Isolamento e produção de Chlorella sp..pdf

UNIVERSIDADE NILTON LINS PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA

Isolamento e produção de Chlorella sp.

(CHLOROPHYCEAE) e Moina sp.(CLADOCERA) para

utilização na larvicultura de Matrinxã (Brycon amazonicus)

JOANA PAULA DE SOUZA CORNÉLIO

Manaus, Amazonas

2012

ii

JOANA PAULA DE SOUZA CORNÉLIO

Isolamento e produção de Chlorella sp.

(CHLOROPHYCEAE) e Moina sp.(CLADOCERA) para

utilização na larvicultura de Matrinxã (Brycon amazonicus)

Orientadora: Drª Marle Angélica Villacorta Correa

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-graduação em

Aquicultura da Universidade Nilton

Lins como parte dos requisitos para

obtenção de título de Mestre em

Aquicultura

Manaus, Amazonas

2012

iii

C834i Cornélio, Joana Paula de Souza.

Isolamento e produção de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEAE) e Moina

sp.(CLADOCERA ) para utilização na larv icultura de Matrinxã (Brycon

amazonicus)./Joana Paula de Souza Cornélio.- Manaus:UNL,2012.

79.; il.; 30 cm.

Dissertação (Mestrado em Aquicultura) – Universidade Nilton Lins,

Manaus, 2012.

Orientador: Marle Angélica Villacorta-Correa

Palavras-chave: Isolamento, produção, Chlorella, Cladocera. I.Título.II.Universidade

Nilton Lins.

CDU 639.3.043

iv

BANCA JULGADORA

Membros titulares:

_______________________________________

Dr. Alfredo Olivera Gálvez – UFRPE

_______________________________________

Dr. Edinaldo Nelson Santos Silva – INPA

_______________________________________

Dr. André Ricardo Ghidini- UNINORTE

Membros suplentes:

_______________________________________

Drª Maria Célia Portella – CAUNESP

______________________________________

Drª Elizabeth Gusmão Affonso - INPA

AGRADECIMENTOS

v

Sinopse:

Realizou-se o isolamento e a produção de organismos planctônicos

(Chlorella sp. e Cladocera) para utilização na larvicultura de peixes

amazônicos

Palavras-chave: Isolamento, produção, Chlorella, Cladocera

vi

DEDICATÓRIA

À minha família, e em especial minha mãe Valdereis

Maria Farias de Souza e irmã Keila Cristina de Souza

Cornélio pelo amor a mim dado. Amo vocês!

Dedico-lhes...

vii

AGRADECIMENTOS

A Deus por sua presença constante em nossas vidas!!

À minha orientadora, Profa. Dra Marle Angélica Villacorta-Correa pela dedicação,

apoio, confiança e pela aprendizagem não só acadêmica, mas de vida!Obrigada!!

Aos amigos José Augusto Bida Neto, Rosilane Oliveira, Aureliano (Saterê) e Jadilson

(Piauí) pelo apoio, companhia e amizade que tiveram por mim durante o período do

trabalho!Vocês são especiais!

Ao Projeto DARPA em nome do Sr. Geraldo Bernardino pelo apoio dado a pesquisa

realizada!

À Universidade Nilton Lins e Instituto de Pesquisas da Amazônia por proporcionar a

oportunidade de cursar o Mestrado em Aquicultura!

Aos colegas e amigos do curso de aquicultura, em especial Eduardo Ribeiro, Aline

Alcântara e Alyson Ribeiro que direta ou indiretamente contribuíram para a realização

deste trabalho!

Às amigas Antônia Hippy, Raquel Aguiar e Sandra Portela pelas palavras de

incentivo e pela amizade!Obrigada meninas!

À FAPEAM pela concessão da bolsa durante o período de estudo.

viii

Ó Senhor Deus, tu me proteges e me dás força!

(Jeremias 17:19)

ix

RESUMO GERAL

A larvicultura de peixes amazônicos especialmente daqueles com larvas de hábitos

alimentares carnívoros e comportamento canibal se constitui hoje em um dos principais

desafios que dificulta o desenvolvimento da piscicultura na região. Para a criação de

larvas de peixes, a utilização de alimento natural como os organismos planctônicos

constitui uma questão relevante. Estes organismos podem ser produzidos em instalações

especiais e se constituem alimentos de alto valor nutricional nas primeiras fases do

desenvolvimento dos peixes. O objetivo deste trabalho foi realizar adaptações

metodológicas para a produção de Moina sp.(CLADOCERA) para servir como alimento

de larvas de peixes amazônicos. O estudo foi realizado nas instalações da Estação de

Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas – UFAM

de junho de 2011 a fevereiro 2012. O trabalho está apresentado em forma de capítulos:

1) Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para sua produção em laboratório;

2) Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de organismos

zooplanctônicos e 3) Produção de Moina sp. (CLADOCERA: MOINIDAE) para sua

utilização na larvicultura de matrinxã (Brycon amazonicus). Nestes capítulos são

detalhados os procedimentos metodológicos para a produção de Chlorella sp. a partir de

cepas monoespecíficas que foram produzidas em laboratório e zooplâncton

(CLADOCERA) produzido em sistema aberto. As técnicas para a produção tanto de

fitoplâncton como de zooplâncton foram simplificadas utilizando farinha de peixe e o

NPK como fonte de nutrientes. Os resultados obtidos neste trabalho poderão em

primeira mão servir para produção de zooplâncton que atenda as experiências de manejo

alimentar durante a larvicultura do matrinxã (Brycon amazonicus) no âmbito do projeto

“Desenvolvimento da Aquicultura e dos Recursos Pesqueiros na Amazônia” e

posteriormente, repassadas para o setor produtivo.

Palavras-Chave : cultivo de alga, Chlorella, produção de zooplâncton, CLADOCERA,

farinha de peixe, NPK.

x

ABSTRACT

The hatchery fish Amazonian especially those with larvae eating habits are carnivorous

and cannibalistic behavior constitutes today one of the major challenges impeding the

development of fish farming in the region. For the fish larvae creation, the use of natural

food such as plankton is a relevant question.These organisms can be produced in special

plants and foods are of high nutritional value in the early stages of fish development.

The aim of this study was methodological adaptations for producing Moina sp.

(Cladocera) to serve as food for fish larvae Amazon. The study was The study was

undertaken at the premises of the station Aquaculture Experimental Farm of the Federal

University of Amazonas - UFAM June 2011 to February 2012. The work is presented in

the form of chapters: 1) Isolation of Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) for production

in laboratory; 2) Production of Chlorella sp. laboratory for feeding zooplankton and 3)

Production of Moina sp. (Cladocera: MOINIDAE) for use in larviculture matrinxã

(Brycon amazonicus). In these chapters are detailed methodological procedures for

producing Chlorella sp. from monospecific strains that were produced in the laboratory

and zooplankton (Cladocera) produced in an open system. Techniques for the

production of both phytoplankton and zooplankton were simplified using fish meal and

the like NPK nutrient source. The results obtained in this study may serve to firsthand

zooplankton production that meets the experiences of feeding management during the

larviculture matrinxã (Brycon amazonicus) under the project "Development of

Aquaculture and Fisheries Resources in the Amazon" and subsequent ly transferred to

the productive sector.

Keywords: cultivation of algae, Chlorella, production of zooplankton, Cladocera, fish

meal, NPK.

xi

SUMÁRIO

PÁGINA

Introdução geral................................................................................................ 15

Objetivos.......................................................................................................... 21

Capítulo 01

Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para produção em

laboratório

Resumo............................................................................................................. 22

Abstract............................................................................................................ 23

Introdução......................................................................................................... 24

Material e métodos........................................................................................... 26

Resultados........................................................................................................ 29

Discussão.......................................................................................................... 34

Conclusão......................................................................................................... 37

Referências bibliográficas................................................................................ 38

Capítulo 02

Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de

organismos zooplanctônicos

Resumo............................................................................................................. 41

Abstract............................................................................................................ 42

Introdução......................................................................................................... 43


Resultados........................................................................................................ 49

Discussão.......................................................................................................... 54

Conclusão......................................................................................................... 57


Capítulo 03

Produção de Moina sp.(Cladocera:Moinidae) para sua utilização na

larvicultura de peixes amazônicos

Resumo............................................................................................................. 61

Abstract............................................................................................................ 62

Introdução......................................................................................................... 63


Resultados........................................................................................................ 68

Discussão.......................................................................................................... 71

Conclusão......................................................................................................... 75


xii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Página

Figura 1. Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da UFAM: a) Localização, b) Instalações..............................................................................................

26

Figura 2. Viveiros onde foram coletadas as amostras de fitoplâncton: a) CPAq/INPA

,b) Estação de Aquicultura da UFAM.............................................................................

26

Figura 3. Coleta da amostra com rede de fitoplâncton de 30 μ ...................................... 30

Figura 4. Filtragem da amostra para eliminar a matéria

orgânica..............................................................................................................................

30

Figura 5- Amostra concentrada de Chlorella sp............................................................... 30

Figura 6. Incubação das amostras sob condições controladas........................................... 30

Figura 7. Cultura em meio sólido: a- Estriamento; b- Diferenciação das colônias iniciais de Chlorella sp......................................................................................................

31

Figura 8. Crescimento das colônias de Chlorella sp.: a-colônias em meio agar com 3 dias de incubação;b- Amostra concentrada de Chlorella sp..............................................

31

Figura 9. Retirada das colônias de Chlorella sp................................................................ 31

Figura 10. Transferência das cepas isoladas para tubos de ensaio...............................................................................................................................

32

Figura 11 . Incubação das cepas de Chlorella sp. isolada no laboratório de fitoplâncton

da Fazenda Experimental da UFAM.................................................................................

32

Figura 12. Processo de isolamento de cepas de Chlorella sp............................................ 32

xiii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO II

Página

Figura 1. Delineamento experimental inteiramente casualizado.........................

47

Figura 2. Unidades experimentais utilizadas para o cultivo: a- 250 ml; b-1000 ml; c- 5 litros; d- 20 litros; e- 35 litros. ...............................................................

48

Figura 3. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de

peixe e NPK em volume de 200 ml......................................................................

49

Figura 4. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de peixe e NPK volume de 900 ml...........................................................................

50

Figura 5. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de peixe e NPK em volume de 4 L.........................................................................

50

Figura 6. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de

peixe em volume de 18 L.................................................................................

51

Figura 7. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de peixe em volume de 30L......................................................................................

52

Figura 8. Padrão de coloração das culturas a) fase de indução b) fase de crescimento exponencial....................................................................................... 53

xiv

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO III

Página

Figura 1. Desenho experimental utilizado na pesquisa........................................

67

Figura 2. Locais de coleta das amostras nas unidades experimentais..................

67

Figura 3. Espécie utilizada para a produção: a- Moina sp.; b-Estruturas

taxonômicas para identificação:a) segunda antena; b) ocelos; c) rostro; d) posabdômen; e) ramos do posabdômen..............................................................

68

Figura 4. Curva de crescimento da Moina sp. : a-Meio de cultura farinha de peixe; b-Meio de cultura NPK.............................................................................

69

Figura 5.Densidade média de Moina sp. por estágio de desenvolvimento na produção com o meio de cultura farinha de peixe...............................................

69

Figura 6. Densidade média de Moina sp. por estágio de desenvolvimento na

produção com o meio de cultura NPK.................................................................

70

15

INTRODUÇÃO GERAL

O pescado produzido no Brasil no ano de 2010 foi de 1.264.765 t, com um

incremento de 2 % em relação a 2009, quando foram produzidas 1.240.813 t. Em 2010

houve uma redução de 8,4% na produção oriunda da pesca extrativa marinha em relação

a 2009, resultada de um decréscimo de 49.217 t. Em contra partida, a produção da pesca

extrativa continental e a aquicultura continental fecharam em alta em relação a 2009,

com um acréscimo de 3,9% e 16,9% respectivamente (MPA, 2010).

A ampliação de políticas públicas facilitando o acesso aos programas

governamentais existentes tais como o Plano Mais Pesca e Aquicultura desenvolvida

pelo MPA, possibilitou o desenvolvimento da aquicultura nacional. Isto pode ser

constatado com o crescimento da produção entre 2008 e 2009 que mesmo sendo menos

acentuada que a do triênio 2008-2010 (40%), teve um incremento de 16,9 % (MPA,

2012).

Gandra (2010) refere que na região amazônica o peixe representa a principal fonte

de proteína para consumo humano, particularmente das populações ribeirinhas que

apresentam um consumo per capita de pescado estimado entre 500 e 600 g/dia. Em

Manaus o consumo é de 93,61 g/pessoa/dia e parte desta demanda é suprida pelo

pescado oriundo da piscicultura. Contudo, a produção da piscicultura local (12.000 t de

tambaqui em 2009) não atendeu as necessidades do mercado consumidor já que desse

valor, 6.000 toneladas são oriundos da piscicultura de outros estados como Rondônia,

Roraima e Acre (Gandra, 2010).

Segundo dados do IBAMA (2007), os peixes mais cultivados e mais estudados até

o momento na região amazônica são o tambaqui (Colossoma macropomum), o matrinxã

(Brycon amazonicus) e o pirarucu (Arapaima gigas). O tambaqui é a espécie mais

cultivada e com maior produtividade na região Norte (Ostrensky et al., 2000) contando

com maiores informações técnicas que faz com que cadeia produtiva esteja mais

estruturada e em vias de consolidação.

A necessidade de otimizar a utilização de recursos e investimento em pesquisas

conduziu a uma estratégia adotada pelo MPA para seleção de espécies amazônicas sobre

as quais serão realizados investimentos utilizando o método de escores. Este método se

16

fundamenta em critérios que consideram a importância econômica, estratégica, social,

probabilidade de êxito na pesquisa e adoção de tecnologia.

De acordo com o método do escore, a matrinxã, após o tambaqui é a segunda

espécie cujas pesquisas devem ser priorizadas na região amazônica e que foi

considerada na proposta do “Projeto Desenvolvimento da Aquicultura e dos Recursos

Pesqueiros na Amazônia”.

Diversos trabalhos destacam o bom desempenho zootécnico do matrinxã (Val e

Honczarick, 1995; Brandão et al., 2004; Fim, 2004; Izel et al., 2004). Entretanto,

Sampaio (2010) afirmou que a oferta de pós- larvas e juvenis nas estações de produção

não está suprindo a demanda dos produtores regionais. Uma das causas da baixa

produção é o canibalismo que ocorre nas primeiras fases de desenvolvimento da espécie

(Bernardino et al., 1993; Ceccarelli, 1997).

Várias estratégias foram utilizadas com a finalidade de minimizar o canibalismo

nas primeiras fases do desenvolvimento do matrinxã como: redução das densidades de

estocagem das larvas (Campagnolo e Nuñer, 2006); formato dos tanques utilizados na

larvicultura (Pedreira, 2006); utilização de substratos artificiais, escurecimento das

incubadoras (Lopes et al., 1995); uso de hormônios tireoideos (Vasques, 2003;

Leonardo, 2005) e enriquecimento da ração com triptofano (Hoshiba, 2007).

Dentre as estratégias alimentares, vem sendo realizadas pesquisas sobre a oferta de

organismos planctônicos para diminuir o canibalismo da matrinxã na fase larval. A

produção e utilização de alimento natural vivo são fundamentais para os peixes nos

primeiros estágios de desenvolvimento por apresentarem altos níveis de proteína de

excelente qualidade, vitaminas, minerais, ácidos graxos essenciais e possuírem enzimas

necessárias para ajudar no crescimento e sobrevivências das larvas (Coutteau e

Sorgeloos, 1997; Kubitza, 1998; Kolkovski, 2001; Portella et al., 2002; Carvalho et al.,

2003; Sipaúba-Tavares, 2003; McKinnon et al., 2003).

Os organismos planctônicos também são importantes para o crescimento das pós-

larvas porque a maioria dos peixes nesta fase, não possuem sistema enzimático e

digestório completamente desenvolvidos (Furuya et al., 2001).

A utilização de microalgas como fonte de alimento na aquicultura vem se

destacando por apresentar fonte de proteínas, ácidos graxos insaturados, vitaminas, sais

17

minerais, pigmentos, enzimas, antibióticos e outros metabólitos biologicamente ativos

(Pereira, 2001).

Lourenço (2006), afirma que o cultivo de microalgas em laboratório é uma

ferramenta essencial para a produção de biomassa algal que pode ser utilizada para a

alimentação de Zooplâncton que por sua vez servirão de alimento para peixes na fase

larval.

Segundo Cecarelli e Senhorini (1996), a matrinxã tem preferência alimentar por

crustáceos planctônicos, principalmente da classe Cladocera. Sampaio (2010),

trabalhando com conteúdo estomacal de larvas de matrinxã encontrou que até 11 dias

após a eclosão as larvas de matrinxã tem preferência alimentar por cladóceros e

posteriormente ocorre o consumo de alimento inerte.

Portanto, este item alimentar poderia ser utilizado durante a larvicultura até que as

larvas sejam capazes de aceitar a ração. Assim, se torna necessário o investimento em

pesquisas para a produção em massa de Cladocera utilizando uma metodologia simples

e adaptada às condições locais que suporte a alimentação de larvas de matrinxã.

Neste contexto, no presente trabalho apresentamos em forma de capítulos as

diferentes técnicas utilizadas na produção de organismos planctônicos (fitoplâncton e

zooplâncton) visando à produção em massa de Cladocera. Estes organismos poderão ser

utilizados na larvicultura da matrinxã para diminuir o canibalismo desta espécie nas

primeiras fases de seu desenvolvimento, que atualmente se constitui no maior entrave

tecnológico para aumentar a produção de alevinos e abastecer a crescente demanda dos

produtores da região.

18

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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19

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Val, A. L.; Honczaryk, A. 1995. Criando peixes na Amazônia. Ed.19. Manaus, INPA,

150 pp.

21

OBJETIVOS

GERAL

Isolar e produzir organismos planctônicos, fitoplâncton Chlorella sp. e zooplâncton

Moina sp. , para utilização na larvicultura da Matrinxã (Brycon amazonicus).

ESPECÍFICOS

1. Isolar Chlorella sp. para produção em laboratório;

2. Produzir de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de organismos

zooplanctônicos ;

3. Produzir Moina sp. para utilização na larvicultura da matrinxã (Brycon

amazonicus).

22

Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para produção em laboratório

RESUMO

O isolamento e o cultivo de microalgas em laboratório têm recebido um grande impulso

nos últimos anos, embora exista a necessidade de aprimoramento dos métodos e tecnologias empregadas, principalmente para as espécies de água doce. O objetivo deste

trabalho foi o isolamento da microalga Chlorella sp. visando à formação de um banco de cepas monoalgais para posterior cultivo em laboratório e em larga escala. O experimento foi realizado no laboratório de fitoplâncton na Estação de Aquicultura da

Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas-UFAM. As coletas foram realizadas nos viveiros da Coordenação de Pesquisas em Aquicultura do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia - Cpaq / INPA e na Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas – UFAM. Foram utilizadas duas metodologias de isolamento de microalgas utilizando meio de cultura

NPK: 1) Subculturas repetidas e 2) Meio NPK sólido com Agar. Para o método 2,a incubação foi realizada em temperatura entre 25 e 27º C (ambiente) e intensidade

luminosa de aproximadamente 5.000 lux. As colônias monoespecíficas foram transferidas para frascos erlenmeyer contendo inicialmente 30 ml de meio de cultura liquido para iniciar uma subcultura e posteriormente foi diluído para 200 ml

constituindo as cepas isoladas. O material foi distribuído em tubos de ensaio com tampa de rosca e mantidos em câmara de incubação a temperaturas entre 20 e 27º C, sob iluminação continua.

Palavras-Chave : isolamento de microalgas, cepas de microalgas, Chlorella, incubação,

NPK.

23

Isolation of Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) for producing in laboratory

ABSTRACT

The Insulation and cultivation of micro-algae laboratory have received a big

boost in recent years, although there is a need for improved methods and technologies employed, particularly for freshwater species. The objective of this work was the insulation of microalgae Chlorella sp. for the training of a bank of monoalgaes strains

for further cultivation in the laboratory and on a large scale. The experiment was conducted in the laboratory of phytoplankton at Station Aquaculture Experimental Farm

of the Federal University of Amazonas-UFAM. Samples were collected in ponds at the Aquaculture Research Coordination National Institute of Amazonian Research - CPAQ / INPA and Aquaculture Station of the Experimental Farm of the Federal University of

Amazonas - UFAM. Two methodologies insulation using microalgae culture medium NPK: 1) Repeated Subcultures and 2) Half NPK solid Agar. For the second method, the

incubation was carried out at a temperature between 25 and 27 ° C (ambient) and luminous intensity of about 5,000 lux. The monospecific colonies were transferred to Erlenmeyer flasks containing initially 30 ml of liquid culture medium to initiate a

subculture and were subsequently diluted to 200 ml constituting the isolates. The material was distributed in test tubes with screw cap and kept in an incubation chamber at temperatures between 20 and 27 ° C under continuous illumination.

Keywords : insulation of microalgae strains of microalgae, Chlorella, incubation, NPK.

24

Capítulo 01: Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para produção em

laboratório

INTRODUÇÃO

As algas são organismos unicelulares que habitam ambientes marinhos e

continentais, são capazes de realizar fotossíntese (Calijuri, 2006) e servir de alimento e

abrigo para muitas espécies de organismos aquáticos. As algas constituem o primeiro

elo da cadeia alimentar e são de fundamental importância na manutenção da vida nos

ecossistemas aquáticos, além disso, são responsáveis por 98 % do oxigênio da terra

(Bicudo 2004). Estes organismos possuem importância tanto ambiental, pois podem

realizar o equilíbrio nos ambientes aquáticos quanto social e econômico, servindo como

fonte de alimento e matéria prima (Barros, 2010).

O fitoplâncton desempenha função importante na aquicultura, pois é fonte de

aminoácidos essenciais e servem como alimento vivo para os estágios iniciais de

organismos aquáticos (Portella et al. 1997).

Rotíferos e Cladocera são itens alimentares preferidos por larvas de tambaqui

Colossoma macropomum (Sipauba Tavares, 1993; Carvalho & Goulding, 1982), já as

larvas de matrinxã Brycon amazonicus tem preferência por cladocera (Senhorini, 2002;

Sampaio, 2010). Day (1958) afirma que cladoceros podem servir como alimento para

diversos peixes de água doce na Índia (Cyprinidae e Siluridae). Moina sp. tem sido

extensivamente utilizado como alimento vivo durante a larvicultura, manutenção e

cultura de peixes de aquário de importância comercial (Bellosillo, 1937; Alikunhi,

1952; Alikunhi et al, 1955; Cooper e Grasslight, 1963).

Varias espécies de algas são utilizadas para a produção de organismos

zooplanctonicos. Espécies do gênero Chlorella foram utilizadas com sucesso na

produção de Moina sp. (Montealegre 1996; Prieto, 2006).

Para iniciar o processo de cultivo de microalgas em laboratório é necessário o

desenvolvimento de métodos e técnicas adequadas que permitam a produção com

sucesso de culturas monoalgais. Segundo Bicudo (1970), existe uma predominância

sequencial das espécies existentes, aquelas que predominam inicialmente tendem a

desaparecer, sendo substituídas por outras mais comuns e mais resistentes. A

25

competição entre espécies é uma das principais dificuldades na preservação de uma

população. Assim, o isolamento de microalgas em um meio adequado para o

crescimento é necessário para estabelecer uma cultura monoalgal.

Entre as algas de água doce mais cultivadas estão as Chlorophyceae, ressaltando o

potencial da Chlorella sp.,Scenedesmus quadricauda, Ankistrodesmus gracilis, que têm

mostrado excelente resultado em cultivos realizados em laboratório e quando utilizada

indiretamente como alimento de larvas de peixes via zooplâncton (Sipaúba-Tavares e

Braga,1999; Sipaúba-Tavares et al.,1999).

Conforme Vendrúscolo (2009), o cultivo de microalgas dos gêneros Chlorella e

Scenedesmus sp. para alimentação de espécies de microcrustáceos tem se destacado pela

facilidade de manejo destas espécies, e de suas características de alimentação,

reprodução e facilidade de cultivo.

Portella (1995) afirma que a cultura monoespecífica a partir de cepas purificadas

de microrganismos vegetais e animais em larga escala abriu novas e amplas

perspectivas para a alimentação de larvas de espécies marinhas e de água doce.

O aprimoramento das técnicas para o cultivo em massa de algas é de grande

importância, pois possibilita a transferência dos seus nutrientes (vitaminas e ácidos

graxos) para um nível trófico superior (Sipaúba-tavares & Rocha, 1993; Brown et al.

1997). Pouco tem sido feito na região amazônica para produzir algas tanto em

laboratório quanto em larga escala a partir de cepas purificadas de espécies nativas

visando sua aplicação na larvicultura.

Diversos métodos foram desenvolvidos para o isolamento de microalgas visando à

produção de culturas monoalgais (Sipauba-Tavares e Rocha, 2001; Guerreiro &

Villegas, 1982; Hardy e Diaz-Castro, 2000).

Neste trabalho foram testados diferentes métodos para o isolamento de Chlorella

sp. visando a formação de um banco de cepas monoalgais.

26

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no laboratório de Fitoplâncton da Estação de

Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas - UFAM

localizada no Km 38 da BR 174 (Manaus – Presidente Figueiredo) (Figura 1 A e B).

As amostras de fitoplâncton foram coletadas nos viveiros da Coordenação de

Pesquisas em Aquicultura do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - CPAq /

INPA e da Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal

do Amazonas - UFAM. (Figura 2).

Figura 1. Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da UFAM: a- Localização; b- Instalações.

a

a

B

Figura 2. Viveiros onde foram co letadas as amostras de fitoplâncton. CPAq/INPA (A), Estação de

Aquicultura da UFAM (B)

Fonte: Ribeiro, 2011; Arquivo pessoal.

b

27

As amostras foram coletadas utilizando uma rede de fitoplâncton com abertura de

30µ. A água foi filtrada com peneiras de 1 mm, 170µ, 60µ e 40µ para eliminar o

material orgânico, insetos e zooplâncton e concentrar a amostra de fitoplâncton. Sob um

microscópio óptico com aumento de 10X verificou-se a ocorrência da espécie desejada

Chlorella sp.

Como existiam na amostra outras espécies de fitoplâncton não desejadas, o

material coletado foi diluído em três erlenmeyers de 25 ml contendo um meio

enriquecido com 2 ml de solução padrão de NPK (20:5: 20 g/l) em um litro de água

destilada autoclavada e mantidos no laboratório sob iluminação contínua.

Durante o período de incubação foi acompanhado diariamente o crescimento da

espécie desejada e quando verificada sua predominância foi realizada a seleção das

células de Chlorella sp. e transferidos para outros erlenmeyers sob as mesmas condições

de cultivo até que quase 100% da amostra fosse composta pela espécie desejada,

estando em condições de ser transferida para o meio sólido.

O meio sólido foi preparado conforme a metodologia descrita por Guerrero e

Villegas (1982) que consiste na utilização de Agar na concentração de 1,5 % que

equivale a 1,5 g por 100 ml de meio de cultura enriquecido com 2 ml de solução padrão

de NPK/ litro de água destilada. Este meio de cultura foi esterilizado em autoclave a

120º C durante 20 minutos. Retirado da autoclave o meio foi mantido a temperatura

ambiente durante aproximadamente cinco minutos e ainda em estado liquido transferido

para placas Petri por aproximadamente 10 minutos até a solidificação após o

esfriamento.

Uma gota de água contendo o fitoplâncton desejado (Chlorella sp.) foi colocado

no meio sólido e realizado o estriamento sobre a superfície com uma alça de vidro. Este

material foi incubado sob condições favoráveis de cultivo (entre 25 e 27º C e

aproximadamente 5.000 lux) e acompanhado o crescimento até o aparecimento de

colônias algais, e quando estas eram bem diferenciadas e espalhadas em mais de 50% da

placa foram retiradas com uma alça bacteriológica, colocadas em uma pequena

quantidade do meio liquido e verificado sob microscópio se estas colônias continham

uma única espécie de alga.

As colônias monoespecíficas foram transferidas para frascos erlenmeyer contendo

inicialmente 30 ml de meio de cultura liquido para iniciar uma subcultura que

posteriormente foi diluída para 200 ml. Este material foi distribuído em tubos de ensaio

28

com tampa de rosca e mantidos em câmara de incubação a temperaturas entre 24º e 27º

C, sob iluminação continua.

29

RESULTADOS

A coleta de microalgas foi realizada com o objetivo de obter uma cultura unialgal.

A rede de plâncton com abertura de malha de 30 µ foi eficiente pra reter o fitoplâncton

(Figura 3). A amostra original concentrada (Figura 4) foi observada sob microscópio

óptico. Verificada a presença da espécie desejada (Chlorella sp.) (Figura. 5) foi

acrescentada a amostra um meio de cultura enriquecido com NPK em quantidade

equivalente a 50% do volume da amostra. Deste concentrado foram retiradas sub

amostras de 30 ml e diluídas para volumes de 200 ml. Este material foi mantido sob

iluminação constante de aproximadamente 5.000 lux e temperatura entre 25 e 27ºC

(Figura 6). Diariamente se realizaram observações visuais para verificar o crescimento

das espécies desejadas.

Com 4 dias de cultivo, constatada a abundancia da espécie desejada (Chlorella

sp.) foi realizada uma seleção preliminar e posteriormente transferido para três

erlenmeyers contendo 100 ml do meio de cultura.Após cinco dias de incubação,

verificada a predominância das células desejadas, uma gota da cultura foi estriada em

seis placas com o meio de cultura sólido, composto por Agar enriquecido com NPK

(Figura 7). Após 3 dias de incubação, foi observada a presença de colônias

diferenciadas cobrindo mais de 50 % da placa (Figura 8). Utilizando uma alça

bacteriológica foram retiradas as colônias individualizadas e transferidas para um vidro

de relógio contendo algumas gotas do meio de cultura (Figura 9).

Confirmada a presença de uma única espécie o concentrado unialgal foi

transferido para três erlenmeyers contendo 30 ml de meio de cultura. Este material foi

incubado por 2 dias e repicada para 3 volumes de 200 ml. Transcorrido cinco dias, na

fase de crescimento exponencial, 20 ml da cultura unialgal foram transferidos para

tubos de ensaio com capacidade de 30 ml. Com este material foi implementado um

banco de cepas de Chlorella sp. (Figura 10). As cepas foram mantidas em câmara de

incubação com fotoperíodo de 12 horas no claro e 12 horas no escuro e temperatura

entre 24 e 27º C (Figura 11).

30

Na Figura 13 pode ser observado o processo de isolamento desde a coleta até a

estocagem das cepas.

Figura 4. Filtragem da amostra para eliminar para

eliminar a matéria orgânica

Fonte: Arquivo pessoal

Figura 6. Incubação das amostras sob condições controladas


Figura 3. Coleta da amostra com rede de

fitoplâncton de 30 μ


Figura 5- Amostra concentrada de Chlorella sp.


31

a b

Figura 8.Crescimento das colônias de Chlorella sp.: a-colônias em meio agar com 3 dias de

incubação;b- Amostra concentrada de Chlorella sp.


b a

Figura 7. Cultura em meio sólido: a - Estriamento; b- Diferenciação das colônias iniciais de Chlorella sp.


Chlorella sp.

Figura 9. Ret irada das colônias de Chlorella sp


32

Figura 11. Incubação das cepas de Chlorella sp.

isolada no laboratório de fitoplâncton da Fazenda

Experimental da UFAM


Figura 10 . Transferência das cepas isoladas para tubos de ensaio

Fonte:Arquivo pessoal

33

Figura 12. Processo de isolamento de cepas de Chlorella sp.

34

DISCUSSÃO

O crescente interesse no estudo de microalgas se deve à sua importância nas

diversas cadeias tróficas e na possibilidade de aplicação em distintas áreas como

nutrição, saúde humana e animal, tratamento de águas residuais, produção de

biocombustível e fertilizantes (Anupama e Ravindra, 2000; Becker, 2004; Pulz,2004;

Lourenço,2006; Peres,2007; Patil,2011; Karnataka,2011).A aplicação mais comum tem

sido na aquicultura para alimentação direta ou indireta de algumas espécies de peixes,

moluscos, crustáceos e diversos organismos forrageiros de interesse econômico (Derner

et al.,2006).

A produção de microalgas no Brasil é realizada principalmente por empresas

localizadas no litoral de Santa Catarina e região nordeste que produzem biomassa e a

utilizam principalmente na alimentação de organismos como camarões e moluscos

marinhos (Derner et al, 2006). Apesar de ser uma atividade consolidada em outros

países, não encontramos disponível na literatura, trabalhos sobre isolamento de algas

nativas da região amazônica visando sua utilização na larvicultura de peixes. Entre as

principais microalgas cultivadas na aquicultura destacam-se as espécies dos gêneros

Chlorella e Scenedesmus (Sipaúba-Tavares e Rocha, 1993; Portella et al.,1997; Hardy e

Diaz-Castro, 2000; Macedo e Pinto-Coelho, 2000; Becker, 2004; Ohse et al., 2008;

Vendrúscolo, 2009). Estes gêneros são utilizados como alimento na produção de

Rotíferos e Cladocera (Hardy e Diaz-Castro, 2000; Sebastien e Granja, 2005, Portella,

1997; Macedo e Pinto Coelho, 2000) que constituem alimento de larvas de peixes como

Colossoma macropomum e Brycon amazonicus (Goulding e Carvalho, 1982; Sipaúba-

Tavares, 1993; Senhorine, 2002; Sampaio, 2010).

O isolamento de microalgas é o primeiro passo para o cultivo tanto em laboratório

como em larga escala. Existem vários métodos para o isolamento, entre eles o método

das culturas repetidas (Guerrero e Villegas, 1982), que se mostrou eficiente neste

trabalho, para a eliminação do fitoplâncton acompanhante e consequente predominância

de Chlorella sp. Guerrero e Villegas (1982) sugerem que os volumes para as diluições,

estejam entre 50 e 100 ml, entretanto, os volumes de 30 e 200 ml utilizados neste

trabalho foram também eficientes.

35

A intensidade de luz e a duração da iluminação influenciam diretamente no

crescimento das microalgas, pois a luz atua como principal fonte de energia no processo

de produção de biomassa (Sipaúba-Tavares e Rocha, 2001).

Neste trabalho, a iluminação constante de aproximadamente 5.000 lux foi eficiente

no crescimento de Chlorella sp., entretanto Portella et al. (1997), obteve bons resultados

para o cultivo de Chlorella homosphaera com intensidade entre 3.200 a 4.000 lux.

Sipaúba-Tavares e Rocha (1993) obtiveram bons resultados utilizando intensidade de

luz de 5200 lux no cultivo de Scenedesmus bijugus semelhante ao utilizado neste

experimento. Já Hardy e Diaz-Castro (2000) utilizaram lâmpadas fluorescentes de 2500

lux, abaixo do utilizado neste experimento e também tiveram bons resultados. De

acordo com os resultados acima referidos podemos observar que a intensidade de luz

para o crescimento de ambas as espécies pode variar entre 2500 e 5200 lux.

Portella et al. (1997) e Pequeno et al. (2012), encontraram que fotoperíodo de 12

horas claro/escuro foram eficientes no aumento da densidade algal, que difere dos

resultados encontrados neste trabalho onde a iluminação foi constante obtendo-se

também resultados satisfatórios.

Neste trabalho a multiplicação das células de Chlorella sp.ocorreu em

temperaturas entre 25 e 27º C semelhantes àquelas utilizadas por Ohse et al (2008) e

Pequeno et al.(2012) para o cultivo de Chlorella sp. (25±2º C e 28 ± 3°C

respectivamente). Vendrúscolo (2009) utilizou a temperatura de 24º C para

S.quadricauda. Já no estudo sobre qualidade nutricional de S. quadricauda

desenvolvido por Macedo (1999) a temperatura foi de 20º C. Sipaúba-Tavares e Rocha

(2001) propõe temperatura de 25º C para o gênero Chlorella.

Após a predominância das espécies desejadas através do método de subculturas

repetidas seguiu o isolamento das colônias monoalgais pelo método de Ágar em placas.

Para a utilização deste método, foram realizados testes pilotos com outros meios de

cultura como farinha de peixe, CHU10 e NPK e constatamos a eficiência do NPK

corroborando os resultados de Sipaúba-Tavares e Rocha (1993); Hardy e Diaz-Castro

(2000).

36

Após o estriamento, a incubação para o desenvolvimento das colônias unialgais

utilizando meio sólido foi realizada: 1) em geladeira a temperatura de aproximadamente

10º C conforme utilizado por Hardy e Diaz-Castro (2000); 2) em estufa a 40º C de

acordo com Guerrero e Villegas (1982) e 3) na câmara de incubação a temperatura

ambiente. Este último método (3) foi mais eficiente que os anteriores (1 e 2).Quando a

incubação foi realizada em geladeira até vigésimo dia não houve nenhum

desenvolvimento de colônias. Na estufa, a partir do décimo terceiro dia foi observado

poucas colônias, porém o meio o meio de cultura estava contaminado por outros

microrganismos inviabilizando a cultura.

Hardy e Diaz-Castro (2000) obtiveram resultados satisfatórios no crescimento das

colônias utilizando incubação em geladeira. Guerrero e Villegas (1982) sugerem a

incubação em temperatura em 40ºC. Entretanto, os resultados obtidos nesse trabalho

diferem dos anteriormente referidos, tendo sido encontrado o melhor crescimento das

colônias depositando as placas em uma câmara de incubação em temperatura entre 27 e

28º C.

O tempo de incubação na câmara foi de 3 dias que consideramos bastante eficiente

se compararmos estes resultados com aqueles encontrados por Hardy e Diaz-Castro no

qual o tempo de incubação foi entre 3 e 4 semanas e por Guerrero e Villegas (1982),de

aproximadamente 10 dias. Portanto consideramos o método adaptado neste trabalho

adequado e que pode ser adotado para a o isolamento das colônias.

37

CONCLUSÕES

1. O método das subculturas repetidas mostrou-se eficiente no processo de

eliminação de fitoplâncton acompanhante e seleção de Chlorella sp.

2. O meio NPK (20:5: 20) sólido com agar foi eficiente para o isolamento das

cepas;

3. A incubação em temperaturas entre 27 e 28º (ambiente natural) utilizando

câmara de incubação foi eficiente para o crescimento das cepas;

4. O processo de isolamento de Chlorella sp. nas condições deste trabalho teve

duração de 19 dias desde a coleta até a obtenção das cepas monoalgais.

38

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41

Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de organismos

zooplanctônicos

RESUMO

O cultivo de algas é de grande importância dentro da cadeia produtiva da piscicultura,

pois as mesmas transferem direta ou indiretamente, através do zooplâncton, nutrie ntes para as larvas de peixes. A Chlorella sp. constitui um dos alimentos de preferência do zooplâncton. O objetivo deste trabalho foi o cultivo de Chlorella sp. visando sua

utilização na produção de Cladocera para a alimentação de larvas de matrinxã (Brycon amazonicus). O experimento foi realizado na Estação de Aquicultura da Fazenda

Experimental da Universidade Federal do Amazonas-UFAM. Foram utilizadas cepas isoladas de Chlorella sp. produzidas no laboratório de fitoplâncton da UFAM. Para a produção de Chlorella sp. foram testados dois meios de cultura distribuídos em dois

tratamentos T1(farinha de peixe procedente do Peru,0,35 g l-1 de água destilada peneirada e esterilizada a 160 ° C) e T2 ( 2 ml l- de água destilada de uma solução

padrão de NPK 20:5:20 g l-1). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três repetições por tratamento. O ambiente de cultivo foi mantido com iluminação durante 24 horas aproximadamente (5.000 lux). A temperatura foi

monitorada diariamente quatro vezes por dia. O cultivo foi iniciado em um volume de 200 ml, com diluições sucessivas para 900 ml; quatro litros; 18 litros e 30 litros

efetuadas na fase de crescimento exponencial das células. Para a comparação das médias do número de células por tratamento foi utilizado o teste t com nível de significância de 5%. A média da temperatura diária do ambiente durante o experimento

foi 26,75 °C com valor mínimo de 24,4 °C e máximo de 30,75 °C. Em todas as diluições a exceção daquela de 200 ml a produção de Chlorella sp. (número de células

por ml) utilizando meio de cultura enriquecido com farinha de peixe foi significativamente superior (P<0,05) aquela produzida no meio de cultura enriquecido com NPK (P>0,05).No final do experimento na diluição de 30 litros foram obtidas

5.747.500 cél ml -1 no meio de cultura de farinha de peixe e 1.557.500 cél ml -1 no meio com NPK. Em todas as diluições a farinha de peixe apresentou maior número de

cél ml -1. . O crescimento exponencial das células, quando foram feitas as diluições foi de 3 dias a exceção daquela de 30 litros que durou dois dias. O tempo total da produção de Chlorella sp. em laboratório foi de 11 dias.No final do experimento foi confirmada a

eficiência da farinha de peixe na produção de Chlorella sp. que poderá ser utilizada na elaboração de um protocolo para o cultivo dessa microalga.

Palavras-chave: cultivo de Chlorella , meios de cultura para microalgas, farinha de

peixe, NPK.

42

Production of Chlorella sp. laboratory for feeding zooplankton

ABSTRACT

Growing algae is of great importance in the chain of farming because they transfer directly or indirectly, through zooplankton, nutrients for fish larvae. The Chlorella sp. is preferably a food zooplankton. The aim of this work was the cultivation

of Chlorella sp. for their use in the production of Cladocera for feeding larvae matrinxã (Brycon amazonicus). The experience was conducted at Station Aquaculture

Experimental Farm of the Federal University of Amazonas-UFAM. We used strains of Chlorella sp. produced in the laboratory of phytoplankton UFAM. For the production of Chlorella sp. were tested both culture media distributed in two treatments T1 (fish meal

coming from Peru, 0.35 g l-1 distilled water sieved and sterilized at 160 ° C) and T2 (2 ml l-distilled water solution standard NPK 20:5:20 g l-1). The experimental design was

completely randomized with three replicates per treatment. The culture environment was kept lit for 24 hours approximately (5.000 lux). The temperature was monitored daily four times per day. The cultivation was

started in a volume of 200 ml with successive dilution to 900 ml, four liters, 18 liters and 30 liters performed in the exponential growth phase of the cells. To compare the

mean number of cells per treatment was used t test with significance level of 5%. The average daily temperature in the room during the experiment was 26.75 ° C with a minimum of 24.4 ° C and maximum of 30.75 ° C. At all dilutions except that 200 ml of

the production of Chlorella sp. (Number of cells per ml) using culture medium supplemented with fish meal was significantly higher (P <0.05) that produced in the

culture medium enriched with NPK (P> 0.05). At the end of the experiment at a dilution of 30 liters were obtained 5747500 CELL ml -1 in the culture medium of fish meal and 1,557,500 ml -1 in the middle with NPK. In all dilutions fishmeal had the greatest

number of Cel ml -1. The exponential growth of the cells, when the dilutions were made 3 days was the exception that 30 liters which lasted two days. The total time of

production of Chlorella sp. laboratory was 11days. No end of the experiment confirmed the efficiency of fishmeal production of Chlorella sp. that could be used in developing a protocol for the cultivation of these microalgae.

Keywords : cultivation of Chlorella, culture media for microalgae, fish meal, NPK.

43

Capítulo 02: Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de

organismos zooplanctônicos

INTRODUÇÃO

O fitoplâncton compreende os organismos aquáticos que vivem dispersos na

coluna de água e têm capacidade fotossintética (Calijuri, 2006), por isso representam o

mais eficiente conversor de nutrientes e luz em ambientes aquáticos, transferindo

energia aos níveis tróficos superiores e determinando a produtividade destes ambientes

(Richmond, 2004).

Kay (1991), afirma que as algas são fonte de alimento rapidamente renovável e

produzem mais biomassa que qualquer outro produtor primário por unidade de tempo.

A produção de trigo (300 kg/matéria seca/ha/ano) quando comparada à produção de

alga Chlorophyceae,Chlorella sp. (15.700 kg/matéria seca/ha/ano) apresenta valores

bem inferiores para uma mesma unidade de tempo.

Na aquicultura, as microalgas são utilizadas como alimento para peixes,

moluscos, crustáceos e organismos zooplanctônicos, geralmente consumidos na forma

fresca (alimento vivo), sendo essenciais em determinados estágios de desenvolvimento

ou em todo ciclo de vida destes organismos (Nunes, 2005).

Em geral, as microalgas apresentam altas concentrações de lipídios, ácidos

graxos polinsturados, vitaminas, entre outros que podem ser transferidos para níveis

mais altos da cadeia trófica via zooplâncton (Sipaúba-Tavares, e Rocha 2001;

Vendruscolo, 2009).

Uma microalga para ser viável em dietas fornecidas a zooplâncton deve

apresentar altas taxas de crescimento, fácil cultivo, ser robusta, ter tamanho e forma

adequada para ser ingerido, ter parede celular digerível ou ausente, ter disponibilidade

de carboidratos assimiláveis e alta qualidade nutritiva, ou seja, alto teor de proteína, que

nas algas fica em torno de 30% (Lourenço, 2006).

Segundo Sipaúba-Tavares e Rocha (1993), clorofíceas unicelulares ou

cenobiais são selecionadas para servirem de alimento do zooplâncton, por apresentarem

44

paredes celulares mais finas e quantidade elevada de carbono orgânico total em relação

ao peso seco.

Entre os gêneros mais utilizados para o cultivo em laboratório e em larga

escala está a Chlorella. Vários trabalhos utilizaram este gênero para o cultivo com

diversas finalidades entre elas a produção de zooplâncton (Tanji et al.,1983 ;Portella et

al ,1997; Alva-Martinez et al.,2001 ;Rodrigues e Filho, 2004; Oshe et al.,2008).

Segundo Wikfors et al.(1992) as culturas em massa de algas foram obtidas

basicamente por dois métodos: 1) indução da biomassa do fitoplâncton natural pela

fertilização de tanques de cultivo e 2) fomento de culturas monoespecificas. Segundo

estes autores, o primeiro método é mais simples, porém, ineficiente no controle das

espécies produzidas, já o segundo proporciona um controle a partir da utilização de

cepas selecionadas, sendo por isso mais adotado por estações de piscicultura em todo

mundo.

No Brasil as estações de piscicultura adotam principalmente o primeiro método

(Albinati,1984;Araujo,1984;Silva et al.,1984;Grieco-Reis et al.,1986). Esta técnica

apresenta alguns problemas, como a limitação de luz após florescimento do fitoplâncton

com alta biomassa seguida de um declínio pelo sombreamento das camadas inferiores,

tornando esta técnica inadequada, para o cultivo em larga escala de algas e zooplâncton

(Sipaúba-Tavares, 1988).

Vários meios alternativos para o cultivo de algas em laboratório foram

desenvolvidos com a finalidade de diminuir os custos na produção obtendo organismos

com alto valor nutricional em curto espaço de tempo.

Alguns métodos alternativos foram utilizados para a produção de Chlorella

sp.como: esgoto doméstico esterilizado (Pipes e Gotaas, 1960); extrato de lodo ativado

e lodo digerido (Wong & Lay, 1980); despejos industriais purificados ricos em

nitrogênio (Jusiak et al., 1984); resíduos líquidos de indústria de suco de laranja

(Beltrão, 1992); vinhaça de cana de açúcar (Oliveira, 1995); NPK (20:5:20) (Sipaúba

Tavares e Rocha, 1993).

Ismiño-Orbe (2009), testou a produção de zooplâncton (rotíferos) utilizando

com sucesso a farinha de peixe como fertilizante para a produção de fitoplâncton.

Atualmente esta técnica está sendo utilizada com sucesso em Iquitos - Peru para a

larvicultura do tambaqui e surubim.

São de grande importância pesquisas para desenvolver técnicas de cultivo em

massa de algas utilizadas na alimentação direta ou indireta das larvas possibilitando a

45

transferência dos nutrientes para um nível trófico superior (Sipaúba-Tavares e Rocha,

1993; Brown et al.,1997).

Existem diversas espécies de algas e zooplâncton que não possuem tecnologia

de cultivo em larga escala. Porém foram realizados estudos com enfoque na produção

em pequena escala (Sipaúba-Tavares, 1988; Sipaúba-Tavares e Rocha, 1993; Sipaúba-

Tavares et al.,1994; Sipaúba-Tavares et al.,1999; Hardy e Castro,2000; Macedo e Pinto-

Coelho, 2000).

A produção de fitoplâncton constitui uma necessidade para viabilizar a

produção de organismos zooplanctônicos que possam ser utilizados na alimentação

inicial de larvas de peixes amazônicos que hoje constitui o maior entrave tecnológico

para a piscicultura de espécies nativas como o tambaqui e matrinxã.

Considerando-se a necessidade de adaptar uma metodologia de cultivo de

fitoplâncton para a produção de zooplâncton, o objetivo deste trabalho foi desenvolver

uma metodologia própria de cultivo de Chlorella sp. que seja de fácil adoção e

economicamente viável, para a produção continua e em massa de alimento vivo de boa

qualidade. Conjectura-se que este alimento seja capaz de suportar a larvicultura

intensiva de peixes utilizados na piscicultura regional que atualmente constitui um elo

fundamental na cadeia produtiva da piscicultura com espécies nativas amazônicas.

46

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no Laboratório de Fitoplâncton da Estação de

Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas-UFAM,

localizada no km 38 da BR 174, em janeiro de 2012.

A partir de cepas isoladas de Chlorella sp. obtidas conforme descrito no capítulo

1, para o cultivo desta espécie em laboratório foram testados dois meios de cultura

distribuídos em dois tratamentos: no tratamento 1 (T1) foi utilizado farinha de peixe

(0,35 g l-1 peneirada e esterilizada a 160°C) (Ismiño-Orbe, 2009) e no tratamento 2

(T2), NPK (2 l l-1 de uma solução padrão de NPK 20:5: 20 g l-1) (Hardy e Diaz-Castro,

2000). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três repetições

por tratamento (Figura 1).

O sistema utilizado para o cultivo foi estático não- axênico. A iluminação foi

mantida constante de aproximadamente 5.000 lux monitorado com luxímetro digital. A

temperatura ambiente, monitorada diariamente quatro vezes por dia (01:00; 07:00;

13:00 e 19:00 horas). As culturas foram mantidas com aeração continua proveniente de

um compressor radial utilizando pedras porosas de aquário.

O cultivo foi iniciado a partir de 20 ml da cepa diluída em um volume 200 ml, e

posteriores diluições para 900 ml; 4 litros; 18 litros e 30 litros efetuados na fase

exponencial de crescimento das células (Figura 2). Em cada diluição e em ambos meios

de cultura foi acrescentada vitamina do complexo B (B1 100mg, B12 5000mcg e B6

100mg) preparada em farmácia de manipulação. Uma cápsula deste complexo

vitamínico foi diluída em 2 litros de água destilada. As dosagens utilizadas podem ser

observadas na tabela 1.

O acompanhamento do crescimento algal foi diário a partir de contagens sob

microscópio óptico com aumento de 10X utilizando uma câmara de Neubauer (Sipaúba-

Tavares e Rocha, 2001). Foram feitas três contagens diárias de cada repetição

totalizando 9 amostras por tratamento.

Para estimar o número de células/ml foi utilizada a fórmula:

d (células/ml) = contagem total x 10 ⁴/n° de blocos contados (Sipaúba-Tavares e

Rocha,2001).

Para a comparação das médias do número de células por tratamento foi utilizado o

teste t calculado com o programa Sigma Stat versão 3.1.

47

Durante cultivo, medidas de assepsia foram praticadas como procedimento de

rotina para evitar a contaminação das amostras. Para evitar a contaminação por insetos e

outras substâncias indesejáveis os recipientes contendo as amostras foram cobertos com

uma malha de 150µ e papel alumínio perfurado.

Volumes (ml) Vitamina B (ml)

200 0,5

900 0,8

4.000 3,5

18.000 19

30.000 30

Tabela 1. Quantidade do complexo vitamínico utilizado por volume

Figura 1. Delineamento experimental inteiramente casualizado

T2 T1 T1 T2 T2 T1

48

A B C

D ED

Figura 2. Unidades experimentais utilizadas para o cultivo: a - 250 ml; b-1000 ml; c- 5 litros; d- 20

lit ros; e- 35 litros.


a b

c d

e

49

RESULTADOS

O cultivo de Chlorella sp. foi iniciado em volume de 200 ml com média de

1.065.000,00 cél.ml- para o meio de cultura farinha de peixe e 369.027,77 cél.ml-1 com

o meio de cultura NPK.

Após 3 dias de cultivo nesta diluição (200 ml) o meio de cultura com farinha de

peixe apresentou uma concentração algal de 7.888.750,00 cél. ml-1 que foi superior

quando comparada ao meio de cultura NPK que foi de 6.415.250,00 cél.ml-1(Figura

3). Entretanto, o teste t aplicado aos dados revelou que não existiu diferença

significativa entre os valores médios finais de cada tratamento (P=0,129).

Após o terceiro dia de cultivo, na diluição de 900 ml o meio com farinha de

peixe alcançou 47.275.00,00 cél. ml-1, enquanto o meio com NPK alcançou

2.912.500,0 cél.ml-1 ,tendo o meio com farinha de peixe um crescimento algal

significativamente maior (P=0, 005) quando comparado com o meio NPK (Figura 4).

Figura 3. Curvas de crescimento de Chlorella sp em volume de 200 ml : a- meio de cu ltura farinha de peixe;b-

meio de cultura NPK

200 ml

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0

2e+6

4e+6

6e+6

8e+6

1e+7

200 ml

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0

1e+6

2e+6

3e+6

4e+6

5e+6

6e+6

7e+6

50

No volume de 4 litros, a fase exponencial de crescimento foi alcançada no

terceiro dia com 4.138.750,0 cél. ml-1 para o cultivo com farinha de peixe e 2858750,0

cél.ml-1 para o cultivo com NPK (Figura 5).O teste t aplicado aos dados revelou que o

crescimento algal no meio de cultura com farinha de peixe foi significativamente

superior que no meio de cultura NPK (P=0, 001).

Figura 5. Curvas de crescimento de Chlorella sp. em volume de 4 litros : a- meio de cultura farinha de peixe;b-

meio de cultura NPK

4 litros

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0

1e+6

2e+6

3e+6

4e+6

5e+6

4 litros

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0

5e+5

1e+6

2e+6

2e+6

3e+6

3e+6

Figura 4. Curvas de crescimento de Chlorella sp. em volume de 900 ml : a- meio de cultura farinha de peixe;b-

meio de cultura NPK

900 ml

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0

1e+6

2e+6

3e+6

4e+6

5e+6

900 ml

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0,0

5,0e+5

1,0e+6

1,5e+6

2,0e+6

2,5e+6

3,0e+6

3,5e+6

51

No volume de 18 litros, a farinha de peixe também se mostrou mais eficiente no

crescimento algal comparado com o meio de cultura NPK com 4.322.500,00 cél. ml-1 e

1.495.000,0 cél.ml-1, respectivamente (Figura 6). O teste t aplicado aos dados revelou

que existia diferença significativa entre os valores médios de cada tratamento (P< = 0,

001) ao terceiro dia de cultivo, onde o T1(farinha de peixe) foi mais eficiente que o T2

(NPK).

No volume de 30 litros o crescimento exponencial foi obtido com dois dias de

cultivo e o número de células obtido utilizando farinha de peixe foi de 5.747.500,00 cél.

ml-1 superior ao número obtido no meio de cultura NPK que foi de 1.557.500,00 cél.ml-

1 .(Figura 7). O teste t aplicado aos dados revelou que o número de células no meio com

farinha de peixe foi significativamente superior (P=< 0,001) aos obtidos com o meio

NPK.

Figura 6. Curvas de crescimento de Chlorella sp. em volume de 18 litros : a- meio de cu ltura farinha de

peixe;b- meio de cu ltura NPK

18 litros

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0

1e+6

2e+6

3e+6

4e+6

5e+6

18 litros

Dias de cultivo

1 2 3

Células/ml

0,0

2,0e+5

4,0e+5

6,0e+5

8,0e+5

1,0e+6

1,2e+6

1,4e+6

1,6e+6

52

Durante o período de cultivo, a média da temperatura diária foi de 26,75º C

como valor mínimo de 24,4º C e máximo de 30,75º C.

Em todas as diluições a farinha de peixe apresentou crescimento exponencial

com três dias de cultivo a exceção daquela de 30 l que durou dois dias. O tempo total da

produção de Chlorella sp.em laboratório foi de 11 dias.

Foi observado que a fase de crescimento exponencial coincide com uma

coloração verde claro uniforme sem grumos. Quando a coloração se torna verde-escuro

e com presença de grumos foi observado que o número de células diminui

caracterizando a fase senescente (Figura 8).

Figura 7. Curvas de crescimento de Chlorella sp. em volume de 30 litros : a- meio de cu ltura farinha de peixe;b-

meio de cultura NPK

30 litros

Dias de cultivo

1 2

Células/ml

1e+6

2e+6

3e+6

4e+6

5e+6

6e+6

30 litros

Dias de cultivo

1 2

Células/ml

6,0e+5

8,0e+5

1,0e+6

1,2e+6

1,4e+6

1,6e+6

53

Figura 8. Padrão de coloração durante o cultivo de Chlorella sp. nas diferentes

diluições utilizadas:a-200 ml; b-900 ml ;c- 4 litros; d- 18 lit ros; e- 30 litros



54

DISCUSSÃO

Em cultivos controlados de algas os meios de cultura oferecem os nutrientes

necessários para o crescimento ótimo das espécies (Fioresi e Sipaúba-Tavares, 2008). A

densidade de células no cultivo depende da espécie e do tipo de fertilizante utilizado,

interagindo com as variáveis físicas e químicas no desenvolvimento e crescimento da

microalga (Sipaúba-Tavares et al.,1999).

Neste estudo o cultivo de Chlorella sp. com o meio de cultura farinha de peixe

apresentou no final do experimento densidade média de células significativamente

maior que no NPK em todas as diluições a exceção da de 200 ml.

Vários meios de cultura alternativos vêm sendo utilizados para o cultivo de

Chlorella, entre eles estão os efluentes industriais, efluentes de biogestores, lodo

digerido, esgoto domestico e resíduos de suinocultura (Pipes e Gotaas,1960; Wong e

Lay,1980;Jussiak et al.,1984; Rodriguez,2000;Sanchez et al,2001).

Ismiño-Orbe (2009) trabalhando com produção de S.quadricauda mostrou a

eficiência da farinha de peixe como meio de cultura para a produção massiva desta

espécie que por sua vez foi utilizada para a produção de organismos zooplanctônicos

que foram utilizados na larvicultura de tambaqui e surubim. Neste trabalho foi também

demonstrada a eficiência da farinha peixe com produção de 5.747.500,00 cél. ml-

1.cel.ml que não podem ser comparados com os dados da referida autora, pois a mesma

não fornece dados quantitativos.

Pereira (2001) utilizando meio de cultura NPK para o cultivo de

Ankistrodesmus gracilis afirma que o mesmo foi eficiente tanto em pequena como em

larga escala promovendo fase exponencial em cinco dias com número máximo de

células de 119, 30 x104 cél.ml-1. Hardy e Diaz-Castro (2000) trabalhando com os meios

tradicionais NPK (20:5: 20) e Chu 12, afirmam que o Scenedesmus quadricauda teve

bom desenvolvimento em ambos os meios, com crescimento exponencial entre 5 e 7

dias e tendência de melhor crescimento no meio NPK com 107 células.ml-1.

Klein e Gonzalez (1993), testando diferentes meios de cultura (água de

matadouro, vinhoto e caldo de peixe) para o cultivo de Tetraselmis chuii obteve bons

resultados com caldo de peixe apresentando densidade celular de 201 x 104 céls.ml-1, no

55

entanto o cultivo com a farinha de peixe, utilizada neste trabalho, teve resultados

superiores em número de células/ml-1 .

No presente estudo no decorrer de 11 dias foram obtidos 5.7475.00,00 cél. ml-1

em farinha de peixe e 1.557.500,00 cél.ml-1 no NPK. Vendrúsculo (2009), testando o

cultivo da Chloropyceae, Scenedesnus quadricauda com biodigerido de aves obteve

um pico máximo de 1.327.756 células/ml no sétimo dia, totalizando 14 dias de cultivo.

O número de cél.ml‾1 foi menor ao encontrado com farinha de peixe. O mesmo afirma

que o cultivo da microalga Scenedesmus quadricauda atinge o máximo

desenvolvimento num intervalo de 8 a 11 o que também foi observado neste estudo

(11dias) para Chlorella sp.

Rodrigues e Belli Filho (2004), cultivando Chlorella minutissima em meio de

esterco suíno, obtiveram um pico de crescimento ao redor do 7o dia em menor

densidade (2,1 x 105 células.ml-1), quando comparado aos resultados deste estudo com

farinha de peixe e NPK.

Neste trabalho a multiplicação das células de Chlorella sp. e S.quadricauda

ocorreu em temperaturas entre 25 e 27ºC semelhantes aquelas utilizadas por Ohse et

al.(2008) e Pequeno et al.(2012) para o cultivo de Chlorella sp. (25±2º C e 28 ± 3°C

respectivamente).Vendrúscolo (2009) utilizou a temperatura de 24º C para

S.quadricauda. Já no estudo sobre qualidade nutricional de S.quadricauda desenvolvido

por Macedo (1999) a temperatura foi de 20º C. Sipaúba-Tavares e Rocha (2001) propõe

temperatura de 25º C para o gênero Chlorella.

Pequeno et al (2012) e Oshe et al (2008), estudando o efeito da temperatura no

crescimento de microalgas encontraram densidades de 7,5 cél.ml‾1 e 772x104 cél.ml‾1

em temperaturas de 28 ± 3°C e 25º C respectivamente. Os intervalos de temperatura

encontrados neste estudo (24,4º C e 30,75º C) foram semelhantes aos resultados

referidos pelos autores.

Comparando o efeito da iluminação sobre o crescimento celular com os dados

de Portella et al.(1997); Hardy e Diaz-Castro(2000); Oshe et al (2008) e que utilizaram:

3200 a 4000 lux; 2500 lux respectivamente. Estes resultados foram semelhantes a

luminosidade utilizada neste trabalho que foi de aproximadamente 5000 lux.

De acordo com as observações realizadas neste experimento a densidade algal

estava relacionada com a tonalidade de coloração sendo o verde claro sendo a cor

característica de cultura em crescimento exponencial quando foram realizadas as

56

diluições. A cor verde escura com formação de grumos foi característica de células em

fase senescente cuja qualidade pode prejudicar seu crescimento.

Em termos práticos para a produção massiva de algas a coloração das culturas

pode ser uma referencia para determinar o momento em que deve ser realizada a

diluição para volumes maiores e que poderia ser adotado pelo setor produtivo.

57

CONCLUSÕES

1. O meio de cultura farinha de peixe foi mais eficiente para a produção de

Chlorella sp.

2. O tempo de cultura para a produção de Chlorella sp. em laboratório, foi de 11

dias com temperatura entre 24,4 e 30,75ºC e luminosidade de aproximadamente

5000 lux.

58

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61

Produção de Moina sp. (CLADOCERA: MOINIDAE) para utilização na

larvicultura do matrinxã (Brycon amazonicus)

RESUMO

Os organismos zooplanctônicos da classe Cladocera são considerados recursos alimentícios para a aquicultura, pois são fonte valiosa de proteínas, aminoácidos, lipídeos, ácidos graxos, minerais e enzimas digestivas. Estes organismos formam parte

da dieta de várias espécies de peixes amazônicos nas primeiras fases de desenvolvimento. O objetivo deste trabalho foi produzir Moina sp. em larga escala para

sua utilização como alimento de larvas de matrinxã. O experimento foi realizado na Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas-UFAM. Foram utilizadas seis caixas de fibra de vidro retangulares com área

útil de 200 litros providas de aeração constante. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com dois tratamentos (T1 e T2) e três repetições por

tratamento. No T1 foi utilizada a farinha de peixe (0,35 g l-1) como fertilizante para a produção de Chlorella sp. que foi utilizada como alimento da Moina sp., e no T2 NPK (20: 5: 20 g l-1 ). No sétimo dia de produção foi realizado um reforço da adubação com

25% da dosagem inicial. Foi utilizado o fotoperíodo natural (12 horas claro:12 horas escuro). Foram monitoradas duas vezes por dia (7:00 e 16:00 horas) as variáveis ambientais: temperatura do ambiente e da água, oxigênio dissolvido, pH e

condutividade elétrica. Para comparar as médias do número de indivíduos por litro de Moina sp. em cada tratamento foi utilizado o teste t. A produção foi iniciada com um

volume de 90 ml de um concentrado de Moina sp. contendo em média 1.320 indivíduos. Foram realizadas coletas diárias em cada unidade experimental obtendo uma amostra de seis litros retirado de seis pontos. As amostras contendo Moina sp. foram concentradas

em 90 ml. Deste concentrado foram retiradas três subamostras fixadas em formol tamponado a 6% para posterior contagem. A temperatura média diária do ambiente foi

26,22 ° C. Os valores médios diários das variáveis físicas e químicas da água foram: T1: T °C =31,88; O2=3,82 mg l-1 ; pH =7,82 ;Condutividade = 165,49 μs cm-1 ; T2:T°C =31,88;O2 = 4,14 mg l-1; pH=7,26; Condutividade =171,40 μs cm-1. O número máximo

de indivíduos para T1 (9.055,05 indivíduos l-1) ocorreu no décimo segundo dia e no T2 (2.785,05 indivíduos l-1) no sexto dia de produção. No final do experimento foi

verificado que existiram diferenças significativas no número máximo de indivíduos produzidos P = 0,009. O tempo de produção em cada caixa no T1 foi de cinco dias e no T2 de três dias. A farinha de peixe foi mais eficiente que o NPK para a produção de

Moina sp..

Palavras-chave: Cladocera, Moina, alimento vivo, larvicultura, matrinxã.

62

Production of Moina sp. (Cladocera: MOINIDAE) for use in the hatchery

matrinxã (Brycon amazonicus)

ABSTRACT

The class Cladocera zooplankton food resources are considered for aquaculture because they are valuable source of protein, amino acids, lipids, fatty acids, minerals and digestive enzymes. These organisms are part of the diet of many species of fish

Amazon in the early stages of development. The aim of this work was to produce Moina sp. large scale for use as food for larvae matrinxã. The experience was co nducted at

Station Aquaculture Experimental Farm of the Federal University of Amazonas-UFAM. A total of six fiberglass boxes with rectangular floor area 200 liters fitted with constant aeration. The experimental design was completely randomized with two treatments (T1

and T2) and three replicates per treatment. T1 was used in fishmeal (0.35 g l-1) as a fertilizer for the production of Chlorella sp. which was used as food Moina sp. and T2

NPK (20: 5: 20 g l-1). On the seventh day of production was enhanced fertilization performed with 25% of the initial dosage. We used the natural photoperiod (12 hours light: 12 hours dark). Were monitored twice daily (7:00 and 16:00 hours) environmental

variables: temperature of the environment and water, dissolved oxygen, pH and electrical conductivity. To compare the average number of individuals per liter of

Moina sp. in each treatment t test was used. The production was initiated with a volume of 90 ml of a concentrated Moina sp. containing on average 1320 individuals. Were collected daily in each experimental unit by obtaining a sample of six liters removed six

points. Samples containing Moina sp. were concentrated to 90 ml. This concentrate was withdrawn three subsamples fixed in buffered formalin for later counting 6%. The average daily temperature of the environment was 26.22 ° C. The daily average values

of physical and chemical parameters of the water were: T1: T = 31.88 ° C, O2 = 3.82 mg l-1, pH = 7.82; Conductivity = 165.49 mS cm-1, T2 : T ° C = 31.88; O2 = 4.14 mg

l-1, pH = 7.26; = 171.40 Conductivity mS cm-1. The maximum number of individuals to T1 (9055.05 individuals l-1) occurred on the twelfth day and T2 (2785.05 individuals l-1) on the sixth day of production. At the end of the experiment it was found that there

were significant differences in the maximum number of individuals produced P = 0.009. The production time in each case was at five days T1 and T2 in three days. Fishmeal

was more efficient than the NPK for producing Moina sp. Keywords : Cladocera, Moina, live feed, hatchery, matrinxã.

63

Capítulo 03: Produção de Moina sp. (CLADOCERA: MOINIDAE) para utilização

na larvicultura de matrinxã (Brycon amazonicus)

INTRODUÇÃO

Dentre os organismos zooplanctônicos os Cladocera representam um dos grupos

mais característicos de águas doces sendo popularmente conhecidos como “pulgas

d’água” (Sipaúba-Tavares & Rocha 2001). Possui tamanho entre 0,2 e 3,0 mm, a

reprodução é partenogenética ou partenogenética cíclica com ciclos de vida curtos, as

fêmeas produzem de 1 a 40 ovos, os recém-nascidos denominados neonatas, são

morfologicamente similares aos adultos, porém bem menores (Infante,1988; Sipaúba-

Tavares e Rocha,2001).

Os Cladocera nadam por meio de suas antenas, são filtradores, se alimentam de

plâncton ou detritos (Barnes, 1984). Constituem-se itens alimentares indispensáveis na

dieta de diferentes espécies de peixes, pois são presas de fácil captura nos estágios em

que a predação é visual (Infante 1988).

Varias espécies de Cladocera no âmbito mundial são considerados recursos

alimentícios para a aquicultura, pois são fonte valiosa de proteínas, aminoácidos,

lipídeos, ácidos graxos, minerais e enzimas digestivas, são de fácil cultivo, e tem a

facilidade de elevar seu valor nutricional graças a sua capacidade filtradora (Pinto-

Coelho, 1991; Prieto et al. ,2006). Pereira (2001) afirma que os cladóceros conseguem

monopolizar quase toda a produção primária em curtos períodos de tempo.

Uma das limitações na produção aquicola é a obtenção e produção de alimento

de baixo custo que cumpra com os requerimentos para as espécies de peixes objeto de

cultivo (Torrenteira e Tacon, 1989). Os cladóceros são importantes como alimento vivo

nas fases iniciais do desenvolvimento de peixes de consumo e ornamentais. Seu cultivo

é relativamente fácil, entretanto, a produção e conhecimento sobre algumas espécies são

incipientes e limitados a práticas de fertilização orgânica nos viveiros (Figueiredo e

Cabrera 1988; Taco, 1989; Martinez e Gutierrez, 1991).

O uso de espécies nativas de Cladocera na alimentação de larvas até hoje tem

sido limitado por ausência de tecnologias de manejo que permitam obter massivamente

populações que supram em qualidade e quantidade os requerimentos básicos das

diferentes espécies de peixes objeto de cultivo (Prieto et al.,2006).

64

Alguns trabalhos têm sido realizados utilizando determinadas espécies de

microalgas, com destaque para os gêneros Chlorella, Scenedesmus e Ankistrodesmus,

visando à produção de Cladocera para a larvicultura de peixes (Sipaúba-Tavares e

Rocha, 1993;Pereira,2001; Prieto,2003; Prieto et al ,2006).

Conforme o exposto, podemos inferir que os trabalhos realizados sobre

produção de zooplâncton com objetivo de alimentação de organismos aquáticos, estão

limitados a produção em pequena escala, sendo necessários esforços em termos de

pesquisa para gerar informações que viabilizem a produção em larga escala atendendo

as necessidades de produção de formas jovens em quantidades adequadas que possam

ser utilizadas pelo setor produtivo.

Fonseca (1999) afirma que os estudos de alimentação que envolvem a

disponibilidade e preferência alimentar, norteiam aspectos indispensáveis para a

utilização do alimento natural e a busca de uma cultura mais eficiente, principalmente

para espécies neotropicais, bastantes desconhecidas neste aspecto.

De acordo com Bachion (1996), uma vantagem do cultivo dos cladóceros é que

sob condições ótimas de temperatura, alimento e qualidade da água, pode-se obter um

grande número de indivíduos num curto período de tempo, devido à sua reprodução

partenogenética e ao seu curto ciclo de vida.

A Moina micrura, desempenha importante papel nos ecossistemas aquáticos de

água doce como fonte de alimentação nos estágios juvenis dos peixes (Fonseca, 1991).

É uma das espécies mais abundantes em viveiros de piscicultura (Pereira, 1998). Tem

sido muito estudada por suas condições ótimas de cultivo, alto valor nutritivo e

facilidade de produção (Wiwattanapatapee et al.,2002).

Moina micrura possui enzimas importantes como as proteinases, peptidases,

amilases, lípases e celulases que servem como exoenzimas no intestino das larvas.

Algumas espécies podem apresentar 60% de proteína do seu peso seco e aminoácidos

favoráveis para os requerimentos nutricionais de alevinos de peixes bem como gordura

total por peso seco de 20 a 27% para as fêmeas adultas e de 4 a 6% para os juvenis

(Zimmermann,1998; Rottman, 1999; Sipaúba-Tavares e Rocha, 2001).

Na região amazônica, a piscicultura apresenta posição de destaque dentro das

criações de animais voltadas à produção de alimento. Todavia, as características de

algumas espécies nativas recomendadas para o cultivo não permitem eficiente

propagação em cativeiro (Fim e Hardy, 1993) como é o caso da matrinxã que apresenta

comportamento canibal nas primeiras fases de desenvolvimento.

65

O canibalismo durante a fase larval de espécies nativas como a matrinxã e

surubim tem sido um dos problemas que dificulta a oferta de alevinos aos produtores.

São de extrema importância, estudos que possam contribuir para a diminuição da

mortalidade por canibalismo, apontado como uma das maiores causas de mortalidade no

início do desenvolvimento.

Uma das estratégias apontadas na literatura para aumentar a sobrevivência na

fase larval é a oferta de alimento vivo que atenda as demandas nutricionais. Assim, a

produção de organismos planctônicos se torna uma demanda emergencial para

implementar programas de manejo alimentar das espécies com comportamento canibal.

Neste contexto, o objetivo desta pesquisa foi estudar o crescimento

populacional do Cladocera Moina sp. em cultivo experimental utilizando como dieta a

microalga Chlorella sp. tendo como fertilizante a farinha de peixe e NPK.

Os resultados obtidos neste trabalho poderão servir inicialmente como base nas

experiências sobre manejo alimentar durante a larvicultura da matrinxã, já que vários

estudos demonstraram que esta espécie tem acentuado comportamento canibal durante a

larvicultura, tem preferência alimentar por cladóceros e seletividade por espécies do

gênero Moina (Senhorini et al.,2002; Sampaio,2010).

As experiências bem sucedidas poderão também ser adotadas para o manejo

alimentar de formas jovens de outras espécies de interesse para a piscicultura regional e

com isto contribuir para aumentar a produção de peixes jovens que atenda as demandas

do setor produtivo, fortalecendo assim a cadeia produtiva da piscicultura no Amazonas.

66

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no Setor de Produção de Zooplâncton e larvicultura,

da Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da UFAM, localizada no km 38 da

BR 174, Manaus-Presidente Figueiredo, em fevereiro de 2012.

Foram utilizadas seis caixas de fibra de vidro retangulares com área útil de 200

litros, providas de aeração. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado

com dois tratamentos (T1 e T2) cada um com três repetições (F igura 1). No T1 foi

utilizada a farinha de peixe (0,35 g l-1) (Ismiño-Orbe, 2009), e no T2 NPK (20: 5: 20 g

/l-1) ambos utilizados como fertilizante para a produção de Chlorella sp. que constituiu

o alimento da Moina sp.

A farinha de peixe foi peneirada e aquecida em estufa a 160°C durante uma

hora visando diminuir ao máximo a contaminação. Em todas as unidades foram

adicionados 30 litros do inoculo de Chlorella sp. cultivada em laboratório como

resultado do capitulo 2 desse trabalho e mais 170 litros de água. Nas caixas do T1 foi

adicionado 70 g de farinha de peixe e nas do T2 800 ml de solução padrão de NPK

(20:5:20 g/l). No sétimo dia de produção foi realizado um reforço da adubação

utilizando 25% da dosagem inicial (T1-17,5 g e T2-200 ml).

A produção foi iniciada com um inoculo 90 ml de um concentrado de Moina

sp. contendo em média 1.320 indivíduos, proveniente de isolamento e reprodução de

indivíduos coletados em viveiros utilizando uma rede de zooplâncton de 50 µm.

Para o isolamento dos indivíduos de Moina sp. a amostra obtida nos viveiros

foi filtrada com peneiras de diferentes aberturas de malha com finalidade de concentrar

o zooplâncton. Foi realizada a triagem de 50 indivíduos sob estereomicroscópio,

utilizando pipeta Pasteur, previa identificação com auxílio de chave taxonômica

(Lourdes e Loureiro, 1997). Este material foi transferido para béqueres contendo 800 ml

de cultura algal onde foram mantidos durante 8 dias a temperatura entre 27 e 29°C e

aeração moderada e constante.

Durante a produção foi utilizado fotoperíodo natural (12 claro: 12 escuro).

Foram monitoradas as variáveis ambientas: oxigênio dissolvido, temperatura ambiente,

temperatura da água, pH e condutividade elétrica as 7:00 e 16:00 horas.

Para acompanhar o crescimento populacional foram realizadas coletas diárias

obtendo uma amostra de seis litros retirada de seis pontos de cada unidade experimental

67

(Figura 2). A amostra obtida de Moina sp. foi concentrada em 90 ml da qual se

retiraram três subamostras de 1 ml utilizando uma seringa adaptada para essa

finalidade. As contagens foram feitas separando os indivíduos em: fêmeas grávidas ,

jovens e neonatas.

As médias do número de indivíduos entre tratamentos foram comparadas

utilizado o teste t a 5% de probabilidade com o programa Sigma Stat 3.1.

T1 T2

T2 T1 T1

T2

X X

X X

X X

Figura 2. Pontos de coleta das amostras nas

unidades experimentais, para a contagem dos

indivíduos


Figura 1. Desenho experimental inteiramente cassualizado.


68

RESULTADOS

A Moina sp. (Figura 3) foi a espécie predominante nos viveiros da estação de

aquicultura da Fazenda experimental da UFAM e foi utilizada neste trabalho. No meio

com farinha de peixe, a partir do 7º dia de criação a produção de Moina aumentou até o

12º dia quando alcançou o pico máximo com uma média de 9.055,05 indivíduos. l-1.

Podemos inferir que o tempo efetivo de produção foi de cinco dias. Já com o meio de

NPK foram obtidas maiores produções entre o sexto e oitavo dia com pico no 6 º dia

alcançando uma média de 2.785,05 indivíduos.l-1, com 3 dias de produção efetiva

(Figura 4).

A farinha de peixe apresentou maior desempenho em termos de tempo de

produção e número de indivíduos por litro com, com P=0,009 sendo significativamente

superior ao NPK. O tempo de duração do experimento da Moina sp. nos dois

tratamentos foi de 13 dias com o número máximo de indivíduos no 12º na farinha de

peixe e 6º dia no NPK.

Nos picos de produção diária, as formas jovens predominaram em ambos os

meios e quando diminuiu a produção, os neonatas foram mais abundantes no meio com

NPK (Figura 5 e 6).

Os valores médios diários das variáveis físicas e químicas da água foram: T1:

T °C =31,88; O2=3,82 mg. l-1 ;pH =7,82 ; Condutividade = 165,49 μs.cm-1 ;T2:T° C

=31,88;O2 = 4,14 mg l-1;pH=7,26; Condutividade =171,40 μs.cm-1; A temperatura

média diária do ambiente foi 26,22 ° C (Tabela 1).

B

Figura 3. Espécie utilizada para a produção: a- Moina sp;

Fonte: Arquivo pessoal e

69

Dias

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Indivíduos/litro

0

2000

4000

6000

8000

10000

Dias

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Indivíduos/Litro

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Figura 5.Densidade média de Moina sp. por estágio de desenvolvimento na produção

com o meio de cu ltura farinha de peixe

Fonte:Arquivo pessoal

Farinha de Peixe

Farinha de Peixe NPK

Dias

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Indivíduos/litro

0

2000

4000

6000

8000

10000

Dias

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Indivíduos/Litro

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Figura 4.Desenvolvimento populacional da Moina sp. : a- Meio de cultura farinha de peixe; b-Meio de

cultura NPK

Farinha de Peixe NPK

70

Variáveis Valores médios e Desvio Padrão

T1 T2

Temperatura da água 31,88±2,11 oC 31,88±2,14 oC

Oxigênio Dissolvido 3,82±0,82 mg/l 4,41±0,64 mg/1

pH 7,82±0,34 7,26 ±0,48

Condutividade Elétrica 165,49±11,70 µs/cm2 171,40±14,41 µs/cm2

Tabela 1. Valores médios e desvio padrão das características ambientais durante o

experimento

NPK

Figura 6. Densidade média de Moina sp. por estágio de desenvolvimento na produção

com o meio de cu ltura NPK

Fonte:Arquivo Pessoal

71

DISCUSSÃO

A produção de peixes com fins aquicolas depende em grande parte da

disponibilidade de organismos zooplanctonicos para alimentação durante a larvicultura.

Neste sentido, os cladóceros, Moina sp. constituem uma boa ferramenta na aquicultura

devido a várias características que facilitam sua produção, como rápido

desenvolvimento, alta taxa de multiplicação, fácil manejo, facilidade de elevar seu valor

nutricional mediante enriquecimento graças a sua capacidade filtradora entre outros

aspectos (Martínez et al 1988;Montealegre,1996; Atencio-García 2000; Prieto,2000;

Prieto et al.,2006).

Pereira (1998), trabalhando em viveiros de piscicultura, verificou que a espécie

de Cladocera mais abundante foi a Moina micrura, o mesmo foi observado neste

trabalho durante as coletas realizadas nos viveiros da fazenda experimental em que o

gênero Moina foi predominante. A mesma refere que o crescimento das populações de

Cladocera é influenciado pela fecundidade dos indivíduos e está relacionada

diretamente com a temperatura da água, quantidade e qualidade do alimento do

alimento disponível. Ghidini e Santos-Silva (2009), analisando a distribuição nictemeral

da biomassa dos organismos, durante a seca no lago Tupé, Amazonas, verificaram que

M.minuta foi responsável pela maior contribuição da biomassa dos Cladóceros.

Algumas características taxonômicas são importantes para a identificação do

gênero Moina e foram observados para identificação: com carapaça translucido

quitinoso; ser comprimido lateralmente, pós-abdômen proeminente com garras

terminais, cinco pares de patas torácicas, presença pares de antenas e reprodução

partenogenética (Prieto, 2000).

Ismiño-Orbe (2009), vem obtendo ótimos resultados em termos quantitativos e

qualitativos utilizando farinha de peixe como fertilizante para a o cultivo de

S.quadricauda para a produção em larga escala de zooplancton (cladóceros e rotíferos)

para a larvicultura de peixes nativos como Colossoma macropomum; Prochilodus

nigricans; e Pseudoplatystoma fasciatum. Isto pode ser comprovado nos resultados

desse experimento que obteve um número de indivíduos elevado num curto espaço de

tempo (13 dias).

72

Romero Lopez (2009), trabalhando com Moina sp. alimentada com a microalga

Scenedesmus sp. cultivada com resíduos da industria pesqueira obteve no 13º dia de

produção o número máximo de 3000 ind.l-1 , com 14 dias totais de produção.

Comparando os resultados acima citados com os obtidos nesse estudo, o

numero de indivíduos por litro foi menor que o encontrado na produção com farinha de

peixe e maior que com o NPK. Isto pode estar relacionado com o valor nutritivo do

alimento que influencia a taxa de crescimento de uma população. Podemos inferir que o

meio de cultura em que a microalga e cultivada influencia diretamente no número de

indivíduos do zooplâncton alimentado com este ítem, uma vez que são fontes de

nutrientes importantes tanto em termos qualitativos quanto quantitativos. Em termos

dias de produção o resultado foi similar com diferença de um dia para o experimento

realizado com Scenedesmus.

Prieto et al (2006), produzindo Moina sp. obteve uma densidade máxima

estimada de 48,30 x102 ind.l -1 em 14 dias de produção com uma dieta de

Ankistrodesmus sp.Já a dieta de Ankistrodesmus sp. + Saccharomyces cereviseae

obteve 112,89 X 102 ind.l -1 em 12 dias, apresentando melhor resultado no aumento do

número de indivíduos. Porém se compararmos ao no de ind.l-1 produzido com o uso da

farinha de peixe verificamos que esta foi mais eficiente com 9.055,050 ind.l-1 com

tempo de produção de 13 dias.

Macedo (1999), utilizando duas dietas (Ankistrodesmus gracilis e Scenedesmus

quadricauda) cultivadas com o meio Chu12 e oferecidas a Cladocera, Moina micrura,

produziu 300 ind.l-1 no 10º dia para o primeiro e 200 ind.l-1 no 12º dia para o segundo,

totalizando 14 dias de produção. Enquanto Nascimento (1989), obteve 3160 ind l-1 no

14º dia de produção de Moina micrura alimentadas com Monaraphidium

densus,totalizando 17 dias de produção, sendo 7 dias efetivos.

Klein e Gonzalez (1993) utilizando caldo de peixe, que é considerado um meio

de cultura com fertilização orgânica, para o cultivo da microalga Tetraselmis chuii

apresentou bons resultados chegando a atingir 201 x 104 cel/ml no experimento inicial e

156 x 104 cel/ml na repetição. De acordo com Oliveira e Koening (1984), o caldo de

peixe apresenta os seguintes nutrientes: NO3=0,48; NO2=10,60; PO4= 48,20.

Dessa forma a farinha de peixe se constitui numa alternativa que apresentou

resultados satisfatórios para o cultivo da microalga Chlorella sp. destinada a produção

de organismos zooplanctônicos para a larvicultura de organismos aquáticos.

73

Macedo (2001) utilizou uma temperatura media de 22,6º C para a produção de

Moina sp. Rodriguez- Estrada et al (2003), estudando o efeito da temperatura e tipo de

alimento no desenvolvimento da Moina micrura concluiu que esta espécie apresenta

desenvolvimento satisfatório em temperatura media de 25º C onde se registrou um

maior numero de neonatos. Murugan (1975) registrou 13 dias de produção de

M.micrura alimentada com seston a temperatura de 28º C. Por outro lado, Jana e Pal

(1985) registraram19 dias de produção para a mesma espécie alimentada com resíduos

da extração de óleo de Madhuca indica e 9 dias quando se alimentou com resíduos de

arroz, sendo o intervalo da temperatura em ambos os casos de 29 a 32o.

Prieto et al (2006), registrou temperatura entre 22.57± 0.40°C y 22.44± 0,40°C

não encontrando interferência na produção de Moina sp., pois se mantiveram estáveis

nesse período. Romero et al (2009), registrou temperaturas entre 25 e 27º C na produção

de Moina sp., pH entre 7 e 8; OD entre 7,5 e 9,9 mg.l-1.

Pereira (2001) afirma que na produção de Diaphanossoma birgei, os tanques

com maiores temperaturas (23,2 ± 3,7º C) apresentaram 37,9 % de neonatas; 53,2% de

jovens 70,9 % de adultos. Já em tanques com menor temperatura (21,11 ± 1,4º C) foram

visualizadas poucas neonatas, enquanto jovens e adultos apresentaram percentuais

variando de 8,3 a 37,9% e 62,1 a 81,7%.

Rottmam et al .(2003), demonstraram que a Moina sp. é resistente e tolerante a

variações significativas de temperatura de 5 a 31º C. Hoff e Snell (1997), propõem o

intervalo de temperatura ótimo para esta espécie entre 24 a 31º C.

Velasques (1986), afirma que para ambientes naturais varias espécies de

Cladocera se desenvolvem com pH entre 7,4 e 8,3.

As concentrações de oxigênio dissolvido na água não são limitantes para a

produção de Cladocera . Rottman et al (2003), afirma que em técnicas de cultivo para o

gênero Moina há uma tolerância destes organismos em ambientes carentes em O2.

Durante o experimento as variáveis ambientais se comportaram de maneira

similar em ambos os tratamentos, sem variações que pudessem interferir na produção de

Moina sp.

Observou-se que o reforço da adubação de 25% da quantidade inicial dos

meios utilizados, proporcionou um aumento no número de indivíduos em ambos os

tratamentos, sendo que no T1 o tempo de produção iniciou-se após esta adubação.

Podemos sugerir que esta medida pode ser praticada de quatro em quatro dias para

aumentar os dias de disponibilidade de Moina sp. para a larvicultura.

74

75

CONCLUSÕES

1. A produção de Moina sp. utilizando como fertilizante farinha de peixe foi mais

eficiente que o meio NPK.

2. O tempo total para a produção de Moina sp. foi de 13 dias;

3. A farinha de peixe constitui um fertilizante alternativo que pode ser utilizado

para a produção de cladóceros tanto em pequena como larga escala.

76

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Isolamento e produção de Chlorella sp..pdf