Prof. Paola Gramatica - QSAR Research Unit - DBSF - University of Insubria - Varese (Italy)

Prof. Paola GramaticaProf. Paola Prof. Paola GramaticaGramatica

Introduzione allaChimica AnaliticaIntroduzioneIntroduzione allaalla

ChimicaChimica AnaliticaAnalitica

CorsoCorso didi ChimicaChimica AmbientaleAmbientale

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paola.gramaticapaola.gramatica @ @ uninsubria.ituninsubria.it

CAMPIONAMENTO

L’obiettivo della raccolta di campioni ambientaliper analisi è ottenere una piccola porzione, ricca di informazioni, della matrice che si intendestudiare (acqua, suolo, sedimento, biota)

I campioni devono essere rappresentativi dell’area del prelievo e del periodo di studio.

La corretta pianificazione del campionamento permette di ottenere il massimo di informazionecon il minimo consumo di tempo e denaro.

Obiettivi essenziali del campionamento:• Esplorazione (sorveglianza puntuale)• Monitoraggio (valutazione nel tempo e nello

spazio)

PROTOCOLLI DI CAMPIONAMENTO

Si devono indicare:

• Posizioni dei campioni

•Variabili fisiche, meteo, idrologiche, chimiche (pH, ossigeno, ecc)

•Tipi di apparecchiature (per prelievo, per trasporto, per conservazione ecc)

•Volumi e caratteristiche campioni

•Numero e tipi di bianchi

•Trattamenti in campo

•Metodiche di trasporto, conservazione)

:

ESTRAZIONIESTRAZIONI

ORGANICI Estrazioni con Solventi Organicida campioni acquosi

Imbuto Separatore:• Pochi campioni• Piccole quantità

Estrattore di Soxhlet: (in continuo)• Numerosi campioni• Grosse quantità• Batteria di estrattori (Soxhtec)

ORGANICIEstrazioni con Solventi Organici

da campioni solidi

Estrattore di Soxhlet: Con ditale di cellulosa

INORGANICI Digestione con acidi (HCl HNO3)

Imbuto SeparatoreImbuto SeparatoreEstrazione Liquido-Liquido

Estrazione con solvente organico meno denso dell’acqua

solvente organico

acqua

Estrattore diEstrattore di SoxhletSoxhlet:: (in continuo)

Estrattore di Soxhlet: (in continuo)

Batteria di estrattori (Soxhtec)con ditale di cellulosa per campioni solidi

Fasi in successione:

1)1) IsolamentoIsolamento del campione (miscela) OK

2) SeparazioneSeparazione dei componenti la miscela

Metodi cromatografici

3) AnalisiAnalisi identificativa dei singoli componenti

Metodi spettroscopici per Indagine strutturale

Stato del Campione

e Tecniche di analisiadatte

Fasi in successione:2) Separazione dei componenti la miscela

Dopo l’isolamento della miscela da analizzare, se ne devono separare i singoli componenti applicando alcuni dei più comuni metodi di separazionecromatografica:

Cromatografia su strato sottile (TLC)Cromatografia su colonna

gravitazionale (varie fasi stazionarie)Cromatografia su colonna ad alta

efficienza (HPLC)Gas-Cromatografia (GC)

METODI CROMATOGRAFICIMETODI CROMATOGRAFICI

Si distinguono in base alla fase mobile eluenteliquida (LCLC) o gassosa (GCGC).

• CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)• Adsorbimento Liquido-Solido

(TLC, Colonne)

• Ripartizione Liquido-Liquido (HPLC)

• Scambio Ionico

• Esclusione molecolare (Gel permeation)

• Affinità

GAS-CROMATOGRAFIA (GC)

• Adsorbimento Gas-Solido

•Ripartizione Gas-Solido

TIPI di CROMATOGRAFIE 2TIPI di CROMATOGRAFIE 2

PRINCIPI di BASE delle SEPARAZIONIPRINCIPI di BASE delle SEPARAZIONICROMATOGRAFICHECROMATOGRAFICHE

Il più comune principio alla base delle tecniche cromatografiche è

la competizione tra forze

che tendono a “legare” alla fase stazionaria (fase fissa) i singoli componenti della miscela da analizzare e forze che tendono a “staccare” ed eluirequesti componenti con la fase mobile(eluente).

I diversi componenti della miscela saranno trattenuti ed eluiti in modo diverso e quindi separati lungo il sistema cromatograficoprescelto.

CROMATOGRAFIE LIQUIDECROMATOGRAFIE LIQUIDE

Fasi mobili (liquidi organici) sia perCromatografia su strato sottile (TLC)Cromatografia su colonnaCromatografia su colonna ad alta

prestazione (HPLC)

La polarità della fase mobile determina la forza e quindi la velocità con cui un singolo componente, della miscela da separare, viene eluito dal sistema cromatografico(viene cioè “staccato” dalla fase stazionaria e “trascinato” con la fase mobile). E’ quindi determinante per differenziare dagli altri il movimento di ogni singolo prodotto da separare nel sistemacromatografico utilizzato.

SERIE ELUOTROPICASERIE ELUOTROPICA

Singoli solventi o miscele a varie composizioni.

TECNICHE CROMATOGRAFICHETECNICHE CROMATOGRAFICHE

Cromatografia piana

Su Carta

LC LiquidoCrom Su Strato Sottile (TLC)

Cromatografia su colonna

LiquidoCrom(LC)

a Pressione Atmosferica (colonne gravitazionali)

a Pressione Elevata (HPLC)

Gas Crom(GC)

Colonne Impaccate

Colonne Capillari

TIPI di CROMATOGRAFIE :TIPI di CROMATOGRAFIE :Cromatografia pianaCromatografia piana

La cromatografia piana su strato sottile (TLC),o su carta, è una cromatografia liquida di adsorbimento liquido-solido

sistema ascensionale: l’eluente liquido (la fase mobile) sale per capillarità sulla fase fissa solida (carta, silice o allumina supportata su vetro o alluminio), nel suo movimento ascensionale scioglie, e quindi stacca dall’interazione con la fase fissa,preferenzialmente le sostanze più solubili in esso, spostandole più in alto nella “lastrina”.

Comunemente, sostanze meno polari “corrono” verso il fronte dell’eluente, mentre le più polari restano assorbite in basso.

Rf= retention factor

Rf è diverso per uno stesso prodotto a seconda dell’eluente utilizzato. Per caratterizzare in TLC un prodotto bisogna indicare accanto al suo Rf il sistema eluentecon cui questa separazione è stata ottenuta

Cromatografia su strato sottile (TLC)Cromatografia su strato sottile (TLC)Piana, Liquido Crom.,

Adsorbimento Solido-liquido

Rf= retention factor è il parametro che misura la “corsa” di ogni singolo prodotto rispetto alla “corsa” dell’eluente.

TIPI di CROMATOGRAFIE :TIPI di CROMATOGRAFIE :Cromatografie su ColonnaCromatografie su Colonna

La cromatografia su colonna è un sistemaanalogo alla TLC, ma gravitazionale per cui le sostanze che “corrono” di più si trovano nel basso della colonna e vengono eluiteper prime.

Vari tipi: gravitazionale, HPLC, GC.

Caratteristica principale della GC è la fase mobile inerte: gas di trasporto, e della HPLC la pressione di esercizio.

Cromatografia su colonna e TLCCromatografia su colonna e TLC

GASGAS--CROMATOGRAFIA: CROMATOGRAFIA:

la strumentazionela strumentazione

GASGAS--CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA

COLONNE in GCCOLONNE in GC

Colonne Impaccate•Vetro •Lunghezza: 2-3 m•Diametro: 0.2-0.4 cm•Forma ad U o a spirale•Fase stazionaria liquida supportata su materiale inerte solido (diatomee) 60-100mesh

Colonne Capillari•Vetro o silice fusa (capillari flessibili)•Lunghezza: 25-50 m•Diametro: 0.2-0.5 mm•Forma a spirale•Fase stazionaria legata alle pareti

10 volte più efficace:- Diffusione trascurabile- Risoluzione migliore (picchi stretti e ben

separati)- Separazione migliore- Tempi di eluizione inferiori

GASGAS--CROMATOGRAFIA aCROMATOGRAFIA aTemperatura ProgrammataTemperatura Programmata

IsotermIsoterma a

a 45°Ca 45°C

IsoterIsoterma ma a a 145°C 145°C

T T programmprogramm

ataata3030--180°C 180°C

Esempi diEsempi di

separazioniseparazioni

GasGas--CromatograficCromatografic

hehe

SPETTROMETRIA DI MASSASPETTROMETRIA DI MASSA

r = mv/zH

m/z=H2r2/2V

m= massa z= carica v=velocità particellaV=potenziale campo elettrico acceleranteH= intensità campo magnetico devianter= raggio curvatura

Gli ioni vengono deviati in base al loro rapporto massa/carica

z=1 Deviazione in base alla MASSA

Uno Spettro di MassaUno Spettro di Massa

I PICCHI ISOTOPICI in MSI PICCHI ISOTOPICI in MS

32.598

Esempio di analisi Esempio di analisi GCGC--MSMS

HPLC (High Performance HPLC (High Performance Liquid Liquid CromatographyCromatography): ):

la strumentazionela strumentazione

Sistema di iniezione: Sistema di iniezione:

il il looploop

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

E’ una Cromatografia di Ripartizione Liquido/Liquido- il soluto si ripartisce tra fase stazionaria (un liquido supportato o chimicamente legato su solido all’interno di una colonna di acciaio o vetro speciale e la fase mobile liquida (il solvente eluente).

Diversi tipi e possibilità:Cromatografia liquida in fase diretta:

fase stazionaria più polare della fase mobilesostanze più polari più trattenute, escono dopo,

TR >

Cromatografia liquida in fase inversa (“Reverse Phase”):

fase mobile più polare della fase stazionariasostanze più polari meno trattenute, escono prima,

TR <

Eluizione isocratica = stesso eluenteEluizione a gradiente = varia polarità eluente

Fase inversaFase inversa

Fase direttaFase diretta

•Fasi stazionarie agranulometria

fini ssima (400 mesh)

•Colonne d’acciaio

•Sotto pressione (fino 400 atm)

COLONNECOLONNE

Esempi di

separazioni

HPLC

Esempi di

separazioni

HPLC

Spettri UV : tipi di transizioni e assorbimenti di cromofori caratteristici

Spettri UV di sostanze molto diverse possono essere molto simili

Assorbimento Atomico (AA)

ICP