ISAIAS LANS VARGAS

Estudio teórico-experimental del mecanismo de transferencia de hidruro entre

Ferredoxina-NADP reductasa (FNR) de Anabaena y NADP+

ISAIAS LANS VARGAS

Application of Ensemble-Average Transition State Theory with Multidimensional Tunneling to the Study of Hydride Transfer between Anabaena Tyr303Ser FNR and

NADP+/H

Isaias Lans, José Ramón Peregrina y Milagros Medina

José M. Lluch, Mireia Garcia-Viloca and Àngels Gonzàlez-LafontDepartament de Química y Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Barcelona), España.

Citosol

Lumen tilacoidal

La Cianobacteria Anabaena PCC 7119

FNR2Fldox + NADPH2Fldrd + NADP+ + H+

Mecanismo de transferencia de hidruro

N

N

N-

NH

O

O

C

CHO

C

C

CH2

HO

HO

H

H

H

O

P

O

P

O

O

-O

-O O CH2O

HO OH

N

N

N

N

NH2

N+

NH2

O

O

OHHOPO2

-

O

PO2-

CH2O

HO OPO2H-

N

N

N N

NH2

1 2

34aC

O

4

10a

5

10

5a

9a

6

98

7

1' HH

H H 12

34

5

6

7

5'

H

HN5

FADH- NADP+

Se propone la transferencia neta de hidruro desde el átomo N5 del anillo de Flavina hacia el átomo C4 del anillo de Nicotinamida

C-I C-II C-III Y303

S

C-III* ¿Tyr303?

?

Y303

Hermoso et al. J. Mol. Biol. 319, 1133-1142 (2002) Nogués et al. Biochemistry 44, 11730-11740 (2005).Bortolotti et al. Biochem. Biophys. Acta-Proteins and Proteomics 1794, 199-210 (2009)

C4

N5

H-

La transferencia de hidruro entre FNRhq y NADP+

Obtener un conocimiento más amplio del mecanismo de transferencia de hidruro al NADP+ catalizado por la FNR (Tyr303Ser). Lo cual podría dar una indicación del papel de la Tyr303 en la FNR nativa

Objetivos

Por medio de un estudio teórico-experimental

Estudio Experimental

Determinar las constantes cinéticas del proceso de transferencia de

hidruro y efecto isotópico

Estudio Teórico

Obtener detalles estructurales del proceso de transferencia de hidruro en

FNR (Tyr303Ser)

Determinar las constantes de reacción y efecto isotópico

del proceso de transferencia de hidruro en FNR

(Tyr303Ser)

Resultados Experimentales

FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH

kB C

[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]

Tiempo muerto

CTC-2 CTC-1

WT FNR

kHT

kHT-1

Tiempo muerto


kB C

[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]CTC-2 CTC-1

Tyr303Ser FNR

kHT

Tiempo muerto

Tiempo muerto

El equilibrio es desplazado hacia la producción de NADPH

El remplazo de Tyr303 por Ser elimina la capacidad de reducción de NADP+

Lans et al. J. Phys. Chem. B. 114, 3368-3379 (2010)

La Disposición estructural entre la flavina y la nicotinamida en el mutante parece ser adecuada para que se de la

transferencia de hidruro en ambas direcciones

Anabaena Tyr303Ser FNR:NADP+ complex 2BSA

Dinámica molecular

Términos de Campos de Fuerza más comunes:

QMH-

Métodos mecánico-cuánticos (QM)-Pueden tratar reacciones químicas-No pueden tratar sistemas muy grandes

Métodos de mecánica molecular (MM)-No pueden tratar reacciones químicas-Pueden tratar sistemas muy grandes

QM/MM

Parte del sistema más involucrada en

la reacción

Resto del sistemaParte más alejada del

sitio de reacción

Programas Usados

CHARMM GAUSSIANCHARMMRATE

A B

FAD

Y303

NADP+

NADP+

FAD

FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)

Estructura cristalográfica de FNR

Dinámica Molecular QM/MM del complejo Y303S FNR:NADP+

QM H-

N

N

N-

NH

O

O

C

CHO

C

C

CH2

HO

HO

H

H

H

O

P

O

P

O

O

-O

-O O CH2O

HO OH

N

N

N

N

NH2

N+

NH2

O

O

OHHOPO2

-

O

PO2-

CH2O

HO OPO2H-

N

N

N N

NH2

1 2

34aC

O

4

10a

5

10

5a

9a

6

98

7

1' HH

H H 12

34

5

6

7

5'

H

HN5

FADH- NADP+

Centro de reacción en la FNRModelo del Sistema Biológico Coordenadas Cartesianas de PDB 2BSA.

Estado de protonación: PROPKA. Adición de átomos de H:HBUILD/CHARMM.Neutralización con 7 Na+

Solvatación TPI3PTotal número de átomos: 41896(4800 átomos de proteína)

Equilibrado Campo de fuerza CHARMM22 Dinámica Molecular NPT (270 K, 1 atm) Condiciones de límite periódico Particle Mesh Ewald method.

58 átomos QM; 2 Átomos frontera (GHO); 41838 Átomos MM

RD RA

Coordenada de reacción (z) = RD- RA

Definición de la coordenada de reacción

Potencial de Fuerza Media (PMF)

Muestreo sesgado: umbrella samplingSe Obliga al sistema a explorar zonas de alta energía

V´(x) = V(x ) + W(x) Wi(x) = 1/2k(x - xo)2

Para la eliminación del sesgo se hace uso del método WHAM

Wi

x

Nº

Con

form

acio

nes

))(ln()( xPTkxW B

-2 -1 0 1-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

PM

F(k

cal/m

ol)

z(Å)

Proceso endoérgico, con barrera de energía potencial de ~35 kcal/mol

Potencial de fuerza media (AM1)

R (CTC-2)P (CTC-1)

TS

Evaluación del método QM usado

AM1 describe mal la contribución de la energía de dispersión al apilamiento y favorece la formación de puentes de hidrógeno

Usando el nivel MPWB1K/6-31+G(d,p) la lumiflavina y 1-metilnicotinamida presentan interacción de apilamiento.

MPWB1K/6-31+G(d,p) describe mejor las interacciones de apilamiento que B3LYP (6 kcal/mol de diferencia en energía de formación del complejo)

AM1

MPWB1K/631g(d,p)

PES de Y303SFNR:NADP

Corrección a doble nivel del PMF

RPAM

AMcQM

RPAM

KMPWBcQM

CMAMCMDL zVzVzWzW 11

111

AM1 MPWB1K/631g(d,p) Corrección a doble nivel

FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH

FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH

NT FNR

Y303S FNR

AM1

•La corrección de energía con MPWB1K cambia la endoergicidad de la reacción

•La localización del estado de transición se desplaza levemente hacia los productos.

34.9 kcal/mol 35.8 kcal/mol

3.6 kcal/mol

14.9 kcal/mol

R (CTC-2)P (CTC-1)

TS

R (CTC-2) P (CTC-1)


Interacción del centro de reacción con la proteína

Variación del ángulo entre los anillos de flavina y nicotinamida en la reacción

•El ángulo N5 – hidruro – C4N se aproxima a 180º y el átomo aceptor y donador se aproximan entre sí.

• Deformación del par iónico FNRrd-NADP+, y pérdida parcial de la interacción de apilamiento π

•La penalización energética incrementa el costo energético del estado de transición

β=120º β=170º

α = 10º

HH

α = 60º

N5 C4

HH

N5 C4

TSR (CTC-2)

R (CTC-2)

P (CTC-1)TS


+-

CMFTRR

CMCMCMact GzWzWzG ,,

zWzWzW vibCMQC

RvibCM

FTRRCMQCQC

act WGzWzWzG ,,,

Corrección vibracional

-2 -1 0 1-5

0

5

10

15

20

25

30

35

PM

F(k

cal/

mo

l)

z(Å)

PMF H/DVi (s)Para cada configuración i.

Coordenada de reacción z

R SP PZ1

Z2

Aproximación a zona secundaria estática(Frozen Bath)

Coeficiente de transmisión neto promedio γ

Por cada configuración de estado de transición vibracional Por cada configuración de estado de transición vibracional i i a a zz**

QCQC::

1) AM1/CHARMM22 SP localización 2) AM1/CHARMM22 MEP3) Corrección a doble nivel del MEP (interpolación usando ISPE).4) Factor de transmisión Quasiclásico Γi5) Coeficiente de transmisión Semiclásico κi

Coeficiente de Transmisión

Coeficiente de Transmisión:

/

/

E kT

E kT

P E e dET

e dE

0

≠TE

2

1

1 EP E

e

P(E) : permeabilidad (o probabilidad de transmisión):

)exp( */

RT

zG

h

TkTk

QCQCactBMTVTSTEA

T T T

2

1

2/12/1

])([)2(

s

s

Ga dsEsVE

8 estructuras optimizadas

-2 -1 0 1-5

0

5

10

15

20

25

30

35

PM

F(k

cal/

mo

l)

z(Å)

R

P

TS

Cálculo del Coeficiente de Transmisión: γ

T T T

i(T) = exp{-Gi}

PMF

Vi (s)Para cada configuración i.

Coordenada de reacción z

Gi

tunel

I(T)

)exp( */

RT

zG

h

TkTk

QCQCactBMTVTSTEA

Cálculo de la constante de reacción



kB C


Tyr303Ser FNR

kHT

Tiempo muerto

Tiempo muertokHT-1

Comparación Teórico Experimental

Parámetro Teórico Experimental

kHT (279k) 92.8 s-1 190 s-1

kDT (279 K) 3.5 s-1 16.3 s-1

KIE 26.3 11.6

AH/AD12.5



kB C


Tyr303Ser FNR

kHT

Tiempo muerto

Tiempo muertokHT-1

• La transferencia de hidruro en la dirección fisiológica desde Tyr303Ser FNRrd hacia NADP+ no es posible. Sin embargo, la reacción inversa, la transferencia de hidruro de NADPH hacia Tyr303Ser FNRox, ocurre.

• Las constantes de reacción teórica y experimental están en concordancia.

• En la zona de reactivos la distancia N5-C4N es compatible con la transferencia de hidruro, pero el ángulo entre los átomos N5-hidruro-C4N no es colineal, y por lo tanto, la transferencia de hidruro es ineficiente.

• La transferencia de hidruro involucra una importante cantidad de efecto Túnel.

• Las deformaciones geométricas que incluyen pérdida parcial de interacción de apilamiento π involucran una gran penalización de energía libre para poder alcanzar el estado de transición.

Conclusiones

WT FNR

Posible papel de Tyr303 en WT FNR

Cualquier factor capaz de romper la interacción de apilamiento entre el par iónico FADH-:NADP+ podría desestabilizar los reactivos, incrementando la constante de reacción.

α = 10º

HH

α = 60º

N5 C4

HH

N5 C4

AGRADECIMIENTOSGrupo de Biología Estructural

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular

Universidad de Zaragoza

Prof. Dra. Milagros Medina Prof. Dr. Carlos Gómez-Moreno Dra. Marta Martínez Dra. Patricia FerreiraDra. Susana Frago José Ramón Peregrina Guillermina Goñi Ana Serrano Beatriz Herguedas Ana Sánchez Raquel Villanueva

Departament de Química

Institut de Biotecnologia i de Biomedicina,

Universitat Autònoma de Barcelona, Dr. José M. Lluch, Dra. Mireia Garcia-VilocaDra. Àngels Gonzàlez-Lafont

Grupo de interacción proteína- proteína y transferencia de electrones (UZ)

Gracias por su atención

Corrección Vibracional

-4 -2 0 2

-4

-2

0

2

B

A

B Gauss Fit of B

-4 -2 0 2-3

-2

-1

0

1

C

A

C Gauss Fit of C

Corrección vibracional H Corrección vibracional D

Ajuste a una curva gaussiana

z

E(k

cal/m

ol)

z

A B

FAD

Y303

NADP+

NADP+

FAD

E3E2E1

Hipótesis del mecanismo de reconocimiento del NADP+ en la FNR

FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)

Simulación NT FNR:NADP

sims

sims

N

jBjbiasjj

N

iii

TkxwFn

xPxnxP

1,

1

'

/]exp([

)()(

Weighted Histogra Analysis Method (WHAM)

dx)(exexp /)(/xPp TkxwTkF

Bibi

))(ln()( xPTkxW B

Modelo de partida para la simulación del complejo NT FNR:NADP+.

Equilibrado del Modelo

Dinámica Molecular con la restricción del movimiento de la Arg 264

Dinámica Molecular con restricción del movimiento de FADH- y NAD+

Simulación del complejo FNR:NADP+

R264

Fluctuación de residuos de FNR durante la dinámica molecular

PES partiendo del modelo de WT

Plantilla Y303SER

24kcal/mol

Z(Å)

V(k

cal/m

ol)

N1-C4N

N10 N1N

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

B

A

W(k

cal/m

ol)

Z(Å)

Corrección a doble nivel del PMF WT

-2 -1 0 1 2-50

-40

-30

-20

-10

0

10

Z(Å)

V(k

cal/m

ol)

pKa Glu301: 5.11 pKa Glu301: 8.04

PES con Glu301 protonado

-3 -2 -1 0 1 2 3-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

-3 -2 -1 0 1 2 3

V(k

ca

l/m

ol)

Z(Å)

75kcal/mol

PES partiendo de reubicación de TYR

-3 -2 -1 0 1 2 3-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

V(k

cal/

mo

l)

Z(Å)

35kcal/mol

Modelos de FNR WT obtenidos con el servidor Geno3D

Plantilla: estructura de FNR PDB (1qga)

-3 -2 -1 0 1 2

0

10

20

30

40

50

V(k

cal/

mo

l)

Z(Å)

PES partiendo de un modelo obtenido usando el servidor Geno3D

Plantilla: estructura de FNR de guisante

25kcal/mol

N

N

N

NH

R

O

O

N

N

N

NH

R

O

O

N

N

N

NH

R

O

O

-

+*

-

H H

e- + H+ e-

2

3

1

44a

10a

5

109a5a6

987

QN NEUTRA SQ NEUTRA HQ ANIÓNICA

Puntos a tener en cuenta para la simulación de la FNR WT

Glu301Ser80

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