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Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia
do Rio de Janeiro, Campus Rio de Janeiro.
Investigação da participação da Galectina-3 no
perfil fenotípico imune e no curso da infecção
aguda pelo Trypanosoma cruzi.
CEFAS AUGUSTO DE MEDEIROS PAIVA
Rio de Janeiro
Novembro, 2016.
ii
CEFAS AUGUSTO DE MEDEIROS PAIVA
Investigação da participação da Galectina-3 no perfil fenotípico
imune e no curso da infecção aguda pelo Trypanosoma cruzi.
Dissertação de Mestrado, apresentado como
requisito parcial a obtenção do grau de Mestre em
Bioquímica e Biologia Molecular pelo Programa
Multicêntrico de Bioquímica e Biologia Molecular
do Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Rio de Janeiro
Orientador: Professor Luiz Dione Barbosa de Melo
Co-Orientador: Georgia Correa Atella.
Rio de janeiro
Novembro, 2016.
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
P149 Paiva, Cefas Augusto de Medeiros,
Investigação da participação da Galectina-3 no perfil
fenotípico imune e no curso da infecção pelo
Trypanosoma cruzi./ Cefas Augusto de Medeiros
Paiva.- Rio de Janeiro, 2016. 101f : 21 cm.
Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia
Molecular) – Instituto Federal de Educação, Ciência
e Tecnologia do Rio de Janeiro, 2016.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Dione Barbosa de Melo
1. Galectina-3 2. Camundongo. 3. Trypanosoma I.
Melo, Luiz Dione Barbosa de. II. Título
IFRJ/CMAR/CoBib CDU 593.161
v
CEFAS AUGUSTO DE MEDEIROS PAIVA
Investigação da participação da Galectina-3 no perfil fenotípico
imune e no curso da infecção aguda pelo Trypanosoma cruzi.
Dissertação de Mestrado, apresentado como
requisito parcial a obtenção do grau de Mestre em
Bioquímica e Biologia Molecular pelo Programa
Multicêntrico de Bioquímica e Biologia Molecular
do Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Rio de Janeiro.
Aprovado pela banca examinadora em novembro de 2016.
Prof.. PhD Luiz Dione Barbosa de Melo (IFRJ), Membro Efetivo,
__________________________________
Profª PhD Joanna Reis Oliveira, (IFRJ), Membro Efetivo,
__________________________________
Profª PhD Landi Veivi Guillermo Costilla, (UNIRIO), Membro Efetivo,
__________________________________
Profª PhD Sheila Albert dos Reis, (IFRJ), Suplente Interno,
__________________________________
Profª PhD Renata de Meirelles Santos Pereira, (UFRJ), Suplente Externo.
v
“Não sei se a vida é curta ou longa para
nós, mas sei que nada do que vivemos
faz sentido se não tocarmos o coração
das pessoas.
Muitas vezes basta ser: colo que
acolhe, braço que envolve, palavra
que conforta, silêncio que
respeita, alegria que contagia,
lágrima que corre, olhar que
acaricia, desejo que sacia, amor
que promove.
E isso não é coisa de outro mundo, é o
que dá sentido à vida. É o que faz
com que ela não seja nem curta,
nem longa demais, mas que seja
intensa, verdadeira, pura
enquanto durar. Feliz aquele que
ensina o que sabe e aprende o que
ensina.”
Cora Coralina
ix
AGRADECIMENTOS
Agradeço muito a Deus e a todos que de alguma forma fizeram parte desta longa
caminhada de altos e baixos que gostamos de chamar de vida. Ao longo dela todas as dificuldades
e soluções que surgiram contribuíram para o ser que me tornei hoje, onde para alguns melhorei e
para outros nem tanto. O que importa é que esta caminhada é feita de fases não muito diferente
de um jogo, e o que escolhemos fazer e quem decidimos ter ao nosso lado durante essas fases é o
que dita se teremos mais facilidade ou dificuldade para passar delas. Meu pai usava sempre uma
frase para nos aconselhar a respeito de nossas companhias: “Diga-me com quem andas, que te
direi quem és”.
Sendo assim, eu gostaria de agradecer em especial aos meus pais Manoel Jorge de Oliveira
Paiva e Maria Cristina de Medeiros Paiva que, por vezes com pulso firme e com muitas
dificuldades, sempre me direcionaram ao caminho da educação com muito amor, frisando sempre
que o futuro reserva o que plantamos no presente. E juntamente agradeço aos meus irmãos Caio
e Hanny que desde sempre foram minha companhia no início da vida e hoje me orgulho em ver
cada um tomando o controle do seu próprio jogo com sucesso.
À minha noiva, e em breve esposa, Rhayane Peres de Oliveira da Silva que soube lidar
com todos os momentos de dificuldades e revoltas com amor e compromisso, demonstrando que
todo “carry” precisa no jogo de um “support” e em tudo me apoiou e me deu forças para
continuar. Que tenha em mente que a realização deste mestrado é uma demonstração de como o
amor sincero e verdadeiro, que antes eu não acreditava existir, atrelado ao compromisso e
dedicação é capaz de mudar a vida das pessoas para melhor. Eu te amo muito muié! Não
esquecendo de agradecer a dona Aldaris Peres que me acolheu como segunda mãe e me deu todo
o suporte possível quando mais precisei, juntamente com toda sua família que com carinho me
receberam de braços abertos.
Aos professores Luiz Dione, Juliene Ramos e Marcelo Alex que se empenham com
esforços incessantes para o bom andamento do laboratório de genética molecular do IFRJ. Foi a
paciência (muita paciência mesmo!) e o comprometimento de vocês com o exercício de
excelência da profissão e da pesquisa que me permitiram de alguma forma alcançar esse novo
patamar de ensino. Por maior proximidade, gostaria de agradecer em especial ao professor Luiz
ix
Dione que além de professor na vida profissional, tomei como um amigo pessoal. Saiba que não
vai se livrar de mim tão fácil! Deixo com todos vocês um pedaço da minha jornada e carrego
comigo toda carga de aprendizado, memórias e inevitável admiração que tenho por vocês
conseguirem nadar bravamente em direção a melhorias e ao ensino, quando toda maré no país
tenta arrastar nossa educação cada vez mais para perto da formação de seres não pensantes com
ignorância total de conhecimento!
Aos meus companheiros de trabalho por terem lidado tanto tempo comigo e ainda assim
permanecerem sãos, ou pelo menos em parte sãos. Em especial agradeço ao João de Séllos,
Michelle Chain e Igor Maciel que estiveram mais perto durante minha estadia no laboratório e me
ajudaram muito em tudo que precisei. Desejo a todos do laboratório muito sucesso e realizações
porque vocês merecem!
Aos meus familiares que sempre demonstraram preocupação e quando necessário me
ajudaram por muitas vezes financeiramente e por orações. Venho por meio deste demonstrar que
o apoio de vocês foi de suma importância para mim!
Aos meus amigos que mesmo com toda a distância que a vida insiste em manter entre nós
estiveram apoiando da melhor forma possível e que inclusive davam alguns choques de realidade
para demonstrar que a vida é curta e que precisamos trabalhar para viver, e não viver para
trabalhar.
Muito obrigado por todos vocês partilharem de caminhos, até mesmo por simplesmente
cruzarem ou caminharem momentaneamente comigo! É com lágrimas nos olhos e aperto no peito
que me recordo de todos aqueles amigos e familiares que hoje não se encontram mais comigo,
mas guardo comigo todo ensinamento, memória e amizade que um dia nos manteve próximos.
Na vida nada é para sempre e ao contrário do que muitos dizem, não sei se realmente duram o
tempo que tem que durar. Mas tenho certeza de que não importa o quanto se aproveita, quando as
coisas boas de verdade terminam e pessoas que amamos se vão ficamos sempre com gostinho de
quero mais...
ix
RESUMO
A doença de Chagas é uma doença causada pela infecção pelo Trypanosoma cruzi, um agente
etiológico identificado em 1909 pelo Dr. Carlos Chagas. O processo inflamatório nos tecidos
infectados pelo parasito se deve a citocinas que mediam um estado imune tolerogênico, o qual
favorece o processo de infecção, a persistência do parasito e também promove uma resposta
autoimune que caracteriza a fase crônica da doença. Alguns mediadores imunes, como a
Galectina-3, possuem funções pleiotrópicas associadas com a apoptose, resposta imune e
reconhecimento parasitário, na modulação da secreção de citocinas na proliferação, maturação, e
ativação de células imunes. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar a participação da
Galectina-3 na resposta imune de fase aguda da doença de Chagas utilizando como modelo de
infecção experimental camundongos C57Black/6J selvagens (wt) e C57Black/6J knockout para
Galectina-3 (Gal-3 KO). Buscamos associar a Galectina-3 com o perfil da resposta imune celular
in vivo e ex vivo e com o perfil de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias de resposta Th1
e Th2. Para as análises ex vivo foram utilizados macrófagos peritoneais infectados em cultura com
tripomastigotas da cepa Dm28c de T. cruzi mensurando a viabilidade celular, o brotamento
(liberação) de parasitos e as alterações nos níveis protéicos de Galectina-3. Demonstramos que
macrófagos provenientes de camundongos Gal-3 KO o sucesso infectivo é menor. Para as
abordagens in vivo, demonstramos que camundongos selvagens infectados com a cepa Y de T.
cruzi apresentaram maior parasitemia e mortalidade precoce, quando comparados com
camundongos Gal-3 KO. A regulação da resposta imune Th1/Th2 nos camundongos Gal-3 KO
foi alterada por modificações no perfil de citocinas, as quais passaram a ser expressas de forma
mais tardia nestes animais. Esse perfil revelou também um aumento de todas as citocinas pró-
inflamatórias com exceção de TNF-α, e um aumento tardio de citocinas anti-inflamatórias no 15º
dia pós-infecção. Além disso, nesse trabalho foram obtidas linhagens THP1 superexpressando a
Galectina-3 íntegra, Gal-3 deletado do domínio de reconhecimento de carboidratos, e linhagem
de THP-1 depletada de Galectina-3 por RNAi, as quais serão utilizadas em futuros ensaios de
resposta imune in vitro. Podemos sugerir que Galectina-3 atua no primeiro momento de resposta
à infecção pelo T. cruzi através do controle de ativação dos macrófagos, e continua regulando o
perfil de resposta Th1/Th2 através da sua capacidade de modular a interação parasito-hospedeiro,
a proliferação, ativação, diferenciação e apoptose de células imunes.
Palavras chaves: Galectina-3; Trypanosoma cruzi; camundongos, resposta imune.
ix
ABSTRACT
The Trypanosoma cruzi is an etiologic agent identified in 1909 by Carlos Chagas and its
infection causes Chagas disease. The inflammatory process in the parasite infected tissues is due
to cytokines that mediate a tolerogenic immune status, which favors the infection process, the
parasite persistence and also trigger an autoimmune response that characterize the disease
chronic phase. Some immune mediators like galectin-3 play pleiotropic functions associated
with apoptosis, parasite recognition and immune response, modulating the cytokines secretion,
ploriferation, migration and activation of immune cells. Our goal is through in vivo murine
experimental model using C57Black/6J wild type (wt) and galectin-3 knockout (Gal-3 KO)
mice, investigate the Gal-3 participation in the imunne response on Chagas disease acute phase.
We seek to associate the Galectin-3 with the cellular immune response profile in vivo and ex
vivo to the Th1/Th2 proinflamatory and antiinflamatory citokines profile. In the ex vivo
experiments we used peritoneal macrophages cultured infected with T. cruzi Dm28c strain to
measure cell viability, parasite burst and the alterations in the galectin-3 levels. We show that
the infective success is lower in macrophages provided from Gal-3 KO. Within in vivo
approach, we showed that wild type mice infected with Y stain of T. cruzi present higher
parasitemia when compared to Gal-3 KO mice. The Gal-3 KO mice cytokine profile is changed
– there is late expression of cytokines in those animals, which modified Th1/Th2 immune
response regulation. This profile also revealed a higher concentration of all antiinflamatory and
proinflamatory cytokines with the exception of TNF-α on the 15º day post infection.
Furthermore, we obtained THP1 linage cells overexpressing the Galectin-3 full-length protein,
Gal-3 CRD lacking the carbohydrate recognition domain and the THP1 depleted from Gal-3
with RNAi, which will be used in the future to immune response in vitro experiments. We can
suggest that Galectin-3 play a role in the first moment of Trypanosoma cruzi infection through
the control of macrophages activation, and continue regulating the Th1/Th2 response profile
through its capacity on modulate the host-parasite interaction, the proliferation, activation,
differentiation and apoptosis in immune cells.
Keywords: Galectin-3; Trypanosoma cruzi; mouse; imune response.
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo de vida simplificado do Trypanosoma cruzi. . ...............................................2
Figura 2 – Distribuição geográfica aproximada das DTU’s de T. cruzi. ................................3
Figura 3 – Imagem ilustrativa dos grupos de lectinas . .........................................................10
Figura 4 – Diferentes tipos de organização dos domínios nas galectinas de vertebrados. ..13
Figura 5 – Estrutura da Galectina-3. ......................................................................................14
Figura 6 – Padronização do ensaio de análise por citometria de fluxo.................................28
Figura 7 - Mapa do vetor pHIV-eGFP (Addgene #21373). ...................................................30
Figura 8. Análise do Potencial de Infecção In Vitro. .............................................................35
Figura 9. Análise da Viabilidade Celular in vitro no decorrer da infecção pelo
Trypanosoma cruzi. .................................................................................................................36
Figura 10. Avaliação das Alterações nos Níveis Proteicos de Galectina-3 frente a Infecção
pelo Trypanosoma cruzi. .........................................................................................................37
Figura 11. Gráficos de quantificação de citocinas no sobrenadante de cultura primária de
macrófagos peritoneais provenientes de camundongos C57Black/6J selvagens e knockouts
para Galectina-3. ......................................................................................................................39
Figura 12. Padronização da Concentração do Inóculo para Infecção in vivo por
Trypanosoma cruzi da cepa Y. ................................................................................................41
Figura 13. Análise da Parasitemia Comparativa entre Camundongos Isogênicos da
Linhagem C57Black/6J Selvagens e Knockout para Galectina-3 Infectados por
Trypanosoma cruzi da cepa Y. ................................................................................................41
Figura 14. Gráfico de Sobrevivência Comparativa entre os Camundongos Isogênicos
C57Black/6J Selvagens e Knockout para Galectina-3 Infectados com Trypanosoma cruzi
da Cepa Y..................................................................................................................................42
Figura 15. Investigação Fenotípica do Baço no Decorrer da Fase Aguda da Infecção pelo
Trypanosoma cruzi da Cepa Y Através do Peso do Órgão e Índice de Celularidade. ........44
Figura 16. Figura Ilustrativa da Esplenomegalia Observada nos Animais no 15° Dia de
Infecção por Trypanosoma Cruzi da Cepa Y. ........................................................................44
Figura 17. Determinação do Percentual de Macrófagos/Monócitos no Decorrer da Fase de
Incubação e Início da Fase Aguda da Infecção por Trypanosoma Cruzi da Cepa Y.. ........46
Figura 18. Avaliação das Populações de Linfócitos T no Baço de Camundongos
C57Black/6J Selvagens e Knockout para Galectina-3 Frente a Infecção por Trypanosoma
Cruzi. ........................................................................................................................................47
Figura 19. Avaliação da População de Células NK no Baço de Camundongos C57Black/6J
Selvagens e Knockout para Galectina-3 Frente a Infecção por Trypanosoma Cruzi. ........48
Figura 20. Quantificação de citocinas pró-inflamatórias no soro de camundongos
C57Black/6J selvagens e knockouts infectados com Trypanosoma cruzi da cepa Y. ..........51
Figura 21. Quantificação de citocinas anti-inflamatórias no soro de camundongos
C57Black/6J selvagens e knockout para Galectina-3 infectados com Trypanosoma cruzi da
cepa Y. .......................................................................................................................................52
Figura 22. Quantificação da citocina pró-inflamatória IL-17 no soro de camundongos
C57Black/6J selvagens e knockouts infectados com Trypanosoma cruzi da cepa Y. ..........53
Figura 23. Gel de eletroforese das amostras de PCR com Pfx DNA polimerase para
obtenção e massa dos amplicons Gal-3wt e Gal-3ΔCRD. .....................................................55
xi
Figura 24. Eletroforese da reação de PCR para confirmação das clonagens no plasmídeo
pHIV-puro+. ..............................................................................................................................55
Figura 25. Análise dos níveis proteicos de Galectina-3 após Transdução de THP-1. Extrato
proteico total das linhagens THP-1 wild type, THP-1 scramble, THP-1 shGal-3, THP-1 ..........57
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
Anti-IgG: anti-imunoglobulina G – ‘anti-immunoglobulin G’
Bax: Proteína X associada a Bcl-2 – ‘Bcl-2-Associated X Protein’
Bcl-2: Célula B de Linfoma 2 - ‘B-cell lymphoma 2’
CaCl2: Cloreto de cálcio – ‘Calcium chloride’
Células NK: Células Natural Killer – ‘Natural Killer cells’
Células Treg: Células T regulatórias – ‘Regulatory T cells’
CO2: Dióxido de Carbono – ‘Carbon Dioxide’
CRD: Domínio de Reconhecimento de Carboidratos – ‘Carbohidrate
Recognition Domain’
DNA: Ácido Desoxirribonucleico – ‘Deoxyribonucleic Acid’
DTT: 1,4 Ditiotreitol – ‘1,4 Dithiothreitol’
DTU: Discrete Typing Units
E. coli: Escherichia coli
ECM: Matriz extracelular – ‘Extracellular Matrix’
ERK 1/2: Cinase Regulada por Sinal Extracelular 1/2 – ‘Extracellular signal-
Regulated Kinase 1/2’
Gal-3: Galectina-3 – ‘Galectin-3’
GFP: Proteína Fluorescente Verde – ‘Green Fluorescent Protein’
GM-CSF: Fator Co-estimulante de macrófagos e granulócitos – ‘Granulocyte-
macrophage colony-stimulating factor’
Gp82: Glicoproteína 82 – ‘Glycoprotein 82’
HRP: Peroxidase de Rábano - ‘Horseradish Peroxidase’
IFN-γ: Interferon gama
IgG: Imunoglobulina G – ‘Immunoglobulin G’
IL-10: Interleucina 10 – ‘Interleukin 10’
IL-12: Interleucina 12 – ‘Interleukin 12’
IL-17a: Interleucina 17a – ‘Interleukin 17a’
IL-2: Interleucina 2 – ‘Interleukin 2’
IL-4: Interleucina 4 – ‘Interleukin 4’
IL-6: Interleucina 6 – ‘Interleukin 6’
JNK: Cinase Janus – ‘Janus Kinase’
kDa: Kilo Daltons
LAMC1: Laminina-γ I – ‘Laminin-γ 1’
LPS: Lipopolissacarídeo – ‘Lipoplysaccharide’
MGF: Fator de Crescimento de Macrófagos – ‘Macrophage Growth Factor’
MHC-1: Complexo principal de Histocompatibilidade classe 1 – ‘Major of
Histocompatibility Class 1’
MMP: Metalopeptidase de Matriz – ‘Metrix Metallopeptidase’
MMP-9: Metalopeptidase de Matriz 9 – ‘Matrix metallopeptidase 9’
MØ: Macrógafo – ‘Macrofage’
xiii
MTT – 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Brometo – ‘3-(4,5-
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide’
Na2HPO4: Fosfato de Sódio Dibásico – ‘Sodium phosphate dibasic’
NaCl: Cloreto de Sódio – ‘ Sodium Chloride’
NaH2PO4: Fosfato de Sódio Monobásico – ‘ Sodium phosphate monobasic’
NF-κB – Fator Nuclear κ B- ‘Factor Nuclear κ B’
NK: ‘Natural Killer’
NO: Óxido Nítrico – ‘ Nitric Oxide’
PAMP: Padrão Molecular Associado a Patógenos – ‘Patogens Associated
Molecular Pattern’
PARP: Polimerase Poli ADP Ribose - ‘Poly ADP Ribose Polymerase’
PBS: Tampão Fosfato Salino – ‘Phosphate Buffer Saline’
PCR: Reação de Polimerase em Cadeia –‘Polymerase Chain Reaction’
PEI: Polietilenoimina – ‘Polyethyleneimine’
PLC: Fosfolipase C – ‘Phospholipase C’
PRR: Receptor de Reconhecimento Padrão – ‘Pattern Recognition Receptor’
PS: Penicilina e Estreptomicina – ‘Penicilin and Streptomicin’
RNA - Ácido ribonucleico – ‘Ribonucleic Acid’
RNAm: RNA mensageiro – ‘Messenger RNA’
SDS: Dodecil Sulfato de Sódio – ‘Dodecyl Sodium Sulfate’
SFBI: Soro Fetal Bovino Inativado –‘Inativated Bovine Fetal Serum’
shRNA: RNA de silenciamento short hairpin – ‘short hairpin Silence RNA’
STAT-1: Sinal Transdutor e Ativador de Transcrição 1 – ‘Signal Transducer
and Activator of Transcription 1’
STAT-3: Sinal Transdutor e Ativador de Transcrição 3 – ‘Signal Transducer
and Activator of Transcription 3’
T. cruzi: Trypanosoma cruzi
TBS: Tampão Tris-fosfato salino – ‘Tris-phosphate Buffer Saline’
TCR: Receptor de células T – ‘T cell recetor’
TLR: Receptor do tipo Toll – ‘Toll-like Receptor’
TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa – ‘Tumor Necrosis Factor alfa’
Tris: Tris(hidroximetil)aminometano - ‘tris(hydroxymethyl)aminomethane’
Tris-HCl: Tris(hidroximetil)aminometano hidroclorado-
‘tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride’
CRD: Deletado a região de reconhecimento de carboidratos –‘Lacking the
Carbohidrate Recognition Domain’
Nocaute – ‘Knockout’
xiv
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................................................... 1
1.1 Trypanosoma cruzi e doença de Chagas ..........................................................................................1
1.1.1 Classificação do Trypanosoma cruzi. ............................................................................................1
1.1.2 Epidemiologia da doença de Chagas. ............................................................................................3
1.1.3 Resposta Imune Inata e Adaptativa na Doença de Chagas. ..................................................................6
1.2 Papel das Lectinas na Fisiologia Celular...........................................................................................8
1.2.1 Lectinas ..............................................................................................................................8
1.2.2 Galectinas. ........................................................................................................................12
1.2.3 Galectina-3 .......................................................................................................................13
1.3 Influência de Modelos Murinos na Experimentação ..............................................................................16
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................................................19
2.1 Objetivo Geral ..........................................................................................................................19
2.1 Objetivos Específicos .................................................................................................................19
3. METODOLOGIA ............................................................................................................................................................................... 20
3.1 Camundongos Utilizados .............................................................................................................20
3.2 Parasitos Utilizados ..................................................................................................................20
3.3 Cultivo in vitro de formas epimastigotas .........................................................................................20
3.4 Cultivo in vitro de formas tripomastigotas. ......................................................................................20
3.5 Metaciclogênese ......................................................................................................................21
3.6 Cultura Primária de Macrófagos Peritoneais ....................................................................................21
3.7 Ensaios de infecção e produção de tripomastigotas ............................................................................22
3.8 Ensaio de viabilidade celular (MTT) ................................................................................................22
3.9 Obtenção dos extratos proteicos ..................................................................................................23
3.10 SDS-PAGE e Western blotting ......................................................................................................23
3.11 Infecção in vivo e manutenção das colônias de camundongos ................................................................24
3.12 Obtenção de Esplenócitos. ..........................................................................................................25
3.13 Citometria de Fluxo ..................................................................................................................26
3.14 Quantificação de Citocinas por CBA (Cytometric Bead Array) ...............................................................28
3.15 Reação em cadeia da polimerase(PCR) de Galectina-3 .......................................................................29
3.16 Plasmídeo utilizado ..................................................................................................................30
3.17 Restrição e ligação de DNA .........................................................................................................30
xv
3.18 Eletroforese de DNA .................................................................................................................31
3.19 Cepa de bactéria .....................................................................................................................31
3.20 Transformação de E. coli ..........................................................................................................31
3.21 Transfecção e Transdução Lentiviral .............................................................................................32
4. RESULTADOS ........................................................................................................................................................................... 34
4.1 Análise da viabilidade celular e do potencial de infecção in vitro no decorrer da infecção pelo T. cruzi. ..............34
4.2 Avaliação das alterações nos níveis protéicos de Galectina-3 frente à infecção pelo T. cruzi. .........................37
4.3 Investigação do perfil de produção de citocinas pró e anti-inflamatórias no decorrer da infecção pelo T. cruzi. ...38
4.4 Análise da parasitemia e mortalidade durante a fase aguda da infecção com cepa Y de T. cruzi. ......................40
4.5 Investigação fenotípica da esplenomegalia no decorrer da fase aguda pelo peso do órgão e índices de celularidade.
43
4.6 Determinação do percentual de diferentes populações de células T (Totais, T citotóxicas, T helper, NK, etc),
macrófagos/monócitos no decorrer da fase aguda de infecção pelo T. cruzi. .................................................45
4.7 Relacionar o perfil celular imune com o perfil de produção de citocinas pró e anti-inflamatórias no decorrer da
infecção pelo T. cruzi......................................................................................................................49
4.8 Clonagem de Galectina-3 selvagem e deletada do domínio de reconhecimento de carboidrato (mutante ∆CRD) em
vetor lentiviral. ............................................................................................................................54
4.9 Transdução da linhagem monocítica THP1 com construções lentivirais e posterior seleção. ...........................56
4.10 Análise preliminar da infecção nas linhagens depletadas ou superexpressando Galectina-3 na forma selvagem ou
mutante. 56
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................................................................. 58
6. CONCLUSÕES .......................................................................................................................................................................... 69
7. PERSPECTIVAS ....................................................................................................................................................................... 70
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................................................................ 71
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Trypanosoma cruzi e doença de Chagas
1.1.1 Classificação do Trypanosoma cruzi.
O agente etiológico Trypanosoma cruzi, foi identificado em 1909 pelo doutor
Carlos Chagas, também responsável pela identificação do mecanismo de transmissão da
doença e seu vetor. Por esse motivo a doença caracterizada pela infecção por este parasita
recebeu o nome de doença de Chagas (CHAGAS, 1909a; CHAGAS, 1909b; CHAGAS,
1909c).
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado da classe Kinetoplastea, ordem
Tripanosomatida, família Tripanosomatidae e gênero Trypanosoma (ADL et al., 2012).
É um parasita que alterna seu ciclo de vida entre um hospedeiro vertebrado (mamíferos)
e um invertebrado (hemípteros triatomíneos), por isso, é classificado como heteroxênico.
Pode ser transmitido por mais de 130 espécies de vetores triatomíneos, principalmente os
dos gêneros Pantrongylus, Rhodnius, e Triatoma, para mais de 150 espécies de
mamíferos domésticos e selvagens incluindo o humano (SÁ et al., 2016). A forma
tripomastigota sanguícola, presente no hospedeiro vertebrado, é internalizada pelo
triatomíneo durante o repasto sanguíneo, ao alcançar o intestino médio do inseto se
diferencia na forma epimastigota, que é capaz de proliferação. Ao chegar no intestino
posterior, a forma epimastigota se diferencia na forma tripomastigota metacíclica, capaz
de infectar o hospedeiro vertebrado, sendo liberado nas fezes e urina do hemíptero durante
o repasto sanguíneo. As fezes e urina contendo o parasito entram em contato com a lesão
causada pelo inseto, promovendo assim a contaminação do hospedeiro vertebrado. A
forma tripomastigota invade as células do hospedeiro vertebrado diferenciando-se
posteriormente na forma amastigota intracelular, que é capaz de proliferar de modo
intracelular diferenciando-se na forma tripomastigota sanguícola, levando à lise celular e
infecção de novas células, ou dando início a um novo ciclo evolutivo do parasito (Figura
1) (CHAGAS, 1909a; CHAGAS, 1909b; CHAGAS, 1909c).
2
Figura 1 – Ciclo de vida simplificado do Trypanosoma cruzi. Demonstração de todos os estágios
evolutivos do parasito, nos hospedeiros vertebrado e invertebrado. Adaptado de CASTRO, 2011.
O Trypanosoma cruzi vem sendo amplamente estudado desde o final dos anos
70, onde se tornou um modelo experimental para epidemiologistas moleculares e
geneticistas de população. Consequentemente este protozoário parasita está entre os
agentes patogênicos que tiveram sua estrutura e evolução mais bem estudadas. As amplas
condições ecológicas naturais somadas às condições laboratoriais que levaram a uma
grande heterogeneidade ao longo de muitos anos em cultura, provocaram uma grande
diversidade e multiplicidade genotípica e fenotípica dentro da espécie (ZINGALES et al.,
2012). Sendo assim, cepas que apresentavam características muito próximas, mas que
ainda assim poderiam ser diferenciadas por marcadores específicos, foram classificadas
em grupos baseando-se em sua bioquímica e marcadores moleculares em comum. Tais
grupos foram denominados DTU (Discrete Typing Units) e variam de TcI a TcVI. Além
destas existe ainda a DTU que se-acredita ser a ancestral das cepas TcI e TcII, identificada
em morcegos, sendo assim classificada com Tcbat (COTTONTAIL et al., 2014).
A variabilidade genética entre as DTU influencia em vários aspectos diferentes
que envolvem a interação parasita-vetor que é dependente da distribuição geográfica dos
mesmos (Figura 2), variações clínicas da doença de Chagas que provavelmente estão
3
fortemente associadas com as características intrínsecas do parasita, do hospedeiro e da
concomitante ocorrência de diferentes cepas no mesmo hospedeiro (ARAÚJO et al.,
2016; LIMA et al., 2015; ZINGALES et al., 2012).
Figura 2 – Distribuição geográfica aproximada das DTU’s de T. cruzi nos ciclos de transmissão
selvagem e doméstica. Adaptado de ZINGALES etal., 2012.
1.1.2 Epidemiologia da doença de Chagas.
Após mais de 100 anos da descrição da doença pelo Dr. Chagas, ainda existem
entre 10 e 15 milhões de pessoas infectadas pelo T. cruzi na América Latina, em torno
de 20 a 40% apresentando sintomas da doença (MARTINS-MELO et al., 2014). Se
tratando do Brasil, a transmissão domiciliar foi erradicada no ano de 2006, e estudos
feitos com amostras de doadores demonstraram que a quantidade de pessoas infectadas
reduziu substancialmente, não só no Brasil, mas em todos os países da América Latina
(RASSI et al., 2010). Ainda assim, estimativas da Organização Mundial de Saúde
indicam que 6-7 milhões de pessoas estão infectadas de forma sintomática e a maior
parte delas na América latina (WHO, 2016).
Utilizando métodos estatísticos, Bruce Y Lee e seu grupo em 2013 estimaram
um gasto anual de aproximadamente 120 milhões de dólares em gastos no tratamento
de pacientes com doença de Chagas nos Estados Unidos, o segundo país na tabela de
gastos, perdendo apenas para o Brasil que é o primeiro (LEE, et al., 2013). Estima-se
que 45.000 imigrantes latino-americanos que vivem nos Estados Unidos apresentem o
quadro de cardiomiopatia chagásica e 300.000 estejam infectados com o T. cruzi
4
(BERN & MONTGOMERY, 2009). O que demonstra que a doença de Chagas,
inicialmente predominante em áreas endêmicas rurais, se espalhou com a migração de
pessoas para áreas urbanas e países não endêmicos na Europa, América do Norte e
Pacífico se tornando um problema mundial (SCHMUNIS & YADON, 2010).
1.1.3 Fisiopatologia e sintomatologia da doença de Chagas
A doença de Chagas é uma doença crônica e sistêmica causada pela infecção
pelo protozoário T. cruzi. A doença é caracterizada por um curto período de infecção
aguda com sintomas normalmente brandos e variáveis que dura entre 2-3 meses, seguido
de uma fase assintomática que pode durar a vida inteira quando não tratada (TANOWITZ
et al., 2015). Os sinais típicos da fase aguda humana são o chagoma, ou seja, lesão na
porta de entrada do parasito que promove inchaço local e a parasitemia que nada mais é
que a presença do parasita no sangue circulante. A parasitemia desenvolve-se por uma
fase indetectável microscopicamente denominada período pré-patente, uma fase com
parasitemia detectável e crescente e uma terceira, com parasitemia detectável e
decrescente. Após a fase aguda, geralmente benigna e às vezes assintomática, segue-se
uma fase clínica conhecida como “indeterminada” ou “inaparente”, na qual se associam
ausência de sintomatologia clínica com sorologia positiva (JORGE & CASTRO, 2000).
Em torno de 30%-50% dos infectados progridem desta fase assintomática indeterminada
para a fase crônica da doença de Chagas que vem acompanhada de cardiomiopatias, em
alguns casos associadas com aneurismas, taquicardia ventricular e falência cardíaca
repentina. Além disso, o paciente pode desenvolver a forma cardiodigestiva, ou
gastrointestinal da doença caracterizada pelo megacólon e megaesôfago (RASSI et al.,
2010; FORSYTH et al., 2016; TANOWITZ et al., 2015). Aproximadamente 1/3 dos
pacientes podem desenvolver dilatação em qualquer porção do trato gastrointestinal
como megacólon e megaesôfago, desordens gastrointestinais como acalasia (perturbação
no funcionamento dos esfíncteres e espasmos no esôfago), distúrbios no esvaziamento
gástrico, trânsito intestinal alterado e desordens motoras do cólon e vesícula biliar. Tais
manifestações ocorrem como resultado de danos no sistema nervoso entérico (MATSUA
et al., 2009).
A cardiomiopatia é a principal manifestação da doença de Chagas. Por muito
tempo acreditou-se que a cardiomiopatia chagásica era uma doença parasitária
proveniente da infecção aguda pelo Trypanosoma cruzi, induzida pela resposta
inflamatória à presença de grande quantidade de parasitas na fase crônica (CUNHA-
5
NETO et al., 1995). No entanto, hoje sabe-se que a cardiomiopatia chagásica é fruto de
uma interação multifatorial, persistente e variável entre o parasita e seu hospedeiro
(LESCURE et al., 2010). A resposta imune à infecção crônica por formas
tripomastigotas e amastigotas promove infiltrados de células mononucleares no
endocárdio, miocárdio e pericárdio, levando à fibrose tecidual. Quanto maior a resposta
inflamatória local, mais intenso é o dano no tecido cardíaco (MARINHO et al., 2009).
As manifestações clínicas envolvem arritmias, tromboembolismo, insuficiência
cardíaca, derrame e morte repentina (BIOLO et al., 2010). Assim, apesar da escassez de
parasitas nas lesões cardíacas, sugere-se que a presença do parasita no coração é que
promove o processo de inflamação crônica com fibrose e perda de células miocárdicas
(MARINHO et al., 2009).
1.1.4 Tratamento da Doença de Chagas
As drogas utilizadas atualmente visam a fase aguda da doença, sendo pouco
eficientes na fase crônica e variando sua eficácia de acordo com a cepa de T. cruzi a ser
combatida (SCHOFIELD et al., 2006; MARTINS-MELO et al., 2012; LEE et al., 2013;
SCHMUNIS & YADON, 2010). Atualmente as únicas medicações utilizadas no
tratamento contra o T. cruzi são o benzonidazol e o nifurtimox, sendo ambos mais
efetivos no estágio inicial da infecção. O tratamento atual apresenta chance de cura que
beira os 100% no tratamento de neonatos infectados de forma congênita e no tratamento
de pacientes na fase aguda chega a ultrapassar 60% (FORSYTH et al., 2016). O
tratamento com a combinação destas drogas chega a possibilitar a chance de 50-60% de
cura na fase crônica, porém este tratamento apresenta uma toxicidade considerável
(SILVA et al., 2016) com seguintes complicações: reações cutâneas como dermatites
alérgicas; desordens gastrointestinais como intolerância digestiva; desordens
neurológicas como polineurites e neuropatia periférica; angiodema; depressão da medula
óssea; hepatite tóxica; e especificamente o Nifurtimox possui efeito colateral levando à
desordens neuropsiquiátricas (CERVEY et al.,2016).
Encontrar um tratamento apropriado, ou seja, eficiente para todos os pacientes
tem sido um desafio complexo, pois devido a toxicidade o tratamento já existente é
contraindicado em algumas instâncias, como por exemplo, durante a gravidez
(MORAES et al., 2014). Apesar dos diversos alvos moleculares explorados como
derivados terpenóides (ALMEIDA et al., 2016) e naftoquinonas (DIOGO et al., 2013),
a alta eficiência e baixa toxicidade de algumas moléculas encontradas como a dos
6
compostos nitroheterocíclicos (MORAES et al., 2014), os ensaios clínicos não têm sido
bem-sucedidos. Grande parte da dificuldade de se obter tal tratamento está relacionada
com as diferenças entre as cepas dos parasitos e a complexidade das interações destas
cepas com o hospedeiro (SILVA et al., 2016).
Alguns estudos mostram evidências de desenvolvimento de mecanismos de
resistência do parasito, tanto em humanos como em animais (ALSFORD et al., 2012).
Além disso, mesmo com o sequenciamento do genoma do parasita e as diversas
informações obtidas sobre suas vias de sinalização, as informações ainda são escassas
e potenciais alvos terapêuticos carecem de investigação (EL- SAYED et al., 2005).
1.1.3 Resposta Imune Inata e Adaptativa na Doença de Chagas.
A infecção humana pelo T. cruzi ativa um conjunto de reações que levam ao
reconhecimento do parasito e à montagem de uma resposta imune específica bastante
eficaz, capaz de controlar o crescimento parasitário por toda a vida do indivíduo. Nos
indivíduos imunocompetentes, a articulação da resposta imune ocorre em três etapas. A
primeira se desenvolve nas duas primeiras semanas pós-infecção, antes do aparecimento
de parasitemia patente e ascendente, e depende dos mecanismos efetores da resposta
imune inata, com destaque para a resposta inflamatória (JORGE & CASTRO, 2000). A
segunda etapa, que se desenvolve nos estágios intermediário e tardio da fase aguda da
infecção, quando a fase ascendente da parasitemia é refreada e controlada até atingir
novamente níveis subpatentes, e depende dos componentes celulares e humorais da
resposta imune específica adquirida. E a terceira etapa, também dependente da resposta
imune específica, se mantém por toda a fase crônica da infecção e é responsável pela
manutenção da parasitemia subpatente por longo prazo, por forte sorologia positiva e pela
memória imunológica que garante resistência à reagudização pelo parasito infectante ou
por qualquer outra cepa do T. cruzi no hospedeiro imunocompetente (JORGE &
CASTRO, 2000).
O sistema imune parece estar envolvido no controle dos três principais aspectos
da doença de Chagas: replicação do parasita, na sua propagação, e na reação inflamatória
nos tecidos infectados (JUNQUEIRA et al., 2010). O sistema imune inato é composto
por proteínas solúveis e receptores de membrana expressos pelas linhagens
indiferenciadas para identificar substâncias potencialmente nocivas. Seus principais
componentes celulares são os macrófagos residentes e inflamatórios, as células NK,
7
outras células apresentadoras de antígenos como as células dendríticas, e algumas células
T primitivas.
A característica comum a todas as células da resposta imune inata é a expressão
de moléculas de superfície com capacidade de reconhecimento dos componentes solúveis
da resposta inata, bem como de reconhecimento de padrões estruturais diferentes do
próprio, especialmente carboidratos e glicolipídios complexos comuns em
microorganismos. Assim, diversos tipos de receptores de superfície são moléculas de
reconhecimento características dessas células, tais como os receptores scavenger, os
receptores para complemento, o receptor para LPS e os receptores lectínicos como o
receptor de manose ou as galectinas (JORGE & CASTRO, 2000). Estudos em
camundongos já evidenciaram que a interação do T. cruzi com as células do hospedeiro
responsáveis pela resposta imune inata como macrófagos e outros tipos celulares
envolvidos é mediada por PRR’s (Pattern Recognition Receptors – Receptores de
Reconhecimento de Padrão) como os TLR’s (Toll Like Repectors – Receptores do Tipo
Toll), que reconhecem PAMP’s (Pathogen-Associated Molecular Pattern – Padrão
Moleculares Associado à Patógenos) presentes na superfície do parasito. Após o
reconhecimento, os TLR’s enviam um sinal através do domínio citoplasmático Tol1/IL-
1R recrutando moléculas adaptadoras citosólicas incluindo MyD88 (Myeloid
Differentiation primary-response protein 88), que ativa essas células induzindo a ativação
do fator nuclear-κB (NFκB), levando assim à produção de citocinas pró-inflamatórias e
integração da resposta imune inata com a adaptativa (MACHADO et al., 2012).
Uma vez ativados, os MØ’s e células NK produzirão IL-12 que leva à produção
de IFN-γ, o que por sua vez, gera um feedback positivo na produção do IL-12, TNF-α e
óxido nítrico (NO) responsáveis pela eliminação dos parasitos. Há ainda um
favorecimento do recrutamento de células T pelo INF-γ através da produção de
quimiocinas e moléculas de adesão (ANDRADE et al., 2014).
Nos estágios iniciais da infecção experimental em murinos, a produção de
proteínas inflamatórias e ativação de células citolíticas se tornam essenciais para o
controle dos parasitos. A proteína 2-microglobulina se associa com produtos do loci de
MHC-1 (Major of Histocompatibility Class 1), essa associação promove o
desenvolvimento de células TCD8+ e promove a apresentação de antígenos para
diferenciação das mesmas. Camundongos no qual o gene que codifica a 2-
microglobulina foi deletado por recombinação homóloga, falham em expressar MHC de
classe 1, sendo assim, se mostraram deficientes na resposta citotóxica mediada por
8
linfócitos T CD8+ e na produção dessas células. Tais camundongos apresentam
parasitemia mais alta e morte precoce quando infectados pelo T. cruzi (TARLETON et
al., 1992).
Também foi observado um papel orquestrador da resposta imune mediada por
linfócitos T CD4+ que atuam auxiliando a resposta humoral principalmente na produção
de IFN- (JUNQUEIRA et al., 2010). Como demonstrado por Limon-Flores e seu grupo
(2010), a atuação dos linfócitos T CD4+ é essencial para promover o estímulo de
diferenciação de linfócitos T CD8+, e assim atuarem no combate ao T. cruzi.
Camundongos C57Black/6 knockouts para CD4 e CD8 foram infectados e apresentaram
parasitemia muito aumentada quando comparada com a parasitemia de animais selvagens
(LIMON-FLORES et al., 2010).
Além do papel de quimiotaxia e ativação de células do sistema imune, as
citocinas, proteínas catiônicas, transferrinas e outras proteínas do sistema complemento
ativadas pela via alternativa, são importantes fatores do sistema imune inato que
promovem resistência natural à infecção e redução da parasitemia, lise de tripomastigotas
e atividade tóxica contra as formas de T. cruzi. (TEIXEIRA et al, 2011).
É sabido que a resposta imune ideal não visa somente o controle dos parasitos,
mas também um papel regulatório que impeça grandes danos aos tecidos do hospedeiro.
Experimentos demonstraram a função essencial da citocina IL-10 na imunomodulação da
resposta pró-inflamatória mediada por TNF-α em tecidos de camundongos infectados
(HOLCHER et al, 2000). Camundongos infectados com tripomastigotas da cepa Y
quando tratados com um composto que estimulou o aumento de IL-10 sérico
apresentaram alta parasitemia e morreram mais cedo que camundongos infectados que
não receberam a droga (PUPULIN et al., 2016). O controle da resposta à infecção pelo T.
cruzi está relacionado também com as células NK, que através de STAT-1 regulam a
expressão de IFN-γ e IL-10 promovendo um balanço de resposta Th1/Th2, por isso é
necessário que haja um balanço entre as respostas pró e anti-inflamatórias (KULKARNI
et al., 2015).
1.2 Papel das Lectinas na Fisiologia Celular
1.2.1 Lectinas
As lectinas são uma classe de proteínas diversas de origem não imune, que
possuem pelo menos um domínio de interação não catalítico, o que as permite reconhecer
9
seletivamente carboidratos e se ligar especificamente de forma reversível com alta
especificidade a eles na natureza sem alterar sua estrutura (LANOO & VAN DAMME
2010; YAMAGUCHI & NAGAE, 2015). As especificidades e afinidades das lectinas por
seus ligantes são determinadas por diversos fatores incluindo composição, formato e
densidade dos glicanos (YAMAGUCHI & NAGAE 2015).
Por serem proteínas que possuem pelo menos um domínio de reconhecimento
de carboidratos (CRD – Carbohidrate Recognition Domain), diferentes classificações em
tipos de lectinas foram desenvolvidas de acordo com as classes de carboidratos
reconhecidos por elas, as relações evolucionárias e as similaridades estruturais (LANOO
& VAN DAMME, 2010). Sendo assim, podemos dividir as lectinas em três grandes
grupos gerais: merolectinas, hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS & VAN
DAMME, 1995; CAO & LV, 2016).
O grupo de merolectinas é formado por proteínas constituídas por um único
polipeptídeo e que possuem apenas um CRD. São proteínas que devido seu caráter
monovalente, são incapazes de precipitar glicoconjugados ou de aglutinar células. O
grupo das hololectinas é formado por proteínas que possuem exclusivamente dois ou mais
CRD’s, que podem ser formados por oligomerização de proteínas que possuem CRD’s
idênticos ou homólogos. Este grupo abrange todas as lectinas que possuem múltiplos
sítios de ligação com carboidratos, e por isso, as proteínas que constituem este grupo
possuem a capacidade de aglutinação e de precipitar glico-conjugados. O grupo das
quimerolectinas é formado por proteínas fusionadas que além de possuir um ou mais
CRD’s, possuem também um outro domínio catalítico ou de outra função conhecida,
disposto em tandem e que seja capaz de atuar independente do domínio de
reconhecimento de carboidratos. As quimerolectinas podem se comportar como
merolectinas formando apenas uma ligação a carboidratos, ou como uma hololectina se
ligando a vários e promovendo aglutinação (Figura 3) (PEUMANS & VAN DAMME,
1995).
10
Figura 3 – Imagem ilustrativa dos grupos de lectinas classificados de acordo com a composição
estrutural. Adaptado de PEUMANS & VAN DAMME, 1995.
As lectinas estão distribuídas em uma grande variedade de microrganismos,
animais e plantas (CAO & LV, 2016). Em plantas, as lectinas têm função conhecida de
repelir possíveis predadores ou patógenos em potencial, enquanto em animais é
frequentemente associada a processos de interação celular (YAU et al., 2015). Devido à
alta especificidade de interação com certos tipos de carboidratos, essa classe possui
proteínas que atuam em funções biológicas importantíssimas como desenvolvimento
tecidual, regulação do sistema imune desde o reconhecimento de patógenos até a ativação
da resposta inflamatória, sinalização celular, embriogênese e adesão celular
(BOJAROVÁ & KREN, 2016; CAO, & LV, 2016).
Apesar das diversas funções em que atuam, uma característica que todas as
lectinas compartilham é o envolvimento com o sistema imune em processos biológicos,
tanto normais quanto patológicos, variando apenas o grau da interação com o sistema
imune (YAU et al., 2015). Tratando-se de infecções, as lectinas funcionam como
receptores de superfície celular atuando como PRR’s, ou moléculas solúveis que
reconhecem e opsonizam através da interação com açúcares específicos que compõem
moléculas presentes na superfície de patógenos denominadas PAMP’s (KOLOGRAIAKI
et al., 2016; DRUMMOND & LIONAKIS, 2016; ROMERO et al., 2016; MASON &
TARR, 2015).
Mas a alta especificidade das lectinas do hospedeiro também é uma ferramenta
utilizada por alguns patógenos como forma de defesa, um exemplo disso é a interação
com ácidos siálicos. Os ácidos siálicos são açúcares ácidos que possuem nove esqueletos
carbônicos presentes, predominantemente, no resíduo terminal de glicoproteínas e
glicolipídios de superfície (SCHAUER et al., 2011; SINGH & SUNDAR, 2014). Atuam
11
em diversos processos celulares como ligantes para lectinas imunoglobulina-like,
elemento de defesa contra diversos tipos de receptores, barreira física de carga negativa
utilizada por células e patógenos, regulação da ativação de células imune e
extravasamento leucocitário (VARKI & GAGNEUX, 2012; SCHAUER et al., 2011).
Na infecção por Leishmania donovani, apesar dos ácidos siálicos em geral
servirem para sinalização e apoptose nos hospedeiros, a interação de ácidos siálicos
presentes na superfície do parasito com os receptores que os reconhecem promove a
supressão de funções efetoras do sistema imune inato estabelecendo o sucesso na infecção
em macrófagos (ROY & MANDAL, 2016). Sendo assim, uma gama de outros patógenos
intracelulares como: Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Neisseria meningitides, Campylobacter jejuni e Trypanosoma cruzi, são capazes de
produzir ou adquirir moléculas contendo ácido siálico, expondo-as em sua superfície e
amenizando assim a resposta imune no hospedeiro (KHATUA, B. et al., 2013; JACOBS,
T. et al., 2010).
Particularmente em Trypanosoma cruzi, a membrana celular é coberta por
estruturas parecidas com mucinas que são ancoradas por moléculas de
glicofosfatidilinositol. Essas estruturas denominadas glicanas são altamente sialiladas
apesar dos parasitos serem incapazes de produzir ácidos siálicos por si só (BUSCAGLIA
et al., 2006). Isso é possível porque o parasito possui uma enzima chamada trans-sialidase
que cliva ácidos siálicos de gliconjugados do hospedeiro e transfere para estruturas
presentes na superfície do parasito, ricas em resíduos de serina e treonina que são sítios
aceptores para adição de oligossacarídeos O-ligados (JACOBS et al., 2009). O papel
desta enzima promovendo a sialilação em Trypanosoma cruzi é fundamental para
infecção, uma vez que confere ao parasito resistência ao sistema complemento do
hospedeiro (TOMLINSON et al., 1994).
Essas moléculas parecidas com mucinas presentes na superfície do parasito são
expressas por regiões poligênicas. A expressão dessas moléculas varia na superfície do
parasito quanto a sua forma, ou seja, em epimatigotas são encontradas mucinas de 30-50
kDa enquanto na forma tripomastigota encontran-se mucinas de 60-200 kDa (JACOBS
et al., 2009). Não só relacionada com a forma do parasito, a expressão das mucinas
também varia de acordo com a DTU no qual o parasito pertence. Um estudo de infecção
em camundongos C57Black/6J realizado com Trypanosoma cruzi das cepas Tuhuantepec
(TCI) e Tulahuen (TCII) relacionou a parasitemia com a atividade da trans-siladase pela
presença de moléculas sialiladas nos parasitas. Observou-se que parasitos da cepa
12
Tuhuantepec foi incapaz de gerar infecção in vivo e apresentou menos moléculas
sialiladas na superfície, já os parasitos da cepa Tulahuen apresentaram uma maior
quantidade de moléculas sialiladas na superfície e uma alta parasitemia nos animais.
Ainda no mesmo trabalho quando realizadas infecções in vitro ambas as cepas geraram o
mesmo potencial infectivo. Esses dados sugerem que altos níveis de sialilação devem
exercer funções críticas durante a infecção e replicação do parasito, além de promover
uma modulação do sistema imune do hospedeiro para favorecer a infecção pelo
Trypanosoma cruzi (ERDMANN et al., 2009).
É importante o conhecimento aprofundado nos aspectos da interação lectina-
glicano, tanto in vitro quanto in vivo, pois estes estudos mais aprofundados podem ser
utilizados de forma eficiente no desenvolvimento futuro de biotecnologias de bioimagem,
endereçamento e liberação de drogas marcadas, diagnósticos e métodos de análises
biológicas (CAO & LV, 2016).
Além disso, baseando-se nas propriedades defensivas e na capacidade de induzir
apoptose já atribuída às proteínas da classe das lectinas, muitos estudos vêm sendo
desenvolvidos buscando utilizar lectinas animais como alvo e de plantas como uma opção
de tratamento contra células cancerosas (YAU et al., 2015).
1.2.2 Galectinas.
As galectinas são um grupo de proteínas lectinas encontradas amplamente
em animais, que possuem o domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD –
Carbohidrate Recognition Domain) altamente conservado evolutivamente e apresentam
uma alta similaridade sua sequência motivo. As galectinas reconhecem especificamente
glicanas, tanto de forma livre quanto associadas a glicoproteínas e glicolipídeos, que
possuam -galactosídeos em sua estrutura (BOJAROVÁ & KREN, 2016; VASTA et al.,
2015; NABI et al., 2015). Foram inicialmente isoladas como proteínas ligantes de -
galactosídeos, e posteriormente classificadas como uma família de 15 genes diferentes
em mamíferos que codificam um ou dois CRD’s de ~130 aminoácidos (COOPER, 2002;
NABI et al., 2015).
Em vertebrados essas proteínas apresentam três formas de interação e
organização dos seus domínios, sendo assim classificadas em três tipos: proto, repetição
em tandem e quimera (Figura 4) (VASTA et al., 2015; RAPOPORT & BOVIN, 2015).
As gelectinas do tipo proto (galectina-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 e -15) possuem
13
apenas um CRD com 130 aminoácidos por subunidade, sendo usualmente encontradas na
forma de homodímero ligado de forma não covalente. Galectinas de repetição em tandem
(galectina-4, -6, -8, -9 e -12) apresentam dois CRD’s homólogos, com afinidade de
ligação por carboidratos diferentes e que estão separados por uma cadeia polipeptídica
única de até 70 aminoácidos. A gelectina-3 é a única galectina quimera, sendo capaz de
formar oligômeros (LIU et al., 2012; VASTA et al., 2015; NABI et al., 2015).
Figura 4 – Diferentes tipos de organização dos domínios nas galectinas de vertebrados. Adaptado de
RAPOPORT & BOVIN, 2015.
As galectinas participam de processos celulares básicos como crescimento
celular, apoptose, diferenciação, adesão célula-célula e célula-matriz, tráfego de vesículas
e sinalização. Além disso, o envolvimento destas proteínas em processos patofisiológicos
como infecção, aterosclerose e carcinogênese tem sido amplamente descrito nos últimos
anos (VAN DER HOEVEN et al., 2016; BOJAROVÁ & KREN, 2016).
1.2.3 Galectina-3
A Galectina-3 é uma proteína lectina multifuncional que apesar do seu
gene codificar uma proteína com massa molecular calculada de 26,1kDa com 250
aminoácidos, foi descrita com massa molecular entre 32-35 kDa. É expressa
principalmente por células epitelias, endoteliais e macrófagos (BALAN et al., 2010;
CHEN & KUO, 2016). A Galectina-3 é a lectina mais bem estudada e constituída por três
domínios distintos: um domínio N-terminal, um domínio colágeno-like rico em prolina e
um domínio C-terminal que possui o CRD (DESMEDT et al., 2016). Esta proteína é
codificada por um único gene em humanos, o gene LGALS3, composto de 5 íntrons e 6
exons localizado no cromossomo 14, locus q21-q22. A região promotora do gene, assim
14
como o primeiro exon, exibem uma grande quantidade de ilhas CpG’s indicando que
mecanismos epigenéticos também controlam a expressão de Galectina-3, como
observado na progressão e transformação de tumores malignos (CARDOSO et al., 2016).
Esta proteína é predominantemente encontrada no citoplasma onde é
formada, mas pode ser encontrada na superfície celular, transportada para o núcleo ou
ainda secretada para o meio extracelular (CARDOSO et al., 2016; CHEN & KUO, 2016).
Por ser a única galectina de vertebrado com estrutura quimera, é a única capaz de formar
pentâmeros aumentando assim a capacidade de interação com seus ligantes (Figura 5)
(FORTUNA-COSTA et al., 2014). Algumas modificações pós-traducionais podem
ocorrer na Galectina-3. A fosforilação pode ocorrer no domínio N-terminal composto por
12 aminoácidos, onde dois deles são serinas encontradas na posição 6 e na posição 12 que
são substratos para a caseína cinase 1. O domínio colágeno-like possui dois sítios de
reconhecimento por metaloproteases de matriz (MMP’s) composta por uma sequência
rica em prolina, glicina, tirosina e glutamina de 9 aminoácidos, sem carga e sem resíduos
hidrofóbicos em suas cadeias laterais (HUFLEJT et al., 1993; BALAN et al.,2010;
BALAN et al.,2012).
Figura 5 – Estrutura da Galectina-3. Representação esquemática do monômero de Galectina-3, sua
oligomerização formando um pentâmero através do domínio N-terminal e sua forma de associação com
parceiro de interação. Adaptado de FORTUNA-COSTA et al., 2014.
A Galectina-3 está envolvida em diversos processos celulares como ´proliferação,
crescimento celular, diferenciação, inflamação, apoptose, migração e adesão celular
(CHEN & KUO, 2016; LI et al., 2016). Algumas dessas funções são resultado não de
uma interação da Galectina-3 com carboidratos, mas sim de interações proteína-proteína
demonstrando a versatilidade da mesma. Baseando-se na ampla distribuição nos
15
compartimentos subcelulares e na grande quantidade de moléculas capazes de interagir
com a Galectina-3, acredita-se que esta proteína sirva como uma proteína móvel, atuando
em diversos processos biológicos com funções diferentes que dependem da sua
localização na célula (CARDOSO et al., 2016). Como exemplo pode-se citar a atuação
no núcleo da Galectina-3 modulando o splicing de RNA mensageiro (RNAm) e a
sobrevivência celular. Para modular o splicing a Galectina-3 forma complexos com
membros do spliceossomo, mediando assim a montagem associação do pré-RNAm com
o spliceossomo de uma maneira independente de interação com carboidratos. Apesar da
ausência de glicanos ligantes no compartimento intracelular, cálculos do potencial
eletrostático sugerem que uma ordem linear de três argininas carregadas positivamente
na fenda do CRD sirva como possível sitio de ligação ao RNA (SEETHARAMAN et al.,
1998; CARDOSO et al., 2016). Na modulação da sobrevivência da célula, o CRD de
Galectina-3 modula a resposta de dano ao DNA através da interação com BARD1, um
dos parceiros de BRCA1 (CARVALHO et al., 2014), e ao mesmo tempo atenua a
atividade pró-apoptotica de BAX através da interação com proteínas da família BCl2
(YANG et al, 1996; HARAZONO et al., 2014). Essa capacidade de regulação dos
processos celulares e envolvimento no processo inflamatório fizeram com que nos
últimos anos diversos estudos fossem desenvolvidos para melhor elucidar a atuação da
Galectina-3 em patologias inflamatórias renais, cardíacas, processos tumorais e outras
mais (DAVIS et al., 2016; HU et al., 2016; CHEN & KUO, 2016; LI et al., 2016).
Dumic e colaboradores (2006) destacam a importância da Galectina-3 na
resposta inflamatória, devido sua capacidade de reconhecer glicoconjugados contendo
galactosídeos nos patógenos. Ressaltam ainda a capacidade de interação da Galectina-3
com o LPS (lipopolysccharide) presente na parede celular de bactérias Klebsiella
pneumoniae, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium e Escherichia coli, não
apenas através de seu domínio CRD reconhecendo cadeias laterais contendo β-
galactosídios no LPS, mas também através da interação do domínio N-terminal com
estruturas não glicanas como o lipídio A (DUMIC et al., 2006).
Tratando especificamente do reconhecimento do Trypanosoma cruzi, a
Galectina-3 reconhece através do seu CRD, β-galactosídeos existentes em glicoproteínas
presentes na superfície do parasito, como a mucina Tc45 (MOODY et al., 2000; NDE et
al., 2012). Esse reconhecimento facilita a migração do parasito na matriz extracelular e a
infecção em células musculares lisas e dendríticas (KLESHCHENKO et al., 2004; VRAY
et al., 2004; NDE et al., 2012). O pentâmero de Galectina-3 oligomerizado através da
16
porção N-terminal da proteína, atua interagindo com mucinas do Trypanosoma cruzi de
45 kDa (Tc45), presentes na superfície do tripomastigota por um lado, e com a laminina
da matriz extracelular por outro através de CRD (MOODY et al., 2000;
KLESHCHENKO et al., 2004; NDE et al., 2012). Logo, a Galectina-3 atua no
recrutamento de tripomastigotas para a matriz extracelular que facilita o estágio de
infecção inicial. Desta maneira, Galectina-3 promove uma ponte entre os tripomastigotas
e a laminina em células do hospedeiro (KLESHCHENKO et al., 2004; NDE et al., 2012).
Outra forma de regulação da matriz/célula para o processo infectivo, é quando o
tripomastigota bombardeia a célula do hospedeiro com glicoproteína 83 (gp83) clivada
por PLC (phospholipase C) ativando a via de ERK1/2, e desta forma induzir a produção
de laminina que por sua vez possui uma ligação cruzada e aumenta também a expressão
de Galectina-3. Desta forma aumentando a infecção através da via laminina – mucina 45
– Galectina-3, o que promove também o recrutamento de mais parasitos através da
interação com Tc45. Existem indícios ainda de que a mucina do Trypanosoma cruzi de
85 kDa (Tc85) também interaja com a laminina e uma metaloprotease atuando na
degradação da matriz extracelular aumentando o sucesso na infecção. (NDE et al., 2012;
NOGUEIRA DE MELO et al., 2004).
1.3 Influência de Modelos Murinos na Experimentação
O envolvimento dos diferentes perfis genéticos na susceptibilidade à infecção
tem sido estudado em diferentes linhagens isogênicas de camundongos, comparando-as
com as populações geneticamente heterogêneas de camundongos albinos Swiss
(SIQUEIRA et al., 1976). As diferenças entre altos e baixos níveis de produção de
anticorpos está relacionada a uma gama diversa de antígenos complexos, o que evidencia
os efeitos multiespecíficos de genes relevantes (SIQUEIRA et al., 1977; BIOZZI et al.,
1979). Análises genéticas por experimentos de mapeamento utilizando marcadores
microssatélites indicaram que diversos loci de características quantitativas regulam o
fenótipo de produção de anticorpos, e os três de maior significância estão presentes nos
cromossomos 3, 8 e 9 (DE SOUZA et al., 2010). A resistência à infecção por T. cruzi das
linhagens de camundongos está diretamente relacionada com a regulação poligênica que
leva a altas ou baixas produções de anticorpos, e máxima ou mínina resposta inflamatória
(VORRARO et al., 2014).
17
O background genético do hospedeiro e a virulência da cepa de Trypanosoma
cruzi utilizados são fatores determinantes para resistência à infecção tanto em humanos
como em camundongos (TRISCHMANN & BLOMM, 1982). A susceptibilidade de
infecção pela cepa Y de T. cruzi varia entre as linhagens de camundongos. Camundongos
da linhagem A/J são extremamente susceptíveis, já os da linhagem C57Black/6J
apresentam uma maior resistência à infecção, logo, é um excelente modelo para se obter
a cronificação da doença, principalmente quando o número de parasitos no inóculo é
baixo (POSTAN et al., 1984)
Um dado importante a se comentar é que dados comparativos da infecção por
tripomastigotas da cepa CL-Brener ou por tripomastigotas da cepa JG em ratos
demonstraram que animais infectados com a cepa CL-Brener apresentam resposta
inflamatória mais intensa. Os animais infectados com a cepa CL-Brener apresentaram
maior produção de IFN-acompanhada do aumento da subpopulação de linfócitos T
duplo negativos (TCD4-, TCD8-), além disso a menor resposta inflamatória no grupo de
animais infectados pela cepa JG é acompanhada de uma maior expressão de IL-10 que
tem papel anti-inflamatório, em relação a TNF-que possui papel pró-inflamatórioo
que não se observa nos animais infectados pela cepa CL-Brener (NAGIB et al., 2007).
Isso demonstra que a cepa do parasito utilizada influencia na resposta experimental em
animais.
O mimetismo entre antígenos do parasito e antígenos do hospedeiro pode ser a
base do desenvolvimento de resposta autoimune no hospedeiro (CARDILLO et al.,
2015). Durante a infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos, o animal pode
desenvolver anticorpos contra antígenos próprios presentes no musculo cardíaco, tecidos
nervosos e outros tecidos (CUNHA-NETO et al., 2006). Em estudo com camundongos
A/J e C57Black/6J, observou-se que a resposta autoimune gerada pelas diferentes
linhagens era diferente. Os animais foram infectados por parasitos da cepa Brazil e como
controle positivo os camundongos foram imunizados com miosina cardíaca e adjuvante
completo de Freund. O estudo relata que camundongos A/J apresentaram miocardite
aguda e seus níveis de IgG contra miosina cardíaca eram proporcionais ao dos
camundongos imunizados, apesar de mais baixos. Já os camundongos da linhagem
C57Black/6J apresentaram um nível quase indetectável de IgG contra miosina cardíaca e
não apresentaram quadro de autoimunidade quando infectados pelo parasito. Sendo assim
a resposta autoimune gerada pela infecção pelo Trypanosoma cruzi está relacionada, além
18
da resposta humoral, com a predisposição genética apresentada pela cepa de camundongo
utilizada (LEON et al., 2001).
Apesar das limitações em corroborar estes dados obtidos em modelo murino para
o processo que ocorre em humanos, o uso de modelos experimentais ajudou em muito a
elucidar vários aspectos conceitualmente importantes da infecção pelo T. cruzi,
destacando o papel crucial de respostas inflamatórias mediadas por respostas imunes
estabelecidas por efeito da doença (ANDRADE et al., 2014).
19
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar o envolvimento da proteína Galectina-3 na resposta imune decorrente
do processo de infecção pelo Trypanosoma cruzi utilizando macrófagos peritoneais em
modelo ex vivo e camundongos C57 Black/6 selvagens e nocautes para Galectina-3 in
vivo.
2.1 Objetivos Específicos
A) Utilizar um modelo in vitro com macrófagos peritoneais de camundongos
selvagens e nocautes para Galectina-3:
Análise da viabilidade celular e do potencial de infecção in vitro no decorrer da
infecção pelo T. cruzi;
Avaliação das alterações nos níveis protéicos de Galectina-3 frente a infecção pelo T.
cruzi;
Investigação do perfil de produção de citocinas pró e anti-inflamatórias no decorrer da
infecção pelo T. cruzi;
B) Utilizar um modelo in vivo com camundongos selvagens C57 Black/6 selvagens e
nocautes para Galectina-3:
Análise da parasitemia e mortalidade durante a fase aguda da infecção com cepa Y de
T. cruzi;
Investigação fenotípica da esplenomegalia no decorrer da fase aguda pelo peso do
órgão e índices de celularidade;
Determinação do percentual de diferentes populações de células T (Totais, T
citotóxicas, T helper, NK, etc), macrófagos/ monócitos no decorrer da fase aguda de
infecção pelo T. cruzi;
20
3. METODOLOGIA
3.1 Camundongos Utilizados
Camundongos isogênicos da linhagem C57Black/6J provenientes do INCA
foram utilizados para o desenvolvimento do trabalho. Dentre os camundongos
C57Black/6J estão os animais selvagens e os geneticamente modificados knock-out para
Gal-3 (Gal-3 KO). Tais camundongos foram alojados temporariamente no Biotério de
Manutenção da instituição, e os procedimentos foram aprovados pelo protocolo 001/2014
– CEUA – IFRJ.
3.2 Parasitos Utilizados
O Trypanosoma cruzi apresenta como característica uma grande diversidade
genética intraespecífica, foram utilizadas duas cepas de T. cruzi para o desenvolvimento
deste trabalho: as cepas Y e Dm28c já existentes no laboratório, ambas para os ensaios
de infecção in vivo e ex vivo, respectivamente.
3.3 Cultivo in vitro de formas epimastigotas
A cultura das formas epimastigotas foi mantida a 27˚C em frascos de cultivo
celular de 25cm2 com a tampa totalmente rosqueada, contendo meio LIT (Liver Infusion
Tryptose) (para 500mL de meio: NaCl: 2,0g; Na2HPO4: 4,0g; Glucose: 1,0g; Triptona
2,5g; Infusão de fígado: 2,5g; Hemina 12,5mg) (CAMARGO, 1964). Em volumes
proporcionais a necessidade, suplementado com 10 ou 15% de soro fetal bovino inativado
(SFBI) (Cultilab), mais 0,025 mg/mL de hemina (Sigma Aldrich Corp.).
3.4 Cultivo in vitro de formas tripomastigotas.
Para os ensaios de infecção foi utilizada a cepa Y, onde formas tripomastigotas
foram previamente obtidas através de culturas de epimastigotas em meio LIT + 10% soro
fetal bovino inativado (SFBI) (Cultilab) envelhecidas com mais de 10 dias para mimetizar
estresse nutricional. Parasitos foram centrifugados a 2000g por 10 minutos e ressuspensos
em meio de cultura RPMI + 10% SFBI + 100μg∕mL penicilina e estreptomicina (PS)
(Thermo Scientific) e utilizadas com uma m.o.i mínima de infecção 1:10 (célula:parasito)
21
utilizando a linhagem renal de primata LLC-MK2, um tipo celular eficaz para a produção
de massa parasitária in vitro (ANDREWS & COLLI, 1982).
3.5 Metaciclogênese
Para o processo de metaciclogênese foi utilizado como base o protocolo descrito
por Contreras e colaboradores (1985, 1988). Formas epimastigotas foram crescidas em
meio LIT suplementado com 15% de SFBI contendo estreptomicina∕penicilina a
100μg∕mL por 5 dias. Após o crescimento, foram centrifugados 10mL da cultura no fim de
fase exponencial a 2000g por 10 minutos e foram feitas duas lavagens, ressuspendendo o
precitpitado em meio TAU (NaCl 190mM, KCl 17mM, MgCl2 2mM, CaCl2 2mM,
Tampão fosfato pH 6,0 8mM, NaHCO3 0,6mM) e centrifugado a 2000g por 10 minutos.
Após as lavagens os epimastigotas foram contados com auxílio do hemocitômetro e foram
ressuspensos 108 epimastigotas em 1 mL de meio TAU pH 6,0 em tubos falcon de 15mL
que foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após a incubação,
epimastigotas foram diluídos 20x em meio TAU-3AAG (Meio TAU acrescido de Glicose
10mM, I-Prolina 10mM, Glutamato de sódio 50mM e Aspartato de sódio 2mM) pH 6,5
para a concentração de proporção 5 x 106 por mililitro, colocados em garrafas de cultura
de 175cm2 e mantidos em estufa a temperatura de 27oC. As formas epimastigotas
aderiram-se ao fundo do frasco e em torno de 5 a 6 dias de cultivo os parasitos se
diferenciaram para a forma tripomastigota, soltando do fundo do frasco e mantendo-se no
sobrenadante da cultura.
3.6 Cultura Primária de Macrófagos Peritoneais
Os camundongos linhagem isogênica C57Black/6J dos genótipos selvagem ou
Gal-3 KO foram devidamente eutanasiados com CO2 e o tecido que recobre todo o
abdômen do animal foi retirado, expondo assim o músculo abdominal. Foi injetado entre
8-10 mL de tampão fosfato salino em pH 7.4 (PBS pH 7,4) gelado utilizando seringa de
10 mL e agulha de 22 Gauge 1 ¼ (0,7mm x 30mm), onde introduziu-se apenas a ponta
da agulha, iniciou-se a injeção com um jato forte e ao longo do enchimento da cavidade
peritoneal foi-se adicionando com cuidado. Ao encher por completo a cavidade, ainda
com a agulha dentro do animal, puncionou-se cuidadosamente o máximo de líquido
contendo as células desejadas com uma pequena quantidade de hemácias resultantes de
alguns pequenos vasos rompidos ao longo do processo. As células foram centrifugadas a
22
1600rpm em centrífuga clínica, o sobrenadante foi então descartado e as células
ressuspensas em 2 mL de tampão de lise de hemácias (17 mM Tris-HCl + 0,144 M de
cloreto de amônia pH7.2) gelado, incubadas por 5 minutos em temperatura ambiente e
logo após centrifugadas a 1600 rpm em centrífuga clínica e lavadas 2x com PBS pH 7,4
gelado. As células foram então ressuspensas em 5 mL de meio RPMI contendo 10% de
soro fetal bovino inativado (SFBI) e estreptomicina/penicilina 100μg∕mL gelado,
seguindo-se com a diluição de 1:100 dessa suspensão de células e contagem em câmara
de Neubauer para posterior plaqueamento e experimentação.
3.7 Ensaios de infecção e produção de tripomastigotas
Após a metaciclogênese, os tripomastigotas metacíclicos foram coletados e centrifugados
a 3400 rpm por 15 minutos em centrífuga clínica e ressuspendidos em meio RPMI +
10% SFBI contendo os antibióticos penicilina/estreptomicina 100ug/mL. Este meio
contendo os parasitos foi colocado em células Vero (nº de células) com uma m.o.i mínima
de infecção 1:10 (célula:parasito), após 48 horas foi realizada a troca por meio RPMI +
5% SFBI. A cultura foi então acompanhada até o brotamento de formas tripomastigotas
de cultura. Aproximadamente no terceiro ou quarto dia pós-infecção, o sobrenadante
contendo os parasitos foi coletado e lavado duas vezes em PBS pH 7,4 por centrifugação
a 34000 rpm por 20 minutos em centrífuga clínica. Após lavagens, parasitos foram
ressuspendos em RPMI e novamente centrifugados a 3400 rpm por 20 minutos em
centrífuga clínica e incubados por 3-4 horas a 37ºC em atmosfera úmida de 5% de CO2.
Desse modo, os tripomastigotas de cultura móveis nadavam em direção ao sobrenadante,
separando-se assim dos amastigotas sésseis. O número de parasitos foi estimado em
hemocitômetro e utilizados para experimentação.
3.8 Ensaio de viabilidade celular (MTT)
Foram plaqueados 104 macrófagos peritoneais dos diferentes genótipos de
camundongo C57Black/6J por poço em uma placa de 96 poços (vide tópico 3.6). Após
16 horas em cultura, as células foram infectadas com tripomastigotas metacíclicos
provenientes de metaciclogênese com m.o.i de 1:5 (célula:parasito) e como controle
foram analisadas células não infectadas. As células foram incubadas em diferentes
tempos (24, 48 e 72 horas), após o tempo de incubação os poços foram lavados 3 vezes
com PBS pH 7.4 estéril e foi adicionado 100µL de MTT (Sigma Aldrich Corp.) na
concentração de 0,5mg∕mL por poço diluído em meio de cultura RPMI sem soro. Uma
23
vez adicionado, o MTT foi realizado a incubação da placa a 37oC em estufa úmida de
5% de CO2 no escuro por 4 horas. Depois da incubação foi adicionado 100µL de solução
SDS 10% em HCl 0,01M com incubação a 37oC no escuro overnight. Posteriormente foi
feita a leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 495nm utilizando o
leitor de ELISA Spectra Max 190 da Molecular Devices.
No ensaio de infecção in vitro foram utilizados macrófagos peritoneais obtidos
de camundongos C57Black/6J selvagens e Gal-3 KO. As células na concentração de 106
células/poço foram plaqueadas em placas de 24 poços e mantidas por 24 horas em cultura
com meio RPMI suplementado com 10% de SFBI e contendo os antibióticos
estreptomicina/penicilina antes da realização do experimento. As células foram
infectadas com a adição de 5x106 tripomastigotas metacíclicos da cepa Dm28c, obtidos
pelo processo de metaciclogênese descrito acima e incubados por 24 horas a 37°C em
estufa úmida de 5% de CO2. Após esse período os poços foram lavados três vezes com
PBS pH 7.4 estéril e as células mantidas em cultura por 5 dias em meio RPMI + 10%
SFBI contendo os antibióticos penicilina/estreptomicina 100ug/mL até o brotamento das
formas tripomastigotas das células. O sobrenadante de cada poço foi coletado,
centrifugado por 2 minutos a 800 rpm em centrifuga clínica para baixar os restos
celulares e os tripomastigotas presentes no sobrenadante foram contados em
hemocitômetro.
3.9 Obtenção dos extratos proteicos
Para obtenção do extrato proteico total das células, 2 x 105 macrófagos foram
semeados em placas de 96 poços, posteriormente foram infectadas com m.o.i. de 5
parasitos por célula e incubados em diferentes tempos (0, 2, 4, 8, 16 e 24 horas). Após
incubação, as células foram lisadas diretamente no poço utilizando 20µL de Laemmli
buffer (187,5 mM Tris pH 6,8; 6% SDS; 30% glicerol; 0,3M DTT; e 0,0015% azul de
bromofenol), lisado foi coletado e aquecido por 8 minutos a 95oC em termociclador
Veriti (Applied Biosystem), após tal processo as amostras foram acondicionadas a -80ºC
para posterior SDS-PAGE.
3.10 SDS-PAGE e Western blotting
Após a obtenção dos extratos proteicos foi feito para análise dos níveis proteicos
de PARP e Galectina-3. Para tal, foi realizado um SDS- PAGE em gel de corrida com
uma concentração de 10% de acrilamida/bisacrilamida (29:1) para o gel de separação e
24
de 4% de acrilamida/bisacrilamida (29:1) para gel de empacotamento. Na transferência
semi-seca para membrana de nitrocelulose Hybond-C (GE Healthcare) foram
utilizadas as condições elétricas de 0,5Volts/cm2 para transferência de único gel ou
0,8Volts/cm2 para transferência dupla de géis, utilizando o sistema TransBlot (BioRad).
Após a transferência, a membrana foi bloqueada em solução de 5% leite desnatado
diluído em TBS 1X (Tris 200 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) complementado com 0,05%
Tween-20 entre 1-4 horas. Após bloqueio foram realizadas analises para as proteínas
Galectina-3 e PARP.
Para análise dos níveis de Galectina-3 o anticorpo primário utilizado foi IgG de
camundongo anti-Galectina-3 (hibridoma) na diluição de 1:50 em solução de 0,5% leite
desnatado em TBS + 0,05% Tween-20 e para PARP foi utilizado anticorpo primário
IgG de coelho na diluição de 1:500 em solução de 2% leite desnatado em TBS
complementado com 0,05% Tween-20.
As membranas com proteínas foram incubadas nas soluções contendo os
respectivos anticorpos primários por 16 horas a 4oC. O anticorpo secundário anti-IgG
de camundongo conjugado a HRP (Santa Cruz Biotech. #sc2005) foi utilizado na
diluição 1:2000 em solução de 0,5% leite desnatado em TBS complementado com
0,05% Tween-20 por 1 hora a temperatura ambiente para a proteína Galectina-3. O
anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado a HRP foi utilizado na diluição
1:2000 em solução de 0,5% leite desnatado em TBS complementado com 0,05%
Tween-20 por 1 hora a temperatura ambiente para a proteína PARP.
Em todos os ensaios de western blotting sempre após as incubações com os
anticorpos, primário e secundário, foram realizadas três lavagens de 10 minutos cada
com solução TBS 0,1% Tween-20. Para quantificação da quimioluminescência
produzida pela atividade da peroxidase conjugada aos anticorpos secundários, as
membranas foram escaneadas pelo equipamento C-Digit (Licor) em exposições curtas
e longas e as imagens digitalizadas. A análise densitométrica foi realizada com auxílio
do programa ScionImage (Scion Corporation)
3.11 Infecção in vivo e manutenção das colônias de camundongos
As infecções in vivo foram mantidas em camundongos da linhagem Swiss
Albino entre 8 e 24 semanas, utilizando a cepa Y de Trypanosoma cruzi. Os camundongos
com idade de 10-20 semanas foram infectados intraperitonealmente com 5 x 106 formas
tripomastigotas provenientes de cultura de células LLC-MK2, diluídos em meio RPMI
25
contendo 5% SFBI, estreptomicina/penicilina. Após 48h de infecção, os camundongos
receberam uma única dose intraperitoneal de 200mg/Kg do fármaco ciclofosfamida
(nome comercial Genuxal, Empresa Baxter, USA), que foi diluída em água milliQ
autoclavada e injetada na concentração de 200 mg/Kg nos animais, para imunossupressão
e consequentemente obtenção de uma maior produção de massa parasitária in vivo de
tripomastigotas sanguícolas.
Ao 8° dia pós-infecção, os animais eram anestesiados com Quetamina 100mg/kg
& Xilazina 20mg/kg. A coleta ocorreu através de uma veia presente atrás do globo ocular
dos animais, onde após a retirada do olho, foram coletados entre 1 e 1,5 mL de sangue
por gotajemento em um tubo de 1,5mL contendo 150µL de citrato de sódio (3,2%), para
atuar como anticoagulante. Os animais foram eutanasiados imediatamente após a coleta
com deslocamento cervical.
Os tubos com o sangue coletado foram centrifugados a 200g por 22 minutos a
temperatura ambiente e após a centrifugação os tubos foram mantidos por 20 minutos a
37°C para que os parasitos migrassem da fase mais densa, o aglomerado de hemácias,
para a menos densa do plasma na superfície. Esse plasma contendo as formas
tripomastigotas sanguícolas foi coletado em fluxo laminar, realizando-se a contagem de
tripomastigotas em hemocitômetro. Por fim, o plasma diluído em meio DMEN
(Dulbeco’s Modified Eagle Medium) estéril e sem soro, ou em PBS pH 7,4 foi utilizado
para preparar a injeção intraperitoneal na concentração desejada de tripomastigotas
sanguícolas por mililitro de solução, seja para os ensaios de parasitemia com as linhagens
de camundongos C57Black/6J selvagens ou nocautes para Gal-3, seja para manutenção
da colônia com a linhagem de camundongos Swiss infectados. Este procedimento foi
repetido semanalmente, ou quando necessário.
3.12 Obtenção de Esplenócitos.
Os animais eutanasiados por CO2 tiveram a cavidade abdominal aberta do lado
esquerdo do corpo e com o auxílio de pinça com ponta fina e tesoura cirúrgica, foi
removido o baço dos animais com cuidado para que não viesse com tecido adiposo e/ou
se rompesse. O órgão foi pesado e com duas seringas com agulha de insulina de 8 mm x
0,3 mm (30 Gauge) foram dissociadas as células de dentro do mesmo em placa de cultura
de 60mm contendo 500uL de PBS pH 7,4 gelado. A suspensão total de células obtida por
meio da dissociação foi centrifugada a 1800 rpm em centrífuga clínica e ressuspensa com
26
2 mL de tampão de lise de hemácias (17 mM Tris-HCl + 0,144 M de cloreto de amônia
pH 7.2) gelado. Após incubação de 10 minutos no gelo e as células foram então
centrifugadas a 1800 rpm em centrífuga clínica e lavadas duas vezes com PBS pH 7,4.
3.13 Citometria de Fluxo
Os esplenócitos foram contados em câmara de Neubauer e aliquotados em tubos
1,5mL na concentração de 2 x 106 células por tubo previamente identificados com as
marcações que seriam realizadas. Para bloquear ligações inespecíficas, foi utilizado 1uL
de Fcblock, um anticorpo contra receptor Fcγ CD16/CD32 (eBioscence) diluído em
100uL de Flow Cytometry Staining Buffer Solution (eBioscience) já contendo as células
a serem analisadas. As amostras foram incubadas por 30 minutos, a 4°C e em seguida,
foram incubadas com 1uL dos anticorpos de interesse: F4/80-PerCP-Cy5.5 (eBioscience
#45.4801.80); CD3e PerCP-Cy5 (Molecular Probes #553065); CD4-PE (BD Pharmigen
#553730); CD8a-PE (BD Pharmigen #553033); CD11b-FITC (eBioscience
#11.0112.81); CD335(WKp46)-FITC (Molecular Probes #A14752).Tais anticorpos
foram adicionados aos respectivos tubos para marcações múltiplas segundo a seguinte
lógica de marcações: Controle (Fc Block CD16/32); linfócitos T totais (CD3e-PerCP-
Cy5); linfócitos T CD4 (CD3e-PerCP-Cy5, CD4-PE); linfócitos T citotóxicos (CD3e-
PerCP-Cy5, CD8a-PE); células NK (CD3e-PerCP-Cy5, CD335-FITC); células NK
CD4+ (CD3e-PerCP-Cy5, CD335-FITC, CD4-PE); células NK CD8+ (CD3e-PerCP-
Cy5, CD335-FITC, CD8a-PE) e macrófagos/monócitos (CD11b-FITC, F4/80-PerCP-
Cy5).
Além destas marcações, foram realizadas marcações com isotipos IgG de
camundongo e rato conjugados respectivamente aos fluoróforos Alexa 488 e Alexa 546
(Molecular Probes #A11018) os quais serviram de controle negativo isotípico para
CD335 anticorpo IgG2a de rato, CD3 anticorpo IgG de hamster, CD25 anticorpo IgG1 de
rato, F4/80 anticorpo IgG2a de rato, CD11b IgG2b de rato, CD4 anticorpo IgG2a de rato
e CD8 IgG2b de rato.
Os tubos foram então incubados por 60 minutos, a 4°C na ausência de luz. Após essa
etapa, as células foram centrifugadas a 300-400g por 5 minutos e lavadas 2x com Flow
Cytometry Staining Buffer Solution (eBioscience), descartando cuidadosamente o
sobrenadante. Por fim, as células foram então ressuspensas em 100uL de Flow Cytometry
Staining Buffer Solution (eBioscience) e analisadas no citômetro Accuri™ C6 (BD
27
Bioscience). Um total de 80 mil eventos foram coletados, e posteriormente, analisados
empregando-se o BD Accuri C6 Software. Primeiramente, foi feita a exclusão de debris
celulares utilizando os parâmetros SSC-A x FSC-A selecionando a população a ser
analisada. Para tal, foi coletado o baço de um camundongo C57Black/6J selvagem para
testar os anticorpos e observar se de fato o bloqueio de ligação inespecífica feito pelo
anticorpo FcBlock CD16/32 é eficiente e não interfere de forma prejudicial na marcação.
Foi realizado então um experimento piloto de padronização onde marcou-se esplenócitos
somente com o FcBlock CD16/32 para demonstrar que apenas a utilização desde
anticorpo não é o suficiente para alterar o caráter morfológico ou fluorescente das células
(Fig.). E marcou-se também os esplenócitos com os anticorpos anti-F4/80, anti-CD4, anti-
CD8, anti-CD25, anti-CD11b e anti-CD3e na ausência e presença do bloqueio por
FcBlock CD16/32. Pôde se observar que o bloqueio realizado pelo FcBlock CD16/32 é
de fato eficiente inibindo ligações inespecíficas (FIGURA 6), principalmente nas
marcações para CD8 (Fig. B) em que a fluorescência diminuiu de 12% para 9%, CD4
(Fig. C) em que a fluorescência diminuiu de 30,2% para 20% e CD25 (Fig. E) em que a
fluorescência diminuiu de 6,5% para 5,2%.
28
Figura 6 – Padronização do ensaio de análise por citometria de fluxo. A análise da frequência de todas
as células foi realizada através da análise convencional, onde a população celular de interesse (R1) foi
estabelecida em gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC). Após a
seleção da região de interesse, a frequência de populações celulares expressando marcadores dentro de R1
foi obtida em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de fluorescência.
3.14 Quantificação de Citocinas por CBA (Cytometric Bead Array)
O kit de quantificação de citocinas murinas (BD Cytometric Bead Array – CBA
Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit) foi utilizado para quantificar as citocinas IL-6, IL-2,
TNF-α, IFN-γ, IL-17A IL-4 e IL-10 no sobrenadante de macrófagos peritoneais
infectados in vitro no tempo de 24 horas e no soro coletado de camundongos infectados
com 2, 5, 9 e 15 dias. Para a realização desta quantificação, os experimentos foram
conduzidos conforme especificações do fabricante e protocolo de marcação proposto com
pequenas modificações (Becton Dickinson and Company, #560485). A amostras de
sobrenadante de macrófagos e soro de camundongos foram estocadas em freezer -80°C
29
por tempo suficiente para que pudéssemos juntar todo o material a ser analisado e,
posteriormente, descongeladas a temperatura ambiente. O padrão de citocinas foi
reconstituído com 2,0mL do Reagente G (solução tampão) e por diluição seriada foram
obtidas as seguintes diluições: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 e 1/256,
caracterizando respectivamente as concentrações de 2.5ng/mL, 1.25ng/mL, 625pg/mL,
312.5pg/mL, 156pg/mL, 80pg/mL, 40pg/mL e 20pg/mL. Uma mistura de beads foi
preparada antes do uso, cerca de 3μL de cada suspensão de beads para cada ensaio.
Durante a execução do ensaio, adicionou-se 21μL das misturas de beads a 25μL dos
padrões, nas respectivas diluições; e também a 25μL das amostras nos respectivos tubos
para a realização do ensaio. Logo em seguida, adicionou-se em todos os tubos 18μL do
Reagente B (Reagente de detecção correspondente aos anticorpos específicos para
citocinas conjugados a ficoeritrina) e incubou-se por 2 h, a temperatura ambiente e ao
abrigo da luz. Após a incubação, adicionou-se 500μL do Reagente F (solução de lavagem)
em cada tubo, centrifugou-se a 600g por 7 min a 18°C. O sobrenadante foi aspirado,
deixando aproximadamente 100μL do sobrenadante em cada tubo e novamente,
adicionou-se 100μL do Reagente F em cada tubo e procedeu-se a leitura. Para a leitura
das amostras foi utilizado o citômetro Accuri™ C6 (BD Bioscience). Os dados obtidos
foram analisados com o software FCAP Array Software TM versão 3.0 (Soft Flow
Hungary Ltd, BD Biosciences).
3.15 Reação em cadeia da polimerase (PCR) de Galectina-3
Para a amplificação da região codificante de Gal-3 selvagem contendo 753pb
foram utilizados os oligonucleotídeos: Fw-HsGal3(wt): XbaI 5’GCTCTAGACCAT
GGCAGACAATTTTTCGC-3’ versus Rv-HsGal3:BamHI 5´CGCGGATCCTTATA
TCATGGTATATGAAGC ACTGG-3´. Para amplificação da região codificante de Gal-
3 depletada do domínio CRD, o mutante Gal3-ΔCRD, os oligonucleotídeos utilizados
foram: Fw-HsGal3(wt):XbaI 5’GCT CTAGACCATGGCAGACAATTTTTCGC-3’
versus Rv-Gal3(ΔCRD): BamHI 5´CGC GGATCCTCAAGGCACAATCAGTGGC 3´.
As condições de ciclagem foram: 94°C 5’; 35 ciclos [desnaturação: 94°C por 1 minuto;
temperatura de anelamento 68°C por 1 minuto ou 72°C por 1 minuto]; 4°C ∞. As
temperaturas de extensão foram de 72°C para Taq DNA polimerase (Thermo Scientific)
ou 68°C para Pfx50 DNA polimerase (Thermo Scientific).
30
3.16 Plasmídeo utilizado
Os amplicons obtidos foram clonados no vetor pHIV-puro, uma versão
modificada do vetor pHIV-eGFP (Addgene Corp. #21373), previamente obtida pelo
grupo do laboratório com substituição da região codificante de eGFP pela região
codificante de puro+ utilizando sítios ClaI e MscI, para expressão de gene de interesse
transcrito de modo policistrônico com gene de resistência à puromicina (FIGURA 7).
Figura 7 - Mapa do vetor pHIV-eGFP (Addgene #21373). Vetor lentiviral 3ª geração inativado para co-
expressão de um gene de estudo em conjunto com repórter eGFP. O vetor utilizado no trabalho foi uma
versão modificada deste, apresentando a substituição do gene eGFP pelo gene de resistência a puromicina
(puroR) nos sítios de restrição MscI e ClaI gerando o vetor pHIV-puro.
3.17 Restrição e ligação de DNA
Especialmente, para a extração plasmidial pelo método de lise alcalina, com
melhor qualidade e pureza, foi utilizado o kit QIAprep® Miniprep (Qiagen), segundo as
instruções do fabricante para a purificação do DNA plasmidial se dá por cromatografia
de afinidade em colunas de sílica.
As enzimas utilizadas para a subclonagem do Gal-3 wt e Gal-3 ΔCRD no vetor
pHIV-puro foram BamHI e XbaI. As digestões foram realizadas por 1 hora e 30 minutos,
a 37°C, já que as enzimas utilizadas foram da linha FastDigest® (Thermo Scientific).
31
Todos os fragmentos foram purificados após seu fracionamento por eletroforese. Para tal,
foi utilizado o Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen) seguindo recomendações do
fabricante.
As ligações foram realizadas com a enzima T4 DNA ligase (Thermo Scientific)
seguindo recomendações do fabricante, complementando as reações com a adição de ATP
para concentração final de 1mM como cofator, por um período de 16 a 18h, a 16°C. As
proporções molares de vetor:inserto foram de 1:5
3.18 Eletroforese de DNA
As eletroforeses foram realizadas utilizando tampão Tris-Acetato-EDTA (Tris-
Acetato 40mM e EDTA 1mM) (TAE) 1x na confecção do gel de agarose e como tampão
de corrida. Foi utilizado o Gel Red™ (Biotium) como intercalante de DNA na diluição
recomendada pelo fabricante. O marcador de peso molecular utilizado nas eletroforeses
foi o GeneRuler 1Kb ladder (Thermo Scientific), que apresenta as bandas: 250pb 500pb,
750pb, 1000pb, 1500pb, 2000pb, 2500pb, 3000pb, 3500pb, 4000pb, 5000pb, 6000pb,
8000pb, 10000pb.
3.19 Cepa de bactéria
A cepa DH5α (genótipo: fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del) M15
gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17) de Escherichia coli foi utilizada nas clonagens
dos plasmídeos (vide tópico 3.19)
3.20 Transformação de E. coli
O preparo de bactérias competentes e transformação pelo método do cloreto de
cálcio foi modificado a partir do procedimento descrito por Cohen e colaboradores
(1972). Algumas adaptações foram realizadas como a diluição de 50 vezes do inóculo em
fase estacionária, oriundo de uma colônia de E. coli, crescido em meio LB sob agitação
constante por 18 horas. A densidade óptica (DO) foi acompanhada até atingir-se o valor
de 0,5 a 600nm. A técnica consiste em centrifugar em tubo falcon a 12000 rpm em
centrífuga clinica por 10 minutos para então descartar o meio Lb no qual cresceram as
bactérias. Ressuspender delicadamente o pellet de bactérias formado em 5 mL de solução
de CaCl2 50mM autoclavada e gelada, centrifugando posteriormente a 12000 rpm por 5
minutos repetindo o procedimento por 2x. Por fim, é feita a ressuspensão do precipitado
de bactérias na mesma solução complementada com glicerol (Sigma Aldrich Corp.) a uma
32
concentração final de 20%, as células são gentilmente homogeneizadas, distribuídas em
criotubos e armazenadas a freezer -80°C. Todo o protocolo foi realizado com materiais e
soluções geladas, mantidos no gelo por todo o procedimento.
O protocolo utilizado para transformação se baseou na incubação das bactérias
competentes previamente preparadas com DNA plasmidial por 30 minutos em gelo,
seguido de choque térmico a 42°C por 90 segundos e imediata transferência para o gelo
e plaqueamento das bactérias transformadas em meio LB Ágar contendo o antibiótico
ampicilina na concentração de 50µg/mL permitindo que apenas as bactérias que
internalizaram o plasmídeo, e consequentemente fossem resistentes ao antibiótico,
crescessem. A seleção dos clones positivos foi feita por uma uma PCR dos plasmídeos
extraídos de colônias de bactérias isoladas utilizando os oligonucleotídeos iniciadores
referentes à região codificante de Gal-3. Sendo assim, somente clones positivos contendo
o inserto deram amplificação na PCR resultado positivo.
3.21 Transfecção e Transdução Lentiviral
Células de empacotamento da linhagem Hek293-FT foram transfectadas para
gerar os vírus para posterior transdução de células THP1. Para a transfecção, as células
Hek293-FT foram semeadas em placas de 6 poços na concentração de 5 x 105 células por
poço e foram mantidas em estufa overnight.
No dia seguinte do plaqueamento, as células foram tratadas com a mistura de
transfecção composta pelas construções plasmidiais lentivirais: pCMV-VSV-G (Addgene
# 8454), pMDLg/pRRE (Addgene #12251) pRSV-Rev (Addgene #12253), juntamente
com o plasmídeo de expressão pHIV-puro+ contendo a forma de Gal-3 selvagem ou a
forma ΔCRD, polietilenoamina (Polysciences #23966) e meio de cultura DMEM sem
soro. A mistura de transfecção foi previamente incubada a temperatura ambiente por 30
minutos, quando então foi gotejada sobre a cultura celular que foi mantida em estufa.
Após um período de 2 horas trocou-se o meio por meio de cultura DMEM suplementado
com 10% SFBI.
Após 48 horas da transfecção, o sobrenadante contendo as partículas virais foi
coletado, centrifugado a 1600 rpm por 5 min em centrífuga clínica para baixar os restos
celulares e filtrado em filtro de seringa de 45µM (Millipore). Adicionou-se 10mg/mL de
polibreno (St. Cruz Biotech) e 50% a mais de meio RPMI suplementado com 10% de
SFBI.
33
Na transdução da linhagem THP1, as células foram centrifugadas e cerca de 2 x
105 células foram ressuspensas na mistura de meios, onde centrifugou-se por 45 minutos
a 450g na centrífuga Sorvall em temperatura ambiente. O sobrenadante foi então
descartado e as células ressuspensas em meio RPMI suplementado com 20% de SFBI e
manteve-se em cultura por mais 72 horas, onde após esse tempo houve mais uma
centrifugação a 200g por 5 minutos e as células foram ressuspensas em meio RPMI
suplementado com 20% de SFBI e puromicina na concentração de 4 µg/mL para seleção
das células que foram transduzidas. A pressão seletiva com puromicina foi mantida por
um mês após a transdução.
34
4. RESULTADOS
4.1 Análise da viabilidade celular e do potencial de infecção in vitro no decorrer
da infecção pelo T. cruzi.
Para analisar o potencial de infecção in vitro de tripomastigotas metacíclicos
Dm28c, utilizou-se macrófagos peritoneais provenientes de camundongos C57Black/6J
selvagens e knockout para Galectina-3. Os macrófagos coletados foram mantidos em
cultura por 24 horas após semeados e então infectados em cultura durante 48 horas na
presença dos parasitos. Após este tempo, os poços foram lavados com PBS estéril e a
cultura foi mantida por mais 5 dias até que houvesse o brotamento das formas
tripomastigotas que foram mensuradas através da contagem em hemocitômetro
(FIGURA 8A). O resultado da mensuração dos parasitos em cultura demonstrou que há
um maior brotamento de tripomastigotas nos macrófagos provenientes dos camundongos
selvagens, quando comparado ao brotamento de tripomastigotas nos macrófagos
provenientes dos camundongos knockout para Galectina-3 (FIGURA 8B).
Para avaliar a viabilidade celular, os macrófagos coletados foram semeados em
placa de 96 poços e então seguiu-se o curso da infecção de forma que todos os pontos
fossem processados juntos no tempo de 72 horas (FIGURA 9A). De modo geral, os
resultados demonstraram que os macrófagos provenientes de camundongos selvagens
apresentam maior viabilidade em cultura quando comparados com os macrófagos
provenientes de camundongos knockout para Galectina-3 (FIGURA 9B).
35
Figura 8. Análise do Potencial de Infecção In Vitro. Macrófagos peritoneais provenientes dos
camundongos C57Black/6J de genótipos selvagem e knockout para Galectina-3 foram semeados
em placas de 24 poços, infectados com tripomastigotas metacíclicos da cepa Dm28c e cultivados
até o brotamento de tripomastigotas de cultura que foram mensurados através da contagem
utilizando hemocitômetro dos parasitos presentes no sobrenadante. (A) Curso temporal da
infecção, (B) resultado da contagem das formas tripomastigotas no sobrenadante. Os dados foram
estatisticamente analisados por T-student no programa GraphPad Prism 5.0 (* sendo p<0,05).
36
Figura 9. Análise da Viabilidade Celular in vitro no decorrer da infecção pelo Trypanosoma
cruzi. Macrófagos foram obtidos através de lavado peritoneal, semeados em placa de 96 poços
com meio RPMI + 10% SFBI contendo penicilina e estreptomicina em estufa a 37°C. (A) Os
macrófagos foram então infectados com 5 parasitos por célula no momento do plaqueamento para
o ponto de 72 horas de plaquamento, 24 horas após o plaqueamento para o processamento do
ponto de 48h após infecção, e células não infectadas utilizadas como controle negativo. Os poços
foram lavados com PBS pH 7.4 estéril após 24 horas de infecção, no caso das células não
infectadas após o plaqueamento, e sempre antes da adição do MTT (B) As células foram
incubadas por 3 horas com MTT e por 15 horas com solução SDS/HCl e analisadas por
espectrofotometria no comprimento de onda de 495nm. Todas as absorbâncias obtidas foram
normalizadas com o meio das células controle selvagem e estatisticamente analisadas usando o
método two way ANOVA no programa GraphPad Prism 5.0 (* sendo p<0,0001).
37
4.2 Avaliação das alterações nos níveis protéicos de Galectina-3 frente à
infecção pelo T. cruzi.
Foi realizado western blotting com extratos proteicos de macrófagos
provenientes do lavado peritoneal em camundongos C57Black/6J de ambos os genótipos
já citados anteriormente, que foram submetidos a infecção e mantidos em cultura por 2,
4, 8, 16 e 24 horas ou que não tenham sido infectados, mas ainda assim mantidos nas
mesmas condições de cultivo para controle. Os resultados obtidos demonstraram que há
um aumento na quantidade de Galectina-3 no extrato proteico dos macrófagos selvagens,
mantidos em cultura por 8 horas após a infecção, de pouco mais que o dobro da
quantidade de Galectina-3 detectada no controle não infectado, sendo que os níveis de
Galectina-3 aumentada detectados no tempo de 8 horas pós-infecção começam a diminuir
no ponto de 16 horas. Esse resultado refletiu os trabalhos anteriores de Vray e
colaboradores (2004) e Kleshchenko e colaboradores (2004) que demonstraram um
aumento da expressão de Galectina-3 em resposta à infecção. Surpreendentemente
detectou-se a presença de níveis baixos de Galectina-3 no extrato dos macrófagos
provenientes dos camundongos knockout para Galectina-3 mantidos em cultura nos
tempos de até 8 horas pós-infecção, mesmo nas células controle (FIGURA 10).
Figura 10. Avaliação das Alterações nos Níveis Proteicos de Galectina-3 frente a Infecção pelo
Trypanosoma cruzi. Western blotting foi realizado usando 2 x 104 macrófagos coletados de camundongos
selvagens ou knockout para galectin-3. Os macrófagos foram semeados em uma placa de 96 poços, e
infectadas com 10 parasitos por célula. Os extratos foram obtidos por lise diretamente com tampão Laemmli
2x nos tempos de 2, 4, 8, 16 e 24 horas pós infecção. O SDS-PAGE foi realizado em um gel de acrilamida
10%, transferido para membrana PVDF por transferência semiseca e bloqueada com 5% de leite diluído
em TBS + 0,05% Tween-20. Foi feita incubação per noite com anitcorpo anti-Galectina3 proveniente de
hibridoma, diluído em 0,5% de leite em TBS + 0,05% Tween-20 na concentração de 1:50. O controle de
carregamento foi obtido através da incubação com anti-β-Actina. Imagens foram analisadas através do
programa Image Studio Lite version 5.0 (LI-COR Bioscience).
38
4.3 Investigação do perfil de produção de citocinas pró e anti-inflamatórias no
decorrer da infecção pelo T. cruzi.
Já se tem bem estabelecido em literatura que os macrófagos e células dendríticas
são a primeira linha de defesa e consequentemente de infecção pelo T. cruzi. Sendo assim,
moléculas secretadas por esses tipos celulares atuam não só no combate direto ao parasito,
mas também mediando e induzindo a quimiotaxia, ativação e diferenciação de outros
tipos celulares do sistema imune.
Com o intuito observar se há diferença no perfil de citocinas secretadas por esses
macrófagos peritoneais isolados em cultura, realizou-se a quantificação através do
método CBA (Cytometric Bead Array) de algumas citocinas no meio de cultivo de
macrófagos dos camundongos selvagens e knockout para Galectina-3.
Dentre as citocinas analisadas IL-6, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-17A IL-4 e IL-10
somente TNF-α, IL-6, IL-4 e IL-2 apresentaram níveis detectáveis. Especialmente, para
TNF-α foi verificada uma considerável produção endógena no sobrenadante da cultura
tanto nos macrófagos selvagens de camundongos infectados quanto não infectados. Por
outro lado, os macrófagos knockout apresentaram níveis detectáveis somente após a
infecção (FIGURA 11). Como esperado para TNF-α, estes resultados demonstram que o
parasito desencadeia uma resposta pró-inflamatória in vitro.
Outra citocina que apresentou diferenças significativas entre os genótipos
avaliados foi IL-6, macrófagos selvagens não infectados já apresentaram uma taxa basal
de IL-6 mais alta que macrófagos knockout não infectados (FIGURA 11).
39
Figura 11. Gráficos de quantificação de citocinas no sobrenadante de cultura primária de macrófagos
peritoneais provenientes de camundongos C57Black/6J selvagens e knockouts para Galectina-3. Macrófagos peritoneais foram coletados de camundongos C57Black/6J selvagens e knockout para
Galectina-3, semeados em placa de 96 poços e após 24 horas em cultura foram infectados na proporção de
5 tripomastigotas de cultura/célula. O sobrenadante foi coletado e analisado por CBA em citometria de
fluxo realizada no citômetro BD Accuri C6. Os dados foram gerados e quantificados no programa FCAP
Array Software TM versão 3.0 (Soft Flow Hungary Ltd, BD Biosciences), e plotados no programa GraphPad
Prism 5, onde foram analisados estatisticamente pelo método one way ANOVA, com post-test Bonferroni
(* sendo p<0,0001).
40
4.4 Análise da parasitemia e mortalidade durante a fase aguda da infecção com
cepa Y de T. cruzi.
De posse dos dados in vitro do perfil de infecção pelo T. cruzi em macrófagos
peritoneais de camundongos selvagens e knockout para Galectina-3 tornou-se interessante
avaliar o perfil de resposta imune desses animais frente a infecção in vivo. Para isso, se
fez necessário a utilização de uma cepa que fosse mais virulenta que a cepa TcI Dm28c
anteriormente utilizada nos experimentos em cultura, logo, optamos por utilizar parasitos
da cepa Y que é TCII e seu perfil de infecção é mais intenso (GUHL F. & RAMIREZ
J.D., 2011; ZINGALES B. et al., 2012). Essa mudança de cepas se fez necessário pelo
fato dos camundongos da linhagem C57Black/6J apresentarem maior resistência à
infecção por T. cruzi (POSTAN, M. et al., 1983; POSTAN, M. et al., 1984)
Na literatura são descritas diversas concentrações de inóculo, para diferentes
vias de infecção em camundongos, por isso decidimos avaliar a parasitemia com
diferentes inóculos para escolhermos um inoculo que garantisse a infecção, mas não
levasse a morte precoce dos animais em fase aguda.
Camundongos selvagens foram infectados com 103, 104 e 105 parasitos pela via
de injeção intraperitoneal para observação da parasitemia diária no período de 6-13 dias
pós infecção, determinando assim a melhor concentração para se trabalhar de acordo com
o perfil do pico de parasitemia apresentado e a capacidade de detecção da mesma por
hemocitômetro. Após a contagem em hemocitômetro e analise em gráfico, a maior
concentração de 105 parasitos foi a concentração escolhida para trabalho (FIGURA 12).
Após a padronização da concentração do inóculo para infecção pela injeção
intraperitoneal, 7 camundongos selvagens e 6 camundongos knockout para Galectina-3
foram infectados com 105 tripomastigotas sanguícolas e acompanhados diariamente até o
13° dia para detecção e quantificação de parasitemia por hemocitômetro. O resultado do
experimento demonstrou que camundongos knockout para Galectina-3 infectados com T.
cruzi cepa Y apresentam menor parasitemia quando comparados aos camundongos
selvagens infectados nas mesmas condições (FIGURA 13).
Esses mesmos animais foram mantidos em observação até 30 dias pós-infecção
para análise de sobrevida entre os animais dos diferentes genótipos. Pode-se sugerir que
a mortalidade no camundongo selvagem foi aumentada e com uma tendência temporal
precoce quando comparada com os camundongos knockout para Galectina-3. Porém, ao
analisar estatisticamente os dados, não houve diferença significativa (FIGURA 14).
41
Figura 12. Padronização da Concentração do Inóculo para Infecção in vivo por
Trypanosoma cruzi da cepa Y. Camundongos C57Black/6J foram infectados via injeção
intraperitoneal com diferentes concentrações de tripomastigotas sanguícolas da cepa Y. A
parasitemia foi quantificada diariamente pela diluição de 2µL de sangue em PBS pH 7,4 e os
parasitos mensurados através da contagem em hemocitômetro. Os dados em verde são referentes
a concentração de 103 parasitos, os dados em preto referentes a concentração de 104 parasitos e
os dados em vermelho referentes a concentração de 105 parasitos.
Figura 13. Análise da Parasitemia Comparativa entre Camundongos Isogênicos da
Linhagem C57Black/6J Selvagens e Knockout para Galectina-3 Infectados por Trypanosoma
cruzi da cepa Y. Os camundongos foram infectados via injeção intraperitoneal com 105
tripomastigotas sanguícolas da cepa Y. A parasitemia foi quantificada diariamente pela diluição
de 2µL de sangue em PBS pH 7,4 e os parasitos mensurados através da contagem em
hemocitômetro. Os dados em preto são referentes a parasitemia dos camundongos selvagens e os
dados em vermelho são referentes a parasitemia de camundongos knockout para Galectina-3.
42
Sobrevivência infecção in vivo
(C57 Black/6 wt versus C57 Black/6 Gal-3 KO)
0 5 10 15 20 25 300
50
100
150
C57 Black/6 wild type
C57 Black/6 Gal-3KO
dias
Pe
rce
nta
ge
m
de
so
bre
viv
ên
cia
Figura 14. Gráfico de Sobrevivência Comparativa entre os Camundongos Isogênicos
C57Black/6J Selvagens e Knockout para Galectina-3 Infectados com Trypanosoma cruzi da
Cepa Y. Os animais foram infectados pela via intraperitoneal com 105 tripomastigotas
sanguícolas em PBS 1x estéril. Os dados em vermelho são referentes à percentual de
sobrevivência de animais knockout para Galectina-3 e os dados em preto são referentes à
percentual de sobrevivência de animais selvagens. Os dados obtidos foram analisados
estatisticamente pelo Log-rank (Matel-cox) test no programa GraphPad Prism5.
43
4.5 Investigação fenotípica da esplenomegalia no decorrer da fase aguda pelo
peso do órgão e índices de celularidade.
Após a morte dos animais pode-se observar uma esplenomegalia acentuada nos
camundongos C57Black/6J de ambos os genótipos. Isso nos levou ao desejo de analisar
mais de perto, ou seja, fenotipicamente o perfil imune das células presentes no baço dos
animais infectados ao longo da infecção. Sendo assim, um total de 19 camundongos
C57Black/6J Selvagens foram utilizados para experimentação, onde 5 foram mantidos
não infectados como controle negativo de infecção e 14 animais foram infectados e
eutanasiados nos tempos de 2, 5, 9 e 15 dias pós-infecção. Da mesma forma um total de
18 camundongos C57Black/6J knockout para Galectina-3 foram utilizados para
experimentação, onde 4 animais foram mantidos não infectados para controle negativo
de infecção e 14 animais foram infectados e eutanasiados nos tempos de 2, 5, 9 e 15 dias
pós-infecção. Os animais foram pesados antes da eutanásia e após a eutanásia foram
coletados o baço e o soro para análises fenotípicas (FIGURA 15A)
Os primeiros dados obtidos deste experimento foram a massa do baço dos
animais, onde o peso do baço foi normalizado através da divisão do mesmo pelo peso do
animal e não houve diferença significativa na comparação dos dados obtidos dos
camundongos selvagens comparados com os dados dos camundongos knockout para
Galectina-3 (FIGURA 15B).
A celularidade do baço foi outro parâmetro avaliado, onde o baço dos animais
foi dissociado manualmente em solução salina (PBS pH 7,4) gelada na placa de Petri. As
hemácias foram lisadas e mensurou-se a quantidade de esplenócitos através da contagem
de células em câmara de Neubauer. O que se pôde observar é que quantidade de
esplenócitos aumenta consideravelmente no baço dos animais de ambos os genótipos,
mas que estatisticamente não há diferenças entre a quantidade de células observadas
quando se compara os dados do mesmo dia entre os dois genótipos de camundongos
(FIGURA 15C). Porém um dado interessante é que mesmo com a diminuição abrupta da
quantidade de esplenócitos no 15° dia após a infecção, a massa do baço se mantém alta e
o tamanho do baço é visivelmente maior que no 9° dia após a infecção (FIGURA 16).
44
Figura 15. Investigação Fenotípica do Baço no Decorrer da Fase Aguda da Infecção pelo
Trypanosoma cruzi da Cepa Y Através do Peso do Órgão e Índice de Celularidade. (A)
Esquema experimental com Camundongos C57Black/6J Selvagens e knockouts para Galectina-
3. Os animais foram infectados via injeção intraperitoneal e eutanasiados nos dias 2, 5, 9 e 15
pós-infecção para coleta do baço para análises. (B) O baço foi pesado e normalizado pelo peso do
animal ao longo dos dias de eutanásia. Os dados em preto são referentes a média do peso
normalizado do baço dos camundongos selvagens e os dados em vermelho referentes a média do
peso normalizado do baço dos camundongos knockout para Galectina-3. (C) Os esplenócitos
foram mensurados através da contagem em câmara de Neubauer e comparadas as quantidades de
células entre os diferentes genótipos ao longo da infecção. Os dados foram analisados
estatisticamente no GraphPad Prim 5.0
Figura 16. Figura Ilustrativa da Esplenomegalia Observada nos Animais no 15° Dia de
Infecção por Trypanosoma Cruzi da Cepa Y.
45
4.6 Determinação do percentual de diferentes populações de células T (Totais,
T citotóxicas, T helper, NK, etc), macrófagos/monócitos no decorrer da fase
aguda de infecção pelo T. cruzi.
A primeira população analisada foi a de macrófagos e monócitos, marcados com
CD11+ e F4/80 somente nos animais infectados. Foi observado que em ambos os
genótipos de camundongos há o aumento de macrófagos e monócitos no quinto dia após
a infecção, e de forma significativa estatisticamente no 9° dia após a infecção essa
população cai bruscamente no baço dos animais selvagens o que não se observa no baço
dos camundongos knockouts pra Galectina-3 (FIGURA 17).
Para análise fenotípica das células imunes no baço, foram avaliadas as
porcentagens de linfócitos T totais, linfócitos T ativados, linfócitos T CD4+, linfócitos T
citotóxicos CD8+, células NK, células NK CD8+ e células NK CD4+.
Dentre as populações de linfócitos T avaliadas, pôde-se observar que a
porcentagem de células T totais encontra-se aumentada baço dos camundongos
C57Black/6J selvagens já no segundo dia após a infecção, e essa porcentagem de células
diminui ao longo da infecção até o 9º dia pós-infecção, perfil este que não é observado
quando avaliada a porcentagem dessas células no baço dos camundongos C57Black/6J
knockout para Galectina-3 (FIGURA 18).
Porém, pode-se observar uma tendência na diminuição da porcentagem de
células T citotóxicas CD8+ no baço dos camundongos C57Black/6J selvagens após o 5º
dia de infecção, o que não se observa quando analisamos o gráfico dessa população no
baço dos C57Black/6J knockout para Galectina-3 (FIGURA 18).
As análises de células NK, NK CD8+ ou NK CD4+ não revelaram diferenças
significativas na comparação da porcentagem no baço dos camundongos C57Black/6J
knockouts para Galectina-3 e C57Black/6J selvagens. Porém quando analisamos os dados
do 9º dia pós-infecção observamos que há uma tendência no aumento das células NK nos
camundongos knockouts para Galectina-3 que não se observa nos selvagens, apesar de
não ser estatisticamente significativo (FIGURA 19).
46
Figura 17. Determinação do Percentual de Macrófagos/Monócitos no Decorrer da Fase de
Incubação e Início da Fase Aguda da Infecção por Trypanosoma Cruzi da Cepa Y. Os
esplenócitos obtidos após a lise de hemácias foram contados e ressuspensos em Flow Cytometry
Staining Buffer Solution (eBioscience) e incubados durante 30 minutos com FcBlock CD16/32 a
4°C sobre agitação. Após a incubação com o FcBlock, adicionou-se os anticorpos CD11+ e F4/80
e incubou-se por mais 1 hora a 4°C sobre agitação. Procedeu-se com duas lavagens utilizando
Flow Cytometry Staining Buffer Solution (eBioscience) e seguiu-se para análise em citômetro de
fluxo Accuri C6 (BD Biosciences). Os dados foram plotados no programa GraphPad Prism 5.0
e analisados estatisticamente pelo método two way ANOVA com teste comparativo Bonferroni.
(*** sendo p<0,001).
47
Figura 18. Avaliação das Populações de Linfócitos T no Baço de Camundongos C57Black/6J Selvagens e
Knockout para Galectina-3 Frente a Infecção por Trypanosoma Cruzi. Os esplenócitos obtidos após a lise de
hemácias, foram contados e ressuspensos em Flow Cytometry Staining Buffer Solution (eBioscience) e incubados
durante 30 minutos com FcBlock CD16/32 a 4°C sobre agitação. Após a incubação com o FcBlock, adicionou-se os
anticorpos CD3ε para marcação dos linfócitos T totais; CD3ε e CD4 para marcação dos linfócitos T CD4; CD3ε e CD8
para marcação de linfócitos T citotóxicos e incubou-se por mais 1 hora a 4°C sobre agitação. Procedeu-se com duas
lavagens utilizando Flow Cytometry Staining Buffer Solution (eBioscience) e seguiu-se para análise em citômetro de
fluxo Accuri C6 (BD Biosciences). Os dados foram plotados no programa GraphPad Prism 5.0 e analisados
estatisticamente pelo método two way ANOVA com teste comparativo Bonferroni. (* sendo p<0,05).
48
Células NK
Dia
2
Dia
5
Dia
9
Dia
2
Dia
5
Dia
9
0
5
10
15
20Selvagem
Gal-3 KO
CD
3+ C
D335
+ (
%)
Células NK CD8+
Dia
2
Dia
5
Dia
9
Dia
2
Dia
5
Dia
9
0
5
10
15
20
25Selvagem
Gal-3 KO
CD
3+ C
D335
+C
D8
+ (
%)
Células NK CD4+
Dia
2
Dia
5
Dia
9
Dia
2
Dia
5
Dia
9
0
10
20
30
40
50Selvagem
Gal-3 KO
CD
3+ C
D335
+ C
D4
+ (
%)
Figura 19. Avaliação da População de Células NK no Baço de Camundongos C57Black/6J Selvagens e
Knockout para Galectina-3 Frente a Infecção por Trypanosoma Cruzi. Os esplenócitos obtidos após a lise de
hemácias, foram contados e ressuspensos em Flow Cytometry Staining Buffer Solution (eBioscience) e incubados
durante 30 minutos com FcBlock CD16/32 a 4°C sobre agitação. Após a incubação com o FcBlock, adicionou-se os
anticorpos CD3ε e CD335 para marcação das células Natural Killer (NK); CD3ε, CD335 e CD8 para marcação das
células NK CD8+; CD3ε, CD335 e CD4 para marcação das células NK CD4+ e incubou-se por mais 1 hora a 4°C
sobre agitação. Procedeu-se com duas lavagens utilizando Flow Cytometry Staining Buffer Solution (eBioscience) e
seguiu-se para análise em citômetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences). Os dados foram plotados no programa
GraphPad Prism 5.0 e analisados estatisticamente pelo método two way ANOVA com teste comparativo Bonferroni.
49
4.7 Relacionar o perfil celular imune com o perfil de produção de citocinas pró
e anti-inflamatórias no decorrer da infecção pelo T. cruzi.
Afim de associar os dados de fenotipagem do baço com o perfil de citocinas
expressos nos animais (IL-6, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-17A IL-4 e IL-10), foi realizada a
análise do soro dos animais por CBA. O sangue dos mesmos animais infectados utilizados
para o experimento de fenotipagem de células do baço foi coletado quando eutanasiados,
deixados coagular por 30 minutos em temperatura ambiente e centrifugados para
obtenção do soro.
Das citocinas pró-inflamatória analisadas (IL-6, IL-2, TNF-α, IFN-γ) pôde-se
observar que no 9º dia pós-infecção houve um aumento significativo na quantidade de
TNF-α no soro dos animais selvagens em comparação ao soro dos camundongos knockout
para Galectina-3 (FIGURA 20).
No 5º dia pós-infecção pode-se observar que há uma maior quantidade
significativa de IFN-γ no soro dos animais selvagens quando comparada estatisticamente
com a quantidade encontrada no soro dos camundongos knockouts, essa concentração de
IFN-γ nos selvagens tende a se manter mais alta que no soro dos knockouts para
Galectina-3 até o 9º dia pós-infecção. Porém o mais interessante é que no 15º dia pós-
infecção esse perfil é revertido e a quantidade de IFN-γ está bem mais alta no soro dos
camundongos knockout para Galectina-3 e quando analisada se mostrou estatisticamente
significativo (FIGURA 20).
A citocina IL-6 se mostrou baixa durante os primeiros dias de infecção no soro
dos animais de ambos os genótipos, começou a aumentar a concentração de forma igual
no 9º dia pós-infecção e se mostrou bem aumentada no soro dos animais no 15º dia pós-
infecção. Ao 15º dia pôde-se observar também que a quantidade presente no soro dos
camundongos knockouts para Galectina-3 se mostrou mais alto quando comparada a
quantidade encontrada no soro dos animais selvagens, sendo estatisticamente
significativa essa diferença (FIGURA 20).
Outra citocina avaliada foi IL-2, e essa apresentou um resultado muito curioso,
sendo a única das citocinas avaliadas que se manteve em baixas concentrações durante
toda infecção no soro dos camundongos selvagens e knockouts. Contudo, no 15º dias pós-
infecção teve um aumento abrupto de sua concentração no soro dos animais knockouts
para Galectina-3 o que não acontece no soro dos animais selvagens (FIGURA 20).
50
Duas citocinas anti-inflamatórias foram quantificadas no soro dos camundongos
infectados de ambos os genótipos já citados anteriormente, IL-10 e IL-4.
Dentre estas, a única que apresentou níveis diferentes em algum dos dias
analisados foi IL-4. Onde no 15º dia pós-infecção não houve níveis detectáveis dessa
citocina no soro dos camundongos selvagens, já no soro dos camundongos knockouts para
Galectina-3 esta citocina se mostrou em alta concentração (FIGURA 21).
Alguns dados na literatura correlacionam o potencial autoimune da resposta
Th17 com os danos cardíacos devido a infecção pelo T. cruzi. Sendo assim, foi realizada
a quantificação de IL-17a no soro dos animais infectados a fim de observar se há o
aumento dessa citocina na fase inicial da infecção e se existe alguma alteração em sua
concentração dentre os genótipos dos camundongos infectados. Apesar da detecção de
altos níveis de IL-17a no 15º dia pós-infecção, não houve diferença estatisticamente
significativa entre a concentração encontrada no soro dos animais selvagens comparada
ao quantificado no soro dos animais knockouts (FIGURA 22).
51
*
Standart TNF-alfa
1:256
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8 1:4 1:2
Top Sta
ndart
0
2000
4000
6000
8000
10000
pg
/mL
TNF-alfa (Soro)
Selvagem
dia
0
Gal-3
KO
dia
0
Selvagem
dia
2
Gal-3
KO
dia
2
Selvagem
dia
5
Gal-3
KO
dia
5
Selvagem
dia
9
Gal-3
KO
dia
9
Selvagem
dia
15
Gal-3
KO
dia
15
0
100
200
300
400
500Selvagem
Gal-3 KO
pg
/mL
Standart IFN
1:256
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8 1:4 1:2
Top Sta
ndart
0
2000
4000
6000
pg
/mL
IFN-g (Soro)
Selvagem
dia
0
Gal-3
KO
dia
0
Selvagem
dia
2
Gal-3
KO
dia
2
Selvagem
dia
5
Gal-3
KO
dia
5
Selvagem
dia
9
Gal-3
KO
dia
9
Selvagem
dia
15
Gal-3
KO
dia
15
0
100
200
300
400
500 Selvagem
Gal-3 KO
pg
/mL
Standart IL-6
1:25
6
1:12
81:
641:
321:
16 1:8
1:4
1:2
Top Sta
ndart
0
2000
4000
6000
pg
/mL
IL-6 (Soro)
Selvag
em d
ia 0
Gal-3
KO
dia
0
Selvag
em d
ia 2
Gal-3
KO
dia
2
Selvag
em d
ia 5
Gal-3
KO
dia
5
Selvag
em d
ia 9
Gal-3
KO
dia
9
Selvag
em d
ia 1
5
Gal-3
KO
dia
15
0
500
1000
1500
2000
Gal-3 KO
Selvagem
pg
/mL
Standart IL-2
1:256
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8 1:4 1:2
Top Sta
ndart
0
1000
2000
3000
4000
5000
pg
/mL
IL-2 (Soro)
Selvag
em d
ia 0
Gal-3
KO
dia
0
Selvag
em d
ia 2
Gal-3
KO
dia
2
Selvag
em d
ia 5
Gal-3
KO
dia
5
Selvag
em d
ia 9
Gal-3
KO
dia
9
Selvag
em d
ia 1
5
Gal-3
KO
dia
15
0
200
400
600
800Selvagem
Gal-3 KO
pg
/mL
***
*
**
***
Figura 20. Quantificação de citocinas pró-inflamatórias no soro de camundongos C57Black/6J selvagens e
knockouts infectados com Trypanosoma cruzi da cepa Y. O soro foi coletado dos animais segundo o dia pós-
infecção e armazenados no freezer -80ºC até a análise por CBA em citômetro Accuri C6 (BD Biosciences). Os dados
foram gerados e quantificados no programa FCAP Array Software TM versão 3.0 (BD Biosciences), e plotados no
programa GraphPad Prism 5 e analisados estatisticamente pelo método two way ANOVA com teste comparativo
Bonferroni (*** sendo p<0,001 / ** sendo p<0,01 / * = p<0,05).
52
Standart IL-10
1:25
6
1:12
81:
641:
321:
16 1:8
1:4
1:2
Top
Sta
ndar
t
0
5000
10000
15000
20000
pg
/mL
IL-10 (Soro)
Sel
vage
m d
ia 0
Gal
-3 K
O d
ia 0
Sel
vage
m d
ia 2
Gal
-3 K
O d
ia 2
Sel
vage
m d
ia 5
Gal
-3 K
O d
ia 5
Sel
vage
m d
ia 9
Gal
-3 K
O d
ia 9
Sel
vage
m d
ia 1
5
Gal
-3 K
O d
ia 1
5
0
500
1000
1500
2000
2500Selvagem
Gal-3 KO
pg
/mL
Standart IL-4
1:25
6
1:12
81:
641:
321:
16 1:8
1:4
1:2
Top
Sta
ndar
t
0
2000
4000
6000
8000
10000
pg
/mL
IL-4 (Soro)
Sel
vage
m d
ia 0
Gal
-3 K
O d
ia 0
Sel
vage
m d
ia 2
Gal
-3 K
O d
ia 2
Sel
vage
m d
ia 5
Gal
-3 K
O d
ia 5
Sel
vage
m d
ia 9
Gal
-3 K
O d
ia 9
Sel
vage
m d
ia 1
5
Gal
-3 K
O d
ia 1
5
0
100
200
300
Gal-3 KO
Selvagem
pg
/mL
*
Figura 21. Quantificação de citocinas anti-inflamatórias no soro de camundongos
C57Black/6J selvagens e knockout para Galectina-3 infectados com Trypanosoma cruzi da cepa
Y. O soro foi coletado dos animais segundo o dia pós-infecção e armazenados no freezer -80ºC até a
análise por CBA em citômetro Accuri C6 (BD Biosciences). Os dados foram gerados e quantificados
no programa FCAP Array Software TM versão 3.0 (BD Biosciences), e plotados no programa
GraphPad Prism 5 e analisados estatisticamente pelo método two way ANOVA com teste
comparativo Bonferroni (* = p<0,05).
53
IL-17a (Soro)
Selva
gem d
ia 0
Gal
-3 K
O d
ia 0
Selva
gem d
ia 2
Gal
-3 K
O d
ia 2
Selva
gem d
ia 5
Gal
-3 K
O d
ia 5
Selva
gem d
ia 9
Gal
-3 K
O d
ia 9
Selva
gem d
ia 1
5
Gal
-3 K
O d
ia 1
5
0
200
400
600
800Selvagem
Gal-3 KO
pg
/mL
Figura 22. Quantificação da citocina pró-inflamatória IL-17 no soro de camundongos C57Black/6J
selvagens e knockouts infectados com Trypanosoma cruzi da cepa Y. O soro foi coletado dos animais
segundo o dia pós-infecção e armazenados no freezer -80ºC até a análise por CBA em citômetro Accuri C6
(BD Biosciences). Os dados foram gerados e quantificados no programa FCAP Array Software TM versão
3.0 (BD Biosciences), e plotados no programa GraphPad Prism 5 e analisados estatisticamente pelo método
two way ANOVA com teste comparativo Bonferroni.
54
4.8 Clonagem de Galectina-3 selvagem e deletada do domínio de
reconhecimento de carboidrato (mutante ∆CRD) em vetor lentiviral.
Para isolarmos região codificante da proteína Gal-3 (Gal-3wt) na sua forma
selvagem e na ausência do domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD), foi feita
uma amplificação pelo método de PCR (Polimerase Chain Reaction) utilizando Pfx DNA
polimerase. Como observado houve a amplificação do produto desejado com os tamanhos
esperados de 351pb para Gal-3CRD e 753pb para Gal-3wt (FIGURA 23).
De posse já dos plasmídeos com a inserção dos amplicons de interesse, seguiu-
se com a transformação de bactérias da cepa DH5α com seleção em meio LB ágar
contendo ampicilina. As colônias obtidas neste meio de seleção foram crescidas em meio
líquido com ampicilina e investigadas por PCR. Brevemente, as colônias foram fervidas
à 100°C por 5 minutos, em água MilliQ, e centrifugadas por 1 minuto a 14000g, o
sobrenadante contendo o DNA plasmidial foi então utilizado como molde na reação de
PCR com a Taq DNA polimerase para confirmação dos clones positivos contento os
insertos Gal-3wt e Gal-3 CRD. Na eletroforese dos produtos da PCR de confirmação
das clonagens em pHIV-puro+, tanto para a região codificante íntegra de Galectina-3,
quanto para a região codificante parcial de Gal-3ΔCRD, observamos que todos os clones
foram positivos (FIGURA 24).
55
Figura 23. Gel de eletroforese das amostras de PCR com Pfx DNA polimerase para obtenção
e massa dos amplicons Gal-3wt e Gal-3ΔCRD. A primeira raia não numerada representa o
marcador de peso molecular GeneRuler 1Kb Ladder (75, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1500,
2000, 3000, 4000, 5000, 7000, 10000, 20000pb); na raia 1 o controle negativo do mix sem DNA
das reações; nas raias 2 e 3 os produtos da reação de PCR para amplificação da região codificante
íntegra de Gal-3wt; nas raias 5 e 6 os produtos da reação de PCR para amplificação da região
parcial de Gal-3ΔCRD. O gel de agarose foi preparado em tampão TAE (Tris-Acetato 40mM e
EDTA 1mM) na concentração de 1%, sendo o TAE também utilizado como tampão de corrida.
Figura 24. Eletroforese da reação de PCR para confirmação das clonagens no plasmídeo
pHIV-puro+. A raia 1 e a raia 19 representam o marcador de peso molecular GeneRuler 1Kb
Ladder (75, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 7000, 10000, 20000pb);
na raia 5 o controle positivo com o plasmídeo pcDNA3.1-Gal3-wt como molde para a
amplificação. Das raias 6 à 17 estão as amostras de PCR realizadas com oligonucleotídeos para
amplificação da região codificante parcial de Gal-3ΔCRD, das raias 20 à 33 as amostras de PCR
realizadas com oligonucleotídeos para amplificação da região codificante íntegra de Gal-3. As
raias 18 e 34 são os controles negativos da reação sem adição de DNA. O gel de agarose foi
preparado em tampão TAE (Tris-Acetato 40mM e EDTA 1mM) na concentração de 1%, sendo o
TAE também utilizado como tampão de corrida.
56
4.9 Transdução da linhagem monocítica THP1 com construções lentivirais e
posterior seleção.
No primeiro dia foi feito o plaqueamento das células HEK293-FT utilizando 5 x
105 células/poço de 35cm2, no segundo dia foi realizada a transfecção propriamente dita
com a adição de 5μg de um dos plasmídeos pHIVs modificados, juntamente com 5μg do
plasmídeo pLP/VSVG, 2,5μg do pLP1 e 2,5μg do pLP2, utilizando como reagente de
transfecção polietilenoimina (PEI) 1μg/μL (Polysciences Inc.). No quarto dia foi coletado
o sobrenadante contendo as partículas virais, e centrifugado a 600g por 5 minutos para
descarte de células presentes no sobrenadante. A seguir, a linhagem THP1 foi transduzida
com partículas virais em meio DMEM 10% SFB complementado com polibreno 10
mg/mL na diluição 1:1000.
Cerca de 24h e 48h após a transdução foi retirado o sobrenadante e adicionado
meio DMEM com 10% SFB contendo a respectiva droga de seleção. Como as partículas
virais com o arcabouço de pHIV-puro-Gal-3wt ou pHIV-puro-Gal-3ΔCRD possuem um
gene que codifica uma proteína que confere resistência à puromicina, somente as células
transduzidas integraram o vírus no seu genoma, sendo resistentes à pressão seletiva com
droga. Sendo assim, adicionamos ao meio de cultivo das células da linhagem THP-1
4µg/mL de puromicina, respectivamente. O meio com puromicina foi renovado a cada
três dias, mantendo a pressão seletiva com a droga até a recuperação e expansão da célula.
4.10 Análise preliminar da infecção nas linhagens depletadas ou
superexpressando Galectina-3 na forma selvagem ou mutante.
Para confirmação da superexpressão das isoformas da proteína Galectina-3 foi
realizada extração proteica total das células transduzidas e selecionadas com puromicina,
seguida do fracionamento das proteínas em SDS-PAGE. Posteriormente, foi realizada
análise de western blotting com anticorpo anti-Gal-3 de hibridoma para comprovarmos
as alterações realizadas.
Podemos observar um aumento nos níveis de Galectina-3 na linhagem
superexpressando a forma íntegra, THP-1 Gal-3, quando comparada com a linhagem com
níveis endógenos de Galectina-3, linhagem THP-1 wild type. Para a depleção por RNAi
podemos observar redução significativa nos índices endógenos de Galectina-3 na
linhagem THP-1 sh-Gal3, quando comparada com linhagem THP-1 wild type e linhagem
THP-1 scramble que expressa um shRNA não relacionado. Para a linhagem THP-1 Gal-
57
3 ∆CRD, não detectamos a banda correspondente ao mutante, uma vez que além de apresentar
baixo peso molecular de 11kDa, esta não é reconhecida como epítopo pelo anticorpo oriundo de
hibridoma. Novos ensaios estão em curso, utilizando um outro anticorpo anti-Gal-3 e um controle
de massa com anti-β-actina para análises por western blotting, além de ensaios de RT-PCR para
corroborarmos as alterações genéticas nas linhagens (FIGURA 25).
Figura 25. Análise dos níveis proteicos de Galectina-3 após Transdução de THP-1. Extrato
proteico total das linhagens THP-1 wild type, THP-1 scramble, THP-1 shGal-3, THP-1 Gal-3,
THP-1 Gal-3 ∆CRD foram obtidos pela lise das células com tampão RIPA, quantificação pelo
método colorimétrico de Bradford, seguido de desnaturação em Laemmli buffer a 95oC por 5
minutos, utilizando 30 µg por raia no SDS-PAGE. Análise por western blotting foi realizada com
IgG de hibridoma anti-Galectina-3 na diluição de 1:50, sendo n=1.
58
5. DISCUSSÃO
Como citado na introdução, a Galectina-3 reconhece através do seu CRD, β-
galactosídeos existentes em glicoproteínas presentes na superfície do parasito, como a
mucina Tc45 (MOODY, T. N. et al., 2000; NDE, T. N. et al., 2012). Esse reconhecimento
facilita a migração do parasito na matriz extracelular e a infecção em células musculares
lisas e dendríticas (KLESHCHENKO, Y. Y. et al., 2004; VRAY, B. et al., 2004; NDE,
T. N. et al., 2012). Sabendo que macrófagos são células fagocíticas profissionais, o intuito
do experimento foi analisar se a Galectina-3 estaria de alguma forma atuando na
promoção da fagocitose parasitária e no sucesso infectivo do T. cruzi, tendo em vista que
a Galectina-3 pode atuar como um PRR (DE SOUZA, 2012).
Nossa ideia experimental inicial foi avaliar a quantidade de parasitos no
sobrenadante de células infectadas, ou seja, buscar associar a liberação de formas
tripomastigotas no meio com a quantidade de parasitos que foram inicialmente
fagocitados e obtiveram sucesso infectivo. Desta forma os resultados obtidos
demonstraram que o brotamento dos tripomastigotas de cultura da cepa Dm28c foi menor
quando infectamos macrófagos provenientes de camundongos C57Black/6J Gal-3 KO,
do que índices quando infectamos macrófagos provenientes de camundongos selvagens.
Sabendo que a Galectina-3 é uma proteína de atuação pleiotrópica e uma de suas
atuações é a participação no controle da morte celular (CHEN, SC. & KUO, PL., 2016;
LI, LC. et al., 2016), decidimos então avaliar a viabilidade celular in vitro dos macrófagos
peritoneais provenientes dos camundongos C57Black/6J dos diferentes genótipos. Pôde-
se observar que de fato os macrófagos provenientes de camundongos knockouts possuem
menor viabilidade em cultura quando comparados com os selvagens. Dado que corrobora
com a publicação de Rabinovich e colaboradores (2002), onde demonstraram por
experimentos in vivo e in vitro que uma das maneiras de Galectina-3 modular a reposta
imune é prolongando a sobrevivência de células imunes.
Mas o interessante foi observar que no ponto de 48 horas após a infecção, os
macrófagos provenientes de camundongos de ambos os genótipos apresentaram um perfil
de células com menor viabilidade, provavelmente decorrente do próprio estresse inicial
da infecção, mas esse perfil foi revertido no ponto de 72 horas exclusivamente nos
macrófagos selvagens e não nos macrófagos knockout. A Galectina-3 está de alguma
forma envolvida com o estímulo de vias de sobrevivência reguladas positivamente pelo
59
parasito ao longo da infecção, igualando-se a viabilidade dos macrófagos infectados com
controle não infectado.
Acreditamos que o menor índice de brotamento de formas tripomastigotas
observado para os macrófagos knockouts esteja relacionado com dois fatores
independentes mediados por Galectina-3: (1) uma menor adesão-invasão pelo T. cruzi
decorrente da ausência de Galectina-3 como PRR nos macrófagos, (2) um menor
percentual de macrófagos viáveis para adesão-invasão pelo T. cruzi ao longo do
experimento. Desse modo, a conjuntura desses dois fatores contribui para um menor
índice endocitico de parasitos e uma menor sobrevivência da célula hospedeira.
Vale destacar que essas observações não foram tomadas com um exsudato
peritoneal estimulado com tioglicolato. A utilização do tioglicolato estimula a migração
de células mononucleares fagocíticas da medula para a cavidade peritoneal, e estas células
mantém parcialmente sua capacidade proliferativa no exsudato peritoneal (VAN FURTH
& COHN, 1968), justamente por este motivo não utilizamos estímulo com tioglicolato.
Sabe-se que na coleta de macrófagos peritoneais, a cultura primária realizada irá
apresentar também um pequeno percentual de fibroblastos, que através da produção de
MGF (Macrophage Growth Factor) mantém as células não diferenciadas em proliferação
(VAN DER ZEIJST et al., 1978). No entanto, a análise de imunomarcação prévia dos
nossos exsudatos com os CDs CD11b e F4/80 específicos para população de macrófagos
murinos apresentou percentuais de células duplamente positivas, CD11b+ F4/80+,
próximos de 100% (dados não mostrados), descartando possibilidade de contaminações
com outras populações em nossas coletas.
De posse dos dados de viabilidade celular tornou-se interessante avaliarmos os
níveis proteicos de Galectina-3 nos macrófagos em cultura, uma vez que Galectina-3 está
diretamente associada com vias de sobrevivência/proliferação. O resultado obtido refletiu
os trabalhos anteriores de Vray e colaboradores (2004) e Kleshchenko e colaboradores
(2004) que demonstraram um aumento da expressão de Galectina-3 em resposta à
infecção.
Porém, foi a presença de Galectina-3 nos extratos obtidos dos camundongos
knockouts que chamou mais a nossa atenção, ao analisarmos a literatura nos deparamos
com a publicação de Hsu e colaboradores (2000) que descreve o processo de inativação
da Galectina-3 nos camundongos C57Black/6J. O knockout murino consistiu na inserção
de gene que codifica proteína de resistência à neomicina (neo+) entre os éxons 4 e 5 do
gene de Galectina-3, garantindo a sua inativação (HSU et al, 2000). A estrutura genômica
60
da Galectina-3 possui 6 éxons onde os éxons 2 e 3 codificam para a porção N-terminal e
os exons 4, 5 e 6 codificam para a porção C-terminal e consequente CRD da proteína.
Em nosso modelo, de alguma forma a infecção desencadeia um estímulo
transcricional sobre o promotor de Galectina-3 levando a produção de uma proteína
híbrida Gal3-neo+ com porção N-terminal truncada e inativa de Galectina-3 apresentando
peso molecular em kDa similar a Galectina-3 íntegra.
Além disso, Hsu e colaboradores (2000) demonstram também que os
macrófagos peritoneais Gal-3 KO possuem maior sensibilidade a estímulos apoptóticos,
o que corrobora com a menor viabilidade celular observada anteriormente com
macrófagos peritoneais sob condições normais de cultivo.
Decidimos então avaliar de forma comparativa a parasitemia pelo T. cruzi nos
camundongos C57Black/6J dos diferentes genótipos. A variabilidade genética entre as
cepas de T. cruzi influenciam na capacidade de infecção do mesmo (ARAÚJO et al.,
2016; LIMA et al., 2015; ZINGALES et al., 2012), por isso optamos pela utilização de
tripomastigotas cepa Y, uma cepa TcII, que possui maior capacidade infectiva in vivo.
Silva e colaboradores (2013) investigaram a susceptibilidade à infecção pela cepa Y de
T. cruzi de diversas linhagens isogênicas de camundongos e observaram uma grande
variação entre elas, principalmente, entre a linhagem A/J que é extremamente susceptível,
e a linhagem C57Black/6J que é mais resistente (SILVA et al, 2013).
Logo, para gerarmos um protocolo de infecção eficiente e detectável, a ponto de
permitir a observação e contagem dos tripomastigotas sanguícolas, camundongos
C57Black/6J selvagens foram infectados com 103, 104 e 105 tripomastigostas sanguícolas
provenientes do soro de camundongos Swiss, e avaliados diariamente, para contagem de
parasitos no sangue para determinar o progresso da parasitemia na fase aguda da doença.
A partir do 6° dia de infecção os animais começaram a apresentar parasitemia, e o pico
se deu entre o 7º e o 9º dia. O que se pôde observar foi que a resistência destes animais à
infecção está mais relacionada à sobrevida dos animais do que ao número de parasitos
necessários para se gerar uma infecção experimental. Isso porque, mesmo animais
inoculados com doses possuindo concentrações baixas de tripomastigotas sanguícolas
geraram uma parasitemia.
Vale ressaltar que os experimentos prévios não apresentados no presente
trabalho, mas realizados com as formas tripomastigotas de cultura e tripomastigotas
metacíclicos das cepas Y, CL Brener e Tulahuen foram todos infrutíferos. Em nenhuma
das cepas e em nenhuma das massas parasitárias utilizadas, 103 a 106 parasitos, obtivemos
61
índices detectáveis de parasitemia em camundongos C57Black/6J. O sucesso que
alcançamos posteriormente foi devido a utilização de formas tripomastigotas de cultura,
juntamente com a utilização da droga imunossupressora ciclofosfamida que foi um fator
determinante no sucesso da infecção em camundongos Swiss para gerar massa parasitária
e assim possibilitar os resultados in vivo com C57Black/6J aqui apresentados com
tripomastigotas da cepa Y.
Buscando observar a fase aguda e mortalidade nos diferentes genótipos de
camundongos C57Black/6J, a maior concentração de parasitos (105) foi escolhida como
inóculo de infecção. A parasitemia em camundongos selvagens foi muito mais alta que
nos camundongos knockout para Galectina-3 e a sobrevida de animais knockout foi maior.
No curso da infecção tecidual, os tripomastigotas modulam o aumento da
expressão de laminina γ-1 (LAMC1), a laminina mais abundante na ECM através da
ativação de ERK1/2 via PLC (Phosphoinositide phospholipase C). LAMC1 é um parceiro
de Galectina-3, e uma vez que a glicoproteína mucina Tc45 de tripomastigotas consegue
se associar com Galectina-3, essa associação serviria de ponte molecular para acesso do
parasito à ECM, intensificando a infecção tecidual das células hospedeiras através do
complexo LAMC1/Galectina-3/Tc45 (MOODY et al., 2000; KLESHCHENKO et al.,
2004; NDE et al., 2012). A interação LAMC1/Galectina-3/Tc45 também auxilia a
migração dos tripomastigotas para a matriz dos tecidos, facilitando a interação com as
células (KLESHCHENKO et al., 2004). Ambos os animais, C57Black/6J wt e Gal-3 KO,
possuem a LAMC1, mas o mediador da interação entre a LAMC1 e a mucina Tc45 não
está funcional nos animais knockout, por isso é de se esperar que a colonização tecidual
por esta via não ocorra da mesma forma nos mesmos.
Para melhor elucidar a resposta imune, e desta forma buscar um perfil que nos
dite a diferença entre a infecção que ocorre nos animais selvagens e knockouts, foram
realizados experimentos de infecção in vivo e in vitro. Uma vez que as passagens
sucessivas de infecção nos camundongos aumentam a virulência dos parasitos,
procuramos normatizar os experimentos in vivo utilizando sempre a massa parasitária de
tripomastigotas sanguícolas da cepa Y, provenientes da segunda passagem em
camundongos C57Black/6J tratados com ciclofosfamida. Dados do grupo demonstram
que após uma média de 8 passagens para produção de massa parasitária destinada aos
experimentos, os camundongos infectados apresentavam uma alta mortalidade, de mais
de 90% antes de completarem 10 dias de infecção (dados não mostrados).
62
Outro ponto analisado foi a esplenomegalia que é frequentemente observada em
infecções experimentais com o T. cruzi (FRANCISCO et al., 2015). Durante o
experimento de infecção o peso corporal dos animais foi mensurado, o baço foi coletado
pós-eutanásia e pesado, com isso gerou-se um gráfico a partir da normalização do peso
do baço com o peso corporal dos animais. Isto foi feito afim de minimizar a possibilidade
de valores tendenciosos, tendo em vista que os animais de diferentes genótipos possuem
disparidade de tamanho. O gráfico gerado demonstrou que há um aumento na massa do
baço dos camundongos infectados de ambos os genótipos, porém não houveram
diferenças significativas quando comparados os dados provenientes de camundongos
selvagens com os dados dos camundongos knockouts.
Outro parâmetro avaliado no baço foi a quantidade de espelenócitos encontrados
no baço ao longo da infecção. O que se pôde observar foi que a quantidade de esplenócitos
aumentou consideravelmente no baço dos animais de ambos os genótipos, mas
estatisticamente não houve diferenças entre a quantidade de células observadas quando
comparamos os dados do mesmo dia entre os dois genótipos de camundongos. Porém,
um dado interessante foi que mesmo com a diminuição abrupta da quantidade de
esplenócitos no 15° dia pós-infecção, a massa do baço se manteve alta e o tamanho do
baço foi visivelmente maior que no 9° dia pós-infecção.
Após a análise de parâmetros gerais do baço, foram feitas imunomarcações para
marcadores de superfície nos esplenócitos para quantificar e caracterizar o perfil de
células imunes presentes no baço durante o curso inicial da infecção. Depois da atuação
de macrófagos/monócitos e células dendríticas na resposta in loco de primeiro momento
contra a infecção por T. cruzi, os linfócitos T, células NK (Natural Killer cells) e
macrófagos ativados são os principais tipos celulares ativados através da indução
principalmente por IL-12 e TNF-α (ANDRADE et al., 2014). Estes tipos celulares estão
envolvidos no desenvolvimento da resposta imune contra a infecção, e secretam
principalmente IFN-γ que levará a diferenciação e ativação de outros tipos celulares
(ANDRADE et al., 2014; JORGE, T.C.A. & CASTRO, S.L., 2000). Por esse motivo, a
avaliação fenotípica da presença dessas células no órgão linfóide secundário como o baço
e a quantificação de citocinas no soro desses animais é um viés interessante, já que
qualquer modificação na expressão e diferenciação destes tipos celulares nos
camundongos knockout para Galectina-3 pode ser um dado chave para o envolvimento
da Galectina-3 no perfil de resposta imune contra o T. cruzi.
63
O percentual de monócitos/macrófagos foi investigado no 2º, 5º e 9º dias pós-
infecção, tendo em vista que estas são as primeiras células preferencialmente infectadas
pelo T. cruzi (HISSA & ANDRADE, 2015). O observado foi que que em ambos os
genótipos de camundongos, há o aumento de macrófagos e monócitos no 5º dia pós-
infecção, e de forma significativa no 9° dia pós-infecção essa população cai bruscamente
no baço dos animais selvagens, o que não se observa no baço dos camundongos knockouts
para Galectina-3 (FIGURA 17).
Como este pico de redução no 9º dia não é observado nos camundongos
C57Black/6J knockouts, esses dados sugerem que boa parte dos macrófagos presentes no
baço desses animais do 2º ao 5º dia pós-infecção são macrófagos infectados que migram
e que se estabelecem no baço. A posteriori, a liberação dos parasitos após a conclusão de
um ciclo de infecção nesses macrófagos é capaz de reduzir a sua população no 9º dia em
camundongos selvagens, mas não em camundongos knockouts. Acreditamos que esta
cinética possa estar diretamente relacionada com a parasitemia nos camundongos
selvagens que tem seu pico de parasitemia no 8-9º dia pós-infecção com 105
tripomastigotas sanguícolas da cepa Y e posteriormente tende a cair significativamente,
enquanto que nos camundongos knockouts há uma cinética de retardo na parasitemia
(FIGURA 13). O que justificaria uma alta concentração de macrófagos vivos no baço de
camundongos knockouts ainda no 9º dia pós-infecção.
O processo infeccioso no baço promove lesão tecidual e consequente inflamação
local, podem ser as causas da esplenomegalia observada ao 15º dias pós-infecção
(FIGURA 16). O controle do T. cruzi no hospedeiro depende tanto da imunidade inata,
quanto da resposta imune adquirida que é ativada durante a fase aguda da infecção, e essa
ativação se faz essencial para a sobrevivência do hospedeiro. Neste processo são ativados
macrófagos específicos (MØ), células NK (natural killer), linfócitos T e B envolvendo a
produção de citocinas inflamatórias do tipo Th1 como IFN-γ (Interferon-γ), TNF-α
(Tumour Necrosis Factor alpha) e interleucina-10 (MACHADO et al., 2012).
Na avaliação dos esplenócitos pôde-se observar que a porcentagem de células T
totais encontra-se aumentada baço dos camundongos C57Black/6J selvagens já no
segundo dia após a infecção, e essa porcentagem de células diminui ao longo da infecção
até o 9º dia pós-infecção, perfil este que não é observado quando avaliada a porcentagem
dessas células no baço dos camundongos C57Black/6J knockout para Galectina-3
(FIGURA 18). Harding e colaboradores (1992) demonstraram que o estímulo de ativação
e proliferação de células T na resposta imune frente uma infecção se dá por moléculas co-
64
estimulatórias. A associação entre as moléculas co-estimulatórias CD28 e B7 gera um
dos sinais mais significativos de indução à proliferação de linfócitos T (HARDING et al.,
1992; TANASKOVIC et al., 2016). E essa observação do aumento de células T no baço
de camundongos selvagens leva a crer que de alguma forma esse estímulo proliferativo
possui a atuação da proteína Galectina-3.
Já os linfócitos T CD4+ não apresentaram diferença estatística significativa nas
porcentagens entre os camundongos dos diferentes genótipos. A ativação de células T
pode ocorrer de forma independente de CD28 quando há o estímulo contínuo e específico
por antígenos (MARTINS et al., 2004), o que explica o porquê que na ausência de
Galectina-3 há a ativação linfocitária. Porém, Demetriou e colaboradores (2001)
demonstraram em publicação que a associação da Galectina-3 com complexos
glicoproteicos restringe o recrutamento de TCR’s e consequentemente modula
negativamente a ativação de células T (DEMETRIOU et al., 2001).
No 9º dia pós-infecção observou-se uma tendência de diminuição na população
de linfócitos T CD8+ nos camundongos selvagens, o que não foi observada nos
camundongos knockouts. Silva-Monteiro e colaboradores (2007) investigaram o perfil do
timo frente a infecção pelo T. cruzi, nos backgrounds genéticos selvagens e Gal-3 KO de
ambas as linhagens de camundongos BALB/c e C57Black/6J identificando nos
camundongos selvagens uma atrofia tímica e uma alta taxa de morte nos timócitos, o que
não foi observado na infecção dos camundongos Gal-3 KO. Este perfil observado para os
camundongos selvagens durante a infecção foi relacionado com alta taxa de apoptose em
células T imaturas no timo e migração dessas células do timo para órgãos linfoides
periféricos, devido a interação com glicoproteínas de superfície celular e aumento na
expressão de Galectina-3 (SILVA-MONTEIRO et al., 2007).
Ademais, Cabral-Piccin e colaboradores (2016) demonstraram que a prevenção
de apoptose de células T no baço de camundongos BALB/C leva a uma reprogramação
na resposta imune com aumento de células T CD8+ e polarização de macrófagos M2 para
M1 (CABRAL-PICCIN et al., 2016). Levantando a hipótese de que a queda de células
CD8+ no 9º dia pós-infecção observada somente nos camundongos selvagens, pode ter
sido subvertida por uma reprogramação imune, que somada a menor taxa de apoptose no
órgão levou ao aumento da quantidade de células CD8+ ao invés da diminuição das
mesmas nos camundongos K.O.
Células NK atuam de forma significativa no controle parasitário frente a infecção
por T. cruzi (ANTUNÉZ & CARDOSO, 2004). As análises de células NK, NK CD8+ ou
65
NK CD4+ não revelaram diferenças significativas na comparação da porcentagem no baço
dos camundongos knockouts e selvagens. Porém, quando analisamos os dados do 9º dia
pós-infecção observamos que há uma tendência no aumento das células NK nos
camundongos knockouts para Galectina-3, o que não se observa nos selvagens. O controle
da resposta à infecção pelo T. cruzi está relacionado principalmente com as células NK,
que através de STAT-1 regulam a expressão de IFN-γ e IL-10 promovendo um balanço
de resposta Th1/Th2 (KULKARNI et al., 2015). A tendência ao aumento desse subtipo
celular observada nos camundongos knockouts pode ser um dos fatores que gera maior
controle da infecção e consequente menor parasitemia nos animais como observamos no
gráfico de parasitemia da figura 13.
Tratando-se das citocinas o IFN-γ é a que possui maior atuação no controle
parasitário durante a infecção pelo T. cruzi através da ativação de macrófagos específicos
que levam à destruição de parasitos pela produção de óxido nítrico e liberação de citocinas
pró-inflamatórias como TNF-α (McCABE et al., 1991; ABEL et al, 2001). Como já
citado, os macrófagos e células dendríticas compõem a primeira linha de defesa contra a
infecção, e ao serem infectados também secretam a citocina pró-inflamatória TNF-α,
cujas ações são autócrinas e parácrinas, potencializando a ativação e produção de óxido
nítrico pelos próprios macrófagos (MACHADO et al, 2012). O IFN-γ tem sua principal
produção pelas células NK que também são estimuladas por TNF-α, atuando de forma
indireta no controle parasitário dos macrófagos infectados com T. cruzi.
Logo, na presença de IFN-γ, os macrófagos são capazes de uma sinalização
autócrina para o combate parasitário através da liberação de TNF-α (SILVA et al., 1995;
GUTIERREZ et al, 2009). Sendo assim, os níveis mais altos de IFN-γ observados nos
animais selvagens demonstra a maior indução de resposta pró-inflamatória nestes animais
para o controle dos parasitas internalizados do que a resposta observada nos animais
knockouts.
O aumento de TNF-α observado no 9º dia pós-infecção pode ser devido a
parasitemia e consequente reinfecção de células e indução de inflamação em diversos
tecidos. Apesar de necessário para controle da parasitemia e ativação do perfil Th1 de
respostam inata, com altos níveis de IFN-γ e TNF-α têm sido associados a patogenia da
fase crônica da doença de Chagas (FIUZA et al., 2009).
Outra citocina que apresentou diferenças significativas entre os genótipos
avaliados foi IL-6, onde nossos dados demonstraram que no 15º dia pós-infecção a
concentração de IL-6 está significativamente mais alta no soro dos camundongos
66
knockouts. A literatura descreve que a Galectina-3 limita a secreção de IL-6 por
macrófagos e regula negativamente a quantidade e função de células Treg (BERNARDES
et al, 2006; FERRAZ et al, 2008; FERMINO et al, 2013). Corroborando com nossos
dados, Fermino e colaboradores (2016) reportam o aumento da expressão relativa do
RNAm de IL-6 após estímulo com LPS em células diferenciadas de medula óssea de
camundongos BALB/c Gal-3 KO quando comparado com a expressão relativa em células
provenientes dos camundongos selvagens.
Esta citocina ao interagir com seu receptor (IL-6R) promove uma cascata de
sinalização que ativa JNK (Janus Kinase) resultando na fosforilação do fator
transcricional STAT3 promovendo a migração do mesmo para núcleo e assim levando a
transcrição de genes alvos de IL-6 como outras citocinas que atuam na resposta
inflamatória e genes envolvidos na sinalização de NF-κB, defesa e citoproteção. Na fase
crônica da doença de Chagas a ativação da via de STAT3 por IL-6 confere aos
cardiomiócitos proteção em resposta ao meio inflamatório (PONCE et al., 2013). Logo,
apesar de IL-6 ser considerada exclusivamente pró-inflamatória na infecção pelo T. cruzi,
nossos dados sugerem que o aumento de IL-6 sérica pode estar promovendo citoproteção
aos camundongos knockouts e diminuição dos danos nos tecidos destes animais.
A citocina IL-2 é considerada uma citocina pró-inflamatória por funcionar como
um fator de crescimento para células T, possuir a capacidade de aumentar o potencial
citolítico de células citotóxicas e por promover a produção de imunoglobulinas por
células B (ROCHMAN, 2009). Apesar de seu papel indutor de proliferação e expansão
clonal de células T, a IL-2 em partes também modula a resposta tolerogênica através da
regulação de células Treg e indução de apoptose em células T pelo sequestro de IL-2 por
células Treg. A deficiência em IL-2 promove redução na população de células Treg, linfo-
proliferação e autoimunidade (FONTENOT et al, 2005; YAO et al, 2007).
Nossos dados demonstraram que IL-2 encontra-se significativamente em maior
concentração no soro dos animais knockouts que nos animais selvagens no 15º dia pós-
infecção. Gonzalez e colaboradores (2016) demonstraram o aumento da expressão
relativa do RNAm de IL-2 e seus níveis proteicos por imunohistoquímica no timo de
camundongos C57Black/6J no 17º dia pós-infecção com tripomastigotas da cepa
Tulahuen. O aumento de IL-2 pode então estar promovendo ausência de supressão de IL-
2 nos camundongos knockouts.
A citocina IL-10 é essencial na imunomodulação da resposta pró-inflamatória
mediada por TNF-α em tecidos de camundongos infectados diminuindo os danos que
67
poderiam ser causados por uma resposta pró-inflamatória exacerbada (HOLSCHER et al,
2000). Num trabalho publicado em 2013, Andrew W. Chung e colaboradores descrevem
a atuação da Galectina-3 na resposta imune inata, na indução da secreção de IL-10 e
principalmente na diminuição da diferenciação de monócitos e recrutamento de células
dendríticas (CHUNG et al., 2013). Porém, em nossos experimentos não houve diferença
significativa na concentração desta citocina no soro dos animais durante a infecção
quando comparamos os knockouts com os selvagens.
Outra citocina anti-inflamatória analisada foi IL-4 que no 15º dia pós-infecção
se apresentou aumentada nos camundongos knockouts. Esta citocina é um fator de
sobrevivência para células dendríticas e juntamente com GM-CSF induz a diferenciação
de progenitores de monócitos e células dendríticas (MAYORDOMO, 1997; THURNER,
1999). IL-4 é necessária para o desenvolvimento e função das células Thelper que são
células de perfil Th2, e atuam na troca de classe de imunoglobulinas (HOLGATE &
POLOSA, 2008). IL-2 e IL-4 são ambos necessários para a indução eficiente do perfil
Th2 de resposta, onde a produção de IL-2 leva à exposição de receptores de IL-4 (IL-4R)
aumentando a responsividade a IL-4 (ROCHMAN et al, 2010).
O que se observa é que aparentemente há uma desregulação no balanço da
regulação do perfil de resposta Th1/Th2 nos camundongos knockouts para Galectina-3,
onde pode-se observar a coexpressão de altos níveis de citocinas de ambos os perfis
Th1/Th2 no 15º dia pós-infecção. Essa coexpressão de citocinas pode estar atrelada
também com a maior sobrevida desses animais, onde mesmo com a expressão de citocinas
pró-inflamatórias, as altas concentrações de citocinas anti-inflamatórias como IL-2 e IL-
4 atuariam impedindo uma resposta inflamatória exacerbada ao longo da infecção,
diminuindo os danos ao próprio.
Apesar de não ser significativa a diferença na concentração sérica de IL-17 entre
os genótipos, pode-se observar que há um aumento considerável na concentração desta
citocina no soro dos camundongos de ambos os genótipos no 15º dia pós-infecção.
Experimentos in vivo e in vitro realizados com camundongos knockouts para IL-17
demostraram que esta citocina interage com ligantes de TLR, IL-1β e TNF promovendo
a indução na produção de metaloproteases e citocinas pró-inflamatórias, e essa indução
de citocinas leva a ativação de células e proteção contra infecções (BOARI et al, 2012;
XU, 2010). Mas sabe-se que esta citocina também possui papel essencial ou funções
auxiliadoras para formação de quadros patológicos no desenvolvimento doenças crônicas
(XU, 2010). Desta forma, seu aumento no 15º dia pode estar relacionado com o aumento
68
da quantidade de parasitos e sítios de infecção nos camundongos. Sendo mais um
mecanismo de suporte do hospedeiro na tentativa de controlar a carga parasitária.
Um outro viés do trabalho foi a obtenção de células da linhagem de monócitos
THP-1 superexpressando a proteína Galectina-3 íntegra e uma isoforma deletada do
domínio de reconhecimento de carboidratos, além da depleção de Galectina-3 por
interferência de RNA. A galectina-3 é uma proteína já descrita na literatura como atuante
na regulação do perfil da resposta imune TH1/TH2 frente outros tipos de infecção, como
fúngica por Paracoccidioides brasiliensis (RUAS et al., 2009) e parasitária por
Toxoplasma gondii (BERNARDES et al., 2006). Sabendo que macrófagos são tipos
celulares capazes de secretar galectina-3 e desta forma sinalizar de forma autócrina ou
parácrina para indução de diferenciação monocitária e produção de espécies reativas de
oxigênio (LIU et al., 1995; CHUNG et al., 2013), estudar a diferença de expressão e a
produção de isoformas mutadas da galectina-3 pode nos auxiliar a elucidar melhor o papel
da galectina-3 na regulação imune frente ao primeiro estímulo causado na infecção pelo
T. cruzi.
Dados do nosso grupo não demonstrados aqui já revelaram que há supressão da
produção de IL-6 e aumento de TNF-α por macrófagos peritoneais 24 horas após a
infecção em cultura. Essa supressão de IL-6 ocorre nos macrófagos provenientes dos
camundongos de ambos os genótipos, porém a produção de TNF-α se mostra em cultura
maior nos macrófagos provenientes dos camundongos gal-3 (-/-). A obtenção de células
de cultura que possuam diferentes fenótipos de expressão da galectina-3 vai nos facilitar
na avaliação do perfil monocitário de diferenciação e resposta, uma vez que manter essas
células em cultura é menos trabalhoso e a gama de possibilidades experimentais aumenta
quando não há necessidade de gerar animais para se obter grandes quantidades de células
o que implicaria em mais tempo e gasto.
Em resumo, acreditamos que a Galectina-3 atua no primeiro momento de
resposta à infecção pelo Trypanosoma cruzi através do controle de ativação dos
macrófagos, e continua regulando o perfil de resposta Th1/Th2 através da sua capacidade
de modular a interação parasito-hospedeiro, a proliferação, ativação, diferenciação e
apoptose de células imunes.
69
6. CONCLUSÕES
Macrófagos peritoneais coletados de camundongos C57Black/6J Gal-3 KO
apresentam uma menor viabilidade em cultura e uma menor adesão-invasão pelo
T. cruzi demonstrando a participação da Galectina-3 em vias pró-sobrevivência e
não só como PRR nos macrófagos.
A infecção pelo T. cruzi aumenta a expressão de Galectina-3 intracelular nos
macrófagos em cultura a partir de 4 horas pós-infecção e se mantém até pelo
menos 24 horas pós-infecção, com pico de expressão em 8 horas pós-infecção.
Na infecção com tripomastigotas sanguícolas da cepa Y, os camundongos
C57Black/6J selvagens apresentam maior parasitemia e mortalidade precoce
quando comparados com os camundongos C57Black/6J Gal-3 KO. Isso aparenta
estar mais relacionado com a susceptibilidade à infecção do que com o controle
imune inato propriamente dito.
Camundongos Gal-3 KO infectados com parasitos da cepa Y apresentam uma
desregulação no balanço dos perfis Th1/Th2 de resposta imune à infecção na fase
aguda, apresentando uma resposta mais tardia na produção das citocinas
analisadas quando comparados com os camundongos selvagens.
70
7. PERSPECTIVAS
Avaliar a taxa de diferenciação e o padrão infectivo de macrófagos diferenciados de
THP1 expressando as diferentes isoformas de gal-3 ou silenciada por shRNA através do
ensaio de brotamento, comparando os resultados entre as linhagens.
Analisar o padrão de resposta imune na fase crônica da infecção in vivo pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos C57Black/6J selvagem e knockout para galectina-
3.
Buscar associar os resultados obtidos com análises de imunohistoquímica do baço e
coração dos camundongos infectados para avaliar infiltrados inflamatórios, ninhos de
amastigotas, expressão de galectina-3 e lesão tecidual.
Fechar ao certo os resultados ex vivo, tentando entender a diminuição de imunidade.
71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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