isolamento anaerobios

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Text of isolamento anaerobios

  • UNIVERSIDADE DE SO PAULOINSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICASDEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

    LABORATRIO DE ANAERBIOS

    MTODOS DE ISOLAMENTO E

    IDENTIFICAO DE BACTRIAS

    ANAERBIAS

    Prof. Dr. Mario Julio Avila-CamposHomepage: www.icb.usp.br/bmm/mariojacp g p j

  • ISOLAMENTO DE ANAERBIOS

    9 Para que isolar anaerbios?

    - Conhecer os diferentes tipos microbianos

    - Informao microbiolgica completa e g prpida

    - Identificao dos organismosIdentificao dos organismos

    - Susceptibilidade a antimicrobianos

  • Isolamento de Anaerbios - Espcimes a serem pesquisados

    - Leses associadas ao trato gastrointestinal ou genitalfeminino.- Septicemia.- Infeces crnicas do trato respiratrio superior(sinusites, otite mdia).- Leso supurativa do trato respiratrio inferior(pneumonia)(pneumonia).- Meningites associadas com infeces crnicas do tratorespiratrio superior (fluido crebro-espinal)respiratrio superior (fluido crebro espinal).- Abscessos superficiais e profundos (cerebral).- Infeces dentaisInfeces dentais.- Leses por queimaduras e mordidas.

  • DIFICULDADES NO ESTUDO DA MICROBIOTA ANAERBIA

    9 Tcnicas de coleta, transporte e processamento9 Volume do espcime

    9 Diluente e homogeneizao do espcime9 Diluente e homogeneizao do espcime

    9 Meios seletivos e no seletivos, suplementados

    9 Microbiota associada mucosa

    9 Variaes da dieta, e variao dia a dia da amostragem

    9 Interferncia de Antimicrobianos9 Interferncia de Antimicrobianos.

  • Indcios clnicos de infeco por anaerbios

    Secreo de odor ptrido Infeco na proximidade de mucosa de revestimento. Tecido necrtico, gangrena, formao de pseudomembrana. Gs nos tecidos ou na secreo.

    Endocardites com hemocultura negativo.

    Infeces devidas ao uso de aminoglicosdeos

    Quadro de bacteremia com ictercia.

    Infeces aps mordidas humanas ou animais Infeces aps mordidas humanas ou animais.

    Secreo escura e fluorescentes na UV

    Condies clnicas tais como aborto sptico, infeco aps cirurgia gastro-intestinal, etc.

  • Indcios bacteriolgicos de infeco por anaerbios

    Morfologia singular na colorao de Gram

    Nenhum crescimento em cultura rotineira

    Vestgio de crescimento em aerobiose Vestgio de crescimento em aerobiose

    Crescimento em 100 g/ml de canamicina ou Crescimento em 100 g/ml de canamicina ouneomicina, ou 7,5 g/ml de vancomicina.

    C / Cultura com produo de gs e/ou odor ptrido

    Colnias fluorescentes sob UV (P. melaninogenica, F. Colnias fluorescentes sob UV (P. melaninogenica, F.nucleatum

  • MTODOS DE COLETAS E

    TRANSPORTE DE

    ESPCIMES CLNICOSESPCIMES CLNICOS

  • sondagem

    coletacoleta

    Coleta em ces com d i d t ldoena periodontal

  • Coleta de leso periodontalperiodontal

  • Coleta de polpa necrtica e tecido

    periimplantar.

  • Espcime clnico do duodeno

    Espcimes de ala intestinalp

  • Mini-jarra (Tcnica do bombril com CuSO4)Mini jarra (Tcnica do bombril com CuSO4)

  • Soluo Ringer-PRAS

    Meio VMGA III

  • Coleta e transporte de espcimes clnicosespcimes clnicos

  • MTODOS DE OBTENO DE ANAEROBIOSE

    1. SUBSTNCIAS REDUTORAS- Placas de Brewer- Placas de Brewer- Jarras com catalizadores de H2 - Paladium (Gaspak)- Absoro pelo PirogalolAbsoro pelo Pirogalol

    2. CONSUMO BIOLGICO DO OXIGNIO LIVRE- Tcnica de Fortner

    3. PROCESSO MECNICO DE MISTURA DE GASES3. PROCESSO MECNICO DE MISTURA DE GASES

    - 90% N2 + 10% CO2; 5% H2 + 85% N2 + 10% CO2

    4. ESTUFAS E CMARAS DE ANAEROBIOSE

  • Processo mecnico de

    bt dobteno de anaerobiose por mistura gasosa g

    (90% N2 /10% CO2)

  • Jarra de Anaerobiose

  • Cmara de Anaerobiose

  • Isolamento eIsolamento e Identificao

  • Esquema de isolamento e identificao

    E i GEspcime Gram

    Diluies

    ISOL

    Meio seletivo No

    seletivo

    TioglicolatoLAME

    Colnia caractersticaAnaerobiose

    GramMeio no

    NTO

    Cultura puraseletivo

    Teste respiratrio GramCA Teste respiratrio Gram

    EstocagemTestes presuntivos

    RACT

    Testes definitivosBioqumica

    Imunolgicos Susceptibilidade a antimicrobianos

    Biologia molecular: sondas, PCR...Cromatografia gasosa

    ERI.

  • Isolamento e meios de cultivo

    Prevotella Fusobacterium BacteroidesPorphyromonas

    Meios Meios seletivos

    gar sangue com canamicina Omata-Disraely

    BBE

    Perodo de incubao 7-14 dias 3-5 dias

    3-5 dias

    Tempo de exposio 1 hora 3 horas 72 horas

    ao ambiente

  • Identificao Bacteriana Presuntiva

    Prevotella

    PorphyromonasFusobacterium Bacteroides

    Porphyromonas

    Gram

    Fl i

    Gram

    Hid li li

    Gram

    Hidrlise esculinaTestes presuntivos

    Fluorescncia

    Hidrlise amido e esculina

    Hidrlise esculina

    SIM

    Hidrlise esculina

    Produo de gs

    SIMSIM

    SIM

    F d F d

    Testes definitivos

    Fermentao de acares

    Kits comerciais

    Fermentao de acares

    Kits comerciais

    Fermentao de acares

    Kits comerciais

    Testes moleculares Testes moleculares Testes moleculares

  • TESTES PRESUNTIVOS

    9 Colorao de Gram: morfologia celular

    9 Morfologia colonial

    9 Pigmentao natural ou luz UV

  • B. fragilis

    F. nucleatum

  • C lt d b t i d t d i tCultura pura de bactrias produtoras de pigmento negro

  • C. Perfringens : Dupla hemlise

    C. difficile: CCFA - cicloserina, cefoxitina, frutose, gar. g

  • TESTES DEFINITIVOS

    9 Aspectos bioqumicos e FisiolgicosAspectos bioqumicos e Fisiolgicos

    9 Imunolgicos9 Imunolgicos

    9 Cromatografia gasosa

    9 Biologia molecular: sondas, PCR, sequenciamento

    9 Susceptibilidade a drogas antimicrobianas

    Biologia molecular: sondas, PCR, sequenciamento

    9 Susceptibilidade a drogas antimicrobianas

  • Sistema Mini-API 32-A (bi M i )(bioMrieux)

  • Cromatgrafo gasosogasoso

  • CARACTERIZAO MICROBIANA

    Caractersticas fenotpicas

    Estabilidade influenciada pela presso seletiva do meio ambiente

    Identificao pouco precisa ou especfica

  • CARACTERIZAO MOLECULAR

    9 REA: anlise com enzima de restrio

    9 Hibridizao usando sondas de DNA ou RNA

    9 PFGE l t f l l d

    9 RFLP: polimorfismo tamanho fragmentos restrio

    9 Polymerase Chain Reaction (PCR)

    9 PFGE: eletroforese gel em campo pulsado

    9 Polymerase Chain Reaction (PCR)

    9 Sequenciamento

  • Mtodos Moleculares

    9 Especificidade e sensibilidade

    9 Rapidez e facilidade

    9 Deteco e identificao simultneas

    9 Custo

    9 rea fsicarea fsica

  • CARACTERIZAO MOLECULAR

    Reao em cadeia da polimerase (PCR)

    (Dcada de 80)

    Deteco de genes alvosDeteco de genes alvos

    Rapidez diagnstico de doenas infecciosas e facilitou estudos epidemiolgicos

  • Reao em Cadeia da Polimerase - PCR

    9 Detecta pequenas quantidades de DNA bacteriano (ng)9 Detecta pequenas quantidades de DNA bacteriano (ng)mesmo em amostras mistas;

    9 Permite amplificao de pouco DNA para gerargrandes q antidades do mesmo;grandes quantidades do mesmo;

    9 Pode detectar microrganismos em espcimes clnicosestocados;

  • Reao em Cadeia da Polimerase - PCR

    9 Viabilidade microbiana no necessria para aViabilidade microbiana no necessria para aidentificao;

    9 Identifica e distingue organismos com altasimilaridade fenotpica e genotpica;

    9 Detecta organismos difceis de distinguir por cultivo

    similaridade fenotpica e genotpica;

    9 Detecta organismos difceis de distinguir por cultivotradicional ou no cultivveis.

  • Alguns genes estudados em anaerbios de relevncia clnica

    Organismos Genes Metodologia

    bft (bft1, bft2, bft3) PCR; Multiplex-PCR

    B. fragilis nanH PCR; Nested-PCRcepA PCR; AP-PCR; PFGEcfiA/ccrA PCR; AP-PCR; PFGEcfiA/ccrA PCR; AP-PCR; PFGEcfxA PCR; AP-PCR; PFGE

    C. difficilePaLoc (tcdA/tcdB)Toxina binria (cdtA/cdtB)

    PCR; SequenciamentoPCR

    fliC PCR

    P i i li prtC PCRP. gingivalis prtC PCRfimA PCR; Sequenciamento

  • ETBF: subtipos do gene bft (bft1, bft2, bft3)

    1 2 3 4 5 6 7 8 bp287 (bft3)

    190 (bft1)175 (bft2)

    Colunas 1, 2, 3 e 5: cepas P13C, P60A, P60C e P60F (bft1 e bft3);Colunas 1, 2, 3 e 5: cepas P13C, P60A, P60C e P60F (bft1 e bft3);coluna 4, cepa B. distasonis; colunas 6 e 7: cepa GAI 97124 e ATCC43858 (bft2 e bft3); coluna 8: 50 bp.

    Multiplex-PCR.

  • H ainda muito que estudar no que seH ainda muito que estudar no que se

    refere estrutura genmica de bactrias

    anaerbias, e certamente as tcnicas

    l l i l i d lmoleculares incluindo a clonagem e

    sequenciamento devero contribuir para o

    esclarecimento das dvidas, ainda existentes

    nesse grupo microbiano

  • Consideraes finais

    9 Grupo importante e predominante em ecossistemashumanos, animais e ambientais;

    9 Propicia equilbrio e manuteno de ecossistemas:tilid d t bli d t bilid d fi i l iversatilidade metablica e adaptabilidade fisiolgica;

    9 Participa de infeces mistas de natureza endgena;

    9 No recebe a importncia clnica necessria;

    p g ;

    9 Poucos so os grupos que estudam esses organismos:t f t i t iaspectos fenotpicos e genotpicos.