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IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
Laboratorio di Biologia Molecolare
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
DIAGNOSI PRENATALE • villi coriali
• liquido amniotico
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
94°C 1min 1 ciclo
94°C 20sec 28 cicli 62°C 7 min 72°C 10 min 1 ciclo
1) ESTRAZIONE E VALUTAZIONE DEL DNA
FASE ANALITICA
2) LONG-PCR (REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI)
%67
110 124 147 190 242 320 404 692
5%–%36%CTG 37%–%50%CTG 51%–%150%CTG
%1° STEP: Valutazione di alleli normali ed alleli patologici con un numero massimo di 150-170 [CTG]
3) GEL METHAPHOR 3.5% IN TBE1X
M
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
DM1
CLASSIFICAZIONE DELL’ ESPANSIONE
5-37 repeats (normale)
38-50 repeats (premutato)
50-150 repeats (paziente affetto)
150-1000 repeats (paziente affetto)
>1000 repeats (paziente gravemente affetto CDM)
4) SOUTHERN BLOTTING 1% AGAROSIO IN TBE1X
359 492 710 992
1164
%2° STEP: Valutazione alleli patologici con elevate espansioni e presenza di mosaicismo
>%151%CTG
<%150%CTG
M M cN N P P P
SONDA!SPECIFICA!!5’%DIG%[CTG]10%
cP
Forma Classica
Forma Mild
Range di normalità
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
genitore figlio
ANTICIPAZIONE
DM1
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
DM1
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
Cohort!of!113!pa5ents!
n°%(%)%% Age%(±DS)%
Men! !74!(65.5)! 45!(16)!
Women! 39!(34.5)! 40!(19)!
n°%(%)%
DM1Eposi5ve*! 20!(17.7)!
DM1/DM2Enega5ve*! 11!(9.7)!
DM1Enega5ve/DM2Eposi5ve*! 13!(11.5)!
*!From!a!previous!molecular!diagnosis!with!different!“homeEmade”!tests!
69!news!pa5ents!
Validazione del test genetico per la diagnosi della Distrofia Miotonica di tipo I DM1
!!!!!!!!Myotonic!Dystrophy!SB!kit!!
E SENSIBILITA’!E!SPECIFICITA’!E!ACCURATEZZA!
!E !NO!FALSIEPOSITIVI!E !NO!FALSIENEGATIVI!
>99%
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
DM1
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
valutazione e controllo di qualità esterna
GARANZIA%DI%QUALITA’%
DM1
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
Validazione e messa a punto del test genetico per la diagnosi della Distrofia Miotonica di tipo II
DM2
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
94°C 1min 1 ciclo
94°C 20sec 28 cicli 62°C 7 min 72°C 10 min 1 ciclo
1) ESTRAZIONE E VALUTAZIONE DEL DNA
FASE ANALITICA
2) LONG-PCR (REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI)
DM2
3) SOUTHERN BLOTTING 1% AGAROSIO IN TBE1X %2° STEP: Valutazione alleli patologici con elevate espansioni e presenza di mosaicismo
SONDA!SPECIFICA!!5’%DIG%[GGCA]6%
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
DM2
CLASSIFICAZIONE DELL’ ESPANSIONE
7-24 repeats (normale)
22-33 repeats (premutato)
75-11000 repeats (paziente affetto)
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
DM2 DM2 SB kit-FL
!E SENSIBILITA’!E!SPECIFICITA’!E!ACCURATEZZA!
!E !NO!FALSIEPOSITIVI!E !NO!FALSIENEGATIVI!
>99%
I DATI PRELIMINARI SUGGERISCONO CHE IL KIT Può RAPPRESENTARE UNA VALIDA ALTERNATIVA ALL’ATTUALE
TEST DIAGNOSTICO ! AUMENTARE LA CASISTICA
IRCCS%%Policlinico%San%Donato%
RINGRAZIAMENTI
Dr. G. Meola – U.O. Neurologia IRCCS Policlinico San Donato Dr.ssa E. Costa – Responsabile Servizio Medicina di Laboratorio Dr.ssa R. Valaperta – Laboratorio Biologia Molecolare Dr.ssa F. Schiavon - Experteam, Venezia