160
INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR Paulo Figueiredo

INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

  • Upload
    lamphuc

  • View
    288

  • Download
    5

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

INTRODUÇÃO À QUÍMICA

ALIMENTAR

Paulo Figueiredo

Page 2: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que
Page 3: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

To my father...

Page 4: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Índice

Capítulo 1 – Nomenclatura em Química Orgânica 1

Capítulo 2 – Reactividade Química 10

Capítulo 3 – Ligações Químicas 14

Capítulo 4 – Cinética Química 17

Capítulo 5 – Qualidade dos Dados Analíticos 20

Capítulo 6 – Amostragem 24

Capítulo 7 – Proteínas 26

Capítulo 8 – Lípidos 41

Capítulo 9 – Hidratos de Carbono 58

Capítulo 10 – Água 70

Capítulo 11 – Vitaminas e Minerais 79

Capítulo 12 – Aditivos Alimentares 90

Capítulo 13 – Contaminantes Alimentares 94

Capítulo 14 – Aromas 102

Capítulo 15 – Técnicas de Separação 105

Capítulo 16 – Métodos Espectrométricos 126

Capítulo 17 – Ensaios Imunológicos 146

Capítulo 18 – Métodos de Análise em Biotecnologia 152

Bibliografia 156

Page 5: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

1

Capítulo 1

Nomenclatura em Química Orgânica

A química orgânica estuda os compostos que contêm átomos de carbono

(Tabela 1.1). Apesar de existir um grande número de compostos orgânicos,

estes são constituídos por uma relativamente pequena quantidade de partes

semelhantes, combinadas de diversos modos, o que nos permite compará-los

entre si. Estas partes são denominadas grupos funcionais. A identificação

destes grupos funcionais e a capacidade de prever a reactividade de uma

molécula, tendo como base as propriedades dos seus grupos funcionais, são

uma das pedras basilares da química orgânica.

Tabela 1.1

Compostos orgânicos

Hidrocarbonetos Álcoois Éteres, aldeídos e cetonas Ácidos carboxílicos e ésteres Aminas e amidas Compostos aromáticos

Grupos funcionais são átomos, iões ou grupos de átomos específicos com

propriedades consistentes, caracterizados por possuirem uma composição

elementar e ligações específicas, as quais conferem uma dada reactividade à

molécula que os contém. Os principais grupos funcionais podem ser

encontrados na Tabela 1.2.

Um átomo de carbono saturado encontra-se ligado a 4 outros átomos e é

designado como tetravalente. Hidrocarbonetos insaturados possuem uma ou

mais ligações duplas (alcenos) ou triplas (alcinos) entre átomos de carbono.

As moléculas orgânicas podem exibir diversos tipos de isomerismo.

Isómeros conformacionais são formados por rotação das ligações simples C-C.

Estereoisómeros são moléculas com o mesmo padrão de ligações, mas cujos

átomos possuem diferentes arranjos espaciais. Existem 2 tipos de

estereoisómeros: enantiómeros e diastereómeros. Enantiómeros são como

imagens no espelho um do outro. Diastereómeros são isómeros que não são

imagens espelhadas um do outro.

Page 6: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

Tabela 1.2

Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo

Álcool Hidroxilo ROH

Metanol

Aldeído Aldeído RCHO

Acetaldeído

Alcano Alquilo RHn

Metano

Alceno Alcenilo R2C=CR2

Etileno

Page 7: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo

Alcino Alcinilo RCɼCR’ Acetileno

Amida Carboxamida RCONR2

Acetamida

Aminas

Amina primária

RNH2 Metilamina

Amina secundária

R2NH

Dimetilamina

Amina terciária

R3N

Trimetilamina

Page 8: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo

Compostos azo Azo RN2R’

Alaranjado de

metilo

Ácido carboxílico Carboxilo RCOOH

Ácido acético

Éter Éter ROR’

Éter dietílico

Éster Éster RCOOR’

Butirato de etilo

Haleto de alquilo Haleto RX Cloroetano

Page 9: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo

Cetona Cetona RCOR’

Metil etil cetona

Peróxido Peroxi ROOR

Peróxido de di-tert-butilo

Derivados do benzeno

Fenilo RC6H5 Cumeno

Fosfato Fosfato ROP(=O)(OH)2

Gliceraldeído 3-fosfato

Tiol Sulfidrilo RSH

Mercaptoetanol

Page 10: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

6

Diz-se que os enantiómeros possuem quiralidade, ou seja não têm um

plano de simetria, não podendo ser sobrepostos à sua imagem no espelho.

Num composto orgânico, qualquer átomo ligado a 4 átomos ou cadeias

diferentes pode ser considerado quiral.

Fig. 1.1 – Enantiómeros.

A configuração dos compostos orgânicos pode ser descrita segundo três

nomenclaturas, a actividade óptica, a configuração relativa (mais antigas e em

desuso) e a configuração absoluta.

Os isómeros ópticos recebem a designação (+) ou (-) consoante fazem

rodar o plano da luz polarizada no sentido dos ponteiros do relógio (+) ou no

sentido contrário (-). Também são utilizadas as designações dextrorotatório

para o isómero (+) e levorotatório para o (-).

A configuração relativa usa o gliceraldeído (o açúcar mais simples) como

modelo e designa as moléculas que rodam o plano da luz no sentido dos

ponteiros do relógio como D e as que a rodam no sentido contrário como L. De

notar que não existe relação entre as notações (+)/(-) e D/L, pois esta última

apenas refere se a estereoquímica do composto está relacionada com o

enantiómero dextrorotatório ou levorotatório do gliceraldeído.

Fig. 1.2 – Configurações relativas do gliceraldeído.

No caso dos aminoácidos existe uma regra empírica que facilita a

atribuição da designação D ou L. Se os substituintes COOH, R, NH2 e H

estiverem dispostos à volta do carbono quiral no sentido contrário ao dos

ponteiros do relógio, teremos um D-aminoácido; no caso contrário um L-

aminoácido (Figura 1.3).

Page 11: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

7

Fig. 1.3 – Configurações relativas da alanina.

Na nomenclatura de configuração absoluta, os centros quirais são

designados R ou S, de acordo com um sistema em que é atribuída uma ordem

de prioridades aos seus substituintes, baseada no seu nº atómico. Deste modo,

não existe qualquer relação fixa com as duas outras nomenclaturas.

Fig. 1.4 – Notação R/S.

A nomenclatura R/S só se aplica no caso de ligações simples. Para o caso

de ligações duplas carbono-carbono, utiliza-se a notação cis/trans ou,

preferencialmente, a mais recente E-/Z-.

Fig. 1.5 – Alcenos com configurações cis/trans.

No caso de os dois átomos de carbono terem substituintes idênticos

(Figura 1.5) a designação cis corresponde a Z e a trans a E. Já no caso de os

substituintes serem diferentes, isso nem sempre corresponde à verdade. A

nomenclatura cis/trans apenas deverá ser utilizada se ambos os átomos de

carbono numa ligação dupla tiverem um átomo de H como substituinte.

Na Figura 1.6 está exemplificada a aplicação da nomenclatura E/Z.

Dividindo a ligação dupla em duas metades, atribuem-se prioridades (baseadas

no nº atómico) a cada par de substituintes. No caso de os substituintes com

Page 12: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

8

igual ordem de prioridade serem simétricos relativamente ao corte imaginário, a

ligação será designada Z e se não forem simétricos E.

Fig. 1.6 – Aplicação da notação E-/Z- a alcenos.

De uma forma simples, considera-se que dois estereoisómeros são

diastereómeros se apenas um centro quiral diferir entre eles. Se uma molécula

tiver apenas um carbono assimétrico (estereocentro), ela exibirá duas formas

que serão imagens espelhadas uma da outra. Se a molécula tiver dois carbonos

assimétricos, existirão quatro configurações possíveis, sendo impossível que as

quatro sejam todas imagens no espelho umas das outras. Ou seja, quanto

maior o número de centros quirais numa molécula, mais provável é a existência

de confórmeros diferentes, e portanto de diastereómeros. O número de

confórmeros possíveis numa molécula quiral é 2n, onde n indica o nº de centros

quirais

Fig. 1.7 – Diastereómeros.

Os compostos aromáticos são um conjunto de moléculas estáveis, devido

ao total preenchimento e baixa energia dos seus orbitais ligantes, possuindo

4n+2 electrões . As ligações electrónicas estão dispostas numa forma cíclica.

A aromaticidade pode ser definida como uma propriedade química em que

um anel conjugado de ligações não saturadas, pares de electrões ou orbitais

vazias exibem uma estabilidade superior à resultante apenas do efeito de

conjugação. Tal é devido à capacidade que os electrões têm de circular por

todos os átomos, os quais estão ligados por ligações simples e duplas

alternadas. Estas ligações podem ser consideradas como híbridos de ligações

simples e duplas, sendo todas idênticas entre si.

Page 13: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

9

A aromaticidade é regulada pela regra de Hückel, a qual diz que uma

molécula, para ser considerada aromática, terá que possuir um nº par de

electrões deslocalizados, mas esse número não poderá ser múltiplo de 4. A

regra indica que uma molécula aromática terá 4n+2 electrões , em que n =

0,1,2,3,…

Fig. 1.8 – Exemplos de moléculas aromáticas. Compostos cíclicos,

com 4n+2 electrões (n = 1, 2, 3, ...).

Page 14: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

10

Capítulo 2

Reactividade Química

Existem diversos mecanismos de reacções com compostos orgânicos,

nomeadamente adição, eliminação, substituição e rearranjos. Muitas delas

ocorrem em alimentos antes ou durante o seu processamento.

Numa reacção de adição, 2 moléculas combinam-se para formar uma

única molécula maior. Existem dois tipos de adição: electrofílica e nucleofílica.

Uma adição nucleofílica é uma reacção em que existe a remoção de uma

ligação pela criação de duas novas ligações covalentes. Habitualmente, os

compostos aos quais é feita a adição possuem ligações carbono-carbono duplas

ou triplas.

Fig. 2.1 – Reacção de adição electrofílica.

Na adição nucleofílica, a ligação é removida pela criação de duas novas

ligações covalentes pela adição de um nucleófilo (substância doadora de um

par de electrões ligantes, numa ligação química). As reacções de adição

nucleófila estão limitadas a moléculas com ligações múltiplas carbono-carbono

ou carbono com outro átomo.

Fig. 2.2 – Reacção de adição nucleofílica.

O oposto de uma reacção de adição é uma reacção de eliminação. Nestas

reacções dois substituintes são removidos de uma molécula. A reacção pode

dar-se num único passo (E2) ou em dois passos (E1).

A eliminação bimolecular (E2) resulta na formação de uma ligação e os

dois grupos de partida (habitualmente um hidrogénio e um halogénio) terão

que ser coplanares. Neste caso, a quebra das ligações carbono-hidrogénio e

carbono-halogénio dá-se num único passo.

Page 15: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

11

Fig. 2.3 – Exemplo de uma reacção de eliminação E2.

Na eliminação unimolecular E1 ocorre em primeiro lugar um passo de

ionização em que a quebra da ligação carbono-halogénio dá lugar à formação

de um carbocatião. No passo seguinte dá-se a desprotonação do carbocatião.

Fig. 2.4 – Exemplo de uma reacção de eliminação E1.

Numa reacção de substituição, um grupo funcional de uma molécula é

substituído por um outro grupo. Podem existir diversos tipos de substituição,

sendo as mais relevantes a substituição nucleofílica e a electrofílica.

A substituição nucleofílica pode por sua vez ser alifática ou aromática,

conforme a natureza da molécula que sofre a substituição. Neste tipo de

reacção, um nucleófilo liga-se a um átomo com carga positiva ou parcialmente

positiva. Este átomo (electrófilo) faz parte de um grupo de saída. Existem dois

possíveis mecanismos numa substituição nucleofílica, SN1 e SN2, em que 1 e 2

representam a ordem da cinética reaccional. Numa reacção SN2, a adição do

nucleófilo e a eliminação do grupo de saída ocorrem em simultâneo. Uma

reacção SN1 ocorre em dois passos.

Numa reacção de substituição electrofílica, um electrófilo desloca um

outro substituinte, frequentemente um hidrogénio. Este tipo de substituição é

característico de compostos aromáticos, embora também possa ocorrer em

compostos alifáticos. Neste tipo de reacção, é um composto electrofílico que

desloca um grupo funcional, podendo a reação ocorrer em dois passos (SE1) ou

num único passo (SE2). No mecanismo SE1, o substrato primeiro forma um

carbanião e um resíduo orgânico com carga positiva. Segue-se uma rápida

Page 16: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

12

recombinação do carbanião com o electrófilo. No mecanismo SE2 existe um

único estado de transição, no qual coexistem a nova ligação e a antiga.

Fig. 2.5 – Exemplo de substituição nucleofílica.

Fig. 2.6 – Sequência de passos numa substituição electrofílica.

Existe um terceiro tipo de reacções de substituição, importante na química

alimentar, a substituição radicalar, a qual envolve uma sequência de 2 ou 3

passos. No 1º passo, a iniciação, é criado um radical livre. No passo final, ou

terminação, o radical reage com outra espécie radical, parando a cadeia

reaccional. No caso de a reacção não terminar, o radical continua a reagir,

originando novos radicais, disponíveis para novas reacções. Este passo

intermédio é designado propagação.

Page 17: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

13

Fig. 2.7 – Mecanismo de reacção numa substituição radicalar.

Quando uma molécula orgânica sofre uma alteração, de modo a originar

um seu isómero estrutural, essa reacção é designada rearranjo.

Fig. 2.8 – Exemplo de uma reacção de rearranjo.

Page 18: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

14

Capítulo 3

Ligações Químicas

As ligações químicas são responsáveis pelas interacções de atracção

entre átomos e moléculas. O conceito de ligação química está associado à

partilha de electrões entre os átomos participantes na ligação. Os electrões

sofrem uma atracção electromagnética dos núcleos atómicos, devido à

diferença de cargas eléctricas. Na formação de ligações químicas, alguns

electrões deslocam-se parcialmente de um átomo para outro(s). Esta

deslocação é favorecida por uma redução do estado de energia, causada por

um rearranjo das cargas, resultando numa redução da distância média entre os

electrões de todos os átomos ligados e os seus núcleos. A transferência de

carga provocada pelo movimento dos electrões, origina uma atracção

electromagnética entre os átomos participantes na ligação. É a esta força

atractiva entre átomos que se chama ligação química.

As ligações químicas podem ser divididas em covalentes e iónicas. Nas

primeiras, há uma partilha de electrões entre os átomos; nas segundas, um

conjunto de átomos possui um excesso de electrões, enquanto o outro tem

uma deficiência de electrões, havendo uma transferência de electrões entre

núcleos atómicos. Numa ligação iónica existe uma atracção electrostática entre

átomos ionizados.

Fig. 3.1 – Ligações químicas.

Page 19: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

15

A teoria da ligação de valência diz que uma ligação química se forma

quando dois electrões de valência, nos seus respectivos orbitais atómicos,

colaboram para manter dois núcleos juntos, devido a um efeito de redução da

energia do sistema. Esta teoria baseia-se em 6 princípios:

1. A ligação entre um par de electrões forma-se devido à interacção entre

um electrão desemparelhado em cada um dos átomos.

2. Os spins dos electrões têm que ser opostos.

3. Uma vez emparelhados, os electrões não poderão participar noutra

ligação.

4. A transferência electrónica envolve apenas uma função de onda por cada

átomo.

5. Os electrões disponíveis no mais baixo nível energético formam as

ligações mais fortes.

6. Entre dois orbitais atómicos, aquele que consegue uma maior

sobreposição com um orbital de outro átomo formará a ligação mais

forte, a qual tenderá na direcção do orbital concentrado.

Fig. 3.2 – Ligação de valência em BF3: 3 orbitais sp2 do átomo de

Boro sobrepostos a 3 orbitais p, um por cada átomo de

Flúor.

Uma teoria alternativa, para explicar a natureza das ligações químicas, é a

teoria dos orbitais moleculares, a qual utiliza uma combinação linear de orbitais

atómicos para formar orbitais moleculares, os quais cobrem a totalidade da

molécula. Nesta teoria, os orbitais moleculares são divididos em orbitais

ligantes, anti-ligantes e não ligantes. Se os electrões de um orbital tiverem

maior probabilidade de se encontrar entre os núcleos atómicos que noutra

posição qualquer, o orbital será ligante. No caso contrário, o orbital molecular

será anti-ligante. Os orbitais ligantes reforçam a ligação e os anti-ligantes

enfraquecem-na. Num orbital não ligante, os electrões encontram-se em

orbitais mais próximos do núcleo e não influenciam a força da ligação química.

Page 20: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

16

Fig. 3.3 – Orbitais moleculares na molécula de hidrogénio (H2).

As duas teorias são hoje em dia consideradas complementares.

As ligações covalentes e iónicas são ligações intramoleculares. As ligações

formadas entre duas ou mais moléculas são designadas ligações

intermoleculares. Exemplos comuns em química dos alimentos são interacções

entre dipolos e ligações de hidrogénio.

Page 21: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

17

Capítulo 4

Cinética Química

A cinética química descreve a dependência da velocidade das alterações

químicas em função de condições como a concentração dos reagentes, a

temperatura, o pH e a força iónica. A velocidade da alteração é habitualmente

representada como dependente das concentrações dos reagentes elevadas a

uma potência.

velocidade = k[A]x[B]y (4.1)

Em 4.1, k é a constante de velocidade. A ordem da reacção (x+y) é igual

ao nº de moléculas envolvidas no passo mais lento (o que determina a

velocidade) da reacção. Em química alimentar, a generalidade das reacções são

descritas por cinéticas de ordem 0 ou 1. Numa sequência de reacções, é o

passo limitante que habitualmente determina a ordem da cinética. A velocidade

de uma reacção é influenciada pelo estado físico dos reagentes e suas

concentrações, pela temperatura à qual ocorre e pela presença ou não de

catalisadores.

Reacções ácidas, formação de sais e permutas iónicas são reacções

rápidas. Pelo contrário, quando são formadas ligações covalentes ou grandes

moléculas, as reacções tendem a ser lentas. Quando os reagentes estão no

mesmo estado, o movimento térmico coloca-os em contacto mas, quando estão

em diferentes fases, a reacção está limitada pela interface existente entre os

reagentes.

Segundo a teoria das colisões, as moléculas têm que colidir para reagirem.

Nessa perspectiva, quanto maior a concentração dos reagentes, maior a

frequência das colisões entre si. A frequência das colisões também aumenta

com a temperatura. No entanto, existe uma mais importante dependência

cinética da temperatura, dado que a energia térmica de uma molécula aumenta

com a temperatura. Desse modo, ao aumentar a temperatura, aumenta o teor

de moléculas de reagente com energia suficiente para reagir, ou seja energia

mais elevada que a energia de activação (Ea).

A energia de activação, expressa pela equação de Arrhenius (4.2) indica

que a constante de velocidade (k) depende da temperatura T (em graus

Page 22: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

18

Kelvin). Nesta equação, A é o factor de frequência e R a constante universal

dos gases.

lnak

E RTA

(4.2)

A velocidade de uma reacção químicapode ser alterada através da

utilização de substâncias chamadas catalisadores. Um catalisador é uma

substância que modifica o estado de transição de uma reacção, de modo a

reduzir a energia de activação, aumentando a velocidade da reacção, mas não

sendo consumido por esta.

Fig. 4.1 – Diferenças na energia de activação de uma reacção na

ausência (——) e na presença (----) de um catalisador.

Enquanto a cinética química descreve a velocidade das reacções químicas,

a termodinâmica química determina a extensão dessas reacções. Numa reacção

reversível, alcança-se o equilíbrio químico quando as velocidades das reacções

directa e inversa são iguais e as concentrações de reagentes e produtos deixam

de variar. De uma forma geral, a variação de energia livre (G) de uma reacção

determina a ocorrência de uma transformação química e a cinética descreve a

velocidade dessa reacção. Uma reacção pode ser fortemente exotérmica e ter

uma variação de entropia positiva, mas na prática não ocorre porque é

demasiado lenta. Se um reagente tiver capacidade de originar dois produtos

diferentes, será formado o que for termodinamicamente mais estável, excepto

em circunstâncias especiais, caso em que se diz que a reacção está sob

controlo cinético.

A energia livre de Gibbs é a energia, associada a uma reacção química,

que pode ser utilizada para produzir trabalho. É definida pela equação (4.3) em

que G é a variação na energia livre de Gibbs, H é a variação de entalpia, T a

temperatura absoluta e S a variação em entropia. Quando G < 0 a reacção é

Page 23: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

19

espontânea, se G > 0 a reacção é não espontânea e se G = 0 estamos em

condições de equilíbrio (nem a reacção directa nem a inversa são favorecidas).

G = H – TS (4.3)

A expressão 4.4 relaciona a constante de equilíbrio com a energia livre de

Gibbs. G0 representa a energia livre de Gibbs no equilíbrio.

0G

RTeqK e

(4.4)

Page 24: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

20

Capítulo 5

Qualidade dos Dados Analíticos

É necessária uma atitude crítica relativamente aos resultados analíticos,

de modo a compreender o seu significado e as suas limitações. A precisão

depende do método utilizado e só pode ser melhorada até um certo ponto. Para

obter um compromisso aceitável entre a qualidade dos resultados e o tempo do

analista, é necessário conhecer a natureza e origem dos erros produzidos. Tal é

possível através do uso de métodos estatísticos, tornados mais úteis devido à

utilização conjunta de técnicas informáticas. Esta manipulação de dados é

designada por quimiometria.

Definem-se de seguida alguns conceitos básicos da quimiometria:

Exactidão (accuracy) – proximidade de uma medida ou resultado

ao seu verdadeiro valor. Expressa em termos de erro.

Erro – a diferença entre o resultado verdadeiro e o resultado

medido. Deve ser expresso como erro absoluto, a diferença real

entre o verdadeiro valor e o valor medido, nas mesmas unidades.

Por vezes apresentado como erro relativo, ou seja uma

percentagem do valor medido relativamente ao verdadeiro.

Média – média aritmética de um conjunto de medidas (replicadas).

Precisão – a variabilidade de uma medida. Pode ser expressa em

termos absolutos ou relativos. O desvio padrão é o melhor

indicador da precisão.

Desvio padrão () – calculado a partir da expressão 5.2 em que xi é

um resultado medido, N é o número de replicadas e x é a média

dessas replicadas. Para um elevado número de amostras usa-se N

e para um pequeno número (30 ou menos) usa-se N-1.

2

1

1 N

i

i

xN

(5.1)

2

1

1

1

N

i

i

s x xN

(5.2)

Desvio padrão relativo (coeficiente de variação) – usado para

comparar precisões.

Page 25: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

21

100sCV

x

(5.3)

Variância – é o quadrado do desvio padrão. A sua utilidade prática

advém do facto de os valores serem aditivos.

2 2 2 2

x y z x y zs s s s (5.4)

Fig. 5.1 – Ilustração dos conceitos de excatidão e precisão. a) boa

exactidão e boa precisão; b) boa precisão e má

exactidão; c) boa exactidão e má precisão; d) má

exactidão e má precisão.

Consoante a sua origem, os erros podem ser classificados como

determinados ou indeterminados. Os primeiros podem ser quantificados e

corrigidos; os segundos são aleatórios, não podendo ser quantificados. Os erros

têm como habitual origem: o operador, o equipamento ou o método. Podem

ser detectados pela análise de brancos ou de padrões ou ainda análises

independentes, utilizando métodos diferentes ou alternativos.

Na avaliação da qualidade dos dados analíticos é importante conhecer a

sensibilidade e o limite de detecção do equipamento. A sensibilidade está

relacionada com a dimensão da variação do equipamento em resposta à

variação na concentração do composto. Dá indicação da variação que se pode

fazer na composição da amostra até ser notada uma alteração na resposta do

equipamento. O limite de detecção é o menor incremento detectável com um

determinado grau de confiança (geralmente 1%).

Para avaliar a qualidade dos métodos utilizados e dos resultados obtidos

deve proceder-se a uma análise estatística desses resultados. Um número

mínimo de vinte e cinco replicadas deve ser usado, de modo a obter uma

amostra estatisticamente representativa. Como este número é difícil de atingir,

quer do ponto de vista prático, quer económico, terão que ser utilizados

métodos estatísticos eficazes com menor número de dados.

Os resultados são apresentados com um certo número de algarismos

significativos. Num número, todos os algarismos conhecidos com rigor mais o

primeiro algarismo incerto, constituem os algarismos significativos desse

Page 26: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

22

número. Por exemplo, numa medida de 1.0421 g, com rigor de 0.0001 g, há

cinco algarismos significativos. Se a medida fosse de 0.0421 g, teríamos três

algarismos significativos, para o mesmo rigor, pois o 0 só é considerado

significativo quando faz parte do número. Quando um resultado é obtido por

adição ou subtracção de dois valores, os algarismos significativos são

determinados a partir das incertezas absolutas. Considere-se a adição de

155.50.1 e 0.0850.001, cujo resultado é 155.585. A incerteza surge no

quarto algarismo, portanto o resultado deveria ser apresentado como 155.6. No

caso do resultado ser obtido a partir de uma multiplicação ou divisão, os

algarismos significativos são determinados a partir da incerteza relativa do valor

menos rigoroso. Nos dois valores anteriores, 0.085 tem a maior incerteza

relativa (12 ppm), logo o produto 155.5 x 0.085 = 13.3275 tem um desvio

absoluto de 13.3275 x 0.012 = 0.16. Aqui a incerteza aparece no terceiro

algarismo e o resultado deveria ser apresentado como 13.3.

Em análise quantitativa exige-se que uma medida analítica exiba uma

proporcionalidade rigorosa e fiável relativamente à composição da amostra.

Para estabelecer essa proporcionalidade, é necessário efectuar procedimentos

de calibração. Numa calibração simples, é preparada uma gama de padrões,

contendo diversas concentrações do analito em estudo. Estes padrões são

analisados segundo um método padrão e é obtida uma curva de calibração

sinal vs. quantidade do analito. A partir deste gráfico podem interpolar-se os

valores das amostras desconhecidas.

Fig. 5.2 – Exemplo de uma curva de calibração.

Uma boa curva de calibração deverá ser linear numa gama alargada de

concentrações. Idealmente deverá passar pela origem, mas não é obrigatório

que tal aconteça.

Page 27: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

23

O coeficiente de correlação r define o ajuste dos dados a uma linha recta.

É dado por

2 2

i i

i i

x x y yr

x x y y

(5.5)

O valor de r deverá ser o mais próximo possível de +1.000 ou -1.000,

valores que correspondem a uma correlação perfeita.

O coeficiente de determinação r2 dá uma melhor percepção do ajuste dos

dados.

Page 28: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

24

Capítulo 6

Amostragem

Dada a impossibilidade de analisar todos os componentes de um dado

lote para avaliar a sua qualidade ou outros parâmetros, é seleccionada uma

parte do todo e considera-se que esta porção é representativa da totalidade do

produto. A obtenção de uma porção, ou amostra, representativa do todo, é

designada por amostragem e a quantidade total da qual foi retirada a amostra

é chamada população.

Os dois objectivos primários da amostragem são o cálculo do valor médio

de uma característica e determinar se esse valor médio respeita as

especificações definidas no plano de amostragem.

As regras para amostragem em alimentos específicos estão delineadas em

guias como Official Methods of Analysis da AOAC International, de modo a

poderem ser executadas pelos analistas em condições que validem os dados

obtidos.

Uma população ideal seria uniforme e idêntica em todas as circunstâncias,

designando-se por homogénea. A amostragem em tal população é simples,

podendo uma amostra ser tirada aleatoriamente, sendo os dados obtidos

sempre representativos do todo. No entanto, a maioria das populações são

heterogéneas, tendo a amostragem que ter tal facto em consideração.

A amostra deve ser retirada de diversos locais numa população, para

garantir a sua representatividade. Para líquidos deve agitar-se antes de retirar a

amostra. Para sólidos, devem retirar-se amostras de vários pontos.

O tamanho óptimo de uma amostra, para obter representatividade, pode

ser determinado através de análise estatística, usando o teste de t. O tamaho

da amostra depende da exactidão requerida.

Se o tamanho de partícula da amostra for demasiado grande para a

análise pretendida, ele terá de ser reduzido. A amostra poderá ser dividida em

quartos e serem utilizados os dois quartos opostos.

Muitas amostras requerem trituração para assegurar uma análise mais

rigorosa. Existem diversos instrumentos para triturar alimentos, adaptados aos

diversos tipos de amostras. A trituração de amostras húmidas pode provocar

Page 29: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

25

perca de humidade e alterações químicas. A congelação ou a secagem das

amostras pode reduzir estas percas e devem ser efectuadas sempre que

possível. Por outro lado, o processo de trituração não deverá provocar

aquecimento da amostra e o contacto da amostra com superfícies metálicas

deverá ser evitado, se a amostra se destinar à análise de minerais.

Um mau armazenamento das amostras pode também ser um factor de

erro para os dados analíticos obtidos. As amostras devem estar protegidas dos

factores ambientais (humidade, ar, luz, calor) que as possam afectar. Em

alguns casos poderão ser utilizados conservantes para proteger amostras de

alimentos.

Muitos alimentos contêm enzimas, as quais podem causar degradação dos

componentes a analisar. Por esse motivo, a actividade enzimática deve ser

eliminada ou controlada antes da análise, através de métodos seleccionados de

acordo com as características do alimento. Os métodos mais comuns são

desnaturação e inactivação das enzimas a temperatura elevada ou limitação da

sua actividade por congelação, podendo também ser utilizada a alteração do pH

ou adição de agentes redutores no caso das enzimas com actividade oxidante.

Os alimentos com teor elevado de gordura apresentam maiores

dificuldades para preparação de amostras. A sua trituração é difícil, requerendo

frequentemente prévia congelação e os lípidos insaturados são sensíveis à

oxidação, necessitando armazenamento em vácuo ou sob atmosfera de azoto.

Poderão ser-lhes adicionados antioxidantes, desde que não interfiram com a

análise.

Page 30: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

26

Capítulo 7

Proteínas

As proteínas são grandes moléculas orgânicas, compostas por

aminoácidos ligados entre si. Estas ligações peptídicas (Fig. 7.1) são formadas

entre os grupos carboxilo e amino de dois aminoácidos adjacentes. Dos cerca

de 500 aminoácidos encontrados na natureza, apenas 20 aminoácidos

diferentes são capazes de formar proteínas. A composição em aminoácidos de

uma proteína determina o valor biológico desta, de onde a importância do

desenvolvimento de métodos analíticos que permitam a identificação dos

aminoácidos resultantes da hidrólise de uma proteína.

10 ou 11 destes 20 aminoácidos não são sintetizados pelo organismo

humano, sendo apenas adquiridos através da dieta, daí resultando a sua

classificação como aminoácidos essenciais.

Fig. 7.1 – Reacção de condensação entre 2 aminoácidos,

originando uma ligação peptídica.

As diferentes características químicas destes aminoácidos (Fig. 7.2) estão

na base da estrutura tridimensional das proteínas e da sua função. A estrutura

das proteínas pode ser classificada como:

primária – uma sequência de aminoácidos

secundária – estruturas regularmente repetidas estabilizadas por

ligações de hidrogénio. Adoptam a conformação de hélice alfa ou

folha beta

terciária – formação de um núcleo hidrofóbico, estabilizado por

pontes salinas, ligações de hidrogénio, pontes bissulfito e

modificações pós-translacionais

quaternária – interacções entre várias proteínas

Em função da sua estrutura, as proteínas podem ser classificadas como

fibrosas ou globulares (Fig. 7.3). As proteínas fibrosas, apenas encontradas em

animais, são insolúveis em água devido à sua estrutura secundária e possuem

Page 31: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

27

funções de armazenamento ou usadas em tendões, músculos e ossos. As

proteínas globulares são hidrossolúveis, devido a possuirem estrutura terciária e

desempenham diversas funções nos organismos, entre as quais hormonal e

enzimática.

Fig. 7.2 – Estruturas químicas dos 20 aminoácidos componentes

das proteínas.

As proteínas sofrem desnaturação quando expostas a temperaturas

elevadas, alterações de pH, de força iónica ou de solvente e ainda a

manipulações intensas, como por exemplo durante o processamento de alguns

alimentos. A desnaturação proteica consiste na perca da sua estrutura.

Page 32: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

28

Fig. 7.3 – Estruturas proteicas.

A análise de proteínas nos alimentos é relevante para a correcta

rotulagem das embalagens, para a investigação das suas propriedades

funcionais e para a determinação da sua actividade biológica. Existem métodos

analíticos que podem ser aplicados quando se pretende determinar o teor

proteico total, o teor de uma dada proteína, o teor proteico durante o

isolamento e purificação de uma dada proteína, o teor de azoto não proteico, a

composição em aminoácidos e o valor nutritivo de uma proteína.

O método de Kjeldahl permite determinar o teor de azoto orgânico total

de um alimento. Todos os compostos orgânicos são digeridos com ácido

sulfúrico, na presença de catalisadores e o azoto orgânico total é convertido em

sulfato de amónio. O material digerido é neutralizado com uma base e destilado

numa solução de ácido bórico. Os aniões borato formados são titulados com

uma solução padrão de ácido, obtendo-se o teor de azoto na amostra. Este

Page 33: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

29

resultado pode ser relacionado com o teor proteico na amostra, através de um

factor de conversão.

As amostras usadas têm que ser trituradas e homogeneizadas. A digestão

é feita com auxílio de catalisadores e resulta na formação de sulfato de amónio.

O carbono e o hidrogénio presentes são convertidos em CO2 e H2O.

Proteína ɹ (NH4)2SO2 (7.1)

Depois de diluir o material digerido com água, adiciona-se tiossulfato de

sódio em meio básico, para neutralizar o ácido sulfúrico. A amónia formada é

destilada numa solução de ácido bórico, contendo indicadores.

(NH4)2SO4 + 2NaOH ɹ 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O (7.2)

NH3 + H3BO3 ɹ NHŸ + H2BO„ (7.3)

O ião borato (quantidade proporcional à de azoto) é titulado com uma

solução padrão de HCl, permitindo calcular o número de moles de N na

amostra, o qual é igual ao número de moles de NH3, que por sua vez é igual ao

de HCl.

H2BO„ + H+ ɹ H3BO3 (7.4)

Deve ser feito um branco para subtrair o teor de azoto dos reagentes

daquele da amostra.

Vol. ácido corrigido 14 g N%N = N HCl x x x 100

peso da amostra (g) mol (7.5)

Nesta fórmula N HCl é a concentração de HCl em mol.L-1, o volume de ácido

corrigido corresponde ao volume de HCl gasto para titular a amostra menos o

gasto para titular o branco e 14 é a massa atómica do azoto.

Utiliza-se um factor de correcção para converter a percentagem de azoto

em percentagem de proteína. Como a maioria das proteínas contém 16% de

azoto, normalmente esse factor é de 6.25 (100/16=6.25). Estão publicados

factores de conversão específicos para diversos alimentos, encontrando-se

alguns dos quais expressos na Tabela 7.1.

Este é um método aplicável a todo o tipo de alimentos, barato e exacto

mas algo lento e requer manipulação de reagentes corrosivos.

O método de Kjeldahl tem sofrido modificações que permitem um

aumento da sua eficácia e também uma automação ou semi-automação das

medidas e também a sua utilização para medir teores na ordem dos g.

Page 34: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

30

Tabela 7.1

Alimento Factor

Ovos ou carne 6.25 Lacticínios 6.38 Trigo 5.70 Outros cereais e oleaginosas 6.25 Amêndoas 5.18 Amendoins 5.46 Coco 5.30

Um método alternativo, que também mede o azoto orgânico total, é o de

Dumas. Neste processo, as amostras são pesadas e introduzidas num reactor

de combustão. O azoto libertado é medido num cromatógrafo gasoso que lhe

está anexo. O método de Dumas também se aplica a todos os alimentos, mas é

mais rápido e permite automação, tendo ainda a vantagem de não utilizar

reagentes perigosos. Para calcular o teor proteico dos alimentos é necessário

recorrer aos mesmos factores de conversão usados no método de Kjeldahl.

O teor proteico pode também ser determinado através da espectroscopia

no infravermelho, tendo por base o princípio de que diferentes grupos

funcionais numa amostra absorvem radiação a diferentes frequências. No caso

das proteínas utilizam-se as bandas de absorção características das ligações

peptídicas (6.47 m, 3300-3500 nm, 2080-2220 nm e 1560-1670 nm),

permitindo calcular a concentração proteica. Este método é aplicável a uma

vasta gama de alimentos e as análises são rápidas, mas tem a desvantagem de

requerer uma calibração prévia do equipamento, que poderá ser demorada.

O método do biureto é um processo químico que permite determinar a

concentração de proteínas num alimento, baseado no princípio de que

substâncias contendo ligações peptídicas reagem com iões Cu2+ em meio

básico. A absorvância da cor produzida pode ser medida a 540 nm e a sua

intensidade é prporcional à concentração de proteínas na amostra.

O reagente do biureto (inclui sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio

e potássio, usado para estabilizar os iões Cu2+ em meio básico) é adicionado a

uma solução da proteína e após estabilização durante 15-30 minutos à

temperatura ambiente mede-se a absorvância relativamente a um branco do

reagente. No caso de a mistura reaccional não se apresentar límpida é

necessário efectuar uma centrifugação ou filtração da mesma, antes de ler a

absorvância. Para obter a concentração proteica é necessário obter

previamente uma curva padrão, usando para o efeito albumina do soro bovino

(BSA).

Page 35: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

31

Fig. 7.4 – Método do biureto. À direita água com reagente do

biureto; à esquerda alteração de cor produzida quando

se adiciona o reagente a uma proteína.

Este método pode ser usado para determinar concentrações de proteínas

em cereais, carnes e soja e como método qualitativo em rações para animais.

Este é um dos métodos mais simples para análise de proteínas, sendo

mais barato e mais rápido que o de Kjeldahl e tem poucos interferentes. As

principais desvantagens são uma menor sensibilidade que outros métodos e

necessidade de pelo menos 2-4 mg de proteína. Para utilizar como método

quantitativo é necessário comparar os valores obtidos com uma curva padrão.

O método de Lowry é um procedimento que combina a reacção do biureto

com a redução do reagente de Folin-Ciocalteau por resíduos de tirosina e

triptofano das proteínas. Forma-se uma cor azulada que pode ser medida a

750 nm (elevada sensibilidade para baixas concentrações de proteína) ou a

500 nm (baixa sensibilidade para elevadas concentrações de proteína).

As proteínas a determinar são inicialmente diluídas para garantir uma

gama de absorvâncias apropriada, de seguida é-lhes adicionada uma solução

de tartarato de sódio e potássio e carbonato de sódio. Após incubar 10 minutos

à temperatura ambiente, adiciona-se uma solução de sulfato de cobre-tartarato

de sódio e potássio-hidróxido de sódio, deixando-se de novo à temperatura

ambiente durante 10 minutos. Adiciona-se o reagente de Folin-Ciocalteau,

sendo a mistura incubada a 50 ºC durante 10 minutos. Lê-se a absorvância a

650 nm (modificação do método original) e comparam-se os valores obtidos

com os de uma curva padrão obtida com BSA.

É um método muito sensível e mais específico que a maioria dos outros e

é bastante rápido, no entanto apenas funciona com proteínas previamente

extraídas do alimento e pode ser afectado pela presença de interferentes como

sejam alguns açúcares, lípidos e tampões.

Page 36: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

32

O método de Bradford é outro método colorimétrico para determinação do

teor proteico, baseado na mudança de cor de um reagente (azul brilhante de

Coomassie) de vermelho para azul, quando se liga a proteínas. O seu máximo

de absorvância muda de 465 nm para 595 nm e a intensidade a este último

comprimento de onda é proporcional à concentração de proteína na amostra.

Este método, tal como outros semelhantes, tira partido da natureza

anfotérica das proteínas. Quando a solução que contém a proteína é acidificada

a um pH inferior ao valor do seu ponto isoeléctrico (pI) o pigmento forma uma

ligação electrostática.

Para efectuar a determinação de proteínas por este método, o pigmento é

dissolvido em 95% de etanol e acidificado com 85% de ácido fosfórico, sendo

de seguida adicionado a soluções contendo a proteína e um padrão (BSA). Lê-

-se a absorvância a 595 nm contra um branco do reagente e a concentração da

proteína é calculada a partir da curva padrão para a BSA.

O método de Bradford é muito usado em purificação de proteínas, devido

à sua rapidez, sensibilidade e existência de poucos interferentes. Alterações ao

procedimento original permitem a determinação de g de proteínas.

A capacidade que as proteínas possuem de reduzir iões Cu2+ a iões Cu+ é

utilizada no método do ácido bicinchoninico (BCA) para a sua determinação

quantitativa. O reagente BCA (sal de sódio do BCA, carbonato de sódio, NaOH e

sulfato de cobre) é adicionado à solução de proteína, deixa-se incubar a 37 ºC

durante 30 minutos (ou à temperatura ambiente durante 2 h ou ainda a 60 ºC

durante 30 minutos) e lê-se a absorvância a 562 nm contra um branco do

reagente. A quantificação é feita a partir de uma curva padrão obtida com BSA.

O método pode ser adaptado para medir g. A sua principal desvantagem

reside no facto de outros compostos com capacidade de reduzir o cobre

(açúcares redutores, …) poderem interferir.

As proteínas exibem uma forte absorvância a 280 nm, devido à presença

dos aminoácidos triptofano e tirosina. Como o teor destes aminoácidos nas

proteínas dos alimentos é razoavelmente constante, a absorvância a 280 nm

pode ser usada para calcular a concentração de proteínas, através da lei de

Beer. Como a composição das diversas proteínas é diferente, é necessário

conhecer o seu coeficiente de extinção molar, de modo a determinar a sua

concentração.

Para proceder à análise, as proteínas têm que ser dissolvidas num tampão

ou numa base, sendo aplicável com maior eficácia a proteínas previamente

extraídas dos alimentos. Pode sofrer interferências da presença de ácidos

Page 37: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

33

nucleicos, os quais também absorvem a 280 nm. É um método rápido e

relativamente sensível. Não destruindo a amostra, pode utilizar-se a proteína

para posteriores análises.

A maioria das técnicas utilizadas para separação de proteínas explora as

diferenças em tamanho, solubilidade e carga, as características de adsorção e a

afinidade biológica para outras moléculas.

A separação por precipitação explora as diferenças de solubilidade das

proteínas. Estas são determinadas pelo tipo e carga dos aminoácidos

componentes. As proteínas podem ser selectivamente precipitadas alterando o

pH, força iónica, constante dieléctrica, ou temperatura. Este é um processo

habitualmente utilizado nas fases iniciais de uma sequência de purificação e

apresentam maiores vantagens quando se trabalha com grandes quantidades

de material.

Sais neutros podem ser usados para aumentar a força iónica do meio e

precipitar proteínas. O mais usado é o sulfato de amónio, sendo alternativas

NaCl, KCl ou outros. Este processo é designado salting out e desenrola-se em

dois passos. Primeiro adiciona-se (NH4)2SO4 numa concentração ligeiramente

inferior à necessária para precipitar a proteína (quando a solução é

centrifugada, as proteínas menos solúveis são precipitadas, enquanto a

proteína de interesse permanece em solução) e depois adiciona-se (NH4)2SO4

até perfazer uma concentração imediatamente superior à necessária para

precipitar a proteína de interesse (quando a solução é centrifugada, a proteína

precipita e as outras mais solúveis permanecem no sobrenadante).

O ponto isoeléctrico (pI) de uma proteína corresponde ao pH ao qual uma

proteína em solução não possui carga. As proteínas formam agregados e

precipitam a esse valor devido à não existência de repulsão electrostática entre

elas. Como as proteínas possuem diferentes valores de pI, podem ser

separadas ajustando o pH da solução.

A solubilidade de uma proteína a um dado pH e força iónica depende da

constante dieléctrica da solução. Esta propriedade serve de base à separação

de proteínas por fraccionamento em misturas de água e solventes orgânicos. A

adição de solventes miscíveis com água (etanol, acetona) reduz a constante

dieléctrica da água e reduz a solubilidade da maioria das proteínas.

Muitas proteínas desnaturam e precipitam quando aquecidas ou

submetidas a valores de pH muito altos ou muito baixos. As proteínas que são

estáveis a temperaturas elevadas ou a valores extremos de pH podem ser

separadas das restantes.

Page 38: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

34

A cromatografia de adsorção é usada na separação de proteínas, tendo

por base a diferente afinidade das proteínas para a fasee estacionária ou para o

eluente. As cromatografias de afinidade e de permuta iónica usam esta

propriedade para separar proteínas.

A cromatografia de permuta iónica é a técnica de separação de proteínas

mais utilizada, sendo usadas sobretudo resinas aniónicas (com carga positiva).

A proteína de interesse é adsorvida à resina sob condições tampão (força iónica

e pH) que maximizem a afinidade da proteína para a resina. As restantes

proteínas, tendo cargas diferentes, não são adsorvidas. As proteínas que ficam

ligadas à resina são depois eluídas por alteração gradual do pH ou da força

iónica do eluente.

Na cromatografia de afinidade, a proteína é separada numa fase

estacionária contendo um ligando covalentemente ligado ao suporte sólido. Os

ligandos usados incluem inibidores enzimáticos, substratos enzimáticos,

coenzimas, anticorpos e alguns pigmentos. A proteína é eluída sob condições

tampão (pH, força iónica, temperatura e concentração proteica) que

maximizem a ligação da proteína ao ligando. As restantes proteínas e outras

moléculas que não se ligam ao ligando são eluídas. No final, a proteína ligada

será eluída da coluna alterando as condições de pH, temperatura ou

concentração do sal ou do ligando no tampão usado como eluente.

Fig. 7.5 – Separação de proteínas utilizando a cromatografia de

afinidade.

Esta técnica é muito eficaz na separação de proteínas, mas apresenta a

desvantagem da necessidade de utilização de fases estacionárias caras.

Page 39: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

35

Diversos métodos cromatográficos para separação de proteínas foram

adaptados para utilização em sistemas de HPLC.

As proteínas podem ser separadas com base no seu raio de Stokes, o raio

médio da proteína em solução, o qual depende da conformação da proteína.

Uma das técnicas que tem em conta essa propriedade para separar

proteínas é a diálise. São utilizadas membranas semi-permeáveis, as quais

apenas permitem a passagem de pequenas moléculas. Coloca-se uma solução

contendo a proteína num tubo de diálise, o qual é colocado num grande volume

de água ou de tampão, sob agitação suave. Os solutos de baixo peso molecular

saem para fora do tubo, enquanto o tampão entra. Este método é simples mas

demorado (12 h ou mais).

Fig. 7.6 – Separação de proteínas utilizando o processo de diálise.

Um processo alternativo e mais rápido passa pela utilização de

membranas de ultrafiltração, estando a sua utilização quase restrita a

laboratórios de investigação.

A cromatografia de exclusão molecular é outra técnica utilizada para

separação de proteínas, esta baseada no seu tamanho. Uma solução contendo

a proteína elui através de um suporte sólido poroso. As moléculas maiores que

os poros são excluídas, atravessando rapidamente a coluna. As moléculas de

menores dimensões são retidas nos poros, eluindo muito lentamente. Moléculas

de tamanhos intermédios interagem parcialmente com o suporte e eluem a

tempos intermédios. Deste modo, a ordem de eluição segue a diminuição do

tamanho da molécula.

Existem suportes com diversas dimensões de poro, podendo ser utilizados

para fraccionar eficazmente proteínas.

Page 40: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

36

Esta técnica também pode ser utilizada para calcular pesos moleculares de

proteínas, fazendo eluir em conjunto proteínas de peso desconhecido e padrões

de peso molecular conhecido. Um gráfico do volume de eluição para cada

proteína em função do logaritmo do seu PM dá uma recta.

A electroforese permite separar proteínas a partir de uma mistura

complexa, por migração diferencial destas através de uma matriz sólida, à qual

é aplicado um campo eléctrico. A técnica mais utilizada para separar proteínas é

a electroforese de zona e os géis de poliacrilamida, as matrizes mais utilizadas.

A separação depende da fricção da proteína na matriz e da sua carga, de

acordo com:

tensão aplicada x carga da moléculaMobilidade =

fricção da molécula (7.6)

Uma proteína apresenta carga negativa se o pH da solução for superior ao

seu pI e carga positiva se o pH for inferior ao seu pI. A dimensão da carga e a

tensão aplicada determinarão a extensão da migração da proteína num campo

eléctrico. Quanto mais alta a tensão aplicada e mais forte a carga da proteína,

maior a migração. A migração também depende do tamanho e forma da

molécula, ou seja do raio de Stokes da proteína. Um aumento do raio de Stokes

origina um aumento da fricção e uma redução da mobilidade. Deste modo, as

proteínas mais pequenas tendem a migrar mais rapidamente. Finalmente, uma

redução no tamanho do poro do gel provoca uma redução na mobilidade.

Fig. 7.7 – Separação de proteínas por electroforese em gel.

Na electroforese não desnaturante, as proteínas são separadas na sua

forma nativa com base na carga, tamanho e forma da molécula. Na

electroforese com desnaturação (ou SDS-PAGE), utiliza-se um gel de

poliacrilamida e um detergente aniónico (dodecil sulfato de sódio - SDS) para

separar proteínas com base no seu tamanho. As proteínas, depois de reagir

com um agente redutor (adicionado en conjunto com o detergente), ligam-se

Page 41: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

37

ao SDS e adquirem carga negativa, sendo depois separadas em função do seu

tamanho. Adiciona-se habitualmente um corante (azul de bromofenol) à

solução contendo a proteína. Sendo uma molécula pequena, o corante migra à

frente das proteínas e permite seguir o andamento da migração. Após concluída

esta, o gel é corado de maneira a permitir a visualização das bandas das

proteínas. A mobilidade relativa de cada proteína é calculada por comparação

com a do corante.

m

distância percorrida pela proteína=

distância percorrida pelo coranteR (7.7)

O peso molecular pode ser determinado por esta via, relacionando o Rm

de uma proteína com os Rm de proteínas padrão, de PM conhecido. Traça-se

um gráfico dos logaritmos dos PM dos padrões em função dos seus Rm e usa-se

esse gráfico para extrapolar os PM das proteínas desconhecidas.

A focagem isoeléctrica é uma modificação da electroforese em que as

proteínas são separadas, de acordo com a sua carga, num campo eléctrico

aplicado a um gel, no qual se produziu um gradiente de pH. As proteínas

migram para o local em que o pH do gel iguala o seu pI. Esta é uma das

técnicas de separação de proteínas com melhor resolução.

Fig. 7.8 – Princípio de separação de proteínas por focagem

isoeléctrica.

A focagem isoeléctrica e o SDS-PAGE podem ser combinados na

electroforese em duas dimensões, muito útil para separar misturas muito

complexas de proteínas. As proteínas são primeiro separadas por focagem

Page 42: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

38

isoeléctrica, com base na sua carga, sendo depois separadas por SDS-PAGE,

segundo os seus tamanho e forma.

Fig. 7.9 – Electroforese em duas dimensões de proteínas.

A electroforese capilar partilha dos mesmos princípios que a electroforese

convencional, quando aplicada à separação de proteínas. A principal diferença é

a utilização de um tubo capilar no lugar de um gel. O principal factor de

separação é o fluxo electroosmótico gerado no interior do tubo.

O sistema (Fig. 7.10) é composto por um tubo capilar, dois reservatórios

com tampões, uma fonte eléctrica e um detector. As proteínas, depois de

separadas são analisadas por detectores de absorção electrónica (os mais

comuns), fluorescência ou condutividade eléctrica, semelhantes aos utilizados

em HPLC.

Fig. 7.10 – Esquema de um equipamento de electroforese capilar.

Page 43: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

39

Existem três variantes de electroforese capilar, aplicadas à separação de

proteínas: electroforese capilar de zona, electroforese capilar com SDS e

focagem isoeléctrica capilar.

A electroforese capilar de zona é semelhante à electroforese em gel

clássica, exceptuando que as proteínas são separadas no interior de tubos

capilares cheios com um tampão do pH desejado. a parede interna do capilar

possui carga negativa e atrai catiões do tampão para formar uma dupla camada

iónica na interface entre o capilar e o tampão. Quando se aplica um campo

eléctrico, esses catiões são atraídos para o cátodo e “puxam” as outras

moléculas na mesma direcção. Isto permite que catiões, aniões e moléculas

neutras sejam separadas numa única “corrida”. O fluxo elctroosmótico pode ser

controlado por alteração do pH ou da força iónica do tampão.

Na electroforese capilar com SDS as proteínas são desnaturadas e

dissociadas na presença de SDS e de um agente redutor, sendo depois

separadas no capilar.

A focagem isoeléctrica capilar usa um gradiente de pH no interior do

capilar para separar as proteínas.

A análise de aminoácidos é usada para determinar quantitativamente a

composição em aminoácidos de uma proteína. A proteína é primeiro hidrolisada

para libertar os aminoácidos, os quais são depois separados por métodos

cromatográficos e quantificados. As técnicas cromatográficas usadas são a

permuta iónica, RP-HPLC e GC.

A hidrólise é habitualmente feita na presença de HCl 6N durante 24 h,

mas como os aminoácidos não têm um comportamento homogéneo nestas

condições, é necessário proceder a alguns procedimentos especiais para

prevenir a ocorrência de erros na determinação.

O triptofano é completamente destruído durante a hidrólise, sendo

necessário proceder a uma hidrólise alcalina seguida de cromatografia para o

quantificar.

Os aminoácidos metionina, cisteína, treonina e serina são

progressivamente destruídos durante a hidrólise, portanto a duração desta

influenciará os resultados obtidos. As percas de treonina e serina podem ser

calculadas por hidrólise das amostras durante três períodos diferentes (24, 48 e

72 h, por exemplo). Pode ser feita uma compensação para a destruição de

aminoácidos por extrapolação para o tempo zero, considerando que a

degradação segue uma cinética de 1ª ordem. A cisteína e a cistina podem ser

Page 44: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

40

convertidas em ácido cístico, mais estável, o qual é depois hidrolisado e

cromatografado.

Asparagina e glutamina são convertidos quantitativamente em ácido

aspártico e ácido glutâmico, respectivamente, não podendo ser quantificados.

Isovalina e leucina são hidrolisados mais lentamente, sendo por isso os

seus valores calculados a partir de um hidrolisado com 72 h e, finalmente, a

tirosina pode sofrer oxidação.

A separação por cromatografia de permuta iónica utiliza um gradiente de

pH e força iónica e pós-derivatização com nihidrina, para produzir formas

coradas, as quais podem ser medidas espectrofotometricamente. Em RP-HPLC,

a derivatização é feita antes da entrada na coluna, com feniltiocarbamil (ou

outros compostos) e a quantificação é feita por um detector de absorção

electrónica.

A quantificação de cada aminoácido é feita com a ajuda de um padrão

interno. Este padrão interno é, habitualmente, um aminoácido não encontrado

nos alimentos, como a norleucina.

Page 45: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

41

Capítulo 8

Lípidos

Os lípidos podem ser descritos como substâncias solúveis em solventes

orgânicos e incluem gorduras, óleos, ceras, colesterol, esteróis e as quatro

vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K). Os termos gorduras e óleos são usados

para descrever triacilgliceróis, respectivamente no estado sólido e no estado

líquido. Devido ao seu elevado grau de saturação, os triacilgliceróis de origem

animal tendem a ser sólidos, equanto que os provenientes de peixes e plantas

tendem a ser óleos.

Fig. 8.1 – Exemplos de diversos lípidos.

Os triacilgliceróis são formados por uma molécula de glicerol esterificada

com três ácidos gordos. Estes três ácidos gordos podem ser todos diferentes,

todos iguais ou dois iguais e um diferente. O comprimento das cadeias dos

ácidos gordos existentes nos triacilgliceróis naturais é variável, embora as

estruturas com 16, 18 e 20 carbonos sejam as mais frequentes. Nos animais e

nas plantas, os ácidos gordos possuem número par de átomos de carbono, mas

alguns microrganismos são capazes de sintetizar ácidos gordos com número

ímpar. Esta é a razão pela qual nos ruminantes se encontram ácidos gordos

com número ímpar de átomos de carbono, pois as bactérias existentes no

rúmen são capazes de os produzir.

Page 46: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

42

Fig. 8.2 – Estruturas de ácidos gordos saturados (lineares) e

insaturados.

Os ácidos gordos são ácidos carboxílicos com cadeias alifáticas mais ou

menos longas, as quais podem ser saturadas ou insaturadas. Nos ácidos gordos

insaturados, as ligações duplas (insaturações) podem ocorrer em configuração

cis ou trans. Nos ácidos gordos cis, as cadeias exibem uma curvatura,

restringindo a liberdade conformacional da molécula. Quanto maior o número

de ligações cis, menor a flexibilidade. Já nos ácidos gordos trans, não se

verifica esse efeito conformacional e as moléculas adoptam configurações

semelhantes às dos ácidos gordos saturados.

Fig. 8.3 – Ácido oleico nas configurações cis e trans.

Na natureza, a maioria dos ácidos gordos ocorre na configuração cis. Nos

alimentos, uma fracção pode ocorrer em configuração trans devido ao

processamento dos alimentos, como por exemplo na operação de hidrogenação

que está na origem da produção de gorduras sólidas a partir de óleos

alimentares.

Page 47: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

43

Existem diversos sistemas de nomenclatura para os ácidos gordos

insaturados:

nome comum – nomes habitualmente utilizados, não obedecendo a

qualquer sistematização. Ex: ácido oleico

nome IUPAC – a contagem começa na ponta ácido carboxílico e as

ligações duplas são designadas cis/trans ou E/Z. Nomenclatura

sistemática. Ex: ácido (9Z)-octadec-9-enoico

nomemclatura x – cada ligação dupla é indicada por x, o que

indica que a ligação dupla se encontra na xª ligação carbono-

carbono, contando a partir da ponta do ácido carboxílico. Cada

ligação dupla é precedida pela designação cis ou trans. Ex: ácido

cis-9-octadecenoico

nomenclatura n-x (-x) – indica que a ligação dupla está situada na

xª ligação carbono-carbono, contando a partir da cauda alifática. A

notação é muito comum na literatura, mas a IUPAC dá

preferência à notação n. Ex: -9, n-9

números de lípidos – na nomenclatura C:D, C designa o :número de

átomos de carbono e D o número de ligações duplas. Ex: 18:1

O corpo humano é capaz de sintetizar todos menos dois dos ácidos gordos

de que necessita. Estes dois, o ácido linoleico e o ácido -linolénico,

considerados ácidos gordos essenciais, encontram-se amplamente distribuídos

em óleos vegetais.

Os fosfolípidos são semelhantes aos triacilgliceróis, com a excepção de

que um dos grupos hidroxilo do glicerol está ligado a um grupo fosfato, o qual

por sua vez se encontra ligado a um outro grupo orgânico (Fig. 8.1).

Os ácidos gordos insaturados podem sofrer ataques por parte de agentes

oxidantes levando à formação de flavours desagradáveis. Frequentemente, a

oxidação ocorre através de reacções radicalares, nas quais se formam

compostos intermédios, denominados hidroperóxidos, os quais se degradam a

aldeídos e cetonas voláteis, que são os responsáveis pelo forte flavour final.

O teor lipídico total de um alimento é habitualmente determinado a partir

de métodos de extracção com solventes orgânicos. A polaridade dos solventes

influencia a solubilidade dos lípidos e a quantificação dos mesmos. Para além

destes métodos, outros baseados nas propriedades químicas e físicas, são

utilizados para a determinação do teor em gordura dos alimentos.

A preparação da amostra para análise de lípidos depende do alimento e

dos lípidos presentes. Por tal razão, não existe um método único para a

extracção de todos os tipos de lípidos em todos os alimentos. Um factor em

Page 48: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

44

comum é a necessidade de preparar a amostra sob uma atmosfera inerte de

azoto e a baixa temperatura, para minimizar reacções químicas, tais como a

oxidação. Outros passos comuns, que contribuem para a eficácia do método

analítico, são a remoção da água, a redução do tamanho de partícula e a

separação dos lípidos ligados a proteínas e/ou hidratos de carbono.

Uma parte significativa dos lípidos em certos alimentos (lacticínios, pão,

farinha e produtos cárneos) está ligada a proteínas e hidratos de carbono,

impedindo a sua eficaz extracção com solventes não polares. Antes da

extracção, tais alimentos devem ser sujeitos a uma hidrólise ácida, de modo a

quebrar ligações covalentes e iónicas. A amostra pode ser pré-digerida com HCl

3 N, a refluxo durante 1 h e pode adicionar-se etanol e hexametafosfato para

facilitar a separação dos lípidos dos restantes componentes, antes da extracção

daqueles por solvente.

Os requisitos de um solvente para extracção de gorduras são uma elevada

capacidade de dissolver lípidos e baixa ou nula para proteínas, aminoácidos e

hidratos de carbono. O solvente a usar deve evaporar rapidamente e não deixar

resíduos, possuir um ponto de ebulição relativamente baixo e não ser

inflamável nem tóxico, tanto no estado líquido como no gasoso. Deve ainda ser

não higroscópico e barato. Sendo difícil encontrar um solvente ideal, que

preencha todos estes requisitos, opta-se pelo uso habitual de éter etílico e éter

de petróleo, existindo ainda as alternativas de hexano e pentano.

O éter etílico é um melhor solvente para gorduras que o éter de petróleo,

mas é relativamente caro, apresenta maior risco de explosão e de incêndio, é

higroscópico e forma peróxidos. O éter de petróleo é uma mistura de

compostos (principalmente pentano e hexano) e é mais hidrofóbico que o éter

etílico. É selectivo para lípidos mais hidrofóbicos, é mais barato, menos

higroscópico e menos inflamável que o éter etílico.

Utiliza-se frequentemente uma combinação de dois ou três solventes, para

optimizar a extracção. É necessário utilizar uma razão solvente/soluto adequada

para maximizar a extracção de lípidos dos alimentos.

O método de Goldfish é um processo de extracção contínua por solvente,

em que um solvente quente flui continuamente sobre a amostra contida num

recipiente de cerâmica. O teor de gordura é obtido a partir da perca de peso da

amostra ou por pesagem da gordura removida. Um método contínuo é mais

rápido e eficaz que um semi-contínuo, mas pode resultar numa extracção

incompleta.

O cálculo da gordura é obtido a partir da equação 8.1

Page 49: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

45

Peso de gordura = (proveta + gordura) - proveta (8.1)

e a percentagem de gordura com base no peso seco por

gordura na amostra/g% Gordura = x 100

amostra seca/g (8.2)

Fig. 8.4 – Um extractor de Goldfish.

O método de Soxhlet é um exemplo de processo de extracção semi-

-contínua, em que o solvente se acumula no recipiente de extracção durante 5-

-10 minutos, envolvendo completamente a amostra, e depois é recirculado para

o balão de aquecimento. O teor de gordura é medido a partir do peso da

amostra inicial subtraindo a gordura perdida ou por pesagem da gordura

removida.

Fig. 8.5 – Um extractor de Soxhlet.

Page 50: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

46

Este é um método mais lento que o de Goldfish, mas permite uma

extracção mais completa da gordura. No caso de amostras com mais de 10%

de água, estas terão que ser previamente secas até atingirem um peso

constante (~5 h). O cálculo do teor de gordura é também efectuado a partir da

equação 8.2.

O método de Mojonnier para extracção de gordura por solventes é um

processo descontínuo em que a extracção é realizada com uma mistura de éter

etílico e éter de petróleo num balão chamado de Mojonnier. A gordura extraída

é seca até peso constante e exprime-se em percentagem por peso.

Fig. 8.6 – Extracção em balão de Mojonnier.

Este método tem a vantagem de não exigir remoção prévia de humidade

da amostra e aplica-se quer a alimentos líquidos quer a sólidos, mas requer a

preparação diária de um branco de água destilada em duplicado, para efectuar

os cálculos. O teor de gordura é dado por

peso prato + gordura - peso prato - peso médio do resíduo do branco% Gordura = 100 x

peso amostra

(8.3)

Existem dois métodos que utilizam interacções entre o solvente e a

amostra a pressões e temperaturas elevadas, a extracção por fluidos

supercríticos (SFE) e a extracção acelerada por solvente (ASE). Estes métodos

apresentam a característica de reduzir o consumo de solventes orgânicos, com

o consequente benefício ambiental. No caso de SFE, é completamente

eliminado o uso de solventes orgânicos perigosos, sendo substituídos por um

solvente inerte e não tóxico, como o CO2. Quando submetido a condições de

temperatura e pressão elevadas e ultrapassa o seu ponto crítico, passa a exibir

propriedades de fluido supercrítico. Neste estado, a sua densidade facilita a

extracção de gorduras, e as suas propriedades semelhantes às de um gás

facilitam a sua remoção do extracto, no finnal da extracção. A sua densidade

Page 51: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

47

pode ser alterada por variação da pressão e/ou temperatura, aumentando a

selectividadde para componentes específicos.

Fig. 8.7 – Diagrama de fases de uma substância, ilustrando o

estado supercrítico.

Na extracção por fluidos supercríticos, a gordura extraída é precipitada,

após separação do solvente, seca e quantificada como percentagem de gordura

por peso da amostra. O teor em gordura é obtido através de

peso gordura + recipiente - peso recipiente% Gordura = x 100

peso amostra seca (8.4)

Um extractor supercrítico pode ser acoplado a um cromatógrafo gasoso,

permitindo uma rápida e eficaz separação e quantificação dos componentes da

gordura extraída.

Fig. 8.8 – Diagrama de um extractor supercrítico.

Page 52: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

48

O método ASE não elimina completamente a necessidade de solventes

orgânicos, mas reduz significativamente o seu consumo. A extracção de

gordura ocorre a temperaturas muito superiores à do ponto de ebulição do

solvente usado, aumentando a solubilidade e a difusão dos lípidos da amostra

para o solvente, encurtando o tempo de extracção e a quantidade de solvente.

Fig. 8.9 – Funcionamento de um extractor ASE.

A extracção pode funcionar em modos estático ou dinâmico, usando um

solvente não polar. No modo estático, a extracção dá-se sem fluxo de solvente

para o exterior, enquanto que em modo dinâmico, solvente fresco flui

continuamente através da amostra. O solvente é separado, por evaporação, da

gordura e esta é seca e pesada para quantificação. Esta é feita a partir da eq.

8.4. Os resultados são comparáveis aos obtidos por extracção em Soxhlet, com

menor dispêndio de tempo e solvente.

A extracção em modo dinâmico é mais rápida, mas usa mais solvente; o

modo estático usa menos solvente mas é mais lento. A combinação dos dois

métodos produz melhores resultados globais e é frequentemente utilizada.

A extracção de lípidos pode também ser feita por métodos que não

utilizam solventes, quer químicos quer instrumentais.

No método de Babcock, adiciona-se H2SO4 à amostra, num recipiente

apropriado (garrafa de Babcock). O ácido digere as proteínas, produz calor e

liberta a gordura. A gordura é isolada por centrifugação e adição de água

quente e é medida volumetricamente na parte graduada da garrafa de

Babcock, mas o resultado é expresso como percentagem de gordura por peso

da amostra.

O método não é capaz de determinar fosfolípidos nem é aplicável a

alimentos contendo açúcar ou chocolate.

Page 53: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

49

Fig. 8.10 – Exemplos de garrafas de Babcock.

O método de Gerber é semelhante ao de Babcock, mas utiliza ácido

sulfúrico e álcool amílico. O ácido digere as proteínas e hidratos de carbono,

liberta a gordura e liquefá-la devido ao calor gerado. Este método é mais

simples e rápido que o de Babcock. O álcool amílico impede a queima dos

hidratos de carbono, permitindo um uso mais amplo.

Um outro método químico é o método do detergente, em que este reage

com as proteínas formando um complexo, levando à quebra de emulsões e à

libertação da gordura. A amostra é pipetada para uma garrafa de Babcock e

adiciona-se um detergente aniónico, o qual dispersa a camada proteica que

estabiliza a gordura, para a libertar. De seguida adiciona-se um detergente não

iónico para separar a gordura dos restantes componentes. A gordura é medida

volumetricamente e expressa como percentagem.

O índice de refracção é característico para cada tipo de gordura, variando

os valores com o grau e tipo de insaturação e teor de gordura. A gordura é

extraída com um solvente (bromonaftaleno), e o índice de refracção do

solvente é comparado com os índices de refracção da solução com a gordura

extraída e da gordura, segundo a equação 8.5, em que V é o volume de

bromonaftaleno, d a densidade da gordura, n o índice de refracção da gordura,

n1 o índice de refracção do bromonaftaleno, n2 o índice de refracção da solução

extraída e W o peso da amostra.

1 2

2

( )% Gordura = 100 x

( )

Vd n n

W n n

(8.5)

Comparativamente com os métodos anteriores, os métodos instrumentais

são, em geral, rápidos, não destrutivos, exigem pouca preparação da amostra e

Page 54: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

50

consomem poucos reagentes. No entanto, alguns equipamentos são caros e é

frequente a necessidade de curvas de calibração.

A ressonância magnética nuclear (NMR) pode ser usada para medir lípidos

de forma não destrutiva. É um método rápido e exacto, que permite um

elevado grau de automação. Na quantificação e caracterização de lípidos em

alimentos usa-se o NMR de baixa resolução, em que se obtém informação

sobre a intensidade do sinal e tempo de relaxação da amostra sujeita ao campo

magnético aplicado. Estes dados podem ser usados para determinar a

quantidade de lípidos, o teor de lípidos sólidos e líquidos teores de água e óleo

presentes.

O NMR é aplicado no modo pulsado, em que o campo magnético é

aplicado durante períodos muito curtos. Nesta modalidade, os sinais dos

núcleos 1H dos diversos componentes dos alimentos podem ser distinguidos

através das suas relaxações nucleares. Os núcleos em fases sólidas relaxam

muito rapidamente, enquanto que os protões em fases líquidas relaxam muito

devagar. A intensidade dos sinais é proporcional ao número de núcleos de

hidrogénio, ou seja ao teor de hidrogénio. Esta intensidade pode ser convertida

em teor de óleo, usando métodos de calibração. Esta técnica permite medir

teores de água e de óleo, teor de gorduras sólidas e razão sólido/líquido.

A utilização de espectrometria de NMR exige que as amostras estejam a

temperatura constante, já que é uma técnica cujo sinal varia com a

temperatura.

A absorção de raios X é um método rápido, que tem sido usado para

análise de lípidos em carnes. Baseia-se no facto de que a absorção de raios X é

maior em carne magra do que em carne gorda. A quantificação é feita por

comparação com curva padrão obtida a partir de uma extracção com solvente.

A medição da constante dieléctrica pode ser usada para determinar o teor

lípidico de um alimento, tendo por base o princípio de que a constante dielétrica

varia com o teor de óleo. Os valores medidos são comparados com os obtidos a

partir de uma curva de calibração, preparada a partir de uma extracção com

solventes.

As gorduras originam uma absorção a 5.73 m, cuja intensidade é

proporcional à concentração de gorduras na amostra. A espectroscopia de

infra-vermelho é usada para determinar o teor de gorduras em alimentos,

tendo por base essa propriedade, podendo o método ser utilizado durante o

processamento dos alimentos, já que se trata de uma técnica não destrutiva.

Page 55: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

51

As medidas de ultra-sons também são não destrutivas e podem ser

usadas para determinar a composição de diversos alimentos, baseadas no facto

de que os vários componentes possuem diferentes propriedades acústicas. As

medidas são efectuadas a partir de modelos empíricos ou teóricos.

O teor de óleo nas oleaginosas pode ser determinado a partir da medida

da densidade das sementes e estabelecendo uma correlação entre esse valor e

o medido para o teor de gordura através de um método de extracção por

solventes.

Por motivos de rotulagem, nutricionais ou outros é frequente haver

necessidade de medir não apenas o teor em gordura total de um alimento mas

também de caracterizar a sua composição lipídica. Parâmetros como o teor de

colesterol, de ácidos gordos saturados e insaturados e mesmo o tipo de ácidos

gordos presente são importantes para determinar a conservabilidade de um

produto e influem no seu processamento.

As amostras utilizadas para caracterização de óleos e gorduras devem ser

preparadas sob condições que evitem a sua oxidação (exposição a calor, luz ou

ar) e a presença de água e devem apresentar-se límpidas, sem sedimentos.

A refractometria é uma das técnicas utilizadas para caracterizar gorduras,

trabalhando a 20 ºC com óleos e às temperaturas a que as restantes gorduras

se apresentam fluidas. O índice de refracção, para além de permitir uma análise

qualitativa, devido a possuir um valor específico para cada substância, é

proporcional à saturação do ácido gordo, podendo ser usado para medir o grau

de saturação. Este método apresenta as desvantagens de ser influenciado pela

presença de ácidos gordos livres, pela oxidação dos ácidos gordos e ser

dependente da temperatura.

Existem diversos métodos que permitem medir o ponto de fusão de uma

gordura, com o objectivo de determinar a sua composição, sendo todos eles

algo subjectivos quanto ao valor medido e, portanto, relativamente pouco

rigorosos.

O índice de iodo é uma medida do grau de insaturação. Define-se como a

quantidade (em peso) de iodo absorvida por 100 g de amostra. Quanto maior a

insaturação, mais iodo é absorvido, ou seja quanto maior o índice de iodo,

maior o grau de insaturação.

Uma amostra de óleo ou gordura é dissolvida num solvente apropriado e

é-lhe adicionada uma quantidade conhecida de iodo (ou outro halogéneo). Dá-

se uma adição às ligações duplas (8.6). Adiciona-se uma solução de iodeto de

potássio para reduzir o excesso de ICl e produzir iodo livre (8.7). Este iodo livre

Page 56: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

52

é depois titulado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio, usando

amido como indicador, o qual muda de azul para incolor (8.8).

ICl(excesso) + R-CH=CH-R ɹ R-CHI-CHCl-R + ICl (8.6)

ICl + 2KI ɹ KCl + KI + I2 (8.7)

I2 + amido + 2Na2S2O3 ɹ 2NaI + amido + Na2S4O6 (8.8)

O índice de iodo é calculado a partir da equação 8.9, em que B é o

volume de titulante usado para titular um branco, S o volume de titulante para

a amostra, N a concentração de Na2S2O3 (mol/1000 mL), W o peso da amostra

e 126.9 a massa de iodo (g/mol).

x x126.9Índice de iodo x100

B S N

W

(8.9)

O índice de saponificação mede a quantidade de base necessária para

saponificar uma determinada quantidade de óleo ou gordura. A gordura é

tratada com uma base degradando-a em glicerol e ácidos gordos. O índice de

saponificação é expresso como a quantidade de KOH necessária para

saponificar 1 g de amostra. Este índice é uma medida do peso molecular médio

dos triacilgliceróis presentes na amostra. Se este valor médio for dividido por 3,

dá um peso molecular médio aproximado para os ácidos gordos presentes. Na

prática, quanto menor o índice de saponificação, maior a cadeia dos ácidos

gordos.

Uma solução alcoólica com KOH em excesso é adicionada à amostra,

aquecendo-se para saponificar a gordura. O KOH que não reage é titulado com

HCl, usando fenolftaleína como indicador e o índice é calculado através da

equação 8.10, onde B é o volume de titulante para o branco, S o volume de

titulante para a amostra, N a concentração de HCl (mmol/mL), W o peso da

amostra e 56.1 a massa de KOH (mg/mmol).

x x56.1Índice de saponificação x100

B S N

W

(8.10)

As medidas de acidez das gorduras geralmente reflectem a quantidade de

ácidos gordos hidrolisados dos triacilgliceróis. A percentagem em peso de um

dado ácido gordo designa-se ácido gordo livre (FFA – free fatty acid) e o índice

de acidez define-se como a quantidade de KOH necessária para neutralizar os

ácidos livres presentes em 1 g de óleo ou gordura. A percentagem de FFA é

frequentemente referida a ácido oleico e calcula-se a partir de uma amostra de

Page 57: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

53

gordura fluida à qual são adicionados etanol a 95% e o indicador fenolftaleína.

Após titulação com NaOH, o valor é calculado usando

(como oleico) x x 282

% FFA = x 100V N

W (8.11)

em que V é o volume de NaOH usado para titular, N a concentração de NaOH,

W o peso da amostra e 282 o peso molecular do ácido oleico.

Numa gordura bruta, este valor é uma estimativa da quantidade de óleo

que será perdida durante a refinação. Numa gordura refinada, um índice de

acidez elevado indica uma incorrecta refinação ou degradação da gordura após

armazenamento ou utilização. No caso de os ácidos libertados serem voláteis, o

valor de FFA pode ser uma medida da rancidez hidrolítica.

A percentagem de gorduras sólidas numa amostra pode ser determinada

por NMR. A proporção de gorduras sólidas em alimentos (margarinas, cremes

para barrar, ...) tem importância no que se relaciona com as suas propriedades

funcionais, tais como a textura.

As gorduras podem sofrer processos de degradação, originando a

produção de sabores e aromas indesejados, globalmente designados por ranço.

A rancidez das gorduras pode provir da lipólise (rancidez hidrolítica) ou da

oxidação lipídica (rancidez oxidativa).

A lipólise designa a hidrólise dos triacilgliceróis. Quando os ácidos gordos

que os compõem possuem cadeias curtas, a lipólise resulta na formação de

compostos voláteis, frequentemente caracterizados por aromas desagradáveis.

A oxidação lipídica (ou autoxidação) ocorre através de um mecanismo com

radicais livres, o qual origina a produção de hidroperóxidos, que por sua vez

sofrem degradação com produção de diversos produtos, incluindo aldeídos,

cetonas, ácidos orgânicos e hidrocarbonetos.

Existem diversos métodos que permitem a quantificação da oxidação

lipídica em alimentos, a maioria dos quais requer a extracção de lípidos antes

de efectuar a análise.

O índice de peróxidos é um método titrimétrico, que parte do pressuposto

que todos os compostos reactivos são peróxidos ou produtos análogos

resultantes da oxidação lipídica. A amostra é dissolvida numa mistura de ácido

acético e isooctano, à qual é adicionado um excesso de KI. O iodeto reage com

os peróxidos, libertando iodo. Esta solução é titulada com tiossulfato de sódio,

usando amido como indicador.

Page 58: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

54

ROOH + KI ɹ ROH + KOH + I2 (8.12)

I2 + amido(azul) + 2Na2S2O3 ɹ 2NaI + amido(incolor) + Na2S4O6 (8.13)

O índice de peróxidos é então calculado a partir da equação 8.14, em que

S é o volume de titulante usado para a amostra, B o volume de titulante para o

branco, N a concentração de tiossulfato de sódio, W o peso da amostra e 1000

o factor de conversão de g para kg.

( ) x Índice de peróxidos = x 1000

S B N

W

(8.14)

Como este índice mede um produto transiente de oxidação (os peróxidos

formados sofrem, também eles, degradação para formar outros produtos)

quando se obtém um valor baixo, tal pode significar quer um início quer um

estado adiantado de oxidação. Para distinguir entre os dois, deve medir-se o

índice de peróxido em função do tempo, durante um certo período.

Um valor de 0 indica uma gordura de elevada qualidade e um valor

superior a 20 corresponde a uma gordura de má qualidade.

Uma desvantagem na aplicação deste método a alimentos é a necessidade

de uma amostra de 5 g de gordura ou óleo.

O índice de p-anisidina calcula a quantidade de aldeídos e insaturados,

formados como produtos secundários de oxidação de óleos e gorduras. Estes

aldeídos reagem com a p-anisidina formando um composto corado, podendo

ser medido espectrofotometricamente. O índice é obtido multiplicando por 100

o valor da absorvância a 350 nm, de uma solução contendo 1 g de óleo diluído

para 100 mL de isooctano e p-anisidina.

O índice totox indica a oxidação total de uma amostra através dos índices

de peróxidos e de p-anisidina:

Índice totox = índice de p-anisidina + 2 x índice de peróxidos (8.15)

Este índice totox aumenta continuamente ao longo da oxidação.

Os compostos orgânicos voláteis (VOCs) presentes nas gorduras e óleos

estão associados ao seu flavour, qualidade e susceptibilidade à oxidação.

Incluem-se neste grupo os produtos secundários da oxidação lipídica,

responsáveis pelos sabores e aromas desagradáveis das gorduras e óleos

oxidados. Entre os compostos habitualmente medidos incluem-se pentano,

pentanal, hexanal e 2,4-decadienal. A medição, por GC, do hexanal no espaço

de cabeça é uma indicação da extensão da oxidação. Os detectores

habitualmente utilizados são o de ionização de chama (FID) ou de massa (MS)

Page 59: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

55

e a quantidade de hexanal formada é calculada a partir da área do respectivo

pico.

Este método apresenta a vantagem de não exigir prévia extracção de

lípidos.

O ensaio do ácido tiobarbitúrico (TBA) mede um outro produto secundário

da oxidação dos lípidos, o malonaldeído. Baseia-se na reacção de malonaldeído

com o TBA para produzir um composto colorido, o qual é medido

espectrofotometricamente. Como a reacção não é específica para o

malonaldeído, os resultados são por vezes apresentados como medida de

substâncias reactivas com TBA (TBARS). O ensaio pode ser feito directamente

com o alimento, mas este sofre habitualmente uma destilação prévia, para

eliminar interferentes e só depois se faz reagir o destilado com o TBA.

A absorvância da solução é medida a 530 nm e os valores são

convertidos, usando uma curva padrão, a mg de malonaldeído por kg de

amostra. Alternativamente, o teor de malonaldeído pode ser medido através de

uma análise do destilado por HPLC.

O malonaldeído também é um produto transiente da oxidação, mas o

ensaio do TBA apresenta melhores correlações com a avaliação sensorial da

rancidez que o índice de peróxido.

As ligações duplas dos lípidos passam de não conjugadas a conjugadas

quando sofrem oxidação. Os compostos com ligações duplas conjugadas

apresentam absorções características, podendo essa propriedade ser utilizada

para identificar a existência de oxidação numa amostra.

As amostras líquidas são pesadas e diluídas para um volume que permita

obter um valor de absorvância entre 0.1 e 0.8. A absorvância é então medida a

232 nm (dienos conjugados) e 270 nm (trienos conjugados) contra um branco

do solvente.

O método dos dienos e trienos conjugados permite seguir as primeiras

fases de uma oxidação, não existindo uma boa correlação em etapas mais

adiantadas.

A estabilidade de um alimento relativamente à oxidação pode ser

determinada através de ensaios acelerados, os quais provocam artificialmente a

rápida oxidação por exposição das amostras ao calor, oxigénio, catalisadores

metálicos, luz ou enzimas. Estes ensaios partem da condição de que as

reacções que ocorrem nestas condições artificiais são as mesmas que ocorrem

em condições normais.

Page 60: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

56

Um destes ensaios usa um forno a cerca de 60 ºC, no qual é colocado o

óleo ou a gordura. O ensaio permite simular condições de armazenamento, mas

num período muito mais curto. Actualmente designa-se por ensaio em forno de

armazenamento e é uma actualização do ensaio em forno de Schaal.

Um outro método mede o tempo necessário para que o oxigénio comece a

desaparecer de um sistema fechado. Designado por bomba de oxigénio, este

método usa um contentor hermeticamente fechado, ligado a um medidor de

pressão. A amostra é colocada no seu interior e adiciona-se O2 até alcançar

uma pressão de ~690 kPa (100 psi). De seguida, coloca-se o contentor num

banho de água a ferver. Mede-se o tempo que demora a atingir uma queda

brusca de pressão, correspondente à rápida absorção de O2 pela amostra.

A fracção lipídica, presente num alimento, pode ser caracterizada pela sua

composição em ácidos gordos, mono, di e triacilgliceróis, fosfolípidos, esteróis,

pigmentos e vitaminas lipossolúveis. A cromatografia gasosa é ideal para a

análise de lípidos, podendo ser utilizada para determinar a composição em

ácidos gordos totais, distribuição e posição dos ácidos gordos, estabilidade e

oxidação, detecção de adulterações e antioxidantes. Quando combinada com a

espectrometria de massa, a cromatografia gasosa permite a identificação dos

compostos separados. A cromatografia líquida (HPLC) também tem aplicações

na análise de lípidos e a cromatografia em camada fina (TLC) usa-se em

ensaios de rotina devido à sua simplicidade e baixo custo.

O perfil em ácidos gordos de um alimento é determinado após extracção

dos lípidos e análise do extracto em GC capilar. Para aumentar a volatilidade, os

triacilgliceróis e os fosfolípidos são saponificados e os ácidos gordos livres

resultantes são esterificados, formando ésteres metílicos (FAMEs).

Fig. 8.11 – Reacção de formação de ésteres metílicos de um ácido

gordo, em meio básico.

A maioria das gorduras e óleos naturais extraídos das plantas contém

apenas ligações duplas cis (não conjugadas), mas os extraídos de fontes

animais podem conter pequenas quantidades de ligações duplas trans. Estas

ligações trans também podem resultar de processos como a oxidação,

Page 61: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

57

extracção, aquecimento e hidrogenação. A determinação de isómeros trans

pode ser efectuda por GC, mas também por espectrometria de infra-vermelho.

A concentração de ácidos gordos trans pode ser medida a partir da

absorção a 966 cm-1. Para obter um espectro de IV, a amostra terá que estar

no estado líquido e os ácidos gordos terão que ser convertidos nos respectivos

ésteres metílicos. Usa-se elaidato de metilo como padrão externo, para calcular

o teor em compostos trans.

Os métodos cromatográficos, HPLC e GC, são as técnicas mais recentes

utilizadas para determinar mono, di e triacilgliceróis.

Para quantificar colesterol num alimento, é necessário saponificar os

lípidos extraídos da amostra. O colesterol, que fica na fracção não saponificada,

é extraído e derivatizado para formar éteres trimetilsililados, que serão

analisados por GC.

No caso de alimentos cárneos e congelados, não é necessária a prévia

extracção da gordura, podendo saponificar-se directamente a amostra.

Os produtos de oxidação do colesterol podem se quantificados por GC,

HPLC ou TLC.

Page 62: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

58

Capítulo 9

Hidratos de carbono

Designa-se por hidrato de carbono qualquer composto orgânico de

fórmula (CH2O)n com n ≥ 3. Quimicamente, os hidratos de carbono são

aldeídos ou cetonas, com diversos grupos hidroxilo ligados. Os hidratos de

carbono simples, que não podem ser hidrolisados a açúcares mais simples são

chamados monossacáridos.

Fig. 9.1 – -D-glucopiranose, um monossacárido.

Os monossacáridos são classificados de acordo com três características: a

posição do grupo carbonilo, o número de átomos de carbono e a quiralidade.

Se o grupo carbonilo é um aldeído, o monossacárido designa-se por aldose; se

o grupo carbonilo for uma cetona, o monossacárido será uma cetose. Os

açúcares simples com valores n de 3, 4, 5 e 6 são designados por trioses,

tetroses, pentoses e hexoses. Cada átomo de carbono com um OH substituinte,

exceptuando o primeiro e o último carbonos, são assimétrcos podendo exibir

configurações R ou S.

A nomenclatura D ou L tem em conta a orientação do carbono assimétrico

mais afastado do grupo carbonilo. Numa projecção de Fischer, se o grupo

hidroxilo está à direita da molécula, o açúcar será D e no caso oposto será L.

Os grupos aldeído ou cetona de um monossacárido reagem

reversivelmente com um grupo hidroxilo de outro átomo de carbono, formando

um anel heterocíclico. Se o anel tiver cinco membros é uma furanose e se tiver

seis uma piranose. Na forma cíclica, o átomo de carbono do grupo carbonilo

(carbono anomérico) torna-se um centro quiral com duas conformações

possíveis: o átomo de oxigénio pode ficar acima ou abaixo do plano do anel,

Page 63: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

59

originando dois possíveis anómeros. Num anómero , o grupo OH do carbono

anomérico fica situado no lado oposto do anel relativamente ao grupo CH2OH;

num anómero , o CH2OH fica no mesmo lado do plano do anel relativamente

ao hidroxilo do carbono anomérico.

Fig. 9.2 – A azul está representado o átomo de carbono mais

afastado do grupo carbonilo (vermelho). Como o OH

está à direita, este é um açúcar D.

Fig. 9.3 – Anómeros e da glucose.

Nos açúcares simples, o grupo aldeído do carbono 1 pode sofrer uma

hidrogenação, resultando na formação de um álcool polihidroxilado ou poliol.

Alguns destes compostos ocorrem na natureza, podendo também ser

produzidos industrialmente. Estes compostos possuem menor teor calórico, são

melhor tolerados por diabéticos e não provocam formação de cáries,

comparativamente com os açúcares “normais”.

Os monossacáridos podem ligar-se uns aos outros, formando

oligossacáridos ou polissacáridos. A ligação covalente entre dois

monossacáridos designa-se ligação peptídica. Os oligossacáridos mais simples

são os dissacáridos, como a lactose ou a sacarose.

A sacarose não possui um carbono anomérico, sendo considerado um

açúcar não redutor. Pelo contrário, a maioria dos monossacáridos e dissacáridos

como a lactose têm capacidade de reduzir Cu2+ a Cu+ (teste de Fehling) sendo

designados açúcares redutores.

Page 64: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

60

Fig. 9.4 – Sacarose, o dissacárido mais abundante na natureza.

A partir de dez unidades monoméricas, os hidratos de carbono são

habitualmente designados polissacáridos. Alguns dos polissacáridos mais

importantes na natureza são o amido, a celulose e o glicogénio. O amido é uma

mistura dos polissacáridos amilose e amilopectina em diferentes proporções. A

celulose é um polímero linear de unidades de D-glucose ligadas por ligações

(1ɹ4).

Fig. 9.5 – Cadeia de celulose, evidenciando as ligações de

hidrogénio formadas entre as unidades D-glucose.

O equivalente do amido nos animais é o glicogénio, também um

polissacárido de glucose com funções de armazenamento.

A pectina é um heteropolissacárido estrutural, encontrado nas plantas

terrestres. A sua estrutura difere de planta para planta, nas diferentes partes

das plantas e mesmo durante o desenvolvimento das plantas.

Como os hidratos de carbono possuem uma elevada gama de

solubilidades, os métodos de preparação de amostra para a sua análise são

também variados.

Page 65: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

61

Fig. 9.6 – Esquema mostrando a estrutura fortemente ramificada

do glicogénio.

Para analisar os hidratos de carbono na maioria dos alimentos, efectua-se

um primeiro passo de secagem (pode servir para determinar o teor de

humidade). Após secagem, a amostra é finamente triturada e faz-se a

extracção dos lípidos por Soxhlet, usando uma mistura 95:5 v/v

clorofórmio/metanol. A extracção da fracção lipídica facilita a mais completa

extracção de hidratos de carbono.

Os produtos alimentares contêm frequentemente substâncias que

interferem com as medidas de mono e oligossacáridos presentes. Por essa

razão, a amostra, depois de seca e sujeita à extracção da fracção lipídica, é

extraída a quente com 80% de etanol, na presença de carbonato de cálcio para

neutralizar alguma acidez. Os hidratos de carbono são solúveis em solventes

polares, mas outros componentes dos alimentos (polissacáridos, proteínas, ...)

são insolúveis em etanol quente a 80%. O passo de extracção é repetido, de

modo a ssegurar uma completa extracção dos mono e oligossacáridos.

O extracto ainda conterá outras substâncias, para além dos hidratos de

carbono. Como estes são neutros e aquelas possuem carga, os contaminantes

podem ser removidos por técnicas de permuta iónica.

Page 66: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

62

A solução etanólica contendo o extracto é sujeita a secagem, num

evaporador rotativo a 45 – 50 ºC e o resíduo resultante é dissolvido num

volume conhecido de água, para posterior análise.

A determinação do teor total em hidratos de carbono pode ser feita

tirando partido da reacção característica dos hidratos de carbono com ácidos

fortes. Nestas condições (o efeito pode ser reforçado a temperatura elevada)

produzem-se diversos furanos, os quais podem condensar entre si ou com

outros produtos, originando substâncias de cor castanha e preta. Entre estes

outros produtos que reagem com os furanos, contam-se os compostos

fenólicos. O método mais utilizado para determinar hidratos de carbono totais é

a condensação com o fenol em meio de ácido sulfúrico (método do fenol/ácido

sulfùrico). Este método é simples, rápido, sensível, rigoroso e específico para

hidratos de carbono. Prepara-se uma solução com os hidratos de carbono a

determinar e um branco com água. Adiciona-se uma solução aquosa de fenol,

mistura-se e adiciona-se ácido sulfúrico. A solução fica com uma cor amarelo-

-alaranjada e a sua absorvância é medida a 490 nm.

O método do fenol e outros usados para medir o teor de açúcares

redutores não envolvem reacções estequiométricas, dependendo a extensão da

reacção da estrutura do açúcar. Por este motivo, é necessária a utilização de

curvas de calibração, frequentemente com D-glucose.

O método mais utilizado para determinar teores de açúcares redutores é o

método de Somogyi-Nelson. Este e outros métodos semelhantes podem ser

usados em conjunto com métodos enzimáticos para determinar oligo e

polissacáridos. Os métodos enzimáticos usam hidrolases específicas para

converter oligo e polissacáridos em monossacáridos ou unidades repetitivas de

oligossacáridos, os quais podem ser medidos pelos métodos usados para

determinar açúcares redutores.

O método de Somogyi-Nelson baseia-se na redução de Cu2+ a Cu+ pelos

açúcares redutores. Os iões Cu+, por sua vez, reduzem um complexo de

arsenomolibdato em ácido sulfúrico. A redução deste complexo origina uma cor

azul intensa e estável, a qual pode ser medida espectrofotometricamente a

520 nm, contra um branco de água. Como a reacção não é estequiométrica,

tem que usar-se uma curva de calibração para quantificar os açúcares

redutores.

Existem outros métodos baseados na redução, em meio alcalino, de Cu2+

a Cu+. Nestas condições, o Cu+ precipita na forma de Cu2O, de cor vermelho-

-tijolo. O método de Munson-Walker é um deles, podendo o precipitado ser

medido por gravimetria, por titulação com tiossulfato de sódio, por titulação

com permanganato de potássio, por titulação na presença de azul de metileno

Page 67: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

63

(método de Lane-Eynon) e por electrólise. Todas estas variantes requerem a

utilização de curvas de calibração, devido à especificidade de reacção de cada

açúcar.

Em geral, é conveniente identificar cada hidrato de carbono presente e

determinar as suas concentrações, para o que será necessário optar por outros

métodos.

HPLC é o método mais eficaz para a análise de oligo e monossacáridos,

podendo também ser usado para análise de polissacáridos, após hidrólise

destes.

Como os hidratos de carbono possuem pKa elevados (12-14) em soluções

com pH alcalino alguns grupos hidroxilo dos hidratos de carbono são ionizados,

permitindo a separação em colunas de permuta aniónica. A sequência de

eluição é geralmente alditóis, monossacáridos, dissacáridos e oligossacáridos de

maior cadeia. A cromatografia de permuta aniónica é habitualmente utilizada

em conjunto com detectores electroquímicos.

As resinas de permuta catiónica podem ser usadas em alternativa,

invertendo-se aqui a ordem de separação. A maior eficácia destas colunas está

na separação de monossacáridos.

HPLC também pode ser usada em fase normal para análise de hidratos de

carbono. Usando fases estacionárias com grupos amino e fases móveis

acetonitrilo/água conseguem separar-se os hidratos de carbono na ordem

monossacáridos, alditóis, dissacáridos e outros oligossacáridos. Alguns açúcares

reagem com os grupos amino e a fase estacionária vai perdendo eficácia,

embora modificações recentes na fase estacionária permitam a regeneração da

mesma.

As colunas de fase reversa mostram alguma eficácia na separação de

mono, di e trissacáridos, mas os monossacáridos tendem a coeluir com baixos

tempos de retenção.

A detecção em HPLC de hidratos de carbono pode ser feita por índice de

refracção, detectores electroquímicos ou por derivatização pré e pós-coluna.

Os detectores de índice de refracção podem ser aplicados a todos os

hidratos de carbono e apresentam uma resposta linear numa ampla gama de

concentrações, mas não são compatíveis com a utilização de gradientes.

Os detectores de amperometria pulsada são utilizados em cromatografia

de permuta aniónica e permitem a detecção quer de açúcares redutores quer

de não redutores.

Page 68: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

64

A derivatização dos hidratos de carbono pré-coluna ou pós-coluna permite

aumentar a sensibilidade de detecção por detectores de absorção electrónica

ou de fluorescência.

A cromatografia gasosa permite a análise quantitativa e qualitativa de

hidratos de carbono, com a limitação de que estes têm que sofrer uma

derivatização (em dois passos) para serem convertidos em compostos voláteis.

A detecção é habitualmente efectuada por detectores de ionização de chama

(FID).

O processo de derivatização é diferente para açúcares neutros e para

amostras contendo ácidos urónicos.

Vários métodos enzimáticos têm sido empregues para a determinação de

hidratos de carbono, em particular do amido. Estes métodos apresentam a

vantagem de serem frequentemente específicos para a substância a ser

estudada.

É recomendado que as amostras destinadas a serem determinadas por

métodos enzimáticos sofram um tratamento prévio que permita a quebra de

emulsões, precipitação de proteínas e absorção de cores. Este tratamento de

Carrez envolve a adição de hexacianoferrato de potássio (K4[Fe(CN)6]), seguida

da adição de sulfato de zinco (ZnSO4) e de hidróxido de sódio (NaOH).

Na determinação enzimática de D-glucose, esta é quantitativamente

oxidada pela enzima glucose oxidase a D-glucono-1,5-lactona e H2O2. O

peróxido de hidrogénio reage com um pigmento na presença de peroxidase e

origina a formação de um composto corado, o qual é medido

espectrofotometricamente, permitindo a quantificação da D-glucose.

O único método de confiança para determinação do teor total em amido

baseia-se na conversão total de amido em D-glucose por enzimas (amilases) e

posterior determinação da D-glucose por uma enzima específica.

Este método apresenta problemas de quantificação com o amido

resistente (amido e produtos de degradação do amido que resistem à digestão

no intestino delgado). Existem quatro tipos de amido resistente: a) amido preso

em matrizes alimentares, fisicamente inacessível a amilases; b) amido que

resiste à hidrólise enzimática devido à natureza dos seus grãos (amido de

batata, ...); c) amido que recristalizou após gelatinização (ex: batatas cozidas e

arrefecidas); d) amido que foi estruturalmente modificado, de maneira a torná-

-lo menos susceptível à digestão.

O problema causado pelo amido resistente pode ser, em parte,

solucionado por dispersão do amido em DMSO (dimetil sulfóxido) e posterior

Page 69: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

65

conversão quantitativa em D-glucose por tratamento com -amilase,

conseguindo-se assim a despolimerização e solubilização do amido.

Fig. 9.7 – Determinação enzimática da D-glucose.

Para determinar o amido total, uma amostra é finamente triturada,

colocada num tubo de ensaio e é-lhe adicionado etanol a 80%. Adiciona-se

DMSO e agita-se vigorosamente. Aquece-se em água a ferver, retira-se do

banho e adiciona-se uma solução de -amilase. Agita-se bem e volta a colocar-

-se no banho de água. Ao fim de 5 minutos, o tubo é levado a 50 ºC, adiciona-

-se tampão de acetato de sódio (pH 4.5) e amiloglucosidase. Agita-se e incuba-

-se a 50 ºC. De seguida, o conteúdo do tubo é transferido para um balão

volumétrico, ajustando-se o volume com água destilada. Após agitação

vigorosa, retiram-se alíquotas, adiciona-se uma mistura de glucose

oxidase/peroxidase (reagente GOPOD) e incuba-se a 50 ºC. Finalmente, mede-

-se a bsorvância da amostra contra um branco do reagente GOPOD.

Utilizam-se glucose e um amido com baixo teor de proteínas e lípidos

como padrões, após determinação dos respectivos teores de humidade.

Não existe um método oficial para determinação de pectina, mas existem

alguns métodos publicados, baseados na sua precipitação com etanol, em

alimentos em que é o único polissacárido presente.

O ácido D-galacturónico é um elemento constante na composição das

pectinas (frequentemente mais de 80%). As ligações dos ácidos urónicos são

difíceis de hidrolisar sem degradação da molécula, pelo que os métodos que

utilizam hidrólise ácida e cromatografia não são aplicáveis à análise de pectinas.

Page 70: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

66

Um dos métodos usados faz saponificação da amostra em NaOH, seguida

da sua acidificação e adição de Ca2+, para precipitar a pectina. O pectato de

cálcio precipitado é recolhido, lavado, seco e pesado.

Define-se fibra dietética como a soma dos componentes não digeríveis de

um alimento. Na sua maioria é composta de polissacáridos (celulose,

hemiceluloses e lenhina). A fibra dietética é composta por uma parte de fibra

solúvel e outra de fibra insolúvel. A fibra insolúvel é composta por celulose,

celulose microcristalina usada como aditivo alimentar, lenhina, hemiceluloses

presas na matriz linhocelulósica e amido resistente. Os restantes polissacáridos,

incluindo diversas hemiceluloses, a maioria da pectina e a maioria das

gomas/hidrocolóides compõem a fibra solúvel.

O teor em fibra dietética de um alimento pode ser calculado por dois

processos: gravimétrico e químico. Nos métodos gravimétricos, os hidratos de

carbono digeríveis, lípidos e proteínas são removidos por catálise enzimática ou

solubilizados selectivamente. A parte não digerida ou não solubilizada é filtrada

e pesada. Nos métodos químicos, os hidratos de carbono digeríveis são

removidos por digestão enzimática e os componentes da fibra hidrolisados em

meio ácido. De seguida, medem-se os monossacáridos libertados, considerando

que o seu teor corresponde ao teor de fibra.

Todos os métodos usados para determinação de fibras incluem um passo

de aquecimento a 80-130 ºC (10 min a 3 h) para gelatinizar os grânulos de

amido, tornando-os passíveis de ser hidrolisados. Só o amido resistente não

será hidrolisado.

As medidas de fibra requerem que as amostras sejam secas e finamente

trituradas e funcionam melhor em amostras com menos de 10% de lípidos.

Quando a amostra possui um teor lipídico superior, os lípidos são removidos por

extracção com éter de petróleo ou hexano. A amostra é depois seca em estufa

de vácuo a 70 ºC e triturada.

As amostras não sólidas com menos de 10% de fibra devem ser

analisadas após liofilização. Se tiverem mais de 10% de fibra, forem

homogéneas, com tamanho de partícula suficientemente pequeno para permitir

uma remoção eficaz de hidratos de carbono digestíveis e de proteína e

possuirem um baixo teor de lípidos, podem ser analisadas sem secagem.

Entre os métodos gravimétricos inclui-se o método para determinação de

fibra bruta. Este é um método antigo, que foi utilizado até à década de 1970

para determinar o teor de fibra em alimentos para humanos. A fibra bruta é

determinada por extracção sequencial da amostra com H2SO4 1.25% e NaOH

1.25%. O resíduo insolúvel é recolhido por filtração, seco, pesado e incinerado,

Page 71: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

67

de modo a corrigir para a eventual contaminação por minerais. Este método

não tem em conta as hemiceluloses, pectinas e gomas/hidrocolóides, já que

estes são solubilizados e removidos.

Os métodos com detergentes ácido e neutro foram desenvolvidos para

obter uma determinação mais correcta de fibra. O método com detergente

ácido mede a lenhina e a celulose e o método com detergente neutro mede

lenhina, celulose e hemiceluloses. Nenhum destes métodos permite medir

pectinas ou gomas. No entanto, como os componentes não medidos estão

geralmente presentes em muito pequenas quantidades, estes métodos são

aceites para analisar rações para animais.

O método gravimétrico de referência para medir fibras em alimentos para

consumo humano faz a medida das fibras total, solúvel e insolúvel. Este método

usa amostras secas, livres de lípidos e trituradas. As amostras são digeridas

com -amilase, glucoamilase e protease, para remover amido e proteínas. A

fibra insolúvel é recolhida por filtração e a fibra solúvel é precipitada por adição

de etanol a 78% e depois recolhida por filtração. Este resíduo é lavado com

etanol e acetona, seco na estufa e pesado. De seguida é analisado para

verificar da existência de proteína e cinzas [fibra = peso do resíduo - (peso de

proteínas + peso das cinzas)].

Para determinar os teores de fibra solúvel e insolúvel, depois do

tratamento com glucoamilase, filtra-se a mistura sobre Celite (ajuda a filtração).

A fibra insolúvel, retida no filtro, é lavada com água e o filtrado será a fibra

solúvel. Para a precipitar, adiciona-se etanol a 95% e água. Após filtrado, o

precipitado será lavado com etanol a 78%.

No final, o resíduo de fibra (total, insolúvel ou solúvel) é lavado com

etanol a 95% e acetona, seco em estufa e pesado. O teor de fibra tem que ser

corrigido para a presença de proteínas e minerais complexados com

constituintes das paredes celulares. Pode determinar-se o teor de amido

resistente suspendendo o resíduo em KOH 2M. A base vai solubilizar o amido

resistente, o qual é depois digerido com glucoamilase (após ajuste do pH a um

valor entre 4.0 e 4.7). A glucose libertada é determinada por via enzimática ou

colorimétrica.

Durante todo este procedimento experimental, é necessário preparar

brancos dos reagentes em duplicado, de modo a efectuar os cálculos (Fig. 9.8).

Page 72: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

68

Fig. 9.8 – Determinação dos teores de fibra total, insolúvel e

solúvel.

1 2 = 2

R RB

P A

(9.1)

1 2

1 2

2%Fibra = x 100

2

R RP A B

m m

(9.2)

Nas equações 9.1 e 9.2, B é o valor do branco, P o da proteína, A o das

cinzas, m1 e m2 são os pesos das amostras em duplicado e R1 e R2 os pesos dos

resíduos, também em duplicado. A fibra total é igual à soma da fibra insolúvel

com a fibra solúvel.

A fibra total também pode ser determinada directamente por pesagem do

produto de digestão com glucoamilase, após adição de etanol a 95%, aquecido

a 60 ºC e seguindo o procedimento usado para determinação da fibra solúvel.

Nos métodos químicos, o teor em fibra é dado pela soma de todos os

monossacáridos não provenientes do amido mais a lenhina. Os monossacáridos

podem ser medidos por métodos colorimétricos ou cromatográficos (HPLC, GC).

A soma das hexoses, pentoses e ácidos urónicos dá o teor total em

polissacáridos.

O principal método químico para determinação de fibra é o método

Englyst-Cummings, no qual o amido é gelatinizado e digerido por enzimas. Os

restantes polissacáridos são hidrolisados com ácido sulfúrico. Os açúcares

neutros são determinados por cromatografia e os ácidos urónicos por

colorimetria. Em alternativa, todos os monossacáridos podem ser medidos por

colorimetria.

Page 73: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

69

No método Englyst-Cummings, as amostras são misturadas com DMSO e

aquecidas em água a ferver, de modo a gelatinizar o amido. O amido será

digerido com pululanase e a proteína com pancreatina. A digestão do amido

será completada pela adição de glucoamilase. A fibra será precipitada pela

adição de etanol a 100% seguida de refrigeração. Por centrifugação separa-se

o resíduo de fibra. Segue-se a lavagem da fibra com, sucessivamente, etanol, a

85% (2 vezes), etanol a 100% e acetona, em cada caso seguida de

centrifugação. O resíduo final é seco e os polissacáridos presentes são

hidrolisados por incubação em H2SO4 concentrado a 35 ºC, posteriormente

diluído para 2 M e a mistura aquecida em água a ferver durante 1 h. A fracção

hidrolisada é usada para análise de açúcares, uma parte para determinação

cromatográfica dos açúcares neutros e a restante para determinação de ácido

urónico por colorimetria. O peso de fibra é dado pela soma dos açúcares

neutros com o ácido urónico.

Estes métodos são usados para determinar teores de fibra total. Quando

se pretende determinar o teor de fibra insolúvel, substitui-se o etanol absoluto

por um tampão de pH 7 e a fibra hidrossolúvel é extraída por aquecimento,

durante 30 min, da mistura digerida em água a ferver. A fibra insolúvel é

separada por centrifugação, lavada, seca e hidrolisada com ácido. O teor em

fibra solúvel será obtido por subtracção do teor de fibra insolúvel da fibra total

(fibra solúvel = fibra total – fibra insolúvel).

É possível determinar o teor em celulose na fibra total se não se efectuar

o passo de hidrólise com H2SO4 concentrado, passando directamente para a

hidrólise dos restantes polissacáridos com H2SO4 2 M. O peso dos

monossacáridos resultantes desta hidrólise é igual ao peso dos polissacáridos

não celulósicos e o teor em celulose é dado por fibra total – polissacáridos não

celulósicos.

Page 74: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

70

Capítulo 10

Água

A água é a molécula mais abundante na superfície terrestre e é o

principal constituinte de muitos alimentos. Influencia directamente a sua

degradação e a sua textura. É o meio em que ocorrem diversas reacções

químicas e é um reagente nos processos hidrolíticos. É uma estrutura molecular

simples. Cada átomo de hidrogénio está ligado covalentemente ao átomo de

oxigénio através de um par de electrões partilhados. O oxigénio possui ainda

um outro par de electrões não partilhados.

A água é uma molécula polar, ou seja possui uma distribuição desigual da

sua densidade electrónica. A molécula possui uma carga negativa parcial (-)

perto do átomo de oxigénio, devida a um par de electrões não partilhados e

cargas positivas parciais (+) junto dos átomos de hidrogénio.

Fig. 10.1 – Representação esquemática do dipolo formado por

uma molécula de água.

A molécula da água possui uma estrutura tetraédrica ligeiramente

deformada. Cada molécula de água está coordenada com quatro outras

moléculas de água através de ligações de hidrogénio.

A estrutura da água é desestabilizada pela solubilização de sais ou

moléculas com grupos polares e/ou hidrofóbicos.

Esta estrutura tridimensional fortemente organizada está na base de

muitas das propriedades invulgares da água, tais como a sua grande

estabilidade e elevados pontos de fusão e ebulição.

Page 75: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

71

A molécula de água pode sofrer uma auto-ionização, com a formação dos

iões H3O+ e OH-.

2H2O Ý H3O+ + OH- (10.1)

Fig. 10.2 – Estrutura tetraédrica de moléculas de água, ligadas

por pontes de hidrogénio.

Sendo um processo reversível, pode definir-se uma constante de

equilíbrio, K ’w.

+ -

3'

2

H O OH

H OwK

(10.2)

Como [H2O] é constante, pode escrever-se Kw=[H3O+][OH-]=10-14. Daqui

deriva o conceito de pH=-log[H3O+].

A água afecta a conservabilidade dos alimentos, não devido ao seu teor

mas sim à sua actividade. A actividade da água (aw) define-se como a pressão

de vapor da água acima de uma dada substância dividida pela pressão de vapor

da água pura, à mesma temperatura e varia entre 0 e 1.

0

w

Pa

P (10.3)

Na prática, a actividade da água descreve a quantidade de água em

equilíbrio disponível para a hidratação de uma dada substância. Um valor igual

a 0 indica a total ausência de moléculas de água livre disponíveis, enquanto que

um valor de 1 indica água pura.

A relação entre o teor de água e a actividade da água é indicada pelas

isotermas de sorção da substância. Estas apresentam uma forma sigmóide, com

Page 76: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

72

pequenas variações conforme a estrutura física, a composição química, a

temperatura e a capacidade de retenção de água do alimento. Quando

aw < 0.3, estamos na zona de absorção primária, onde as moléculas de água

poderão estar ligadas a pontos de absorção primários (-COOH) que por sua vez

se ligam a outras moléculas de água por pontes de hidrogénio. Para valores de

aw entre 0.4 e 0.8, existe a possibilidade de reacções químicas e enzimáticas

rápidas, devido ao aumento da concentração dos reagentes. Nesta zona, o

crescimento de microrganismos é nulo ou muito rduzido. Acima de 0.9, as

reacções químicas e enzimáticas podem ver a sua velocidade reduzida pela

baixa concentração dos reagentes e haverão condições para crescimento

microbiano.

Fig. 10.3 – Isotermas de sorção, mostrando as três diferentes

zonas.

O teor de humidade nos alimentos apresenta grandes variações,

dependendo do alimento. Em função dessa variedade, são também vários os

métodos disponíveis para a sua determinação. Dependendo da forma em que a

água se encontra no alimento (livre, adsorvida ou água de hidratação) o

método escolhido poderá medir mais ou menos da humidade presente.

Durante a preparação duma amostra para determinação do seu teor em

humidade, será necessário minimizar percas ou ganhos de humidade

acidentais: reduzindo a exposição atmosférica; minimizando aquecimento por

fricção durante a trituração da amostra; reduzindo o volume do espaço de

cabeça no recipiente de armazenamento, para minimizar as percas por

equilíbrio da humidade com o ambiente; reduzindo variações de temperatura.

Os métodos mais simples para determinação do teor de humidade

baseiam-se na secagem em estufa e medição da perca de peso. Nestes

Page 77: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

73

métodos, a quantidade de humidade medida depende do tipo de estufa usada,

das condições no interior da estufa, do tempo e da temperatura de secagem.

Estes métodos têm por base o ponto de ebulição da água que é inferior aos da

generalidade dos outros componentes alimentares. No entanto, alguns desses

componentes degradam a 100 ºC, como o caso dos hidratos de carbono,

libertando água (10.4). A água determinada nestes casos será sobreavaliada

relativamente ao verdadeiro valor.

C6H12O6 ɹ 6C + 6H2O (10.4)

Outras reacções, como por exemplo a hidrólise da sacarose (10.5), reduzem o

teor de humidade medido.

Sacarose + H2O ɹ Glucose + Frutose (10.5)

Outros problemas, embora menos sérios, resultam da perca de componentes

voláteis, contribuindo para a perca de peso da amostra. Por outro lado, pode

ocorrer ganho de peso devido à oxidação de ácidos gordos insaturados e de

outros compostos.

Existem três tipos de estufas usadas para determinação do teor de

humidade, estufas de convecção, com ventilação forçada e de vácuo. As

estufas de convecção são as menos precisas, já que podem existir variações de

temperatura no seu interior de ~10 ºC. Nas estufas de ventilação forçada essa

variação é inferior a 1 ºC. As estufas de vácuo têm pequenas variações de

temperatura no seu interior e a vantagem de eliminar a humidade interior.

Fazendo a secagem sob pressão reduzida, é possível obter, num prazo mais

curto, uma mais completa remoção de água e voláteis sem decomposição da

amostra.

Os recipientes utilizados para secagem de amostras são de diversas

formas e materiais, podendo ter tampa ou não. As tampas impedem a perca de

material durante o aquecimento. Sempre que possível, é aconselhável o uso de

material descartável. Estes recipientes devem ser sempre manipulados com o

auxílio de pinças, de modo a não deixar dedadas (iriam influir no peso) e

devem ser sempre bem secos em estufa antes de serem utilizados.

Page 78: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

74

Fig. 10.4 – Estufa de vácuo, utilizada na determinação de

humidade.

Alguns alimentos tendem a formar crostas ou a aglomerar quando secos,

conduzindo a resultados errados. Para impedir que tal suceda, mistura-se areia

seca e previamente pesada.

Usando estes métodos, os teores de humidade e de sólidos totais são

calculados por

peso da amostra húmida - peso da amostra seca%Humidade = x 100

peso da amostra húmida (10.6)

peso da amostra seca%Sólidos totais = x 100

peso da amostra húmida (10.7)

As amostras são secas durante um dado período de tempo e depois

pesadas ou, em alternativa, são feitas secagens e pesagens sucessivas até

serem obtidas duas medidas seguidas idênticas.

A secagem por micro-ondas permite uma determinação rápida e precisa

do teor de humidade. Os modelos mais recentes permitem um controlo da

temperatura e alguns vêm equipados com uma balança no interior, permitindo

seguir a perca de água durante a secagem. Alguns equipamentos combinam a

secagem por micro-ondas com o efeito do vácuo, permitindo medições muito

rápidas. A amostra tem que ser uniforme e colcada no centro do aparelho de

modo a assegurar uma secagem uniforme e completa.

Fig. 10.5 – Medidor de humidade por micro-ondas.

Uma alternativa para secagem rápida de alimentos é a secagem por

radiação infra-vermelha.

O teor de humidade em alimentos pode ser determinado por destilação,

usando técnicas directas ou por refluxo. A humidade de um alimento é

Page 79: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

75

codestilada com um solvente de ponto de ebulição superior e que seja imiscível

com a água.

Os métodos por destilação provocam menor degradação térmica dos

alimentos do que a secagem em estufa a temperaturas mais elevadas. A

destilação por refluxo é mais utilizada que a destilação directa.

A destilação por refluxo usa um solvente menos denso que a água (o mais

utilizado é o tolueno). O aquecimento leva à formação de uma emulsão, na

forma de vapor, de água em tolueno. Quando o vapor sobe, dá-se condensação

e a inversão da emulsão, com tolueno disperso na água. Ao arrefecer, a

turvação vai desaparecendo lentamente. O processo é repetido até não se

conseguir destilar mais água e o volume desta é medido.

Fig. 10.6 – Montagem para destilação por refluxo da humidade de

um alimento.

O método de Karl Fischer é um processo químico para determinação do

teor de humidade, particularmente adaptado a alimentos que produzem

resultados de má qualidade quando aquecidos ou submetidos a vácuo. Este

método tem por base a reacção de redução de iodo por SO2 na presença de

água.

2H2O + SO2 + I2 ↓ C5H2SO4 + 2HI (10.8)

O método foi modificado de modo a incluir metanol e piridina num sistema

que permita a dissolução do iodo e SO2:

C5H5N.I2 + C5H5N

.SO2 + C5H5N + H2O ↓ 2C5H5N.HI + C5H5N

.SO3 (10.9)

Page 80: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

76

C5H5N.SO3 + CH3OH ↓ C5H5N(H)SO4

.CH3 (10.10)

O I2 em excesso que não reage com a água pode ser visualmente

determinado. O ponto de viragem é vermelho-acastanhado e pode também ser

determinado, com maiores sensibilidade e rigor, por potenciometria.

Fig. 10.7 – Titulador de Karl Fischer para determinação do teor de

humidade.

No método de Karl Fischer, adiciona-se directamente o reagente de Karl

Fischer (KFR) se a humidade na amostra estiver acessível. No caso de não estar

acessível, é necessário extraí-la primeiro com um solvente apropriado (metanol,

…). Esse extracto será depois titulado com o reagente de Karl Fischer.

Antes de efectuar o cálculo do teor de humidade numa amostra, é

necessário determinar a equivalência de humidade no reagente de Karl Fischer

(KFReq). Este valor representa a quantidade equivalente de humidade que reage

com 1 mL de reagente de Karl Fischer. Como o valor de KFReq varia com o

tempo, a padronização terá que ser verificada antes de cada utilização. O valor

de KFReq pode ser determinado com padrões de água, água em metanol ou

tartarato de sódio. Com tartarato de sódio, o valor de KFReq é dado por:

2 2 4 4 6 2eq

36 g H O/mol Na C H O 2H O x x 1000 =

230.08 g/mol x

SKFR

A

(10.11)

em que S é o peso do tartarato de sódio e A o volume de reagente necessário

para a titulação do tartarato de sódio.

Uma vez conhecido o valor de KFReq, determina-se o teor de humidade

usando a equação 10.12:

Page 81: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

77

eq

2

KFR x %H O = x 100

sK

S (10.12)

em que Ks é o volume de reagente usado para titular a amostra e S o peso da

amostra.

O teor de humidade em alimentos pode ainda ser determinado através de

métodos físicos, como sejam os métodos electroquímicos, a hidrometria, a

refractometria, a espectrometria de IV e a medição do ponto de congelação.

Os métodos electroquímicos baseiam-se na medida da constante

dielétrica, que é mais elevada na água que na maioria dos outros solventes e

na medida da condutividade, que aumenta com o teor de humidade na

amostra. Nestes métodos há necessidade de calibrar os instrumentos com

padrões.

Em alimentos que contenham mais de 30 – 35 % de humidade não é

possível utilizar métodos electroquímicos.

A hidrometria mede a densidade com picnómetros, hidrómetros ou a

balança de Westphal.

A refractometria é usada para medir teores de humidade em produtos

líquidos ricos em açúcar e em leite condensado. Como todos os compostos

possuem um índice de refracção, a refractometria pode ser usada para

identificação de compostos, comparando o valor medido com os da literatura. O

índice de refracção varia com a concentração do composto, permitindo calcular

teores de humidade, mas também com a temperatura e o comprimento de

onda, pelo que se terá que trabalhar em condições controladas.

A utilização da espectrometria de IV na determinação do teor de

humidade baseia-se na existência de bandas de absorção a 1400 – 1450 nm e

1920 – 1950 nm, características do estiramento dos OH da água.

O ponto de congelação da água é utilizado para determinar o teor de

humidade no leite. Este valor varia entre -0.503 ºC e -0.541 ºC, sendo a média

-0.517 ºC. A determinação do ponto de congelação permite identificar

adulterações por adição de água e é feita através da fórmula seguinte, em que

T é o ponto de congelação da amostra:

2

0.517 - %H O adicionada = x 100

0.517

T (10.13)

No caso de se pretender determinar se um alimento é perecível, a

medição do teor de humidade não dá uma boa indicação, pois a água associa-

Page 82: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

78

-se de diferentes formas com os alimentos. A água mais fortemente ligada não

está disponível para o crescimento microbiano, ao contrário da menos ligada. O

cálculo da actividade da água (aw) é uma melhor indicação dessa

disponibilidade da água para crescimento microbiano.

Page 83: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

79

Capítulo 11

Vitaminas e minerais

As vitaminas são compostos orgânicos existentes em pequenas

quantidades nos alimentos, mas essenciais como nutrientes. São habitualmente

separadas em lipossolúveis (A, D, E e K) e hidrossolúveis. No ser humano são

encontradas as 4 lipossolúveis e 9 hidrossolúveis (8 vitaminas B e vitamina C).

Tabela 11.1

Nome genérico Designação química

Vitamina A Retinóides (retinol, retinóides, carotenóides)

Vitamina B1 Tiamina

Vitamina B2 Riboflavina

Vitamina B3 Niacina, niacinamida

Vitamina B5 Ácido pantoténico

Vitamina B6 Piridoxina, piridoxamina, piridoxal

Vitamina B7 Biotina

Vitamina B9 Ácido fólico, ácido folínico

Vitamina B12 Cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina

Vitamina C Ácido ascórbico

Vitamina D Ergocalciferol, colecalciferol

Vitamina E Tocoferóis, tocotrienóis

Vitamina K Filoquinona, menaquinonas

Designa-se por vitamina um composto que não é sintetizado em suficiente

quantidade pelo organismo, tendo que ser obtido através da alimentação.

As vitaminas são classificadas quanto às suas actividades biológica e

química, não quanto à sua estrutura. Por exemplo, o termo vitamina A é usado

para designar os compostos retinal, retinol e diversos carotenóides.

As vitaminas possuem diversas funções bioquímicas, incluindo hormonal

(ex. vitamina D), antioxidante (ex. vitamina E) e reguladora (ex. vitamina A). a

maioria das vitaminas (ex. complexo B) funciona como precursores de

Page 84: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

80

coenzimas, participando no metabolismo. Nalguns casos (ex. biotina), as

próprias vitaminas funcionam como coenzimas, caso do ácido fólico.

OH

CH3

CH3CH3CH3 CH3

O

CH3

CH3CH3CH3 CH3

CH3

CH3CH3CH3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

Retinol

Retinal

-Caroteno

Fig. 11.1 – Três dos compostos habitualmente designados por

vitamina A.

Os teores em vitaminas podem ser determinados segundo três

estratégias: ensaios biológicos em seres humanos e animais, ensaios

microbiológicos e ensaios físico-químicos.

Os ensaios biológicos apenas serão utilizados se não existir uma outra

alternativa.

Como algumas vitaminas são sensíveis à luz, ao oxigénio, ao calor e a

alterações de pH, deverão ser tidas precauções adequadas na preparação e

armazenamento das amostras.

Em geral, os métodos de análise de vitaminas requerem a sua prévia

extracção do alimento. Os métodos de extracção são quase sempre específicos

para cada vitamina e envolvem tratamentos com ácidos, bases, solventes,

enzimas ou aplicação de calor. Em particular, para:

ácido ascórbico – extracção a frio com ácido metafosfórico/ácido

acético;

vitaminas B1 e B2 – ebulição (ou autoclave) em ácido seguida de

tratamento enzimático;

niacina – aquecimento em autoclave em ácido (produtos não

derivados de cereais) ou em base (cereais);

vitaminas A, E ou D – extracção em solvente orgânico,

saponificação e nova extracção com solvente orgânico. Adicionam-

-se antioxidantes, para impedir oxidações.

Page 85: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

81

A análise das vitaminas lipossolúveis pode exigir a sua saponificação.

Os ensaios microbiológicos estão limitados às vitaminas hidrossolúveis. O

crescimento de um dado microrganismo numa amostra contendo a vitamina a

analisar é comparado com o seu crescimento em meio contendo quantidades

conhecidas dessa vitamina. O crescimento pode ser medido em termos de

turbidez, produção de ácido, gravimetria ou respiração. Existem métodos

microbiológicos oficiais para análise de niacina e folato.

Os métodos químicos permitem analisar um maior número de vitaminas:

A, E, C, B1 e B2.

A vitamina A é sensível à radiação UV, ar e outros agentes oxidantes,

temperaturas elevadas e humidade, pelo que é necessário trabalhar com

equipamento adequado, sob condições não oxidantes e a temperatura

controlada. O único método considerado rigoroso para determinação de

vitamina A é a cromatografia líquida (HPLC).

A amostra é primeiro saponificada (após adição de pirogalol, que vai servir

de antioxidante) depois a vitamina A é extraída com um solvente orgânico e

concentrada, seguindo-se a determinação por HPLC. A cromatografia permite

separar os isómeros trans-retinol e cis-retinol e as respectivas determinações

são feitas a partir das equações abaixo.

TT

ST

x x DF

-retinol =

AW

Atrans

V (11.1)

CC

SC

x x DF

-retinol =

AW

Acis

V (11.2)

AT é a área do pico de trans-retinol na amostra, AC é a área do pico de cis-

retinol na amostra, AST e ASC as áreas dos picos dos padrões de trans e cis-

retinol, respectivamente, WT e WC os pesos de amostra, DF o factor de diluição

e V o volume da amostra.

A vitamina E encontra-se nos alimentos sob oito formas diferentes, os

tocoferóis , , e e os quatro tocotrienóis correspondentes (, , e ).

A análise de vitamina E é feita em HPLC de fase normal, com detecção por

fluorescência, com excitação a 290 nm e leitura da emissão a 330 nm.

Dependendo da origem da amostra, os procedimentos analíticos diferem,

fazendo-se, para a generalidade dos alimentos, uma saponificação sob refluxo,

na presença de pirogalol, seguida por uma extracção com hexano e injecção no

Page 86: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

82

cromatógrafo. No caso de margarinas e outras gorduras vegetais sólidas,

dissolve-se a amostra em hexano, adiciona-se MgSO4 para remover a água,

filtra-se e injecta-se o filtrado em HPLC. Os óleos são dissolvidos em hexano e

directamente injectados no HPLC.

Fig. 11.2 – As oito formas de vitamina E encontradas nos

alimentos.

A quantificação da vitamina E é feita recorrendo ao método do padrão

externo.

A vitamina C (ácido L-ascórbico e ácido L-dehidroascórbico) é muito

susceptível a degradação oxidativa, sobretudo a pH elevado e na presença de

Fe3+ e Cu2+. Deste modo, a sua análise deverá realizar-se a baixo pH e na

presença de um agente quelante. A oxidação suave do ácido ascórbico resulta

na formação de ácido dehidroascórbico, o qual pode ser reconvertido em ácido

ascórbico por reacção com agentes redutores.

A determinação de vitamina C pode ser feita por dois métodos diferentes,

um titrimétrico e outro com análise por espectroscopia de fluorescência.

No método titrimétrico, o ácido ascórbico é oxidado a ácido

dehidroascórbico por um indicador corado. No final da titulação, o indicador em

excesso é rosado em meio ácido e poderá ser quantificado por absorção

electrónica a 545 nm. O cálculo do teor em ácido ascórbico (mg por g ou mL de

amostra) é feito usando a equação 11.3, em que C é o peso de ácido ascórbico

por mL de indicador, V o volume de indicador usado para titular a amostra

diluída, DF o factor de diluição e WT o peso da amostra.

DFteor em ácido ascórbico = x x

WTC V (11.3)

Page 87: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

83

O método microfluorimétrico mede tanto o ácido ascórbico como o ácido

dehidroascórbico. Após oxidação do ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico,

faz-se reagir este com o-fenilenodiamina, formando um composto fluorescente,

o qual é medido com excitação a 356 nm e emissão a 440 nm. Para compensar

a possível existência de interferentes é necessário preparar um branco com

ácido bórico antes da adição da solução de o-fenilenodiamina.

O cálculo do teor em ácido ascórbico (mg por g ou mL) é dado pela

equação 11.4, em que A e C são as intensidades de fluorescência da amostra e

do padrão, respectivamente, B e D são as intensidades de fluorescência dos

brancos da amostra e do padrão, respectivamente, S é a concentração do

padrão, DF o factor de diluição e WT o peso da amostra.

DFteor em ácido ascórbico = x x

WT

A BS

C D

(11.4)

A medição do teor em vitamina B1 baseia-se na medida da fluorescência

da sua forma oxidada, o tiocromo. Como o tiocromo é sensível à luz, todos os

passos a seguir à oxidação devem ser feitos ao abrigo da luz forte. A própria

tiamina (vitamina B1) é sensível ao calor, sobretudo em meio alcalino, pelo que

o procedimento deve ser efectuado com rapidez.

A tiamina é oxidada por K2Fe(CN)6 e a leitura do tiocromo é feita com

excitação a 365 nm e emissão a 435 nm. É preparado um branco para corrigir

para a presença de interferentes e a quantificação é feita com recurso a

padrões da vitamina, usando a fórmula seguinte:

b o

b p

- 25teor em tiamina = x x x

Std - Std WT

S S VC

A V (11.5)

S e Sb são as intensidades de fluorescência da amostra e do branco da amostra,

respectivamente, Std e Stdb são as intensidades de fluorescência do padrão e

do branco do padrão, respectivamente, C é a concentração do padrão, A é o

volume da alíquota usada, 25 o volume final eluído, Vp o volume que atravessa

a coluna cromatográfica, Vo, o volume de diluição da amostra original e WT o

peso da amostra. O teor em vitamina B1 é expresso em mg/g.

A determinação da vitamina B2 (riboflavina) segue também um método

fluorimétrico. A riboflavina é oxidada por KMnO4 e o produto formado é

doseado por fluorescência, com excitação a 440 nm e leitura de emissão a

565 nm. É necessário ter atenção à sensibilidade da vitamina B2 à radiação UV.

Para calcular o teor em riboflavina (mg/g) usa-se a fórmula:

- CS DFteor em riboflavina = x x

- WT

A C

B A V (11.6)

Page 88: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

84

A e C são as intensidades de fluorescência da amostra contendo água e

hidrossulfito de sódio (redutor), respectivamente, B é a intensidade de

fluorescência da amostra contendo o padrão da vitamina, CS a concentração do

padrão, V o volume da amostra usada na medida de fluorescência, DF o factor

de diluição e WT o peso da amostra.

Os minerais são os constituintes que permanecem, sob a forma de

cinzas, após a combustão de tecidos vegetais e animais. Podem ser divididos

em elementos essenciais, microelementos e ultra-microelementos. Os

elementos essenciais são Na, K, Ca, Mg, Cl e P e possuem essa designação

devido a serem necessários na dieta humana em teores superiores a 50 mg/dia.

Os microelementos (Fe, I, F, Zn, Se, Cu, Mn, Cr, Mo, Co, Ni) são necessários

em concentrações inferiores a 50 mg/dia. O seu papel biológico é variado (em

vitaminas, enzimas e outras proteínas) e a sua deficiência resulta em problemas

metabólicos.

A deficiência nos elementos Al, As, Ba, Bi, B, Br, Cd, Cs, Ge, Hg, Li, Pb,

Rb, Sb, Si, Sm, Sn, Sr, Tl, Ti e W parece estar associada a alguns problemas de

saúde, mas não estando completamente estabelecidas relações causa/efeito

nem as dosagens requeridas, sabendo-se apenas serem muito baixas.

Os elementos essenciais e os microelementos exibem diversas actividades,

como sejam eléctrólitos, constituintes de enzimas e constituintes estruturais de

ossos e dentes.

Os teores em minerais nos alimentos variam durante o seu processamento

e a sua absorção pelo organismo depende da presença de outros compostos

(proteínas, péptidos, aminoácidos, polissacáridos, açúcares, lenhina, fitina e

ácidos orgânicos) que a eles se ligam, aumentando ou reduzindo a sua

absorção.

A análise de minerais em alimentos pode ser feita por diversos processos,

sendo em geral necessário extrair os minerais previamente da amostra. Um dos

principais problemas existentes, na preparação de uma amostra para análise de

minerais, é a existência de contaminação causada pelo equipamento, pelo que

deverão, sempre que possível, ser utilizados materiais não metálicos.

O ligando etilenodiaminatetraacetato (EDTA) forma complexos com

diversos iões minerais, permitindo a sua utilização em titulações

complexométricas para análise de minerais. Os pontos finais das titulações

podem ser determinados usando outros quelantes, com constantes de

Page 89: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

85

coordenação menores que o EDTA (menor afinidade para os iões) e que

originam cores diferentes nos estados livre e complexado.

Fig. 11.3 – Complexo formado entre Ca2+ e EDTA.

A principal aplicação deste método é na análise de cálcio e magnésio para

determinação da dureza da água, mas também é utilizado para determinar o

teor de cálcio em vegetais e outros alimentos em que os teores de magnésio e

fósforo são baixos.

A titulação por precipitação está na origem de métodos utilizados pela

indústria alimentar na determinação de minerais.

O método de Mohr para determinação de cloretos é um deles e baseia-se

na formação de um sólido de cor laranja (cromato de prata) após o ião prata,

proveniente do nitrato de prata adicionado, ter complexado todo o cloreto

disponível.

Ag+ + Cl- ɹ AgCl (11.7)

2Ag+ + CrO4

2- ɹ Ag2CrO4 (11.8)

Fig. 11.4 – Método de Mohr. Titulação antes (esquerda) e após

(direita) a formação do precipitado.

Uma das aplicações do método de Mohr é na determinação de sal em

alimentos.

Page 90: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

86

No método de Volhard, um excesso de uma solução padrão de nitrato de

prata é adicionada a uma solução de uma amostra contendo cloreto. O excesso

de prata é depois titulado com uma solução padrão de tiocianato de potássio ou

amónio, usando Fe3+ como indicador. FeSCN é vermelho, permitindo identificar

a existência de SCN- não ligado a Ag+. A quantidade de prata, que precipita

com o cloreto presente na solução da amostra, é calculada por subtracção do

excesso de prata do total originalmente adicionado.

Ag+ + Cl- ɹ AgCl (11.9)

Ag+ + SCN- ɹ AgSCN (11.10)

SCN- + Fe3+ ɹ FeSCN (11.11)

A reacção 11.10 permite determinar a quantidade de prata não

complexada com o cloreto.

Os métodos colorimétricos utilizam compostos que, após reacção com a

substância a determinar, formam produtos coloridos. Existem vários destes

compostos capazes de reagir selectivamente com diversos minerais. O produto

de reacção colorido é solúvel e pode ser quantificado por espectroscopia de

absorção electrónica, utilizando a lei de Lambert-Beer. A quantificação é

habitualmente efectuada com recurso a uma curva de calibração feita com

padrões.

De modo a ter o mineral livre de interferentes, é necessário proceder a

uma prévia incineração da amostra, obtendo assim as suas cinzas, a partir das

quais se solubiliza o mineral a determinar.

Os métodos colorimétricos são geralmente muito específicos, podendo ser

executados sem separação dos diversos minerais existentes nas cinzas e, em

muitos casos, permitem obter uma precisão semelhante à da absorção atómica.

Foram desenvolvidos diversos eléctrodos para medidas selectivas de

vários aniões e catiões (brometo, cálcio, cloreto, fluoreto, potássio, sódio e

sulfito). Estes eléctrodos selectivos de iões permitem determinar a actividade

iónica, a qual pode ser considerada próxima da concentração dos iões medidos.

Esta aproximação só é válida em condições de baixas concentrações e força

iónica controlada.

A relação entre a actividade iónica e a concentração é dada por

A = C (11.12)

Page 91: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

87

O coeficiente de actividade () varia em função da força iónica, o que justifica a

utilização de tampões para ajuste da força iónica nas amostras e nos padrões.

A eficácia destes eléctrodos é afectada pela presença de interferentes,

sobretudo por iões com carga e tamanho semelhantes aos que se pretende

determinar. Como também a temperatura afecta a resposta dos eléctrodos, é

necessário trabalhar a temperatura constante.

A concentração do ião de interesse pode ser calculada através de uma

curva de calibração, da adição de um padrão ou por determinação do ponto

final de uma titulação. O método de adição de padrão é usado quando existe

um número pequeno de amostras, não permitindo o desenvolvimento de uma

curva de calibração. Os eléctrodos selectivos podem ser usados para determinar

o ponto final de uma titulação, usando compostos que formam precipitados ou

complexos fortes com o ião a analisar.

Define-se como cinza o resíduo inorgânico que resulta da combustão ou

total oxidação da matéria orgânica de um alimento. Existem dois tipos de

procedimentos para análise de cinzas, o método das cinzas secas, usado

sobretudo para determinação do teor em cinzas e análise de alguns minerais

específicos e o método das cinzas húmidas (oxidação) que serve de preparação

para a análise de diversos minerais. Os alimentos secos não requerem qualquer

preparação prévia, mas os restantes necessitam uma secagem antes da

obtenção das suas cinzas. Os alimentos ricos em gordura poderão ter que

sofrer uma prévia extracção de lípidos, para além da secagem.

As cinzas secas são obtidas numa mufla capaz de atingir 500 – 600 ºC. A

água e os compostos voláteis são vaporizados e os compostos orgânicos

degradados, na presença de oxigénio do ar, a CO2 e óxidos de azoto. A maioria

dos minerais é convertida em óxidos, sulfatos, fosfatos, cloretos e silicatos.

Alguns elementos (Fe, Se, Pb e Hg) podem ser parcialmente volatilizados, pelo

que este método não é adequado se se pretende analisar os componentes

individuais de uma amostra.

Para determinar a composição mineral de um alimento recorre-se ao

método das cinzas húmidas. Neste método, as substâncias orgânicas são

oxidadas por ácidos, agentes oxidantes ou combinações de ambos. Os minerais

são solubilizados sem volatilização.

As amostras podem provir de outras determinações que necessitam de

usar material seco. A maioria do material vegetal deverá ser seco em duas

etapas, primeiro a 55 ºC e depois a uma temperatura superior, de modo a

impedir a interferência da lenhina. Se as amostras vegetais tiverem um teor de

humidade inferior a 15% não é necessário secá-las previamente.

Page 92: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

88

Alguns alimentos requerem tratamentos adicionais, antes da obtenção das

cinzas, devido a terem elevados teores de gordura ou humidade (salpicos,

dilatação) ou açúcares (formação de espuma) o que impede a perca de

amostra. Carnes, açúcares e compotas deverão ser secos num banho de vapor

ou com uma lâmpada de infra-vermelhos. Adicionam-se uma ou duas gostas de

azeite (que não produz cinzas) para permitir a saída de vapor à medida que se

vai formando uma crosta na amostra.

As cinzas secas são obtidas por incineração a 525 ºC ou mais, existindo

diversos tipos de recipientes para o efeito. A escolha do material de que estes

são feitos depende da natureza da amostra. Os de quartzo são resistentes a

ácidos e halogéneos, mas não a bases, a temperaturas elevadas. Os de Vycor

são estáveis a 900 ºC, mas os de Pyrex apenas até 500 ºC. Recipientes de

porcelana possuem propriedades semelhantes às dos de quartzo, mas tendem

a quebrar com variações bruscas de temperatura. Devido ao seu baixo preço,

são frequentemente os escolhidos. Os recipientes de aço são resistentes a

ácidos e a bases e são baratos, mas podem originar contaminações com crómio

e níquel. A platina é provavelmente o melhor material, mas é muito cara.

Existem também recipientes descartáveis, de fibra de quartzo, os quais

suportam temperaturas até 1000 ºC e, sendo porosos, permitem rápidos

aquecimento e arrefecimento.

Após incineração, os recipientes devem ser arrefecidos num exsicador,

antes de pesados. O teor em cinzas será calculado a partir de:

peso após incineração - peso do cadinho% cinza = x 100

peso da amostra x coeficiente de matéria seca (11.13)

em que:

% sólidoscoeficiente de matéria seca =

100 (11.14)

No método das cinzas húmidas, não existe um único ácido capaz de,

completa e rapidamente, oxidar um material orgânico. É frequente utilizar

combinações de ácidos: nítrico, sulfúrico/peróxido de hidrogénio, perclórico.

São usadas diferentes combinações para diferentes tipos de amostra. Como o

ácido perclórico, embora muito eficaz, é de utilização mais perigosa, existe uma

tendência para substituí-lo.

Quer o método das cinzas secas, quer o das cinzas húmidas podem ser

realizados em aparelhos de micro-ondas, reduzindo o tempo de preparação de

amostra a alguns minutos. A obtenção de cinzas húmidas pode ser feita em

recipiente aberto ou fechado, sendo que neste último podem ser aplicadas

Page 93: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

89

pressão e temperatura elevadas, o que aumenta a eficácia do sistema.

Concretamente, pode ser utilizado apenas ácido nítrico para a digestão,

tornando o processo mais seguro.

As muflas por micro-ondas, usadas para obtenção de cinzas secas, são

muito mais rápidas que as muflas convencionais (até 97% mais rápidas) já que

conseguem operar a temperaturas até 1200 ºC.

Para além das cinzas secas e húmidas, existem outros tipos de métodos

com cinzas aplicáveis à análise de alimentos:

cinzas solúveis e insolúveis, aplicadas a frutos;

cinzas insolúveis em ácido, para determinação de contaminantes

insolúveis em ácido;

alcalinidade das cinzas, para distinguir entre cinzas de frutos e

legumes (alcalinas) e de carnes e alguns cereais (ácidas);

cinzas sulfatadas, aplicadas a açúcares, xaropes e corantes.

Page 94: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

90

Capítulo 12

Aditivos Alimentares

Aditivos alimentares são substâncias adicionadas, em pequenas

quantidades, aos alimentos, intervindo na sua produção, processamento,

embalagem e/ou armazenamento. Habitualmente, os aditivos ou as substâncias

resultantes da sua degradação permanecem nos alimentos, embora por vezes

sejam removidos durante o processamento.

Podem usar-se aditivos para:

alterar o valor nutritivo de um alimento – vitaminas, minerais,

aminoácidos e seus derivados, mas também espessantes,

emulsificantes, edulcorantes, etc. para certos tipos de dietas;

alterar as propriedades sensoriais de um alimento – corantes,

aromatizantes e potenciadores de sabor são usados para corrigir

percas sensoriais durante o processamento e armazenamento dos

alimentos. Estabilizantes, antioxidantes e outros compostos

também podem ser usados para impedir essas percas;

aumentar o tempo de prateleira de um alimento – aditivos para

proteger contra a degradação microbiana e agentes que impedem

ou retardam alterações químicas ou físicas, tais como reguladores

de pH e espessantes;

alterar o valor prático de um alimento – compostos usados para

permitir a produção de alimentos de preparação culinária mais fácil

e mais rápida.

Os aditivos alimentares e os seus produtos de degradação não poderão

ser tóxicos nas concentrações em que são utilizados. A sua utilização é

regulamentada, embora essa regulamentação varie um pouco de país para

país. No entanto, há correntemente um esforço de harmonização internacional,

baseada simultaneamente nos conhecimentos de toxicologia e nas

necessidades tecnológicas modernas.

Na Europa, é atribuído um nº E aos aditivos alimentares aprovados. Essa

aprovação é atribuída apenas após uma avaliação da segurança do aditivo nas

condições de utilização pretendidas.

Page 95: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

91

São apresentadas de seguida algumas das principais propriedades dos

aditivos alimentares.

12.1 Potenciadores de sabor

São compostos que intensificam o aroma de um alimento, embora eles

próprios não exibam aroma nem gosto, nas concentrações utilizadas. O seu

efeito é intensificar e acelerar a percepção do aroma.

Encontram-se neste grupo aditivos como o glutamato monosódico e o

maltol.

12.2 Substitutos do açúcar

Encontram-se neste grupo as substâncias que são usadas como

edulcorantes, mas que são metabolizados sem a influência da insulina. Alguns

exemplos são os álcoois de açúcar ou polióis, sorbitol, xilitol e manitol.

12.3 Edulcorantes

São compostos naturais ou sintéticos que transmitem uma sensação de

doçura, possuindo pouco ou nenhum valor nutricional. Não se incluem neste

grupo os hidratos de carbono.

12.4 Conservantes

São sobretudo compostos com actividade antimicrobiana, cujo uso se

destina a substituir ou complementar processos físicos de eliminação da

microflora contaminante dos alimentos. Tem havido pouca evolução nas

substâncias utilizadas, pois é difícil encontrar compostos simultaneamente com

largo espectro antimicrobiano, baixa toxicidade e custo razoável. A maioria

destes são ácidos fracos, como os ácidos sórbico, benzóico, propiónico e acético

e seus derivados. Também utilizados para este efeito são o SO2 e os sulfitos,

nitritos e nitratos.

12.5 Antioxidantes

A oxidação lipídica pode ser retardada pela remoção do oxigénio ou pela

adição de antioxidantes. Estes são, na maioria, compostos fenólicos (naturais

ou sintéticos) e são mais eficazes se usados em simultâneo com um agente

quelante. Os antioxidantes mais importantes são os tocoferóis, ésteres do ácido

ascórbico, ésteres do ácido gálico, BHT (butilhidroxitolueno) e BHA

(butilhidroxianisole). Os agentes quelantes contribuem para a estabilização das

Page 96: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

92

cores, aromas e texturas, devido à sua capacidade para se ligarem a iões

metálicos, os quais actuam como catalisadores da oxidação de gorduras.

Diversos constituintes dos alimentos possuem essa capacidade, tais como os

ácidos carboxílicos e polifosfóricos, os aminoácidos, péptidos, proteínas e

porfirinas.

12.6 Agentes tensioactivos

Os agentes tensioactivos, naturais e sintéticos, são usados no

processamento de alimentos quando é necessária a redução da sua tensão

superficial, como por exemplo na produção e estabilização de dispersões. Estas

dispersões incluem emulsões, espumas, aerossóis e suspensões. Em todos os

casos existem duas fases distintas, uma externa e contínua e outra interna e

descontínua, a fase dispersa.

12.7 Substitutos de gorduras

Compostos que se destinam a substituir as gorduras tradicionais, devido

ao elevado valor energético destas. No entanto, nenhum dos substitutos

consegue preencher todas as funções das gorduras. Os substitutos podem ser

divididos em dois grupos, os naturais (miméticos das gorduras) e os sintéticos

(substitutos das gorduras).

Reduzindo o tamanho de partícula das proteínas a 0.1 – 3 m dá-lhes

uma textura cremosa, permitindo a sua utilização na substituição de gorduras

em alimentos que não requeiram exposição a temperaturas elevadas (gelados,

sobremesas, etc.).

Alguns oligossacáridos, que se dissolvem completamente em água quente,

podem ser obtidos a partir do amido. Após arrefecimento destas soluções,

obtém-se um gel, cuja textura é semelhante à dos óleos alimentares, podendo

ser usados como substitutos da gordura em margarinas, por exemplo.

12.8 Espessantes, gelificantes e estabilizantes

Diversos polissacáridos e seus derivados provocam um aumento de

viscosidade, a formação de géis e a estabilização de emulsões, espumas e

suspensões. Estes compostos também são inibidores da cristalização (produtos

de confeitaria, gelados, etc.) e são usados para encapsular aromas, em

alimentos desidratados.

A gelatina é uma proteína com actividade gelificante, usada em diversos

alimentos.

Page 97: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

93

12.9 Humectantes

Alguns polióis, como o glicerol e o sorbitol, possuem propriedades

higroscópicas específicas, o que possibilita a sua utilização como humectantes,

isto é agentes que retêm a textura e suavidade de um alimento, impedindo

também a cristalização.

Page 98: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

94

Capítulo 13

Contaminantes Alimentares

Os alimentos podem sofrer contaminação por compostos tóxicos de

diversas proveniências:

Poluentes derivados da queima de combustíveis fósseis, de

radionuclídeos ou de emissões originadas em processos industriais

(microelementos tóxicos, PAHs, dioxinas, etc.).

Componentes do material de embalagem, detergentes,

desinfectantes, etc.

Metabolitos tóxicos produzidos por microrganismos.

Resíduos de produtos usados na protecção de culturas.

Resíduos originados na criação de aves e de gado (medicamentos e

aditivos usados em rações).

Outros contaminantes podem ser formados no próprio alimento ou no

aparelho digestivo, devido a reacções de alguns ingredientes e aditivos

alimentares, caso das nitrosaminas.

Entre os contaminantes mais relevantes contam-se os microelementos

arsénico, mercúrio, chumbo e cádmio. Relativamente aos radionuclídeos, os

radioisótopos 137Cs e 90Sr contam-se entre os mais perigosos.

A actividade tóxica microbiana é atribuída às enterotoxinas produzidas por

bactérias. Estes compostos são maioritariamente proteínas com actividade

antigénica e muito venenosas. Contam-se entre estas as toxinas produzidas por

Clostridium botulinum, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus.

Também os fungos produzem toxinas alimentares, designadas por

micotoxinas. As mais estudadas e tóxicas são as aflatoxinas produzidas pelo

género Aspergillus spp. A aflatoxina B1 é o mais forte carcinogénico conhecido.

Estas toxinas provêm principalmente dos frutos e frutos secos, sendo os

pistachios uma das fontes mais importantes.

Os produtos utilizados na protecção de culturas compreendem os

herbicidas, fungicidas e insecticidas, mas também outros pesticidas menos

frequentemente utilizados e ainda os reguladores do crescimento das plantas.

Page 99: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

95

Os alimentos de origem vegetal podem ser directamente contaminados

devido ao tratamento das plantas ou por absorção a partir do solo, a partir da

atmosfera ou a partir de locais de armazenamento previamente tratados. Os

alimentos de origem animal são contaminados devido a ingestão, por parte do

animal, de alimentos contendo agentes de limpeza ou por contacto dos animais

com materiais tratados, com medicamentos ou por ingestão de rações contendo

material vegetal desinfectado.

Fig. 13.1 – Estrutura da aflatoxina B1, produzida por Aspergillus

spp.

Diversos medicamentos, como antibióticos, antihelmínticos e

coccidiostáticos são habitualmente usados no tratamento de animais, podendo

esse uso resultar em contaminação alimentar.

Os bifenilos policlorados (PCBs) são misturas complexas de substâncias

usadas em diversas indústrias que, devido à sua ampla utilização, entram em

contacto com os alimentos. Sendo muito persistentes e lipossolúveis tendem a

acumular em alimentos gordos. Acresce que estes compostos podem produzir,

por combustão, dioxinas fortemente tóxicas. Devido a estes factos, a sua

produção e aplicação encontram-se interditas.

A queima de matéria orgânica como madeira, óleo ou carvão resulta em

reacções de pirólise e na formação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(PAHs), com efeito carcinogénico. Estes compostos podem contaminar os

alimentos, quer através dos processos de preparação dos mesmos, quer

através de transporte pela atmosfera. Sendo compostos lipossolúveis, tendem a

acumular em tecidos gordos.

O nitrato provém principalmente dos alimentos de origem vegetal, mas

também de alguma carne e peixe, enquanto que o nitrito é originário,

sobretudo, de carne e produtos cárneos curados. A toxicidade do nitrato deriva

da sua oxidação a nitrito, causada por bactérias.

As nitrosaminas e nitrosamidas são potentes carcinogénicos, provenientes

de alimentos curados ou sujeitos a temperaturas elevadas.

Page 100: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

96

As dioxinas, dibenzo-p-dioxinas policloradas e dibenzofuranos policlorados,

ocorrem associados a diversos produtos clorados e bromados. Também podem

ser formadas por processos térmicos, na presença de compostos halogenados.

São compostos que se concentram na fase gorda dos alimentos (ex. leite) e de

toxicidade variável.

Existem diversos métodos analíticos para determinação de resíduos de

pesticidas, podendo ser quantitativos (resíduo único ou multi-resíduos), semi-

-quantitativos ou ainda qualitativos (Tabela 13.1).

Tabela 13.1

Quantitativo Semi-quantitativo ou qualitativo

Multi-resíduos GC TLC HPLC Inibição enzimática

Resíduo único GC HPLC Ensaios imunológicos

Os métodos multi-resíduos são usados para detectar e medir diversos

resíduos numa variedade de alimentos. São suficientemente rigorosos para

permitir boas estimativas de teores de resíduos para muitos pesticidas, aos

níveis (ou mesmo abaixo) legalmente permitidos.

Estes métodos utilizam passos de preparação da amostra, extracção,

eliminação de interferentes (cleanup), separação cromatográfica e quantificação

com a ajuda de detectores muito selectivos. Nenhum destes métodos é capaz

de detectar todos os resíduos de pesticidas em todos os tipos de plantas. Na

prática, representam um compromisso entre o número de resíduos que podem

ser detectados, a gama de alimentos em que podem ser empregues e os níveis

de resíduos que podem ser medidos.

Os métodos de resíduo único envolvem os mesmos passos que os para

multi-resíduos, mas com cada passo optimizado para o resíduo de interesse. O

seu objectivo é medir um único analito e, frequentemente, os seus principais

metabolitos e produtos de transformação com importância toxicológica.

Os métodos quantitativos seguem os passos gerais de preparação da

amostra, extracção, eliminação de impurezas, separação, detecção e

quantificação. A escolha do método a utilizar depende das propriedades da

amostra e do analito de interesse e dos equipamentos analíticos disponíveis. É

conveniente dividir os alimentos em quatro grupos, segundo os seus teores em

gordura e humidade: 1) humidade elevada, gordura baixa (frutos e legumes);

Page 101: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

97

2) humidade e gordura elevadas (carnes); 3) humidade e gordura baixas

(frutos secos); 4) humidade baixa, gordura elevada (grãos de cacau).

Os pesticidas encontram-se distribuídos à superfície das plantas, de um

modo não uniforme. Os frutos e legumes frescos não devem ser lavados antes

da análise e apenas deverão ser removidas as partes externas danificadas.

Quando as partes externas dos vegetais não são habitualmente consumidas,

estas são removidas antes da análise. Deve ter-se cuidado com alguns

pesticidas que podem ser degradados pela trituração ou pela maceração da

amostra, durante a sua preparação.

A extracção é habitualmente feita com um solvente orgânico (acetonitrilo

ou acetona) sendo adicionado um sal anidro (NaCl ou Na2SO4) para absorver

água. Noutros casos, pode ser adicionada uma pequena quantidade de água

para facilitar a purificação do extracto numa subsequente partição contra outro

solvente orgânico. No final, o solvente é separado da fracção sólida por

filtração.

O extracto obtido é, frequentemente, submetido a uma purificação parcial

(cleanup) antes dos passos de separação e quantificação. Neste passo tenta

eliminar-se os interferentes, podendo usar-se métodos cromatográficos

(adsorção ou exclusão molecular). Mais recentemente, foram introduzidas

técnicas alternativas, com menor consumo de solventes e uma maior rapidez de

execução. A extracção em fase sólida (SPE) usa uma pequena quantidade de

um material de empacotamento, contido em pequenas colunas ou em discos, o

qual permite purificar, concentrar ou derivatizar os analitos antes do passo de

separação cromatográfica. A microextracção em fase sólida (SPME) envolve a

utilização de uma fibra revestida com um polímero adsorvente, a qual é imersa

num extracto aquoso ou colocada no espaço de cabeça de um recipiente

contendo a amostra, de modo que os analitos difundem para o revestimento da

fibra. Após atingir o equilíbrio, a fibra é transferida para o injector de um GC e

os analitos sofrem uma desorção térmica para o interior da coluna. A extracção

com solvente assistida por micro-ondas também permite reduzir o tempo de

extracção e a quantidade de solvente utilizada. Tal deve-se à utilização de

temperaturas superiores aos pontos de ebulição dos solventes. A extracção

acelerada com solventes utiliza pequenas quantidades de solventes

convencionais a temperatura e/ou pressão elevadas.

Por vezes é útil ou necessário derivatizar os analitos para facilitar a sua

separação e detecção. Esta derivatização é habitualmente efectuada antes da

entrada na coluna cromatográfica (derivatização pré-coluna) mas pode também

ser feita após saída da coluna (derivatização pós-coluna). Esta técnica tem

Page 102: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

98

aplicação limitada aos métodos de resíduo único ou àqueles que determinam

um pequeno grupo de resíduos com estrutura química semelhante.

A cromatografia gasosa é a técnica mais utilizada para separação e

determinação de pesticidas. Existem processos descritos para colunas de

empacotamento e capilares, bem como para colunas megabore, as quais

possuem características intermédias entre as de empacotamento e as capilares.

A maioria dos pesticidas contém heteroátomos (outros que não C, H e O) na

sua estrutura, o que é explorado pelos detectores que respondem a esses

átomos: de chama (FID) para detecção de S e P, de captura electrónica (ECD)

e de condutividade para halogéneos, S e N, térmiónico (TID) para N e P. A

espectrometria de massa (MS) é um método fortemente selectivo para

identificação e quantificação de pesticidas.

Os componentes separados em GC são comparados com padrões, com

base nos respectivos tempos de retenção e frequentemente os seus tempos de

retenção são referidos relativamente ao do padrão interno, clorpirifos. Este

composto contém átomos de P, S, N e Cl, para além de C, H e O, o que permite

a sua detecção em todos os detectores usados em GC.

Fig. 13.2 – Estrutura do pesticida clorpirifos.

A aplicação de cromatografia HPLC à análise de pesticidas restringe-se aos

analitos que não são suficientemente voláteis ou não possuem estabilidade

térmica que lhes permita ser analisados por GC. Uma vantagem desta técnica é

a não necessidade de um passo de eliminação de interferentes tão extenso. A

detecção é normalmente feita por absorção electrónica ou por fluorescência. Os

compostos que não são naturalmente fluorescentes, são derivatizados, quer pré

quer pós-coluna.

Os ensaios imunológicos utilizam anticorpos com elevadas afinidade e

especificidade para o pesticida a analisar. Estes métodos são simples, rápidos e

relativamente baratos e têm aplicação analítica se a interacção entre o

anticorpo e o pesticida puder ser detectada e, preferivelmente, quantificada.

Uma das principais desvantagens dos ensaios imunológicos relaciona-se com o

carácter não polar dos pesticidas, que os tornam pouco solúveis nos tampões

aquosos habitualmente enpregues nestes ensaios.

Page 103: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

99

As análises semi-quantitativas e qualitativas são, em geral, capazes de

detectar um número limitado de resíduos de pesticidas semelhantes entre si.

São também designados por métodos de varrimento, já que são capazes de

analisar um grande número de amostras, num tempo relativamente curto.

Enquanto os métodos semi-quantitativos permitem uma estimativa de uma

gama de concentrações para um resíduo, os métodos qualitativos detectam a

presença de um resíduo acima de determinado valor. Estes são métodos

rápidos, simples e baratos, que utilizam sobretudo as técnicas de TLC, inibição

enzimática e ensaios imunológicos.

Apesar das suas limitações, a cromatografia em camada fina (TLC) é

usada como método semi-quantitativo de varrimento para um grupo limitado de

pesticidas. Uma melhoria na capacidade de resolução pode ser conseguida por

HPTLC.

A obtenção de uma amostra representativa da distribuição de micotoxinas

num alimento é particularmente difícil. Os métodos analíticos empregues para a

sua análise podem ser quantitativos ou de varrimento. Os métodos não

quantitativos incluem o uso de mini-colunas e de TLC.

As mini-colunas tiram partido da fluorescência natural das aflatoxinas

zearalenona e ocratoxina A. São usadas pequenas colunas cromatográficas em

vidro (diâmetro interno de 4 – 6 mm) contendo diversas substâncias

adsorventes, disponíveis comercialmente, capazes de detectar as citadas

micotoxinas. Após um passo inicial de cleanup, o extracto é adicionado ao topo

da coluna e depois eluído com diversos solventes. No passo final, o analito é

eluído da camada superior do adsorvente para um nível inferior contendo

Florisil®. Quando submetido a uma luz de 365 nm, o analito exibe

fluorescência.

A utilização preliminar de placas de TLC permite a análise simultânea de

várias amostras. A utilização de TLC em duas dimensões permite a obtenção de

resultados de maior confiança, mas com uma redução na quantidade de

amostras analisadas por placa.

Os métodos quantitativos para análise de micotoxinas seguem os mesmos

passos gerais que os indicados para os pesticidas, com pequenas diferenças. A

técnica mais popular para separação de micotoxinas é o HPLC e a maioria

destes compostos é detectada por espectroscopia de absorção electrónica ou

de fluorescência.

Os métodos bioquímicos usados para determinação de micotoxinas têm

sofrido grandes desenvolvimentos, existindo actualmente processos de análise

Page 104: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

100

para diversos destes contaminantes que recorrem a ensaios rádio-imunológicos

(RIA) e a ensaios imunoenzimáticos (ELISA).

Fig. 13.3 – Análise de aflatoxinas por TLC.

Uma técnica mais recente, para o isolamento de aflatoxinas a partir de

matrizes biológicas, faz uso de anticorpos ligados covalentemente a uma matriz

de agarose, contida numa coluna descartável de plástico. O material de

empacotamento da coluna adsorve selectivamente as aflatoxinas, sendo estas

depois libertadas da coluna com a ajuda de um solvente orgânico polar. Este

método de cromatografia de imunoafinidade com anticorpos monoclonais

permite um cleanup mais eficaz que os métodos mais tradicionais.

Fig. 13.4 – Esquema ilustrativo de um ensaio rádio-imunológico.

Page 105: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

101

Fig. 13.5 – Cromatograia de imunoafinidade com anticorpos

monoclonais, aplicada ao isolamento de micotoxinas.

O crescimento de microrganismos, num meio de cultura transparente,

pode ser seguido pelo aumento da turvação do meio ou, em alternativa, se

colocado num meio de cultura sólido, forma-se uma zona de inibição de

crescimento ao redor do agente inibidor de crescimento. Esta é uma forma

comum de detecção de agentes inibidores em alimentos.

Fig. 13.6 – Ensaio de inibição de crescimento microbiano.

As determinações quantitativas de resíduos de medicamentos seguem

também os passos de preparação de amostra e isolamento dos analitos de

interesse indicados para os outros contaminantes atrás mencionados. O método

mais utilizado para a separação e quantificação de resíduos de medicamentos é

a cromatografia em HPLC. Este método tem a vantagem de não exigir uma

preparação de amostra muito complexa. Actualmente, existem alguns

procedimentos capazes de analisar resíduos múltiplos de antibióticos.

Page 106: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

102

Capítulo 14

Aromas

As substâncias com aroma são compostos voláteis reconhecidos pelos

receptores olfactivos. Estão referenciados mais de 7000 compostos voláteis em

cerca de 450 alimentos, mas apenas um pequeno número destes (5%) é

relevante para o aroma. Aqueles cuja concentração está abaixo do limiar

sensorial de percepção não são reconhecidos como aromas.

Podem existir alterações aos aromas dos alimentos causadas por reacções

enzimáticas ou não enzimáticas. Alterações não enzimáticas de aromas, à

temperatura ambiente, apenas se verificam após armazenamento prolongado

do alimento. Essa alteração deve-se à peroxidação lipídica, à reacção de

Maillard e à degradação de aminoácidos (degradação de Strecker) com ela

relacionada. Estes processos são acelerados durante o processamento térmico

dos alimentos.

Os compostos voláteis mais relevantes formados por reacções não

enzimáticas são carbonilos, piranonas, furanonas, tióis, tioéteres, dissulfuretos

e trissulfuretos, tiazóis, pirróis, piridinas, pirazinas, aminas e fenóis.

Fig. 14.1 – Estruturas de uma piranona (1) e de uma furanona

(2), compostos formados por reacções não

enzimáticas.

Outros aromas podem ser formados a partir de reacções enzimáticas

originadas na alteração dos tecidos do alimento (corte ou trituração de frutos e

vegetais, por exemplo). Também existem aromas formados por intervenção

indirecta de proteínas, como nos casos de formação de aminoácidos por

hidrólise de proteínas ou formação de açúcares a partir de polissacáridos. Estes

compostos são depois convertidos em voláteis por reacções não enzimáticas. O

1 2

Page 107: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

103

pão, a cerveja e o chá são exemplos de alimentos em que ocorre este

fenómeno.

Fig. 14.2 – Estruturas de um tiazole (1) e de uma pirazina (2),

compostos formados por reacções não enzimáticas.

Entre os compostos mais importantes formados por via enzimática

contam-se os carbonilos, álcoois, hidrocarbonetos, ésteres, lactonas, terpenos,

compostos sulfurados, pirazinas, escatol e p-cresol.

Fig. 14.3 – Estruturas de um terpeno (1) e do escatol (2),

compostos formados por reacções enzimáticas.

Aromas defeituosos podem provir de susbtâncias estranhas ao alimento,

por perca de compostos voléteis relevantes, ou alterações nas concentrações

relativas dos compostos voláteis.

A intensidade e qualidade dos aromas depende também da interacção

com outros constituintes dos alimentos, nomeadamente lípidos, proteínas e

hidratos de carbono.

Aditivos aromatizantes, naturais e sintéticos, têm sido utilizados com os

objectivos de substituir aromas naturais caros ou pouco intensos e de

compensar as percas de aromas verificadas durante o processamento dos

alimentos.

Entre os aditivos naturais, a larga maioria provém de material vegetal, nas

formas de óleos essenciais, extractos e destilados. Os compostos sintéticos

podem ser idênticos aos naturais, derivados dos naturais ou estritamente

sintéticos.

1 2

1 2

Page 108: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

104

Page 109: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

105

Capítulo 15

Técnicas de Separação

Para analisar compostos individuais numa mistura complexa é necessário

isolá-los e concentrá-los. Para esse efeito existem diversas técnicas, ditas

separativas. Estas técnicas exploram diferenças nas propriedades físico-

-químicas entre os diferentes componentes de uma mistura. As propriedades

mais úteis para essa finalidade são a volatilidade, solubilidade, carga, tamanho

da molécula, forma e polaridade.

A maioria das técnicas de separação depende da transferência selectiva de

materiais entre duas fases imiscíveis. As técnicas mais utilizadas e os sistemas

de fases a elas associados estão resumidos na tabela 15.1.

Tabela 15.1

Técnica Sistema de fases

Extracção por solventes Líquido-líquido Extracção em fase sólida Líquido-sólido Cromatografia gasosa Gás-líquido

Gás-sólido Cromatografia líquida Líquido-líquido

Líquido-sólido Cromatografia em camada fina Líquido-sólido

Líquido-líquido Cromatografia de permuta iónica Líquido-sólido Cromatografia de exclusão molecular Líquido-líquido Cromatografia com fluidos supercríticos

Fluido supercrítico-líquido ou sólido

Electroforese Líquido Electrocromatografia capilar Líquido-sólido

A extracção por solventes permite a transferência selectiva de materiais

em pequenas quantidades (g – g) entre duas fases líquidas imiscíveis,

baseada na diferença de solubilidades.

A separação pode ser efectuada em regime descontínuo, em âmpolas de

decantação, mas também em contínuo, utilizando um sistema de refluxo. O

primeiro é o método mais simples, em que as duas fases são agitadas na

âmpola, até se alcançar um equilíbrio e depois deixa-se em repouso até

Page 110: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

106

separação das fases. O soluto pode ser quantitativamente transferido numa

única extracção ou serem necessárias várias extracções.

Fig. 15.1 – Âmpola de decantação utilizada em extracção

descontínua por solventes.

Na extracção em contínuo, destila-se o solvente orgânico contido num

balão, seguindo-se a sua condensação e passagem através da fase aquosa,

regressando ao balão para ser reciclado.

Fig. 15.2 – Montagens para extracção em contínuo por solventes.

(a) Solvente mais leve que a água; (b) Solvente mais

pesado que a água.

A extracção por solventes é habitualmente utilizada para isolar uma

determinada espécie química, antes da sua quantificação e, menos

Page 111: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

107

frequentemente, para concentração de muito pequenas quantidades. A

aplicação mais vulgar é a concentração e determinação de metais e compostos

orgânicos. Outra das suas vantagens é a aplicabilidade a uma vasta gama de

amostras e concentrações. Uma das principais desvantagens é a necessidade

de utilizar elevadas quantidades de solventes orgânicos; outra desvantagem é

uma fraca resolução de misturas de substâncias orgânicas.

A extracção em fase sólida (SPE) é utilizada para transferir selectivamente

materiais em muito pequenas quantidades ( sub-g – mg) entre um sorvente

sólido e uma fase líquida. A eficiência da separação depende das diferentes

afinidades relativas para as duas fases, baseadas na adsorção, no tamanho ou

na carga do composto.

Esta técnica tem aplicação crescente numa purificação prévia da amostra

antes de uma análise cromatográfica e em pré-concentração de quantidades

diminutas de analitos. Tende a substituir, com vantagem, a extracção por

solventes.

A principal desvantagem da extracção em fase sólida prende-se com a

reduzida eficiência de algumas fases sólidas. O método alternativo,

microextracção em fase sólida, apresenta dificuldades de calibração e

replicabilidade.

A extracção em fase sólida pode ser executada em diversos suportes.

Entre os mais frequentemente utilizados contam-se os tubos de seringa de

polipropileno, nos quais o sorvente é retido por discos de polietileno.

Fig. 15.3 – Extracção em fase sólida, usando como suporte tubos

de seringa.

Page 112: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

108

Em alternativa podem usar-se discos de fibra de vidro ou PTFE, nos quais

estão embebidas as partículas de sorvente, ou ainda pontas de pipetas de

plástico, cheias com pequenas esferas de sorvente.

A extracção em fase sólida pode ser completa ou parcialmente

automatizada, de modo a aumentar a quantidade de amostras processadas,

mas também a precisão e o rigor.

Fig. 15.4 – Sistema automatizado para extracção em fase sólida.

A microextracção em fase sólida (SPME) é uma variante que permite a

determinação de quantidades reduzidas de analitos em amostras líquidas ou

gasosas, através da concentração destas em fibras ópticas revestidas com uma

camada de uma substância polimérica, usada como fase estacionária em

cromatografia gasosa. Deste modo, a fibra pode ser directamente inserida num

cromatógrafo gasoso.

Todas as técnicas cromatográficas têm por base o mesmo princípio: a

variação na velocidade de migração de diferentes componentes de uma

amostra, através de uma fase estacionária, sob a influência de uma fase móvel.

A velocidade de migração varia devido a diferenças nas razões de distribuição

entre as fases.

Durante uma separação cromatográfica, as moléculas do soluto movem-se

continuamente entre as fases móvel e estacionária. Enquanto permanecem na

fase móvel, são empurradas por esta, mas permanecem quase estacionárias

enquanto estão na fase estacionária. A velocidade de migração de cada soluto é

assim determinada pela proporção de tempo em que permanece na fase móvel.

As separações cromatográficas podem ser classificadas segundo quatro

diferentes mecanismos de sorção: adsorção à superfície, partição, permuta

iónica e exclusão.

Page 113: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

109

Fig. 15.5 – Princípio de funcionamento da microextracção em

fase sólida.

No mecanismo de adsorção à superfície, as polaridades relativas do soluto

e da fase estacionária sólida determinam a velocidade do movimento do soluto

através de uma coluna ou de uma superfície.

Se a fase estacionária for constituída por um suporte sólido inerte

revestido à superfície por um líquido, o movimento do soluto será determinado

apenas pela sua solubilidade relativa nas duas fases, ou pela sua volatilidade,

se a fase móvel fôr um gás. Este mecanismo é designado por partição.

Fig. 15.6 – Diagramas dos mecanismos de separação

cromatográfica por adsorção e por partição.

Page 114: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

110

Os mecanismos de adsorção e partição podem ocorrer em simultâneo,

sendo a contribuição de cada um deles determinada pelas naturezas das fases

estacionária e móvel, do suporte sólido e do soluto.

Na separação por permuta iónica, a fase estacionária é um polímero sólido

permeável, ao qual estão ligados grupos carregados e contra-iões móveis, os

quais podem permutar com os iões do soluto, transportados pela fase móvel.

O processo de exclusão não é um verdadeiro processo de sorção, pois os

solutos ficam permanentemente na fase móvel. A separação dá-se devido à

diferente difusão dos solutos através de uma fase estacionária inerte mas

porosa. Esta é habitualmente um gel, com pequenos poros, através dos quais

apenas moléculas pequenas conseguem passar, sendo retardadas no

atravessamento da coluna. Moléculas maiores são excluídas e atravessam

livremente a coluna.

Fig. 15.7 – Diagramas dos mecanismos de separação

cromatográfica por permuta iónica e por exclusão.

Um gráfico da concentração do soluto na fase móvel em função da sua

concentração na fase estacionária, a temperatura constante, deveria ser linear

e o perfil de concentração simétrico. Em sistemas não ideais ocorrem

distorções, designadas por tailing e fronting. A ocorrência destes efeitos é

indesejável, pois conduz a más separações e quantificações imprecisas. O

fenómeno de tailing tem tendênccia a ocorrer em processos de adsorção,

enquanto que o de fronting ocorre mais frequentemente em mecanismos de

partição. A causa mais frequente de ambos é uma sobrecarga da coluna com

amostra em excesso.

A velocidade de um soluto é dada pelo seu coeficiente de distribuição.

fase estacionária

fase móvel

CD

C (15.1)

Page 115: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

111

Este indica que, quanto maior D, mais lento será o progresso do soluto

através do sistema cromatográfico.

Fig. 15.8 – Isotermas de sorção e perfis de concentração em

cromatografia. (a) Isoterma linear; perfil Gaussiano.

(b) Isoterma curva; tailing. (c) Isoterma curva;

fronting.

Em cromatografia em coluna, mede-se o volume de retenção (VR) definido

como o volume que atravessa a coluna entre o momento de aplicação da

amostra no seu topo e a saída do soluto no outro extremo. VM é o volume de

fase móvel na coluna (designado por volume morto) e k é o factor de retenção,

directamente proporcional a D.

R M MV V kV (15.2)

Para um fluxo F constante de fase móvel

R RV Ft (15.3)

No caso de o fluxo ser conhecido, o tempo de retenção tR pode ser usado

como medida de VR.

Nas cromatografias em papel e em camada fina, o processo de separação

é parado numa fase em que os componentes separados ficam no suporte, sob

a forma de manchas. A velocidade do soluto pode ser medida pelo factor de

retenção, Rf.

distância percorrida pelo centro da mancha do soluto

distância percorrida pela frente da fase móvelfR (15.4)

Page 116: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

112

As distâncias são medidas a partir do ponto de aplicação da amostra. Rf

tem uma relação inversa com D.

Numa análise cromatográfica ideal, os componentes de uma mistura

deveriam estar completamente separados uns dos outros no mais curto período

de tempo possível. O desempenho de um processo cromatográfico pode ser

avaliado pela sua eficiência e resolução e pela assimetria dos picos.

A largura de uma banda ou pico é uma medida da eficiência do processo,

e a resolução é determinada pela capacidade de resolver picos de componentes

com valores de tR ou Rf semelhantes.

Fig. 15.9 – Exemplo de um cromatograma e respectivos

parâmetros.

A eficiência da separação, numa coluna, está relacionada com o tempo de

retenção e a largura do pico e é dada pelo número de pratos teóricos, N. O

modelo dos pratos teóricos considera transferências sucessivas entre as quais

se estabelece um equilíbrio termodinâmico. Cada volume assim definido é um

prato teórico.

LN

H (15.5)

Page 117: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

113

Fig. 15.10 – Diagrama ilustrativo do modelo dos pratos teóricos.

Nesta equação, L é o comprimento da coluna e H a altura equivalente de

cada prato teórico. Considerando que um pico representa uma distribuição

aproximadamente Gaussiana, a eficiência pode ser dada por

2

16 rtNl

(15.6)

em que l representa a largura do pico na base. Alternativamente, como é

frequentemente mais fácil medir a largura a meio do pico, lh/2, pode usar-se a

equação 15.7 para determinar a eficiência.

2

2

5.54 r

h

tN

l

(15.7)

A resolução, RS, de uma coluna mede a capacidade de separar dois

solutos e é medida a partir do cromatograma, relacionando a separação entre

dois picos adjacentes com a média da sua largura.

2B A

r rs

A B

t tR

l l

(15.8)

Fig. 15.11 – Ilustração do conceito de resolução. WA e WB são as

larguras dos picos, correspondentes às notações lA e lB.

Page 118: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

114

É aceite que um valor de RS ≥ 1.5 é indicativo de uma boa separação.

A resolução de uma coluna pode também ser dada pela expressão 15.9,

em que N é o número de pratos teóricos para o segundo soluto, kB o seu factor

de retenção e o factor de separação, ou selectividade.

1

4 1

BS

B

kNR

k

(15.9)

' '

' '

B

A

r B

r A

t k

t k (15.10)

A largura de um pico é determinada pela difusão total do soluto, durante o

seu movimento através do sistema cromatográfico e pela velocidade de

transferência de massa entre as duas fases. Os dois efeitos são

interdependentes e complexos. Tratando-se de efeitos cinéticos , a sua

influência na eficiência é determinada pela velocidade da fase móvel através do

sistema.

Fig. 15.12 – Efeitos da difusão e transferência de massa na

largura do pico. (a) Perfis de concentração do soluto

no início da separação. (b) Perfis de concentração do

soluto após atravessar parte do sistema.

A chamada equação de van Deemter é usada para definir eficiência em

termos cinéticos. A é o termo anisotrópico, que traduz a existência de vários

trajectos possíveis e reflecte a homogeneidade da fase estacionária. O seu

efeito é minimizado pela redução do tamanho da partícula, mas aumenta com o

comprimento da coluna. u representa a velocidade linear da fase móvel. O

termo B/u representa a difusão longitudinal e reflecte a difusão das moléculas

de soluto na fase móvel, causada por gradientes locais de concentração. A

difusão através da fase estacionária também contribui para este termo, o qual

apenas é significativo para fluxos reduzidos e aumenta com o comprimento da

coluna. É um termo inversamente proporcional ao fluxo. C.u é o termo que

representa a transferência de massa e resulta do tempo que as moléculas de

Page 119: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

115

soluto demoram a deslocar-se entre as duas fases. Tem em conta os factos de

que: moléculas colocadas no centro do fluxo avançam mais rapidamente que as

restantes; a fase estacionária não tem uma forma regular, o que provoca

diferenças na retenção das moléculas. O efeito deste termo é mínimo para

pequenos diâmetros de partícula e aumenta com o fluxo e o comprimento da

coluna.

.B

H A C uu

(15.11)

Fig. 15.13 – Eficiência como função da velocidade da fase móvel e

efeito de cada termo da equação de van Deemter.

Da análise do gráfico da Fig. 15.13 pode concluir-se que: a separação é

máxima para H mínimo; B domina para u baixos e C domina para u elevados; a

difusão é muito menos significativa em cromatografia líquida (HPLC); A é

menor em cromatografia líquida, pelo que Hmin é cerca de 10 vezes menor que

em cromatografia gasosa e obtém-se para valores de u cerca de 10 vezes

inferiores; os picos tendem a alargar mais em cromatografia gasosa que em

cromatografia líquida.

O coeficiente de distribuição dos solutos, D, depende da temperatura, pelo

que a escolha da temperatura de operação tem um enorme efeito sobre a

separação cromatográfica. Um aumento na temperatura causa uma diminuição

em D e um correspondente decréscimo no tempo de retenção. Assim, um

aumento de temperatura torna a cromatografia mais rápida mas tal pode ter

como consequência uma pior resolução, pelo que terá sempre que se procurar

um compromisso entre ambos.

A eluição com gradiente é um procedimento em que as condições de

eluição da amostra variam progressivamente, de modo a acelerar o processo.

Para tal pode alterar-se a composição da fase móvel, aumentar a temperatura

Page 120: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

116

ou o fluxo. O efeito é uma mais rápida eluição dos componentes no final da

cromatografia e uma melhoria no perfil de eluição.

Na cromatografia em fase gasosa (GC), a separação dos componentes é

conseguida por vaporização da amostra numa fase móvel gasosa, através de

uma coluna contendo uma fase estacionária líquida (cromatografia gás-líquido)

ou sólida (cromatografia gás-sólido). Os componentes da amostra migram com

velocidades dependentes do ponto de ebulição, da solubilidade ou da adsorção.

Na cromatografia gás-líquido (GLC) o processo dominante é a partição,

enquanto na cromatografia gás-sólido, a adsorção é o principal processo de

separação. Em ambos os casos, as amostras terão que ser voláteis e

termicamente estáveis à temperatura de trabalho.

Fig. 15.14 – Diagrama de um cromatógrafo gasoso.

Os gases mais frequentemente utilizados na fase móvel são o azoto, hélio

e hidrogénio, sendo a escolha feita em função do tipo de coluna

(empacotamento ou capilar) utilizada, do preço e do detector utilizado. Hélio e

hidrogénio são preferidos para colunas capilares, já que se adaptam melhor a

fluxos mais elevados.

A introdução da amostra no cromatógrafo pode ser realizada por diversas

técnicas:

injecção em split – uma válvula desvia a maior parte da amostra

injectada para a atmosfera, passando apenas 2% ou menos para a

coluna. No caso de amostras com componentes tendo pontos de

ebulição muito diferentes, estes tendem a ser separados em

Page 121: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

117

diferentes proporções, o que constitui uma limitação da técnica.

Esta técnica de injecção só é aplicável quando não se pretende

uma sensibilidade elevada, já que a maioria da amostra não é

analisada.

injecção em splitless – amostra colocada no injector a uma

temperatura inferior ao ponto de ebulição do componente mais

volátil, sendo depois aquecida de modo a eluir sequencialmente os

componentes. A técnica só se aplica no caso de todos os

componentes da amostra possuirem pontos de ebulição

relativamente elevados.

injecção on-column – permite a introdução directa de amostras

líquidas muito pequenas no topo da coluna fria. Esta técnica reduz

o risco da decomposição de compostos termo-sensíveis.

Fig. 15.14 – Diagrama de um injector em split para coluna

capilar.

A coluna pode ser feita de aço inoxidável, vidro ou quartzo, tendo de 1 m

a 100 m de comprimento e um diâmetro interno entre 0.1 mm e 3 mm. A

coluna é colocada num forno, cuja temperatura pode ser controlada, operando

em condições isotérmicas (temperatura constante durante a separação) ou de

gradiente (temperatura sobe durante a separação).

As colunas de empacotamento são mais curtas e mais grossas e

fabricadas em aço inoxidável ou vidro. Em GLC são preenchidas com um sólido

Page 122: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

118

inerte e poroso, que serve de suporte a uma fase estacionária líquida ou semi-

-líquida. Para utilização em GSC, as colunas têm uma fase estacionária sólida.

Estas colunas são mais baratas que as capilares, mas possuem menor eficiência

de resolução.

Fig. 15.15 – Diagrama de um injector on-column.

Nas colunas capilares a fase estacionária líquida reveste ou está ligada à

parede interior do tubo de quartzo. O exterior da coluna pode ser revestido com

alumínio ou um polímero plástico, para protecção. A sua maior resolução é fruto

de um muito maior número de pratos teóricos.

O detector deverá responder a modificações na composição do gás que

emerge da coluna, à medida que os solutos vão eluindo. Um detector ideal

deveria: responder rapidamente à presença de um soluto; dar uma resposta

linear numa vasta gama de concentrações; possuir uma elevada sensibilidade;

ser estável. Apesar de existirem mais de doze tipos de detectores disponíveis

para GC, apenas aqueles que usam a condutividade térmica, ionização de

chama e captura electrónica são frequentemente usados.

Compostos não voláteis ou termo-sensíveis podem ser derivatizados para

aumentar a sua volatilidade ou estabilidade. Compostos com grupos funcionais

Page 123: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

119

hidroxilo, carbonilo e amino podem ser feitos reagir com reagentes adequados,

de modo a converter esses grupos polares em derivados menos polares e mais

voláteis (metilo, trimetilsililo ou trifluoroacetilo). Entre os compostos mais

frequentemente sujeitos a derivatização para análise em GC contam-se os

ácidos gordos, hidratos de carbono, fenóis e aminoácidos.

A identificação dos compostos separados em cromatografia gasosa pode

ser efectuada por comparação dos seus tempos de retenção com padrões, por

recolha e posterior análise com outras técnicas ou hifenando outros métodos

com o GC, através de uma interface.

Uma dessas técnicas hifenadas é a espectrometria de massa. A principal

dificuldade em juntar estes dois métodos é o facto de que o espectrómetro de

massa trabalha a baixa pressão enquanto o gás saído do cromatógrafo vem à

pressão atmosférica. No entanto, a evolução tecnológica permite que hoje em

dia esta seja uma das técnicas mais relevantes para identificação de compostos

em GC.

Uma outra é a junção da espectroscopia de Infra-vermelho com a

cromatografia gasosa, embora a sua menor sensibilidade contribua para um

reduzido sucesso da técnica.

A quantificação dos compostos é conseguida por integração dos picos no

cromatograma, sendo que a área do pico é directamente proporcional à

concentração do soluto. Para que tal método possa ser utilizado, é necessário

que as condições de operação sejam padronizadas e que sejam conhecidos os

factores de resposta dos detectores.

Se os componentes de uma mistura forem todos idênticos e forem todos

detectados, pode determinar-se o teor em percentagem de cada um deles

área do componente %

área total de todos os componentes

xx (15.12)

Esta fórmula só será válida se a sensibilidade do detector for a mesma

para todos os componentes. Caso contrário, a resposta para cada componente

terá que ser determinada com o recurso a padrões. Neste caso, as áreas

determinadas serão multiplicadas pelos factores de correcção obtidos.

Podem usar-se dois métodos de quantificação por adição de padrão:

padrão interno – adiciona-se uma quantidade conhecida do padrão

à amostra, antes de esta ser cromatografada. Calcula-se a razão

das áreas do pico do padrão sobre a do pico do componente e

converte-se esta razão no peso do componente através de uma

Page 124: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

120

curva de calibração previamente preparada. O padrão interno

deverá ter um tempo de retenção próximo do dos componentes a

determinar, mas com uma boa separação. Deverá ainda estar

presente na mesma gama de concentrações.

adição de padrão – se estiver disponível uma amostra pura do

componente a determinar, essa amostra poderá ser

cromatografada antes e após a adição de uma quantidade

conhecida do componente puro. O seu teor na amostra é obtido a

partir da razão das áreas dos picos nos dois cromatogramas.

Em cromatografia líquida (LC) e mais em particular em cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC) é possível separar componentes de misturas

em quantidades entre g e g por passagem da mesma através de uma coluna

contendo uma fase estacionária sólida. A fase móvel é um líquido a pressão

elevada. A separação dos componentes é baseada nas diferenças de afinidade

para as fases móvel e estacionária devido a propriedades de adsorção, tamanho

e carga.

Em cromatografia líquida clássica são utilizadas colunas à pressão

atmosférica, com as desvantagens de más separações e longo tempo de

operação. Uma melhor separação pode ser conseguida usando fases

estacionárias com menor diâmetro de partícula e uma redução no tempo de

análise é conseguida usando fluxos mais elevados e trabalhando a pressões

superiores. A técnica de HPLC é mais versátil que GC, já que não se limita a

compostos voláteis e termo-estáveis e também as fases móveis e estacionárias

são mais diversificadas.

Fig. 15.16 – Diagrama de um cromatógrafo HPLC.

Page 125: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

121

Em HPLC, a injecção é quase sempre realizada através de uma válvula, a

qual permite uma elevada reprodutibilidade. As colunas mais vulgares são

fabricadas em aço inoxidável. A grande versatilidade de fases estacionárias

disponíveis permite tirar partido de todos os mecanismos cromatográficos de

separação.

Em HPLC, a escolha de uma fase móvel adequada é crucial para a

eficiência da separação. Quando o sistema funciona em fase normal (fase

estacionária polar – fase móvel não polar) a capacidade de eluição aumenta

com o aumento da polaridade do solvente, enquanto que em fase reversa (fase

estacionária não polar – fase móvel polar) a capacidade de eluição diminui com

o aumento de polaridade do solvente. É frequente que a utilização de misturas

de mais que um solvente produza melhores resultados que a utilização de um

único solvente.

Quando se trabalha com um único solvente ou uma mistura de solventes

com composição fixa, diz-se que se trata de operação em condições isocráticas

e quando essas condições variam designa-se por eluição com gradientes.

O detector ideal em HPLC deverá apresentar as mesmas características

que para GC, nomeadamente resposta rápida e reprodutível para os solutos,

resposta linear para uma ampla gama de concentrações, elevada sensibilidade

e estabilidade. Os detectores mais vulgares são os de absorção electrónica e de

índice de refracção. Outros detectores mais sensíveis, mas mais específicos são

os de fluorescência e condutividade eléctrica. Existem outros ainda, mas com

aplicação mais limitada.

De modo semelhante à GC, a análise qualitativa em HPLC é feita por

comparação dos dados de retenção. A recolha de componentes isolados para

posterior análise por outras técnicas (IV, MS, NMR) é fácil de realizar, mas os

métodos hifenados tendem a sobrepor-se a essa prática. A análise quantitativa

também é efectuada de modo semelhante à indicada para GC.

A interface entre um HPLC e um detector de espectrometria de massa

também coloca algumas dificuldades, existindo diversas soluções possíveis e

também diversos processos de ionização dos componentes separados em HPLC.

Uma variante de HPLC, designada por cromatografia iónica, foi

desenvolvida para a separação de iões inorgânicos e também de alguns

orgânicos. Para tal, são utilizadas colunas de permuta iónica e os iões são

detectados através da sua condutividade ou, em alternativa, por espectroscopia

de absorção electrónica.

Page 126: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

122

Para separar aniões, a coluna tem uma fase estacionária de permuta

aniónica, com iões HCO„. Para a análise de catiões, utilizam-se resinas

catiónicas na forma de H+.

A cromatografia com fluidos supercríticos é uma técnica mais recente, a

qual utiliza um fluido supercrítico como fase móvel. Para atingir o estado

supercrítico, o solvente é sujeito a elevadas temperatura e pressão, o que

provoca alterações na sua densidade, viscosidade e coeficiente de difusão. O

solvente mais utilizado é o CO2. A aparelhagem utilizada tem por base

elementos usados em GC e HPLC. Para optimizar a separação é frequente

utilizar gradientes de pressão. Podem ser utilizados detectores típicos de GC,

como os de ionização de chama, ou de HPLC, como os de UV ou de

fluorescência.

Em cromatografia com fluidos supercríticos também são utilizados

detectores hifenados, tais como IV e MS.

A cromatografia em camada fina (TLC) utiliza camadas finas de uma fase

estacionária aplicadas sobre suportes de vidro, plástico ou alumínio. Quando

um solvente atravessa essa superfície, por capilaridade, provoca o

arrastamento dos componentes de uma dada mistura com diferentes

velocidades, dependendo das suas propriedades de solubilidade, adsorção,

tamanho ou carga. A distância percorrida é medida ou as manchas produzidas

são removidas para posterior análise por métodos espectrométricos.

Fig. 15.17 – Exemplo de um cromatograma em TLC.

Os materiais utilizados para fase estacionária em cromatografia em

coluna, de permuta iónica ou de exclusão, também podem ser usados em TLC.

A fase móvel é escolhida, sobretudo, com base em experiência prévia.

Page 127: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

123

A identificação de componentes pode ser feita apenas com base nos

valores de Rf, comparando-os com os de padrões, analisados em condições

idênticas. Em alternativa, as manchas podem ser removidas da placa e

analisadas por métodos qualitativos. A análise quantitativa só pode ser

efectuada em circunstâncias particulares e nunca é muito rigorosa.

Um processo semelhante à cromatografia é a separação por exclusão

molecular. Utiliza-se um gel que separa os componentes segundo o seu peso

molecular e a sua forma. Os poros do gel excluem moléculas maiores que um

certo tamanho crítico, permitindo a difusão através do gel das menores. As

moléculas maiores saem mais rapidamente, enquanto as restantes eluem a

velocidades dependentes do seu grau de permeação através do gel. Existem

géis hidrofílicos e hidrofóbicos, permitindo a separação de uma vasta gama de

compostos.

Um outro método de separação com crescente aplicação na química

alimentar é a electroforese. O mecanismo de separação baseia-se na migração

diferencial de substâncias com carga, através de uma superfície ou de uma

coluna, devido à acção de um gradiente de potencial. A velocidade de migração

depende do tamanho, carga e forma da molécula.

A electroforese tradicional é realizada sobre suporte de papel, acetato de

celulose ou géis poliméricos. Mais recentemente foi introduzida a electroforese

capilar que se efectua em tubos capilares de sílica.

Na electroforese tradicional, a amostra é colocada no centro do suporte e

os componentes são separados em manchas individuais. A detecção é

efectuada através de reagentes reveladores, os quais permitem visualizar o

electroferograma obtido.

Fig. 15.18 – Princípio de operação da separação por

electroforese.

Page 128: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

124

A mobilidade das substãncias é afectada pela temperatura, pH e força

iónica, pelo que é necessário controlar estes parâmetros, de modo a obter

resultados reprodutíveis e comparáveis.

Duas variantes desta técnica são a focagem isoeléctrica e a imuno-

-electroforese. A primeira complementa a separação por gradiente de potencial

com gradientes de pH e de densidades; a segunda utiliza interacções

específicas antigene-anticorpo.

Na electroforese capilar, aplica-se uma tensão de corrente mais elevada e

detectores semelhantes aos usados em HPLC (absorção electrónica,

fluorescência, ...), o que origina a obtenção de perfis semelhantes aos picos

cromatográficos, embora mais estreitos. Nesta versão da electroforese, a

introdução da amostra faz-se pelo extremo do tubo oposto ao do detector, por

via hidrodinâmica ou electrocinética. No primeiro caso, a amostra é introduzida

no tubo por gravidade, pressão positiva ou vácuo; no segundo, a amostra entra

por efeito de uma diferença de potencial aplicada.

Fig. 15.19 – Métodos de operação em electroforese capilar. (a),

(b) e (c) – Hidrodinâmica. (d) – Electrocinética.

A electrocromatografia capilar é uma técnica híbrida entre a electroforese

capilar e HPLC. Utiliza colunas de elctroforese capilar empacotadas com fase

estacionária típica de HPLC e um tampão de pH > 4. Estabelece-se um fluxo

electroosmótico do tampão, devido à aplicação de uma corrente eléctrica, em

direcção ao extremo catódico do capilar. Esta técnica apresenta as vantagens

Page 129: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

125

de uma maior eficiência e menor consumo de solvente que HPLC e maior

facilidade em ligar um detector de espectrometria de massa.

Page 130: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

126

Capítulo 16

Métodos Espectrométricos

Todas as técnicas espectrométricas dependem da absorção ou emissão

de radiação electromagnética e das variações de energia associadas, em

sistemas atómicos ou moleculares. As variações de energia estão associadas

aos níveis discretos de energia atribuídos a átomos e moléculas. As transições

entre esses níveis energéticos permitem obter informação quantitativa e

qualitativa sobre as espécies químicas.

A radiação electromagnética tem carácter ondulatório, mas as suas

absorção e emissão possuem uma natureza quântica. Uma onda pode ser

caracterizada em termos de frequência (), comprimento () e amplitude (A). A

energia é proporcional à frequência da radiação e inversamente proporcional ao

comprimento de onda.

Fig. 16.1 – Representação esquemática de uma onda

electromagnética.

A frequência e o comprimento de onda estão relacionados pela expressão

c

(16.1)

em que c é a velocidade de propagação da onda no vácuo (2.998x108 ms-1).

A teoria quântica considera a radiação como um fluxo de fotões (ou

quanta) que se deslocam no espaço a velocidade constante (c). A energia de

um fotão é dada por

Page 131: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

127

E h (16.2)

em que h é a constante de Planck (6.6x10-34 Js).

A energia total de um átomo ou de uma molécula inclui diversas

contribuições: do interior do núcleo (energia nuclear), de interacções entre

electrões e o núcleo (energia electrónica), dos spins electrónico e nuclear, dos

movimentos rotacionais e vibracionais das moléculas e da translacção de

átomos ou moléculas através do espaço. Todas estas formas de energia,

excepto a translaccional, são descontínuas. Para cada forma de energia, um

átomo ou molécula podem existir em níveis discretos de energia, definidos por

números quânticos e de acordo com uma formulação matemática. A dimensão

das várias formas de energia e as diferenças entre os níveis adjacentes são

muito diferentes. Os níveis energéticos que um átomo ou uma molécula podem

ocupar, em condições ambientes, são determinados pelas regras da teoria

quântica e pela equação de Maxwell-Boltzmann (16.4). Estes são designados

por níveis do estado fundamental, os de maior energia são chamados níveis do

estado excitado.

Fig. 16.2 – Níveis energéticos electrónico, vibracional e rotacional

(escala não real).

Quando uma substância é irradiada com radiação electromagnética, a

energia dos fotões incidentes pode ser transferida para os seus átomos e

moléculas, obrigando-os a passar do estado fundamental para um estado

excitado. Este processo de absorção pode ser traduzido pela equação

2 1E E E h (16.3)

Page 132: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

128

em que E1 e E2 são os dois níveis de energia. A energia absorvida é

rapidamente perdida por colisões, permitindo que o sistema reverta para o

estado fundamental. Se, em alternativa, a energia for reemitida, o processo

designa-se por fluorescência.

Fig. 16.3 – Ilustração dos processos de absorção (esquerda) e de

emissão de fluorescência (direita).

A informação que pode ser obtida sobre estas transições de energia, é

apresentada sob a forma de espectros, representações gráficas do grau de

absorção ou da intensidade de emissão da radiação, em função da frequência,

comprimento de onda ou número de onda. As riscas espectrais resultantes de

transições em átomos ou moléculas no estado gasoso são estreitas, tal como

aquelas originadas em transições de spin nuclear ou electrónico. Já os

espectros de absorção molecular nas regiões do ultra-violeta, vísivel e infra-

vermelho apresentam conjuntos de riscas não completamente resolvidas

(bandas) devido às colisões entre as moléculas do soluto e do solvente e a

limitações instrumentais.

As populações relativas de cada nível energético, ou seja as proporções do

analito que os ocupam, têm uma influência directa nas intensidades das riscas e

são determinadas pelo espaçamento dos níveis e pela temperatura. Estas

relações são definidas pela equação de Maxwell-Boltzmann.

2 2

1 1

expn g E

n g kT

(16.4)

n1 e n2 são o número de espécies nos estados de energia E1 e E2, separados

por E, g1 e g2 são factores estatísticos, k é a constante de Boltzmann

(1.38x10-23 JK-1) e T é a temperatura.

Page 133: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

129

A partir desta equação, verifica-se que os espectros de absorção nas

regiões do UV, visível e IV resultam sempre e unicamente de transições a partir

do estado fundamental.

A análise quantitativa em espectrometria é possível devido à existência de

uma proporcionalidade directa entre a intensidade de uma risca ou banda e o

número de átomos ou moléculas envolvidos na transição. Informação

qualitativa sobre a composição e estrutura de uma amostra é obtida através da

posição e intensidades relativas das riscas ou bandas do espectro.

Apesar de bastante diferentes entre si, os aparelhos usados em

espectrometria possuem três elementos característicos:

gerador de radiação com frequência apropriada às variações de

energia pretendidas na amostra;

análise do espectro produzido por essa radiação, de modo a obter

informação qualitativa;

medição da intensidade da radiação nas frequências seleccionadas,

para obtenção de informação quantitativa.

As técnicas de espectrometria atómica permitem análise quantitativa e

qualitativa, dado que produzem espectros caracterizados por riscas estreitas,

cujos comprimentos de onda são característicos de cada elemento e cujas

intensidades são proporcionais ao número de átomos associados à transição.

Tratando-se de técnicas muito sensíveis, a sua principal utilização é na

análise elementar de compostos em baixas concentrações.

De acordo com a teoria quântica, os electrões de um átomo ocupam

orbitais segundo um conjunto de quatro números quânticos, cujos valores

permitidos (Tabela 16.1) são determinados por regras matemáticas. Os

electrões tendem a ocupar as orbitais com a mais baixa energia possível,

seguindo o princípio de exclusão de Pauli, o qual diz que num átomo não

existem dois electrões que possam ser definidos pelo mesmo conjunto de

valores para os quatro números quânticos n, l, ml e s. As formas e energias dos

orbitais são determinadas pelos valores dos números quânticos e por efeitos

interelectrónicos.

A espectrometria de emissão atómica baseia-se na emissão de radiação

electromagnética nas regiões do UV e do vísivel a partir de átomos e de iões,

após excitação electrónica. É utilizada para a detecção de minerais em

pequenas quantidades e para análise quantitativa de metais, sobretudo em

Page 134: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

130

amostras sólidas. Embora a precisão seja moderada, esta técnica é bastante

usada devido à rapidez de processamento dos resultados obtidos.

Tabela 16.1

Número quântico Símbolo Parâmetro Valores permitidos

principal n distância radial inteiro de 1 a ∞ secundário l ângulo inteiro de 0 a (n-1) magnético ml ângulo inteiro de 0 a ±1

spin s spin ±½

Uma alternativa mais recente a esta técnica faz uso de plasma gasoso a

alta temperatura ou de um laser como fontes de excitação, o que permite uma

maior precisão quer na análise quantitativa quer na qualitativa. As principais

desvantagens da espectrometria de emissão por plasma são a necessidade de

dissolução da amostra e o preço elevado do equipamento.

Fig. 16.4 – Diagrama de níveis de energia para o átomo de sódio.

Os níveis estão identificados pelo número quântico

principal n, pelo número quântico de orbital l e pelo

número quântico de spin s.

A excitação por plasma induzido também pode ser acoplada à

espectrometria de massa, dando origem a uma técnica designada por ICP-MS

(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry), com a qual se pode obter

informação qualitativa por separação dos iões atómicos formados e quantitativa

por medição da corrente iónica gerada. A amostra é introduzida por um

Page 135: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

131

nebulizador, vaporização com laser ou aquecimento eléctrico e os iões

produzidos são analizados no espectrómetro de massa. É utilizada na análise de

elementos em baixas concentrações (ppb), embora sofra de uma precisão nem

sempre elevada e seja uma técnica cara.

Fig. 16.5 – Esquema de um espectrómetro de emissão atómica.

A espectrometria de absorção atómica baseia-se na absorção de radiação

electromagnética, nas regiões do UV e do vísivel, por átomos. As resultantes

alterações na estrutura electrónica são medidas, de modo a obter informação

quantitativa. A detecção faz-se a partir da passagem de radiação característica

de um dado elemento através do vapor atómico da amostra. Este vapor é

produzido por aspiração de uma solução para uma chama ou por evaporação a

partir de uma superfície aquecida por corrente eléctrica. É uma técnica muito

utilizada para determinação quantitativa de metais em baixas concentrações

(0.1-100 ppm) e com uma razoável precisão. A absorção medida é proporcional

à concentração do elemento na amostra.

Fig. 16.6 – Esquema de um sistema ICP-MS.

As principais limitações desta técnica são a necessidade de uma amostra

líquida e a necessidade de uma lâmpada de detecção para cada elemento.

Page 136: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

132

Fig. 16.7 – Esquema de um espectrómetro de absorção atómica.

As medidas quantitativas podem ser realizadas com o recurso a curvas de

calibração previamente preparadas ou através da adição de padrão, sendo

necessário que a resposta instrumental seja linear na gama de concentrações

considerada.

Na espectrometria de fluorescência atómica detecta-se a radiação de

fluorescência característica emitida pelo vapor atómico de um analito, após a

sua irradiação com radiação UV/vísivel. Na prática, esta técnica está limitada ao

elemento volátil Hg e a outros que podem ser tornados voláteis (As, Se, Te, Bi,

Cd). Tem uma sensibilidade na gama das ppb e é razoavelmente precisa.

A intensidade da emissão de fluorescência é directamente proporcional à

concentração dos átomos, mas é reduzida devido a colisões entre os átomos

excitados e outras espécies (extinção de fluorescência).

Na espectroscopia de emissão de raios X, observa-se radiação emitida por

transições envolvendo electrões K e L. Fazem-se medidas qualitativas a partir

dos comprimentos de onda e quantitativas a partir das intensidades das

emissões. É uma técnica que permite a análise não destrutiva de amostras

sólidas ou líquidas, mas com uma sensibilidade e precisão não muito elevadas.

As transições electrónicas nas camadas internas de um átomo envolvem

variações de energia consistentes com a absorção ou emissão de radiação com

elevada energia (baixo comprimento de onda). Tal conduz à obtenção de

espectros simples e característicos dos elementos presentes.

Page 137: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

133

Fig. 16.8 – Um electrão

da esfera K é ejectado do

átomo por uma fonte

externa de excitação

(raios X) criando uma

vaga. Um electrão das

camadas L ou M ―salta‖

para preencher a vaga.

Ao fazê-lo emite um raio

X característico do

elemento, produzindo

uma vaga nas camadas L

ou M e assim

sucessivamente.

As técnicas de espectrometria molecular são mais variadas e

completas quanto à informação analítica que proporcionam. Incluem

contribuições de movimentos translaccionais, rotacionais e vibracionais a partir

de electrões que ocupam os orbitais moleculares e de spins nucleares. A

separação entre os níveis quânticos de energia varia na ordem

electrónica vibracional rotacional spin nuclearE E E E

os níveis translaccionais não estão incluidos, pois são demasiado próximos, não

permitindo a sua quantização.

Page 138: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

134

Em análise, existem três técnicas com maior relevo: espectrometria no

ultra-violeta e vísivel (electrónica), espectrometria no infra-vermelho

(vibracional) e espectrometria de ressonância magnética nuclear (spin nuclear).

A espectrometria de massa fornece informação estrutural semelhante, mas é

uma técnica destrutiva que funciona segundo princípios diferentes.

Os métodos quantitativos baseados na absorção de radiação

electromagnética envolvem a medida da radiação transmitida pela amostra, a

qual é proporcional à concentração da espécie que absorve a radiação, na

amostra. Esta relação é descrita pela lei de Beer-Lambert.

0logI

A clI

(16.5)

I0 e I são, respectivamente, as intensidades das radiações incidente e

transmitida, A a absorvância, c a concentração da espécie que absorve a

radiação, l é a espessura do meio que absorve a radiação (na prática, o trajecto

óptico da cuvette) e é uma constante designada por coeficiente de absorção

molar.

O valor de depende da natureza da espécie e do comprimento de onda

da radiação incidente. A absorvância está relacionada com a fracção de

radiação transmitida (transmitância, T) pela espécie, de acordo com

1logA

T (16.6)

A absorvância é uma propriedade aditiva, pelo que, a um dado

comprimento de onda, a absorção total de uma solução contendo vários

componentes que absorvem radiação é dada por

1 1 2 2 ...totalA c l c l (16.7)

considerando que não existem interacções entre as espécies.

Para aplicar a lei de Beer-Lambert, deve preparar-se previamente uma

recta de calibração da absorvância de diversos padrões em função da sua

concentração. Esta recta deverá passar pela origem e ter um declive igual a l.

As medidas de absorvância são habitualmente feitas no valor máximo da curva,

de modo a minorar erros.

A lei de Beer-Lambert é aplicável apenas a soluções diluídas e a radiação

monocromática. Para concentrações elevadas (~>0.01 M) ocorrem desvios.

Se se quiser analisar apenas uma substância, obtêm-se bons resulatados

com um simples fotómetro. Quando aplicada na zona do vísivel, esta técnica é

Page 139: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

135

denominada colorimetria. Nesta técnica simples não é válida a lei de Lambert-

Beer e não existe compatibilidade entre equipamentos diferentes. Devido a

estas limitações é mais frequente a utilização da espectrofotometria.

A espectrometria no ultra-violeta e vísivel resulta da absorção de radiação

nessas regiões do espectro, a qual origina alterações na estrutura electrónica

de iões e moléculas. É uma técnica apenas válida para amostras em solução e

com dificuldades de aplicação em misturas não previamente separadas.

A absorção de radiação nas regiões vísivel e ultra-violeta origina transições

electrónicas entre os orbitais moleculares e, devido às relativamente elevadas

variações de energia, ocorrem simultaneamente variações nas energias

vibracional e rotacional. À temperatura ambiente, todas as moléculas estarão

no estado electrónico fundamental e, provavelmente, no nível vibracional mais

baixo. A absorção de energia provoca transições para qualquer nível vibracional

no primeiro estado excitado. Devido às interacções entre as moléculas do soluto

e as do solvente, não são observadas riscas, mas sim bandas largas. Estas

bandas são caracterizadas pela posição do seu máximo de absorvância (max) e

correspondente absorptividade molar. Para moléculas poliatómicas e complexos

metálicos, o espectro pode ter diversas bandas, resultantes de diversas

transições electrónicas e estruturas vibracionais e rotacionais associadas.

De acordo com a teoria dos orbitais moleculares, a interacção entre

orbitais atómicos conduz à formação de orbitais moleculares ligantes e anti-

-ligantes. Estes podem ser dos tipos ou . Existem ainda orbitais moleculares

não ligantes n, ocupados por electrões que não participam na ligação.

Fig. 16.9 – Formas, energias relativas dos orbitais moleculares e

transições possíveis entre eles.

Page 140: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

136

Na maioria dos compostos orgânicos, os orbitais ligantes e não ligantes

estão preenchidos e os anti-ligantes desocupados. As transições de menor

energia (bandas no vísivel e UV próximo) são aquelas entre orbitais não

ligantes e orbitais anti-ligantes, n↓*. As transições n↓* e ↓* possuem

energias semelhantes entre si e dão origem a bandas a comprimentos de onda

superiores. As transições ↓* ocorrem a menos de 200 nm e têm pouca

utilidade analítica. Os hidrocarbonetos saturados que são transparentes nas

zonas do vísivel e UV próximo são bons solventes para esta técnica. As bandas

mais intensas são produzidas pelas transições ↓* e ↓*, enquanto as

resultantes de transições n↓* e n↓* são mais fracas.

Moléculas não saturadas (cromóforos) são responsáveis pelas absorções

n↓* e ↓* adequadas a análise quantitativa, já que produzem bandas nas

zonas do vísivel e UV próximo.

A espectrometria no ultra-violeta e vísivel é usada em análise quantitativa,

por comparação das absorvâncias de padrões com as das amostras, a um dado

comprimento de onda. Esta é a principal aplicação desta técnica, podendo

mesmo ser aplicada a misturas não muito complexas, devido à propriedade

aditiva das absorvâncias. Outras aplicações desta espectrometria incluem a

determinação da estabilidade termodinâmica ou cinética de compostos, para

estudos fundamentais ou com objectivos analíticos.

A absorção de radiação electromagnética na zona do UV/vísivel é seguida

pela relaxação dos estados excitados para o estado fundamental,

maioritariamente através de diversos processos não radiativos (relaxação

vibracional, conversão interna e cruzamento inter-sistemas). A

fotoluminescência é um outro tipo de relaxação em que radiação de menor

energia que aquela originalmente absorvida é reemitida após a relaxação

vibracional. A fluorescência e a fosforescência são duas formas de

fotoluminescência, com aplicação analítica.

Um espectro de emissão de fluorescência resulta de transições entre o

nível vibracional de menor energia do primeiro estado excitado e diversos níveis

vibracionais do estado fundamental (Fig. 16.10). O espectro resultante é

aproximadamente uma imagem reflectida do espectro de absorção, mas

deslocado para um comprimento de onda superior devido à perca inicial de

energia, causada pela relaxação vibracional. Poucos compostos são capazes de

relaxar por fluorescência. Quase só as moléculas orgânicas rígidas e estruturas

aromáticas o fazem. A intensidade da emissão de fluorescência depende do

rendimento quântico (F) o qual varia entre zero (não há fluorescência) e um

Page 141: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

137

(todas as moléculas no estado excitado relaxam por fluorescência). O

rendimento quântico é influenciado por factores estruturais da molécula e pela

natureza do solvente usado.

Fig. 16.10 – Processos de relaxação a partir dos estados

excitados.

Existe uma relação linear entre a concentração C de um composto

fluorescente e a intensidade da emissão IF,

02.303F FI I Cl (16.8)

Se a intensidade da radiação incidente I0 e l forem constantes e a absorvância

baixa (i. e. concentração do analito reduzida) tem-se

FI kC (16.9)

Page 142: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

138

A fluorimetria é menos usada que a espectroscopia de absorção devido ao

limitado número de compostos naturalmente fluorescentes. No entanto, muitos

destes compostos podem ser derivatizados de modo a obter substâncias

fluorescentes, permitindo a sua análise. A sua utilização predominante é em

análise quantitativa, sendo mais sensível que a espectroscopia de absorção.

A espectrometria no infravermelho (IV) baseia-se na absorção de radiação

electromagnética na região do infravermelho, o que provoca alterações na

energia vibracional das moléculas. Pode ser aplicada à identificação e análise

estrutural de moléculas orgânicas, sendo menos usada que as duas técnicas

anteriores para fins quantitativos. Aplica-se quer a amostras sólidas, quer a

líquidas.

Uma molécula é capaz de absorver energia apenas se não existir variação

no momento dipolar durante uma vibração. A quase totalidade das moléculas

poliatómicas preenche este requisito.

A espectrometria no IV apresenta dificuldades na análise de misturas e

requer cuvettes especiais para análise de amostras aquosas.

A complexidade dos espectros de infravermelho permite a sua utilização

na identificação de compostos desconhecidos e na investigação de pormenores

estruturais. Os espectros são utilizados de modo empírico, por comparação com

padrões e com valores encontrados na literatura.

Fig. 16.11 – Espectro de IV do formaldeído, H2C=O, mostrando as

absorções características.

A absorção de radiação electromagnética na região das frequências de

rádio dá origem a variações na orientação do spin nuclear num campo

magnético, dando origem à espectrometria de ressonância magnética nuclear

Page 143: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

139

(NMR). Esta técnica permite a identificação e análise estrutural de compostos

orgânicos e estudos cinéticos, sobretudo a partir da análise de núcleos de 1H e 13C. Também apresenta potencial para estudos quantitativos, embora seja

raramente utilizada para tal fim. As suas principais limitações são a

complexidade da técnica, o elevado custo do equipamento e a necessidade de

utilizar solventes deuterados para a apalicação mais vulgar dos núcleos de 1H.

Fig. 16.12 – Esquema geral de um espectrómetro de NMR.

As variações de energia estão associadas à orientação do eixo nuclear no

espaço, relativamente a um campo magnético externo aplicado.

Todos os núcleos atómicos possuem um número atómico de spin I, o qual

pode ser 0, ½ ou 1. Apenas aqueles com valor diferente de zero originam um

espectro de NMR. Como o núcleo possui uma carga, ao girar sobre o seu eixo

produz um dipolo magnético ao longo do eixo. O núcleo também possui um

momento angular I e, em cada isótopo, os valores relativos de I e

determinam a frequência de absorção de energia. A sensibilidade da técnica

também é determinada pelo valor de . 1H possui a mais elevada sensibilidade

relativa e 12C e 16O são inactivos devido possuirem I=0.

Na presença de um campo magnético aplicado, o vector do momento

pode apenas assumir um número limitado de orientações espaciais. Isto é, a

sua componente na direcção desse campo será um integral ou um semi-integral

2πz I

hmI (16.10)

Iz representa a dimensão do componente do momento angular na direcção do

campo z, mI = 0, ±½, ±1, ±×, ... e h é a constante de Planck. O número total

de valores para mI, o número quântico magnético, é dado por 2I+1.

Page 144: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

140

A energia de interacção entre um núcleo e o campo magnético aplicado B

é dada por

γ2π

I

hE m B (16.11)

em que é a razão giromagnética.

μγ z

z

I

(16.12)

Num núcleo 1H ou 13C I é ½, portanto mI só pode ter valores ±½ o que

origina dois níveis de energia ou estados de spin.

Fig. 16.13 – Níveis de energia para 1H ou 13C.

Pode demonstrar-se que a frequência de absorção é directamente

proporcional à força do campo magnético aplicado. Na prática, os espectros são

obtidos fazendo variar a frequência da radiação com um campo magnético

constante ou vice-versa. Quando os núcleos dissipam energia, voltando para

um nível inferior, emitem um sinal que é tratado pelo equipamento, originando

bandas estreitas (mais largas no caso de sólidos).

Os espectros de NMR de 1H e 13C exibem habitualmente vários sinais de

absorvância, cada qual correspondente a um núcleo ou grupo de núcleos, cuja

posição no espectro depende do ambiente químico que rodeia o núcleo. Esta

característica é medida pelo desvio químico. Cada um dos sinais produzidos

pode sofrer desdobramentos, causados por interacções com núcleos vizinhos.

Outra informação que se pode tirar de um espectro está relacionada com o

facto de que a área de cada pico é directamente proporcional ao número de

núcleos responsáveis pelo sinal, permitindo a utilização desta técnica em

análise quantitativa.

De acordo com a teoria, todos os protões (núcleos 1H) absorvem energia

com o mesmo valor do campo magnético aplicado. No entanto, o campo

sentido por um dado núcleo difere em grandeza do campo aplicado, devido ao

efeito de blindagem dos electrões vizinhos. Devido às diferenças de blindagem

que os protões sofrem em diferentes ambientes químicos, estes absorvem a

Page 145: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

141

valores diferentes do campo aplicado. Estas diferenças de absorção são

designadas desvios químicos.

Os electrões que rodeiam um núcleo criam um pequeno campo magnético

localizado, oposto ao campo aplicado. A dimensão do campo oposto é

proporcional à densidade electrónica, a qual é determinada, por sua vez, pelas

electronegatividades dos núcleos vizinhos. Quanto mais electronegativo for o

átomo ao qual está ligado o protão, menor a blindagem e menor será o campo

magnético aplicado necessário para alcançar a condição de ressonância. Os

desvios químicos são medidos em unidades de frequência (Hz) relativamente a

um padrão, sendo o tetrametilsilano (TMS) o mais usado para este efeito. Na

prática, o desvio químico é expresso em unidades adimensionais , resultantes

da divisão da frequência do sinal pela frequência de operação do aparelho.

Multiplicando o valor de por 106, obtêm-se valores entre 0 e 15 para a maioria

dos protões orgânicos, vindo assim os desvios químicos expressos em ppm.

O efeito de desdobramento de sinal pode ser explicado a partir do

exemplo simples da molécula C2H6. Considerando dois protões HA e HX ligados a

átomos de carbono adjacentes, possuindo diferentes desvios químicos. O

campo sentido por HA aumenta ou diminui ligeiramente devido aos dois spins

permitidos de HX (up ↑ e down →). Deste modo, o pico de HA divide-se num

dobleto, com intensidades 1:1. O efeito é recíproco e os dois estados de spin de

HA causam a divisão do pico de HX num dobleto. O espaço entre cada dobleto é

designado por constante de acoplamento JAX, medido em Hz. Esta constante é

independente do campo aplicado.

De uma forma mais geral, o número de picos num multipleto é

determinado pelo número de protões no grupo adjacente n e é igual a n+1.

Geralmente, protões ligados ao mesmo átomo de carbono e aqueles ligados a

átomos adjacentes mas possuindo o mesmo desvio químico, são considerados

equivalentes e não sofrem desdobramento de sinal. As excepções a esta regra

não serão aqui consideradas.

Fig. 16.14 – Exemplo do desdobramento de sinais em 1H-NMR de

C2H6.

As intensidades dos picos num multipleto seguem o triângulo de Pascal e

são resultado da distribuição estatística das várias combinações possíveis dos

dois estados de spin para os protões do grupo adjacente.

Page 146: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

142

Fig. 16.15 – Desdobramento de sinais em NMR, segundo

triângulo de Pascal.

Os espectros de 13C são mais simples que os de 1H por dois motivos: a) os

desvios químicos entre núcleos de 13C em diferentes ambientes químicos podem

diferir até 200 ppm, enquanto que em 1H são raramente superiores a 10 ppm;

b) sendo um isótopo muito menos abundante, não se observam acoplamentos

entre si.

No entanto, ocorre acoplamento entre núcleos de 13C e 1H, embora

possam ser eliminados pelo equipamento, obtendo-se assim espectros mais

simples. Este procedimento não é sempre aplicado, já que em certas situações,

este acoplamento pode fornecer informação útil.

Fig. 16.16 – Espectro de 13C do butano-2-ol.

Aplicando o tratamento das transformadas de Fourier (FT) à

espectrometria de NMR é possível obter uma maior sensibilidade e uma maior

qualidade de informação estrutural.

A espectrometria de 1H-NMR é muito útil para identificação e análise

estrutural de compostos orgânicos, sendo a interpretação dos espectros feita

por comparação com espectros de referência e através da utilização de tabelas

Page 147: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

143

de desvios químicos. Esta técnica é menos utilizada em análise quantitativa,

apesar de existir uma proporcionalidade directa entre as áreas dos picos e a

concentração do composto.

A espectrometria de massa (MS) baseia-se na ionização e fragmentação

de materiais, através de diversos processos. A análise dos fragmentos

produzidos permite obter dados estruturais e quantitativos.

As moléculas são caracterizadas segundo o seu padrão de ionização e

fragmentação quando bombardeadas com electrões de elevada energia, ou

ionizadas com menor fragmentação se forem utilizadas as chamadas técnicas

suaves. Não é um verdadeiro método espectrométrico, pois a radiação

electromagnética não é absorvida nem emitida, mas os dados são obtidos em

forma de espectro, com a abundância relativa dos fragmentos representada

como linhas. O processo de bombardeamento produz geralmente fragmentos

com carga +1, facilitando a sua separação e detecção por processos eléctricos

e magnéticos. Os espectros devem ser registados em condições de vácuo, de

modo a impedir a perca de fragmentos por colisão com moléculas componentes

da atmosfera.

Fig. 16.17 – Esquema de um espectrómetro de massa com

ionização por impacto de electrões.

Existem diversos métodos de ionização, adequados a diversos tipos de

moléculas, das mais simples às mais complexas e com diversas gamas de

sensibilidade. Após ionização e fragmentação da amostra, os fragmentos

iónicos são acelerados para o analisador. Os fragmentos são separados,

fazendo-os deslocar-se através de um campo magnético e/ou electrostático ou

medindo o tempo que demoram a chegar ao detector.

Page 148: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

144

Um avanço que veio permitir maior fragmentação e estudo de iões

seleccionados foi a espectrometria de massa sequencial (MS/MS), a qual

envolve processos secundários de fragmentação, geralmente induzidos por

colisões com moléculas de um gás inerte, contido numa célula colocada entre

dois analisadores. Se houver reciclagem de iões no sistema ou forem

adicionados mais analisadores, o processo é estendido e passa a ser designado

por (MS)n.

O princípio da separação através de um analisador magnético pode ser

racionalizado em termos da energia cinética dos iões fragmentados, da

voltagem de aceleração V e do campo magnético B. A equação 16.13 mostra

que, para iões com carga (z) +1, a massa m é directamente proporcional ao

quadrado do raio da curvatura r.

2 2

2

m B r

z V (16.13)

Num espectro de massa, o padrão de fragmentação é característico de

cada substância e pode ser usado para identificação da mesma. O pico derivado

do ião mais abundante é designado pico base. Uma “ferramenta” útil para a

identificação de um composto é a capacidade de determinar a massa molecular

relativa e estabelecer uma fórmula molecular empírica. A massa molecular

relativa depende da identificação do pico do ião molecular M, produzido quando

um electrão é ejectado da molécula (M + e- ɹ M+ + 2e-). A fórmula empírica

pode ser obtida calculando as intensidades dos picos dos isótopos M+1, M+2,

etc. relativamente ao pico do ião molecular. Um outro auxiliar de interpretação

é a regra do azoto, a qual diz que uma molécula com peso molecular par deve

conter um número par de átomos de azoto ou nenhum átomo de azoto.

Fig. 16.18 – Espectro de massa típico de um hidrocarboneto.

Page 149: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

145

Page 150: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

146

Capítulo 17

Ensaios Imunológicos

Diversos procedimentos para análise de alimentos recorrem à utilização

de ensaios imunológicos, devido às suas especificidade, sensibilidade e

simplicidade. São empregues na análise de resíduos, identificação de bactérias

e vírus e detecção de proteínas. A detecção de proteínas é importante no

contexto da determinação de alergénios, autenticação de espécies de carne e

detecção de plantas geneticamente modificadas.

Os antigénios e os anticorpos são as duas componentes fundamentais de

qualquer ensaio imunológico. Um antigénio é uma molécula que induz a

formação de anticorpos. Anticorpos são proteínas produzidas por animais em

resposta a um antigénio. Estas proteínas ligam-se, com uma elevada afinidade,

ao antigénio responsável pela sua indução.

Um anticorpo é uma molécula em forma de Y, constituída por quatro

cadeias de polipeptídeos, ligadas entre si por pontes dissulfito. Duas das

cadeias de polipeptídeos são idênticas e aproximadamente duas vezes maiores

que as outras duas, também idênticas entre si. O antigénio liga-se em dois

sítios de ligação idênticos.

Fig. 17.1 – Regiões estruturais de um anticorpo.

Page 151: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

147

O anticorpo liga-se à parte externa do antigénio numa região específica

(epítopo). A ligação do anticorpo ao antigénio não envolve ligações covalentes,

mas sim interacções electrostáticas e de van der Waals e pontes de H.

Fig. 17.2 – Representação da ligação antigénio-anticorpo.

Qualquer ensaio imunológico requer duas condições: 1) tem que existir

um método para separar ou diferenciar um antigénio livre de um antigénio

ligado; 2) ou o antigénio ou o anticorpo têm que ser quantificáveis em baixas

concentrações.

A detecção em muito baixas concentrações requer marcadores muito

activos. Um dos primeiros a ser desenvolvido utiliza iodo radioactivo (131I) e

designa-se ensaio radioimunológico (RIA).

Nos ensaios imunológicos utilizam-se recipientes de plástico, tirando

partido da existência de interacções hidrofóbicas entre as proteínas e as suas

superfícies. São habitualmente utilizadas microplacas com 96 cavidades, sendo

colocada uma amostra em cada cavidade.

Fig. 17.3 – Microplaca usada em ensaios imunológicos.

Page 152: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

148

Devido aos perigos associados aos marcadores radioactivos, foram

desenvolvidos marcadores enzimáticos para os substituir. O mais popular é o

ensaio imunoenzimático ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), no qual

se usa uma enzima que deve ser muito estável, ligar-se facilmente a antigénios

ou anticorpos e catalisar rapidamente uma alteração visível num substrato

simples. Existem três variantes deste ensaio: sandwich, competitivo e indirecto.

Um ensaio indirecto pode ser efectuado tanto na variante sandwich como na

competitiva.

No ensaio sandwich, o antigénio fica entre dois anticorpos. Este é o ensaio

imunológico mais utilizado para a identificação de proteínas. Na análise de

alimentos, este tipo de ensaios pode ser utilizado para identificar adulterantes

ou alergénios. O anticorpo de captura é imobilizado num suporte e a solução do

alimento a ser analisada é-lhe adicionada. Esta solução contém uma proteína

que se comporta como um antigénio específico para o anticorpo de captura.

Após formado o complexo anticorpo de captura-antigénio, a restante solução é

removida. Após este passo de lavagem, adiciona-se outro anticorpo ligado a

uma enzima. Este anticorpo, denominado anticorpo de detecção, também

reconhece o antigénio. O excesso desta solução de detecção é removido e

adiciona-se um substrato incolor, que irá mudar de cor ao ligar-se à enzima.

Quanto mais intensa a cor, maior o teor de antigénio presente.

Para analisar componentes mais pequenos que as proteínas, como

resíduos de toxinas, antibióticos e pesticidas, é mais adequado utilizar um

ensaio competitivo. Neste formato, o primeiro passo é a imobilização da

pequena molécula, covalentemente ligada a uma molécula maior. Esta

molécula, geralmente uma proteína, funciona como transportadora e o conjunto

é designado por hapteno. Em alternativa, pode imobilizar-se o anticorpo. Após

a imobilização, remove-se o material em excesso. De seguida, adiciona-se um

extracto de alimento e passa a existir uma competição, entre o hapteno e a

molécula livre existente no extracto, para ligação a um anticorpo marcado com

uma enzima. Após um passo de lavagem, o anticorpo ligado ao hapteno

imobilizado permanece no meio. Quanto mais moléculas alvo existirem no

extracto do alimento, mais anticorpos se ligam às pequenas moléculas livres,

sendo este complexo removido no próximo passo de lavagem, pois não se

encontra imobilizado. O anticorpo ligado será quantificado por adição do

substrato da enzima e observação da alteração de cor produzida. Neste caso,

haverá uma relação inversamente proporcional entre a quantidade de analito

no extracto e a intensidade de cor.

Numa variante do ensaio competitivo, mais sensível, liga-se uma

quantidade limitada de anticorpo à placa e é criada uma competição entre o

hapteno ligado à enzima e a molécula livre no extracto de alimento. O passo

Page 153: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

149

final, após remoção do excesso da amostra, passa pela determinação da

quantidade de hapteno ligado à enzima, através da medição da cor produzida.

Fig. 17.4 – Ensaio imunológico de tipo sandwich.

No ensaio imunológico indirecto, mede-se a quantidade de anticorpo ou

hapteno indirectamente, utilizando frequentemente anticorpos anti-espécie.

Nesta variante, podem realizar-se ensaios sandwich ou competitivos. Os

anticorpos anti-espécie são obtidos a partir de anticorpos de um animal

posteriormente injectados num animal de outra espécie, estimulado o sistema

imunitário deste de modo a produzir anticorpos que se liguem aos epítopos dos

anticorpos do primeiro animal. Depois do passo competitivo, o material em

excesso é removido e adiciona-se o anticorpo anti-espécie, marcado com uma

enzima, para detectar a presença do anticorpo do primeiro animal. Este método

possui elevada sensibilidade, o que em conjunto com a existência no mercado

de diversos anticorpos anti-espécie com vários marcadores, torna esta variante

muito útil em diversos ensaios.

Page 154: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

150

Existe uma tendência para a automação dos ensaios imunológicos, de

modo a melhorar a sua produtividade.

Fig. 17.5 – Ensaio imunológico competitivo.

A especificidade de ligação dos anticorpos também permite o seu uso em

técnicas de purificação. Na purificação por imunoafinidade, o anticorpo é

imobilizado sobre um suporte (agarose ou gel de sílica), servindo de fase

estacionária para separações cromatográficas. Estas fases podem ser

regeneradas e reutilizadas.

Fig. 17.6 – Exemplo de ensaio imunológico indirecto.

A separação por imunoafinidade tem sido utilizada para separar pequenas

moléculas, como as aflatoxinas, mas também materiais de maiores dimensões

como células.

Page 155: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

151

Fig. 17.7 – Purificação por imunoafinidade. O antigénio liga-se ao

anticorpo imobilizado na coluna, o restante material é

removido e, finalmente, liberta-se o antigénio por

variação do pH ou do solvente utilizado.

Page 156: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

152

Capítulo 18

Métodos Analíticos em Biotecnologia

Devido à crescente introdução de alimentos provenientes da

biotecnologia agrícola, ou organismos geneticamente modificados (OGM), que

requerem análise por motivos de segurança, nutricionais e alergénicos, têm-se

desenvolvido métodos analíticos para detectar genes inseridos, partes do ADN

ou as proteínas expressadas pelos novos genes. O método mais utilizado para

análise de ADN é a reacção em cadeia da polimerase (polymerase chain

reaction – PCR) e para detecção de proteínas utilizam-se ensaios imunológicos

(ELISA) e com tiras de fluxo lateral (lateral flow strips - LFS).

Ao inserir novas secções de ADN nas plantas, são sintetizadas pequenas

quantidades de novas proteínas e é necessário desenvolver métodos analíticos

para as diferenciar das restantes proteínas, presentes em grandes

concentrações. Os métodos usados incluem HPLC, electroforese capilar, ensaios

imunológicos e espectrometria de massa.

Os ensaios imunológicos, ELISA e LFS são habitualmente utilizados na

variante sandwich. Existem kits no comércio destinados a analisar as mais

importantes culturas sujeitas a modificação genética.

O ensaio LFS permite determinar se a concentração de uma determinada

proteína se encontra acima ou abaixo de um determinado valor. Em vez de usar

uma enzima e o seu substrato para obter um produto de reacção colorido,

como nos ensaios ELISA, o método LFS utiliza pequenas partículas esféricas e

coloridas ligadas ao anticorpo, para gerar um sinal positivo. A separação da

proteína alvo é conseguida através da imobilização do anticorpo de captura

numa zona da tira. A amostra vai atravessar essa zona por capilaridade. Um

segundo anticorpo capaz de se ligar à proteína de interesse é ligado à superfície

das pequenas partículas coloridas. Estas partículas, revestidas com o anticorpo,

são secas numa zona da tira situada a jusante da zona de ensaio. Quando a

amostra líquida reconstitui as partículas, estas seguem o fluxo capilar da

amostra ao longo da tira. Na extermidade inicial da fibra é colocado um filtro

para reter partículas de grandes dimensões que possam existir na amostra e na

outra extermidade existe uma zona absorvente.

A amostra, contendo a proteína alvo, é colocada em contacto com uma

amostra líquida e é conduzida para a tira por capilaridade. A amostra atravessa

Page 157: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

153

o filtro e alcança a zona em que a proteína alvo se liga ao conjunto partícula

colorida – anticorpo. O complexo formado flui por capilaridade e é capturado

pelo anticorpo imobilizado na zona de ensaio. À medida que mais complexos

vão sendo capturados, torna-se evidente uma linha colorida, indicando a

presença do antigénio na amostra. Uma zona de controlo a jusante desta,

contém um reagente capaz de se ligar ao excesso de partículas que atravessa a

zona de ensaio e serve para indicar o correcto funcionamento do ensaio.

Fig. 18.1 – Funcionamento de um ensaio imunológico utilizando

tiras de fluxo lateral.

A sensibilidade dos ensaios LFS depende, sobretudo, da afinidade dos

anticorpos utilizados e é, em geral, inferior à dos ensaios ELISA.

O western blot é um método que combina dois procedimentos analíticos, a

electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e um ensaio imunológico. A

electroforese separa as proteínas existentes numa mistura complexa, após

desnaturação das mesmas, segundo o seu peso molecular. De seguida, as

proteínas são transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose e o

ensaio imunológico detecta uma dada proteína, após a separação. Para a

detecção é usado, normalmente, um anticorpo marcado com uma enzima,

dando origem a uma risca colorida no local de imobilização da proteína.

A presença de características transgénicas num alimento pode também ser

efectuada por identificação de sequências específicas de ADN. Os ensaios que

utilizam a reacção em cadeia da polimerase podem ter objectivos qualitativos

ou quantitativos, sendo que são mais frequentemente usados como ensaios de

varrimento. Estes servem para procurar as extremidades do fragmento de ADN

inserido.

Page 158: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

154

Fig. 18.2 – Ensaio western blot.

O ADN tem que ser extraído da amostra na forma mais pura possível e

com uma boa qualidade para permitir aplicar o método PCR. Após extracção, o

ADN alvo é amplificado por utilização da PCR. Este procedimento usa uma

cadeia sintética de ADN, com uma sequência complementar à da cadeia alvo. A

cadeia sintética é incubada com os reagentes necessários à replicação da área

alvo. Este ADN sintético é designado por primer. Esta replicação é levada a

cabo até ser produzido um número suficiente de cópias que permita a

detecção, usando uma reacção de separação e coloração. Esta reacção permite

obter quer a quantidade quer o tamanho da cadeia de ADN. A sequência de

ADN pode ser posteriormente caracterizada por outros métodos analíticos que

usam enzimas de restrição ou hibridização com sondas marcadas.

Existem diversos métodos quantitativos, baseados na PCR em tempo real

(real-time PCR). Nesta versão, a reacção é realizada num tubo fechado e a

variação na concentração dos produtos é visualizada com a ajuda de sondas

fluorescentes, as quais vão hibridizar com secções das cadeias de ADN

formado. Quando se dá a ligação das cadeias, produz-se um sinal fluorescente,

o qual é gravado e usado para seguir o progresso da reacção. Os dados

Page 159: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

155

permitem concluir a quantidade relativa de ADN modificado comparativamente

à de ADN original.

Fig. 18.3 – Amplificação de ADN através de PCR.

Page 160: INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR - · PDF fileIntrodução à Química Alimentar 2009 1 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que

Introdução à Química Alimentar 2009

156

Bibliografia

J. M. Hornback, Organic Chemistry, 2nd edition, Thomson Brooks/Cole,

2006

N. N. Potter, J. H. Hotchkiss, Food Science, 5th edition, Aspen Publishers,

Inc., Maryland, 1998

F. W. Fifield, D. Kealey, Principles and Practice of Analytical Chemistry, 5th

edition, Blackwell Science, 2000

R. Owusu-Apenten, Introduction to Food Chemistry, CRC Press, Boca

Raton, 2005

AOAC International, Official Methods of Analysis, 17th edition, AOAC

International, Gaithersbourg, 2000.

S. S. Nielsen, Food Analysis, 3rd edition, Kluwer Academic/Plenum

Publishers, New York, 2003.