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IRCCS Policlinico San Donato Laboratorio di Biologia Molecolare IRCCS Policlinico San Donato DIAGNOSI PRENATALE villi coriali liquido amniotico

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IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

Laboratorio di Biologia Molecolare

IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

DIAGNOSI PRENATALE •  villi coriali

•  liquido amniotico

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IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

94°C 1min 1 ciclo

94°C 20sec 28 cicli 62°C 7 min 72°C 10 min 1 ciclo

1) ESTRAZIONE E VALUTAZIONE DEL DNA

FASE ANALITICA

2) LONG-PCR (REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI)

%67

110 124 147 190 242 320 404 692

5%–%36%CTG 37%–%50%CTG 51%–%150%CTG

%1° STEP: Valutazione di alleli normali ed alleli patologici con un numero massimo di 150-170 [CTG]

3) GEL METHAPHOR 3.5% IN TBE1X

M

IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

DM1

CLASSIFICAZIONE DELL’ ESPANSIONE

5-37 repeats (normale)

38-50 repeats (premutato)

50-150 repeats (paziente affetto)

150-1000 repeats (paziente affetto)

>1000 repeats (paziente gravemente affetto CDM)

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4) SOUTHERN BLOTTING 1% AGAROSIO IN TBE1X

359 492 710 992

1164

%2° STEP: Valutazione alleli patologici con elevate espansioni e presenza di mosaicismo

>%151%CTG

<%150%CTG

M M cN N P P P

SONDA!SPECIFICA!!5’%DIG%[CTG]10%

cP

Forma Classica

Forma Mild

Range di normalità

IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

genitore figlio

ANTICIPAZIONE

DM1

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DM1

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IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

Cohort!of!113!pa5ents!

n°%(%)%% Age%(±DS)%

Men! !74!(65.5)! 45!(16)!

Women! 39!(34.5)! 40!(19)!

n°%(%)%

DM1Eposi5ve*! 20!(17.7)!

DM1/DM2Enega5ve*! 11!(9.7)!

DM1Enega5ve/DM2Eposi5ve*! 13!(11.5)!

*!From!a!previous!molecular!diagnosis!with!different!“homeEmade”!tests!

69!news!pa5ents!

Validazione del test genetico per la diagnosi della Distrofia Miotonica di tipo I DM1

!!!!!!!!Myotonic!Dystrophy!SB!kit!!

E SENSIBILITA’!E!SPECIFICITA’!E!ACCURATEZZA!

!E !NO!FALSIEPOSITIVI!E !NO!FALSIENEGATIVI!

>99%

IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

DM1

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IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

valutazione e controllo di qualità esterna

GARANZIA%DI%QUALITA’%

DM1

IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

Validazione e messa a punto del test genetico per la diagnosi della Distrofia Miotonica di tipo II

DM2

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IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

94°C 1min 1 ciclo

94°C 20sec 28 cicli 62°C 7 min 72°C 10 min 1 ciclo

1) ESTRAZIONE E VALUTAZIONE DEL DNA

FASE ANALITICA

2) LONG-PCR (REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI)

DM2

3) SOUTHERN BLOTTING 1% AGAROSIO IN TBE1X %2° STEP: Valutazione alleli patologici con elevate espansioni e presenza di mosaicismo

SONDA!SPECIFICA!!5’%DIG%[GGCA]6%

IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

DM2

CLASSIFICAZIONE DELL’ ESPANSIONE

7-24 repeats (normale)

22-33 repeats (premutato)

75-11000 repeats (paziente affetto)

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IRCCS%%Policlinico%San%Donato%

DM2 DM2 SB kit-FL

!E SENSIBILITA’!E!SPECIFICITA’!E!ACCURATEZZA!

!E !NO!FALSIEPOSITIVI!E !NO!FALSIENEGATIVI!

>99%

I DATI PRELIMINARI SUGGERISCONO CHE IL KIT Può RAPPRESENTARE UNA VALIDA ALTERNATIVA ALL’ATTUALE

TEST DIAGNOSTICO ! AUMENTARE LA CASISTICA

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RINGRAZIAMENTI

Dr. G. Meola – U.O. Neurologia IRCCS Policlinico San Donato Dr.ssa E. Costa – Responsabile Servizio Medicina di Laboratorio Dr.ssa R. Valaperta – Laboratorio Biologia Molecolare Dr.ssa F. Schiavon - Experteam, Venezia