Nicola J. Winston, Orla McGuinness, Martin H. Johnson, Bernard Maro – 1995 rok, journal of

cell science

Irma Otrębska

Co wiemy do tej pory?Dojrzałe, owulowane oocyty zatrzymują się w II

metafazie dopóki nie zostaną aktywowane lub zapłodnione

Pociąga to za sobą serię oscylacyjnych zmian stężenia jonów wapnia

Wzrost stężenia wapnia powoduje inaktywacje MPF

Cyklina jest regulatorowym substratem MPF i jej destrukcja jest wymagana do wyjścia z metafazy

Do degradacji cykliny B niezbędna jest obecność nienaruszonego wrzeciona podziałowego, ponieważ w obecności nokodazolu poziom degradacji cykliny spada.

NokodazolDziała depolimeryzująco na mikrotubule komórekWejście w interfazę może być opóźnione jeżeli

oocyty zostaną zapłodnione w obecności nokodazolu

Wrzeciono podziałowe ulega degradacji, a chromosomy ulegają rozproszeniu

Usunięcie nokodazolu powoduje gromadzenie się wokół grup chromosomów skupisk mikrotubul

Każde powstałe wrzeciono kończy podział i odłączanych jest wiele ciałek kierunkowych

Oocyt przechodzi w interfazęW przypadku aktywacji, np. etanolem oocyty nie

kontynuują mejozy samoistnie

kontrola

1 minuta

3 minuty

6 minut

Materiały i metody od sześcio- do dziesięcio- tygodniowe samiceDootrzewna iniekcja PMSG 48h przed sekcjąhCG 13 godzin przed sekcją Komórki pęcherzykowe usunięte przez

hialuronidazęOsłonki przejrzyste usunięte przez Tyrode Hodowane in vitro w pożywce M2+BSA

Barwienia immunocytochemiczneBadanie aktywności kinazy histonu H1Badanie poziomu wapnia wewnątrz komórki

fura-2 (barwnik fluoroscencyjny wiążący się w wolnymi jonami wapnia)

Aktywacja etanolemOocyty były hodowane jeszcze przez 5 godzin

po izolacji, a potem podzielone na 6 grup

Brak aktywacji w grupie kontrolnej i u tych oocytów które wcześniej były poddane działaniu nokodazolu

O połowę zmalał poziom aktywacji między aktywowanych etanolem, a etanolem z dodatkiem nokodazolu

kontrola

Po 60 minutach

Oocyty pozostawiono w M2+BSA na godzinę i znowu poddano aktywacji

Zaobserwowano drugie uwolnienie wapniaOocyty zostały aktywowane i wyrzuciły II

ciałka kierunkowe, co zostało potwierdzone po wybarwieniu preparatów (oocyty były w telofazie)

Kinaza odpowiadająca za kondensację chromatyny

Wysoka aktywność w nieaktywnych oocytach

Spada gwałtownie po aktywacji

Oocyty po inkubacji z nokodazolem nie wykazują spadku aktywności

Po godzinnej inkubacji w zwykłej pożywce, i po kolejnej aktywacji etanolem, aktywność kinazy spada

Aktywność kinazy histonu H1

Zapłodnienie w obecności nokodazolu Oocyty w obecności

nokodazolu uległy zapłodnieniu, ale nie opuściły metafazy jeśli ich nie przeniesiono do czystej pożywki

Wtedy Wyrzucają liczne ciałka

kierunkowe i tworzą przedjądrza

Wrzeciona odtwarzane są w przeciągu godziny

Poziom wapnia zmienia się w oocycie zapłodnionym w obecności nokodazolu w bardzo podobny sposób jak w kontroli bez nokodazolu.

Oocyt nie zapłodniony

Oocyt nie zapłodniony inkubowany z nokodazolem a potem przeniesione do zwykłej pożywki

Zapłodniony oocyt

Oocyt zapłodniony w pożywce z nokodazolem i przeniesiony do czystej pożywki

Zablokowanie wzrostu stężenia wolnych jonów wapniaOocyty zostały podzielone na dwie grupy1- przeniesione bezpośrednio po zapłodnieniu do

pożywki zawierającej BAPTA-AM (bufor zapobiegający zmianom stężenia wapnia)

2- najpierw przeniesione do pożywki z nokodazolem, bez wapnia (by wyczerpać wewnątrzkomórkowe zasoby tego pierwiastka). Potem do pożywki bez wapnia.

1Tylko dwa z 249 wyszły z metafazy po 6 godzinach

inkubacjiOocyty znakowane fura pokazały że po przeniesieniu do

BAPTA poziom wapnia przestał się zmieniać Chromosomy we wszystkich oocytach były podzielone

na grupy i skondensowaneKażda grupa zgromadziła wokół siebie mikrotubule, ale

nie uformowało się prawidłowe wrzeciono

Ten sam eksperyment powtórzono z dodatkiem cytochalazyny D podczas inseminacji (zapobiega rozejściu się chromosomów)

Powstało wrzeciono podziałowe ale w lekko nieprawidłowym kształcie

Tylko 1% oocytów wyszło z metafazy na 186 w porównaniu z kontrolą 51/196 (26%)

+BAPTA +cytochalazyna D

2Grupa znajdująca się w pożywce bez wapniaPo godzinie część oocytów została przeniesiona z

powrotem do zwykłej pożywki29% po pięciu godzinach inkubacji przeszło do

interfazyW oocytach zatrzymanych w II metafazie powstały

3,4 skupiska chromosomów każde z własnym wrzecionem podziałowym

Oocyty zatrzymane w metafazie II

Oocyty które wyszły z metafazy

Znakowanie furaPrzeniesienie

oocytów z powrotem do pożywki z wapniem spowodowało powrót zmian stężenia wapnia (8/10)

Dwa z nich wyrzuciły drugie ciałka kierunkowe

WnioskiOocyty inseminowane w obecności nokodazolu, czyli takie

które nie utworzyły wrzeciona podziałowego, nie wychodzą z metafazy II

Nie wytwarzanie wrzeciona nie działa hamująco na zmiany stężenia wapnia

Usunięcie z nokodazolu powoduje możliwość wznowienia cyklu mejotycznego

W oocytach inseminowanych cały czas po przeniesieniu trwają zmiany stężenia wapnia i nie potrzebują żadnego dodatkowego bodźca do przejścia do interfazy

Oocyty wcześniej aktywowane etanolem, żeby kontynuować podział, muszą być aktywowane jeszcze raz

Przy braku wapnia i usunięciu nokodazolu, wrzeciona podziałowe zostały odnowione, ale mejoza nie była kontynuowana

Po przeniesieniu do pożywki z wapniem oocyty przechodzą do mejozy

Wnioski 2Do wyjścia z metafazy wymagana jest degradacja

cykliny i dezaktywację MPFDegradacja cykliny B wymaga obecności wrzeciona

i jest kontynuowana podczas trwania metafazy II na podobnym poziomie, i jest rekompensowana jednoczesną syntezą

Wapń nie rozpoczyna degradacji cykliny, a raczej podnosi jej poziom

Inseminowane oocyty „ pamiętają o aktywacji” . Cały czas obserwowane są skoki stężenia wapnia

Aktywacja mechanizmu degradacji cykliny zachodzi tylko podczas podwyższonego stężenia wapnia

Dziękuje za uwagę!