ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI · PDF fileISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI ETIL ASETAT TUMBUHAN PAKU Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr ... FAKULTAS KEDOKTERAN

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI ETIL ASETAT TUMBUHAN PAKU

Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

AGUNG PRIYANTO NIM. 109102000011

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

JULI 2013/1434 H

iii

HAL AM AN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar. ̀

Nama : Agung Priyanto

NIM : 109102000011

Tanda Tangan :

Tanggal : Juli 2013

iv

HAL AMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : AgungPriyanto

NIM : 109102000011

Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan Dari Fraksi Etil Asetat

Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr

Menyetujui,

Pembimbing I

Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt NIP : 197806302006042001

Pembimbing II

Puteri Amelia, M.Farm., Apt NIP : 198012042011012004

Mengetahui,

Kepala Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Drs. Umar Mansur, M.Sc

v

HAL AMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Agung Priyanto NIM : 109102000011 Program Studi : Farmasi Judul : Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan Dari Fraksi Etil Asetat

Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr.

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Ismiarni komala, M.Sc., Ph.D., Apt ( )

Pembimbing II : Putei Amelia, M.Farm., Apt ( )

Penguji I : Prof. Atiek Soemiati, M.Si., Apt ( )

Penguji II : Eka Putri, M.Si., Apt ( )

Ditetapkan di : Ciputat Tanggal : Juli 2013

vi

ABSTRAK


Program studi : Farmasi

Judul :Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan dari Fraksi Etil Asetat Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr.

Tumbuhan paku digunakan secara luas dalam pengobatan tradisional seperti pengobatan inflamasi, infeksi, impotensi dan permasalahan dalam kehamilan. Ekstrak etanol Nephrolepis falcata dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC5072 µg/mL (Komala, 2012). Studi pendahuluan terhadap aktivitas antioksidan, menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan dan etil asetat dari Nephrolepis falcata aktif dalam menangkap radikal 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Studi lebih lanjut dalam mengisolasi komponen kimia dari ekstrak etil asetat, memperoleh senyawa aktif antioksidan, yang diduga sebagai senyawa β-sitosterol. Struktur kimia di elusidasi dengan menggunakan metode spektroskopi antara lain (FTIR, UV-Visible dan 1H-RMI) dan data yang diperoleh di hubungkan dengan literatur data dari β-sitosterol. β-sitosterol telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 389,5 µM (Baskar, et al., 2010)

Kata Kunci : Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr, tumbuhan paku, β-sitosterol, triterpenoid.

vii

ABSTRACT

Name : Agung Priyanto

Program study : Pharmacy

Title : Isolation of Active Antioxidant Compound from Ethyl Acetate

Fraction of Ferns Nephrolepis falcata (Cav) C. Chr..

Ferns widely used in traditional medicine against inflammation, infection, impotence and problems in pregnancy. Ethanol extract of Nephrolepis falcata was reported to have antioxidant activity with IC50 value 31,72 µg/mL (Komala, 2012). Preliminary study on the antioxidant activity, showed that n-hexane and ethyl acetate extracts of Nephrolepis falcata were active scavenging free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Further study on the isolation of the chemical components of the Ethyl acetate extract gave the active antioxidant compound, which was suggested as β-sitosterol. The structure were elucidated by using spectroscopic data such as (FTIR, UV-Visible and 1H-NMR) and the data were compared to the reference data of β-sitosterol. β-sitosterol was known to have antioxidant activity with IC50 value 389,5 µM (Baskar, et al., 2010).

Keyword : Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr, ferns, β-sitosterol, triterpenoid.

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirahmaanirrahiim

Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT, karena atas segala

rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan

penyusunan skripsi dengan judul “Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan Dari

Fraksi Etil Asetat Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr”. Skripsi

ini disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan program pendidikan

tingkat Strata 1 (S1) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatulah Jakarta.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt dan Ibu Puteri Amelia, M.Farm.,

Apt. Selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, waktu, serta

motivasi kepada penulis selama penelitian.

2. Prof.DR (hc). Dr. M. K Tadjudin, Sp. And. Selaku dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatulah Jakarta.

3. Drs. Umar Mansur, M.Sc. Selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatulah Jakarta.

4. Dosen-dosen, staff, karyawan Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatulah

Jakarta serta karyawan Perpustakaan Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatulah Jakarta.

5. Kepada Ka Eris, Ka Tiwi, Ka Lisna, Ka Liken Ka Rani, Ka Yopi, Ka

Rahmadi yang telah memberi banyak bantuan kepada penulis selama

penelitian di kampus.

6. Kepada kedua orang tua penulis bapak Jasmo, dan Ibu Sudjinem, kakak

Rahayu Apriyanti dan adik Aisyah Khumairah yang senantiasa memberi

ix

support, semangat dan doanya kepada penulis. dalam menyelesaikan

skripsi ini.

7. Kepada Dyah Mundir Sari yang telah memberikan motivasi, dukungan dan

semangat kepada penulis, sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini.

8. Sahabat-sahabat Farmasi angkatan 2009. Muhammad Arif, Gian Pertela

Muchammad Irsyad, Wardah Nabiella, Fauziah Utami, Widya Larasaty

Risda Yulianti, Indah fadlul Maula dan seluruh teman-teman farmasi

angkatan 2009, Terima kasih untuk semangat dan motivasinya.

9. Sahabat-sahabat seperjuangan di laboratorium PHA, Ferry Indar

Ardiansyah, M. Muaffaq Zaki, Siti Zamilatul Azkiyah, Putri Assifa,

Maulida Putri Ahdaini.

10. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak

kekurangan, oleh karena itu penulis dengan senang hati menerima segala saran

dan kritik.

Semoga kebaikan yang telah diberikan kepada penulis dicatat sebagai

amal ibadah dan dibalas oleh Allah SWT dan penulis berharap semoga

penelitian ini dapat bermanfaat bagi masyarakat dan dalam pengembangan

ilmu pengetahuan. Aamiin.

Ciputat, Juli 2013

Penulis

x

HAL AMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIRUNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta, Saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 109102000011

Program studi : Farmasi

Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK)

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya

ilmiah saya dengan judul

ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI ETIL

ASETAT TUMBUHAN PAKU Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Dengan demikian persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : Juli 2013

Yang menyatakan,

(Agung Priyanto)

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. v

ABSTRAK............................................................................................................ vi

ABSTRACT ........................................................................................................ vii

KATA PENGANTAR ......................................................................................... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ................... x

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN .................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 3 1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................... 3 1.4 Manfaat Penelitian.............................................................................. 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 5

2.1 Tumbuhan Paku ................................................................................. 5 2.1.1 Habitat Tumbuhan Paku ......................................................... 5 2.1.2 Penggunaan Tradisional Tumbuhan Paku .............................. 5

2.2 Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr ..................................................... 7 2.2.1 Klasifikasi............................................................................... 7 2.2.2 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologis ............................. 7

2.3 Radikal Bebas ..................................................................................... 8 2.3.1 Reaksi Perusakan Radikal Bebas Terhadap Sel ..................... 9

2.4 Antioksidan ........................................................................................ 9 2.5 Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH ............................. 10 2.6 Ekstrak dan Ekstraksi ......................................................................... 12

2.6.1 Ekstraksi Cara Dingin ............................................................ 13 2.6.2 Ekstraksi Cara Panas .............................................................. 14 2.6.3 Macam-macam Teknik Ekstraksi Lain ................................... 15

2.7 Pelarut................................................................................................. 16 2.8 Vaccum Rotary Evaporator ................................................................ 18 2.9 Metode Isolasi .................................................................................... 19

2.9.1 Kromatografi .......................................................................... 19 2.9.2 Kromatografi Lapis Tipis ....................................................... 20 2.9.3 Identifikasi Kromatogram ...................................................... 23

Halaman

xii

2.9.4 Sistem Fase Gerak Pada KLT ................................................ 24 2.9.5 Kromatografi Gas ................................................................... 24 2.9.6 Kromatografi Kolom .............................................................. 25

2.10 Elusidasi Struktur ............................................................................. 26 2.10.1 UV-Visible .............................................................................. 26 2.10.2 Spektrofotometri Infra Merah ................................................ 27 2.10.3 Spektrofotometri Massa ......................................................... 28 2.10.4 Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa (KG-SM) ........... 28 2.10.5 Resonansi Magnetik Inti (RMI) ............................................. 29

2.11 Kerangka Konsep ............................................................................. 30

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 31 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................................. 31 3.2 ALAT DAN BAHAN ........................................................................ 31

3.2.1 Alat ......................................................................................... .31 3.2.2 Sampel Tumbuhan .................................................................. 31 3.2.3 Bahan Kimia ........................................................................... 31 3.2.4 Instrumen ................................................................................ 32

3.3 PROSEDUR KERJA ......................................................................... 32 3.3.1 Pemeriksaan Sampel Tumbuhan ............................................ 32 3.3.2 Penyiapan Simplisia ............................................................... 32 3.3.3 Pembuatan Ekstrak ................................................................. 32 3.3.4 Kromatografi Lapis Tipis ....................................................... 33 3.3.5 Skrining Fitokimia .................................................................. 34 3.3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Dengan DPPH .............. 35 3.3.7 Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan Dengan

Kromatografi Kolom .............................................................. 36 3.3.8 Pemurnian Kristal ................................................................... 37 3.3.9 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Senyawa

Murni ...................................................................................... 37 3.3.10 Uji Kemurnian Senyawa Aktif Antioksidan .......................... 37

3.3.10.1 Kromatografi Lapis Tipis 2 Dimensi ..................... 38 3.3.10.2 Uji Titik Leleh ....................................................... 38 3.3.10.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT) .................................................................. 39 3.3.11 Penentuan Struktur Molekul ................................................... 39

3.3.11.1 UV-Visible .............................................................. 39 3.3.11.2 FTIR ....................................................................... 39 3.3.11.3 1H-RMI .................................................................. 39

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 40

4.1 Penyiapan Bahan ............................................................................... 40 4.2 Ekstraksi ............................................................................................ 41 4.3 Hasil Penapisan Fitokimia .................................................................. 41 4.4 Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .............................................. 42 4.5 Hasil Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Dengan DPPH ................ 43 4.6 Hasil Pemisahan Dengan Kromatografi Kolom ................................. 44 4.7 Hasil Uji Kemurnian Senyawa ........................................................... 46

xiii

4.7.1 Hasil Uji Titik Leleh (Melting Point) ....................................... 46 4.7.2 Hasil KCKT .............................................................................. 46 4.7.3 Hasil KLT 2 Dimensi ................................................................ 46

4.8 Penentuan Struktur Molekul Senyawa Fraksi F2.D ........................... 47 4.8.1 Hasil UV-Visible ....................................................................... 47 4.8.2 Hasil Spektrofotometri Infra Merah ......................................... 48 4.8.3 Hasil Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-RMI) ..................... 48

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 53 5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 53 5.2 Saran .................................................................................................. 53

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 54

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1.Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr .................................................... 7 Gambar 2.2 Struktur molekul senyawa seskuiterpenoid tipe drimane .................. 8 Gambar 2.3 Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipid ..... 10 Gambar 2.4 Reaksi penghambatan antioksidan terhadap radikal DPPH ............. 12 Gambar 3.1 KLT 2 dimensi .................................................................................. 36 Gambar 4.1 Hasil uji kualitatif antioksidan ekstrak .............................................. 42 Gambar 4.2 Hasil uji kualitatif antioksidan isolat ................................................. 44 Gambar 4.3 Hasil KLT 2 dimensi dari senyawa fraksi F2.D ................................ 46 Gambar 4.4 Struktur molekul β-sitosterol ............................................................. 51

Halaman

xv

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Penggunaan Tumbuhan Paku Sebagai Bahan Obat Tradisional ........... 6 Tabel 4.1 Hasil Rendemen Ekstrak n-Heksana dan Etil Asetat ............................ 41 Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Etil Asetat ..................................... 42 Tabel 4.3 Hasil Isolat Dari Ekstrak Etil Asetat ..................................................... 45 Tabel 4.4 Data Geseran Kimia Proton Senyawa Fraksi F2.D yang

diukur pada frekuensi 500 MHz dengan pelarut CDCl3 ....................... 49 Tabel 4.5 Perbandingan Serapan Gugus Fungsi Senyawa

Fraksi F2.D Dengan Senyawa β-sitosterol ........................................... 50 Tabel 4.6 Perbandingan Geseran Kimia Proton Senyawa

Fraksi F2.D Dengan β-sitosterol ........................................................... 51

Halaman

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil determinasi tumbuhan paku Nephrolepis falcata ................. 61 Lampiran 2. Bagan alur ekstraksi tumbuhan paku Nephrolepis falcata ............. 62 Lampiran 3. Uji kromatografi lapis tipis ekstrak etil asetat dan

n-heksana Nephrolepis falcata ...................................................... 63 Lampiran 4. Bagan isolasi senyawa aktif antioksidan tumbuhan paku

Nephrolepis falcata ....................................................................... 64 Lampiran 5. Hasil analisis senyawa fraksi F2.D dengan KCKT ....................... 67 Lampiran 6. Hasil analisis senyawa fraksi F2.D dengan UV-Visible ................. 68 Lampiran 7. Hasil Spektrum IR Senyawa Fraksi F2.D ...................................... 69 Lampiran 8. Hasil spektrum 1H-RMI senyawa Fraksi F2.D ............................... 70 Lampiran 9. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa F2.D (Diperbesar) .................. 71 Lampiran 10. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa F2.D (Diperbesar) .................. 72 Lampiran 11. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa F2.D (Diperbesar) ................... 73 Lampiran 12. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa F2.D (Diperbesar) ................... 74 Lampiran 13. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa F2.D (Diperbesar) ................... 75 Lampiran 14. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa F2.D (Diperbesar) ................... 76 Lampiran 15. Spektrum 1H-RMI senyawa β-Sitosterol ........................................ 77

Halaman

1 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tumbuhan telah banyak digunakan sebagai bahan obat tradisional

sejak zaman dahulu. Berbagai jenis tumbuhan obat telah digunakan oleh

sekitar 80% dari populasi masyarakat dunia, meskipun dalam kebanyakan

kasus, tidak ada penelitian ilmiah yang telah dilakukan untuk membuktikan

khasiat tumbuhan obat tersebut (Verpoorte, et al., 2006). Setidaknya 80%

dari populasi masyarakat dunia diperkirakan masih akan menggunakan obat

tradisional seperti dalam perawatan kesehatan. Dari 40.000 sampai 70.000

jenis tumbuhan obat, sekitar 20% dari semua spesies adalah tumbuhan

tingkat tinggi (Verpoorte, et al., 2006).

Aktivitas farmakologi dari tumbuhan obat, sering tergantung dari

keberadaan senyawa bioaktif yang disebut metabolit sekunder

(Bruneton, 1999; Heinrich, et al., 2004). Dalam tumbuhan, metabolit

sekunder memiliki fungsi penting sebagai perlindungan terhadap predator,

mikroba patogen atas dasar sifatnya yang beracun, dan perlindungan

terhadap herbivora, mikroba, serta beberapa di antaranya juga terlibat dalam

pertahanan terhadap stres abiotik (misalnya paparan UV-B)

(Schafer, et al., 2009), metabolit sekunder juga penting untuk komunikasi

dari tumbuhan dengan organisme lain (Rosenthal, et al., 1991). Metabolit

sekunder dari tumbuhan yang memiliki aktivitas sebagai obat, dilaporkan

terdiri dari lilin , asam lemak, alkaloid, terpenoid, fenolat, antara lain fenolat

sederhana, flavonoid, glikosida, dan turunannya (Sarker, et al., 2006).

Indonesia adalah negara megabiodiversity yang kaya akan tumbuhan

obat, dan sangat potensial untuk dikembangkan, namun belum dikelola

secara maksimal. Kekayaan alam tumbuhan di Indonesia meliputi 30.000

jenis tumbuhan dari total 40.000 jenis tumbuhan di dunia, 940 jenis

diantaranya merupakan tumbuhan berkhasiat obat. Jumlah ini merupakan

90% dari jumlah tumbuhan obat di Asia (Pers, 2010). Berdasarkan hasil

2


penelitian, dari sekian banyak jenis tumbuhan obat, baru 20-22% yang

dibudidayakan (Pers, 2010). Potensi tumbuhan obat di Indonesia, termasuk

tumbuhan obat kehutanan, apabila dikelola dengan baik akan sangat

bermanfaat dari segi ekonomi, sosial, budaya maupun lingkungan.

Tumbuhan paku merupakan tumbuhan yang distribusinya tersebar

luas di Indonesia dan menjadi salah satu sumber kekayaan alam Indonesia.

Tumbuhan paku sangat mudah tumbuh di Indonesia karena iklim Indonesia

sangat cocok untuk pertumbuhan tumbuhan tersebut. Tumbuhan paku

merupakan tumbuhan yang dikenal pertama kali memiliki sistem pembuluh

sejati. Tumbuhan ini tidak menghasilkan biji dan mereka merupakan

tumbuhan yang paling sederhana diantara tumbuhan yang memiliki sistem

pembuluh sejati (Tracheophytes). Tumbuhan paku distribusinya tersebar

luas di seluruh dunia dan jumlahnya melimpah dalam studi geologi.

Tumbuhan paku tumbuh dengan baik di tempat lembab, dingin dan teduh

serta tersedianya air (Fathima, et al., 2007).

Berdasarkan studi fitokimia, tumbuhan paku telah dilaporkan

mengandung senyawa golongan flavonoid, terpenoid, senyawa fenol dan

xanton (Soeders, 1985). Beberapa tumbuhan paku juga telah dilaporkan

memiliki aktivitas biologis seperti antibakteri, antihelmintik, ekspektoran

dan antioksidan (Lai, 2011).

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat mencegah oksidasi dari

molekul lain dengan cara menghalangi inisiasi atau propagasi dari reaksi

oksidasi berantai. Di dalam industri makanan, antioksidan digunakan sejak

lama sebagai bahan aditif untuk melindungi produk makanan dari reaksi

oksidasi yang berhubungan dengan penurunan kualitas makanan seperti

berbau tengik (Lee, et al., 2004).

Telah dilaporkan bahwa antioksidan alami terdapat dalam banyak

tumbuhan yang berfungsi dalam mengurangi kerusakan sel dan membantu

mencegah mutagenesis, karsinogenesis dan penuaan akibat aktivitas radikal

bebas (Lee, et al., 2004). Antioksidan alami telah diisolasi dari berbagai

macam buah-buahan, sayur-sayuran dan tumbuhan obat

(Boveris et al., 2001).

3


Nephrolepis falcata merupakan salah satu tumbuhan paku yang sangat

mudah ditemukan di Indonesia yang banyak digunakan sebagai tanaman

hias. Berdasarkan penelusuran kepustakaan, penelitian mengenai tumbuhan

ini masih sangat sedikit, baik usaha dalam menentukan metabolit sekunder

maupun dalam penggunaannya sebagai bahan obat. Tetapi spesies lain dari

genus Nephrolepis, yaitu Nephrolepis radicans dilaporkan memiliki

aktivitas antioksidan (Dayanti & Suyatno, 2012), dan Nephrolepis bisserata

dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antioksidan dengan nilai

lC50 0,53 mg/mL (Lai, 2011).

Dalam penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh (Komala, 2012),

telah dilaporkan bahwa ekstrak etanol 70% dari tumbuhan

Nephrolepis falcata yang diambil dari wilayah kampus UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai lC50 31,72

µg/mL. Untuk mengetahui jenis metabolit sekunder dalam tumbuhan ini

yang memberikan aktivitas antioksidan, maka dilakukan penelitian lebih

lanjut dalam mengisolasi kandungan metabolit sekunder dari tumbuhan

Nephrolepis falcata yang memiliki aktivitas antioksidan.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan penelusuran pustaka, belum diketahuinya senyawa yang

memberikan aktivitas antioksidan dalam tumbuhan paku

Nephrolepis falcata (cav,) C.Chr.

1.3 Tujuan Penelitian

a. Mengetahui senyawa aktif antioksidan dari fraksi etil asetat tumbuhan

paku Nephrolepis falcata.

b. Menentukan struktur kimia dari senyawa murni hasil isolasi yang

diduga memiliki aktivitas antioksidan dari tumbuhan paku

Nephrolepis falcata.

c. Mengidentifikasi aktivitas antioksidan dari senyawa hasil isolasi.

4


1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada

masyarakat mengenai khasiat dari tumbuhan Nephrolepis falcata, sehingga

dapat digunakan sebagai bahan obat tradisional. Penelitian ini juga

diharapkan memberikan kontribusi bagi perkembangan ilmu pengetahuan

dengan memberikan informasi terhadap aktivitas antioksidan tumbuhan

Nephrolepis falcata. Mengingat tumbuhan ini belum pernah diteliti

sebelumnya, diharapkan ditemukan senyawa baru yang nantinya mungkin

didapatkan yang akan memperkaya pengetahuan dalam bidang kimia bahan

alam.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tumbuhan Paku

Secara taksonomi tumbuhan paku berada diantara tumbuhan tingkat tinggi

(gymnosperma dan angiosperma) dan tumbuhan lumut (bryophyta). Berbeda

dengan alga dan lumut, tumbuhan paku telah memiliki jaringan pengangkut

seperti xilem dan floem tetapi tidak menghasilkan biji untuk reproduksi

seksualnya (Pooja, 2004).

2.1.1 Habitat Tumbuhan Paku

Habitat tumbuhan paku terdiri dari kondisi iklim yang rendah dengan lokasi

khusus pada tempat-tempat lembab dan teduh. Gangguan kecil terhadap kondisi

iklim tempat tumbuh mereka, dapat menyebabkan hilangnya sejumlah besar

spesies.

Tumbuhan paku terdapat dalam jumlah besar di hutan tropis, subtropis,

temperatur dan kelembaban yang rendah dan siklus hidup mereka didasarkan pada

keberadaan hutan (Dudani, et al., 2010).

2.1.2 Penggunaan Tradisional Tumbuhan Paku

Tumbuhan paku telah banyak digunakan sebagai bahan obat tradisional di

beberapa negara, seperti di kepulauan Hawaii yang menggunakan tumbuhan paku

dari spesies Nephrolepis sebagai bahan obat dalam penyembuhan beberapa

penyakit, diantaranya penyakit diabetes, infeksi yang disebabkan jamur ataupun

bakteri. Selanjutnya tumbuhan paku spesies Nephrolepis tuberosa yang secara

tradisional digunakan untuk menurunkan demam. Bagian daun dari tanaman ini

digunakan untuk mengobati perdarahan pada luka dan akar dari tanaman ini

digunakan dalam mengobati infeksi serta sebagai obat batuk

(Ja & Sharma, 2012)

Beberapa tumbuhan paku yang digunakan sebagai bahan obat tradisional

antara lain (Lai, et al., 2011):

6


Tabel 2.1. Penggunaan Tumbuhan Paku Sebagai Bahan Obat Tradisional.

Nama Tumbuhan Penggunaan Sebagai Obat Tradisional

Acrostichum aureum

(Pteridaceae)

Sinus, sakit tenggorokan, kesehatan pada kehamilan, sembelit, obat penurun panas dan nyeri dada.

Blechnum orientale

(Blechnaceae) Untuk pengobatan luka lecet, abses dan impotensi.

Cibotium barometz

(Dicksoniaceae)

Untuk pengobatan tifus, dispepsia, batuk

dan untuk pengobatan penyakit ginjal

dan hati.

Dicranopteris linearis

(Gleicheniaceae)

Sebagai antihelmintik, antibakteri,

pengobatan penyakit asma, gangguan

pencernaan, wasir, tukak lambung,

epilepsi dan nyeri usus buntu.

Drynaria quercifolia

(Polypodiaceae)

Untuk pengobatan tifus, TBC, dispepsia,

penyakit paru-paru, sebagai ekspektoran,

antihelmintik, meredakan sakit kepala

dan radang usus.

Lygodium circinnatum

(Schizaeaceae)

Untuk menetralkan racun ular dan luka

akibat sengatan serangga.

Nephrolepis biserrata

(Nephrolepidaceae) Untuk pengobatan luka lecet dan abses

Pityrogramma calomelanos

(Hemionitidaceae) Untuk pengobatan sakit ginjal

Pyrossia nummularifolia

(Polypodiaceae)

Sebagai obat batuk

7


2.2 Nephrolepis falcata (Cav.) C.Chr

Gambar 2.1. Nephrolepis falcata (Cav.) C.Chr

(Sumber: Koleksi Pribadi, Februari 2013)

2.2.1 Klasifikasi

Kingdom : Plantae

Divisio : Pteridophyta

Class : Polypodiopsida = Filicopsida

Order : Polypodiales

Family : Davalliaceae

Genus : Nephrolepis

Species : Nephrolepis falcata (Cav.) C.Chr.

2.2.2 Kandugan Kimia dan Aktivitas Biologis

Belum ada penelitian sebelumnya yang mempublikasikan mengenai

kandungan kimia dari Nephrolepis falcata. Tetapi spesies lain dari genus

Nephrolepis yaitu Nephrolepis biserrata diketahui bahwa tumbuhan ini

mengandung senyawa seskuiterpenoid tipe drimane (Seims, et al., 1996), dan

dilaporkan bahwa tumbuhan ini memiliki aktivitas sebagai antioksidan

(Lai, et al., 2011). Aktivitas biologis Nephrolepis falcata dilaporkan, bahwa

ekstrak etanol 70% dari tumbuhan tersebut memiliki aktivitas sebagai antioksidan

dengan nilai IC50 31,72 µg/mL (Komala, 2012).

(http://plants.usda.gov, USA Departement Of Agriculture, Maret 2013)

http://plants.usda.gov/

8


Gambar 2.2. Struktur Molekul Senyawa Seskuiterpenoid Tipe Drimane (Seims, et al., 1996).

2.3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom, molekul atau senyawa-senyawa yang

mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan yang bersifat sangat

reaktif dan tidak stabil (Surai, 2003). Agar menjadi stabil, radikal bebas

memerlukan elektron yang berasal dari pasangan elektron di sekitarnya, sehingga

terjadi perpindahan elektron dari molekul donor ke molekul radikal untuk

menjadikan radikal tersebut stabil (Simanjuntak, et al., 2012).

Senyawa radikal yang terdapat dalam tubuh (prooksidan) dapat berasal dari

luar tubuh (eksogen) atau terbentuk di dalam tubuh (endogen) dari hasil

metabolisme zat gizi secara normal (Muchtadi, 2000). Secara eksogen, senyawa

radikal antara lain berasal dari polutan, makanan atau minuman, radiasi, ozon dan

pestisida (Supari, 1996). Sedangkan secara endogen, senyawa radikal dapat timbul

melalui beberapa macam mekanisme seperti autooksidasi, aktivitas oksidasi dan

sistem transpor elektron.

Radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan pada sel dengan cara

mengoksidasi DNA, sehingga DNA mengalami mutasi dan dapat menyebabkan

penyakit degeneratif (Wang, et al., 2002), senyawa radikal bebas juga dapat

menyebabkan kerusakan pada jaringan tubuh sehingga terjadi proses penuaan dan

menimbulkan penyakit autoimun (Muchtadi, 2000)

9


2.3.1 Reaksi Perusakan Radikal Bebas Terhadap Sel

a. Peroksidasi Lemak

Membran sel kaya akan sumber poly unsaturated fatty acid (PUFA),

yang mudah dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi; proses tersebut

dinamakan peroksidasi lemak. Hal ini sangat merusak, karena merupakan

suatu proses berkelanjutan. Pemecahan hidroperoksida lemak sering

melibatkan katalisis ion logam transisi (Droge, 2002).

b. Kerusakan Protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas daripada

PUFA, sehingga kecil kemungkinan terjadinya reaksi berantai yang cepat.

Serangan radikal bebas terhadap protein sangat jarang kecuali bila sangat

ekstensif. Hal ini terjadi hanya jika radikal tersebut mampu berakumulasi

(jarang pada sel normal), atau bila kerusakannya terfokus pada daerah

tertentu dalam protein. Salah satu penyebab kerusakan terfokus adalah jika

protein berikatan dengan ion logam transisi (Droge, 2002).

c. Kerusakan DNA

Seperti pada protein, kecil kemungkinan terjadinya kerusakan pada

DNA menjadi suatu reaksi berantai, biasanya kerusakan terjadi bila ada

lesi pada susunan molekul, apabila tidak dapat diatasi, dan terjadi sebelum

replikasi, maka akan terjadi mutasi. Radikal oksigen dapat menyerang

DNA jika terbentuk disekitar DNA seperti pada radiasi biologis

(Allen, et al., 2000).

2.4 Antioksidan

Antioksidan adalah zat yang dapat melawan pengaruh bahaya dari radikal

bebas atau Reactive Oxygen Species (ROS) yang terbentuk sebagai hasil dari

metabolisme oksidatif, yaitu hasil dari reaksi-reaksi kimia dan proses metabolik

yang terjadi dalam tubuh (Goldberd, 2003). Senyawa antioksidan dapat berfungsi

10


sebagai penangkap radikal bebas, membentuk kompleks dengan logam-logam

peroksida dan berfungsi sebagai senyawa pereduksi (Andlauer, et al., 1989) .

Antioksidan dapat menangkap radikal bebas sehingga dapat menghambat

mekanisme oksidatif yang merupakan penyebab penyakit-penyakit degeneratif

seperti penyakit jantung, kanker, katarak, disfungsi otak dan artritis

(Miller, et al., 2000). Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi, fungsi

pertama yaitu merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi

atom hidrogen. Antioksidan yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut

sebagai antioksidan primer.

Antioksidan tersebut dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke

radikal lipida (R*,ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara

turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil

dibandingkan radikal lipida. Fungsi kedua merupakan mekanisme fungsi sekunder

antioksidan, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme

diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal

lipida ke bentuk lebih stabil (Gordon, 1990).

Inisiasi : R* + AH RH + A*

Radikal lipid

Propagasi : ROO* + AH RH + A*

Gambar 2.3. Reaksi Penghambatan Antioksidan Primer Terhadap Radikal Lipid

(Gordon, 1990).

2.5 Uj i Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH

Metode DPPH merupakan salah satu metode untuk menentukan aktivitas

antioksidan yang sederhana dengan menggunakan 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

(DPPH) sebagai senyawa pendeteksi (Surai, 2003). DPPH (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) adalah senyawa radikal bebas yang stabil yang dapat bereaksi

11


dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan membentuk DPPH

tereduksi (Surai, 2003).

Metode DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) digunakan secara luas untuk

menguji kemampuan senyawa yang berperan sebagai pendonor elektron atau atom

hidrogen. Metode DPPH merupakan metode yang dapat mengukur aktivitas total

antioksidan baik dalam pelarut polar maupun nonpolar. Beberapa metode lain

terbatas mengukur komponen yang larut dalam pelarut yang digunakan dalam

analisa. Metode DPPH mengukur semua komponen antioksidan, baik yang larut

dalam lemak maupun dalam air (Prakash, 2001).

Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, mudah, cepat dan peka,

serta hanya memerlukan sedikit sampel. DPPH adalah senyawa radikal bebas

stabil kelompok nitrit oksida. Senyawa ini mempunyai ciri-ciri padatan berwarna

ungu kehitaman, larut dalam pelarut DMF atau etanol/metanol, dengan rumus

molekul C18H12N5O6 (Prakash, 2001).

Radikal bebas DPPH yang memiliki elektron tidak berpasangan memberikan

warna ungu dan menghasilkan absorbansi maksimum pada panjang gelombang

517 nm. Warna akan berubah menjadi kuning saat elektronnya berpasangan.

Pengurangan intensitas warna yang terjadi berhubungan dengan jumlah elektron

DPPH yang menangkap atom hidrogen. Sehingga pengurangan intensitas warna

mengindikasikan peningkatan kemampuan antioksidan untuk menangkap radikal

bebas (Prakash, 2001).

Aktivitas antioksidan dapat dinyatakan dengan satuan persen aktivitas. Nilai

ini diperoleh dengan rumus sebagai berikut (Molyneux, 2003).

% Inhibisi = X 100%

Absorbansi kontrol yang digunakan dalam prosedur DPPH ini adalah absorbansi

DPPH, sedangkan blanko yang digunakan adalah etanol 95%. Berdasarkan rumus

tersebut, semakin tinggi tingkat diskolorisasi (absorbansi semakin kecil) maka

semakin tinggi nilai aktivitas penangkapan radikal bebas (Molyneux, 2003).

absorbansi kontrol – absorbansi sampel

absorbansi Kontrol

12


(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyn)

Gambar 2.4. Reaksi Penghambatan Antioksidan Terhadap Radikal DPPH

(Prakash, 2001).

Aktivitas antioksidan pada metode DPPH dinyatakan dengan IC50

(Inhibition Concentration). IC50 adalah bilangan yang menunjukkan konsentrasi

ekstrak yang mampu menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin kecil

nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan. Secara spesifik, suatu

senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 0,05

mg/mL,aktivitas kuat untuk IC50 antara 0,05-0,1 mg/mL, aktivitas sedang jika IC50

bernilai 0.101–0.150 mg/mL dan aktivitas lemah jika IC50 bernilai 0,151 – 0,200

mg/mL (Blois, 1958).

2.6 Ekstrak dan Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut dan massa atau serbuk yang

tersisa, diperlakukan sehingga memenuhi baku yang telah ditetapakan

(Soesilo, 1995). Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair, dibuat dengan

menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang sesuai diluar pengaruh

cahaya matahari langsung (Tiwari, et al., 2011).

13


Parameter yang mempengaruhi kualitas dari ekstrak adalah

(Tiwari, et al., 2011):

a) Bagian dari tumbuhan yang digunakan.

b) Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi.

c) Prosedur ekstraksi

Selama proses ekstraksi, pelarut akan berdifusi sampai ke material padat dari

tumbuhan dan akan melarutkan senyawa dengan polaritas yang sesuai dengan

pelarutnya. Efektivitas ekstraksi senyawa kimia dari tumbuhan bergantung pada.

a) Bahan-bahan tumbuhan yang diperoleh

b) Keaslian dari tumbuhan yang digunakan

c) Proses ekstraksi

d) Ukuran partikel

Macam-macam perbedaan metode ekstraksi yang akan mempengaruhi

kuantitas dan kandungan metabolit sekunder dari ekstrak, antara lain :

a) Tipe ekstraksi

b) Waktu ekstraksi

c) Suhu ekstraksi

d) Konsentrasi pelarut

e) Polaritas pelarut

Beberapa metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut dibagi menjadi dua

cara, yaitu cara panas dan cara dingin (Ditjen POM, 2000).

2.6.1 Ekstraksi Cara Dingin

a) Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur kamar (Ditjen POM, 2000). Keuntungan ekstraksi dengan cara

maserasi adalah pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana,

sedangkan kerugiannya yakni cara pengerjaannya lama, membutuhkan

pelarut yang banyak dan penyarian kurang sempurna. Dalam maserasi,

serbuk halus atau kasar dari tumbuhan obat yang kontak dengan pelarut

disimpan dalam wadah tertutup untuk periode tertentu dengan pengadukan

14


yang sering, sampai zat tertentu dapat terlarut. Metode ini paling cocok

digunakan untuk senyawa yang termolabil (Tiwari, et al., 2011).

b) Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

penyarian sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan

pada temperatur ruang. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan,

tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya

(penetesan/penampungan ekstrak), terus sampai diperoleh ekstrak

(perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali dari bahan (Ditjen POM, 2000).

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur

kamar. Proses perkolasi terdiri dari tahap pengembangan bahan, tahap

perendaman, tahap perkolasi antara, tahap perkolasi sebenarnya

(penampungan ekstrak) secara terus menerus sampai diperoleh ekstrak

(perkolat). Untuk menentukan akhir dari pada perkolasi dapat dilakukan

pemeriksaan zat secara kualitatif pada perkolat akhir. Ini adalah prosedur

yang paling sering digunakan untuk mengekstrak bahan aktif dalam

penyusunan tincture dan ekstrak cairan (Tiwari, et al., 2011).

2.6.2 Ekstraksi Cara Panas

a) Sokletasi

Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru,

dengan menggunakan alat soklet sehingga terjadi ekstraksi kontinyu

dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik

(Ditjen POM, 2000).

b) Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut pada

temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut

terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik

(Ditjen POM, 2000).

15


c) Infusa

Infusa adalah ekstraksi menggunakan pelarut air pada temperatur

penangas air dimana bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih,

temperatur yang digunakan (96-980C) selama waktu tertentu (15-20 menit)

(Ditjen POM, 2000). Cara ini menghasilkan larutan encer dari komponen

yang mudah larut dari simplisia (Tiwari, et al., 2011).

d) Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥300C) dan

temperatur sampai titik didih air (Ditjen POM, 2000). Dekok adalah

ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur 90oC selama 30 menit.

Metode ini digunakan untuk ekstraksi konstituen yang larut dalam air dan

konstituen yang stabil terhadap panas (Tiwari, et al., 2011).

e) Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik pada temperatur lebih tinggi dari

temperatur suhu kamar, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur

40-50oC (Ditjen POM, 2000).

Digesti adalah maserasi dengan pengadukan kontinyu pada temperatur

lebih tinggi dari temperatur ruang (umumnya 25-30oC). Ini adalah jenis

ekstraksi maserasi di mana suhu sedang digunakan selama proses ekstraksi

(Tiwari, et al., 2011).

2.6.3 Macam-macam Teknik Ekstraksi Lain

1) Sonikasi

Prosedur ekstraksi ini melibatkan penggunaan gelombang ultrasonik

dengan frekuensi mulai dari 20 kHz sampai 2000 kHz. Teknik ini

meningkatkan permeabilitas dinding sel dan menghasilkan kavitasi.

Meskipun proses ini berguna dalam beberapa kasus, tetapi pada skala

besar aplikasinya terbatas karena biayanya yang tinggi. Satu kelemahan

dalam teknik ini adalah efek yang merusak dari energi ultrasonik (lebih

16


dari 20 KHz) yang menyebabkan konstituen tanaman membentuk radikal

bebas yang tidak diharapkan (Tiwari, et al., 2011).

2) Supercritical Fluid

Teknik ekstraksi supercritical fluid memberikan fakta bahwa gas

dapat berperilaku sebagai cairan ketika berada dibawah tekanan. Salah

satu contohnya adalah karbon dioksida yang dapat digunakan untuk

mengekstrak biomassa dan memiliki keuntungan bahwa setelah tekanan

dihilangkan, molekul gas akan meninggalkan ekstrak. Karbon dioksida

bertindak sebagai pelarut non polar, tetapi polaritas ekstraksi dengan

supercritical fluid dapat ditingkatkan dengan menambahkan agen tertentu,

yang biasanya berupa pelarut lain seperti metanol atau diklormetan

(Heinrich, 2004).

2.7 Pelarut

Pelarut adalah zat yang digunakan sebagai media untuk melarutkan zat lain.

kesuksesan penentuan senyawa biologis aktif dari bahan tumbuhan sangat

tergantung pada jenis pelarut yang digunakan dalam prosedur ekstraksi

(Ncube, et al., 2008). Sifat pelarut yang baik untuk ekstraksi yaitu toksisitas dari

pelarut yang rendah, mudah menguap pada suhu yang rendah, dapat

mengekstraksi komponen senyawa dengan cepat, dapat mengawetkan dan tidak

menyebabkan ekstrak terdisosiasi (Tiwari, et al., 2011).

Pemilihan pelarut juga akan tergantung pada senyawa yang ditargetkan.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan pelarut adalah jumlah senyawa yang

akan diekstraksi, laju ekstraksi, keragaman senyawa yang akan diekstraksi,

kemudahan dalam penanganan ekstrak untuk perlakuan berikutnya, toksisitas

pelarut dan potensial bahaya kesehatan dari pelarut (Tiwari, et al., 2011).

17


Berbagai pelarut yang digunakan dalam prosedur ekstraksi antara lain:

1) Air

Air adalah pelarut universal, biasanya digunakan untuk mengekstraksi

produk tumbuhan dengan aktivitas antimikroba. Meskipun pengobatan

secara tradisional menggunakan air sebagai pelarut, tetapi ekstrak tumbuhan

dari pelarut organik telah ditemukan untuk memberikan aktivitas

antimikroba lebih konsisten dibandingkan dengan ekstrak air


Air juga melarutkan flavonoid (kebanyakan antosianin) yang tidak

memiliki aktivitas signifikan terhadap antimikroba dan senyawa fenolat

yang larut dalam air yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan.

2) Aseton

Aseton melarutkan beberapa komponen senyawa hidrofilik dan lipofilik

dari tumbuhan. Keuntungan pelarut aseton yaitu dapat bercampur dengan

air, mudah menguap dan memiliki toksisitas rendah. Aseton digunakan

terutama untuk studi antimikroba (Tiwari, et al., 2011).

3) Alkohol

Aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dari ekstrak etanol dibandingkan

dengan ekstrak air dapat dikaitkan dengan adanya jumlah polifenol yang

lebih tinggi pada ekstrak etanol dibandingkan dengan ekstrak air.

Konsentrasi yang lebih tinggi dari senyawa flavonoid terdeteksi dengan

etanol 70% karena polaritas yang lebih tinggi daripada etanol murni


Etanol lebih mudah untuk menembus membran sel untuk mengekstrak

bahan intraseluler dari bahan tumbuhan. Metanol lebih polar dibanding

etanol namun karena sifatnya yang toksik, sehingga tidak cocok digunakan

untuk ekstraksi.

18


4) Kloroform

Terpenoid lakton telah diperoleh dengan ekstraksi berturut-turut

menggunakan n-heksana, kloroform dan metanol dengan konsentrasi

aktivitas tertinggi terdapat dalam fraksi kloroform. Kadang-kadang tanin

dan terpenoid ditemukan dalam fase air, tetapi lebih sering diperoleh dengan

pelarut semipolar (Tiwari, et al., 2011).

5) Eter

Eter umumnya digunakan secara selektif untuk ekstraksi kumarin dan

asam lemak (Tiwari, et al., 2011).

6) n-Heksana

n-Heksana mempunyai karakteristik sangat tidak polar, volatil,

mempunyai bau khas yang dapat menyebabkan pingsan. Berat molekul

n-heksana adalah 86,2 gram/mol dengan titik leleh 94,3°C sampai 95,3°C.

Titik didih n-heksana pada tekanan 760 mmHg adalah 66°C sampai 71°C

(Daintith, 1994). n-Heksana biasanya digunakan sebagai pelarut untuk

ekstraksi minyak nabati.

7) Etil Asetat

Etil asetat merupakan pelarut dengan karakteristik semipolar. Etil asetat

secara selektif akan menarik senyawa yang bersifat semipolar seperti fenol

dan terpenoid.

2.8 Vacuum Rotary Evaporator

Vacuum rotary evaporator adalah alat yang berfungsi untuk memisahkan

suatu larutan dari pelarutnya sehingga dihasilkan ekstrak dengan kandungan kimia

tertentu sesuai yang diinginkan. Cairan yang ingin diuapkan biasanya ditempatkan

dalam suatu labu yang kemudian dipanaskan dengan bantuan penangas dan

diputar. Uap cairan yang dihasilkan didinginkan oleh suatu pendingin (kondensor)

dan ditampung pada suatu tempat (receiver flask). Setelah Pelarutnya diuapkan,

19


akan dihasilkan ekstrak yang dapat berbentuk padatan atau cairan

(Nugroho, et al., 1999).

Kelebihan dari alat ini adalah diperolehnya kembali pelarut yang diuapkan.

Penggunaan vacuum rotary evaporator meningkatkan presentase plarut yang

terevaporasi dibandingkan dengan menggunakan waterbath

(Mutairi & Jasser, 2012). Prinsip kerja alat ini didasarkan pada titik didih pelarut

dan adanya tekanan yang menyebabkan uap dari pelarut terkumpul, serta adanya

kondensor yang menyebabkan uap ini mengembun dan akhirnya jatuh ke tabung

penerima (receiver flask).

2.9 Metode Isolasi

Suatu ekstrak yang telah dihasilkan dari suatu protokol ekstraksi yang sesuai

dan pengujian aktivitas biologis telah dilakukan (contohnya aktivitas antibakteri),

langkah selanjutnya adalah fraksinasi ekstrak menggunakan metode pemisahan

sehingga komponen biologis aktif dapat diisolasi (Heinrich, et al., 2004).

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan

menggunakan salah satu dari keempat teknik kromatografi atau gabungan teknik

tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah: kromatografi kertas (KKt),

kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi gas cair (KGC), dan kromatografi

cair kinerja tinggi (KCKT) (Harborne, 1987).

2.9.1 Kromatografi

Kromatografi merupakan metode pemisahan fisikokimia untuk memisahkan

campuran senyawa berdasarkan perbedaan waktu huni komponen campuran

dalam sistem fase diam dan fase gerak (Hostettman, et al., 1995). Prinsip

pemisahan dari kromatografi adanya distribusi komponen-komponen dalam fase

diam dan fase gerak berdasarkan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan. Pada

dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase, yaitu fase diam

(stationer) dan fase gerak (mobile).

Menurut (Adrianingsih, 2009), persyaratan utama kromatografi antara lain:

1. Ada fase diam dan fase gerak. Fase diam tidak boleh bereaksi

dengan fase gerak.

20


2. Komponen sampel harus larut dalam fase gerak dan berinteraksi

dengan fase diam.

3. Fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase

diam harus terikat kuat di posisinya.

2.9.2 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu metode pilihan

kromatografi secara fisikokimia (Gandjar & Rohman, 2007). KLT merupakan

bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada

KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan

bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium atau plat plastik.

Meskipun demikian, kromatografi planar ini merupakan bentuk terbuka dari

kromatografi kolom (Gritter, et al., 1991).

KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai untuk mencapai

hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem

pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom

(Gritter, et al., 1991).

Kromatografi lapis tipis (KLT) dapat digunakan untuk tujuan analitik dan

preparatif. KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa organik

dalam jumlah kecil, misalnya menentukan jumlah komponen dalam campuran dan

menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT preparatif.

Sedangkan KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari

sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya fraksi-fraksi

tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa berikutnya

(Townshend, 1995).

Plat KLT yang umum digunakan adalah plat KLT analitik dengan ketebalan

0,1-0,2 mm dengan ukuran 20x20 cm yang dilapisi dengan adsorben silika gel 60

F254 dengan ketebalan 0,2 mm. Plat kemudian ditempatkan ke dalam bejana

dengan fase gerak yang sesuai, dimana ketinggian fase gerak cukup untuk

membasahi bagian bawah plat dan tidak sampai membasahi dimana sampel

diaplikasikan. Fase gerak kemudian bermigrasi melewati adsorben dengan gaya

kaliper, dan proses ini dikenal sebagai pengembangan (Sarker, et al., 2006).

21


KLT merupakan teknik yang benar-benar menguntungkan karena tingkat

sensitivitasnya sangat besar dengan jumlah sampel lebih sedikit

(Brain & Turner, 1975). Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang

atau cairan pengelusi, akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler

pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi

pada pengembangan secara menurun (descending) (Gritter, et al., 1991).

Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai

ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah lempeng terelusi, dilakukan

deteksi bercak (Gandjar & Rohman, 2007). Laju pergerakan fase gerak terhadap

fase diam dihitung sebagai retardation farctor (Rf). Nilai Rf diperoleh dengan

membandingkan jarak yang ditempuh oleh zat terlarut dengan jarak yang

ditempuh oleh fase gerak (Gandjar & Rohman, 2007).

Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT

merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut

organik yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh,

dan tidak bereaksi dengan penjerap (Gritter, et al., 1991). Adsorben umumnya

digunakan dalam KLT meliputi partikel silika gel ukuran 12 µm, alumina, mineral

oksida, selulosa, poliamida, polimer penukar ion (Gocan, 2002).

a) Silika Gel

Silika gel adalah yang paling banyak digunakan sebagai adsorben dan

fase stasioner yang dominan untuk KLT. Sebagian besar analisa dengan

KLT dilakukan dengan menggunakan fase normal lapisan silika gel.

Fase diam ini dapat digunakan sebagai fase polar maupun non polar.

Untuk fase polar, merupakan silika yang dibebaskan dari air dan bersifat

sedikit asam. Silika gel perlu ditambah gips (kalsium sulfat) untuk

memperkuat pelapisannya pada pendukung. Sebagai pendukung biasanya

lapisan tipis digunakan kaca dengan ukuran 20x20 cm, 10x20 cm, atau

5x10 cm. Pendukung yang lain berupa lembaran alumunium atau plastik

seperti ukuran di atas yang umumnya dibuat oleh pabrik.

Silika gel kadang-kadang ditambah senyawa fluoresensi, agar bila

disinari dengan sinar UV dapat berfluoresensi atau berpendar, sehingga

22


dikenal dengan silika gel 60 F254 yang berarti silika gel dengan fluoresen

yang berpendar pada panjang gelombang 254 nm. Silika gel untuk fase non

polar terbuat dari silika yang dilapisi dengan senyawa non polar misalnya,

lemak, parafin, minyak silikon, raber gom, atau lilin, dengan fase gerak air

yang bersifat polar dapat digunakan sebagai eluen. Fase diam ini dapat

memisahkan banyak senyawa namun elusinya sangat lambat dan

keterulangannya kurang bagus (Sumarno,2001).

b) Alumina

Alumina merupakan adsorben yang paling banyak digunakan dalam

KLT (Gocan, 2002). Fase diam ini bersifat sedikit basa, lebih jarang

digunakan. Saat akan digunakan harus diaktifkan kembali dengan

pemanasan. Alumina yang digunakan sebagai fase diam untuk KLT

umumnya yang bebas air, sehingga mempunyai aktivitas penjerapan lebih

tinggi (Sumarno, 2001).

c) Perlit Mineral

Perlit mineral adalah adsorben baru untuk KLT, yang dibuat dengan

mengkonversi SiO2 (70-75%) menjadi silikat yang larut dengan Na2CO3

(Gocan, 2002).

d) Kiselgur

Fase diam ini sebenarnya merupakan asam silika yang berbentuk amorf,

berasal dari kerangka diatomae, maka lebih dikenal dengan nama tanah

diatomae, kurang bersifat adsorptif dibanding silika (Sumarno, 2001).

e) Magnesium Silikat

Fase diam ini hanya digunakan bila adsorben atau penjerap lain tidak

dapat digunakan. Nama lain dalam perdagangan dikenal dengan floresil

(Sumarno, 2001). Floresil (magnesium silikat) adalah endapan silika dan

magnesium. Sifat dan aplikasi dari floresil pada KLT dan KCKT ditinjau

dan dibandingkan dengan adsorben lainnya (Gocan, 2002).

23


f) Selulosa

Polaritasnya tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pemisahan secara

partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk lempeng. Kedua bentuk

tersebut masih sering digunakan untuk pemisahan flavonoid. Ukuran

partikel yang digunakan kira-kira 50 たm. Fase diam ini sekarang sudah

diganti dengan bubuk selulosa yang dapat dilapiskan pada kaca seperti

halnya fase diam yang lain sehingga lebih efisien dan lebih banyak

digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa polar atau isomernya

(Sumarno, 2001).

g) Resin

Fase diam resin digunakan pada KLT penukar ion. Resin merupakan

polimer dari stirendivenil yang mengalami kopolimerisasi dan bersifat non

polar. Fase diam ini sangat berguna untuk memisahkan senyawa berbobot

molekul tinggi dan bersifat amfoter seperti asam amino, protein, enzim,

nukleotida. Sebagai fase gerak digunakan larutan asam kuat atau basa kuat

(Sumarno, 2001).

2.9.3 Identifikasi Kromatogram

Ada beberapa cara untuk mendeteksi senyawa yang tidak berwarna pada

kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan

penyerapan di daerah UV gelombang pendek (radiasi utama kira-kira 254 nm)

atau jika senyawa itu dapat dieksitasi pada radiasi UV gelombang pendek dan

gelombang panjang (365 nm). Pada senyawa yang mempuyai dua ikatan rangkap

atau lebih dan senyawa aromatik seperti turunan benzena, mempunyai serapan

kuat di daerah 230-300 nm (Stahl, 1985).

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan tipis yaitu

dengan menggunakan nilai Rf. Nilai Rf didefinisikan sebagai berikut

(Sastrohamidjojo, 2005).

Rf = Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal

Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal

24


Nilai Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga

standar. Nilai Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari

pelarut dan penjerap yang digunakan, meskipun demikian daftar dari harga-harga

Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penjerap dapat diperoleh

(Sastrohamidjojo, 2005).

2.9.4 Sistem Fase Gerak Pada KLT

Polaritas fase gerak perlu diperhatikan pada analisa dengan KLT, sebaiknya

digunakan campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah

mungkin. Campuran yang baik memberikan fase gerak yang mempunyai kekuatan

bergerak sedang. Secara umum dikatakan bahwa fase diam yang polar akan

mengikat senyawa polar dengan kuat sehingga bahan yang kurang sifat

kepolarannya akan bergerak lebih cepat dibandingkan bahan-bahan polar

(Gritter, et al., 1991).

Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT

merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut

organik yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh,

dan tidak bereaksi dengan penjerap (Gritter, et al., 1991).

Pelarut yang ideal harus melarutkan linarut dan harus cukup baik sebagai

pelarut yang bersaing dengan daya serap penjerap. Keadaan yang ideal tersebut

mungkin terjadi jika pelarut tidak berproton seperti hidrokarbon, eter dan senyawa

karbonil dipakai sebagai pelarut pengembang (Gritter, et al., 1991).

2.9.5 Kromatografi Gas

Kromatografi gas merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan

senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-senyawa gas

anorganik dalam suatu campuran. Sampel yang mudah menguap dan stabil

terhadap panas akan bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam

dengan suatu kecepatan yang terantung pada rasio distribusinya. Pada umumnya

solut dari ujung kolom menghantarkan ke detektor (McNair, et al., 1998).

Kromatografi gas penggunaan utamanya ialah pada pemisahan senyawa

atsiri, yaitu asam lemak, mono dan seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa

belerang tinggi. Tetapi, keatsirian kandungan tumbuhan yang bertitik didih tinggi

25


dapat diperbesar dengan mengubahanya menjadi ester dan/atau eter trimetil-silil

sehingga hanya sedikit saja golongan yang sama sekali tidak cocok untuk

dipisahkan dengan cara KGC (Harborne, 1987).

Kromatografi gas dapat digunakan untuk analisia kualitatif dan kuantitatif.

Untuk analisia kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi

dari komponen yang akan dianalisa dengan waktu retensi zat baku pembandig

(standar) pada kondisi analisa yang sama. Untuk analisa kuantitatif dilakukan

dengan cara perhitungan relatif dari tinggi atau luas puncak kromatogram

komponen yang dianalisa terhadap zat baku pembanding (standar) yang dianalisa

(McNair, et al., 1998).

Untuk pemisahan bahan-bahan yang mudah menguap, kromatografi gas

merupakan metode yang tepat karena kecepatannya, resolusinya yang tinggi dan

mudah digunakan (McNair, et al., 1998).

2.9.6 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang

digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak

berdasarkan adsorpsi dan partisi (Gritter, et al., 1991). Kromatografi kolom

membutuhkan zat terlarut yang terdistribusi diantara dua fase, satu diantaranya

fase diam dan yang lainnya fase gerak. Fase gerak membawa zat terlarut melalui

media, hingga terpisah dari zat terlarut lain yang terelusi lebih awal atau akhir.

Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut

berbentuk cairan atau gas (Harborne, 1987).

Pada kromatografi kolom, tabung pemisah diisi penjerap. Penjerap yang

biasa digunakan ialah silika gel. Pengisian ini harus dilakukan secara berhati-hati

dan merata. Penjerap dapat dikemas dalam tabung dengan cara basah maupun

kering (Harborne, 1987). Cara basah, silika gel terlebih dahulu dijenuhkan dengan

cairan pengelusi yang akan digunakan. Kemudian dimasukkan ke dalam kolom

melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit, sambil kran kolom

dibuka.

Kemudian pelarut dialirkan hingga silika gel mampat. Setelah silika gel

mampat, pelarut dibiarkan mengalir hingga batas adsorben. Kemudian kran

26


ditutup dan sampel dimasukkan, sampel yang dimasukkan terlebih dahulu

dilarutkan dalam pelarut hingga diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian

sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit

demi sedikit hingga semua sampel masuk. Selanjutnya kran dibuka dan diatur

tetesannya, serta ditambahkan dengan cairan pengelusi. Tetesan yang keluar

ditampung sebagai fraksi-fraksi (Gritter, et al., 1991).

Sedangkan cara kering, yaitu dengan memasukkan silika gel ke dalam

kolom yang telah diberi kapas sedikit demi sedikit dan diratakan dengan alat

pemampat kemudian ditambahkan dengan cairan pengelusi (Gritter, et al., 1991).

2.10 Elusidasi Struktur

Elusidasi struktur umumnya menggunakan teknik spektroskopi klasik

seperti spektrofotometri masa (SM) dan resonansi magnetik inti (RMI). Langkah

pertama, bagaimanapun harus memperoleh rekaman spektrum sinar inframerah

dan ultraviolet untuk menentukan adanya kelompok gugus fungsi tertentu dalam

suatu molekul (Heinrich, 2004).

2.10.1 UV-Visible

Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang

sangat encer dengan pembanding blanko pelarut serta menggunakan

spektrofotometer yang merekam otomatis. Senyawa tanwarna diukur pada jangka

200-400 nm, senyawa berwarna pada jangka 200-700 nm. Prinsip kerja

spektrofotometer UV-Vis ialah interaksi sinar ultraviolet atau tampak dengan

molekul sampel. Energi cahaya akan mengeksitasi elektron terluar molekul ke

orbital lebih tinggi (Harborne, 1987).

Pada kondisi ini, elektron tidak stabil dan dapat melepas energi untuk

kembali ke tingkat dasar, dengan disertai emisi cahaya. Besarnya penyerapan

cahaya sebanding dengan molekul, sesuai dengan hukum lambert-Beer:

27


(Day & Underwood, 1980).

A= ɛ B C

Keterangan:

A= Serapan/absorbansi

ɛ= Absortivitas molar

B= Tebal kuvet

C= Konsentrasi komponen

Sumber radiasi pada spektrofotometer UV-Vis berdasarkan panjang

gelombang terbagi menjadi 2, yaitu lampu deuterium dan tungstent. Lampu

deuterium menghasilkan sinar 160-500 nm. Lampu tungstent digunakan di daerah

sinar tampak 350-3500 nm. Sumber radiasi dikatakan ideal jika memancarkan

spektrum radiasi yang kontinyu, intensitasnya tinggi dan stabil pada semua

panjang gelombang.

2.10.2 Spektrofotometri Infra M erah

Spektrofotometri infra merah merupakan suatu metode yang mengamati

interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah

panjang gelombang 0,75–1.000 たm atau pada bilangan gelombang

13.000–10 cm-1. Spektrofotometer infra merah merupakan alat untuk mendeteksi

gugus fungsi, mengidentifikasi senyawa dan menganalisis campuran. Banyak pita

absorbsi yang terdapat dalam daerah yang di sebut daerah ”sidik jari” spektrum

(Harborne, 1987).

Spektrum infra merah suatu sampel dapat di ketahui letak pita serapan

yang dikaitkan dengan adanya suatu gugus fungsi tertentu

(Day & Underwood, 1999). Spektrofotometer infra merah digunakan sebagai

analisa kualitatif untuk menentukan gugus fungsi. Gugus fungsi dapat

diintepretasi dengan memeriksa puncak absorbsi dari spektrum infra merah.

Daerah pada spektrum inframerah diatas 1200 cm-1 menunjukkan pita

spektrum atau puncak yang disebabkan oleh getaran ikatan kimia atau gugus

fungsi dalam molekul yang telah ditelaah. Daerah dibawah 1200 cm-1

menunjukkan pita yang disebabkan oleh getaran seluruh molekul, dan karena

kerumitannya dikenal sebagai daerah sidik jari. Intensitas berbagai pita direkam

28


secara subjektif pada skala sederhana yaitu kuat, menengah atau lemah

(Harborne, 1987).

2.10.3 Spektrofotometri Massa

Teknik ini memungkinkan untuk mengukur berat molekul dari senyawa

dan ion molekular yang diidentifikasi, teknik ini memungkinkan untuk mengukur

ion secara akurat, untuk memastikan jumlah dari atom hidrogen, karbon, oksigen

dan atom lain yang terdapat dalam suatu molekul. Teknik ini akan memberikan

hasil data berupa rumus molekul (Heinrich, 2004).

Sejumlah teknik ionisasi terdapat dalam Spektrofotometri massa, yang

mana electron impact digunakan secara luas. Teknik ini memberikan fragmentasi

yang baik dari molekul dan berguna untuk menentukan struktur dengan

menetapkan fragmentasi untuk kelompok gugus fungsi yang terdapat dalam

senyawa (Heinrich, 2004).

2.10.4 KG-SM (Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa)

Kromatografi gas dan spektrofotometri massa dapat digunakan untuk

memisahkan komponen dengan memberikan waktu retensi dan puncak elusi yang

dapat dimasukkan ke dalam spektrofotometer massa untuk memperoleh berat

molekul, karakteristik dan informasi fragmentasi (Heinrich, 2004). Teknik ini juga

dapat digunakan untuk komponen yang polar (senyawa yang larut dalam air)

seperti calistegines dan polihidroksil alkaloid jika dibuat turunannya dengan

komponen yang sesuai (trimetilsilil klorida) untuk meningkatkan volatilitasnya

(Heinrich, 2004).

Kromatografi gas saat ini merupakan metode analisa yang penting dalam

kimia organik untuk menentukan senyawa tunggal dalam campuran.

Spektrofotometri massa sebagai metode deteksi yang memberikan data bermakna,

yang diperoleh dari penentuan langsung molekul zat atau fragmen

(Heinrich, 2004).

29


2.10.5 Resonansi Magnetik Inti (RMI)

Radiasi pada daerah frekuensi radio digunakan untuk mengeksitasi

atom-atom, biasanya proton-proton (1H-RMI) atau atom-atom karbon-13

(13C-RMI), sehingga spinnya berubah dari sejajar menjadi sejajar melawan medan

magnet yang digunakan. Rentang frekuensi yang dibutuhkan untuk eksitasi dan

pola-pola pembagian kompleks yang dihasilkan sangat khas pada struktur kimia

molekul tersebut (Watson, 2009).

Spektra RMI biasanya ditentukan dari larutan substansi yang akan

dianalisa. Untuk itu pelarut yang digunakan tidak boleh mengandung atom

hidrogen karena akan mengganggu puncak spektrum. Ada dua cara untuk

mencegah gangguan oleh pelarut. Pertama dapat digunakan pelarut seperti

tetraklormetana, CCl4 yang tidak mengandung hidrogen atau pelarut yang atom

hidrogennya telah diganti dengan isotopnya yaitu deuterium, sebagai contoh

CDCl3 (Sudjadi, 1985).

30


2.11 Kerangka Konsep

Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata

Determinasi

Ekstraksi Bertingkat Dengan Pelarut n-Heksana dan Etil Asetat

Ekstrak n-Heksana Ekstrak Etil Asetat

Uji Aktivitas Antioksidan Dengan DPPH

Ekstrak Aktif Antioksidan

Fraksinasi Dengan Kromatografi kolom

Senyawa Hasil Isolasi

Uji Kemurnian Senyawa

Penentuan Struktur Molekul Dengan UV, IR, 1H-NMR


31

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di (Laboratorium Analisis Obat dan Pangan) dan

(Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia) Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta. Waktu penelitian ini berlangsung selama 6 bulan, yaitu pada bulan

Januari 2013 sampai dengan bulan Juni 2013.

3.2 ALAT DAN BAHAN

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Ayakan No.40,

blender, timbangan analitik, kertas label, alumunium foil, kertas saring, kapas,

labu erlenmeyer (Duran), beker gelas (Duran), gelas ukur (Duran), corong

(Eyela), tabung reaksi, kolom kromatografi, spatula, batang pengaduk, pipet tetes,

seperangkat alat vaccum rotary evaporator, kaca arloji, cawan penguap, alat

melting point, pipa kapiler, vial, plat KLT dan bejana KLT.

3.2.2 Sampel Tumbuhan

Sampel tumbuhan yang digunakan adalah tumbuhan paku

Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr yang diperoleh di wilayah kampus FKIK UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta, yang selanjutnya dideterminasi di Herbarium

Bogoriense ( LIPI), Cibinong, Bogor.

3.2.3 Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: n-heksana

(Brataco), etil asetat (Brataco), aquades, metanol grade HPLC, aquabides, silika

gel 60 F254 (0,063-0,200 mm for column chromatography) (Merck), lempeng

32


KLT (whatman, 250 µm 20 x 20 cm AL SIL G/UV, Felxible Plates for TLC, Cat

No. 4420222, coating silica gel) (Merck). Reagen kimia antara lain: Dragendorff,

Mayer, Wagner, ferri klorida, asam sulfat, natrium hidroksida, asam asetat,

kloroform, Liberman Buchardat, asam kloroda, natrium klorida, gelatin, Vanilin ,

dan asam perklorat.

3.2.4 Instrumen

Instrumen yang digunakan antara lain: spektrofotometer infra merah,

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), resonansi magnetik inti proton

(1H-RMI), lampu UV 254 nm dan 366 nm ( bioinstrument atta), UV-Visible.

3.3 PROSEDUR KERJA

3.3.1 Pemeriksaan Sampel Tumbuhan

Sampel tumbuhan Nephrolepis falcata sebanyak 10,1 kg yang diperoleh dari

halaman kampus Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, dilakukan

determinasi di Pusat Penelitian Herbarium Bogoriense (LIPI), Cibinong, Bogor.

3.3.2 Penyiapan Simplisia

Sampel daun tumbuhan Nephrolepis falcata sebanyak 10,1 kg disortasi

basah dan dilakukan pencucian dengan menggunakan air mengalir hingga bersih.

Selanjutnya sampel dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan terhindar dari

cahaya matahari, pengeringan dilakukan selama satu minggu hingga sampel

benar-benar kering. Sampel yang telah kering, disortasi kering kemudian

dihaluskan dengan menggunakan blender dan diayak dengan ayakan no.40.

Serbuk simplisia yang diperoleh kemudian ditimbang, Selanjutnya simplisia

disimpan dalam wadah tertutup rapat dan terhindar dari cahaya matahari.

3.3.3 Pembuatan Ekstrak

Prosedur ekstraksi menggunakan metode ekstraksi cara dingin dengan

teknik maserasi bertingkat. Pelarut yang digunakan antara lain, n-heksana dan etil

asetat. Serbuk simplisia sebanyak 1,256 kg dimasukkan ke dalam wadah gelap

33


sehingga terhindar dari cahaya matahari. Selanjutnya dimasukkan pelarut

n-heksana ke dalam wadah yang berisi serbuk simplisia hingga serbuk terendam

±3 cm di atas permukaan simplisia. Pelarut n-heksana yang digunakan untuk

maserasi sebanyak 4,5 liter.

Maserasi dilakukan selama 1-2 hari dengan beberapa kali pengadukan. Hasil

maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Filtrat yang diperoleh

diuapkan dengan vaccum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

Ampas yang tersisa, kembali ditambahkan n-heksana dan proses maserasi

dilakukan kembali. Maserasi dengan menggunakan pelarut n-heksana dilakukan

sebanyak 15 kali hingga pelarut yang digunakan terlihat bening yang menandakan

senyawa telah terekstraksi seluruhnya.

Selanjutnya maserasi diganti dengan perlarut etil asetat, volume etil asetat

yang digunakan sebanyak 4,5 liter. Prosedur ekstraksi sesuai dengan kegiatan

ekstraksi sebelumnya. Maserasi dengan menggunakan pelarut etil asetat dilakukan

sebanyak 10 kali hingga pelarut yang digunakan terlihat bening. Total pelarut

n-heksana yang digunakan untuk maserasi sebanyak 18 liter dan pelarut etil asetat

yang digunakan sebanyak 10 liter.

3.3.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Ekstrak yang diperoleh, dianalisa dengan menggunakan kromatografi lapis

tipis untuk mengamati pola pemisahannya. Lempeng KLT dengan ukuran

5x10 cm, pada bagian atas dan bawah plat, dibuat garis tepi sepanjang 1 cm.

Selanjutnya dibuat sistem fase gerak yang terdiri dari n-heksana dan etil asetat

dengan berbagai perbandingan, setiap perbandingan kepolarannya ditingkatkan

10%. Fase gerak yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam bejana KLT dan

dijenuhkan dengan memasukkan kertas saring ke dalamnya, hingga kertas saring

terbasahi semua. Selanjutnya, 10 mg ekstrak dilarutkan dengan 1 mL pelarut etil

asetat dan ditotolkan pada garis tepi bagian bawah plat dengan menggunakan pipa

kapiler.

Plat KLT dielusi di dalam masing-masing bejana KLT yang berisi fase

gerak, hingga fase gerak mencapai garis tepi bagian atas, kemudian diangkat. Plat

KLT dibiarkan kering dan dilihat pola pemisahannya secara langsung dan di

34


bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Dari hasil

KLT, dilihat kombinasi sistem fase gerak yang memberikan pola pemisahan yang

baik.

3.3.5 Skrining Fitokimia (Tiwari, et al., 2011; Fransworth, 1969)

1) Uji Alkaloid

Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam larutan HCl encer kemudian disaring dan

filtrat dibagi menjadi dua tabung reaksi.

Tes Mayer: filtrat A ditambahkan reagen Meyer (larutan kalium merkuri

iodida). Terjadinya endapan berwarna putih mengindikasikan adanya

senyawa alkaloid.

Tes Dragendorff: filtrat B ditambahkan reagen Dragendorff (larutan

kalium bismut iodida) Terjadinya endapan berwarna merah bata

mengindikasikan adanya senyawa alkaloid.

2) Uji Flavonoid

Sejumlah Ekstrak dilarutkan dalam 5 mL air panas, didihkan selama 5 menit

lalu disaring. Filtrat ditambahkan serbuk Mg secukupnya, 1 mL asam klorida

pekat dan 2 mL etanol. Dikocok kuat dan dibiarkan terpisah. Terbentuk warna

merah, kuning atau jingga pada lapisan etanol menunjukkan adanya senyawa

flavonoid.

3) Uji Saponin

Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam 20 mL aquades, kemudian larutan

dikocok dalam labu ukur selama 15 menit. Terbentuknya lapisan busa setinggi

1 cm mengindikasikan adanya senyawa saponin.

4) Uji Steroid dan Terpenoid

Tes Salkowski: Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam kloroform dan

disaring. Kemudian filtrat ditambahkan beberapa tetes asam sulfat dan

dikocok. Terbentuknya warna kuning emas mengindikasikan adanya

senyawa tepenoid.

Tes Liberman Buchardat: Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam kloroform

dan disaring, filtrat ditambahkan beberapa tetes asam asetat anhidrat,

35


kemudian dipanaskan dan didinginkan. Selanjutnya larutan

ditambahkan beberapa tetes asam sulfat. Terbentuknya cincin coklat

mengindikasikan adanya senyawa steroid.

5) Uji Fenol

Sejumlah ekstrak ditambahkan beberapa tetes larutan FeCl3. Terbentuknya

warna biru kehitaman mengindikasikan adanya senyawa fenol.

6) Uji Tanin

Tes gelatin: Sejumlah ekstrak ditambahkan larutan gelatin yang

mengandung natrium hidroksida. Terbentuknya endapan putih mengindikasikan

adanya senyawa tanin.

7) Uji Asam Lemak

Sejumlah ekstrak dicampur dengan 5 ml eter, kemudian diuapkan. Ekstrak

yang telah diuapkan ditotolkan di atas kertas saring dan dibiarkan kering. Bercak

transparan pada kertas saring setelah ditotolkan ekstrak mengindikasikan adanya

senyawa asam lemak.

8) Uji Kumarin

Sejumlah ekstrak ditambahkan 1 mL NaOH 5 N dalam tabung reaksi,

kemudian dipanaskan selama beberapa menit di atas penangas air. Selanjutnya

larutan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh dilihat

di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Terjadinya

fluoresensi dengan warna kuning kehijauan mengindikasikan adanya senyawa

kumarin.

3.3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Dengan DPPH

Uji kualitatif aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan

kromatografi lapis tipis. Larutan DPPH dengan konsentrasi 0,04% dalam 20 mL

metanol dibuat dengan cara menimbang 8 mg serbuk DPPH, kemudian dilarutkan

dalam 20 mL metanol pro analisis. Ekstrak yang sebelumnya telah dilakuakan

pemisahan dengan KLT, disemprot dengan reagen tersebut hingga seluruh plat

terbasahi. Plat yang telah disemprot dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan

36


tertutup. Selanjutnya dilihat pola bercak yang memberikan aktivitas antioksidan

pada plat KLT (Basma, et al., 2011).

3.3.7 Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan Dengan Kromatografi Kolom

Ekstrak etil asetat yang memiliki aktivitas antioksidan setelah diuji secara

kualitatif dengan DPPH, selanjutnya difraksinasi dengan metode kromatografi

kolom. Kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi 100 cm dan

diameter 5 cm. Kolom disiapkan dengan menyumbat pada bagian dasarnya

dengan menggunakan kapas. Selanjutnya kolom dialiri dengan pelarut n-heksana

dan kapas ditekan-tekan dengan batang pengaduk hingga tidak ada udara yang

terjerap.

Dibuat bubur silika dengan menimbang serbuk silika gel sebanyak 250 gram

kemudian didispersikan dengan pelarut n-heksana hingga menjadi bubur suspensi.

Bubur silika gel dimasukkan ke dalam kolom kromatografi dan Kolom dialiri

dengan menggunakan pelarut n-heksana. Pelarut yang menetes ditampung,

kemudian dimasukkan kembali ke dalam kolom sambil diketuk-ketuk. Proses ini

dilakukan hingga silika gel mampat. Tahap selanjutnya, ekstrak etil asetat

sebanyak 32 gram dipreadsorbsi dengan silika gel sebanyak 15 gram. Ekstrak

dimasukkan ke dalam kolom dan disumbat dengan kapas.

Selanjutnya dibuat sistem fase gerak dengan komposisi n-heksana dan etil

asetat dengan berbagai perbandingan. Sistem fase gerak yang digunakan adalah

sistem gradien, setiap gradien kepolarannya ditingkatkan 10%. Fraksinasi pertama

dilakukan dengan mengaliri kolom menggunakan fase gerak n-heksana 100%

sebanyak 250 mL. Pelarut yang menetes, ditampung dalam vial yang sebelumnya

telah diberi nomor. Penggantian gradien fase gerak dilakukan ketika gradien

sebelumnya telah habis digunakan untuk mengaliri kolom.

Fraksinasi dilakukan hingga fase gerak yang digunakan telah mencapai

gradien akhir yaitu etil asetat 100%. Pada tahap akhir kromatografi kolom, kolom

dicuci dengan mengaliri pelarut metanol 100% sebanyak 300 mL untuk

membersihkan silika gel dari sisa ekstrak yang masih menempel. Setiap fraksi

yang diperoleh, dilakukan kromatografi lapis tipis dan dilihat pola bercak yang

dihasilkan dibawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.

37


Hasil KLT, dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan menyemprot reagen DPPH

dengan konsentrasi 0,04%. Fraksi yang memberikan pola bercak dengan nilai Rf

yang sama, digabungkan dalam satu vial yang selanjutnya akan difraksinasi

kembali untuk melakukan pemisahan lebih lanjut. Fraksinasi dengan kroatografi

kolom dilakukan hingga diperoleh senyawa murni.

3.3.8 Pemurnian Kristal

Pemurnian dilakukan terhadap kristal yang diperoleh dari hasil pemisahan

dengan kromatografi kolom yaitu (fraksi F2.A, F2.D dan F3.C). Prosedur

pemurnian dilakukan dengan mengalirkan pelarut n-heksana pada fraksi F2.A,

kemudian dikocok secara perlahan hingga n-heksana dapat melarutkan komponen

lain tanpa melarutkan kristal. Kemudian komponen yang terlarut dalam n-heksana

ditarik dengan pipet tetes yang sebelumnya telah disumbat kapas pada bagian

ujungnya dan komponen tersebut dipisahkan dari kristal. Pemurnian dilakukan

hingga kristal bersih. Prosedur yang sama juga dilakukan terhadap kristal dari

fraksi F2.D dan fraksi F3.C. Tetapi pada kristal fraksi F3.C menggunakan etil

asetat dalam proses pemurniannya karena etil asetat merupakan pelarut yang

cocok untuk pemurnian kristal fraksi F3.C.

3.3.9 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Senyawa Murni

Kristal yang diperoleh, diuji aktivitas antioksidannya dengan menggunakan

DPPH. Setiap fraksi terlebih dahulu dilakukan kromatografi lapis tipis dengan

fase gerak n-heksana-etil asetat (8:2). Hasil KLT disemprot dengan DPPH 0,04%

dan didiamkan selama 30 menit dalam ruang gelap. Dari ketiga kristal yang

diperoleh, hanya kristal dari fraksi F2.D yang memiliki aktivitas antioksidan,

sehingga kristal tersebut yang akan diuji lebih lanjut.

3.3.10 Uji Kemurnian Senyawa Aktif Antioksidan

Uji kemurnian senyawa dengan menggunakan 3 metode, antara lain

kromatografi lapis tipis 2 dimensi (KLT 2 dimensi), uji titik leleh dan

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

38


3.3.10.1 Kromatografi Lapi Tipis 2 Dimensi (KLT 2 Dimensi)

Uji kemurnian senyawa dengan menggunakan KLT 2 dimensi. Dibuat

plat KLT dengan bentuk bujur sangkar yang setiap sisinya memiliki ukuran 5 cm.

Kemudian sejumlah kristal dilarutkan dengan etil asetat dan ditotolkan pada salah

satu sisi plat dengan pipa kapiler. Plat KLT dielusi dengan fase gerak

n-heksana-etil asetat (8:2) dan dibiarkan kering sesaat. Kemudian plat KLT

dielusi kembali pada sisi lainnya dengan menggunakan fase gerak yang sama.

Bercak dilihat di bawah lampu UV ( そ 254 nm dan 366 nm) dan disemprot dengan

pereaksi godyns sebagai penampak bercak.

3.3.10.2 Uji Titik Leleh

Pengujian titik leleh dengan menggunakan alat melting point. Serbuk

kristal dimasukkan dalam pipa kapiler yang telah ditutup pada salah satu ujungnya

kemudian diketuk-ketuk hingga kristal mampat. Selanjutnya Pipa kapiler

dimasukkan ke dalam alat melting point dan temperatur dinaikkan secara

perlahan-lahan. Lazimnya setiap menit temperatur dinaikkan sebanyak 10C. Titik

leleh ditandai pada saat kristal mulai meleleh hingga meleleh sempurna. Senyawa

dikatakan murni apabila memiliki titik leleh dengan rentang ± 20C.

Gambar 3.1. KLT 2 Dimensi

Elusi Kedua

Elusi Pertama

Sampel

39


3.3.10.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Prosedur Pada KCKT, pertama dengan menentukan beberapa metode

instrumen yang digunakan, antara lain Fase gerak berupa metanol grade

HPLC-aquabides (60%:40%), panjang gelombang UV 239 nm, temperatur kolom

250C, laju alir fase gerak 0,4 mL/menit, volume injeksi sampel 20 µL dan waktu

alir adalah 15 menit. Dilakukan pencucian kolom selama 30 menit dengan

aquabides. Selanjutnya dilakukan baseline pada alat dan dicek konsistensi kolom

dengan melihat adanya puncak atau tidak pada kromatogram. Kristal yang telah

dilarutkan dengan metanol, dianalisa dan dilihat puncak yang dihasilkan. Senyawa

dikatakan murni apabila menghasilkan puncak tunggal pada kromatogram.

3.3.11 Penentuan Struktur Molekul

Penentuan struktur molekul dilakukan dengan menggunakan 3 alat

instrumen antara lain, UV-Visible, FTIR dan 1H-RMI.

3.3.11.1 UV-Visible

Kristal fraksi F2.D dilarutkan dengan menggunakan pelarut metanol.

Pada alat UV-Vis, terlebih dahulu ditentukan panjang gelombang yang digunakan

yaitu 200-400 nm. Kemudian dilakukan baseline pada alat dengan blanko berupa

metanol. Sampel dianalisa dan dilihat panjang gelombang yang dihasilkan.

3.3.11.2 FTIR

Kristal fraksi F2.D sebanyak 0,5 mg, dicampur dengan KBr sebanyak

50 mg dan digerus homogen. Pada alat terlebih dahulu dilakukan baseline dengan

blanko berupa udara. sampel diletakkan ke dalam sel KBr dan dimasukkan ke

dalam alat dengan lubang mengarah ke sumber radiasi kemudian dilakukan

analisa.

3.3.11.3 1H-RMI

Kristal fraksi F2.D dilarutkan dalam kloroform dan dilakukan analisa

dengan 1H-RMI pada frekuensi 500 MHz.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan Bahan

Tumbuhan paku yang diperoleh dari wilayah Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta, dilakukan determinasi di Pusat Penelitian Bogoriense

(LIPI), Cibinong, Bogor, yang bertujuan untuk mengetahui keaslian tumbuhan

yang akan digunakan dan untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam

pemilihan tumbuhan. Hasilnya adalah tumbuhan yang diperoleh merupakan

tumbuhan paku Nephrolepis falcata (Cav.) C.Chr (Lampiran 1).

Tumbuhan paku yang diperoleh sebanyak 10,1 kg, disortasi untuk

memisahkan antara tumbuhan dengan kotoran dan kontaminan lainnya. Proses

pengeringan dilakukan dengan cara diangin-anginkan yang bertujuan untuk

meminimalisir adanya pemanasan yang dapat merusak senyawa yang terkandung,

mengingat senyawa yang akan diisolasi merupakan senyawa antioksidan, karena

senyawa tersebut sebagian besar dapat mengalami kerusakan dengan adanya

pemanasan. Pengeringan dengan cara ini, juga dapat meminimalisir terjadinya

kehilangan senyawa yang mudah menguap (atsiri) apabila dalam tanaman tersebut

mengandung senyawa minyak atsiri.

Penghalusan dilakukan untuk memperkecil ukuran partikel tumbuhan,

yang bertujuan untuk memaksimalkan dalam proses ekstraksi, karena semakin

kecil ukuran partikel, maka semakin besar luas permukaannya, sehingga kontak

antara pelarut dengan partikel tumbuhan semakin besar dan proses ekstraksipun

dapat berjalan maksimal. Dari 10,1 kg sampel daun segar Nephrolepis falcata,

diperoleh 1,256 kg simplisia kering yang selanjutnya Simplisia disimpan dalam

wadah tertutup rapat untuk menghindari cemaran oleh mikroba dan

mikroorganisme lainnya.

41


4.2 Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ekstraksi cara dingin, yaitu

dengan metode maserasi. Prosedur ekstrasi dengan cara dingin dipilih, alasannya

untuk meminimalisir terjadinya pemanasan yang dapat menyebabkan kerusakan

terhadap senyawa yang tidak tahan panas. Proses ekstraksi ini menggunakan

teknik maserasi bertingakat dengan pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang

berbeda-beda yaitu n-heksana yang merupakan pelarut non polar dan etil asetat

yang merupakan pelarut semi polar. Alasan penggunaan teknik ekstraksi

bertingkat, yaitu untuk memaksimalkan proses ekstraksi, di mana senyawa akan

terekstraksi berdasarkan sifat kepolarannya. Selain itu, teknik ini juga digunakan

untuk memperoleh hasil rendemen yang lebih banyak.

Dari proses maserasi, diperoleh 2 ekstrak kental, yaitu ekstrak dari pelarut

n-heksana yang memiliki bobot 20 gram dan ekstrak dari pelarut etil asetat yang

memiliki bobot 40 gram.

Tabel 4.1. Hasil Rendemen Ekstrak n-Heksana dan Etil Asetat

Total Simplisia Ekstrak Bobot Rendemen

1,256 Kg

n-Heksana 20 gram 1,59%

Etil Asetat 40 gram 3,18%

4.3 Hasil Penapisan Fitokimia

Uji penapisan fitokimia dilakukan untuk mengidentifikasi komponen apa

saja yang terkandung dalam tanaman, sehingga memungkinkan untuk mengetahui

senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan. Dari hasil uji penapisan fitokimia,

ekstrak etil asetat positif mengandung beberapa komponen golongan senyawa

antara lain, steroid, terpenoid, flavonoid, dan asam lemak.

42


Tabel 4.2. Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Etil Asetat

No Golongan Kimia Hasil Pengamatan

1 Alkaloid _

2 Flavonoid +

3 Steroid +

4 Terpenoid +

5 Kumarin _

6 Tanin _

7 Asam Lemak +

8 Fenol _

9 Saponin _

4.4 Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk mengetahui pola pemisahan

senyawa dari bercak yang dihasilkan. Keuntungan dari metode KLT ini, yaitu

analisisnya cepat dan sampel yang digunakan sedikit. Pola pemisahan yang baik

tergantung dari fase gerak yang digunakan. Penentuan fase gerak pada KLT

berguna dalam menentukan fase gerak yang akan digunakan dalam kromatografi

kolom.

Dari hasil uji kromatografi lapis tipis, ekstrak n-heksana dielusi dengan

menggunakan fase gerak dengan komposisi n-heksana dan etil asetat dengan

perbandingan 8:2, sedangkan ekstrak etil asetat dielusi dengan menggunakan fase

gerak n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 6:4. Pemilihan fase gerak

untuk kedua ekstrak cukup baik dengan terlihatnya banyak senyawa yang terpisah

(Lampiran 3).

43


4.5 Hasil Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Dengan DPPH

Untuk mengetahui adanya senyawa antioksidan dalam tumbuhan paku

Nephrolepis falcata, dilakukan uji pendahuluan aktivitas antioksidan. Metode

yang digunakan yaitu dengan metode DPPH, alasannya karena metode ini

memiliki kelebihan, diantaranya, analisisnya mudah, cepat dan efisien, serta

memungkinkan mengetahui adanya senyawa yang bersifat sebagai antioksidan

yang dapat dilihat secara visual.

Gambar 4.1. Hasil Uji Kualitatif Antioksidan Ekstrak. (a). Ekstrak Etil Asetat

(b) Ekstrak n-Heksana.

Dari hasil uji aktivitas antioksidan, ekstrak etil asetat dan n-heksana

menunjukkan adanya aktivitas senyawa antioksidan. Ini diketahui dengan melihat

pola bercak setelah disemprot dengan pereaksi DPPH. Pola bercak yang

menimbulkan warna kuning dengan latar belakang ungu setelah disemprot dengan

DPPH, mengindikasikan adanya senyawa antioksidan (Aderogba, et al., 2012)

A B

Eluen

n-heksana:E.A (8:2)

Eluen

n-heksana:E.A (6:4)

44


4.6 Hasil Pemisahan Dengan Kromatografi Kolom

Hasil pemisahan pada kromatografi kolom pertama, diperoleh fraksi

sebanyak 206 vial. Dari 206 fraksi, diperoleh 12 sub fraksi yang memiliki pola

bercak dengan nilai Rf yang sama antara lain F1.A merupakan fraksi no.(14),

F1.B gabungan fraksi no.(15-25), F1.C gabungan fraksi no.(26-34), F1.D

gabungan fraksi no.(35-52), F1.E gabungan fraksi no.(53-67), F1.F gabungan

fraksi No.(68-75), F1.G gabungan fraksi no.(76-97), F1.H gabungan fraksi

No.(98-113), F1.I gabungan fraksi No.(114-132), F1.J gabungan fraksi

no.(133-184), F1.K gabungan fraksi no.(185-188) dan F1.L gabungan fraksi

no.(189-206). Dari 12 sub fraksi, fraksi yang memberikan pola bercak dengan

aktivitas antioksidan yang banyak adalah fraksi F1.A dengan bobot 2,5 gram,

sehingga fraksi tersebut dilakukan pemisahan lebih lanjut dengan kromatografi

kolom.

Hasil pemisahan pada kromatografi kolom kedua, diperoleh fraksi

sebanyak 128 vial. Dari 128 fraksi, diperoleh 6 sub fraksi dari hasil gabungan

fraksi yang memiliki pola bercak yang sama antara lain, F2.A gabungan fraksi

no.(46-50), F2.B gabungan fraksi no.(51-52), F2.C gabungan fraksi no.(56-70),

F2.D gabungan fraksi no.(71-90), F2.E gabungan fraksi no.(91-98) dan F2.F

gabungan fraksi no.(99-128). Dari 6 sub fraksi, fraksi yang memberikan pola

bercak dengan aktivitas antioksidan yang banyak adalah fraksi F2.A dengan bobot

658,7 mg, sehingga fraksi tersebut dilakukan pemisahan kembali dengan

kromatografi kolom untuk memperoleh senyawa yang lebih murni. Dari

kromatografi kolom II, juga diperoleh kristal berwarna putih yang terdapat pada

fraksi F2.A dan fraksi F2.D.

Hasil pemisahan pada kromatografi kolom ketiga, diperoleh 196 fraksi.

Dari 196 fraksi diperoleh 5 sub fraksi dari hasil gabungan fraksi yang memiliki

pola bercak yang sama antara lain, F3.A gabungan fraksi no.(30-47), F3.B

gabungan fraksi no.(48-61), F3.C gabungan fraksi no.(62-77), F3.D gabungan

fraksi no.(78-93) dan F3.E gabungan fraksi no.(93-110). Pada kromatografi kolom

III juga diperoleh kristal berwarna putih yang terdapat pada fraksi F3.C

(No.62-77). Dari hasil pemisahan dengan kromatografi kolom, diperoleh tiga

isolat yang tertera pada tabel di bawah.

45


Tabel 4.3. Hasil Isolat Dari Ekstrak Etil Asetat

Dari ketiga kristal yang diperoleh, setelah dilakukan uji aktivitas antioksidan

dengan DPPH, hanya kristal fraksi F2.D yang aktif sebagai antioksidan, sehingga

kristal tersebut yang dianalisa lebih lanjut.

Gambar 4.2. Hasil Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Isolat. (A). Kristal F2.A

(B) Kristal F2.D, (C) Kristal F3.C.

Fraksi Organoleptik

Rf Eluen Bobot

F2.A Bentuk: Kristal jarum pendek

Warna: Putih bening 0,675

n-heksana:E.A

(8:2) 5 mg

F2.D Bentuk: Kristal jarum panjang

Warna: Putih 0,325

n-heksana:E.A

(8:2) 20 mg

F3.C Bentuk: Kristal jarum pendek

Warna: Putih bening 0,67

n-heksana:E.A

(8:2) 80 mg

A B

Rf = 0,325

n-heksana : E.A

C

(8:2)

Eluen

46


4.7 Hasil Uji Kemurnian Senyawa

Hasil uji kemurnian senyawa meliputi: Hasil uji titik leleh, hasil KCKT

dan hasil KLT 2 dimensi.

4.7.1 Hasil Uji Titik Leleh (Melting Point)

Pengujian titik leleh bertujuan untuk mengetahui kemurnian senyawa

berdasarkan titik leleh senyawa uji. Senyawa dikatakan murni apabila memiliki

titik leleh dengan rentang ±20C. Hasil pengujian titik leleh dari senyawa fraksi

F2.D menunjukkan jarak leleh antara 132-1340C. Dari hasil tersebut diketahui

bahwa jarak antara titik awal senyawa tersebut meleleh hingga meleleh sempurna

adalah 20C, sehingga dapat diindikasikan bahwa senyawa dari fraksi F2.D telah

murni.

4.7.2 Hasil KCKT

Pengujian kemurnian senyawa selanjutnya menggunakan KCKT. KCKT

dipilih karena memiliki beberapa kelebihan, diantaranya memiliki sensitivitas

yang tinggi, kemampuan pemisahan yang cepat, teknik dengan resolusi tinggi dan

efisien. KCKT akan memberikan puncak tunggal apabila senyawa yang di analisa

telah murni.

Dari hasil pengujian kemurnian senyawa fraksi F2.D dengan KCKT,

menunjukkan puncak tunggal pada waktu retensi 5,672 menit. Hasil ini

mengindikasikan bahwa senyawa dari fraksi F2.D telah murni (lampiran 5).

4.7.3 Hasil KLT 2 Dimensi

KLT dua dimensi digunakan untuk menguji kemurnian suatu senyawa

dilihat dari bercak yang dihasilkan dengan kromatografi secara dua arah. Senyawa

dikatakan murni apabila memiliki bercak tunggal setelah dilakukan pengujian

dengan KLT dua dimensi. Hasil KLT dua dimensi dari senyawa fraksi F2.D

menunjukkan bercak tunggal dengan nilai Rf 0,325, sehingga dapat diindikasikan

bahwa senyawa dari fraksi F2.D telah murni.

47


Gambar 4.3. Hasil KLT 2 Dimensi Dari Senyawa Fraksi F2D, Dengan Penampak Bercak: Pereaksi Godyns

4.8 Penentuan Struktur Molekul Senyawa fraksi F2.D.

Penentuan struktur molekul senyawa fraksi F2.D meliputi: Hasil

UV-Visible, spketrofotometri infra merah dan hasil 1H-RMI.

4.8.1 Hasil UV-Visible

UV-Visible digunakan untuk mengetahui karakteristik senyawa

berdasarkan panjang gelombang maksimum yang dihasilkan. Panjang gelombang

dari suatu senyawa tergantung dari senyawa yang dianalisa, alasannya karena

syarat senyawa yang dapat dianalisa dengan UV-Visible adalah senyawa yang

memiliki gugus kromofor atau senyawa tersebut memiliki warna. Senyawa yang

memiliki gugus kromofor akan menghasilkan serapan dengan panjang gelombang

pada daerah UV (200-400 nm), sementara senyawa yang memiliki warna akan

menghasilkan serapan dengan panjang gelombang pada daerah tampak (visible)

(400-800 nm).

Dari hasil analisa senyawa dengan UV-Visible, senyawa dari fraksi F2.D

menghasilkan serapan pada panjang gelombang 239 nm. Senyawa yang dianalisa

Eluen: n-heksana:etil asetat (8:2)

n-heksana:etil asetat (8:2)

Rf = 0,325

Eluen

48


tersebut memiliki panjang gelombang pada daerah UV (200-400 nm), sehingga

dapat diketahui bahwa senyawa tersebut memiliki gugus kromofor (Lampiran 6).

4.8.2 Hasil Spektrofotometri Infra Merah

Infra merah digunakan dalam menetukan struktur molekul senyawa

berdasarkan gugus fungsi dari senyawa yang dianalisa. Gugus fungsi suatu

senyawa dapat diketahui dari spektrum yang dihasilkan oleh infra merah, karena

setiap gugus fungsi memiliki karakteristik spektrum yang khas yang dihasilkan

oleh infra merah. Hasil analisa infra merah dari senyawa fraksi F2.D,

menunjukkan adanya serapan melebar dan kuat pada bilangan gelombang

3450-3426 cm-1, yang mengindikasikan adanya gugus OH. Selanjutnya terdapat

serapan dengan intensitas kuat pada bilangan gelombang 2936-2867 cm-1 yang

mengindikasikan adanya gugus CH alifatik, serapan dengan intensitas medium

terlihat pada bilangan gelombang 1646 cm-1 yang mengindikasikan adanya gugus

karbon dengan ikatan rangkap dua (alkena) C=C dalam struktur cincin

heterosiklik (Lampiran 7).

Gugus alkena dalam struktur cincin heterosiklik ini diketahui karena

umumnya gugus fungsi alkena memiliki frekuensi serapan pada daerah

1640-1670 cm-1, sedangkan frekuensi serapan akan menurun apabila gugus alkena

berada di dalam struktur cincin heterosiklik (Pavia, et al., 2001).

Dari data spektrum infra merah dapat disimpulkan bahwa senyawa dari

fraksi F2.D memiliki gugus fungsi OH, CH alifatik, dan adanya gugus alkena

(C=C).

4.8.3 Hasil Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-RMI)

Analisa struktur dengan 1H-RMI memungkinkan untuk mengetahui

Kedudukan proton dalam suatu struktur molekul. Data yang dihasilkan dari 1H-RMI berupa pergeseran kimia yang dapat dianggap sebagai ciri bagian tertentu

dari suatu struktur molekul dan dapat membantu mengidentifikasi tiap gugus

suatu senyawa.

Dari data spektrum 1H-RMI, senyawa fraksi F2.D memiliki gugus fungsi

yang khas antara lain, terdapat 6 gugus metil (CH3), pada nilai geseran kimia

(0,6755 ppm, 0,8156 ppm, 0,8376 ppm, 0,8415 ppm, 0,9233 ppm, dan 1,0049

49


ppm), pada geseran kimia 2,761 ppm (m) mengindikasikan adanya gugus metilen

(CH2) yang berikatan dengan gugus alkena (C=C-CH2), pada geseran kimia

3,5148 ppm (m) mengindikasikan adanya gugus metin (CH) yang berikatan

dengan gugus OH (CH-OH) dan pada geseran kimia 5,3525 ppm (m)

mengindikasikan adanya satu sinyal proton yang berikatan dengan gugus alkena

(C=CH) (Lampiran 8-13).

Tabel 4.4. Data Geseran Kimia Proton Senyawa Fraksi F2.D Yang Diukur

Pada Frekuensi 500 MHz Dengan Pelarut CDCl3

δH Gugus Fungsi

0,6755 ppm, (s) 3H (CH3)

0,8156 ppm, (m) 3H (CH3)

0,8376 ppm (m) 3H (CH3)

0,8415 ppm, (m) 3H (CH3)

0,9232 ppm, (d) 3H (CH3)

1,0049 ppm, (s) 3H (CH3)

2,761 ppm, (m) 2H (C=C-CH2)

3,5148 ppm, (m) (CH-OH)

5,3525 ppm, (m) 1H (C=CH)

Dari hasil analisa instrumen di atas, senyawa F2.D memiliki kesamaan

struktur dengan senyawa golongan triterpenoid yaitu β-sitosterol. Dari data infra

merah, senyawa F2.D menunjukkan adanya karakteristik spektrum yang sesuai

dengan spektrum β-sitosterol. β-sitosterol sendiri memiliki spektrum yang khas

50


pada infra merah dengan adanya gugus OH pada bilangan gelombang

3373,6 cm-1, kemudian adanya gugus CH alifatik pada bilangan gelombang

2936 cm-1 sampai 2867 cm-1, adanya gugus alkena (C=C) pada bilangan

gelombang 1641 cm-1 dan adanya gugus CH2 pada bilangan gelombang 1457 cm-1

(Kamboj, et al., 2011; Sen, et al., 2012).

Tabel 4.5. Perbandingan Data Serapan Gugus Fungsi Senyawa Fraksi

F2.D Dengan Senyawa β-sitosterol.

β-sitosterol Senyawa Fraksi F2.D Gugus Fungsi

3425 cm-1 3446 cm-1 OH

2936-2876 cm-I 2936-2876 cm-1 CH Alifatik

1641 cm-1 1646 cm-1 C=C

1457 cm-1 1457 cm-1 CH2

Selanjutnya dari data yang diperoleh 1H-RMI, senyawa F2.D

menunjukkan adanya gugus fungsi yang mirip dengan gugus fungsi yang dimiliki

β-sitosterol. Dari data 1H-RMI diketahui bahwa senyawa F2.D memiliki 6 gugus

metil yang mana merupakan ciri dari senyawa β-sitosterol. β-sitosterol memiliki

ciri spektrum yang khas, yaitu 6 gugus metil yang terdapat pada nilai geseran

kimia (0,68 ppm (s); 0,81 ppm (m); 0,83 ppm (m), 0,84 ppm (m); 0,92 ppm (d);

1,01 ppm (s). Selanjutnya pada geresan kimia 3,50 ppm (m) terdapat gugus metin

(CH) yang berikatan dengan gugus OH (CH-OH) pada karbon ke 3, dan pada

geseran kimia 5,35 ppm (m) terdapat satu proton yang berikatan dengan gugus

alkena (C=CH) pada atom karbon ke 6 (Hisham, et al., 2012).

51


Tabel 4.6. Perbandingan Data Geseran Kimia Proton Senyawa Fraksi

F2.D Dengan β-sitoterol (Sosińka, et al., 2013)

δH Gugus Fungsi

β-sitosterol Senyawa F2.D

0,68 ppm (s) 0,6775 ppm (s) 3H (CH3)

0,81 ppm (d) 0,815 ppm (d) 3H (CH3)

0,83 ppm (d) 0,841 ppm (d) 3H (CH3)

0,85 ppm (t) 0,855 ppm (t) 3H (CH3)

0,92 ppm (d) 0,923 ppm (d) 3H (CH3)

1,01 ppm (s) 1,004 ppm (s) 3H (CH3)

0,93 ppm (m) 0,934 ppm (m) 1H (CH)

0,93 ppm (m) 0,941 ppm (m) 1H (CH)

1,02 ppm (m) 1,024 ppm (m) 1H (CH)

1,09 ppm (m) 1,098 ppm (m) 2H (CH2)

1,11 ppm (m) 1,108 ppm (m) 1H (CH)

1,16 ppm (m) 1,163 ppm (m) 2H (CH2)

1,20 ppm (m) 1,202 ppm (m) 2H (CH2)

1,25 ppm (m) 1,248 ppm (m) 2H (CH2)

1,26 ppm (m) 1,274 ppm (m) 2H (CH2)

1,34 ppm (m) 1,346 ppm (m) 2H (CH2)

1,35 ppm (m) 1,361 ppm (m) 1H (CH)

1,44 ppm (m) 1,375 ppm (m) 2H (CH2)

1,45 ppm (m) 1,456 ppm (m) 1H (CH)

1,48 ppm (m) 1,486 ppm (m) 2H (CH2)

1,51 ppm (m) 1,51 ppm (m) 2H (CH2)

1,57 ppm (m) 1,579 ppm (m) 2H (CH2)

1,66 ppm (m) 1,561 ppm (m) 1H (CH)

2,23 ppm (m) 2,34 ppm (m) 2H (CH2)

3,51 ppm (d) 3,514 ppm (d) (CH-OH)

5,35 ppm (d) 5,352 ppm (d) 1H (CH)

52


Kesamaan struktur ini juga diperkuat dengan data lainnya, yaitu data uji titik

leleh. Senyawa F2.D memiliki titik leleh dengan rentang 132-1340C. Berdasarkan

pustaka, sebelumya telah dilaporkan bahwa titik leleh β-sitosterol adalah

1330C (Woldeyes, et al., 2012) Dari data di atas dapat diperkirakan bahwa

senyawa F2.D adalah senyawa β-sitosterol.

β-sitosterol merupakan senyawa golongan triterpenoid yang memiliki

struktur utama yaitu siklopentana perhidrofenantren dengan rumus molekul

C29H50O. Senyawa ini secara alamiah terdapat dalam tumbuhan. Berdasarkan

struktur molekul, senyawa β-sitosterol memiliki 6 gugus metil (CH3), 11 gugus

metilen (CH2), 9 gugus metin (CH), dan adanya satu gugus hidroksil (OH) yang

berperan dalam memberikan aktivitas antioksidan. Berdasarkan pustaka,

β-sitosterol memiliki beberapa aktivitas biologis diantaranya sebagai analgesik,

antiinflamasi, antidiabetes dan antikanker. β-sitosterol juga memiliki aktivitas

antioksidan dengan nilai IC50 389,5 µM (Baskar, et al., 2010).

Gambar 4.4. Struktur Molekul β-sitosterol


BAB 5

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

Senyawa fraksi F2.D yang diperoleh dari ekstrak etil asetat tumbuhan paku

Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr diperkirakan adalah senyawa β-sitosterol. Ini

diketahui berdasarkan data infra merah yang menunjukkan adanya gugus fungsi

utama yaitu gugus OH, CH alifatik dan gugus alkena (C=C) yang merupakan ciri

khas dari struktur senyawa β-sitosterol. Ini diperkuat dengan adanya data 1H-RMI,

yang menunjukkan adanya gugus yang khas antara lain, adanya 6 gugus metil

(CH3), gugus metilen yang berikatan dengan ikatan rangkap karbon (C=C˗CH2),

gugus metin yang berikatan dengan gugus hidroksil (CH-OH) dan adanya satu

proton yang berikatan dengan ikatan rangkap karbon (C=CH). Berdasarkan

pustaka, senyawa fraksi F2.D memiliki gugus fungsi yang identik dengan

senyawa β-sitosterol, sehingga dapat diduga bahwa senyawa fraksi F2.D adalah

senyawa β-sitosterol.

5.2 Saran

1. Perlu adanya data lebih lanjut mengenai penentuan struktur dari senyawa

fraksi F2D, yang meliputi data 13C-RMI dan RMI dua dimensi (HMBC,

HMQC dan NOESY) sebagai data pendukung dari struktur senyawa F2D.

2. Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif dari senyawa F2D

untuk mengetahui seberapa kuat aktivitas antioksidan dari senyawa tersebut.

3. Perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai isolasi antioksidan dari

tanaman ini. Karena diketahui masih banyak senyawa antioksidan yang

belum dapat diidentifikasi pada penelitian ini.

4. Perlu juga dilakukan penelitian mengenai aktivitas farmakologi terhadap

tanaman ini, karena telah diketahui bahwa tanaman ini mengandung senyawa

yang berkhasiat sebagai obat.

45


DAFTAR PUSTAKA

Aderogba, A, M. Kgatle, T, D. McGaw, J, L. Eloff, N, J. 2011. Isolation of

Antioxidant Constituents from Combretum apiculatum subsp. Apiculatum.

South African Journal of Botany 79.

Adrianingsih, R. 2009. Penggunaan High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) Dalam Proses Analisa Ion. Berita Dirgantara Vol.10 No.4.

Allen RG, Tressini M. 2000.Oxidative Stress and Gene Regulation. Free Radical

Biol Med 463-99.

Al -Mutairi, K, S. Al-jasser, S, M. 2012. Effect of Using Rotary Evaporator on

Date Dibs Quality.Journal of American Science 2012.

Andlauer, W. and P. Furst. 1998. Antioxidative Power of Phytochemicals With

Special Reference to Cereals. General Mills, Inc., Minneapolis, Minnesota.

Badami, S., Gupta, M.K., Suresh, B., 2003. Antioxidant Activity of the Ethanolic

Extract of Striga Orobanchioides. Journal of Ethnopharmacology 2852,

Baskar, A, A. Ignacimuthu, S. Paulraj, M, G. Numair, A, S, K. 2010.

Chemopreventive Potential of β-sitosterol In Experimental Colon Cancer

Model–An in Vitro and in Vitro Study. BMC Complementary and

Alternative Medicine, 10:24

Basma, A. A., Zakaria, Z., Latha, Y, L., Sasidharan, S. 2011. Antioxidant Activity

and Phytochemical Screening of the Methanol Extract of Euphorbia hirta

L. Aisan Pasific Journal of Tropical Medicine.

Benjamin A. Manickan V.S. 2007. Medicinal Pterodophyta from Western Ghat.

Indian Journal of Traditional Knowledge.

Blois, M. S,. 1958. Antioxidant Determination By The Use of a Stable Free

Radical, Nature. 181: 1199-1200.

Boveris, A.D., Galatro, A., Sambrotta, L., Ricco, R., Gurni, A.A., Puntarulo, S.,

2001. Antioxidant Capacity of a 3-deoxyanthocyanidin from Soybean.

Phytochemistry 58, 1097–1105.

55


Brain, K, R. Turner, T, B. 1975. The Practical Evaluation of

Phytopharmaceutical. Wrights Sciencetechnia. Bristol.

Bruneton, J., (1999). Pharmacognosy, Phytochemistry and Medicinal Plants.

Intercept. Ltd. England, U.K.

Daintith, J. 1994. Kamus Lengkap Kimia. Jakarta: Penerbit Erlangga.

Day,R. A., dan Underwood, A. L., 1999, Analisis Kimia Kuantitatif (Penerjemah

Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, Ph.D.), Penerbit Erlangga, Jakarta, hal:

491.

Dayanti, R. Suyatno. 2012. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Bagian

BatangTumbuhan Paku Nephrolepis radicans (burm.) kuhn.UNESA Journal

of Chemistry Vol.1, No. 1.

Ditjen POM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta:

Departemen Kesehatan RI.

Droge W. 2002.Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function.

Physiol Rev:47-95.

Dudani, S. Chandran, S, M, D. Ramachandra, T, V. 2012. Pteridophytes of

Western Ghats. Energy & Wetland Research group, Center of Ecological

Sciences, Indian Institute of Science, Bangalore – 50 012

Fathima, M. Shantha, N. Rajagovindan, P, N. 2005. Botany, Higher Secondary-

First Year, Volume 1. Tamilnadu Texbook Coorporation.

Gandjar, I, G. Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka

Pelajar, Hal: 353-367.

Gocan, s. 2002. Stationary Phases for Thin-Layer Chromatography. Journal of

Chromatographic Science, Vol. 40.

Goldberg, G. 2003. Plants: Diet and Health. I Owa State Press, Blackwell

Publishing Company, 2121 State Avenue, Ames, USA.

Gordon, M. H. 1990. The Mechanism of Antioxidant Action in vitro. Di dalam :

Hudson, B. J. F. (ed). Food Antioxidants. Elsevier Applied Science,

London.

56


Gritter, R, J; Bobbit, M, J; Schwarting, E, A. Introduction to Chromatography

(Pengantar Kromatografi), Edisi Kedua. Penerjemah kosasih Padmawinata.

Bandung: Penerbit ITB.

Hanja. Sharma R. 2012.Assessment of Antibacterial Properties of the fern

Nephrolepis tuberosa. International jornal pf Biology, Pharmacy and Allied

Sciences.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Penerjemah: Kosasih P., Soediro Iwang. Bandung: Penerbit

ITB.

Heinrich, M. Barnes, J. Gibbons, S. Williansom, M, E. Fundamental of

Pharmacognosy and Phytotherapy. Philadelpia: Penerbit Elsevier.

Hisham, N, M, D. Lip, M, J. Suri, R. Shafit M, H. Kharis, Z. Shazlin, K. Normah,

A. Nabilah, N, F, M. 2012. Argowaste: Phytosterol from Durian Seed.

World Academy of Science, Engineering and Technology.

Hostettman, K; Hostettman, M; Maerston. 1995. Preparative Chromatography

Technique:Application in Natural Product Isolation. Cara Kromatografi

preparatif: Penggunaan Pada Isolasi Senyawa Alam (diterjemahkan Oleh

Kosasih P) Bandung: Penerbit ITB.

Isnindar. Wahyuono, S. Setyowati, P, E. 2011. Isolasi dan Identifikasi Senyawa

Antioksidan Daun Kesemek (diospyros kaki thunb.) Dengan Metode dpph

(2,2-Difenil-1- Pikrilhidrazil). Majalah Obat Tradisional, 16(3).

Ja, K., Sharma R. , 2012. Assesment of Antibacterial Properties of the Ferns

Nephrolepis tuberosa. IJBPAS, November, 2012, 1(10): 1524-1529

Kamboj, A. Saluja, K, A. 2010. Isolation of Stigmasterol and β-sitosterol from

Petroleum Ether Extract of Aerial Parts of Ageratum Conyzoides

(Asteraceae). International Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol 3, issue

2011.

Khopkar, S, M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.

Komala, I. 2012.Laporan Penelitian Individu. uji aktivitas antioksidan tumbuhan

paku Indonesia.Program Studi Farmasi, Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah. Jakarta.

57


Kumari, K. P. S., Sridevil. V., Lakshmi. C. V. V. M. 2012. Studies on

Phytochemical Screening of Aqueousextract Collected from Fertilizers

Affected Two Medicinal Plants. Journal of Chemical, Biological and

Physical Sciences. Vol.2.No.3, 1326-1332.

Lai, Y, H. Lim Y, Y. 2011. Evaluation of Antioxidant Activities of the Methanolic

Extracts of Selected Ferns in Malaysia. International Journal of

Environmental Science and Development, Vol. 2, No. 6.

Lee, Y, J. Yon, W, J. Kim, T, C. Lim, T, S. 2004. Antioxidant Activity of

Phenylpropanoid Esters Isolated and Identified from Platycodon

grandiflorum A. DC. Journal Phytochemistry. Elsevier.

Lu, Y., Foo, Y., 2001. Antioxidant activities polyphenols from sage (Salvia

officinalis). Food Chemistry 75,Badami, S., Gupta, M.K., Suresh, B., 2003.

Antioxidant activity of theethanolic extract of Striga orobanchioides.

Journal of Ethnopharmacology2852, di dalam, Lee, Y, J. Yon, W, J. Kim, T,

C. Lim, T, S. 2004. Antioxidant activity of Phenylpropanoid Esters Isolated

and Identified from Platycodon grandiflorum A. DC. Journal

Phytochemistry. Elsevier.

McNair, M, H; Miller, M, J. 1998. Basic Gas Chromatography. New York: John

Wiley & Son.

Miller, H. E., F. Rigelholf, L. Marquart, A. Prakash, M. Kanter. 2000. Antioxidant

Content of Whole Grain Breakfast Cereals, Fruits and Vegetables. Journal

of The American College of Nutrition. Vol. 19. No. 3.

Molyneux, P., 2004, The Use of DPPH to Estimate Antioxidant Activity, J.Sci.

Tecnol, 26 (2)

Muchtadi, D. 2000. Sayur-sayuran Sumber Serat dan Antioksidan:

MencegahPenyakit Degeneratif. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi,

Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Ncube NS, Afolayan AJ, Okoh AI. Assessment Techniques of Antimicrobial

Properties of Natural Compounds of Plant Origin: Current Methods and

Future Trends. African Journal of Biotechnology 2008; 7 (12):

Nugroho, B. W., Dadang, & Prijono, D. ńλλλ. “Pengembangan dan Pemanfaatan

Insektisida Alami”. Pusat Kajian Pengendalian Hama Terpadu, IPB. Bogor..

58


Pavia, l, D. Lampman, M, G. Kriz, S, G. 2001. Introduction To Spectroscopy,

Third Edition. Departement of Chemistry Western Washington University

Bellingham, Washington.

Pers., 2010. Lokakarya Nasional Tanaman Obat Indonesia. Pusat Informasi

Kehutanan Republik Indonesia.

Pooja. 2004. Pterrdophyta Discovery Publishing House. India: di dalam, Komala,

I. 2012. Uji Aktivitas Tumbuhan Paku Indonesia. Program Studi Farmasi.

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Prakash, A. Rigelhof, F. Miller, E. 2001. Activity Antioxidant. Medallion

Laboratories.

Proctor PH, Reynolds ES. 1984. Free Radicals and Diseas In Man. Physiol Chem

Phys Med:175-95.

Rashid, A. Qureshi, Z, M. Raza, A, S. William, J. Arsyad, M. Quantitative

Determination of Antioxidant Potential of Artemisia Persica. Analele

UniversităLii din Bucuresti–Chimie (serie nouă), vol ńλ no. ń.

Rates, K, M, S. 2001.Plants As Source Of Drugs. Toxicon 39.

Rosenthal GA, 1991. The Biochemical Basis For the Deleterious Effects of L

Canavanine. Phytochemistry: di dalam, M, Mazid., TA, Khan., F,

Muhammad. 2011. Role of Secondary Metabolites in Defense Mechanisms

Of Plants. Biology and Medicine, 3 (2) Special Issue:

Sarker, D, S. Latif, Z. Gray, I, A. 2006. Natural Product Isolation. Second

Edition. Humana Press. Totowa, New Jersey.

Sastrohamidjojo, H., 2005, Kromatografi. Penerbit Liberty Yogyakarta,

Yogyakarta.

Schafer H, Wink M, 2009. Medicinally Important Secondary Metabolites in

Recombinant Microorganisms or Plants: Progress in Alkaloid Biosynthesis.

Biotechnology Journal.

Sen, A. Dhavan, P. Shulka, K, K. Singh, S. Tejovathi, G. 2012. Analysis of IR,

NMR and Antimicrobial Activity of β-sitosterol Isolated from Momordica

charantia. Science Secure Journal of Biotechnology, Volume 1, Issue 1.

Siems, K., Weigt F. Wollenweber. E. 1996. Dimarines from the Epicuticular Wax

of the Fern Nephrolepis biserrata. Phytochemistry 41.

59


Simanjuntak, P., T. Parwati, L. E. Lenny, S. Tamat, R. Murwani. 2004. Isolasi

dan Identifikasi Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Benalu Teh, Scurrula

oortiana (Korth) Danser (Loranthaceae). Jurnal Ilmu Kefarmasian

Indonesia ISSN 1693-1831, Vol. 2 No. 1.

Soeder, R, W. 1985. Fern Constituens: Including Occurrence, Chemotaxonomy

and Physiological Activity. The Botanical Riview 51 (4), 442-536.

Soesilo, Slamet, Drs. 1995. Farmakope Indonesia, Edisi IV. Jakarta: Departemen

kesehatan Republik Indonesia.

Sosińska, E. Przybylski, R. Hazendonk, P. Zhao, Y, Y. Curtis, M, J. 20ń3.

Characterisation of Non Polar Dimers Formed During Thermo Oxidative

Degradation of β-sitosterol. Food Chemistry. 464-474

Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Penerjemah :

Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB.

Sudjadi, M,S., 1985. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Penerbit Ghalia,

Indonesia, Jakarta.

Sumarno, 2001, Kromatografi Teori Dasar, Bagian Kimia Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Supari, F. 1996. Radikal Bebas dan Patofisiologi Beberapa Penyakit.

ProsidingSeminar Senyawa Radikal dan Sistem Pangan: Reaksi

Biomolekuler, Dampak Terhadap Kesehatan dan Penangkalan. Kerjasama

Pusat StudiPangan dan Gizi-IPB dengan Kedutaan Besar Prancis, Bogor.

Surai, P. F. 2003. Natural Antioxidant in Avian Nutrition and Reproduction.

Bookcraft, Bath, England.

Tiwari, P. Kumar, B. Kaur, M. Kaur, G. Kaur, H. 2011. Phytochemical Screening

and Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia. Vol. 1.

Issue. 1.

Townshend, A. 1995. Encyclopedia of Analytical Science, Vol. 2. London:

Academic Press Inc.

Verpoorte, R. Kim, K, H. Choi, Y, H. 2006. Plants As Source of Medicines.

Amsterdam.

60


Waller, R, G. Mangiafico, S. Richey, R, C. 1978. A Chemical Investigation of

Aloe barbadensis Miller.Department of Biochemistry, Oklahoma

Agricultural Experimental Station, Oklahoma State University, Stillwater,

Oklahoma

Wang, S. Y., Y. H. Kuo, H. N. Chang, P. L. Kang, H. S. Tsay, K. F. Lin, N.

S.Yang, L. F. Shyur. 2002. Profiling and Characterization Antioxidant

Activities in Anoectochilus formosanus Hayata. Journal of. Agricultural

and. Food Chemistry. 50.1859-1865.

Watson, D, G. 2009. Analisis Farmasi : buku ajar untuk mahasiswa farmasi dan

praktisi kimi farmasi. Penerjemah: Winny R. Syarief, Edisi kedua. Jakarta:

EGC.

Woldeyes, S. Adane, L. Triku, Y. Muleta, D. Begashaw, T. 2012. Evaluation of

Antibacterial Activities of Compounds Isolated from Sida rhombifolia

Linn. (Malvaceae). Natural Products Chemistry & Research.Department of

Chemistry, Jimma University, Jimma, Ethiopia

61


Lampiran 1. Hasil Determinasi Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr.

62


Lampiran 2. Bagan Alur Ekstraksi Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata

Ekstrak etil asetat (40 gram)

Uji pola KLT dan uji kualitatif aktivitas antioksidan dengan DPPH

Maserasi dengan 4,5 liter n-heksana Disaring Dievaporasi

Remaserasi dengan 4,5 liter etil asetat

Disaring Dievaporasi

Disortasi Dicuci Dikeringkan Dihaluskan

Sampel daun segar

Nephrolepis falcata (10,1 kg)

Serbuk kering daun

Nephrolepis falcata (1,256 kg)

Ampas Ekstrak n-heksana (20 gram)

Uji pola KLT dan uji kualitatif aktivitas antioksidan dengan DPPH

Ampas

63


LAMPIRAN 3 Uji Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Etil Asetat dan n-Heksana Nephrolepis falcata.

A B A B

Keterangan: Gambar A: Kromatografi lapis tipis (A) ekstrak etil asetat, (B) ekstrak n-heksana, fase gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 6:4.

Gambar B: Kromatografi lapis tipis (A) ekstrak etil asetat, (B) ekstrak n-heksana, fase gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 8:2

A B

64


Lampiran 4 . Bagan Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan Tumbuhan Paku

Nephrolepis falcata

.

Silika gel 40 gram Fase gerak n-heksana:etil asetat Total 128 fraksi

Kromatografi kolom II

F1.A

(14)


Ekstrak etil asetat 32 gram, dipreadsorbsi dengan 15 gram silika gel

Kromatografi kolom I

Uji aktivitas antioksidan dengan DPPH

F1.A

(14)

F1.B

(15-25)

F1.C

(26-34)

F1.D

(35-52)

F1.E

(53-67)

F1.F

(68-75)

F1.G

(76-97)

F1.H

(98-113)

F1.I

(114-132)

F1.J

(133-184)

F1.K

(185-188)

F1.L

(189-206)

F1.F

(99-128)

F2.E

(91-98)

F2.D

(71-90)

(Kristal, 20 mg

F2.C

(56-70)

F2.B

(51-52)

F2.A

(46-50)

(Kristal, 5 mg)

65


LANJUTAN ISOLASI SENYAWA ANTIOKSIDAN


F3.C (kristal, 80 mg)

Kromatografi kolom III


F2.A (46-50)

F3.E (93-110)

F3.D (78-93)

F3.C (62-77)

F3.B (48-61)

F3.A (30-47)


F1.F (99-128)

F2.E (91-98)

F2.D (71-90)

(kristal, 20 mg)

F2.C (56-70)

F2.B (51-52)

F2.A (46-50)

(kristal, 5mg)

66


LANJUTAN ISOLASI SENYAWA ANTIOKSIDAN

Penentuan struktur molekul

F2.D (kristal, 20 mg)


F2.A (kristal, 5 mg)

F2.D (kristal, 20 mg)

F3 (kristal, 80 mg)

Pemurnian senyawa

IR 1H-RMI UV-Vis

Uji kemurnian

KLT 2D KCKT Titik leleh

67


Lampiran.5. Hasil analisis senyawa fraksi F2.D dengan KCKT

68


Lampiran 6 . Hasil analisis senyawa fraksi F2.D dengan UV-Visible

そ max = 23λ.0 nm

69


Lampiran7 . Hasil spektrum IR senyawa fraksi F2.D

70


Lampiran 8. Hasil spektrum 1H-RMI senyawa Fraksi F2.D

71


Lampiran 9 . Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa F2.D (Diperbesar)

72


Lampiran 10. Hasil spektrum 1H-RMI senyawa fraksi F2.D (Diperbesar)

73



74


Lampiran 12. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa Fraksi F2.D (Diperbesar)

75



76


Lampiran 14. Hasil Spektrum 1H-RMI Senyawa Fraksi F2.D (Diperbesar)

77


Lampiran 15. Spektrum 1H-RMI Senyawa β-Sitosterol (Hisham, et al., 2012)

Documents

ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI · PDF fileISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIOKSIDAN DARI FRAKSI ETIL ASETAT TUMBUHAN PAKU Nephrolepis falcata (Cav.) C. Chr ... FAKULTAS KEDOKTERAN