
142
Fig. 16.15 – Desdobramento de sinais em NMR, segundo
triângulo de Pascal.
Os espectros de 13C são mais simples que os de 1H por dois motivos: a) os
desvios químicos entre núcleos de 13C em diferentes ambientes químicos podem
diferir até 200 ppm, enquanto que em 1H são raramente superiores a 10 ppm;
b) sendo um isótopo muito menos abundante, não se observam acoplamentos
entre si.
No entanto, ocorre acoplamento entre núcleos de 13C e 1H, embora
possam ser eliminados pelo equipamento, obtendo-se assim espectros mais
simples. Este procedimento não é sempre aplicado, já que em certas situações,
este acoplamento pode fornecer informação útil.
Fig. 16.16 – Espectro de 13C do butano-2-ol.
Aplicando o tratamento das transformadas de Fourier (FT) à
espectrometria de NMR é possível obter uma maior sensibilidade e uma maior
qualidade de informação estrutural.
A espectrometria de 1H-NMR é muito útil para identificação e análise
estrutural de compostos orgânicos, sendo a interpretação dos espectros feita
por comparação com espectros de referência e através da utilização de tabelas
Introdução à Química Alimentar 2009
143
de desvios químicos. Esta técnica é menos utilizada em análise quantitativa,
apesar de existir uma proporcionalidade directa entre as áreas dos picos e a
concentração do composto.
A espectrometria de massa (MS) baseia-se na ionização e fragmentação
de materiais, através de diversos processos. A análise dos fragmentos
produzidos permite obter dados estruturais e quantitativos.
As moléculas são caracterizadas segundo o seu padrão de ionização e
fragmentação quando bombardeadas com electrões de elevada energia, ou
ionizadas com menor fragmentação se forem utilizadas as chamadas técnicas
suaves. Não é um verdadeiro método espectrométrico, pois a radiação
electromagnética não é absorvida nem emitida, mas os dados são obtidos em
forma de espectro, com a abundância relativa dos fragmentos representada
como linhas. O processo de bombardeamento produz geralmente fragmentos
com carga +1, facilitando a sua separação e detecção por processos eléctricos
e magnéticos. Os espectros devem ser registados em condições de vácuo, de
modo a impedir a perca de fragmentos por colisão com moléculas componentes
da atmosfera.
Fig. 16.17 – Esquema de um espectrómetro de massa com
ionização por impacto de electrões.
Existem diversos métodos de ionização, adequados a diversos tipos de
moléculas, das mais simples às mais complexas e com diversas gamas de
sensibilidade. Após ionização e fragmentação da amostra, os fragmentos
iónicos são acelerados para o analisador. Os fragmentos são separados,
fazendo-os deslocar-se através de um campo magnético e/ou electrostático ou
medindo o tempo que demoram a chegar ao detector.
Introdução à Química Alimentar 2009
144
Um avanço que veio permitir maior fragmentação e estudo de iões
seleccionados foi a espectrometria de massa sequencial (MS/MS), a qual
envolve processos secundários de fragmentação, geralmente induzidos por
colisões com moléculas de um gás inerte, contido numa célula colocada entre
dois analisadores. Se houver reciclagem de iões no sistema ou forem
adicionados mais analisadores, o processo é estendido e passa a ser designado
por (MS)n.
O princípio da separação através de um analisador magnético pode ser
racionalizado em termos da energia cinética dos iões fragmentados, da
voltagem de aceleração V e do campo magnético B. A equação 16.13 mostra
que, para iões com carga (z) +1, a massa m é directamente proporcional ao
quadrado do raio da curvatura r.
2 2
2
m B r
z V (16.13)
Num espectro de massa, o padrão de fragmentação é característico de
cada substância e pode ser usado para identificação da mesma. O pico derivado
do ião mais abundante é designado pico base. Uma “ferramenta” útil para a
identificação de um composto é a capacidade de determinar a massa molecular
relativa e estabelecer uma fórmula molecular empírica. A massa molecular
relativa depende da identificação do pico do ião molecular M, produzido quando
um electrão é ejectado da molécula (M + e- ɹ M+ + 2e-). A fórmula empírica
pode ser obtida calculando as intensidades dos picos dos isótopos M+1, M+2,
etc. relativamente ao pico do ião molecular. Um outro auxiliar de interpretação
é a regra do azoto, a qual diz que uma molécula com peso molecular par deve
conter um número par de átomos de azoto ou nenhum átomo de azoto.
Fig. 16.18 – Espectro de massa típico de um hidrocarboneto.
Introdução à Química Alimentar 2009
145
Introdução à Química Alimentar 2009
146
Capítulo 17
Ensaios Imunológicos
Diversos procedimentos para análise de alimentos recorrem à utilização
de ensaios imunológicos, devido às suas especificidade, sensibilidade e
simplicidade. São empregues na análise de resíduos, identificação de bactérias
e vírus e detecção de proteínas. A detecção de proteínas é importante no
contexto da determinação de alergénios, autenticação de espécies de carne e
detecção de plantas geneticamente modificadas.
Os antigénios e os anticorpos são as duas componentes fundamentais de
qualquer ensaio imunológico. Um antigénio é uma molécula que induz a
formação de anticorpos. Anticorpos são proteínas produzidas por animais em
resposta a um antigénio. Estas proteínas ligam-se, com uma elevada afinidade,
ao antigénio responsável pela sua indução.
Um anticorpo é uma molécula em forma de Y, constituída por quatro
cadeias de polipeptídeos, ligadas entre si por pontes dissulfito. Duas das
cadeias de polipeptídeos são idênticas e aproximadamente duas vezes maiores
que as outras duas, também idênticas entre si. O antigénio liga-se em dois
sítios de ligação idênticos.
Fig. 17.1 – Regiões estruturais de um anticorpo.
Introdução à Química Alimentar 2009
147
O anticorpo liga-se à parte externa do antigénio numa região específica
(epítopo). A ligação do anticorpo ao antigénio não envolve ligações covalentes,
mas sim interacções electrostáticas e de van der Waals e pontes de H.
Fig. 17.2 – Representação da ligação antigénio-anticorpo.
Qualquer ensaio imunológico requer duas condições: 1) tem que existir
um método para separar ou diferenciar um antigénio livre de um antigénio
ligado; 2) ou o antigénio ou o anticorpo têm que ser quantificáveis em baixas
concentrações.
A detecção em muito baixas concentrações requer marcadores muito
activos. Um dos primeiros a ser desenvolvido utiliza iodo radioactivo (131I) e
designa-se ensaio radioimunológico (RIA).
Nos ensaios imunológicos utilizam-se recipientes de plástico, tirando
partido da existência de interacções hidrofóbicas entre as proteínas e as suas
superfícies. São habitualmente utilizadas microplacas com 96 cavidades, sendo
colocada uma amostra em cada cavidade.
Fig. 17.3 – Microplaca usada em ensaios imunológicos.
Introdução à Química Alimentar 2009
148
Devido aos perigos associados aos marcadores radioactivos, foram
desenvolvidos marcadores enzimáticos para os substituir. O mais popular é o
ensaio imunoenzimático ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), no qual
se usa uma enzima que deve ser muito estável, ligar-se facilmente a antigénios
ou anticorpos e catalisar rapidamente uma alteração visível num substrato
simples. Existem três variantes deste ensaio: sandwich, competitivo e indirecto.
Um ensaio indirecto pode ser efectuado tanto na variante sandwich como na
competitiva.
No ensaio sandwich, o antigénio fica entre dois anticorpos. Este é o ensaio
imunológico mais utilizado para a identificação de proteínas. Na análise de
alimentos, este tipo de ensaios pode ser utilizado para identificar adulterantes
ou alergénios. O anticorpo de captura é imobilizado num suporte e a solução do
alimento a ser analisada é-lhe adicionada. Esta solução contém uma proteína
que se comporta como um antigénio específico para o anticorpo de captura.
Após formado o complexo anticorpo de captura-antigénio, a restante solução é
removida. Após este passo de lavagem, adiciona-se outro anticorpo ligado a
uma enzima. Este anticorpo, denominado anticorpo de detecção, também
reconhece o antigénio. O excesso desta solução de detecção é removido e
adiciona-se um substrato incolor, que irá mudar de cor ao ligar-se à enzima.
Quanto mais intensa a cor, maior o teor de antigénio presente.
Para analisar componentes mais pequenos que as proteínas, como
resíduos de toxinas, antibióticos e pesticidas, é mais adequado utilizar um
ensaio competitivo. Neste formato, o primeiro passo é a imobilização da
pequena molécula, covalentemente ligada a uma molécula maior. Esta
molécula, geralmente uma proteína, funciona como transportadora e o conjunto
é designado por hapteno. Em alternativa, pode imobilizar-se o anticorpo. Após
a imobilização, remove-se o material em excesso. De seguida, adiciona-se um
extracto de alimento e passa a existir uma competição, entre o hapteno e a
molécula livre existente no extracto, para ligação a um anticorpo marcado com
uma enzima. Após um passo de lavagem, o anticorpo ligado ao hapteno
imobilizado permanece no meio. Quanto mais moléculas alvo existirem no
extracto do alimento, mais anticorpos se ligam às pequenas moléculas livres,
sendo este complexo removido no próximo passo de lavagem, pois não se
encontra imobilizado. O anticorpo ligado será quantificado por adição do
substrato da enzima e observação da alteração de cor produzida. Neste caso,
haverá uma relação inversamente proporcional entre a quantidade de analito
no extracto e a intensidade de cor.
Numa variante do ensaio competitivo, mais sensível, liga-se uma
quantidade limitada de anticorpo à placa e é criada uma competição entre o
hapteno ligado à enzima e a molécula livre no extracto de alimento. O passo
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final, após remoção do excesso da amostra, passa pela determinação da
quantidade de hapteno ligado à enzima, através da medição da cor produzida.
Fig. 17.4 – Ensaio imunológico de tipo sandwich.
No ensaio imunológico indirecto, mede-se a quantidade de anticorpo ou
hapteno indirectamente, utilizando frequentemente anticorpos anti-espécie.
Nesta variante, podem realizar-se ensaios sandwich ou competitivos. Os
anticorpos anti-espécie são obtidos a partir de anticorpos de um animal
posteriormente injectados num animal de outra espécie, estimulado o sistema
imunitário deste de modo a produzir anticorpos que se liguem aos epítopos dos
anticorpos do primeiro animal. Depois do passo competitivo, o material em
excesso é removido e adiciona-se o anticorpo anti-espécie, marcado com uma
enzima, para detectar a presença do anticorpo do primeiro animal. Este método
possui elevada sensibilidade, o que em conjunto com a existência no mercado
de diversos anticorpos anti-espécie com vários marcadores, torna esta variante
muito útil em diversos ensaios.
Introdução à Química Alimentar 2009
150
Existe uma tendência para a automação dos ensaios imunológicos, de
modo a melhorar a sua produtividade.
Fig. 17.5 – Ensaio imunológico competitivo.
A especificidade de ligação dos anticorpos também permite o seu uso em
técnicas de purificação. Na purificação por imunoafinidade, o anticorpo é
imobilizado sobre um suporte (agarose ou gel de sílica), servindo de fase
estacionária para separações cromatográficas. Estas fases podem ser
regeneradas e reutilizadas.
Fig. 17.6 – Exemplo de ensaio imunológico indirecto.
A separação por imunoafinidade tem sido utilizada para separar pequenas
moléculas, como as aflatoxinas, mas também materiais de maiores dimensões
como células.
Introdução à Química Alimentar 2009
151
Fig. 17.7 – Purificação por imunoafinidade. O antigénio liga-se ao
anticorpo imobilizado na coluna, o restante material é
removido e, finalmente, liberta-se o antigénio por
variação do pH ou do solvente utilizado.
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Capítulo 18
Métodos Analíticos em Biotecnologia
Devido à crescente introdução de alimentos provenientes da
biotecnologia agrícola, ou organismos geneticamente modificados (OGM), que
requerem análise por motivos de segurança, nutricionais e alergénicos, têm-se
desenvolvido métodos analíticos para detectar genes inseridos, partes do ADN
ou as proteínas expressadas pelos novos genes. O método mais utilizado para
análise de ADN é a reacção em cadeia da polimerase (polymerase chain
reaction – PCR) e para detecção de proteínas utilizam-se ensaios imunológicos
(ELISA) e com tiras de fluxo lateral (lateral flow strips - LFS).
Ao inserir novas secções de ADN nas plantas, são sintetizadas pequenas
quantidades de novas proteínas e é necessário desenvolver métodos analíticos
para as diferenciar das restantes proteínas, presentes em grandes
concentrações. Os métodos usados incluem HPLC, electroforese capilar, ensaios
imunológicos e espectrometria de massa.
Os ensaios imunológicos, ELISA e LFS são habitualmente utilizados na
variante sandwich. Existem kits no comércio destinados a analisar as mais
importantes culturas sujeitas a modificação genética.
O ensaio LFS permite determinar se a concentração de uma determinada
proteína se encontra acima ou abaixo de um determinado valor. Em vez de usar
uma enzima e o seu substrato para obter um produto de reacção colorido,
como nos ensaios ELISA, o método LFS utiliza pequenas partículas esféricas e
coloridas ligadas ao anticorpo, para gerar um sinal positivo. A separação da
proteína alvo é conseguida através da imobilização do anticorpo de captura
numa zona da tira. A amostra vai atravessar essa zona por capilaridade. Um
segundo anticorpo capaz de se ligar à proteína de interesse é ligado à superfície
das pequenas partículas coloridas. Estas partículas, revestidas com o anticorpo,
são secas numa zona da tira situada a jusante da zona de ensaio. Quando a
amostra líquida reconstitui as partículas, estas seguem o fluxo capilar da
amostra ao longo da tira. Na extermidade inicial da fibra é colocado um filtro
para reter partículas de grandes dimensões que possam existir na amostra e na
outra extermidade existe uma zona absorvente.
A amostra, contendo a proteína alvo, é colocada em contacto com uma
amostra líquida e é conduzida para a tira por capilaridade. A amostra atravessa
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o filtro e alcança a zona em que a proteína alvo se liga ao conjunto partícula
colorida – anticorpo. O complexo formado flui por capilaridade e é capturado
pelo anticorpo imobilizado na zona de ensaio. À medida que mais complexos
vão sendo capturados, torna-se evidente uma linha colorida, indicando a
presença do antigénio na amostra. Uma zona de controlo a jusante desta,
contém um reagente capaz de se ligar ao excesso de partículas que atravessa a
zona de ensaio e serve para indicar o correcto funcionamento do ensaio.
Fig. 18.1 – Funcionamento de um ensaio imunológico utilizando
tiras de fluxo lateral.
A sensibilidade dos ensaios LFS depende, sobretudo, da afinidade dos
anticorpos utilizados e é, em geral, inferior à dos ensaios ELISA.
O western blot é um método que combina dois procedimentos analíticos, a
electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e um ensaio imunológico. A
electroforese separa as proteínas existentes numa mistura complexa, após
desnaturação das mesmas, segundo o seu peso molecular. De seguida, as
proteínas são transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose e o
ensaio imunológico detecta uma dada proteína, após a separação. Para a
detecção é usado, normalmente, um anticorpo marcado com uma enzima,
dando origem a uma risca colorida no local de imobilização da proteína.
A presença de características transgénicas num alimento pode também ser
efectuada por identificação de sequências específicas de ADN. Os ensaios que
utilizam a reacção em cadeia da polimerase podem ter objectivos qualitativos
ou quantitativos, sendo que são mais frequentemente usados como ensaios de
varrimento. Estes servem para procurar as extremidades do fragmento de ADN
inserido.
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Fig. 18.2 – Ensaio western blot.
O ADN tem que ser extraído da amostra na forma mais pura possível e
com uma boa qualidade para permitir aplicar o método PCR. Após extracção, o
ADN alvo é amplificado por utilização da PCR. Este procedimento usa uma
cadeia sintética de ADN, com uma sequência complementar à da cadeia alvo. A
cadeia sintética é incubada com os reagentes necessários à replicação da área
alvo. Este ADN sintético é designado por primer. Esta replicação é levada a
cabo até ser produzido um número suficiente de cópias que permita a
detecção, usando uma reacção de separação e coloração. Esta reacção permite
obter quer a quantidade quer o tamanho da cadeia de ADN. A sequência de
ADN pode ser posteriormente caracterizada por outros métodos analíticos que
usam enzimas de restrição ou hibridização com sondas marcadas.
Existem diversos métodos quantitativos, baseados na PCR em tempo real
(real-time PCR). Nesta versão, a reacção é realizada num tubo fechado e a
variação na concentração dos produtos é visualizada com a ajuda de sondas
fluorescentes, as quais vão hibridizar com secções das cadeias de ADN
formado. Quando se dá a ligação das cadeias, produz-se um sinal fluorescente,
o qual é gravado e usado para seguir o progresso da reacção. Os dados
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permitem concluir a quantidade relativa de ADN modificado comparativamente
à de ADN original.
Fig. 18.3 – Amplificação de ADN através de PCR.
Introdução à Química Alimentar 2009
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Bibliografia
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