Upload
aldman-abeln
View
118
Download
9
Embed Size (px)
Citation preview
Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren
Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04
Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren
1. Nukleinsäureextrakion:1) Isolierung2) Reinigung3) Konzentrationsbestimmung
2. Nukleinsäureextrakion genomischer DNA
3. Nukleinsäureextrakion niedermolekularer DNA
4. Analyse:1. Elektrophorese2. Färbung
5. Zusammenfassung
1. Nukleinsäureextraktion
• Aufgereinigte Nukleinsäureextrakte Grundvoraussetzung der Nukleinsäureanalytik– Verunreinigungen: Nukleasen, Nukleinsäuren
anderer Art, Salze, Makromoleküle
• Grundsätzliche Verfahrensschritte:1. Isolierung2. Reinigung3. Konzentrationsbestimmung4. Analyse
• Verfahren abhängig von Species, Nukleinsäuretypus und weiterer Anwendung
1.1. Isolierung
• Isolierung genomischer DNA:
• Isolierung niedermolekularer DNA:
Herkunft Eigenschaften Probleme• Gewebe• Zellkulturen• Organismen
(z.B. Bakterien, Hefe)
•Hochmolekular (>200 kbp)
•Zerstückelung durch Scherkräfte •Verpackung (Histone, u.a.)
Herkunft Eigenschaften Probleme•Bakterien-Plasmide•Hefe-Plasmide•virale DNA•extrachromos. DNA
•Niedermolekular (2-200kbp)•oft zirkulär
•Verunreinigungen
1.1. Isolierung
1. Aufschluss• mit Detergenzien, z.B. SDS• durch Enzyme, z.B. Lysozym bei Bakterien• Mechanischer Aufschluß• Kochen
2. Proteindenaturierung• Proteinase K (Protease)• chemisch: Phenolisierung, SDS, NaOH
1.2. Reinigung
Phenolextraktion:
• Ausschütteln mit Wasser - Phenol:→Phenol denaturiert Proteine, nach
Zentrifugation: wässrige Nukleinsäurelösung – Proteine in Interphase oder Phenolphase
• Ausschütteln mit Wasser - Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol:
→stabilere Phasengrenze, gründlichere Denaturierung
• Phenolisierung wiederholen, bis Interphase sich nicht mehr bildet
Phenolextraktion:
1.2. Reinigung
Gelfiltration• „Molekularsiebeffekt“: große DNA-Moleküle
dringen nicht in Gelporen ein – eluieren schneller als niedermolekulare DNA
→Fraktionierte Sammlung des Eluats
1.2. Reinigung
Ethanolpräzipitation:
• Ausfällung der Nukleinsäure mit Ethanol + monovalente Kationen
→Konzentrierungseffekt, waschen mit 70% Ethanol
1.3. Konzentrationsbestimmung
Photometrische Konzentrationsbestimmung:
• Adsorptionsmaximum doppelsträngiger DNA bei 260 nm durch aromatische Ringe der Basen
→50μg/ml doppelsträngige DNA hat Adsorptionswert von 1 (Vorraussetzung: 1cm Schichtdicke, Quarzküvette)
• Hyperchromie: einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle besitzen höhere Adsorption (1 OD260 entspricht 33 μg/ml RNA bzw. 40 μg/ml einzelsträngiger DNA)
• Konzentrationsbestimmung kurzer Oligonukleotide über Summe der Adsorptionskoeffizienten der einzelnen Basen
• Bestimmung der Reinheit: Messung OD260/OD280-Wert (1,8 = rein)
1.3. Konzentrationsbestimmung
Ethidiumbromidanfärbung:
• bei geringen Nukleinsäuremengen: Bestimmung der Konzentration durch Ethidiumbromidanfärbung – Vergleich mit Verdünnungsreihe
• planare Struktur - interkaliert in die Nukleinsäure durch Interaktion der aromatischen/heteroaromatischen Ringe
2.1 Isolierung genomischer DNA
1. Zellwandaufschluss und Proteinabbau
Organismus Aufschluss Proteinabbau
Eukaryotische Zellkulturen
Natriumdodecylsulfat
(SDS)Proteinase K
Gewebe SDS / Proteinase K Proteinase K
PflanzenSDS oder
N-LaurylsarkosinProteinase K
HefeZymolase oder
LyticaseProteinase K
Bakterien Lysozym Proteinase K
Proteinase K: Serinprotease, schneidet relativ unspezifisch, nicht
hemmbar durch Ionen/EDTA, benötigt SDS
• Molekülgrößen um 80 kbp:– Aufschluss und Proteindenaturierung durch Guanidium-
Hydrochlorid– DNA-Isolation durch Ethanolfällung→ Anwendung: Southern-Blot, PCR
• Molekülgrößen 100-150 kbp:– Phenolextraktion– DNA an Phasengrenze Wasser-Phenol– DNA-Entnahme durch Aufrollen auf steriles Stäbchen → Anwendung: Southern-Blot, Genombanken mit Phage λ
• Molekülgröße > 200 kbp:– Denaturierung von Proteinase K und Protein-DNA-Komplexen
durch Formamid– Dialyse in Collodion-Schläuchen → minimale Scherkräfte→ Anwendung: Cosmidbanken
2.2: Reinigung genomischer DNA
3.1: Isolierung niedermolekularer DNA
1. Anzucht:• Mini- (<10ml), Midi- (<100ml), Maxi- Präparationen
(>100ml Bakterienkultur)• Steigerung der Plasmidausbeute durch selektive
Amplifikation (Translationsinhibitoren)
2. Aufschluss:
Aufschlussart Lyse durch: Hintergrund
alkalische Lyse SDS/NaOH schnell, low copy
Kochlyse Lysozym/100°C
Lithium-Methode LiCl/Triton X-100 <10 kbp
SDS-Lyse Lysozym/SDS >15 kbp
3.1: Isolierung niedermolekularer DNA1. alkalische Lyse: • EDTA, RNase, 95°C, • SDS-Lyse, NaOH-denaturiert DNA• Plasmid-Renaturierung durch Kaliumdodecylsulfat• Abzentrifugation unlöslicher Komponenten• Fällung mit Ethanol oder Isopropanol – waschen→ schnelle Methode – zum Austesten von Klonierungen
2. Kochlyse:• Lysozym, aufkochen, abzentrifugieren denaturierter
Bestandteile• DNA in Lösung, gegebenenfalls Phenolisierung der
DNA gegen Endonuclease – Präzipitation
3.1: Isolierung niedermolekularer DNA
3. Lithium-Methode:• Triton 100X (Detergenz)/LiCl – Auflösung der
Plasmamembran• Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol denaturiert
Proteine/Membranen• Plasmid-DNA bleibt gelöst
4. SDS-Lyse:• Lyse durch SDS, partielle Fällung
chromosomaler DNA durch NaCl• nach Zentrifugation – Plasmide im Überstand→ geeignet für große Plasmide
3.2. Reinigung niedermolekularer DNA
• negativ geladene DNA bindet an positiv geladenes Säulenmaterial (z.B. DEAE)
• degradierte Proteine/RNA binden nicht
• Auswaschen der DNA mit hohen Salzkonzentrationen
1. Reinigung über Anionenaustauschersäulen:
3.2. Reinigung niedermolekularer DNA
2. Dichtegradientenzentrifugation:
• Zentrifugation in CsCl-Gradient + Ethidiumbromid liefert hochreine DNA
• Ethidiumbromid interkaliert stärker in lineare als zirkuläre DNA → Dichteunterschiede (Proteine: geringere Dichte, RNA pelletiert)
• Auswaschung: Ethidiumbromid mit n-Butanol, CsCl durch Dialyse
4. Analyse
• Wie groß sind extrahierte Nukleinsäuren?• In welcher Konformation liegt Nukleinsäure
vor?• Sind eventuell transformierte Elemente
eingebaut worden?
Analyseverfahren:
1. Auftrennung durch Gelelektrophorese
2. Anfärbung
4.1: Analyse - Gelelektrophorese
• Trägermaterial: Agarose oder Polyacrylamid
• Nukleinsäuren negativ geladen (Phosphatgruppen)
• Verhältnis Ladung : Molekulargewicht ist konstant
→Trennung im Gel nach Molekülgrößen
• Ogston-Siebeffekt (globuläre DNA)/ Reptationstheorie (lineare DNA)
4.1: Analyse - Gelelektrophorese
Auftrennung in Agarosegelen:
• Wanderungsgeschw. abh. von Agarosekonz., Spannung, Laufpuffer, interkalierenden Farbstoffen
• denaturierende Bedingungen um Sekundärstrukturbildung zu verhinden
• Trennung linearer, doppelsträngiger DNA: lineare Abh. von log Länge (bp) zu Wanderungsdistanz
• Trennung zirkulärer DNA: superhelical > linear > relaxiert →(Abb)
4.2: Analyse - Anfärbung
Ethidiumbromid:• Anregung unter UV-Licht, Nachweisgrenze: 10-20 ng• ändert Konformation zirkulärer DNA-Moleküle
SYBR Green/TOTO1/YOYO1:• Fluoreszenzfarbstoffe – sensitiver (binden mit höherer
Affinität) und weniger mutagen als Ethidiumbromid
Silberfärbung:• extrem sensitiv: Nachweisgrenze 0,03 ng/mm², nicht
mutagen - Reduktion von Silbernitrat zu reinem Silber • Nachteil: zeitaufwendig, hohe Hintergrundfärbung
5. Zusammenfassung
Nukleinsäureextraktion:
1. Isolierung
2. Reinigung
3. Konzentrationsbestimmung
4. Analyse
• Verfahren abhängig von Größe und Art der Nukleinsäure, Ausgangsorganismus und Verwendungszweck
The End!!