Produo de Iogurte Microbiologia industrial - Dezembro 2013

Produo de IogurteCurso de Engenharia BiotecnolgicaNeste ensaio foi estudada o processo de produo de iogurte, em que se partiu de um iogurte comercial, mimosa natural, e a partir duma suspenso desse iogurte foi possvel contar, visualizar e isolar colonias de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus que foram inoculados em leite magro para proceder fermentao lctica e consequente produo de iogurte, fermentao essa que depende de uma simbiose entre esses dois organismos. Os diversos iogurtes produzidos pelos grupos de trabalho foram avaliados organolepticamente.

Abstract

Introduo

O iogurte (yogurt em turco) significa coagular, um laticnio cremoso e macio com alto teor de cido e feito atravs de duas culturas simbiticas: Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophillus que fermentam o leite. O iogurte um produto vivo e por isso seu prazo de validade relativamente curto, cerca de 30 dias e precisa ser guardado em uma temperatura entre 0C e 6C. Entre os principais componentes do sabor do iogurte observa-se o cido ltico, acetaldedo ou etanal (produto primrio do etanol e um dos responsveis pela ressaca) e o diacetil, um aromatizante qumico presente, por exemplo, nas manteigas. O acetaldedo o componente mais importante e mais abundante no iogurte. Pode-se produzir iogurte a partir do leite de bfalos,

vacas, cabras ou outros animais ruminantes. Porm utiliza-se mais leite de vaca para a fabricao de iogurte por ser um leite mais barato, j que uma vaca produz mais leite (cerca de 300 litros) num ciclo de lactao ou dez dias depois do parto e trinta dias antes da prxima gestao. Nos dez dias aps o parto o leite de vaca ainda est muito concentrado em hemoglobina (o leite fica amarelo e muito salgado) e por isso pode-se consumir apenas o leite aps esses dez primeiros dias. Depois de terminada a preparao do leite, ele recebe uma mistura simbitica de bactrias lcticas (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus) em torno de 2 a 3% do volume total de leite, ou seja, o crescimento de uma bactria estimula o da outra, tornando a fermentao mais rpida, j que, se apenas uma dessas bactrias atuasse, a fermentao levaria aproximadamente 8 a 12 horas, mas com a mistura ela demora de 2h 30min a 3h. Observe-se o esquema representativo dessa simbiose:

Fig. 1 - Esquema representativo da simbiose entre Streptococcus termophilus e Lactobacilus debrueckii subsp. Bulgaricus, adaptado de Priyanka Aswal et al., 2012O Streptococcus thermophilus cresce mais no inicio devido ao facto de preferir um pH prximo de 6.8, este produz cido lctico e pequenas quantidades de cido frmico que promove o crescimento do Lactobacillus delbrueckii Subsp. Bulgaricus que prefere pH proximo de 6.0. O Lactobacillus delbrueckii Subsp. Bulgaricus produz aminocidos que estimulam o crescimento do Streptococcus thermophilus. Observe o seguinte grfico:

Grafico 1- F: fator de multiplicao em funo de : tempo de fermentaoEssas duas bactrias fermentam o leite em uma temperatura controlada, prxima de 40C, por isso que o nome popular coalhada blgara. A fermentao ocorre em recipientes especficos, que no caso de iogurtes batidos so tanque e de iogurtes tradicionais so embalagens que sero incubadas. Durante a preparao do iogurte, as duas bactrias fermentam a lactose quando em anaerobiose conforme o modelo seguinte:Lactose + lactase glucose + galactose

gliclise+fermentaoglucose + galactose cido lctico + acetaldedo+ATP. (ver anexo 1 - fig. 5.1 para via metabolica completa quando em anaerobiose). Mas quando esto em aerobiose a fermentao mista e origina D-lactato e etanol. (ver anexo 1 fig.5.2 para via metabolica completa quando em aerobiose). possivel caracterizar trs gamas de pH: pH 6.7 para 6.0 em que a carga global negativa das micelas casenicas diminu reduzindo as repulsoes electrostaticas entre elas. De pH 6.0 para 5 a carga global negativa descresce abruptamente e a casena liberta-se das micelas. Quando o pH se torna 5 e se aproxima do ponto isoletrico da casena estas deixam de se repelir quase por completo e comeam a formar ligaes entre si, ligaes hidrofobicas e electrostaticas, formando complexos tridimensionais de aglomerados e cadeias de casena, coagulao A fermentao termina quando ocorre o coalho do leite, que faz com que esse adquira uma consistncia de gel, assim que atinge um pH prximo de 4,6. Esse ponto chamado de ponto isoeltrico, e nesse momento a proporo das duas bactrias de aproximadamente 1:1. Essa proporo pode variar, mas importante que a quantidade de Streptococcus thermophilus seja maior que a de Lactobacillus bulgaricus. A variao dessa proporo determina o sabor do iogurte, sendo que quanto mais prximo de 1:1, melhor a qualidade do iogurte. Depois de pronto, o iogurte atinge um pH prximo de 4,1, sendo que sua acidez se deve principalmente ao cido lctico, assim como a outros cidos orgnicos produzidos em pequenas quantidades por bactrias lcticas (cido ctrico, cido actico, cido frmico e cido succnico).. Aps a coagulao das protenas (principalmente da casena) no ponto isoeltrico, o iogurte arrefecido lentamente para uma temperatura entre dois e quatro graus Celsius atravs de gua ou ar refrigerado, evitando um choque trmico que prejudicaria a textura do mesmo. O arrefecimento necessrio, pois diminui a velocidade de crescimento das bactrias e impede a separao da gua. O iogurte mantido a uma temperatura de 2 a 4 graus Celsius. Apesar disso, a quantidade de bactrias aumenta durante cerca de uma semana. Dessa forma possvel produzir iogurte caseiro utilizando como fonte de bactrias os potes de iogurtes industriais com at uma semana de fabricao. Um pouco acima desta data acontece a fase de morte celular, portanto no haver bactrias em nmero suficiente para comear um novo processo de fermentao. Portanto, a partir do momento em que o nmero de bactrias atinge seu pico, quanto mais perto do prazo de validade o iogurte for consumido, menos benefcios iro trazer para o organismo. Tambm por esse motivo o prazo de validade dos iogurtes costuma ser curto. comum adicionar aromatizantes, polpas de fruta ou substncias doces aos iogurtes, aps o trmino da fermentao, j que muitas pessoas no gostam do sabor e da acidez do acetaldedo. A adio de tais produtos s pode ocorrer depois que o iogurte estiver completamente pronto, pois caso eles sejam adicionados antes, as bactrias consumiriam essas substncias no lugar da lactose e a fermentao do leite no se completaria. Aps a adio desses produtos, o iogurte pode ser conservado diretamente, sendo chamado de iogurte tradicional ou pode ser batido, sendo chamado de iogurte batido. Depois de pronto, a parte lctica no deve ser menor que 75%. Assim sendo podemos concluir que o processo de produo de iogurte apesar de ser algo simples de se reproduzir mesmo em ambiente caseiro, a actividade enzimatica que ocorre no seu interior variada e complexa. O iogurte consumido no mundo inteiro e possui numeros beneficios para a sade do ser humano como por exemplo: a induo da produo de imunoglobulinas, assimilao de substratos normalmente no assimilados pelo ser humano, actividade anti-tumural e sntese de cido flico. Pelo que o consumo de iogurte recomendavel pois como descrito possui inumeras vantagens.Mtodos

A experincia foi realizada de acordo com o protocolo, fornecido pela docente Elizabete M. Maurcio em que se realizou os seguintes estudos: Estudo da vitalidade dos microrganismos numa amostra de iogurte. Fez-se diluies do iogurte em gua peptonada a 1%. Inoculou-se 5 ml de cada diluio com 10 ml de meio diferencial LS(D) liquefeito pela tcnica da incorporao em placa. Verteu-se as placas e incubou-se a 43C durante 48 horas. Fabrico do iogurte Preparou-se um esfregao espalhando com uma ansa uma gota de iogurte homogeneizado em lmina desengordurada com lcool. Secagem ao ar. Fez-se o esfregao na lmina e fixou-se levemente chama at secar. Colorou-se pelo mtodo de GRAM e preparou-se 3 diluies de iogurte em gua peptonada a 1%. Fez-se o isolamento dos microrganismos pela tcnica do espalhamento superfcie. Inoculou-se 0,1 ml de cada diluio e inoculou-se no meio de cultura selectivo. O meio de cultura selectivo para o Lactobacillus bulgaricus o Meio MRS-Oxoid e para o Streptococcus thermophilus o meio Lac17Oxoid. As placas foram incubadas temperatura de 37C durante 48 horas com as de MRS colocadas ainda dentro de uma jarra de anaerobiose. Estudo da vitalidade dos microrganismos numa amostra de iogurte. Contou-se as colnias desenvolvidas no meio de cultura. Calculou-se o nmero de microrganismo por ml. Produo de iogurte Verificar o crescimento de dois tipos de colnias (observao macroscpica e microscpica- colorao de GRAM) Inoculou-se colnias puras em quatro tubos (dois para cada tipo de colnias) com meio de leite magro e incubou-se depois de selados a 40C 24 a 48 horas. Preparou-se o fermento de iogurte (inculo): Transferiu-se 2,5% (v/v) da cultura de S. thermophilus e 2,5% da cultura de L. bulgaricus para bales de Erlemeyer com leite esterilizado em autoclave a 100C durante 1 hora. Os bales foram incubados 4 horas a 45C e guardados durante a noite a 3C. Adicionou-se 5% (v/v) do fermento de iogurte preparado anteriormente a 20 ml de leite fresco esterilizado. A mistura agitada e o balo incubado durante 3 horas num banho a 45C. Guardar 24 horas a 3C.Resultados

Fig2 Resultados obtidos aps inoculao das sucessivas suspenses do iogurte nos respetivos meios, os meios marcados com um X foram utilizados para realizar a contagem das colonias.

No meio por incorporao era esperado visualizar-se culturas de ambas as espcies mas tal no sucedeu, no houve crescimento observado pelo que conclumos que a colocao do meio lquido para incorporao foi feita precocemente e a temperatura do meio ainda estava demasiado elevada e matou as bactrias. O nmero de colonias nas diluies de 10-2 e 10-4 tanto para o meio MRS como para o meio Lac17 era demasiado elevado, acima de 300 colonias, pelo que se considerou como incontveis. No meio de MRS com diluio 10-6 contou-se 12 colonias e no meio Lac17 10-6 contou-se 30 colonias. Utilizando uma regra de trs simples:N colonias contadas 0,1mL X 1gEm que 1g representa o peso inicial de iogurte para fazer as sucessivas diluies e 0,1mL o volume de suspeno inoculado em cada placa, obtendo-se portanto valores de UFC/g de: 1,2x108UFC/g para o meio de MRS e 3,0x108UFC/g no meio de Lac17. Isto permite concluir que tanto os Lactobacillus bulgaricus, existentes no meio MRS, como os Streptococcus thermophilus, existentes no meio Lac17, esto de acordo com as normas de qualidade para o iogurte em que afirmado que para ser considerado iogurte necessita de 108 UFC/g[3]. Aps a contagem das das UFC/g realizou-se a colorao GRAM de colonias provenientes de cada um dos meios.

Fig3- colonia de Lactobacillus bulgaricus retirada do meio MRS.

Fig4- colonia de Streptococcus thermophilus isolada do meio Lac17.

No meio de MRS encontrou-se tambem colonias de Streptococcus thermophilus, pelo que quando se procedeu inoculao de uma das colonias no leite e a posterior produo do iogurte resultou num iogurte aqueijado devido concentrao mais elevada de Streptococcus thermophilus do que de Lactobacillus bulgaricus. O acido responsvel pelo aroma e gosto aqueijado apresentado pelo iogurte o cido caproico, produzido pelo Streptococcus thermophilus[4]. Os diversos iogurtes produzidos pelos alunos foram avaliados pelas suas qualidades organolticas apresentando-se a seguinte tabela:

Tabela1- avaliao organoltica do grupo de trabalho em relao aos iogurtes produzidoscoraromatexturasabor

Abrancoacdicocremosocido

BbrancoQueijogranulosoqueijo

Cbrancoazedogranulosoazedo

DbrancoIogurtegranulososuave

Tabela2- avaliao degustativa dos grupos em relao aos iogurtes produzidos

12345total

A4 Gosto pouco5,25Gosto5,6Gosto6 Gosto6Gosto5,37 Gosto

B4Gosto pouco6,75GostoMuito3No gosto2No gosto1No gosto3,35No gosto

C3No gosto3No gosto2No gosto2No gosto2No gosto2,4No gosto

D6Gosto5,75Gosto10GostoMuito6Gosto5,75Gosto6,7Gostomuito

Grafico1- avaliao gustativa do grupo de trabalho em relao aos iogurtes produzidos

ConclusoCom este trabalho podemos concluir que se pode produzir iogurte utilizando como inoculo um outro iogurte produzido industrialmente, mimosa natural , no caso do nosso grupo de trabalho. O iogurte produzido pelo nosso grupo sofreu algumas alteraes pois no inicio da actividade laboratorial o isolamento das colonias de Lactobacilius bulgaricus no foi bem sucessdida, Isto resultou num inoculo com uma colonia pura de Streptococcus Termophillus a qual juntmos uma colonia no pura de Lactobacillus Bulgaricus com uma provvel mistura de Streptococcus Thermophillus, originando um inoculo inicial desequilibrado. Isto teve como consequencia, na obteno de um iogurte que sabia e cheirava mais a queijo, pois detinha mais Streptococcus Termophillus do que Lactobacillus Bulgaricus,

o que levou a que o Streptococcus Termophillus adaptasse vias metablicas alternativas originando cido caproico, composto que origina aroma e gosto a queijo, como o seu nome indica um acido tpico dos caprinos. Para alem disso no obtivemos um iogurte to solido como os dos outros grupo talvez, pelo facto de no ter sido possvel colocar o inoculo todo dentro do leite, ou pelo facto de precisar mais de tempo de fermentao visto que o inoculo no tinha a relao de 1:1 pretendida. Os restantes grupos conseguiram todos produzir os seus iogurtes a partir de iogurtes diferentes do utilizado pelo nosso grupo de trabalho, obtendo mais ou menos sucesso, sendo o favorito do iogurte D que foi elaborado a partir de um iogurte liquido, o sabor era suave e no acdico, e o menos aprecivel o iogurte C que tinha um gosto extremamente acdico e um aroma azedo, estes resultados devem-se s concentraes iniciais de cada uma das espcies e de possveis contaminaes ocorridas no processo de inoculao. Referncias[1]- Slides fornecidos pelo Docente da componente terica da cadeira de Microbiologia Industrial.[2]- YOGHURT: PREPARATION, CHARACTERISTICS AND RECENT ADVANCEMENTS, Priyanka Aswal et al., 2012[3]- NYA, Live and active culture yogurt seal program, Apendix A alnia 2, 2008[4]- Production of flavour compounds by yogurt starter culturesD Beshkova et al.,1998[5]- Formation and Physical Properties of Yogurt, W. J. Lee and J. A. Lucey,2010[6]- Metabolism and biochemical characteristics of yogurt bacteria. A review, A Zourari et al., 1991

Anexo - 1Produo de Iogurte Microbiologia industrial - Dezembro 2013

Anexo - 2