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RENATA CAMPOS NOGUEIRA
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA
ESTABILIDADE CITOGENÉTICA APÓS EXPANSÃO IN
VITRO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO, TECIDO
ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO HUMANO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Dra. Milena Botelho Pereira Soares
Feira de Santana, BA
2009
2
Dedico este trabalho:
Aos meus queridos pais, José Eduardo
e Ana Beatriz, pelo apoio incondicional
para que eu seguisse o meu caminho...
... e ao meu amado marido, Emerson F. Queiroz,
por tornar os momentos difíceis mais amenos
e as pequenas vitórias tão especiais.
3
AGRADECIMENTOS
NINGUÉM É MAIS FORTE QUE TODOS NÓS JUNTOS!
Esse trabalho, realizado ao longo de dois anos e meio, só foi possível devido ao empenho e suporte de diversas pessoas. Foi um momento de aprendizado, convivência e renúncia. Aprendizado na área de pesquisa, convivência com os novos colegas e com a riquíssima cultura baiana e renúncia de uma zona de conforto ilusória que impede tantas pessoas de perseguirem seus sonhos. Minha conquista, intangível, vai muito além das páginas seguintes. Nunca me esquecerei desse período. Portanto, meus sinceros agradecimentos: À minha orientadora, Dra. Milena B. P. Soares, que se tornou uma grande amiga e companheira de projetos pessoais e profissionais. Difícil expressar em palavras o agradecimento por ter viabilizado o meu sonho orientando tanto o meu trabalho de mestrado como minha carreira científica e, principalmente, meu eterno reconhecimento por ter aberto sua família e amigos ao meu convívio. Finalizo esta etapa com a certeza de que alguns “projetos” aqui iniciados são para a vida inteira. Ao Dr. Ricardo Ribeiro do Santos, chefe do laboratório, por ter me acolhido no grupo com tanto carinho. Formador de recursos humanos me ensinou que a ciência pouco significaria se não fosse compartilhada. Meu eterno respeito. Ao querido colega Ricardo Santana de Lima pelo suporte nos primeiros dias no laboratório, um terreno completamente desconhecido, pela paciência com que me ensinou a trabalhar com cultura de células e principalmente pelo sentimento de amor ao grupo que hoje guardo comigo. À minha companheira de pesquisa Elisalva Guimarães (querida Liu). Pelo empenho incansável na citometria de fluxo, nas diferenciações, na cultura de células. Estabelecemos uma parceria de sucesso e amizade verdadeira! À Gisele Carvalho e Adriana de Oliveira pela colaboração no PCR. Sem a paciência e determinação de vocês eu não teria conseguido. À Carine Azevedo e Marcos Leal que tiveram participação efetiva na realização dos experimentos de imunofluorescência, demonstrando sempre muita consideração por mim. À Dra. Acácia de Carvalho e Dr. Spencer Payão pela fundamental contribuição na etapa de citogenética. Aos colegas de mestrado, Luís Flávio Maia e Cristina Menezes, por partilharem momentos alegres nesse período. A estrada Bahia-Feira não será mais a mesma! Aos colegas da “penúltima salinha do corredor”: Flávia Maciel, Denis Zubieta (que me ajudou na confecção das figuras), Dra. Mara Pires, Fernanda de Borba e mais recentemente
4
Dra. Zaquer Costa (que revisou profissionalmente meu manuscrito). Obrigada pela amistosa convivência. Às Dras. Fabiana Nonato e Cristiane Flora pela sincera amizade. Com vocês aprendi que é possível conciliar a responsabilidade de mãe, esposa, pesquisadora e continuar sendo, antes de tudo, você mesma. O tempo não pára! À Dra. Simone Macambira pelo amor ao ensino e formação de profissionais. Sua dedicação nos faz acreditar em sonhos e resistir aos percalços. À Roberta Couto e Lucyvera Imbroinise, em especial, pelo trabalho na administração do laboratório. Ao curso de Pós-graduação em Biotecnologia. Em especial ao Helton Ricardo, secretário, e Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto pela dedicação aos alunos. À FAPESB pelo apoio financeiro. Aos colegas do LETI por compartilharem os momentos nesta caminhada. Ao Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz por disponibilizar a excelente estrutura física. Agradecimentos especiais.... À minha amada família baiana: tia Eliane, tio Marcelo e Daniel que me receberam em Salvador onde eu me senti em casa desde o primeiro dia. Hoje, a sensação é de que vocês sempre fizeram parte da minha vida. Só precisava encontrá-los! Às tias Andréia e Vera que “me empurraram” para fora da zona de conforto numa tarde no Rio de Janeiro durante um dos muitos períodos de angústia. As palavras de apoio foram decisivas. À minha “Iazinha”, longe, porém não distante. Você tem o meu amor incondicional. Ao amor dos meus irmãos, Cecília e Duda. Por causa desse sentimento de família tenho certeza de que nunca estou sozinha. À minha avó Landa que, sabiamente, diz: “Dá liberdade ao Pai para que Ele conduza a trama dos teus dias...” Aos meus sogros e cunhados que me receberam com tanto amor na família. Aos meus amigos, em especial minhas amigas de longa data: Alessandra Lima, Larissa Lima e Patrícia Achtschin, por entenderem meus períodos de ausência em prol da pesquisa.
A Deus e aos Orixás por colocarem todas estas pessoas no meu caminho. Não existe acaso!
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"Morre lentamente quem não viaja, quem não lê, quem não ouve música, quem não encontra graça em si mesmo. Morre lentamente quem destrói o seu amor-próprio, quem não se deixa ajudar. Morre lentamente quem se transforma em escravo do hábito, repetindo todos os dias os mesmos trajetos, quem não muda de marca, não se arrisca a vestir uma nova cor ou não conversa com quem não conhece. Morre lentamente quem faz da televisão o seu guru. Morre lentamente quem evita uma paixão, quem prefere o negro sobre o branco e os pontos sobre os "is" em detrimento de um redemoinho de emoções, justamente as que resgatam o brilho dos olhos, sorrisos dos bocejos, corações aos tropeços e sentimentos. Morre lentamente quem não vira a mesa quando está infeliz com seu trabalho, quem não arrisca o certo pelo incerto para ir atrás de um sonho, quem não se permite pelo menos uma vez na vida fugir dos conselhos sensatos. Morre lentamente, quem passa os dias queixando-se da sua má sorte ou da chuva incessante. Morre lentamente, quem abandona um projeto antes de iniciá-lo, não pergunta sobre um assunto que desconhece ou não responde quando lhe indagam sobre algo que sabe. Evitemos a morte em doses suaves, recordando sempre que estar vivo exige um esforço muito maior que o simples fato de respirar. Somente a perseverança fará com que conquistemos um estágio esplêndido de felicidade."
Pablo Neruda
6
RESUMO
Encontrar a fonte de célula-tronco mais apropriada para uso terapêutico depende da
investigação de diversos fatores, como a sua capacidade de proliferação e estabilidade
citogenética quando expandidas in vitro, assim como suas características fenotípicas e
potencial de diferenciação. Neste estudo nós comparamos características de células-tronco
mesenquimais isoladas do epitélio amniótico, tecido adiposo e polpa de dente decíduo em
momentos diferentes após expansão in vitro. Células-tronco mesenquimais (CTM) obtidas do
epitélio amniótico foram facilmente isoladas, mas, expandidas in vitro com dificuldade. A
expressão de Oct-4, um fator de transcrição relacionado ao fenótipo de célula-tronco
indiferenciado, foi observado em culturas de CTM do tecido adiposo e polpa dentária em
diferentes passagens. Estas células também apresentaram capacidade de diferenciação
osteogênica e adipogênica in vitro. A análise de marcadores de superfície celular por
citometria de fluxo foi realizada, confirmando a presença de células expressando fenótipo
característico de CTM, com identificação de diferenças entre tecido adiposo e polpa dentária.
Esta fração correspondeu a uma pequena porcentagem de células (em torno de 2%). Após
expansão in vitro, foram analisadas preparações cromossômicas por técnica de bandeamento
G. Cariótipos normais foram encontrados em metáfases de células do tecido adiposo e polpa
dentária em diferentes passagens in vitro, exceto na passagem mais avançada (20°) da CTM
derivada do tecido adiposo. Os resultados indicam que células-tronco humanas derivadas do
tecido adiposo e polpa de dente decíduo possuem muitas características similares, mas não
são iguais e ambas podem ser expandidas em cultura por pelo menos dez passagens sem
apresentarem sinais de anormalidades cromossômicas. Apesar de muitos avanços terem sido
realizados nesse campo, a correlação entre a informação experimental gerada e a aplicação
clínica adequada permanece um desafio para pesquisas futuras.
Palavras- chave:
Tecido adiposo • polpa de dente decíduo • epitélio amniótico • células-tronco mesenquimais •
expansão in vitro • estabilidade citogenética •
7
ABSTRACT
Finding the most appropriate source of stem cells for therapeutic use depends on investigation
of many factors, such as their capacity to proliferate and cytogenetic stability when in vitro
expanded, as well as their phenotypic characteristics and differentiation potential. In this
study we compared features of mesenchymal stem cells (MSC) isolated from human amniotic
epithelium, adipose tissue and deciduous dental pulp different times after in vitro expansion.
Mesenchymal stem cells from human amniotic epithelium were easily isolated, but difficult to
expand in vitro. The other two sources of cells were easy to expand and used in a series of
analyses. The expression of Oct-4, a transcription factor related to undifferentiated stem cell
phenotype, was observed in cultures of MSC from adipose tissue and dental pulp in different
passages. These cells had also osteogenic and adipogenic differentiation capacity in vitro.
Analysis of cell surface markers by flow cytometry was performed, confirming the presence
of cells expressing phenotype characteristic of MSC, although differences between adipose
tissue and dental pulp. These corresponded to a small percentage of the cells (about 2%).
After in vitro expansion, chromosome preparations were analyzed by G-banding techniques.
Normal kariotypes were found in metaphases of cells from adipose tissue and dental pulp in
different in vitro passages, except for a late passage (20th) of adipose tissue derived MSC. The
results indicate that human adipose tissue and deciduous dental pulp derived stem cells posses
many similarities regarding their characteristics but they are not equal and both cultures can
be expanded for at least ten passages without signs of chromosomal abnormalities. Although
many advances have been made in this field, connection between the experimental
information generated and the suitable clinical application remains a challenge for future
research.
Keywords
Adipose tissue • deciduous dental pulp • amniotic epithelium • mesenchymal stem cells • in
vitro expansion • cytogenetic stability •
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Plasticidade de acordo com o grau de especialização celular. 18
Figura 2 Método de obtenção de CTM de diferentes fontes pela seleção de
células aderentes.
23
Figura 3 Isolamento de células-tronco mononucleares humanas pela técnica
de Boyum utilizando sucessivas centrifugações.
25
Figura 4 Esquema de diferenciação de CTM em linhagem osteogênica,
adipogência e condrogênica quando expostas aos diferentes meios
indutores de diferenciação.
28
Figura 5 Delineamento experimental do processo de extração, análise e
diferenciação osteogênica e adipogênica das CTM.
30
Figura 6 Isolamento de CTM da membrana placentária. 31
Figura 7 Isolamento de CTM do tecido adiposo. 32
Figura 8 Isolamento de CTM da polpa de dente decíduo. 33
Figura 9 Cultura de CTM aderentes provenientes do tecido adiposo. 40
Figura 10 Cultura de CTM aderentes provenientes da polpa de dente decíduo. 40
Figura 11 Cultura de CTM aderentes provenientes do epitélio amniótico. 40
Figura 12 Micrografias de culturas de CTM 41
Figura 13 Análise de CTM do epitélio amniótico na 10 a passagem de cultura
in vitro.
42
Figura 14 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo
na 4° passagem.
44
Figura 15 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo
na 10° passagem.
45
Figura 16 Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície
característicos de CTM.
46
Figura 17 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente
decíduo na 4° passagem.
47
Figura 18 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente
decíduo na 10° passagem.
48
Figura 19 Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície
característicos de CTM.
49
9
Figura 20 RT-PCR de culturas de CTM provenientes do tecido adiposo e polpa
de dente decíduo.
49
Figura 21 Diferenciação adipogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. 51
Figura 22 Diferenciação osteogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. 51
Figura 23 Diferenciação osteogênica de CTM derivadas da polpa de dente
decíduo.
51
Figura 24 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo
in vitro na 2a passagem.
53
Figura 25 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo
in vitro na 10a passagem.
53
Figura 26 Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM
derivada do tecido adiposo.
54
Figura 27 Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM
derivada da polpa de dente decíduo.
54
Figura 28 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo
in vitro na 20a passagem.
55
Figura 29 Características das culturas de CTM derivada de epitélio amniótico,
tecido adiposo e polpa do dente decíduo.
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Anticorpos e seus fornecedores utilizados na citometria de fluxo. 35
Tabela 2 Condições empregadas na reação de PCR. 37
Tabela 3 Análise por citometria de fluxo de CTM do epitélio amniótico na
10° passagem de cultura in vitro.
43
11
LISTA DE ABREVIATURAS
CTE Célula-tronco embrionária
CTM Célula-tronco mesenquimal
MO Medula óssea
CTDA Célula-tronco derivada do tecido adiposo
LIF Leukemia inhibitory factor
TGF-β Transforming growth factor-β
IBMX Isobutil metil xantina
CD Grupo de diferenciação
PCR Reação da cadeia em polimerase
HBSS Hank´s balanced salt solution
SBF Soro bovino fetal
MEM Minimum essential medium
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 OBJETIVOS 17
3 REVISÃO DA LITERATURA 18
3.1 CÉLULAS TRONCO 18
3.1.1 Células-tronco adultas
19
3.2 CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS 20
3.2.1 Obtenção 23
3.2.2 Caracterização 25
3.2.3 Marcadores de superfície 26
3.2.4 Expressão de fatores de transcrição 27
3.2.5 Potencial de diferenciação 27
4 MATERIAL E MÉTODOS 30
4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 30
4.2 ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS 31
4.2.1 Epitélio amniótico 31
4.2.2 Tecido adiposo 32
4.2.3 Polpa de dente decíduo. 33
4.3 SELEÇÃO E EXPANSÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
34
4.4 CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS 35
4.4.1 Coloração por Giemsa 35
4.4.2 Citometria de fluxo 35
4.4.3 Análise da expressão do Oct-4 por RT-PCR semi-quantitativo.
37
4.4.4 Diferenciação osteogênica 38
13
4.4.5 Diferenciação adipogênica 39
4.5 ESTABILIDADE CITOGENÉTICA 39
5 RESULTADOS 40
5.1
ANÁLISE QUALITATIVA DAS CTM DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO, TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO.
40
5.2 SELEÇÃO DE CTM ADERENTES 40
5.3 MORFOLOGIA DE CTM DERIVADA DO TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO.
42
5.4 MARCADORES DE SUPERFÍCIE – CITOMETRIA DE FLUXO 43
5.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA 50
5.6 DIFERENCIAÇÃO INDUZIDA 51
5.7 ESTABILIDADE CITOGENÉTICA 53
6 DISCUSSÃO 57
7 CONCLUSÕES 62
8 REFERÊNCIAS 63
9 ANEXOS 70
9.1 ARTIGO 1 - EARLY TOXICITY SCREENING AND SELECTION OF LEAD COMPOUNDS FOR PARASITIC DISEASES.
71
9.2 ARTIGO 2 - CURRENT STATUS OF STEM CELL THERAPY FOR LIVER DISEASES
80
14
1 INTRODUÇÃO ______________________________________________________________________
As células-tronco podem ser classificadas em duas grandes categorias, de acordo com
seu estágio de desenvolvimento: embrionárias e não embrionárias, ou adultas. As células-
tronco embrionárias (CTE) são isoladas da massa celular interna do embrião no estágio de
blastocisto (MARTIN, 1981; NAGY et al., 1990). As células-tronco adultas estão presentes
no organismo após o nascimento. Dentre os principais tipos de células-tronco adultas
identificadas temos as células-tronco mesenquimais (CTM), que atuam no reparo e
homeostase em vários tecidos do corpo. São células precursoras capazes de se diferenciar em
vários tipos celulares diferentes, mas não em todas as células do organismo (DAN et al.,
2008). Atualmente, as células-tronco têm sido objeto de crescente estudo pela suas potenciais
aplicações na área biomédica.
Na literatura existem relatos da segurança clínica da utilização de terapia com células-
tronco, como, por exemplo, a transfusão autóloga de células mononucleares da medula óssea
na artéria hepática em pacientes com doenças crônicas do fígado (LYRA et al., 2007), nas
coronárias em pacientes com cardiopatia chagásica crônica (VILAS-BOAS et al 2006) assim
como em pacientes com infarto crônico do miocárdio (YAO et al 2008) e na via intramuscular
e intra-arterial de membros inferiores isquêmicos de pacientes diabéticos (GU et al 2008),
dentre outros. O fato das células serem autólogas, eliminando assim o risco de rejeição
imune, e representarem uma fonte acessível e isenta de complicações éticas também contribui
para o crescente interesse da comunidade científica em terapia celular. Casos de sucessos de
transplantes alogênicos, como na estimulação do crescimento em crianças com osteogenesis
imperfecta (HORWITZ et al., 2002) pelo tratamento com CTM isoladas da medula óssea e
expandidas in vitro, reforçam o cenário de um futuro promissor para a terapia celular.
A identificação de novas fontes de CTM é imprescindível para o sucesso da terapia
celular. As células devem possuir boa capacidade proliferativa, manutenção das
características imunofenotípicas quando cultivadas in vitro e estabilidade citogenética.
O futuro aponta para a existência de uma fonte preferencial para uma dada terapia,
estabelecendo assim uma correlação entre marcadores imunofenotípicos e reparação tecidual.
Estudos recentes sinalizam o potencial de CTM proveniente da polpa dentária na regeneração
óssea pela sua expressão de marcadores ósseos (GRONTHOS et al., 2002) e habilidade em
regenerar o complexo de polpa da dentina composto de matriz mineralizada (GRONTHOS et
al., 2000).
15
A medula óssea (MO) é a principal fonte de CTM utilizadas até o momento. Porém, o
procedimento de obtenção dessas células é invasivo, e o número e o potencial de
diferenciação e proliferação diminuem com a idade (STENDERUP et al., 2003).
O método padrão de isolamento de CTM baseia-se na sua capacidade de aderência ao
plástico (FRIEDENSTEIN et al., 1970). Relatos na literatura demonstram o isolamento de
CTM provenientes de outras fontes facilmente accessíveis, tais como a membrana placentária
(MIKI et al., 2005), tecido adiposo (ZUK et al., 2001) e polpa dentária (GRONTHOS et al.,
2002).
O potencial proliferativo de uma célula é inversamente proporcional ao nível de
especialização da mesma (DAN et al., 2008). Espera-se, portanto, que células com fenótipo
indiferenciado possuam alta capacidade de expansão. A estabilidade cromossômica em
culturas de CTM após sucessivas passagens também deve ser avaliada, uma vez que, in vivo,
mudanças cromossômicas geralmente resultam em carcinogênese (CATALINA et al., 2007).
As CTM devem possuir capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica,
adipogênica e condrogênica, de acordo com critérios propostos pelo Comitê de Célula Tronco
Tecidual e Mesenquimal da Sociedade Internacional para Terapia Celular (DOMINICI et al.,
2006).
A caracterização das CTM através da análise da expressão de antígenos de superfície
por citometria de fluxo, foi proposta pelo Comitê de Célula Tronco Tecidual e Mesenquimal
da Sociedade Internacional para Terapia Celular (DOMINICI et al., 2006). Esse comitê
estabeleceu critérios para caracterizar CTM humana baseado nos estudos com CTM
proveniente de medula óssea. Até o momento não foi identificado nenhum marcador
específico para as CTM e na literatura encontram-se proposições para isolar uma população
pura de CTM de um tecido (PITTENGER et al., 1999; ALSALAMEH et al., 2004), mas,
ainda não existe um consenso. Já foi demonstrado que a expressão de antígenos pode mudar
com o cultivo in vitro (FIBBE, 2003) e que pode haver variação na expressão de acordo com
o tipo de tecido em que foi extraída a célula (GRONTHOS et al., 2001).
A presença de reguladores centrais, como Oct-4, Nanog e Sox-2 responsáveis pela
manutenção do estado pluripotente e de autorenovação de CTE humanas (NIWA et al 2000)
também pode ser investigada nas culturas de CTM. Já foi demonstrado na literatura a
expressão dos marcadores de células-tronco embrionárias em CTM proveniente da polpa
dentária (KERKIS et al., 2006) e da membrana placentária (MIKI et al., 2005).
Portanto, nesse estudo investigamos as características das CTM provenientes de três
fontes: membrana placentária, tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Foram avaliados a
16
expressão gênica e de marcadores de superfície, o potencial proliferativo e de diferenciação e
a manutenção da estabilidade citogenética quando expandidas in vitro.
17
2 OBJETIVOS
_____________________________________________________________________
GERAL
Caracterizar comparativamente fontes de células-tronco mesenquimais para utilização em
terapia celular.
ESPECÍFICOS
• Extrair células-tronco do epitélio amniótico, da polpa do dente decíduo e do tecido
adiposo humanos;
• Caracterizar fenotipicamente as células-tronco adultas provenientes desses tecidos, de
acordo com sua morfologia e expressão de antígenos característicos;
• Identificar a expressão de fatores de transcrição responsáveis pela manutenção do
estado indiferenciado das células;
• Investigar o potencial de diferenciação destas células nas linhagens osteogênicas e
adipogênicas.
• Analisar a manutenção numérica e estrutural do cariótipo normal das células após
sucessivas passagens.
18
3 REVISÃO DA LITERATURA
______________________________________________________________________
3.1. CÉLULAS-TRONCO
As células-tronco têm sido objeto de interesse científico crescente pela sua utilidade
em inúmeras aplicações biomédicas. São definidas por duas características essenciais: 1º - são
capazes de gerar cópias idênticas de si mesmas, se autorenovando; 2º - originam diferentes
tipos celulares mais especializados do corpo humano, tais como cardiomiócitos, hepatócitos,
ilhotas pancreáticas e células nervosas (GROVE et al., 2004).
Diferenciação é o processo através do qual uma célula adquire nova morfologia e
característica funcional (THEISE & KRAUSE, 2002). A diferenciação in vivo leva ao
estabelecimento de linhagens celulares somáticas da camada precursora germinativa durante o
desenvolvimento dos mamíferos. De qualquer modo, o processo é também prevalente no
reparo e manutenção de tecidos durante a vida pós-natal e adulta, assim como na
diferenciação de células-tronco da medula óssea em células sanguíneas eritróides e mielóides
funcionais (GROVE et al, 2004).
As células-tronco podem ser classificadas em duas grandes categorias, de acordo com
seu estágio de desenvolvimento: embrionárias e não embrionárias, ou adultas. As células-
tronco embrionárias (CTE) são isoladas da massa celular interna do embrião no estágio de
blastocisto (MARTIN, 1981; NAGY et al., 1990). São células capazes de originar todos os
tecidos do organismo, incluindo o tecido extraembrionário durante o desenvolvimento.
Thomson e colaboradores (1998) isolaram células-tronco embrionárias humanas pela primeira
vez, e posteriormente foi demonstrado que estas células possuem a mesma plasticidade
encontrada nas células-tronco embrionárias de camundongos, ou seja, a habilidade de se
diferenciar em vários tipos de células somáticas com características funcionais, tais como
neurônios, hepatócitos e cardiomiócitos (MULLER et al.,2002; XU et al., 2002).
As células-tronco podem, ainda, ser classificadas quanto ao seu potencial de
diferenciação e plasticidade, ou seja, o potencial de formação de diferentes tipos de células
maduras (figura 1). Por exemplo, uma célula multipotente possui a capacidade de se
diferenciar em múltiplos tipos celulares não restritos a uma única camada germinativa. Tem
sido demonstrada a diferenciação de células-tronco residentes de um determinado tecido em
células características de outro tecido (SNYKERS et al., 2007; TALÉNS-VISCONTI et al.,
2006). Uma célula é dita pluripotente quando se diferencia em todos os tipos celulares
19
encontrados no organismo. Uma célula totipotente pode dar origem a um organismo inteiro,
incluindo membranas extra-embrionárias e placenta. As CTE são classificadas como
pluripotentes (SOLTER, 2006), pois mesmo sendo possível obter um embrião e camundongos
adultos das CTE, estas não podem derivar as membranas extra-embrionárias e placenta
(NAGY et al, 1993). Essa classificação está em constante mudança com os avanços das
pesquisas na área. Outros autores já classificam as CTE como totipotentes (DAN et al.2008).
Figura 1. Plasticidade de acordo com o grau de especialização celular.
3.1.1 Células-tronco adultas
A célula-tronco adulta é uma célula indiferenciada encontrada em um tecido
diferenciado do organismo. Elas são responsáveis pela auto-renovação e homeostase do seu
tecido de origem ao longo da vida (MINGUELL et al., 2001).
As células-tronco adultas mais estudadas são as células-tronco da medula óssea. A
medula óssea humana, derivada do mesoderma embrionário, é um tecido complexo formado
por uma população de células-tronco hematopoiéticas, tendo como suporte o estroma
mesenquimal. O estroma da medula óssea possui uma composição heterogênea, sendo
reservatório de várias populações de células-tronco, entre elas as CTM e as células-tronco
progenitoras multipotentes adultas (JIANG et al., 2002). A medula óssea foi a primeira fonte
de CTM relatada na literatura. Hoje existem referências de propagação de CTM a partir de
PLASTICIDADE
PLASTICIDADE DE ACORDO COM O GRAU DE ESPECIALIZAÇÃO CELULAR
20
inúmeros tecidos e órgãos, tais como o cérebro (CLARKE et al., 2000), o fígado (YANG et
al., 2002), a pele (TOMA et al., 2001), o tecido adiposo (ZUK et al., 2001), o músculo
esquelético (JACKSON et al., 1999), e o sangue (ZHAO et al., 2003). Jiang e colaboradores
(2002) descreveram que as CTM mantêm sua morfologia, o comprimento de telômero (27
kb), e a habilidade de se diferenciar mesmo depois de 60 divisões celulares. Já foi
demonstrada in vitro a diferenciação dessas células em uma enorme variedade de tipos
celulares, tais como osteoblastos, adipócitos, condrócitos, células endoteliais, miócitos
esqueléticos, glia, neurônios e cardiomiócitos (ALVAREZ-DOLADO et al., 2003).
3.2. CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
As células-tronco mesenquimais (CTM) são células especializadas que atuam no
reparo e homeostase de vários tecidos do corpo. São células precursoras, capazes de se
diferenciar em vários tipos celulares diferentes, mas não em todas as células do organismo. As
CTM podem ser extraídas de diversos órgãos, expandidas em cultura como uma população
aderente de células com formato fusiforme semelhante ao de fibroblastos, e induzidas a se
diferenciar em múltiplos tipos celulares (BAKSH et al. 2004; DOCHEVA et al., 2007).
A utilização das CTM na medicina regenerativa para indução de reparo tecidual tem
sido objeto de estudo em diversos grupos de pesquisa no mundo. Uma série de trabalhos
experimentais envolvendo o uso terapêutico destas células tem demonstrado sua eficiência,
por exemplo, em doenças cardíacas (DAI et al., 2005), hepáticas (KUO et al., 2008)
neurológicas (CHOPP & LI, 2002) e renais (MORIGI et al. 2008). Esse procedimento tem
sido promissor também na esfera clínica, onde se observa um crescimento exponencial de
trabalhos publicados nos últimos anos (HORWITZ et al., 2002; KHARAZIHA et al., 2009).
Em conjunto, os estudos experimentais e clínicos parecem indicar um efeito protetor das
CTM decorrente de fatores por elas secretados. Existem algumas barreiras técnicas
importantes a serem superadas na implantação desta terapia, tais como o alto custo de
expansão das células, presença reduzida nos tecidos e dificuldades na caracterização das
mesmas. No entanto, espera-se que a terapia celular com CTM seja uma opção terapêutica em
um médio a longo prazo.
A geração de linhagens celulares humanas para teste de drogas é outro campo onde se
espera grande emprego das CTM (DAVILA et al, 2004). O estabelecimento de testes
toxicológicos in vitro com células humanas especializadas, ao invés de células animais, pode
21
representar um enorme avanço na predição de efeitos colaterais em humanos. Por exemplo,
hepatócitos e cardiomiócitos provenientes de células-tronco in vitro podem ser utilizados
rotineiramente para excluir novas entidades químicas que estejam no processo de screening
baseado na hepatotoxicidade e cardiotoxicidade observada, duas maiores causas de falha do
desenvolvimento pré-clínico de novas drogas terapêuticas. Portanto, uma triagem in vitro
baseada em células hepáticas humanas, visando à identificação de hepatotoxicidade nos
estágios iniciais de desenvolvimento de um medicamento, pode representar uma economia de
tempo e recursos (NOGUEIRA et al., 2009). A diferenciação de CTM em hepatócitos tem
sido largamente investigada (SNYKERS et al 2009) tendo sido objeto de inúmeras revisões,
inclusive pelo nosso grupo (SOUZA et al 2009 aguardando impressão), e já se observam
depósitos de patentes de testes in vitro utilizando estas células (PCT/EP2004/012134).
O método tradicional de obtenção de células a partir da medula óssea por punção da
crista ilíaca é invasivo e sabe-se que o número de células obtidas por procedimento é
influenciado pela idade do paciente (STENDERUP et al., 2003).
Assim como a medula óssea, o tecido adiposo é um órgão derivado do mesoderma e
contém uma população estromal de células endoteliais microvasculares, células do músculo
liso e células-tronco (ZUK et al., 2001). Essas células podem ser dissociadas enzimaticamente
do tecido adiposo (comumente obtido por lipoaspiração) e separada dos adipócitos por
centrifugação. Uma população celular é obtida quando submetida a condições de crescimento
seletivas para CTM. Essa população chamada célula-tronco derivada de tecido adiposo
(CTDA), possui muitas características em comum com as células derivadas da medula óssea,
tais como um extenso potencial proliferativo e capacidade de diferenciação em tipos celulares
característicos de outros tecidos (DE UGARTE et al., 2003).
A descoberta das CTDA pode ser de grande importância para a terapia celular.
Enquanto a idade do paciente limita a quantidade de medula que pode ser obtida e aumenta o
tempo em cultura necessário para se atingir a dose celular terapêutica, a obtenção de CTM
derivadas do tecido adiposo representa uma fonte alternativa de células que podem ser obtidas
em grande quantidade com anestesia local e desconforto mínimo (STREM et al., 2005).
Dentre as fontes de células-tronco mesenquimais está o epitélio amniótico placentário.
A placenta contém três camadas, o âmnion, o córion e a decídua. Cada camada é derivada de
várias fontes diferentes. Apesar de a decídua ser de derivação materna, o âmnion e o córion se
derivam do embrião. Enquanto o córion é derivado do trofoblasto, o âmnion é derivado do
epiblasto oito dias após a fertilização. Portanto, o epiblasto origina o âmnion, assim como
todas as camadas germinativas do embrião. A gastrulação ocorre aproximadamente três
22
semanas após a fertilização, quase duas semanas após a formação de células epiteliais a partir
do epiblasto (DIWAN et al., 1976). Portanto, foi especulado que o âmnion retém a
propriedade pluripotente de células epiblásticas jovens (MIKI et al., 2005).
Estudos recentes demonstraram que a placenta, o sangue do cordão umbilical e o
líquido amniótico contêm células-tronco multipotentes (IN´T ANKER et al., 2004;
ROMANOV et al., 2003). Em 2005, Miki e colaboradores demostraram que as células
epiteliais isoladas da placenta humana expressam marcadores de superfície normalmente
presentes em células-tronco embrionárias e germinativas, e que as células epiteliais
amnióticas expressam Oct-4 e Nanog, que são fatores de transcrição característicos de células-
tronco pluripotentes. Além disso, esses autores demonstraram que, em certas condições de
cultura, as células epiteliais amnióticas formam estruturas esferóides que retêm as
características de células-tronco, que as células amnióticas são não tumorigênicas após
transplante, e que estas têm o potencial de se diferenciar in vitro em tipos celulares
encontrados nos três folhetos germinativos – endoderma (fígado e pâncreas), mesoderma
(cardiomiócito), e ectoderma (células neuronais). Estes achados confirmam que o epitélio
amniótico derivado da placenta após o parto pode ser uma fonte útil e não controversa de
células-tronco para transplante celular e utilização na medicina regenerativa (MIKI et al.,
2005).
Outra fonte promissora de células-tronco é a polpa dentária, que é derivada de
componentes ectodérmicos e mesenquimais que contêm células da crista neural com
capacidade plástica e multipotente (KERKIS et al., 2006). Ela é dividida em quatro camadas,
da mais externa para a interna: a primeira, composta de odontoblasto produzindo dentina; a
segunda camada, pobre em células e rica em matriz extracelular; a terceira camada, que
contém células progenitoras com plasticidade e pluripotencialidade; e a camada mais interna,
que compreende a área vascular e o plexo nervoso (D`AQUINO et al., 2008) . Recentemente
foi descoberto que a polpa de dentes decíduos (dentes de leite) é uma rica fonte de CTM. O
seu acesso fácil e o fato de não serem órgãos vitais provêm um atrativo para utilização destas
células na terapia celular. A coleta de células dos dentes decíduos tem ainda a vantagem de
utilizar um tecido que normalmente seria descartado. As suas limitações são a possibilidade
de contaminação na coleta e a quantidade de células disponível para terapia. Foi demonstrado
que CTM da polpa dentária possuem capacidade de auto-renovação e diferenciação em
adipócitos (GRONTHOS et al., 2002).
A instabilidade genética e cromossômica representa uma preocupação em se tratando
de futuras aplicações terapêuticas baseadas em linhagens de células-tronco. Essa instabilidade
23
cromossômica pode ser a causa da propriedade tumorigênica observada em linhagens de
células embrionárias (MITALIPOVA et al., 2005). Para o emprego de células-tronco
mesenquimais como terapia celular pode ser necessário o cultivo in vitro extenso, aumentando
assim a probabilidade de transformação e instabilidade genética. A estabilidade cromossômica
em linhagens celulares consiste na manutenção numérica e estrutural do cariótipo normal após
sucessivas passagens. A identificação de anormalidades cromossômicas em células-tronco
com potencial emprego terapêutico é preocupante, uma vez que, in vivo, essas mudanças
cromossômicas geralmente resultam em carcinogênese (CATALINA et al., 2007). Portanto,
as células devem ser avaliadas por meio de técnicas citogenéticas para que os métodos de
cultivo e propagação sejam otimizados para cada linhagem celular, de modo a eliminar a
possibilidade de utilização de células portadoras de alterações cromossômicas.
3.2.1. Obtenção
Friedenstein e cols. (1970) desenvolveram um método de isolamento de CTM de
medula óssea baseado na sua capacidade de aderência ao plástico, que é utilizado até hoje
como o método padrão de isolamento destas células. O procedimento de isolamento das CTM
de outros tecidos é muito semelhante e envolve pelo menos duas etapas: isolamento das
células; e aderência em plástico, variando apenas na fase inicial, a depender da origem das
células (figura 2).
Para a obtenção de CTM a partir de fragmentos teciduais realiza-se geralmente o
tratamento com colagenase, que permitirá o desprendimento celular. Após esse processo,
realiza-se a etapa de aderência ao plástico. Utilizando abordagens semelhantes, com
adaptações, encontramos inúmeros exemplos de protocolos de extração de células a partir de
diversos fragmentos teciduais na literatura (TOMA et al., 2001; ZUK et al., 2001; IN´T
ANKER et al., 2004; MIKI et al., 2005).
24
Figura 2. Método de obtenção de CTM de diferentes fontes pela seleção de células aderentes.
Quando as CTMs são purificadas do tecido hematopoético, seja ele aspirado da
medula óssea, sangue de cordão umbilical ou periférico, é realizada a separação da fração de
células mononucleares baseada na técnica originalmente descrita por Boyum (1968), que
emprega centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque (figura 3). Após esse processo,
realiza-se a etapa de aderência em plástico. Encontram-se na literatura diversos artigos que
utilizam variações dessa técnica (ZHAO et al., 2003; ROMANOV et al., 2003; STENDERUP
et al., 2003; JACKSON et al., 1999).
25
ISOLAMENTO DE CÉLULAS TRONCO MONONUCLEARES HUMANAS
•Sangue periférico
•Sangue de cordão umbilical
•Medula óssea
PBS + Sangue
Ficoll -Hypaque
Células mononucleares
Lavagem com PBS
Sedimentadas após centrifugação
Figura 3. Isolamento de células-tronco mononucleares humanas pela técnica de Boyum utilizando
sucessivas centrifugações.
3.2.2. Caracterização
As CTM constituem uma população heterogênea de células, em termos de morfologia,
fisiologia e expressão de antígenos de superfície (BAKSH et al. 2004). Enquanto as CTM
provenientes da medula óssea já foram amplamente descritas fenotipicamente, a
caracterização fenotípica de CTM provenientes do tecido adiposo, polpa dentária, membrana
placentária e outras fontes ainda não foi estabelecida (BOBIS et al., 2006).
O Comitê de Célula Tronco Tecidual e Mesenquimal da Sociedade Internacional para
Terapia Celular (Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society
for Cellular Therapy) propôs recentemente quatro critérios para caracterizar CTM humanas
(DOMINICI et al., 2006), sendo eles:
1- devem ser aderentes ao plástico quando mantidas em condições padrão de cultura.
2- devem possuir capacidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica.
3- devem expressar CD73, CD90 e CD105.
4- não devem expressar marcadores de linhagem hematopoiéticas; c-kit, CD14, CD11b,
CD34, CD45, CD19, CD79 alfa, e antígeno leucocitário humano (HLA)-DR
26
3.2.3. Marcadores de superfície
Até o momento não foi identificado nenhum marcador específico para as CTM, que
expressam um grande número de moléculas de adesão, proteínas de matriz extracelular,
citocinas e receptores de fatores de crescimento, associados à sua função e interações
celulares no estroma da medula óssea (DEVINE et al., 2000). A população de CTM isolada
da medula óssea expressa: CD44, CD105 (SH2; endoglina), CD106 (molécula de adesão
celular vascular; VCAM-1), CD166, CD29, CD73 (SH3 e SH4), CD90 (Thy), CD117, STRO-
1 e Sca-1 (BADDOO et al., 2003). Paralelamente, as CTM não possuem marcadores típicos
de linhagens celulares hematopoiéticas e endoteliais, tais como CD11b, CD14, CD31, CD33,
CD34, CD133 e CD45 (PITTENGER et al., 1999). De acordo com Baddoo e cols. (2003), a
ausência de antígenos CD14, CD34 e CD45 na sua superfície as distingue de precursores
hematopoiéticos.
Diversos estudos foram realizados com o objetivo de identificar um número restrito de
antígenos para isolar uma população pura de CTM de um tecido. Com os dados disponíveis
até o momento, algumas opções foram propostas nesse contexto. Uma delas sugere que a co-
expressão de CD105 e CD73 seria suficiente para a sua caracterização (PITTENGER et al.,
1999). A outra infere que a análise da expressão de CD166 e CD105 torna possível a
separação de precursores de CTM das células mais maduras (ALSALAMEH et al., 2004).
Para a caracterização fenotípica das CTM, deve-se empregar um conjunto de
anticorpos monoclonais que permitirão a avaliação quantitativa e qualitativa da expressão dos
antígenos por citometria de fluxo, caracterizando um perfil imunofenotípico das células
(DOMINICI et al., 2006).
É importante observar que o perfil de expressão gênica e de marcadores de superfície
se aplica às células expandidas in vitro. Todas as tentativas de se estabelecer tanto uma
definição fenotípica exata das CTM quanto uma diferenciação entre as mesmas e os
fibroblastos não obtiveram êxito até o momento. De qualquer forma, a presença de alguns
antígenos pode mudar in vitro devido a condições de cultura específicas e a duração das
passagens. É interessante que alguns antígenos podem ser encontrados em CTM recém-
isoladas, mas sua expressão desaparece quando estas são mantidas em cultura. Esse fenômeno
foi observado no caso do antígeno CD34. Essa molécula foi expressa em CTM obtidas de
pulmão fetal de camundongos, mas não foi encontrada em culturas in vitro de CTM (FIBBE,
2003). Apesar do CD34 ser um marcador utilizado na identificação de células-tronco
hematopoiéticas, a sua expressão em CTDA já foi demonstrada (GRONTHOS et al., 2001).
27
3.2.4. Expressão de fatores de transcrição
Oct-4, Nanog e Sox-2 são reguladores centrais responsáveis pela manutenção do
estado de pluripotencialidade e de auto-renovação de CTE humanas e de camundongos
(RODDA et al., 2005). A proteína Oct-4 (Octamer-binding transcription factor 4) é um fator
de transcrição presente na massa interna do blastocisto e epiplasto. De acordo com o nível de
Oct-4, a célula permanece em estado indiferenciado ou se diferencia em outro tecido. A perda
da expressão dessa proteína indica que a célula entrou no processo de diferenciação (NIWA et
al 2000; LEE et al., 2006). A superexpressão de Nanog permite que as CTE de camundongo
se mantenham pluripotentes sem a necessidade de suplementação do meio de cultivo através
da adição do fator inibidor de leucemia (leukemia inhibitory factor, LIF) (MITSUI et al.,
2003). O Sox-2 é um fator de transcrição regulatório expresso durante o desenvolvimento
primário em vários tecidos, sendo expresso também nas CTE (AVILION et al., 2003). Há
evidências de que estes fatores trabalham de forma coordenada na regulação da expressão de
vários genes (BOYER et al., 2005).
Vários estudos da literatura relatam a expressão de fatores de transcrição relacionados
à pluripotência em CTM, dentre eles o Rex-1, o FGF-4, o Nanog, o Oct-4 e o SOX-2 (ZHU et
al., 2008; KERMANI et al., 2008; SHOCKLEY et al., 2007). Observou-se, em CTM
proveniente da polpa dentária, a expressão dos marcadores de células-tronco embrionárias
Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81 por mais de 25 passagens (KERKIS
et al., 2006). Em CTM provenientes da membrana placentária, foi relatada a expressão de
Oct-4 e Nanog (MIKI et al., 2005). Porém, até o momento não foi definido um conjunto de
fatores de transcrição característicos das CTM e não se sabe se essa expressão está
relacionada à fonte de obtenção das CTM, ao tempo e a condições de cultivo das células.
3.2.5. Potencial de diferenciação celular
Além da capacidade de auto-renovação, crescimento por aderência em plástico e
conjunto de marcadores de superfície, outro critério de caracterização das CTM é sua
capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro
(DOMINICI et al., 2006).
Pittenger e colaboradores (1999) demonstraram que aproximadamente um terço das
CTM se diferencia com sucesso nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica
(figura 4). A diferenciação in vitro em uma determinada linhagem celular requer o tratamento
28
das células com uma mistura específica de fatores de diferenciação. O meio basal, a densidade
celular, a organização espacial, fatores de crescimento e citocinas são fundamentais no
sucesso da diferenciação, devendo ser adaptados ao longo do experimento (MANNELLO et
al., 2007).
Quando as CTM provenientes da medula óssea são plaqueadas em uma densidade
baixa, ocorrem a proliferação e a secreção de Dkk1 (Dickkopf homolog 1) uma proteína
secretada que possui duas regiões ricas em cisteína, favorecendo o fenótipo indiferenciado das
células. Ao contrário, quando as células atingem confluência, a expressão de Wnt-5a, da via
de sinalização Wnt envolvida na embriogênese e em processos fisiológicos, que suprimem o
efeito da Dkk1 (GREGORY et al., 2003; LIE et al., 2005)
Para a obtenção da linhagem celular osteoblástica, uma camada confluente de CTM
deve ser incubada com uma mistura contendo β– glicerofosfato, ácido ascórbico e
dexametasona por um período de 2-3 semanas (DENNIS et al., 2000). A diferenciação na
linhagem osteogênica é medida pela atividade da fosfatase alcalina e pelo acúmulo de cálcio
(PITTENGER et al., 1999).
A diferenciação condrogênica é classicamente realizada em culturas de pellets de
CTM após a adição de Transforming Growth Factor-β (TGF- β) (DENNIS et al., 2000). O
TGF-β e outras citocinas indutoras ativam vias de sinalização intracelular que direcionam à
condrogênese, em sua maioria via ativação das quinases ativadas por mitógenos (mitogen-
activated protein - MAP kinases), tais como ERK-1, p38, PKC e Jun (SEKIYA et al., 2002).
A diferenciação condrogênica pode ser visualizada através de testes histológicos que detectam
a presença de proteoglicanos na matriz extracelular e cadeias de colágeno tipo II, típico de
cartilagem articular (PITTENGER et al., 1999).
A adipogênese in vitro pode ser induzida pelo tratamento de CTM com coquetel
contendo dexametasona, isobutil metil xantina (IBMX) e indometacina (DENNIS et al.,
2000). A diferenciação pode ser confirmada pela técnica de coloração oil red e pela expressão
de proteínas específicas, como receptor ativado de proliferação peroxisoma γ 2 (PPARγ2),
lipoproteína lipase e proteína ligante de ácido graxo (PITTENGER et al., 1999).
29
CÉLULA TRONCO MESENQUIMAL: DIFERENCIAÇÃO
Adipogênese OsteogêneseCondrogênese
Dexametasona
Isobutilmetilxantina
Indometacina
β glicerofosfato
Ácido Ascórbico
DexametasonaTGF-β
Tecido adiposo Osso Cartilagem
Figura 4. Esquema de diferenciação de CTM em linhagem osteogênica, adipogência e condrogênica
quando expostas aos diferentes meios indutores de diferenciação.
30
4 MATERIAL E MÉTODOS ______________________________________________________________________ 4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
As CTM humanas foram isoladas de fragmentos teciduais obtidos de epitélio
amniótico, tecido adiposo e polpa do dente decíduo. Após o processo de isolamento, foi
estabelecida uma cultura de CTM para cada fonte investigada, através da aderência das
células mesenquimais ao plástico. Cada cultura foi expandida in vitro e seguiu-se, então, a
etapa de caracterização das células obtidas (Figura 5).
A caracterização nos estágios iniciais da cultura e após a expansão in vitro consistiu
na:
• Visualização da morfologia pela coloração das células com o método de
Giemsa;
• Análise da expressão de um painel de grupos de diferenciação (CD) propostos
na literatura para caracterizar CTM, utilizando a técnica de citometria de fluxo;
• Investigação da manutenção da expressão do fator de transcrição Oct-4, um
dos responsáveis pela característica indiferenciada, utilizando a técnica de
reação em cadeia da polimerase (PCR);
• Indução da diferenciação em células das linhagens osteogênica e adipogênica,
após cultura em meio contendo misturas específicas de fatores de
diferenciação;
Ao longo das passagens, a estabilidade genética dos cromossomas metafásicos foi realizada
para banda GTG (Sanchez et al., 1973) e as imagens foram capturadas em um microscópio
BX60 e analisadas pelo programa ImagePro.
31
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Epitélio amniótico Tecido adiposo Decídua dentária
1) ISOLAMENTO E EXPANSÃO DAS CÉLULAS
2) CARACTERIZAÇÃO
-Citometria de fluxo
-PCR
- Microscopia
-Diferenciação osteogênica
e adipogênica
3) ESTABILIDADE
CITOGENÉTICA
Figura 5. Delineamento experimental do processo de extração, análise e diferenciação osteogênica e adipogênica das CTM.
4.2. ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS. O processo de isolamento das células-tronco mesenquimais é adaptado de acordo com
a origem do tecido e será descrito em detalhes, a seguir.
4.2.1. Epitélio amniótico
Placentas humanas obtidas após o parto por cesariana foram acondicionadas em saco
estéril e encaminhadas ao laboratório. O procedimento de obtenção das CTM amnióticas está
ilustrado na figura 6. A camada amniótica foi mecanicamente destacada do córion e lavada
várias vezes com solução salina balanceada de Hank ( Hanks´ balanced salt solution - HBSS)
sem cálcio e magnésio, para a remoção do sangue até que não se observou nenhuma coloração
vermelha e a membrana estava levemente rosada. Para o isolamento das células, a membrana
amniótica foi fracionada em pequenos pedaços com tesouras e pinças cirúrgicas estéreis e os
fragmentos foram então incubados a 37°C em banho maria, em tubos de centrifugação de 50
ml contendo solução de 0,05% de tripsina contendo 0,53 mM de EDTA4Na por 10 minutos.
Após esse período, foi realizada uma centrifugação a 800 rpm durante 5 minutos, sendo o
sobrenadante coletado e descartado. A membrana foi novamente incubada durante 30 minutos
nas mesmas condições, sendo o conteúdo do tubo homogeneizado a cada 10 minutos e. após
centrifugação a 800 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante foi coletado e transferido para um
32
outro tubo para obtenção das células. O pellet obtido após a centrifugação foi novamente
ressuspendido em solução de 0,05% de tripsina contendo 0,53 mM EDTA4Na, sendo
realizada uma nova incubação com coleta do sobrenadante, conforme descrito anteriormente.
O tubo que recebeu a solução sobrenadante foi centrifugado a 1500 rpm durante 10 minutos, o
pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino
fetal (SBF, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e lavado duas vezes para retirada da tripsina. Foi
feita a contagem na câmara de Neubauer e avaliação da viabilidade celular com azul de
Trypan.
Figura 6. Isolamento de CTM da membrana placentária. A) Destacamento da camada amniótica, B) Lavagem com HBSS, C) Membrana amniótica livre de sangue, D) Incubação com tripsina contendo 0,53 mM EDTA4Na, E) Pellet obtido após centrifugação e F) Visualização das CTM ao microscópio.
4.2.2. Tecido adiposo
Após o procedimento cirúrgico de lipoaspiração para retirada de tecido adiposo nas
instalações hospitalares, o material (em torno de 60 mL) foi transferido para um tubo falcon
estéril e levado ao laboratório (figura 7). No laboratório, o tecido adiposo foi lavado em salina
duas vezes por meio de centrifugação a 1000 RPM durante 5 minutos. A cada lavagem, o
sobrenadante (tecido adiposo) foi coletado e transferido para dois tubos de 50 mL perfazendo
a quantidade de aproximadamente 25 mL de material por tubo. Após a lavagem, os tubos
A B C
D E F
33
foram incubados com liberase a 2 mg/mL por 45 minutos a 37°C em banho-maria, sendo o
conteúdo homogeneizado a cada 10 minutos. Os tubos foram então centrifugados a 1500
RPM por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspendido em 30 mL de
soro glicosado, sendo realizada duas lavagens por centrifugação a 1500 RPM durante 10
minutos. Após a centrifugação a suspensão de células foi contada na câmara de Neubauer e
foi realizada a avaliação da viabilidade celular com azul de Trypan. O plaqueamento foi
realizado em meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF, Cultilab,
Campinas, SP, Brasil).
Figura 7. Isolamento de CTM do tecido adiposo. A) Lipoaspiração para retirada de tecido adiposo, B) Transferência do material para um tubo falcon estéril, C) Lavagem com salina estéril, D) Centrifugação após incubação com 2 mg/mL de liberase, E) Pellet obtido com a centrifugação e F) Ressuspensão do pellet.
4.2.3. Polpa do dente decíduo
A extração de CTM da polpa dentária foi realizada conforme ilustrado na figura 8. As
unidades marcadas na radiografia foram selecionadas para a exodontia e a cirurgia foi
realizada em duas etapas em um intervalo de 15 dias com um controle rigoroso da cadeia
asséptica. O tecido pulpar foi extraído do interior do dente com lâminas endodônticas em
fluxo laminar e acondicionado em garrafas de cultura, em meio DMEM com 10% de soro
fetal bovino e 50 μg/ml de gentamicina. Células aderentes podem ser visualizadas
inicialmente próximas ao fragmento de tecido pulpar, ocupando progressivamente a superfície
da garrafa de cultura. Após a confluência da população de células aderentes, a cultura foi
tripsinizada e uma parte das células foi separada para criopreservação.
A B C
D E F
34
Figura 8. Isolamento de CTM da polpa dentária. A) Unidades marcadas na radiografia foram selecionadas para a exodontia, B) Arcada dentária e C) Extração do tecido pulpar do interior do dente. 4.3. SELEÇÃO E EXPANSÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
Imediatamente após o isolamento das células, realizamos a seleção que consiste na
etapa de aderência ao plástico. Conforme mencionado anteriormente (Figura 2), essa etapa é
comum para todas as fontes de CTM. Cada pellet obtido no processo anterior foi
ressuspendido em meio DMEM suplementado com 10% de SBF (Cultilab, Campinas, SP,
Brasil) e as células foram plaqueadas em garrafa de cultura. O meio de cada garrafa foi
trocado após 72 horas para remoção das células não aderentes. No início da cultura, as células
possuem um forma ovalada. Após 72 horas as células-tronco mesenquimais já se encontravam
aderidas e adquiriram um formato fusiforme, semelhante ao de fibroblastos e, após
aproximadamente nove a doze dias, as culturas de CTM derivada do tecido adiposo e polpa
do dente decíduo atingem a confluência. As culturas de CTM derivadas do epitélio amniótico
possuem crescimento mais lento. Ao longo das sucessivas passagens, as células-tronco
mesenquimais aderentes foram selecionadas, enquanto que as células suspensas no meio de
cultura foram sendo descartadas.
Para a expansão das células-tronco mesenquimais foi necessário o cultivo em frascos
plásticos de cultura celular. As células que haviam atingido confluência entre 80-90% foram
lavadas duas vezes com salina estéril para retirada do meio DMEM suplementado com 10%
de SBF (Cultilab, Campinas, SP, Brasil). Após a remoção da solução salina, foi adicionado
solução de tripsina a 0,25% (Invitrogen) para que as ligações das células à matriz extracelular
fossem desfeitas permitindo o desprendimento celular. A solução de tripsina foi espalhada por
todo o frasco e o mesmo incubado na estufa a 37°C durante 2-5 minutos, para permitir a ação
enzimática. Em seguida, foi observado ao microscópio o desprendimento celular. Quando a
totalidade das células encontrava-se em suspensão, a enzima era inativada pela adição de
meio DMEM suplementado com 10% de SBF (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) ao frasco de
cultivo. O meio da garrafa contendo as células foi coletado utilizando uma pipeta, e foi
A B C
35
centrifugado a 1500 RPM por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet
ressuspendido em 1 mL de meio DMEM suplementado com 10% de SBF. As células obtidas
eram mantidas em expansão, para realização dos experimentos, ou criopreservadas.
Para a criopreservação foi respeitada a concentração máxima de 106-107 células por
tubo, sendo adicionados em cada um volume final de 1 mL, sendo 900 µL de meio DMEM
suplementado com 10% de SBF contendo as células e 100 µL de DMSO. Os tubos de
criopreservação foram então submetidos a abaixamento criostático até atingirem a
temperatura de -70°C por 24 h, e posteriormente estocados em nitrogênio líquido.
4.4. CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS 4.4.1. Coloração por Giemsa
Para a visualização da morfologia das células, CTM em cultura foram tripsinizadas e
ressuspensas em DMEM suplementado com 10% SBF. Lâminas de vidro contendo células
foram preparadas por citocentrifugação com 200 µL dessa suspensão e centrifugação a 5000
RPM, durante 5 minutos. As lamínulas foram secas e fixadas com metanol por 10 minutos a
4°C e coradas com 100 µL de solução de Giemsa (50 µL de corante em 1 mL de solução
salina) por 30 minutos. Após esse procedimento, as lâminas foram observadas ao microscópio
óptico.
4.4.2. Citometria de fluxo
As subpopulações celulares podem ser identificadas e caracterizadas por modelos de
maturação dos antígenos. As células da amostra são marcadas com anticorpos monoclonais
específicos para designar grupos de diferenciação celular (CD) ligados a fluorocromos, que
permitem a identificação e a quantificação das células pelo tamanho, granulosidade e
intensidade dos diversos fluorocromos.
36
Tabela 1. Anticorpos e seus fornecedores utilizados na citometria de fluxo. Anticorpo Fornecedor Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD90 humano FITC BD Pharmingen
Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD34 humano PE Becton Dickinson Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD54 humano PE-CY5 BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD45 humano APC BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti- CD105 humano FITC R&D Systems Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD166 humano PE BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD117 humano PE-CY5 BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD44 humano FITC BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD73 humano PE BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD31 humano FITC BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD133 humano PE MACS® Abreviações: FITC, isotiocianato de fluoresceína; PE, ficoeritrina; APC, aloficocianina; ; IgG, imunoglobulina G
As células com confluência abaixo de 100% foram tripsinizadas, conforme descrito
anteriormente. Imediatamente após o desprendimento, as células foram ressuspensas em meio
DMEM suplementado com 10% de SBF e permaneceram na estufa em repouso por 2 horas.
Após o período de repouso, as células foram lavadas com salina a 4°C or 2 vezes a 3000 rpm
por 2 minutos a 10oC e ressuspensas em 1mL de salina. Foram adicionados 200 μL da
solução em 5 tubos e em cada um deles recebeu 2 μL dos anticorpos segundo o seguinte
esquema de distribuição: tubo 1- controle, tubo 2- CD90 FITC/ CD34 PE/ CD54 PE-CY5/
CD45 APC, tubo 3- CD105 FITC/ CD166 PE/ CD117 PE-CY5/ CD45 APC, tubo 4 - CD44
FITC/ CD73 PE/ CD45 APC e tubo 5 CD31 FITC/CD133 PE/ CD45 APC. Os tubos foram
incubados a 4 oC ao abrigo da luz por 30 minutos.Os tubos foram então lavados por duas
vezes com salina a 4 oC (1 mL) por centrifugação a 2000 rpm, 10oC, durante 2 minutos. Após
esse procedimento, foi realizada a aquisição dos dados e as análises no citômetro de fluxo
FACScalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA) utilizando o programa CellQuest. Pelo
menos 50.000 eventos foram coletados e analisados.
37
4.4.3. Análise qualitativa da expressão do Oct-4 por RT-PCR.
A extração de RNA foi realizada com o Rneasy® Mini Kit (Qiagen, EUA), com
pequenas modificações do protocolo recomendado pelo fabricante.
As células foram tripsinizadas e, após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado.
Ao tubo falcon contendo o pellet de células, foram adicionados 700 µl de tampão RLT e
homogeneizado por agitação em vórtex durante um minuto. Foram adicionados 700 µl de
etanol 70% preparado com água DEPC, e o conteúdo foi homogeneizado imediatamente com
uma pipeta. Foram adicionados 1.400 µl da amostra na minicoluna acoplada ao tubo coletor
de 2 mL presente no Kit e realizada uma centrifugação por 30 segundos a 10.000 RPM. O
conteúdo do tubo coletor foi descartado e foram adicionados 350 µl de tampão RW1 na
coluna e centrifugado por 30 segundos a 10.000 RPM sendo esse procedimento repetido duas
vezes. A coluna foi transferida para um novo tubo de 2 ml e 500 µl de tampão RPE foram
adicionados à coluna e o tampão no tubo com a coluna foram centrifugados por 30 segundos a
10.000 RPM, sendo o conteúdo do tubo coletor descartado após o processo. Quantidade
adicional de 500 µl de tampão RPE foi adicionado a coluna e centrifugado por 2 minutos a
10.000 RPM para secagem da membrana de gel-sílica. A coluna foi então removida para um
tubo de 1,5 mL e foram adicionados 40 µl de água livre de Rnases diretamente na membrana
gel-sílica, seguido de centrifugação por 5 minutos a 10.000 RPM. Após esse procedimento, a
coluna foi descartada. O RNA foi eluído em água livre de Rnases e a quantificação e o grau
de pureza do RNA foram determinados por espectofotometria utilizando o instrumento
Nanodrop (ND-1000, NanoDrop Technologies, EUA).
Para o preparo do RNA, foram adicionados em um tubo de 0,5 mL 1µg de RNA 1 µl
10X DNase I Reaction Buffer (Invitrogen), 1 µl Dnase I, Amp. Grade 1 U/µl (Invitrogen) e
água DEPC para completar o volume de 10 µl. Os tubos permanecem à temperatura ambiente
por 15 minutos e 1 µl de EDTA 25 mM (Invitrogen) é adicionado para inativação da Dnase.
Segue-se um aquecimento por 10 minutos a 65°C no Thermomix (Eppendorf, Germany) e,
após esse período as amostras permanecem em gelo até o início da transcrição reversa.
No banho de gelo, em um tubo de 0,65 mL autoclavado, foi adicionado 1 µl de Oligo
(dT)12-18 (Invitrogen), 10 µl da solução de RNA tratado com Dnase (Invitrogen) , 1 µl dNTP
10mM (Invitrogen) . O mix foi aquecido por 5 minutos a 70°C e quando a reação acabou o
tubo foi rapidamente colocado no gelo. Logo em seguida, o tubo foi centrifugado e foram
adicionados 4 µl do primeiro tampão 5x concentrado (Invitrogen) e 2 µl DTT 0,1 M
(Invitrogen), sendo o volume homogenizado cuidadosamente com a pipeta e incubado por 2
38
minutos a 42°C. Após a incubação, foi adicionado 1 µl da SuperScript II (Invitrogen) e
homogeneizado cuidadosamente com a pipeta. A mistura foi, então, incubada por 2h a 42°C e
logo em seguida por 15 minutos a 70°C. Após a síntese, as amostras foram mantidas
congeladas no freezer a -70°C para posterior realização da reação.
A reação da polimerase em cadeia para amplificação dos genes da β-actina e Oct-4
continham 1 µL do mix deoxinucleosídeo trifosfato (10 mM de cada dNTP), 2 µL com 20
pmol de cada primer; 0,5 µl (5 IU/µL) de Taq polimerase recombinante (Invitrogen, Carlsbad,
CA), 2 µL contendo 50 mM MgCl2 e 3 µL de DNA total em 50 µL da solução de reação. A
temperatura de anelamento da reação de PCR consistiu de 58°C para Oct-4 e 56°C para β-
actina durante 45 segundos. O tamanho do produto esperado foi de 150 e 103 pares de base
respectivamente. Os produtos de PCR foram visualizados com brometo de etídeo em gel de
agarose a 1.5% submetido à eletroforese (110V, 1 hora). A sequência de primers encontra-se
listada na tabela 3.
Tabela 2. Primers empregadas na reação de PCR.
Gene Primer senso Primer anti-senso Oct-4 GAGGAGTCCCAGGACATCAA GATGGTCGTTTGGCTGAACACCTT
β-actina AGGCATCCTCACCCTGAAGTA CACACGCAGCTCATTGTAGA
4.4.4. Diferenciação osteogênica
As células foram cultivadas em placa de seis poços, em meio DMEM suplementado
com 10% de soro bovino fetal até atingirem 100% de confluência. Em seguida, as células
foram estimuladas, por até quatro semanas, com meio DMEM modificado contendo 10% de
soro bovino fetal, 100 nM dexametasona (Sigma- Aldrich), 0,05 de mM L-ácido ascórbico 2-
fosfato (Sigma- Aldrich) e 10 mM de β-glicerofosfato (Sigma - Aldrich). Em todos os
experimentos foi mantido um grupo controle cultivado em meio DMEM suplementado com
10% de soro bovino fetal (SBF, Cultilab, Campinas, SP, Brasil). O meio das culturas era
trocado a cada dois dias.
A evolução da diferenciação foi acompanhada diariamente através do microscópio
ZEISS, modelo axiovert 25. A deposição de cálcio foi observada através da coloração com
Alzarin Red S (Sigma-Aldrich). Para isso, foi feita a lavagem da cultura com PBS, fixação
39
com paraformaldeído (PFA) 4% (Electron Microscopy Sciences) durante 15 minutos,
aplicação do Alzarin Red S por 5 minutos e, por último, a lavagem com água destilada para
remoção de resíduos.
4.4.5. Diferenciação adipogênica
As células foram cultivadas em placa de seis poços, em meio DMEM suplementado
com 10% de soro bovino fetal até atingirem 100% de confluência. Em seguida foram
estimuladas, por até quatro semanas, com meio DMEM modificado contendo: 10% de soro
bovino fetal, 60 µM de indometacina (Sigma – Aldrich), 0,5 de µM isobutilmetilxantina
(Sigma – Aldrich) e 0,5 µM de hidrocortisona (Sigma – Aldrich). Em todos os experimentos
foi mantido um grupo controle cultivado em meio DMEM suplementado com 10% de soro
bovino fetal. O meio de cultura era trocado a cada dois dias.
A evolução da diferenciação foi acompanhada diariamente em microscópio invertido.
Para observar a deposição de gordura, os poços foram lavados com PBS, as células foram
fixadas com PFA 4% durante 1 hora à temperatura ambiente e coradas com solução de Oil
Red (Sigma – Aldrich) (3 volumes de 3,75% Oil Red O em isopropanol e 3 volumes de água
destilada) por 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de lavagem com água destilada para
remoção de resíduos.
4.5. ESTABILIDADE CITOGENÉTICA
As CTM, após extração e isolamento na segunda, quinta e décima passagens foram
cultivadas em meio Minimum Essential Medium (MEM) Alpha suplementado com 10% de
soro fetal bovino (Gibco), 1% de glutamina (200 mM) (Gibco) e 1% de gentamincina (Gibco)
(BARCH et al., 1997). Células em divisão celular ativa foram bloqueadas na metáfase por
colcemida a 0,1 µg/mL (Gibco) destacadas da superfície de crescimento com tripsina a 0,25%
(Gibco) e subsequentemente infladas pela exposição a solução hipotônica de KCl a 0,057 M
(Merck). As células foram fixadas em solução 3:1 de metanol e ácido acético. A análise
citogenética dos cromossomas metafásicos foi realizada pelo bandeamento GTG (Sanchez et
al., 1973) e as imagens foram capturadas no microscópio BX60 (Olympus), com o programa
ImagePro Plus.
40
5 RESULTADOS_______________________________________________________
5.1. ANÁLISE QUALITATIVA DAS CTM DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO,
TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO.
Uma avaliação da etapa de extração e rendimento após o isolamento das células
estromais foi realizada para se determinar qual fonte possibilita a obtenção do maior número
de células aderentes. O procedimento com menor número de etapas é o de extração de CTM
da polpa de dente decíduo, seguido pelo tecido adiposo, e o mais trabalhoso a extração de
células do epitélio amniótico. Foi observado que a capacidade proliferativa das CTM varia de
acordo com a sua origem. O processo de isolamento das CTM do epitélio amniótico fornece
uma pequena quantidade de células, após grande número de etapas de isolamento, com
reduzida capacidade proliferativa. Essa característica inviabilizou a continuidade dos estudos
com essa fonte de células. A excelente capacidade proliferativa das CTM derivadas da polpa
de dente decíduo, aliada à facilidade de isolamento, suplanta a baixa quantidade de células
obtidas por procedimento devido à pequena quantidade de tecido disponível para isolamento
das células. As CTM derivadas do tecido adiposo apresentam um alto potencial proliferativo,
e o seu processo de isolamento é fácil e de bom rendimento devido à facilidade de se obter
boas quantidades de material lipoaspirado e pela riqueza de células estromais do tecido
adiposo. O tecido adiposo fornece o maior número de células por extração, enquanto a polpa
de dente decíduo fornece o menor número.
5.2 SELEÇÃO DE CTM ADERENTES
Após o processo de isolamento e início do cultivo celular, as células estromais
aderentes obtidas das diferentes fontes adquiriram um padrão morfológico semelhante.
Podemos observar as células com formato oval no momento da semeadura (Figuras 9A, 10A
e 11A), com formato fibroblastóide após 12 horas de cultivo (Figuras 9B, 10B, 11B) e quando
a confluência da cultura foi atingida (Figuras 9C, 10C, 11C) , a partir das três fontes de
células estudadas.
A liberação das células no plástico de cultura foi realizado através do tratamento com
tripsina, no momento em que a cultura atingiu a confluência. O EDTA também foi testado,
mas não foi eficiente, provocando o desprendimento de um aglomerado de células que não se
dissociavam facilmente e que não se aderiam na garrafa subseqüentemente.
41
Figura 9. Cultura de CTM aderentes provenientes do tecido adiposo. A) Células no momento da semeadura, B) Células com característica fibroblastóide, após 72 horas de cultivo, C) Cultura de células confluentes.
Figura 10. Cultura de CTM aderentes provenientes da polpa de dente decíduo. A) Células no momento da semeadura, B) Células com característica fibroblastóide, após 72 horas de cultivo, C) Cultura de células confluentes.
Figura 11. Cultura de CTM aderentes provenientes do epitélio amniótico. A) Células no momento da semeadura, B) Células com característica fibroblastóide, após 72 horas de cultivo, C) Cultura de células confluentes.
42
5.3 MORFOLOGIA DE CTM DERIVADAS DO TECIDO ADIPOSO E DA POLPA DE
DENTE DECÍDUO
Para a melhor visualização da morfologia celular foi empregada a técnica de coloração
das células com solução de Giemsa. CTM de tecido adiposo e polpa de dente decíduo foram
cultivadas em placas de cultura contendo lamínulas de vidro no fundo dos poços. Após a
coloração com Giemsa e montagem em lâminas as células foram observadas ao microscópio
óptico e fotografadas. Nota-se que a morfologia das células-tronco mesenquimais derivadas
do tecido adiposo e polpa de dente decíduo é muito semelhante. Ambas apresentam formato
fibroblastóide com núcleo volumoso, independente do tecido de origem (Figuras 12 A, B).
Essa morfologia também foi observada em CTM derivadas do epitélio amniótico (dados não
mostrados).
Figura 12. Micrografias de culturas de CTM. A) CTM provenientes da polpa de dente decíduo decíduo humana, B) CTM provenientes do tecido adiposo humano. Coloração de Giemsa, aumento de 60X.
43
5.4 MARCADORES DE SUPERFÍCIE – CITOMETRIA DE FLUXO
A expressão de marcadores de superfície característicos de CTM também foi
investigada por citometria de fluxo, que permite a análise da porcentagem de células
expressando um determinado marcador, assim como da intensidade de marcação em cada
célula. Dois experimentos independentes foram realizados para cada passagem das culturas de
CTM derivada do tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Um experimento foi realizado
para cultura de CTM derivada do epitélio amniótico.
Cultura de CTM derivadas do epitélio amniótico humano
As análises de CTM derivadas do epitélio amniótico realizadas por citometria de fluxo
revelaram uma cultura relativamente homogênea, em que aproximadamente 70% das células
expressavam CD105 (Figura 13 e Tabela 3).
Figura 13. Análise de CTM do epitélio amniótico na 10a passagem de cultura in vitro. Análises realizadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos anti-CD90, CD117, CD73, CD105, CD54, CD45 e CD34 conjugados a fluorocromos. A linha cheia corresponde ao controle e a linha vazia corresponde à expressão do antígeno.
CD90 CD117 CD73
CD105 CD54 CD45
CD34
CD90 CD117 CD73
CD105 CD54 CD45
CD34
44
Tabela 3. Análise por citometria de fluxo de CTM do epitélio amniótico na 10a passagem de cultura in vitro.
CTM derivadas do epitélio amniótico MARCADOR P10 (%) CD90 28,83 CD117 13,97 CD73 0,17 CD105 70,02 CD54 1,10 CD45 0,0 CD34 0,16 Cultura de CTM derivada do tecido adiposo humano
A cultura de CTM derivadas do tecido adiposo humano se mostrou uma população
heterogênea fenotipicamente. Apenas uma pequena porcentagem do número total de células
aderentes apresentou marcadores de superfície atribuídos a CTM. Essas células estavam
localizadas na região direita superior do dot-plot para FSCxSSC, correspondendo às células
de maior tamanho e granulosidade. Portanto, as células desta região, que contém menos de
2% dos eventos positivos, foram analisadas (Figuras 14A e 15A). A análise da região descrita
revelou uma alta frequência (maior do que 90%) de expressão de antígenos característicos de
CTM (CD166, CD105, CD90, CD73 e CD54) na quarta passagem (Figura 14). Também
nesta passagem observou-se uma alta porcentagem de expressão de um antígeno característico
de células da linhagem hematopoiética, o CD45 (Figuras 14B e 14C).
A expressão de antígenos de superfície relacionados à CTM, na população de maior
tamanho e granulosidade, aumentou da quarta para a décima passagem. Além disso, na
décima passagem observou-se uma diminuição na expressão de CD45 e aumento de CD133 e
CD44, marcadores expressos em mais de 90% das células desta região (Figuras 15B e 15C).
A figura 16 permite uma melhor visualização das alterações na expressão de antígenos de
superfície entre a 4° e 10° passagens.
45
Figura 14. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo na 4° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD31, CD90, CD34, CD117, CD54, CD73, CD44, CD133, CD45, CD105 e CD166 em células da região de maior tamanho e granulosidade.
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CTR.001FSC-Height ->
A B
FSC
SSC
C
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CTR.001FSC-Height ->
A B
FSC
SSC
C
46
Figura 15. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo na 10° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD105, CD34, CD45, CD166, CD90, CD31, CD133, CD44, CD73, CD54 e CD117 em células da região de maior tamanho e granulosidade.
B
10 10 10 10 100 1 2 3 4
FL3 H i ht10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105 CD34Controle CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD166 CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD117
C
10 10 10 10 100 1 2 3 4
31FITC/133PE/45APC.006FSC-Height ->
A
SSC
FSC85,43±10,433,79±3,03CD54
35,53±1,150,27±0,09CD117
95,19±4,811,42±0,45CD90
95,31±3,010,86±0,45CD44
95,73±4,261,88±0,45CD73
92,98±7,020,92±0,21CD31
4,88±1,790,15±0,05CD45
99,68±0,321,02±0,23CD133
26,55±13,440,27±0,10CD34
98,29±1,411,03±0,38CD166
99,78±0,221,02±0,4CD105
RegiãoTotal
85,43±10,433,79±3,03CD54
35,53±1,150,27±0,09CD117
95,19±4,811,42±0,45CD90
95,31±3,010,86±0,45CD44
95,73±4,261,88±0,45CD73
92,98±7,020,92±0,21CD31
4,88±1,790,15±0,05CD45
99,68±0,321,02±0,23CD133
26,55±13,440,27±0,10CD34
98,29±1,411,03±0,38CD166
99,78±0,221,02±0,4CD105
RegiãoTotal
B
10 10 10 10 100 1 2 3 4
FL3 H i ht10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105 CD34Controle CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD166 CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD117
FL3 H i ht10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105 CD34Controle CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD166 CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD117
C
10 10 10 10 100 1 2 3 4
31FITC/133PE/45APC.006FSC-Height ->
A
SSC
FSC10 10 10 10 100 1 2 3 4
31FITC/133PE/45APC.006FSC-Height ->
A
SSC
FSC
A
SSC
FSC85,43±10,433,79±3,03CD54
35,53±1,150,27±0,09CD117
95,19±4,811,42±0,45CD90
95,31±3,010,86±0,45CD44
95,73±4,261,88±0,45CD73
92,98±7,020,92±0,21CD31
4,88±1,790,15±0,05CD45
99,68±0,321,02±0,23CD133
26,55±13,440,27±0,10CD34
98,29±1,411,03±0,38CD166
99,78±0,221,02±0,4CD105
RegiãoTotal
85,43±10,433,79±3,03CD54
35,53±1,150,27±0,09CD117
95,19±4,811,42±0,45CD90
95,31±3,010,86±0,45CD44
95,73±4,261,88±0,45CD73
92,98±7,020,92±0,21CD31
4,88±1,790,15±0,05CD45
99,68±0,321,02±0,23CD133
26,55±13,440,27±0,10CD34
98,29±1,411,03±0,38CD166
99,78±0,221,02±0,4CD105
RegiãoTotal
47
0
20
40
60
80
100
120
CD166
CD45CD34
CD105
CD133
CD31CD73
CD44CD90
CD117
CD54
Expr
essã
o (%
)P4P10
Figura 16. Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície característicos de CTM. Análise por citometria de fluxo de culturas in vitro de 4° e 10° passagens de células-tronco mesenquimais obtidas do tecido adiposo na região de maior tamanho e granulosidade marcadas com anticorpos anti-CD166, CD45, CD34, CD105, CD133, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54. Valores representam as médias±SD de duas determinações. Cultura de CTM derivada da polpa de dente decíduo humano
A cultura de CTM derivada da polpa de dente decíduo se mostrou uma população
bastante heterogênea, com baixos níveis de expressão dos antígenos analisados. Apenas uma
pequena porcentagem do número total de células aderentes apresentou marcadores de
superfície atribuídos a CTM. Assim como na cultura de CTM derivada do tecido adiposo,
essas células também estavam localizadas na região direita superior do dot-plot para
FSCxSSC e, portanto, uma região de análise contendo menos de 2,0 % dos eventos positivos
foi estabelecida (Figuras 17A e 18A). Não foi identificada a expressão de CD45 em nenhuma
das passagens das células da polpa de dente decíduo. Os antígenos de superfície que
apresentaram maior expressão na quarta passagem foram o CD105 e o CD90 (Figuras 17B e
17C).
Na décima passagem observou-se uma diminuição da expressão de CD34 e também de
outros antígenos, tais como CD166, CD105, CD44 e CD90, enquanto CD31, CD73, CD117 e
CD54 apresentaram um aumento da sua expressão na região de maior tamanho e
granulosidade. Os antígenos de superfície que apresentaram maior expressão nesta passagem
foram o CD105 e o CD73 (Figuras 18B e 18C). A figura 19 permite uma melhor visualização
das alterações na expressão de antígenos de superfície entre a 4° e 10° passagens.
48
Figura 17. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente decíduo na 4° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD117, CD166, CD45, CD105, CD44, CD73, CD90, CD34, CD54, CD31 e CD133 em células da região de maior tamanho e granulosidade.
B
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
7,72±3,540,98±0,91CD54
10,63±1,630,5±0,31CD117
56,34±8,162,54±0,56CD90
29,17±6,150,33±0,33CD44
41,56±9,193,15±0,16CD73
14,32±0,560CD31
0,24±0,240CD45
25,73±8,270,26±0,26CD133
8,99±5,810CD34
32±2,00,02±0,02CD166
53,24±19,240,06±0,06CD105
RegiãoTotal
7,72±3,540,98±0,91CD54
10,63±1,630,5±0,31CD117
56,34±8,162,54±0,56CD90
29,17±6,150,33±0,33CD44
41,56±9,193,15±0,16CD73
14,32±0,560CD31
0,24±0,240CD45
25,73±8,270,26±0,26CD133
8,99±5,810CD34
32±2,00,02±0,02CD166
53,24±19,240,06±0,06CD105
RegiãoTotal
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 CD54 CD31 CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD117
B
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
7,72±3,540,98±0,91CD54
10,63±1,630,5±0,31CD117
56,34±8,162,54±0,56CD90
29,17±6,150,33±0,33CD44
41,56±9,193,15±0,16CD73
14,32±0,560CD31
0,24±0,240CD45
25,73±8,270,26±0,26CD133
8,99±5,810CD34
32±2,00,02±0,02CD166
53,24±19,240,06±0,06CD105
RegiãoTotal
7,72±3,540,98±0,91CD54
10,63±1,630,5±0,31CD117
56,34±8,162,54±0,56CD90
29,17±6,150,33±0,33CD44
41,56±9,193,15±0,16CD73
14,32±0,560CD31
0,24±0,240CD45
25,73±8,270,26±0,26CD133
8,99±5,810CD34
32±2,00,02±0,02CD166
53,24±19,240,06±0,06CD105
RegiãoTotal
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 CD54 CD31 CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD117
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
7,72±3,540,98±0,91CD54
10,63±1,630,5±0,31CD117
56,34±8,162,54±0,56CD90
29,17±6,150,33±0,33CD44
41,56±9,193,15±0,16CD73
14,32±0,560CD31
0,24±0,240CD45
25,73±8,270,26±0,26CD133
8,99±5,810CD34
32±2,00,02±0,02CD166
53,24±19,240,06±0,06CD105
RegiãoTotal
7,72±3,540,98±0,91CD54
10,63±1,630,5±0,31CD117
56,34±8,162,54±0,56CD90
29,17±6,150,33±0,33CD44
41,56±9,193,15±0,16CD73
14,32±0,560CD31
0,24±0,240CD45
25,73±8,270,26±0,26CD133
8,99±5,810CD34
32±2,00,02±0,02CD166
53,24±19,240,06±0,06CD105
RegiãoTotal
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 CD54 CD31 CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD117
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 CD54 CD31 CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 CD54 CD31 CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 CD54 CD31 CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD105
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD117
49
Figura 18. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente decíduo na 10° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD105, CD117, CD166, CD133, CD31, CD73 CD45, , CD44 , CD90, CD54 e CD34 em células da região de maior tamanho e granulosidade.
C
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD105 CD117 CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90 CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34
CD73
B
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
C
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD105 CD117 CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90 CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34
CD73
B
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD105 CD117 CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90 CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD105 CD117 CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90 CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34
CD73
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD133
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Controle CD105 CD117 CD166
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD31
10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD45
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD44
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD90 CD54
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34
CD73
B
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
B
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
15,21±9,430,44±0,14CD54
17,43±1,131,26±0,77CD117
37,65±2,343,71±0,36CD90
8,8±4,870,06±0,06CD44
66,08±8,229,23±0,67CD73
22,05±16,950,04±0,04CD31
00CD45
13,05±3,471,06±0,97CD133
6,24±0,170CD34
19,94±0,060,74±0,36CD166
45,14±2,240,21±0,1CD105
RegiãoTotal
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
10 10 10 10 100 1 2 3 4
A
FSC
SSC
A
FSC
SSC
50
01020304050607080
CD166
CD45CD34
CD105
CD133
CD31CD73
CD44CD90
CD117
CD54
Expr
essã
o (%
)P4P10
Figura 19. Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície característicos de CTM. Análise por citometria de fluxo de culturas in vitro de 4° e 10° passagens de células-tronco mesenquimais obtidas da polpa de dente decíduo na região de maior tamanho e granulosidade marcadas com anticorpos anti-CD166, CD45, CD34, CD105, CD133, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54. Valores representam as médias±SD de duas determinações. 5.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA
O produto obtido pela reação de RT-PCR possuía uma banda única com tamanho específico e compatível com o marcador utilizado. Foi investigada a expressão do fator de transcrição Oct-4 nas culturas de CTM derivadas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Três experimentos independentes foram realizados para cada cultura de células. A 1a, a 10a e a 16a passagens da cultura de CTM derivadas do tecido adiposo foram analisadas. A 1a e a 10a passagens da cultura de CTM derivadas da polpa de dente decíduo foram analisadas. Em todas as culturas foi observada a presença de mRNA para Oct-4 (Figura 20).
Figura 20. RT-PCR de culturas de CTM provenientes do tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Eletroforese em gel de agarose para visualização dos produtos de amplificação para β-actina e Oct-4 nas culturas de CTM derivadas de tecido adiposo na primeira (1); décima (5) e décima-sexta (2) passagens e nas culturas de CTM derivada da polpa de dente decíduo na primeira (3) e décima (4) passagens.
1 2 3 4 5
51
5.6 DIFERENCIAÇÃO INDUZIDA
A capacidade de diferenciação das CTM de tecido adiposo e da polpa de dente decíduo
em osteócitos e adipócitos foi investigada. Culturas de CTM em meio suplementado com
fatores indutores de diferenciação específicos foram acompanhadas e analisadas.
Confirmação qualitativa de plasticidade
Culturas de CTM derivadas da polpa de dente decíduo e tecido adiposo, ambas na
terceira passagem, apresentaram diferenciação in vitro nas linhagens adipogênica e
osteogênica. Todas as culturas que apresentaram acúmulo intracelular lipídico marcado com o
corante Oil Red O foram consideradas positivas para diferenciação adipogênica. Após 10 dias
de cultura em contato com o coquetel indutivo adipogênico, gotículas lipídicas foram
identificadas em todas as culturas de CTM derivadas do tecido adiposo (Figura 21). Culturas
de CTM derivadas da polpa de dente decíduo apresentaram as mesmas gotículas, porém bem
menores e mais dispersas, após duas semanas (dados não mostrados). A diferenciação
osteogênica foi considerada positiva quando houve a formação de espículas que se coravam
após o tratamento com Alizarin Red S. Após aproximadamente dez dias de cultura em contato
com o coquetel indutivo osteogênico, foram identificadas espículas em todas as culturas de
CTM derivadas do tecido adiposo (Figura 22). Culturas de CTM derivadas da polpa de dente
decíduo apresentaram as mesmas formações, mas que foram visíveis apenas após três
semanas de indução (Figura 23). Independente da diferença entre os tempos em que se
identificou a presença de gotículas lipídicas ou espículas, todas as culturas foram coradas com
seus respectivos protocolos após 21 dias de cultura, para efeito de comparação. Culturas
controle também foram coradas para confirmar que não houve diferenciação espontânea.
52
Figura 21. Diferenciação adipogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. As células de tecido adiposo de culturas na 3a passagem foram submetidas ao protocolo de indução de diferenciação adipogênica por 21 dias, quando o material foi preparado para análise. A, Cultura após 21 dias de indução, onde podem ser observadas gotículas lipídicas intracelulares por microscopia óptica com contraste de fase. B, Cultura após 21 dias de diferenciação adipogênica marcada com o corante Oil Red O. C, Cultura sem indução adipogênica. Aumento de 40X.
Figura 22. Diferenciação osteogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. As células de tecido adiposo de culturas na 3a passagem foram submetidas ao protocolo de indução de diferenciação osteogênica por 21 dias, quando o material foi preparado para análise. A, Cultura em meio de indução de diferenciação observada por microscopia óptica com contraste de fase. B, Cultura após 21 dias de diferenciação osteogênica, onde pode-se visualizar a presença de depósitos de cálcio pela marcação com Alizarin Red S. C, Cultura sem indução osteogênica. Aumento de 40X.
Figura 23. Diferenciação osteogênica de CTM derivadas da polpa de dente decíduo. As células da polpa de dente decíduo de culturas na 3a passagem foram submetidas ao protocolo de indução de diferenciação osteogênica. A, Cultura após 21 dias de indução, observadas por microscopia óptica com contraste de fase B, Cultura após 21 dias de diferenciação osteogênica com detecção de depósitos de cálcio pela marcação com Alizarin Red S. C, Cultura sem indução osteogênica. Aumento de 40X para as fotos Ae C e 60X para a foto B.
53
5.7 ESTABILIDADE CITOGENÉTICA
Análise cariotípica
Culturas de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo e polpa de dente
decíduo foram analisadas durante a 2a, a 5a e a 10a passagens. A análise cariotípica de
bandeamento G mostrou que houve a manutenção do cariótipo diplóide com o cultivo das
CTM. Anormalidades estruturais cromossômicas, tais como translocação, inversão e deleção,
não foram observadas com essa técnica (Figuras 24-27). Nas culturas de CTM derivadas do
tecido adiposo de um doador do sexo feminino na 2a (Figura 24) e 10a passagens observamos
um cariótipo diplóide normal (46, XX) (Figuras 25 e 26). Da mesma forma, observamos um
cariótipo diplóide normal (46, XY) na cultura de CTM derivadas da polpa de dente decíduo
de doador do sexo masculino na 5a (Figura 27A) e 10a passagens (Figura 27B). As culturas de
CTM derivadas do tecido adiposo na 5a passagem, assim como da polpa de dente decíduo na
2a passagem, também apresentaram cariótipo diplóide normal (dados não mostrados).
Uma cultura de CTM derivada do tecido adiposo na 20a passagem foi analisada
empregando-se a mesma metodologia descrita anteriormente. Metáfase poliplóide, cariótipo
de 85 cromossomos com arranjos não identificados e associações teloméricas complexas com
considerável instabilidade cromossômica foram identificadas (Figura 28).
54
Figura 24. Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo in vitro na 2a passagem. Nas micrografias A e B observa-se cariótipo normal 46, XX.
Figura 25. Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo in vitro na 10a passagem. Nas micrografias A e B observa-se cariótipo normal 46, XX.
A B
BA B
55
Figura 26. Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM derivada do tecido adiposo. A, Amostras cromossômicas de cultura de CTM na 10a passagem derivada de tecido adiposo de doador do sexo feminino. B, Micrografia reorganizada representando a décima passagem de cultura de CTM proveniente do mesmo doador, evidenciando um cariótipo diplóide normal (46 XX). Figura 27. Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM derivada da polpa de dente decíduo. Amostras cromossômicas de cultura de CTM derivada da polpa de dente decíduo de paciente do sexo masculino. Cultura de 5a (A) e 10a (B) passagens do mesmo doador, evidenciando um cariótipo diplóide normal (46 XY).
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5
21 22 XX
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5
21 22 XX
B
B
A
A
56
Figura 28. Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo in vitro na 20a passagem. A) Metáfase poliplóide, B) Cariótipo de 85 cromossomos com rearranjos não identificados, C) Associações teloméricas complexas com evidência de considerável instabilidade cromossômica, D) Metáfase poliplóide, E) 81 cromossomos, F) Cariótipo: 43,XX,-4,del(12)(p11→pter),-15,-16,-17,-22,+r1,+mar1.
A
D
B
C
E F
D
57
6 DISCUSSÃO ______________________________________________________________________
As CTM representam atualmente uma fonte potencial de células para utilização na
área de terapia celular devido à sua capacidade de auto-renovação e diferenciação em células
especializadas do corpo humano (DAN et al., 2008). O epitélio amniótico (MIKI et al., 2005),
o tecido adiposo (ZUK et al., 2001) e a polpa dentária (GRONTHOS et al., 2002) são fontes
accessíveis de CTM. Os processos de coleta destas células apresentaram vantagens em relação
às CTM derivadas da medula óssea, por serem derivadas de tecidos normalmente descartados
(epitélio amniótico e polpa dentária) ou presentes em abundância no organismo (tecido
adiposo). Para se investigar as similaridades e diferenças existentes entre as CTM dessas
possíveis fontes de obtenção mencionadas, foi realizada uma avaliação da eficiência de
isolamento, indução de diferenciação das culturas obtidas em linhagem adipogênica e
osteogência, análise da expressão dos antígenos de superfície, acompanhamento da
manutenção da expressão do fator de transcrição Oct-4 e estabilidade citogenética após
expansão in vitro. O conhecimento dessas características poderá ajudar a definir a melhor
fonte de células a serem utilizadas e a sua correlação com o sucesso da sua aplicação em
terapia celular.
Eficiência de isolamento
O tecido adiposo fornece o maior número de células por extração, enquanto a polpa de
dente decíduo fornece o menor número. Foi relatado que a quantidade de células por grama
presente no tecido adiposo pode ser cerca de cinco vezes maior do que a quantidade obtida
por mililitro extraído da medula óssea (STREM et al., 2005). Apesar de a polpa de dente
decíduo ser a fonte onde se obtém o menor número de CTM pela reduzida quantidade de
tecido, a capacidade proliferativa das CTM obtidas desta fonte é tão boa quanto aquela
observada nas células isoladas do tecido adiposo. As células isoladas do epitélio amniótico
possuem uma reduzida capacidade proliferativa, apesar de se obter um número considerável
de células por procedimento. O lento crescimento dessas células e baixa eficiência de extração
também foram observados por outros autores (BILIC et al 2008). Tal característica, aliada à
dificuldade na etapa de extração inviabilizou a utilização dessas células no estudo. Talvez isso
explique o reduzido número de trabalhos nos últimos anos utilizando células provenientes
dessa fonte, em contraste com as publicações utilizando células provenientes do tecido
adiposo e até mesmo polpa dentária.
58
O tempo entre coleta e isolamento, a baixa freqüência de CTM nesse tecido em
comparação com os outros e o crescimento lento, dificultando a expansão e estabelecimento
da cultura, podem ser fatores que contribuem para o insucesso na expansão de CTM de
epitélio amniótico. A dificuldade no estabelecimento da cultura também foi relatada
anteriormente (BILIC et al 2008). No entanto, uma vez que o processo se inicia, observamos
que as células podem ser mantidas por várias passagens. Assim como reportado por outros
autores (REBELATTO et al., 2008; GRONTHOS et al., 2002), não foi observada diferença
morfológica entre as fontes pesquisadas e todas as culturas possuíam formato fibroblastóide
característico de CTM, tanto nas passagens recentes quanto nas mais avançadas.
Marcadores de superfície
As culturas de CTM derivadas do epitélio amniótico foram submetidas à análise por
citometria de fluxo e o perfil de expressão de antígenos de superfície foi condizente com o
descrito na literatura: positivo para CD90 e CD105 e negativo para CD45 e CD34
(PAROLINI et al., 2008).
Passagens recentes e avançadas de culturas de CTM derivadas de tecido adiposo e
polpa dentária foram analisadas por citometria de fluxo. Nenhum dos marcadores analisados é
específico de CTM e existem relatos conflitantes na literatura à respeito da sua expressão em
culturas de CTM. A expressão de CD34, por exemplo, é controversa em culturas de CTM
derivadas do tecido adiposo. Alguns autores reportam pouca ou nenhuma expressão (ZUK et
al., 2002; DE UGARTE et al., 2003), enquanto que outros relatam altos níveis de expressão
deste marcador (VARMA et al 2007; MITCHELL et al 2006). As variações encontradas na
literatura talvez possam estar relacionadas a diferentes técnicas de análise por citometria de
fluxo, procedimento de extração empregado e até mesmo escolha do soro na cultura (ASTORI
et al 2007; SHAHDADFAR et al 2005). Em nossos estudos detectamos a expressão de CD34
quando a cultura de células foi analisada por citometria de fluxo. Também identificamos uma
população heterogênea comparável a relatos anteriores (ASTORI et al 2007). A grande
heterogeneidade encontrada leva alguns autores a afirmar que não se estabelece uma cultura
de CTM, mas sim uma cultura de células onde estão presentes CTM que possuem
heterogeneidade, inclusive no que diz respeito à sua capacidade de renovação e
multipotencialidade (BIANCO 2001; DOCHEVA 2006). Observamos que, ao longo da
expansão in vitro das culturas de CTM derivadas do tecido adiposo, ocorre uma diminuição
da expressão de CD45 e o aumento de expressão do conjunto de moléculas que caracterizam
59
CTM, ao compararmos a 4a e 10a passagens. As mudanças de expressão ao longo da expansão
in vitro podem ser decorrentes de uma flutuação dinâmica entre um tipo de célula mais
diferenciado e outro mais característico de célula-tronco indiferenciada, hipótese essa já
previamente especulada (KURTZ 2008).
As culturas de CTM derivadas da polpa dentária apresentaram o mesmo padrão de
heterogeneidade observado nas culturas de CTM derivadas do tecido adiposo. Distintas
populações de células-tronco já foram isoladas por separação com bolinhas magnéticas
(WADDINGTON et al 2009). Em muitos trabalhos encontrados na literatura observam-se
etapas de purificação da população celular estabelecida em culturas de CTM derivadas de
polpa dentária através de seleção por anticorpos contra marcadores como STRO-1 (SHI and
GRONTHOS 2003) e cKit, CD34, STRO-1 (LAINO et al 2006). Esses dados corroboram o
fato de que as culturas de CTM derivadas da polpa de dente decíduo por nós obtidas
apresentaram um padrão heterogêneo após o isolamento.
Diferenciação induzida
As culturas de CTM derivadas de tecido adiposo e polpa dentária se diferenciaram em
células das linhagens adipogênica e osteogênica quando submetidas a protocolos indutores
descritos na literatura (JONES et al., 2002). Para a confirmação da plasticidade foram
utilizados métodos padrão de análise qualitativa, onde observamos que as culturas de CTM
derivadas da polpa dentária produziram pequenas e esparsas gotículas lipídicas quando
comparadas às culturas de CTM derivada do tecido adiposo. Isso impossibilitou a coloração
pelo método clássico onde se utiliza o corante Oil Red O. Apesar de as duas culturas terem
apresentado diferenciação osteogênica, houve diferença em relação ao tempo necessário para
aparecimento dos primeiros nódulos. Enquanto nas culturas de CTM derivadas do tecido
adiposo os nódulos puderam ser visualizados a partir do décimo dia, nas culturas de CTM
derivadas da polpa dentária isso só foi possível após 3 semanas. Esta diferença observada nos
testes de diferenciação induzida sugere que as populações celulares das duas fontes testadas,
apesar de serem capazes de se diferenciar em múltiplas linhagens, variam em relação à sua
potência. Um trabalho recente, ao analisar CTM provenientes de medula óssea, cordão
umbilical e tecido adiposo, relatou que a capacidade de diferenciação varia de acordo com a
fonte de obtenção dessas células (REBELLATO et al., 2008). Outra explicação para o atraso
observado na diferenciação das culturas de CTM derivadas da polpa dentária pode ser a baixa
porcentagem de células que apresentam o padrão de expressão de antígenos característicos de
60
CTM. Ou seja, a pequena quantidade de CTM na cultura poderia ter comprometido a
velocidade de diferenciação dessas células.
Expressão de Oct-4
A manutenção da expressão do fator de transcrição relacionado ao estado
indiferenciado, Oct-4, ao longo da expansão in vitro, é crucial para a confirmação da
qualidade das células. A sua expressão desaparece à medida que a célula começa a se
diferenciar e, como esperado, esse fator não se encontra expresso em fibroblastos (Niwa
2007). A expressão de Oct-4 persistiu até a 16a passagem nas culturas de CTM derivadas do
tecido adiposo e até a 10a passagem na cultura de CTM da polpa dentária, indicando que as
células permaneceram indiferenciadas após a expansão in vitro. A manutenção da expressão
de Oct-4 na 5a e 25a quinta passagem foi evidenciada em culturas de CTM derivadas da polpa
dentária em estudos anteriores, porém com um protocolo de extração diferente do realizado
em nosso estudo (KERKIS et al, 2006). Essa análise revelou que a expressão de Oct-4 é
mantida ao longo da expansão in vitro, tanto de culturas de CTM derivadas de tecido adiposo
quanto de polpa de dente decíduo.
Avaliação citogenética
O controle da estabilidade genética de culturas de células expandidas antes do
transplante é determinante na terapia celular, para se evitar o aparecimento de tumores
causados por possíveis alterações cromossômicas (MITALIPOVA et al 2005). A análise
citogenética de culturas de CTM derivadas da medula óssea após a expansão in vitro por 3
(ZHANG et al 2007) e 25 passagens (BERNARDO et al 2007) apresentou cariótipo diplóide
normal. Pouco se encontra na literatura à respeito da estabilidade genética de culturas de CTM
derivadas de tecido adiposo e da polpa de dente decíduo. Dois grupos independentes
analisaram a variabilidade cromossômica de culturas de CTM derivadas do tecido adiposo.
Mudanças cariotípicas, tais como monossomia e translocação, foram detectadas na 11a e 14a
passagens (BOCHKOV et al 2007), enquanto que outro grupo relatou que a incidência de
aberrações era negligenciável na maioria das culturas de longa duração (MEZA-ZEPEDA et
al 2008). Um único trabalho sobre cultura de CTM da polpa dentária relatou a presença de
cariótipo normal na 25a passagem (KERKIS et al., 2006). Nossos resultados corroboram com
esse último relato sobre a manutenção do cariótipo normal nas duas culturas testadas, já que
nas três passagens analisadas (2a, 5° como 10°) não foram observadas alterações nas condições
de culturas empregadas. É possível que os resultados conflitantes na literatura ocorram em
61
decorrência das diferenças nas condições de cultura (escolha do soro e meio de culturas),
assim como número de células analisadas.
Figura 29. Características das culturas de CTM derivada de epitélio amniótico, tecido adiposo e polpa do
dente decíduo.
Considerações finais
A pesquisa translacional representa uma nova perspectiva em que todos devem
trabalhar de forma complementar e sinérgica para que o paciente seja beneficiado. A
rastreabilidade das células é peça fundamental para se entender os mecanismos pelos quais
elas estão atuando no organismo e exercendo o seu papel reparador. A instabilidade genética
que leva a tumorigenicidade poderia ser rotineiramente avaliada através da citogenética
utilizando-se a técnica do bandeamento-G, pois é sabido que fatores externos podem induzir
mutações e aneuploidias na cultura. As características fenotípicas de cada fonte de CTM
talvez seja um fator determinante na atividade terapêutica. Entender as similaridades e
diferenças entre elas poderá ser útil na composição de uma correlação entre o sucesso
terapêutico encontrado e uma determinada fonte de células. Possivelmente no futuro, as
informações referentes à definição do tecido de origem, via de administração, biodistribuição
das células e estabilidade das culturas de CTM serão exaustivamente avaliadas antes do
estabelecimento do protocolo clínico.
62
7 CONCLUSÕES
______________________________________________________________________
• As CTM isoladas do tecido amniótico possuem reduzida capacidade proliferativa
quando comparado às CTM isoladas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo
humano;
• A expressão de antígenos de superfície das culturas de CTM possui um padrão similar
em todas as fontes pesquisadas. No entanto, cada cultura pode apresentar
particularidades inerentes à sua origem ou ao meio de cultivo e processo analítico.
• As CTM derivadas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo se diferenciaram em
linhagem adipogênica e osteogênica quando cultivadas com meio específico para
diferenciação.
• A expressão do fator de transcrição Oct-4 é mantida após expansão in vitro até a 10a
passagem em culturas de CTM derivadas da polpa de dente decíduo e 16a passagem
em culturas de CTM derivadas do tecido adiposo.
• A análise citogenética revelou manutenção do cariótipo normal nas culturas de CTM
derivadas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo até a 10a passagem, nas
condições de culturas empregadas.
63
8 REFERÊNCIAS ______________________________________________________________________ ALSALAMEH, S.; et al. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Arthritis Rheum., v. 50, p. 1522-1532, 2004. ALVAREZ-DOLADO, M.; et al. Fusion of bone marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature, v. 425, p. 968-973, 2003. ASTORI, G.; et al. "In vitro" and multicolor phenotypic characterization of cell subpopulations identified in fresh human adipose tissue stromal vascular fraction and in the derived mesenchymal stem cells. J. Transl. Med., v. 5, p. 55. 2007. AVILION, A.A.; et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes, v. 17, n. 1, p. 126-140, 2003. BADDOO, M.; et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J. Cell. Biochem., v. 89, p. 1235-1249, 2003. BAKSH, D., SONG, L., TUAN, R.S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J. Cell. Mol. Med., v. 8, n. 3, p. 301-316, 2004. BARCH, M.J., KNUTSEN, T., SPURBECH, J. L. The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. Third Edition. Philadelphia, 666p, 1997. BERNARDO, M.E.; et al. Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms. Cancer Res.,v. 67, n. 19, p. 9142-9149, 2007. BIANCO, P., ROBEY, P.G. Stem cells in tissue engineering. Nature, v. 414, n. 6859, p. 118-121, 2001. BILIC, G.; et al. Comparative characterization of cultured human term amnion epithelial and mesenchymal stromal cells for application in cell therapy. Cell Transplant., v. 17, n. 8, 955-968, 2008. BOBIS, S., JAROCHA, D., MAJKA, M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications. Folia Histochem. Cytobiol., v. 44, n. 4, p. 215-230, 2006. BOCHKOV, N.P.; et al. Chromosome variability of human multipotent mesenchymal stromal cells. Bull. Exp. Biol. Med., v. 143, n. 1, p. 122-126, 2007. BOYER, L.A.; et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell, v. 122, n. 6, p. 947-956, 2005. BOYUM, A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest., v. 97, n. 7, 1968.
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