Introduzione

Evidenze di legame infiammazione-cancro

Perché infiammazione aumenta rischio tumore

Via intrinseca/ Via Estrinseca

Oncogeni e infiammazione

Relazione infiammazione cancro: il caso di NF-kB

Infiammazione e cancro

Se infiammazione é in grado di stimolare lo sviluppo del cancro, questo deve avvenire attraverso la modulazione di tali meccanismi cellulari

Tra i vari pathway attivati durante infiammazione,NF-kB ha un ruolo centrale sia nel controllo della risposta infiammatoria che nello sviluppo del tumore.

Il cancro é una malattia causata da difetti nei meccanismi cellulari di controllo della stabilitá del genoma e e della proliferazione cellulare

NF-kB

NF-kB é un fattore trascrizionale rapidamente attivato in risposta a infezione, infiammazione e stress (danno al DNA)

Regola-attivazione dei linfociti-infiammazione-inibisce apoptosi-stimola crescita cellulare

stress infiammazione

Le subunitá possiedono il dominio REL di legame al DNAREL (la piú importante: REL-A o p65)p50p52, derivata da proteolisi di p105

Esiste come Etrodimero di due tipi:REL/p50REL/p52

NF-kB pathway canonico

NF-kB é mantenuto nel citoplasma da interazione con IkB

In seguito a stimolo, il complesso IkB Chinasi (trimero IKK ) inattiva IkB

NF-kB ha segnali di localizzazione nucleare

NF-kB entra nel nucleo

citoplasma

nucleo

pathway canonico

Come inattivare NF-kB?

Forma mutante di IkB che non púo essere inattivata (fosforilata):I-kB SR: Super Repressore costitutivo!!!!

Pathway non canonico

Geni targetfeedback loop: IkB

proliferazione: MYC, Ciclina D1

anti-apoptosi: BCL2 family (bloccano BAX), cIAP (bloccano caspasi)

Infiammazione:

citochine (e.g., IL-1, IL-6, TNF-a, IFN b, GM-CSF)chemochine (e.g., IL-8, MIP-1 , MCP1, RANTES, and eotaxin),molecole per adesione (e.g., ICAM, VCAM, and E-selectin)effettori, stress ossidativo (e.g., iNOS and COX-2).risposta immunitaria (MHC proteins)

proteasi (MMP9 proteins)

NFKB ha un ruolo sia in cellule infiammatorie che in cellule tumorali

NFKB, infiammazione e cancroIndizi:NF-KB é fondamentale per il processo infiammatorioNF-kB é un attivatore di geni anti apoptotici=oncogeniTumori umani presentano NF-kB costitutivamente attivato

validazione del ruolo di NF-kB in modelli muriniEpatite e carcinoma del fegato (HCC:hepatocellular carcinoma)Carcinogenesi chimica e HCC

Hepatocellular Carcinoma (HCC)

High mortality rate due to late stage diagnosis-resection and transplantation are mostly ineffective-Commonly used drugs are mostly ineffective-emergence of therapy resistance tumor

-Increse incidence due to increase rate of HBV HCV infection

Prevention!

L'epatite virale è un processo infiammatorio (acuto o cronico), che provoca la morte (necrosi) delle cellule del fegato (epatociti) a causa dell'attacco da parte di virus epatotropi (HBV/HCV)

Come risponde l’organo danneggiato?

fegato: capacitá rigenerante

Gli epatociti si dividono raramente.Tuttavia, possiedono la capacità di riprodursi in risposta a:- fattori di crescita

- distruzione/asportazione di una parte del fegato stesso Capacitá fondamentale dopo l'asportazione chirurgica o in seguito a lesioni (lesioni virali, tossiche o ischemiche).

iperplasia controllata

la capacità di rigenerazione del fegato viene compromessa da danno eccessivo:- malattie croniche (epatite)- danni ripetuti (alcol: >50g/giorno/piú anni)

Conseguenza:epatociti verranno sostituiti da tessuto cicatriziale (fibrosi) fino a portare alla cirrosi epatica.

Ripopolazione del fegato e cancro

Un ambiente ricco in stimoli proliferativi puó favorire la selezione di una cellula “iniziata” (pre tumorale)

commento

Infiammazione - tumore

ColangiteInfiammazione vie biliari

Hepatocellular carcinoma

Topi MDR2-/- Modello murino di epatite

Malattie epatobiliari:Gli epatociti secernono la bile nei canalicoli biliari, che sono spazi tra epatociti adiacenti.La bile é composta da acidi biliari e fosfolipidi.

MDR2: glicoproteina di membrana che media la secrezione dei fosfolipidi della bile, famiglia degli ABC transporter.

Topi MDR2 -/- :Un difetto nella secrezione della bile:acidi biliari in assenza di fosfolipidi,che sono ritenuti negli epatociti, sono tossici e causano danno delle membrane e epatitemodello di malattia epatobiliare, é considerato un modello di malattia cronico del fegato, precisamente di Colangite, cioé infiammazione delle vie biliari.

All’etá di 4 - 6 mesi i topi mdr2 (-/-) sviluppano foci di HCC.

Topi MDR2-/- Modello murino di epatite

NF-kB e HCC in topi MDR2-/-

Sistema:Topi MDR2 -/- sviluppano epatite e poi HCC a 6 mesi

Domanda:quale ruolo per NF-kB?

Metodo:Inattivazione di NF-kB nel fegato di topi MDR2-/-

Come?:Attivazione specifica nel fegato di IkB super-repressor

NF-kB é attivato nei topi MDR2-/-

+/+ -/- HCC from -/-

Immunoistochimica con antiNF-KB (p65)

Cosa succede se inattiviamo NF-kB?(attivando IkBSR con sistema TET-OFF)

IkBSR IkBSR

In presenza di DOX, il gene é spento, NF-kB é attivoIn assenza di DOX, il gene é acceso, ikBSR inattiva NF-kB

In presenza di DOX, il gene é spento, NF-kB é attivo

In assenza di DOX, il gene é acceso, ikBSR inattiva NF-kB

IkBSR inibisce NF-kB nel fegato

Staining nucleare di p65 é indice di attivitá di NF-kB:KO = MDR2-/-DM = MDR2-/-, IkBSR

Se inattiviamo NF-kB? (attivando IkBSR)

meno HCC!

MD

R2

-/-

MD

R2

-/-

Ikb

SR

acc

eso

MD

R2

-/-

Ikb

SR

sp

en

to

In che modo NF-kB favorisce lo sviluppo di HCC

Una funzione di NF-kB é inibire apoptosi.

Ipotesi:NF-kB favorisce HCC perché inibisce apoptosiSe cosí fosse, IkBSR dovrebbe far diminuire HCC perché aumenta il livello di apoptosi.

Quindi:Qual é il livello di apoptosi in topi MDR2-/- rispetto a topi MDR2-/- con NF-kB inattivato (da IkBSR)?

modello

epatite

NF-kB

apoptosi

HCC

IkBSR

MDR2-/-

dox

Inibizione di NF-kB (da parte di IkBSR) aumenta apoptosi e riduce incidenza HCC

Se blocco TNF, blocco NF-KB: tolgo l’inibizione dell’apoptosi,e apoptosi aumenta.

Quali geni target di Nf-kB?

Famiglia IAP:legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne inibiscono l’attività enzimatica e ne promuovono ubiquitinazione e degradazione

Quali cellule producono TNF e quali hanno NF-kB attivato?

macrofagi

endotelio

epatocitiNFkB

TNF

NFKB funziona sia in cellule

infiammatorie che in cellule tumorali

MODELLO di carcinogenesi chimica di HCC

NF-kB, cellule e citochine infiammatorie

Induzione HCC in topi adulti:-Trattamento singolo DEN

-Trattamento con promotore per 6 mesi -Comparsa HCC intorno ai 6-8 mesi

DNA alkylation

DENpromotorepromotore

HCCHCC

mesi

Carcinogeni e HCC:DEN

diethylnitrosamina

DANNO

HCC

DANNO

HCC

Ruolo NF-kB

Produzione di IL6

TLR

DEN

HCC

Attivazione macrofagi

Stimolazione cell tumorali

CELLULE NECROTICHE

WtNF-kB-/-

Trattamento con DEN induce proliferazione (ripopolamento) nel fegato

Proliferazione é dipendente da NF-kB

Proliferazione misurata nel fegato come % di cellule positive alla BrdU

Il trattamento con DEN induce IL6Questa induzione dipende da NF-kB

Immunoistochimica per IL6 su sezioni di fegato da topi wt o NF-kB -/-

WT NF-kB-/-

Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN:IL6 é richiesta per la proliferazione indotta da DEN

Proliferazione misurata nel fegato come % di cellule positive alla BrdU

Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN:IL6 é richiesta per sviluppo del tumore

E quindi aumenta il survival se togliamo IL6

Quali sono le cellule responsabili?Kupffer celI (KC): i macrofagi residenti del fegato!

KC isolate e trattate in piastra con LPS o frammenti necrotici:producono IL6 solo se la via di trasduzione del TLR4 é integra

NB: naturalmente fonte di “tissue damage” é anche epatite

conclusioniLe cellule e i mediatori dell’infiammazione sono una presenza importante dell’ambiente tumorale

Lo stato infiammatorio favorisce insorgenza e progressione del tumore

- Infiammazione precede e favorisce l’insorgenza del tumore- Attivazione oncogenica induce un’ambiente infiammatorio che favorisce la tumorigenesi

Chirurgia-chemioterapia-radiazioni:Le principali opzioni terapeutiche inducono infiammazione sistemica o localeCausa: danno tissutale o morte di cellule tumorali

Chirurgia: danno tissutale /infezioni – stress pathway

chemioterapia-radiazioni: induzione di necrosi

______________________________NB: Necrosi può avere duplice effetto:Morte di cellule infiammatorie pro-tumorali

cellule responsabili del microambiente infiammatorioMorte di cellule infiammatorie anti-tumorali

cellule effettrici della risposta immunitaria anti-tumorali

“therapy induced inflammation”Ulteriore livello di complessitá

Farmaci antiinfiammatori possono avere sia azione profilattica che terapeuticariducono incidenza o rallentano la crescita tumorale:Inibitori delle ciclo-ossigenasi (aspirina, inbitori di COX2): riduzione incidenza Colon Cancer, Breast cancer

Agire sull’infiammazione pro-tumorale: strategie.

Inibizione di dei pathway che mediano la crescita/sopravvivenza delle cellule tumorali in risposta alle citochine infiammatorieSequestro delle citochine /chemochine/recettori che mantengono il microambiente infiammatorio (antiIL6, anti TNF, anti CCR2)modulare la risposta infiammatoria che segue la terapiaEliminare cellule infiammatorie responsabili della progressione tumorale, preservando le cellule responsabili della risposta immunitariaInibizione selettiva di citochine pro-tumorali.

Terapia anti-infiammatoria come terapia antitumorale