Isolation and characterIsolation and characterization of antagonists aization of antagonists a

gainst gainst Rhizoctonia Rhizoctonia sp.sp. 報告學生：楊麗燕、白瓊文報告學生：楊麗燕、白瓊文

前言前言** Rhizoctonia Rhizoctonia sp.sp. （立枯絲核菌）屬於不完全菌綱，（立枯絲核菌）屬於不完全菌綱，

以菌核進行感染，是重要的植物病原菌。以菌核進行感染，是重要的植物病原菌。

* * 在純培養下不形成有性與無性胞子，其營養菌在純培養下不形成有性與無性胞子，其營養菌絲具有下列特徵：絲具有下列特徵：

1. 1. 菌絲的分枝在其起源處有縊縮；菌絲的分枝在其起源處有縊縮； 2. 2. 菌絲分枝在距分枝點處不遠有隔膜；菌絲分枝在距分枝點處不遠有隔膜； 3. 3. 菌絲常成直角或銳角分枝；菌絲常成直角或銳角分枝； 4. 4. 菌絲無色至黃褐色，菌落最初為白色至乳白 菌絲無色至黃褐色，菌落最初為白色至乳白 色，最後呈黃褐色色，最後呈黃褐色。。

* * 本菌可為害植株根、莖、葉，造成下位葉黃化，本菌可為害植株根、莖、葉，造成下位葉黃化，嚴重時，黃化現象向上蔓延，造成立枯病，也嚴重時，黃化現象向上蔓延，造成立枯病，也可在葉緣或葉鞘上造成不規則黃褐色可在葉緣或葉鞘上造成不規則黃褐色

條斑等病徵。條斑等病徵。

* * 本菌在水稻上會造成水稻紋枯病，在其他冬本菌在水稻上會造成水稻紋枯病，在其他冬 季作物、田間雜草和其他植物上會造成種子季作物、田間雜草和其他植物上會造成種子 腐爛、根腐病和苗猝倒病，危害範圍相當廣泛，腐爛、根腐病和苗猝倒病，危害範圍相當廣泛，

故其防治辦法也有許多研究報告。 故其防治辦法也有許多研究報告。

* * 前人研究 前人研究 Bacillus Bacillus spp.spp. 、、 Pseudomonas sepaciaPseudomonas sepacia 、、Flavobacterium odoratumFlavobacterium odoratum 、、 Trichoderma Trichoderma spp.spp. 等等都具有程度不一的防治效果。都具有程度不一的防治效果。

目的目的* * 分離並初步鑑定具有能夠對 分離並初步鑑定具有能夠對 Rhizoctonia Rhizoctonia sp.sp.

（立枯絲核菌）產生拮抗作用的菌株。 （立枯絲核菌）產生拮抗作用的菌株。

材料材料 土樣土樣 本組與第五組土樣，故宮路上、青青農場旁及明水路上的菜園。本組與第五組土樣，故宮路上、青青農場旁及明水路上的菜園。

無菌生理食鹽水無菌生理食鹽水 培養基培養基 （（ 11 ）） 1/10 TSA1/10 TSA （＋（＋ cycloheximide 100 ppmcycloheximide 100 ppm ） ） （（ 22 ）） 1/10 TSA 1/10 TSA

（（ 33 ）） MRBMRB （（ + streptomycin 30 ppm+ streptomycin 30 ppm ）） （（ 44 ）） PDA PDA

（（ 55 ）） WA WA

（（ 66 ）） WAWA （玻璃紙） （玻璃紙） （（ 77 ）） NANA

生理及生化測試生理及生化測試 ( 1 ) MacConkey agar( 1 ) MacConkey agar

( 2 ) Simmons citrate agar slant( 2 ) Simmons citrate agar slant ( 3 ) Trypticase nitrate broth( 3 ) Trypticase nitrate broth ( 4 ) Gelatin( 4 ) Gelatin ( 5 ) Phenol red glucose broth( 5 ) Phenol red glucose broth ( 6 ) Phenol red manniol broth( 6 ) Phenol red manniol broth ( 7 ) SIM agar( 7 ) SIM agar ( 8 ) Starch agar( 8 ) Starch agar

實驗架構實驗架構採樣採樣

初步篩菌初步篩菌

細菌細菌 真菌真菌（（ Trichoderma spp.Trichoderma spp. ））

對峙培養對峙培養 對峙培養對峙培養

選效果明顯者選效果明顯者 觀察菌絲纏繞觀察菌絲纏繞

生化測試鑑定生化測試鑑定 分生孢子柄特徵分生孢子柄特徵

實驗方法實驗方法

採樣採樣↓↓

篩菌篩菌↓↓

分離分離↓↓

純化純化

自不同農地取得土樣

細菌： 1/10 TSA + cycloheximide 100 ppm

真菌： MRB + streptomycin 30 ppm

細菌：由菌落外觀挑選

真菌：只取 Trichoderma

土樣稀釋後推平板

細菌： 1/10 TSA

真菌： PDA, WA

↙ ↘↙ ↘

Trichoderma sp.

玻璃紙

Rhizoctonia sp.

細菌Rhizoctonia sp.

↓

生化測試

↓

鏡檢

表一、菌株資料與拮抗實驗結果表一、菌株資料與拮抗實驗結果

類 別 類 別 編 號 編 號 來 源 來 源 對 對 R. solani R. solani 生長抑制距離 （㎝） 生長抑制距離 （㎝） NANA PDAPDA

細 菌 細 菌

P-1P-1

本組 本組

－－ －－P-2P-2 －－ －－P-3P-3 －－ －－P-4P-4 －－ －－P-5P-5 0.50.5 －－G-1G-1

青青農場 青青農場

－－ －－G-2G-2 －－ －－G-3G-3 －－ －－G-4G-4 0.40.4 －－G-5 G-5

G-6G-6

1.51.5

－－1.21.2

－－G-8G-8 －－ －－G-9G-9 －－ －－

－：無抑制－：無抑制

類 別 類 別 編 號 編 號 來 源 來 源 對 對 R. solani R. solani 生長抑制距離 （㎝）生長抑制距離 （㎝） NANA PDAPDA

細 菌 細 菌

B-1B-1

故宮路故宮路

－ － N N B-2B-2 －－ N N B-3B-3 －－ N N B-4B-4 －－ NNB-5B-5 －－ NN

B-6B-6 －－ NNM-1M-1

明水路明水路

－－ N N M-2M-2 －－ N N M-3M-3 －－ N N M-4M-4 －－ NNM-5M-5 －－ NNM-6M-6 －－ NN

表二、菌株資料與拮抗實驗結果表二、菌株資料與拮抗實驗結果

－：無拮抗效果 N ：不生長

類 別 類 別 編 號 編 號 來 源 來 源 對 對 R. solani R. solani 生長抑制距離 （㎝）生長抑制距離 （㎝）NANA PDAPDA

細 菌細 菌

F-1F-1

第五組第五組

0.80.8 －－F-2F-2 －－ －－F-3*F-3* －－ 0.60.6F-4F-4 －－ －－F-6F-6 －－ －－F-7F-7 －－ －－F-8F-8 － － －－F-9F-9 －－ －－F-10F-10 －－ －－F-11F-11 －－ －－F-12F-12 －－ －－F-13F-13 －－ －－F-16F-16 －－ －－

－：無拮抗效果 * F-3 後來證明為真菌

表三、菌株資料與拮抗實驗結果表三、菌株資料與拮抗實驗結果

類 別 類 別 編 號 編 號 來 源 來 源 對 對 R. solani R. solani 生長抑制距離 （㎝）生長抑制距離 （㎝）

NANA PDAPDA

放線菌放線菌

AB-7 AB-7 故宮路故宮路 1.31.3 －－

AG-7 AG-7 青青農場青青農場 0.50.5 －－AG-10 AG-10 －－ NN

AF-5 AF-5

第五組第五組

－－ 0.50.5

AF-14AF-14 －－ NN

AF-15AF-15 －－ NN

AF-17AF-17 －－ NN

－：無拮抗效果 N ：不生長

表四、菌株資料與拮抗實驗結果表四、菌株資料與拮抗實驗結果

表五、真菌菌株資料與對峙實驗結果表五、真菌菌株資料與對峙實驗結果

類別類別 編號編號 來源來源 纏繞現象纏繞現象

Trichoderma Trichoderma spp. spp.

TG-1TG-1 青青農場青青農場 ＋＋

TF-1TF-1第五組第五組

－－

TF-2TF-2 ＋＋

TM-1TM-1明水路明水路

－－

TM-2TM-2 －－

TP-1TP-1 本組本組 －－

TT-1TT-1助教助教

－－

TT-2TT-2 －－

F-1 F-1

G (+) G (+) 桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，會桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，會隨畫線方向生成紡綞狀，直徑約 隨畫線方向生成紡綞狀，直徑約 0.5-0.8 cm0.5-0.8 cm ，邊，邊緣粗糙，產孢時菌體會膨大。緣粗糙，產孢時菌體會膨大。

G-4G-4

G (+)G (+) 桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑0.3-0.5 cm0.3-0.5 cm ，邊緣不規則，產孢。，邊緣不規則，產孢。

G-5G-5

G (+)G (+) 桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑0.3 cm0.3 cm左右，邊緣不規則，產孢。左右，邊緣不規則，產孢。

P-5P-5 G (-)G (-)球桿菌，菌落為有光澤的乳白色，呈圓形突球桿菌，菌落為有光澤的乳白色，呈圓形突

起，直徑起，直徑 0.1 cm 0.1 cm ，具有黏性，不產孢。，具有黏性，不產孢。

F-3F-3 絲狀真菌，起先為白色，成熟後菌落中間呈墨綠絲狀真菌，起先為白色，成熟後菌落中間呈墨綠

色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄。色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄。

TF-2TF-2

Trichoderma Trichoderma sp.sp. ，產孢後菌落顏色偏黃綠色，分，產孢後菌落顏色偏黃綠色，分生孢子柄為短瓶狀，孢子是圓形。生孢子柄為短瓶狀，孢子是圓形。

TG-1TG-1

Trichoderma Trichoderma sp. sp. ，產孢後顏色偏綠色，分生孢子，產孢後顏色偏綠色，分生孢子柄為瓶狀，孢子為略尖的圓形。柄為瓶狀，孢子為略尖的圓形。

表三、具拮抗能力菌株之生化測試表三、具拮抗能力菌株之生化測試

B. subtilus F1 G4 G5 P5

30℃ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋50℃ ＋ ＋ ＋ ＋ －mobility ＋ ＋ ＋ ＋ －citrate ＋ － ＋ ＋ ＋nitrate ＋ ＋ ＋ ＋ －catalase ＋ ＋ ＋ ＋ ＋starch ＋ ＋ ＋ ＋ －gelatin ＋ ＋ ＋ ＋ ＋glucose ＋ ＋ ＋ ＋－ －mannitol ＋ － ＋－ ＋－ －

Gram’s Gram’s stainstain

－－ ＋＋

P-5 P-5 F-1 G-4 G-F-1 G-4 G-5 5

coccobacilli (+)coccobacilli (+) catalasecatalase endospore, rod (+)endospore, rod (+)

motility (-)motility (-)

glucose (-)glucose (-)

BacillusBacillus spp. spp.

5 genera and 1 family5 genera and 1 family

F-1 G-4 G-5F-1 G-4 G-5

BacillusBacillus spp. spp.

（－）（－） Grow at 50℃Grow at 50℃（＋）（＋）

23 species23 species 11 species11 species

(-) (-) Mannitol (±) Mannitol (±)

F-1 F-1 G-4 G-5 G-4 G-5

B. pantotenticusB. pantotenticus (±) (±) Glucose (+) Glucose (+)

G-5G-5 G-4 G-4

B. brevisB. brevis B. licheniformisB. licheniformis

結果結果

1.1. 拮抗實驗所得到的有明顯效果者，在拮抗實驗所得到的有明顯效果者，在五十三株不同類型的測試菌中共有 五十三株不同類型的測試菌中共有 10 10 株，其中株，其中 TrichodermaTrichoderma spp. spp. 有兩株，放有兩株，放線菌有三株，其他種類細菌有四株，還線菌有三株，其他種類細菌有四株，還有一株 有一株 PenicilliumPenicillium sp. sp. 。。

2. 2. 經生理生化測試後得知 經生理生化測試後得知 F-1F-1 、、 G-4G-4 、、G-5G-5 屬於 屬於 BacillusBacillus spp. spp. ，而剩下一株 ，而剩下一株 P-P-5 5 經推論認定屬於 經推論認定屬於 Flavorbacterium Flavorbacterium sp.sp. 。。

3. 3. B. subtilusB. subtilus 作為 作為 Gram’s stain Gram’s stain 的正對照，的正對照，經試驗後亦發現有拮抗 經試驗後亦發現有拮抗 R. solani R. solani 的能的能力。力。

4. 4. 三株 三株 BacillusBacillus spp. spp. 經過進一步的測試經過進一步的測試後，判斷 後，判斷 F-1F-1 、、 G-4G-4 、、 G-5G-5 分別為分別為

B.B. pantotenticuspantotenticus 、、 B.B. licheniformis licheniformis 以及以及 B.B. brevisbrevis 。。

5. 5. TrichodermaTrichoderma spp. spp. 八株中僅 八株中僅 TF-2 TF-2 及 及 TG-TG-1 1 有菌絲纏繞現象有菌絲纏繞現象

6. F-3 6. F-3 菌絲起先為白色，成熟後菌落中間菌絲起先為白色，成熟後菌落中間呈墨綠色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄，呈墨綠色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄，故認定為 故認定為 PenicilliumPenicillium sp. sp. 。。

7. 7. 三株放線菌並未再作進一步鑑定。三株放線菌並未再作進一步鑑定。

討論討論1. 1. 多數的細菌菌株在 多數的細菌菌株在 PDAPDA 平板上不生長，平板上不生長，而有拮抗能力的細菌菌株在 而有拮抗能力的細菌菌株在 PDA PDA 上的上的表現也多較 表現也多較 NANA 上差，推斷是因為 上差，推斷是因為 pH pH 值太低，不適合細菌生長。值太低，不適合細菌生長。

2. 2. TrichodermaTrichoderma spp. spp. 和 和 Rhizoctonia Rhizoctonia sp.sp. 之之間的拮抗無法直接從菌落外表看出，必間的拮抗無法直接從菌落外表看出，必須經由鏡檢才能確定是否有菌絲纏繞的須經由鏡檢才能確定是否有菌絲纏繞的現象。現象。

3. F-33. F-3 是真菌 是真菌 PenicilliumPenicillium sp. sp. ，但卻能在添加，但卻能在添加 cyclohcycloheximide eximide 的 的 1/10 TSA 1/10 TSA 上生長，也許是它對 上生長，也許是它對 cyclocycloheximide heximide 具有抗性。具有抗性。

有明顯拮抗效果的菌株

有明顯拮抗效果的菌株

真菌在分離平板上之形態

顯微鏡下 Trichoderma sp. 對 Rhizoctonia sp. 纏繞的情形

Rhizoctonia sp.

Trichoderma sp.

生化測試

參考文獻參考文獻 Hebbar, P., Berge, O., Heulin, T. and Singh, SP. 1991. Bacterial antHebbar, P., Berge, O., Heulin, T. and Singh, SP. 1991. Bacterial ant

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