Mutageneza tulpinilor de drojdie pentru industria beri,
imbunatatirea proprietatatilor de fermentare a beriiMihalcea
Ioan*Universitatea Lucian Blaga, Facultatea de tiine Agricole,
Industrie Alimentar i Protecia Mediului, SibiuAbstract
O drojdie de bere modificata genetic cu capacitatea de a
fermenta zaharul a fost izolata prin mutatie din Sacharomices
pasteurianus, ce poarta o gena integrata de glucoamilaza si are
copie a genei de sinteza a enzimei acetolactat nefunctionala.Testul
fermentarii mustului confirma faptul ca proprietatea drojdiei
modificate genetic de a fermenta zaharul a fost mlut imbunatatita,
in timp ce performantele sale in industria berii au fost similare
cu cele ale unei tulpini de drojdie salbatica si ca trasaturile
caracteristice a perioadei scurte de marurare au fost
meninute.\Cuvinte cheie: maltotrioz, mutagenez, diacetil,
oligozaharide, bere, Saccharomyces pastorianus.Introducere
Drojdia de bere este de departe,cel mai important microorganism
domesticit care a fost exploatat pentru fabricarea buturilor
alcoolice. Importante procese biotehnologice mediate de specii de
Saccharomyces sunt bazate pe fermentarea hidrolizatelor de amidon,
dar drojdia de bere este n msur s utilizeze oligozaharidele i
maltotrioza coninute de mustul eficient, care contribuie la
ridicarea coninutului caloric n bere, i produce n timpul
metabolismului o enzima numita acetolactat, un produs intermediar,
de unde necesit o perioad mai de lung de maturare
Prin urmare, fermentarea eficient necesit utilizarea rapid i
complet a tuturor zaharurilor pentru scurtarea perioadei de
maturare.Recent, berea redusa din punct de vedere caloric a ctigat
popularitate pe piaa de bere in ntreaga lume
Nivelul dorit de calorii poate fi obinut fie prin reducerea
alcoolului prin distilarea concentratiei reale din bere sau prin
hidroliza dextrinelor superioare din must la zaharuri fermentabile
pentru a crete puterea lor de fermentare.Ultima metod cu reducere
minim a coninutului de alcool din produsul ambalat este cea
preferata. Diferite abordri genetice au fost adoptate cu scopul de
a reduce coninutul caloric ridicat din bere i scurtarea perioadei
de maturare.
Gene heterolog de amilaza sau glucoamilaza au fost introduse n
drojdie de bere de multi cercettori. De asemenea s-a dezvoltat o
tulpina de drojdie de bere, care are capacitatea de a utiliza
concentraii mari de oligozaharide i de a scurta perioada de
maturare a beri. Cu toate acestea, cteva studii au raportat
utilizarea eficient a maltotriozei cu ajutorul drojdiei de
bere.Maltotrioza este doilea cel mai abundent zahar aflat n mustul
de bere, dar nu este o surs preferata de carbon pentru celulele de
drojdie iar marea majoritate a tulpinilor de drojdie de bere
absoarbe att maltoza cat i maltotrioza numai dup epuizarea de
glucoz. n plus, rata de absorbie de maltotrioza de catre celulele
de drojdie de bere este mai lenta dect cea a maltozei iar
maltotrioza de foarte multe ori nu este complet consumat.
Aceast utilizare lenta i incomplet a maltotriozei genereaz un
coninut ridicat de carbohidrai i d un gust atipic produsului finit
de unde rezult o pierdere de venituri.
Prin urmare, proprietatea de fermentare a maltotriozei este o
caracteristic important pentru selectia tulpinilor de drojdie i
unul dintre factorii determinani pentru eficienta fermentari
mustului si calitatea produselor finite.n timp ce unii cercettori
au sugerat c inhibarea transportului maltotriozei in maltoz este
principalul motiv, altii spun ca nu exista un sistem de absorbie
separat al maltotriozei distinct de cel pentru maltoz existent in
Saccharomyces cerevisiae.
O analiz genetic molecular iniial a indicat faptul c o gen
desemnata AGT1, prezent n aproape toate tulpinile de drojdie de
bere, a fost responsabila pentru transportul de maltotrioza.
Mai trziu, s-a descoperit c o tulpina care a fost capabila de a
utiliza maltotrioza ca o surs unic de carbon, poseda gena AGT1 (9).
Aceast constatare indic faptul c exist un sistem de absorbie
specific maltotriozei fie ca aceast tulpin conine si un
transportator de maltotrioza, care nu a fost nc caracterizat.
Salema-Oom si alti (11) au izolat o gen care codific un nou
transportator de maltotrioz la o drojdie de bere de tip lager
numita Saccharomyces pastorianus, ntr-o ncercare de a identifica
genelecare sunt implicate n utilizarea maltotriozeiNeobijnuita gena
MTY 1, care face parte din familia de transport-glucozid are aciuni
de 90% i identitate de 54% cu genele MAL31 respectiv AGT1.
Prin construirea unei biblioteci, Dietvorst et al. (12) a
descoperit ca gena MTT1, care mparte 74% identitate cu MPH2 i MPH3,
62% identitate cu AGT1 i 91% de identitate cu MAL61 i MAL31, toate
cunoscute ca transportatoare de maltoz, partajeaz o identitate mai
mare (98%) cu gena de MTY1 a drojdiei Saccharomyces pastorianus
(11).
Astfel, de departe, rapoartele care se bazeaza pe principiul
utilizarii maltotriozei nu sunt conforme iar cauzele care s conduc
la consumarea incomplet sau ntrziat de maltotrioza n industria beri
bazate pe fermentare de amidon raman incerte.
Cu scopul de a facilita procesul de fermentare al mustului de
bere, am modificat o tulpina de drojdie de bere, care poart o gen
de glucoamilaza cu o singur copie nefuncional de sintaz de
acetolactat.
Proprieti de fermentare ale zaharului i caracteristicile de
fermentare ale beri din tulpina de drojdie de bere au fost
examinate.Materiale i metode
Tulpinile de drojdie i condiiile de cultur: drojdia de bere de
tip slbatic S. pastorianus Sc11, furnizat de ctre o fabric de bere
local (Guoren, SJZ, China) a fost folosit ca tulpin de control i S.
pastorianus ScG11, transformata celei Sc11, a fost folosit ca
tulpina de mutagenez de pornire. Mustul folosit n aceast lucrare a
avut o gravitate original 10.2 Plato ( P) (Un grad P corespunde la
1 g extract per 100 g de soluie lichid) i au fost furnizate de ctre
Guoren Beer Company Limited (Guoren, SJZ, China).Compoziia de zahr
a mustului de bere a fost dup cum urmeaz: maltoz (46,7 g / l),
maltotrioz (14,6 g / l), glucoz (8,3 g / l), i zaharuri
non-fermentabile, care sunt n principal oligozaharide (25,3 g / l).
Mediu complet sintetic, care conine0,67% drojdie pe baz de azot
(YNB, Difco, Detroit, MI, Statele Unite ale Americii) a fost
folosit pentru a scana mutanta i s se determine fermentabilitatea
maltotriozei mutant. Toate tulpinile au fost incubate la 30C i
meninute la temperatura de 4C.Prepararea culturii starter: cultura
nclinat a unei tulpini de drojdie a fost brzdat pe o plac de must
proaspt i incubat la 30C timp de 2 zile. O singur colonie a fost
transferat la 25 ml de fiertur YPD ntr-un flacon, cu capacul puin
strns, de 100 ml i incubate cu agitare (160 rpm) la 30C timp de 18
ore. Amestecul rezultat a fost numrat cu un hemocitometru i
utilizat ca cultur starter pentru alte experimente. Testul
fermentaiei maltotriozei: cultura starter a fost inoculate n YNB-2%
maltotrioz la un debit de 1,5 x 10 celule / ml, incubate cu agitare
(160 rpm) la 30C i se recoltat la intervale diferite de timp.
Concentraiile de maltotrioz din supernatantul culturii au fost
cuantificate utiliznd cromatografia lichid de nalt performan
(HPLC). Compui radioactivi reinui n interiorul celulelor de drojdie
au fost analizate prin metoda descris de Stambuk i colaboratorii.
Fiecare celul extras a fost fracionat prin cromatografie n strat
subire pe silicage,l 60 plci acoperite cu o faz mobil de ap acid
n-butanol-acetic (06:02: 1 [v / v]). Poziiile zaharurilor au fost
detectate prin autoradiografie cu soluii de maltotrioz etichetat
drept control.Testul de fabricare berii: cultura scale-up a fost
efectuat dupa cum urmeaz:100 ml de must a fost inoculat cu 10 l de
cultur starter i incubat cu agitare la 25C timp de 48 ore. Apoi,
900 ml de must proaspt a fost adugat la cultur i incubat la 20C
pentru o perioad suplimentar de 48 ore. n final, celulele de cultur
au fost recoltate prin centrifugare (4500 rpm timp de 10 min la 4
C) i inoculate n fermentator (B. Braun Biotech International,
Melsungen, Germania), la o vitez de aproximativ 1,5 x 10 celule /
ml. Principalele experimente de fermentare au fost efectuate la
12C, timp de 7 zile ntr-un fermentator de 5 litri cu volum de lucru
de 3 litri i proprietile drojdiilor au fost examinate. Fermentaie
la scar industrial a fost efectuate la o scar de 1000 kg cu un
raport scale-up de 5%, n funcie de tehnica companiei Guoren Beer
Company Limited. n aceast tehnic, fermentarea primar a mustului a
fost efectuat la 9C, timp de 7 zile i maturara la 13C pn ce
concenile diacetil au fost sub 0,100 mg / l. Astfel,
caracteristicile mediului de fermentaie au fost
determinate.Rezultate:
Capacitatea de fermentare maltotriozic a genei mutante: pentru a
examina capacitatea de utilizare maltotriozic a SGM11, cultura
starter de SGM11, a fost inoculat n fiertur maltotriozic YNB-2%, n
scopul de a efectua experimente de scuturare a flacoanelor. Proba
fermentat a fost colectat dup 5 zile i cantitatea de maltotrioz
rezidual a fost determinat, iar fermentabilitatea maltotriozei a
fost calculat. Rezultatele au artat c potenialul de fermentare
maltotriozic a SGM11 a fost cu mult mbuntit prin mutagenez,
comparativ cu cea aSC11 sau ScG11. Pentru a stabili dac mutageneza
UV a exercitat orice influen advers asupra caracteristicilor
mbuntite ale mutantei, mutanta a fost supus testelor cu glucoamilaz
i -acetolactat. Rezultatele au indicat c gena mutant i-a pstrat nc
capacitatea de a hidroliza oligozaharide i a redus perioada de
maturare a berii.Testul de fabricare a berii: pentru a examina daca
tulpina mutagen SGM11, a fost capabil s fermenteze mustul similar
tulpinii de tip slbatice SC11, a fost efectuat fermentarea primar a
mustului i a fost completat dup 7 zile. La intervale de o zi, au
fost luate probe aseptic, centrifugate, iar coninutul glucozei
reziduale, maltoza, maltotrioz, i oligozaharide din supernatant au
fost determinate. Rezultate au artat c dup 7 zile fermentaia
primar, cele trei tulpini de drojdie de bere, SGM11, ScG11, i SC11,
ar putea utiliza glucoza n ntregime. Capacitatea de fermentare a
oligozaharidelor a genei mutant SGM11 a fost similar cu cea din
tulpina de pornire ScG11 i mult mai bun dect cea a tulpinii de tip
slbatic SC11. Capacitatea de fermentare maltotriozic a SGM11 a fost
mbuntit ntr-o oarecare msur, comparativ cu cea a ScG11 sau SC11,
adic, a rmas mai puin maltotrioz n mustul de bere dup
fermentaie.Concluzii
Maltotrioza , ca si maltoza, trebuiesc (integrate/internalizate)
de tulpina de drojdie de bere in hidrolizate in molecule de glucoza
inainte ca ele sa fie catabolizate in glicoliza.Din moment ce
glicozidaza , aparent hidrolizeaza ambele zaharuri in acelasi ritm,
se suntine faptul ca sistemul de absorbtie distinct este
responsabil pentru comportamentul nedorit si fermentarea eficienta
a amaltotriozei este o proprietate de dorit a Sacharomyces pentru
industria beriiCu scopul de a rezolva problemele legate de consumul
incomplet de maltotrioza n producia de bere, aceast cercetare s-a
axat pe aplicarea comerciala. Un mutant SGM11 cu capacitate de
fermentare mai mare a maltotriozei a fost ecranata prin mutagenez
cu combinare UV i starea mediului de selecie de bere drojdie
transformant ScG11, care poarta gena glucoamylase cu o singur copie
a genei de sintaz non-funcionale acetolactate.
Capacitate de fermentare a maltotriozei a tulpinei modificate
genetic a fost majorata cu 40.5% n comparaie cu cea a tulpinei de
tipul slbatic, indicnd c tulpina a dobndit caracteristicile
eseniale. S. pastorianus este un microorganism foarte adaptat
pentru utilizarea eficient in fermentarea de zaharuri, urmatoarea
mutatie genetica pentru adaptarea de mediu specifica maltotriozei
poate conferi o capacitatea mai mare de fermentatie a maltotriozei.
Prin rularea TLC de analiz a substanei intracelulare a SGM11, s-a
observat c au avut loc unele schimbari in maltotrioza, care au
legatura cu calea metabolic, imbunatatind continutul intracellular
al maltotriozei.A fost dovedit faptul ca pasul rata limita in
metabolismul maltotriozei este transportul maltozei dincolo de
membrana plasmatica a celulei. Asadar este mult mai probabil ca un
nivel al expresiei elevat al transportorului existent sau un
transportor cu o afinitate mai ridicata pentru substratul maltozei,
mareste rata de metabolizare a maltotriozei. Analiza expresiei a
transportorului familiei de gene alfaglicozidice arata ca nivelul
expresiei AGT1 in tulpina SGM11 sau ScG11 si arata ca modificarile
a sistemului de expresi AGT1 a fost responsabil pentru expresi a
marita AGT1. In genele modificate genetic SGM11, AGT1 ar putea fi
induse de factori precum un activator transcriptional legat de un
potentiator specific localizat in amonte de secventa de codificare
AGT1, rezultand in cressterea transcriptului si expresia marita a
AGT2p.Rezultatele analizei cromatografice in strat subtire
ilustreaza ca cel mai probabil abundend exprimatele AGT1p in SGM11,
transporta mai multe celule de maltotrioza in celule, dar cauzeaza
un nivel ridicat da maltotrioza intracelulara. Utilizand gena
mutanta SGM11 in fermentarea mustului industrial, fermentarea
zaharului din must a fost marit cu 13,4% iar perioada de maturare a
berii a fost redusa de la 7 la 4 zile, continutul de arome in
mustul fermentat a fost retinut la un nivel acceptabil. Aditional
am aratat ca modificarile genetice cu UV nu au cauzat schimbari
glicolazei adaugate, si sintezei de gene acetolactice modificate si
ca stabilitatea generica a SGM11 a fost de 96% in conditii
neselective.Asadar aceasta tulpina ar trebui sa fie potrivita
pentru productia berii industriale si ar putea fi potential
utilizata in productie de bere cu calorii scazute si racoritoare
alcoolice. Pentru a intelege mai bine mecanismul detaliat al
maltotriozei eficient fermentata si potentialul comercializarii
acestei gene sunt necesare cercetari suplimentare.
Bibliografie
1. Gundlli Moses, S. B., Cordero Otero, R. R., La Grange, D. C.,
van Rensburg, P., and Pretorius, I. S.: Different genetic
backgrounds influence the secretory expression of the LKA1-encoded
Lipomyces kononenkoae -amylase in industrial strains of
Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett., 24, 651656 (2002).
2. Kang, N. Y., Park, J. N., Chin, J. E., Lee, H. B., and Im, S.
Y.: Construction of an amylolytic industrial strain of
Saccharomyces cerevisiae containing the Schwanniomyces occidentalis
-amylase gene. Biotechnol. Lett., 25, 18471851 (2003).
3. Marin, D., Jimnez, A., and Fernndez Lobato, M.: Construction
of an efficient amylolytic industrial yeast strain containing DNA
exclusively derived from yeast. FEMS Microbiol. Lett., 201, 249253
(2001).
4. Nieto, A., Prieto, J. A., and Sanz, P.: Stable high-copy
number integration of Aspergillus orizae -amylase cDNA in an
industrial bakers yeast strain. Biotechnol. Prog., 15,
459466(1999).
5. Liu, Z. R., Zhang, G. Y., Li, J., Yang, H., and Ju, G. Q.:
Stable expression of glucoamylase gene in industrial strain of
Saccharomyces pastorianus with less diacetyl produced. Ann.
Microbiol., 57, 233238 (2007).
6. Zheng, X., DAmore, T., Russell, I., and Stewart, G.G.:
Transport kinetics of maltotriosein strains of Saccharomyces. J.
Ind. Microbiol. Biotechnol., 13, 159166 (1994).
7. Zastrow, C. R., Hollatz, C., de Araujo, P. S., and Stambuk,
B.U.: Maltotriose fermentation by Saccharomyces cerevisiae. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol., 27, 3438 (2001).
8. Stambuk, B. U. and de Araujo, P. S.: Kinetics of active
-glucoside transport in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res.,
1, 7378 (2001).
9. Day, R. E., Rogers, P. J., Dawes, I.W., and Higgins, V. J.:
Molecular analysis of maltotriose transport and utilization by
Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 68, 53265335
(2002).
10. Jesperson, L., Cesar, L. B., Meaden, P.G., and Jakobsen, M.:
Multiple -glucoside transporter genes in brewers yeast. Appl.
Environ. Microbiol., 65, 450456 (1999).
11. Salema-Oom, M., Valado Pinto, V., Gon alves, P., and
Spencer-Martins, I.: Maltotriose utilization by industrial
Saccharomyces strains: characterization of a new member of the
-glucoside transporter family. Appl. Environ. Microbiol., 71,
50445049 (2005).
12. Dietvorst, J., Londesborough, J., and Steensma, H. Y.:
Maltotriose utilization in lager yeast strains: MTT1 encodes a
maltotriose transporter. Yeast, 22, 775788 (2005).
13. Liu, Z. R., Zhang, G. Y., and Liu, S.G.: Constructing an
amylolytic brewing yeast Saccharomyces pastorianus suitable for
accelerated brewing. J. Biosci. Bioeng., 98, 414419 (2002).
14. Stambuk, B. U., Panek, A. D., Crowe, J.H., Crowe, L.M., and
de Araujo, P. S.: Expression of high-affinity trehalose- H+ symport
in Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta, 1379, 118128
(1998).
