ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI AEROB PENDEGRADASI SELULOSA
DARI SERASAH DAUN RUMPUT GAJAH (Pennisetum purpureum Schaum)
Kurniawan Sarju Ambriyanto Pembimbing : Dr. rer. nat. Ir. Maya
Shovitri, M.Si., Nengah Dwianita Kuswytasari S.Si., M.Si. Jurusan
Biologi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut
Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya 2010
Abstrak Selulosa adalah polimer yang tersusun dari rantai
monomer glukosa melalui ikatan (14). Rumput gajah (Pennisetum
purpureum Schaum) mengandung 22% selulosa. Penelitian ini bertujuan
untuk mengisolasi, purifikasi dan karakterisasi bakteri aerob
pendegradasi serasah selulosa dari daun rumput gajah dengan
mengikuti kunci Determinasi Bergeys Manual. Pada penelitian ini
diperoleh 5 isolat yang cenderung masuk ke 3 Genus yaitu
Flavobacterium (PP 127A dan PP 141-A), Lampropedia (PP 146-A), dan
Halomonas (PP 79-D dan PP 91-A). Dari uji Hidrolysis Capacity (HC)
dan degradsi in vivo (penurunan berat kering) maka diketahui bahwa
isolat PP127-A adalah isolat yang memiliki ratio HC tertinggi dan
penurunsn berat kering terbanyak, kemudian diikuti oleh isolat
bakteri yang lain. Kata kunci : bakteri pendegradasi selulosa,
rumput gajah
PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang Sellulosa adalah polimer
karbohidrat yang terbanyak yang terdapat di alam (Han and Chen,
2007). Diperkirakan 50% dari biomassa adalah selulosa. Dipekirakan
jumlahnya sekitar 50 milyar ton (Claassen, et al. 1999). Polimer
alami seperti selulosa belum dimanfaatkan secara optimal, sedangkan
jumlahnya di alam melimpah.
Rumput gajah (Pennisetum purpureum Schaum) adalah tanaman yang
dapat tumbuh di daerah dengan minimal nutrisi. Rumput gajah
membutuhkan minimal atau tanpa tambahan nutrient. Sehingga tanaman
ini dapat memperbaiki kondisi tanah yang rusak akibat erosi.
Tanaman ini juga dapat hidup pada tanah kritis dimana tanaman lain
relatif tidak dapat tumbuh dengan baik (Sanderson and Paul, 2008).
Produktifitas rumput gajah adalah 40 ton
per hektar berat kering pada daerah beriklim subtropis dan 80
ton per hektar pada daerah beriklim tropis (Woodard and Prine,
1993). Total karbohidrat dan serat kasar termasuk selulosa
jumlahnya masing-masing adalah 30,91% dan 9,09% ( Okaraonye and
Ikewuchi, 2009). Mikroorganisme memiliki peran yang cukup besar
dalam siklus berbagai unsur seperti siklus karbon, nitrogen,
fosfor, belerang dan unsur yang lain. Siklus selulosa merupakan
bagian dari siklus karbon (Schlegel, 1994), karena selulosa adalah
polimer terbanyak di tanaman, maka hidrolisis selulosa adalah hal
yang sangat penting dalam siklus karbon (Zhang and Lynd, 2004).
Selulosa yang dihasilkan oleh tanaman ada yang mengalami degradasi
oleh mikroorganisme menjadi humus dan ada yang didegradasi oleh
hewan. Akhirnya
selulosa diubah menjadi CO2 dan masuk ke jalur fiksasi CO2
(Brock, 1994). Peran mikroorganisme menjadi penting karena dapat
menjaga keseimbangan unsur-unsur yang ada di alam (Schlegel, 1994).
Bakteri selulotik ditemukan di berbagai ekosistem. Contoh bakteri
selulotik adalah Cellumonas sp, celvibrio sp., Microbispora
bispora, Thermomonospora sp., Acentivibrio cellulolyticus,
Bacteriodes cellulosolvent, Bacteriodes succinogenes, Ruminococcus
albus, Ruminococcus flavefaciens dan Clostridium termocellum .
Enzim selulosa dapat dihasilkan oleh berbagai bakteri dan fungi,
aerob dan anerob, mesofil dan termofil. (Bhat and Bhat, 1997).1.2
Rumusan Masalah Rumput gajah sebagain besar dimanfaatkan sebagian
bahan makanan ternak. Rumput gajah mempunyai potensi untuk
digunakan sebagai bahan baku bioenergi. Untuk dapat digunakan
sebagai bahan baku bioenergi, polisakarida yang terdapat pada
rumput gajah harus dihidrolisis. Untuk menghidrolisis polisakarida
diperlukan bantuan mikroorganisme. Masalah yang ingin dikaji dalam
penelitian ini adalah apakah bakteri selulosa dapat diisolasi dan
dipurifikasi dari seresah rumput gajah (Pennisetum purpureum
Schaum)? 1.3 Batasan Masalah
1.5 Manfaat Manfaat dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan
isolat murni dan mengetahui seberapa besar bakteri tersebut dapat
mendegradasi selulosa. TINJAUAN PUSTAKA Tanaman menghasilkan
biomassa melalui proses fotosintesis (Hatami et al., 2008). Bimassa
tersusun secara unik yang membedakan antara satu spesies dengan
spesies yang lain. Secara umum ada tiga kelompok besar penyusun
biomassa pada tanaman yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin.
Ketiga kelompok senyawa ini biasanya ditemukan secara bersama-sama
dengan perbandingan tertentu yang unik yang didasarkan atas
spesies, umur tanaman atau bagian tanaman dan keadaan lingkungan
tempat tanaman itu hidup (Glazer and Nikaido, 2007). Karena
selulosa tidak ditemukan dalam keadaan murni maka komplek yang
antara selulosa dengan hemiselulosa dan lignin disebut dengan
cellulosan. Cellulosan relatif lebih larut dibandingkan dengan
selulosa (Hatami, et al., 2008). Karena dalam keadaan alami tidaka
ada dari tiga senyawa itu yang berada dalam keaadan murni, hal ini
yang menyebabkan proses degradasi biomassa menjadi lambat (Varnaite
et al., 2008) Dinding sel merupakan sel jaringan vaskuler pada
tanaman tingkat tinggi (Glazer and Nikaido, 2007).Dinding sel
tanaman adalah suatu struktur yang tersusun atas selulosa,
hemiselulosa dan subtrat pektin, lignin dan protein struktural
(Hatfield, 1993). Struktur ini berkaitan antara polimer yang satu
dengan polimer yang lain dengan ikatan kovalen cross-link,,
sehingga memberikan kekuatan fisik (Chesson and Forsberg, 1988
dalam Matsui et al, 1988; Glazer and Nikaido, 2007). Selulosa,
hemiselulosa dan lignin yang kemudian membentuk apa yang disebut
dengan lignoselulosa. Berat keringnya mencapai 90% dari sel
tanaman. Hemiselulosa dan lignin saling terikat melalui ikatan
ester pada residu arabinosa dari hemiselulosa dengan p-coumaric
acid atau ferulic acid pada lignin. Ada banyak perbedaan komposisi
secara struktural polisakarida terutama komposisi hemiselulosa
antara monokotil dan dikotil (Chesson and Forsberg, 1988 dalam
H.
Isolasi dan purifikasi dilakukan secara aerobik sehingga bakteri
pendegradasi selulosa yang diharapkan adalah bakteri aerob.
Karakterisasi yang dilakukan sampai tingkat genus dengan
menggunakan Bergeys Manual Of Determinative Bacteriology 9th (Holt
et al., 1994).1.4 Tujuan Penelitian Tujuannya adalah untuk
mengisolasi, purifikasi dan mengkarakterisasi bakteri aerob
pendegradasi sellulosa dari rumput gajah.
Matsui et al, 1988). Arabinosa adalah hemiselulosa yang
terbanyak yang terdapat pada dinding sel monokotil, sedangkan xylan
adalah hemiselulosa yang terbanyak pada dikotil (Miron and
Ben-Ghedalia, 1993 dalam H. Matsui et al, 1998). Degredasi dari
senyawa organik komplek alami (hemiselulisa dan selulosa) adalah
masalah yang sangat penting. Jumlahnya yang berlimpah di alam
mengakibatkan polimer ini menyimpan sebagian besar energi hasil
fotosintesis yang disimpan dalam bentuk ikatan kimia. Ada sekitar
60% energi yang diperoleh dari fotosintesis berada dalam bentuk
senyawa hemiselulosa dan selulosa (Varnaite et al., 2008)
Gambar 2.1 Struktur dinding sel tanaman
(http://www.astbury.leeds.ac.uk/history/astbu ry18.htm) 2.1.1
Sellulosa Selulosa adalah komponen struktural yang banyak ditemukan
pada dinding sel tanaman terrestrial dan laut, juga diproduksi oleh
beberapa tanaman laut dan bakteri. (Linder dan Teeri, 1997).
Sellulosa adalah polisakarida yang mempunyai fungsi sebagai unsur
struktural pada dinding sel tumbuhan tingkat tinggi. Sellulosa
berbentuk serabut, liat, tidak larut di dalam air, dan ditemukan
terutama pada bagian berkayu pada tumbuhan. Sellulosa adalah
polisakarida terbanyak yang ditemukan pada tanaman. tanaman dan
umur tanaman) (Atalla, 1993 dalam Linder dan Teeri, 1997).
Diperkirakan bahwa jumlah karbon terbanyak terdapat dalam bentuk
selulosa dan mayoritas terdapat di lingkungan teresrial (Levin et
al., 2009). Karena itu material
Sellulosa tersusun atas D-glukosa yang terikat melalui ikatan
(14) (gambar 2.1a). Sellulosa adalah polimer yang tidak bercabang
yang terdiri dari 100-14.000 monosakarida atau lebih (Beguin and
Aubert, 1994 : Lehninger, 1982). Ikatan (14) tidak dapat diputuskan
oleh enzim -amilase (Lehninger, 1982). Molekul-molekul sellulosa
seluruhnya berbentuk linier, dimana setiap molekul glukosa sebagai
penyusun polimer dapat berotasi hingga 180 (Brown, 1996) dan
mempunyai kecenderungan kuat membentuk ikatan-ikatan hydrogen intra
dan intermolekul. Ikatan antar fibril ini yuang kemudian membentuk
selulosa crystalline (Brown et al., 1996). Jadi berkas-berkas
molekul sellulosa membentuk agregat bersama-sama dalam bentuk
mikrofibril. Mikrofibril mimiliki dimensi antara 3-4 nm pada
tanaman tingkat tinggi hingga 20 nm pada Valonia macrophysa, dimana
setiap mikrofibril terdiri dari beberapa rantai selulosa.
Mikrofibril ini memiliki oritentasi yang sangat besar untuk
tersusun secara pararel (Beguin and Aubert, 1994). Mikrofibril ini
pada tempat-tempat tertentu memiliki struktur yang teratur
(crystalline) (gambar 2.1b) dan pada tempat-tempat tertentu
memiliki struktur yang kurang teratur (amorphous) (gambar 2.1b).
Struktur amorphous terjadi karena prose kristalisasi yang tidak
berlangsung sempurna pada semua mikrofibril yang terbentuk (Hon,
1994 dalam Linder dan Teeri, 1997). Mikrofibril membentuk
fibril-fibril dan akhirnya serat-serat sellulosa. Struktur
sellulosa yang berserat dan terdapat ikatanikatan hidrogen yang
kuat mengakibatkan dapat tahan terhadap tarikan tinggi (Sjostrom,
1995 ; Beguin and Aubert, 1994). Jumlah selulosa amorphous dan
crystalline di alam sama banyak. Selulosa terakumulasi di alam
karena relatif resisten di dalam proses degradasi (proses degrdasi
di alam berjalan lambat). Dimensi serat selulosa dan proporsi dari
bagian kristalin dan amorphous sangat tergantung kepada keadaannya
alami (jenis selulotik berbeda menunjukkan property yang berbeda
tergantung kepada sumber yang digunakan dan metode ekstrasi yang
dilakukan, dan jumlah subtrat berbeda yang digunakan dan jenis
enzim selulotik yang digunakan (Linder dan Teeri, 1997).
Bentuk selulosa kristalin yang sering ditemukan di alam adalah
selulosa tipe I, dimana termasuk metastabil (i.e. it is not the
most thermodynamically favorable form), dimana secara alami tidak
dapat diubah menjadi selulosa kristalin tipe yang lain. Selulosa
tipe I dapat diubah menjadi selulosa tipe II dengan treatment
dengan menggunakan alkali (Beguin and Aubert, 1994). Selulosa
kristalin tipe II adalah selulosa yang paling stabil yang
diketahui. Selulosa tipe I mempunyai ikatan glukosida paralel dan
mempunyai ikatan hidrogen intramolekul yang kuat. Di alam ada dua
tipe selulosa tipe I sebagai selulosa kristalin
suballomorphs yaitu tipe I dan I. Perbedaan atara tipe I dan I
terletak pada perbedaan ikatan hidrogen antar rantai selulosa,
proporsi ikatan hidrogen dan tergantung kepada sumbernya di alam
(Beguin and Aubert, 1994).Selulosa tipe II jarang ditemukan di
alam, secara umum dapat dikatakan bahwa sebagai hasil represifitasi
setelah proses swelling dan pelarutan kembali selulosa tipe I.
selain selulosa tipe I dan II juga terdapat selulosa tipe III dan
IV yang sangat jarang ditemukan di alam (Brown et al, 1996). Selain
tanaman bakteri juga menghasilkan selulosa. menjadi energi dapat
dikembangkan menjadi sektor komersial (Walker and Wilson, 1991).
Secara umum biomassa berbasiskan selulosa yang digunakan dalam
produksi etanol dapat dibagi menjadi enam kelompok yaitu : 1.
Residu atau limbah pertanian. Contoh: cane bagase, corn stover,
wheat straw, rice straw, rice hulls, barley straw, sweet sorgum
bagase, olive stone and pulp. 2. Kayu keras. Contohnya: aspen dan
poplar. 3. Kayu lunak. Contohnya: pine dan spruce. 4. Limbah
selulosa. Contohnya: kertas bekas, koran. 5. Biomassa herba.
Contohnya: alfalfa hay, switchgrass, reed canary grass, coastal
Bermuda grass, thimoty grass. 6. Municipal solid waste (MSM) (Sun
and Cheng, 2002). Konversi selulosa menjadi glukosa relatif
membutuhkan biaya yang lebih besar dibandingkan dengan konversi
pati. Hal ini disebatkan karena struktur sekulosa lebih komplek
dibadingkan dengan struktur pati, sehingga dibutuhkan beberapa
enzim untuk dapat mendegradasi selulosa. Selain itu enzim
pendegradasi selulosa membutuhkan membutuhkan medium yang
mengandung selulosa murni untuk mengoktimalkan produksi enzim.
Selain itu diketahui bahwa selulosa memiliki struktur yang beragam
baik dilihat dari tingkat struktural atau supramelekulnya. Untuk
meminimalkan biaya produksi diperlukan pengembangan metode konversi
sellulosa menjadi glukosa.
Gambar (2.2a) struktur serat selulosa, (2.2b) struktur selulosa
teratur (kristalin) dan kurang teratur (amorphous) (Beguin and
Aubert, 1994). Berdasarkan pada sumber alami selulosa dan
pretreatment yang dilakukan maka ratio kristalisasi dari selulosa
berkisar antara 0% pada selulosa amorphous hingga mendekati 100%
pada selulosa yang diisolasi dari Valonia macrophysa (Beguin and
Aubert, 1994). Sellulosa adalah polimer karbohidrat yang terbanyak
yang terdapat di alam (Han and Chen, 2007). Diperkirakan 50% dari
biomassa adalah selulosa. Diperkirakan jumlahnya sekitar 50 milyar
ton (Claassen, et al. 1999). Dari limbah padat yang dihasilkan
dunia 40 % (w/w) adalah salah satu sumber sellulosa. Penelitian
difokuskan bagaimana memanfaatkan limbah organik (terutama
sellulosa) menjadi energi. Penelitian-penelitian yang dilakukan di
seluruh dunia tentang konversi selulosa
Salah satu bidang yang sering dijadikan studi dalam konversi
sellulosa adalah mencari mikroorganisme yang dapat menghasilkan
enzim yang lebih aktif dan efisien dalam mengkonversi selulosa
(Walker and Wilson, 1991). Hal ini disebabkan karena adanya
keanekaragaman yang besar pada selulosa yang terdapat di alam,
sehingga ditemukan banyak enzim selulase yang ditemukan. Hal ini
berkaitan dengan kecocokan antara struktur substrat dengan struktur
enzim (Beguin and Aubert, 1994). Setiap molekul selulosa mengandung
tiga tipe unit glukosa yaitu glukosa dengan ujung yang tereduksi
(reducing end), glukosa yang ujungnya tidak tereduksi (nonreducing
end) dan anhydroglucopyranose.. Unit monomer anhydroglucopyranose
adalah molekul selulosa yang mengandung 3 gugus hidroksil primer
dan dua gugus hidroksil sekunder. Monomer nonreducing end
mengandung empat gugus hidroksil dan monomer reducing end
mengandung gugus hemiacetal pada penambahan tiga gugus hidriksil
(Palonen, 2004). 2.1.2 Lignin Lignin adalah material organik
penyusun matrik dinding sel tanaman tingkat tinggi (Spermatophyta),
predominan pada jaringan pengangkut (Glazer and Nikaido, 2007).
Lignin adalah termasuk penyusun sebagian besar biomassa atau yang
lebih dikenal dengan lignoselulosa. Lignin adalah polimer aromatik
terbanyak di bumi dan merupakan penyebab utama degradasi
lignoselulosa menjadi lambat (Ahmed et al., 2001). Struktur lignin
tidak seragam, lignin juga terdapat bagian yang crystalline dan
amorphous. Lignin pada tanaman tingkat tinggi tidak berbentuk
crystalline (Palonen, 2004). Struktur kimia pada lignin yang
terdapat di alam dapat berubah pada kondisi suhu tinggi dan asam,
seperti saat dilakukan perlakuan dengan menggunakan uap air. Pada
saat dilakukan perlakuan dengan menggunakan suhu di atas 200C, maka
lignin akan mengalami degradasi menjadi senyawa partikel dengan
ukuran yang kecil dan lepasnya ikatan dengan selulosa (Tanahashi et
al., 1983 dalam Palonen, 2004).
Untuk mempermudah dalam mendegradasi lignoselulosa maka
diperlukan delignifikasi. Delegnifikasi adalah suatu proses dalam
menghilangkan lignin yang dilakukan dengan menggunakan bahan kimia
(Ahmed et al., 2001). Namun kerena sudah ditemukan mikroorganisme
yang dapat mendegradasi lignin dengan cepat dan telah disadari
bahwa menggunakan bahan kimia dalam proses penghilangan lignin akan
mengakibatkan limbah yang sangat berbahaya bagi lingkungan (Glazer
and Nikaido, 2007). Lignin tersusun oleh unit yang disebut dengan
lignol, yang terdiri dari aryl propanol yang tersusun pada senyawa
aromatik dan tiga karbon rantai karbon. Lignol secara struktural
sangat berhubungan dengan asam amino phenylalanine dan tyrosin.
Lignol adalah derivat dari asam amino phenylalanine dan tyrosin.
Lignin lebih bersifat hidrofobik dibandingkan dengan selulosa dan
hemiselulosa (Ahmed et al., 2001). 2.1.3 Hemiselulosa Hemiselulosa
secara umum diklasifikasikan berdasarkan residu gula pada backbone.
Hemiselulosa dapat dikelompokkan menjadi xylan, mannans, galactans
dan glucans. Hemiselulosa seringkali dilaporkan memiliki hubungan
secara kimia atau cross-linked dengan polisakarida , protein atau
lignin. Xylan memiliki merupakan senyawa yang mempunyai hubungan
terbanyak dengan polisakarida yang lain. Hemiselulosa lebih larut
dibandingkan dengan selulosa, dapat diisolasi dengan melakukan
ekstraksi dengan menggunakan alkali (Palonen, 2004), Softwood
hemisellulosa mengandung glucomannan, galactoglucomannan,
glucuronoxylan, dan arabinoglucunoxylan sedangkan pada hardwood
hemiselulosa sebagian besar merupakan glucuronoxylan. Gambar di
bawah ini adalah menjelaskan struktur dari hemiselulosa (Glazer and
Nikaido, 2007). Hemiselulosa adalah material yang berbeda dengan
selulosa. Hemiselulosa adalah molekul bercabang yang hanya memiliki
150-200 monomer (Mulcahy, 1996). Hemiselulosa adalah polimer yang
mirip dengan selulosa. Backbone (rangka utama) dari hemiselulosa
adalah terbentuk
dari ikatan 1,4-D-pyranosyl dari unit penyususnnya. Jadi
hemiselulosa secara struktural homologenus dengan selulosa. Dimana
selulosa adalah polimer homolinear dengan sedikit modifikasi antara
molekul yang satu dengan yang lain. Hemiselulosa mempunyai banyak
cabang, secara umum dapat dikatakan bahwa hemiseluloasa merupakan
polimer noncrystalline heteropolysaccharides. Komponen yang
menyusun hemiselulosa adalah gula pentosa ( D-xylose, L-arabinose
), gula hekosa ( Dgalactose, L-galactose, D-mannose, Lrhamnose,
L-fucose ) dan asam uronik (Lglucomonic acid ) (Glazer and Nikaido,
2007). Hemiselulosa adalah polimer polisakarida yang komplek,
komposisi dan frekuensinya tergantung kepada jenis jaringan
tanaman, jenis spesies dan tahapan pertumbuhan pada tanaman.
Hemiselulosa juga merupakan penyusun utama dinding sel tanaman.
Hemiselulosa ditemukan dengan proporsi yang berbeda-beda pada
lemela tengah, dan dinding sel sekunder tanaman. Hemiselulosa tidak
hanya ditemukan berupa xylan, namun juga ditemukan dalam jumlah
yang banyak berupa glucomannans, galactomannans, arabinogalactans
dan senyawa yang lain (Mulcahy, 1996). Kerena secara struktural
hemiselulosa dan selulosa homologenus ditambah dengan adanya
kemiripan nama, maka seringkali hemiselulosa diangggap sebagai
produk intermediet dalam biosintesis dari selulosa. Namun sekarang
jalur biosintesis dari hemiselulosa telah diketahui. Dan diketahui
bahwa jalur biosintesis hemiselulosa berbeda dengan selulosa. Dan
juga telah diketahui bahwa penyusun hemiselulosa berbeda dengan
selulosa (Mulcahy, 1996). 2.2 Metode Menghitung Kadar Selulosa
Berikut ini adalah metode untuk mengukur kandungan selulosa dan
lignin berdasarkan metode Chesson yang dikemukakan oleh Datta
(1981): 1. Satu g sampel kering (berat a) ditambahkan 150 mL H2O
atau alkoholbenzene dan direfluk pada suhu 100C dengan water bath
selama 1 jam. 2. Hasilnya disaring, residu dicuci dengan air panas
300 mL.
3. Residu kemudian dikeringkan dengan oven sampai beratnya
konstan dan kemudian ditimbang (berat b). 4. Residu ditambah 150 mL
H2SO4 1 N, kemudian direfluk dengan water bath selama 1 jam pada
suhu 100C. 5. Hasilnya disaring dan dicuci sampai netral (300 mL)
dan residunya dikeringkan hingga beratnya konstan. Berat ditimbang
(berat c). 6. Residu kering ditambahkan 100 mL H2SO4 72% dan
direndam pada suhu kamar selama 4 jam. 7. Ditambahkan 150 mL H2SO4
1 N dan direfluk pada suhu 100oC dengan water bath selama 1 jam
pada pendingin balik. 8. Residu disaring dan dicuci dengan H2O
sampai netral (400 mL). 9. Residu kemudian dipanaskan dengan oven
dengan suhu 105oC sampai beratnya konstant dan ditimbang (berat d).
10. Selanjutnya residu diabukan dan ditimbang (berat e) Perhitungan
kadar selulosa dan kadar lignin menggunakan rumus berikut ini:
Kadar selulosa = (c-d)/a x 100% Kadar lignin = (d-e)/a x 100%
http://www.biomassmagazine.com/images/up load/20080403103622.jpg
2.3 Degradasi Biomassa Dalam mendegradasi biomassa melalui
mekanisme biologis, dalam hal ini konteknya adalah mendegradasi
biomassa dengan bantuan mikroorganisme. Degradasi melalui enzimatis
menjadi sesuatu yang sangat penting. Enzim menjadi alat yang sangat
penting dalam proses degradasi, hal ini terjadi karena enzim dapat
mengkatalisis reaksi pada kondisi yang normal (Ahmed et al., 2001).
Laju degradasi juga dipengaruhi oleh keadaan lingkungan pada saat
proses degradasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi antara lain
adalah kandungan zat yang dibutuhkan oleh mikroorganisme terutama
yang esensial yang digunakan baik pada saat pertumbuhan
mikroorganisme atau pembentukan enzim. Faktor lain yang
mempengaruhi adalah pH dan suhu optimum yang mempengaruhi
pertumbuhan mikroorganisme dan aktifitas enzim selulase. Adanya
produk metabolit baik primer atau
sekunder yang dapat mempengaruhi kerja enzim dalam mendegradasi
selulosa. Adanya selobiosa dalam jumlah banyak juga mempengruhi
kerja enzim. Hal ini karena selobiosa adalah inhibitor terkuat
dalam proses degradasi (Ahmed et al., 2001). 2.3.1 Degradasi
Selulosa Pada degradasi material lignoselulosa dengan kadar
selulosa yang tinggi sehingga bisa dikatakan selulosa murni
(dihasilkan oleh tanaman kapuk), dengan kadar lignin yang sangat
sedikit saja proses degradasi tidak dapat dilakukan dengan
memasukkan selulosa ke dalam sel mikroorganisme. Hal ini terjadi
kerena ukuran selulosa yang cukup besar. Sehingga strategi yang
dilakukan oleh mikroorganisme adalah dengan mengsekresikan enzim
selulase. Hal ini dapat dilihat ketika melakukan isolasi protein
yang terdapat pada tanah dan proses pengomposan, enzim selulase
adalah komponen utama dari protein yang ditemukan (Ahmed et al.,
2001). Untuk mengopimalkan metabolisme bakteri pendegradasi
selulosa pada keadaan minimal nutrient, setiap bakteri mempunyai
strategi yang berbeda-beda tergantung pada karakteristik bakteri
tersebut (Jescu, 1995). Besar hasil akhir yang diperoleh pada
proses degradasi tergantung kepada beberapa faktor yaitu pH, akses
terhadap karbon (kecocokan konformasi enzim dengan subtrat), reaksi
redok yang terjadi, konsentrasi produk. Dan untuk mengoktimalkan
hasil yang diperoleh maka diperlukan pengetahun tentang genetika
mikroorganisme yang digunakan, enzimatik, dan termodinamika dalam
mekanisme aliran karbon (carbon flow). Detail pengetahuan mengenai
hubungan antara genome content, gen dan produk ekpresi gen, pathway
utilization, dan hasil akhir yang diperoleh akan sangat penting
untuk diketahui dalam degradasi selulosa (Levin et al, 2009).
Karena selulosa di alam yang bersifat berukuran besar dan tidak
larut maka enzim selulase memerlukan perlakuan yang khusus dalam
mendegradsi selulosa. Karena substrat yang tidak dapat terdifusi ke
dalam enzim, maka enzim selulase harus menjadi lebih aktif dan
mendefusi ke dalam substrat (Mattinen, 1998).
Bakteri selulotik dapat bekerja pada variasi keadaan lingkungan
yang berbedabeda dalam mendegradasi seresah daun pada tanah (Beguin
and Aubert, 1994; Denman et al., 1996 dalam Linder dan Teeri,
1997). Mikroba ini dapat mendegradasi melekul komplek, keadaan
dimana subtrat tidak larut dalam air dengan menggunakan berbagai
enzim melalui berbagai cara didalam memutuskan bagian yang berbeda
di dalam substrat. Efisiensi degradasi kayu dengan menggunakan
mikorganisme sepeti fungi filamentus, merupakan tipe yang
mengsekresikan dan mengsinergikan aksi enzim selulase dimana
bakteri menggunakan komplek enzim (cellulosome) yang bekerja pada
permukaan substrat (Tomme et al., 1995; Bayer et al., 1996 dalam
Linder dan Teeri, 1997). Hal ini juga terjadi pada fungi anaerob
dimana memiliki komplek seperti cellulosome dengan ukuran yang
lebih besar (Fanutti et al., 1995; Denman et al., 1996; Dijkerman
et al., 1996 dalam Linder dan Teeri, 1997). Kedua tipe enzim dapat
melepaskan ikatan -1,4-glukosida dengan menggunakan enzim endo atau
exoglukonase yang spesifik yang didasarkan atas topologi dari sisi
aktif. Keberadaan nitrogen sangat mempengaruhi laju degradasi yang
terjadi. Umumnya degradasi selulosa terjadi pada pH normal (Hatami
et al., 2008). Pada degradasi selulosa yang dilakukan oleh fungi,
fungi melepaskan sistem enzim selulase yang terdiri dari beberapa
exo- dan endoselulase, dan satu atau dua -glukosidase. Banyaknya
komponen sistem enzim yang dilepaskan tergantung kepada fungi itu
sendiri. Hal ini seperti yang ditunjukkan oleh Trichoderma reesei
yang melepaskan enzim komplit saat mendegradasi crystalline
selulosa. Sistem enzim selulotik mengandung dua cellobiohydrolases
(CBH I dan CBH II), setidaknya empat endoglukanase (EG I, EG II, EG
III dan EG IV) dan satu -glukosidase (Mattinen, 1998). Sistem enzim
selulase adalah lebih sulit dibandingkan dengan sistem enzim
selulase fungi dan hanya sedikit yang baru diketahui dari sistem
enzim selulase bakteri. Enzim selulase yang dihasilkan oleh
Cellulomonas fimi adalah yang paling sering dilakukan studi.
Beberapa bekteri terutama bakteri anaerob menghasilkan komplek
multi
enzim yang berukuran besar yang dikenal dengan cellulosome.
Contoh bakteri yang memiliki cellulosome adalah Clostridium
thermocellum (Mattinen, 1998). Pada degradasi selulosa murni laju
degradasi terjadi penurunan yang sangat besar. Penurunan ini
disebabkan kerena adanya inhibitor yang sangat banyak jika
dibandingkan pada degradasi lignoselulosa. Selobiosa adalah
inhibitor utama dalam degradasi selulosa, oleh karena itu kehadiran
enzim -glukosidase menjadi sangat penting dalam degradasi selulosa.
Hal ini karena setelah selobiosa diubah menjadi glulosa Tabel 2.1
Struktural selulosa yang berpotensi menghambat pada hidrolisis dari
serat selulosa pada beberapa level struktural (Mansfields et al.,
1999 dalam Palonen, 2004) Level struktur Faktor substrat Degree of
polymerization (DP) Microfibril Crystallinity Cellulose lattice
structure (I, II, III, atau IV) Komposisi struktural (kandungan
lignin, hemiselulosa dan Fibril persebarannya) Particle size
(fibril dimension ) Luas permukaan Fiber Degree of fibrer swelling
Struktur pori dan distribusi Akses enzim selulase terhadap selulosa
pada lignoselulosa menjadi yang penting dalam degradasi selulosa.
Selulosa memiliki akses baik eksternal (dipengaruhi oleh bentuk dan
ukuran paticle) dan internal (struktur kapiler pada fibers). Pada
lignoselulosa yang tidak dilakukan pretreatment hanya sedikit pori
yang dapat digunakan sebagai akses enzim selulase terhadap sustrat
(Palonen, 2004). Pada pretreatment yang dilakuan untuk
menghilangkan hemiselulosa menunjukan terjadi peningkatan pori dan
terdapat permukaan spesifik. Hasil hidrolisis berkaitan dengan
volume pori yang digunakan dalam akses enzim selulase (Grethlein,
1985 dalam Palonen, 2004). Pada beberapa penelitian diketahui bahwa
pengeringan lignoselulosa menurunkan
maka laju degradasi menjadi jauh lebih cepat. Hasil akhir pada
degradasi lignoselulosa tergantung kepada tipe bahan mentah yang
digunakan. Pada berbagai penelitian yang dilakukan secra intensif
dilakukan maka diketahui bahwa tidak ada faktor yang paling
signifikan pada laju hidrolisis pada material lignoselulosa yang
berbeda. Secara umum dapat dikatakan bahwa faktor pembatas
degradasi selulosa dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu struktur
dari substrat (Tabel 2.1), dan mekanisme dan interkasi enzim
selulase. kapileritas sel dan menurunkan pori sehingga menurunkan
efektifitas enzim selulase (Esteghlalian et al., 2001 dalam
Palonen, 2004). Kandungan lignin dalam lignoselulosa dan
persebarannya mempengaruhi degradasi selulosa (Palonen, 2004)
Kemampuan degradasi selulosa oleh bakteri berbeda dengan kemampuan
degradasi fungi dalam mendegradasi selulosa. Bakteri memiliki
kecenderungan untuk mendegradasi selulosa crystalline dibandingkan
dengan sisi a amorphous, dan kemampuan ini dimiliki oleh hampir
semua bakteri pendegradasi selulosa baik secara aerob atau anaerob.
Namun karena selulosa crystalline tidak dapat didegradasi oleh
enzim selulase tunggal karena sifat selulosa crystalline yang
rigrid, maka diduga degradasi selulosa crystalline dilakukan lebih
dari satu enzim (Mulcahy, 1996). Sedangkan fungi memiliki
kecenderungan untuk mendegrdasi selulosa pada sisi amorphous
dibandingkan dengan sisi crystalline. Ektrasellular endo- dan
exoglucanase diproduksi oleh berbagai bakteri. Secara umum struktur
enzim selulase bakteri memiliki kesamaaan dengan yang dhasilkan
fungi. Bakteri mensekresikan enzim selulase sebagai enzim
ekstraselluler yang bersifat soluble atau pada keadaan anaerobik
membentuk komplek yang disebut dengan cellulosome yang menempel
dengan permukaan sel bakteri . Cellulosome nampaknya mampu
mendegradasi tidak hanya selulosa saja, namun semua jenis
polisakarida termasuk berbagai jenis hemisellulosa seperti
xylanases, mannanases, arabinofuranosides, and pectin lyases
(Glazer and Nikaido, 2007).
2.3.2 Degradasi Lignin Bakteri hanya dapat sedikit mengdegradasi
lignin saat terdapat oksigen dan tidak ada satu pun bakteri yang
dapat mendegradasi lignin dalam keadaan anaerob (Glazer and
Nikaido, 2007). Degradasi lignin memerlukan adanya oksigen.
Degradasi lignin adalah proses yang sederhana namun tidak terjadi
pada pada beberapa lingkungan alami. Sebagai contoh bahwa tanaman
yang telah mati ratusan tahun yang lalu masih sering ditemukan
dalam timbunan tanah. Hal ini utamanya terjadi karena tidak
terdapat oksigen. Pada lingkungan dengan keadaan asam maka proses
degradasi tidak terjadi. Belum diketahui bahwa jika pH lingkungan
sedikit asam dan keaadaannya anaerobik apakah proses degradasi akan
terjadi, namun diduga bahwa degradasi jika terjadi akan berlangsung
sangat lama (Kirk and Farrell, 1987 dalam Ahamed et al., 2001).
Degradasi lignin mungkin saja terjadi dan dilakukan oleh bakteri,
namun tidak ada satupun yang dapat diisolasi dan ditumbuhkan pada
laboratorium. Banyak filamentous bakteri (Actinomycetes) dapat
mendegradasi lignin. Actinomycetes tidak dapat mengubah lignin
menjadi CO2, tidak dapat melakukan mineralisasi terhadap lignin.
Hanya Basidiomycetes (white rot fungi) yang dapat melakukan
meniralisasi terhadap lignin. Pada saat terjadi mineralisasi
terhadap lignin yang terdapat pada kayu atau daun maka terjadi
bleaching (perubahan warna menjadi putih pucat) (Ahamed et al.,
2001). Degradasi lignin hanya dapat dilakukan oleh white rot
fungus. Kemampuan fungi ini untuk mendegradasi lignin adalah cukup
besar. Hal ini dapat dilihat pada kemampuan Phanerochaete
chrysospirum hingga 3 gram lignin setiap hari. Degradasi ini
terjadi optimum pada suhu 40C dengan triggernya adalah pembatasan
nitrogen. Proses degradasi ini dilakukan dengan melepaskan lignin
peroxidase. Selain itu P. chrysosporium juga dapat mendegradasi
lignin dengan melepaskan manganesedependent peroxidase. Sampai saat
ini dapat diisolasi 10 isoenzim dari lignin peroxidase dan lima
manganese-dependent peroxidase. Jadi ini bisa memberikan bukti
bahwa ada keragaman biokimia yang memungkinkan
adanya keberagaman kondisi optimum tumbuh dengan berbagai
kondisi lingkungan seperti temperature, pH, dan kekuatan ionik.
Enzim ini mirip tetapi tidak identik dimana tiap enzim dapat
mendegradasi suatu struktur polimer yang berbeda dalam satu
tanaman, dimana hal ini tergantung kepada struktur kimia, keadaan
fisik atau akses (Glazer and Nikaido, 2007). Degradasi lignin
memerlukan hidrogenperoksidase. Hidrogen peroksidase diproduksi
oleh white rot fungus dan disekresikan untuk mengaktifkan lignin
peroxidase dan manganese-dependent peroxidase dalam proses
mendegradasi lignin. Pada proses degradasi melalui lignin
peroksidase diperlukan kondisi asam untuk menciptakan kondisi yang
optimum pada proses degradasi dengan menggunakan reaksi oksidasi.
Lignin peroksidase mengkatalisis pembukaan ikatan pada sisi
arylpropane, ikatan pada ether, pembukaan ikatan siklik aromatik
dan hydroxylation. Kesuksesan degradasi lignin tergantung kepada
penyerangan komponen nonfenol dan fenollignin. Ektraselluler Mn
(II)-dependent peroxidase dalam mengoksidasi komponen fenol lignin.
Fenol lignin tidak dapat didegradsi oleh lignin peroxsidase,
seperti veratryl alcohol, atau model nonfenol yang merupakan
subtruktur dari lignin. Mn (II)dependent peroxidase dan H2O2
diperlukan untuk mengaktifkan isoenzim yang digunakan dalam
degradasi lignin. Quinon merupakan produk yang dihasilkan dari
proses degradasi melalui peroksidase. Sehingga diperlukan adanya
quinon reduktase baik intraselluler dan extraselluler.
Ektraselluler cellobiosa-quinon oksidureduktase hanya akan aktif
jika terdapat selulosa. Enzim ini menggunakan cellobiosa sebagai
donor hydrogen untuk mereduksi quinon menjadi hidroquinon.
Intraselluler quinon reduktase menggunakan NAD(P)H sebagai
kofaktor. Fungi dapat menggunakan hidroquinon dalam metabolismenya.
Jadi dapat dikatakan bahwa fungsi dari quinon reduktase adalah
mengubah produk dari degradasi lignin sehingga dapat digunakan
dalam repolimerasi.Berikut merupakan skema proses degradasi lignin
(Glazer and Nikaido, 2007).
Lignifikasi dan struktur selulosa yang tersusun dengan baik pada
polisakarida, termasuk kristalisasi pada selulosa yang terdapat
pada dinding sel tanaman mengakibatkan proses degradassi menjadi
terhambat (Chesson and Fosberg, 1988 dalam Matsui et al., 1998).
Lignifikasi adalah proses yang mana penambahan melekul lignin
memenuhi ruang kosong pada fibril selulosa dan hemiselulosa serta
membentuk ikatan diantaranya pada dinding sel (Glazer and Nikaido,
2007). Pada penelitian yang dilakukan oleh Benoit et al., (1992),
diketahui bahwa bakteri yang mampu mendegradasi berbagai macam
jenis selulosa murni (sumber selulosa) termasuk selulosa dengan
tingkat kristalisasi yang tinggi (high cristalin) hingga 60-80%
hanya dapat mendegradasi lignoselulosa seperti koran sebesar 15%
dan majalah sebesar 35 %. Pada penelitian yang dilakukan oleh
Sharma and Hobson (1986) dalam Cailliez et al., (1993) diketahui
bahwa proses degradasi lignoselulosa lebih tergantung kepada
kandungan lignin yang terdapat pada material selulotik tersebut
dibandingkan dengan kristalitas suatu material selulotik. Softwood
mengandung lignin yang lebih banyak dibandingkan dengan hardwood.
Hemiselulosa tertinggi terdapat pada rumput-rumputan. Perbandingan
kandungan dari selulosa, lignin dan hemiselulosa pada softwood,
hardwood dan rumput terdapat pada Tabel 2.2. Karena kadar
hemiselulosa yang besar maka proses degradasi selulosa pada
rumput-rumputan relatif menjadi lebih sulit.Tabel 2.2 Persentase
perbandingan lignoselulosa (Glazer and Nikaido, 2007)
Jenis tanaman Rumputrumputan Softwood Hardwood
Lignin Selulosa Hemiselulosa 10-30 25-35 18-25 25-40 45-50 45-55
25-50 25-35 24-50
2.3.3 Degradasi Hemiselulosa Seperti selulosa, hemiselulosa juga
merupaka bagian dari penyusun sebagian besar biomassa dan juga
diperlukan enzim hidrolitik untuk memutuskan ikatan. Namun
diperlukan 24 enzim untuk mendegradasi seluruh hemiselulosa
(Srinivasan, 1992). Namun enzim yang paling dikenal adalah
xylanase yang terdiri dari endoxylanases (1,4--D-xylan
xylanohydrolases, EC 3.2.1.8) dan xylosidases yang merupakan enzim
pendegradasi xylan (senyawa hemiselulosa yang terbanyak) (Moracci
et al., 2000). Selain enzim pendegradasi xylan adalah enzim yang
juga penting dalam degradasi hemiselulosa adalah endomannanases
(1,4--D-mannan mannanohydrolase, EC 3.2.1.78) yang mendegradasi
glucomannan. Enzim yang digunakan dalam mendegradasi oligomer
berantai pendek yang dihasilkan oleh enzim endo pada degradasi
hemiselulosa adalah xylosidase (1,4--D-xyloside xylohydrolase EC
3.2.1.37), -mannoside (1,4--Dmanoside mannohydrolase EC 3.1.1.25)
dan -glukosidase (EC 3.2.21), enzim ini akan memutuskan ikatan
oligosakarida pada sisi pada xylan dan mannans. Sedangkan untuk
ikatan pada sisi oligomer maka ikatan akan diputus dengan
menggunakn enzim diantaranya adalah -glucoronidase (EC 3.2.1.139),
-arabinosidase (-Larabinofuranoside arabinofuranohydrolase, EC
3.2.1.55) dan -D-galactosidase (-Dgalactoside galactohydrolase, EC
3.2.1.22). Gugus acetyl pada hemiselulase akan dipindahkan melalui
enzim esterase (EC 3.1.1.72) (Palonen, 2004).. Degradasi
hemiselulosa adalah proses yang komplek karena tipe enzim yang
dihasilkan adalah multiple isoenzymes (enzim yang mempunyai fungsi
katalitik yang sama namun memiliki lebih dari satu karakteristik
physical yang membendakan antara komponen yang satu dengan komponen
yang lain seperti pH optimum), beberapa mempunyai Cellulose Binding
Domain (CBD), beberapa menghasilkan multi domain protein yang salah
satu domainya dapat mendegradasi selulosa. Produksi enzim xylanase
lebih dipengaruhi oleh adanya selulosa dibandingkan dengan xylan.
Penjelasan mengenai hal ini belum diketahui sampai saat ini (Ahmed
et al., 2001). Dalam menghidrolisis hemiselulosa diperlukan sinergi
dari banyak untuk memutuskan ikatan glikosida pada poly- atau
oligosakarida. Tiap-tiap enzim akan bekerja secara spesifik
memustuskan ikatan kimia dalam mendegradasi hemiselulosa Cazemier
et al., (1997) dalam Zverlova et al. (2003)
enzim pendegradasi lignin tidak ditemukan dalam keadaan anaerob
Guo et al., (2001) dalam Zverlova et al. (2003). 2.4 Derivat
Selulosa Selulosa memiliki banyak derivat yang dimanfaatkan di
berbagai bidang kehidupan. Derivat selulosa dilakukan dengan
melakukan modifikasi selulosa murni yang diisolasi. Derivat selulos
yang sering digunakan dalam isolasi bakteri pendegradasi selulosa
adalah Hydroxyethylcellulose (HE cellulose) dan
Carboxymethylcellulose (CMC) (Klemm et al., 1998).
Carboxymethylation polisakarida adalah suatu bidang penelitian yang
diminati dan banyak dilakukan. Hal ini kerena metode ini adalah
metode yang mudah dilakukan dan hasil yang diperoleh banyak
digunakan untuk berbagai bidang kehidupan. Secara umum dapat
dikatakan bahwa metode yang
dilakukan adalah dengan menggunakan larutan alkali hydroxide
(umunya adalah NaCl) pada polisakarida sehingga ada penggantian
gugus hidroksi yang terdapat pada polisarida. Jadi
Carboxymethylation tidak terjadi hanya pada selulosa dan pati namun
pada polisakarida yang lain (Heinze, 2005). Carboxymethylcellulose
(CMC) pertama kali ditemukan pada tahun 1918 dan diproduksi secara
masal pertama kali pada awal 1920 oleh IG Farbenindustrie AG di
Jerman. Namun hingga sekarang peningkatan teknologi yang digunakan
dalam produksi masih diperbaiki, peningkatan kualitas produk, dan
efisiensi dalam melakukan produksi (Heinze, 2005). Saat ini
terdapat berbagai jenis kualitas CMC yang digolongkan berdasarkan
kandungan pada CMC seperti yang tersaji pada Tabel 2. 3.
Tabel 2.3 Pembagian CMC berdasarkan kualitas dan pemanfaatannya
(Heinze, 2005) Kelompok kualitas Contoh penggunaan Kandungan CMC
(%) Kandungan garam (%) dari CMC Ditergents, mining Technical <
75 > 25 flotation Oil and gas drilling Semi-purifed 75-85 15-25
muds Paper coating, textile sizing and printing, Purired > 98
99,5 < 0.5 pharmaceuticals Pada CMC ada 2 istilah yang sering
digunakan yaitu Degree of Polimeritation (DP) dan Degree of
Substitution (DS). DP menunjukkan seberapa panjang atau berapa
monomer penyusun suatu rantai CMC. Sedangkan DS menunjukkan
seberapa banyak gugus hidroksi pada selulosa yang diganti dengan
gugus lainya setiap 100 AGU (anhydroglucopyranose unit(s)), range
dari DS adalah 0-3. Semakin rendah DS maka akan semakin mudah
mikroorganisme mendegradasi CMC tersebut. Sehingga semakin tinggi
DS maka aktifitas enzim hidrolisis seperti enzim selulase akan
menunjukkan hasil yang semakin rendah. Hal ini karena semakin
tinggi DS maka terjadi resistensi CMC terhadap enzim selulase.Namun
DS yang terlalu rendah (0,4 dan 0,7) tidak efektif digunakan
sebagai CMC, sehingga disarankan menggunakan CMC dengan DS 0,9
terutama pada pengukuran aktifitas enzim selulase pada bakteri
(Hankin and Anagnostakis, 1977). Disarankan untuk menggunakan CMC
dengan DS 1,2 untuk mendeteksi enzim selulase yang dihasilkan oleh
mikroorganisme yang diisolasi dari tanah dan air selokan (Hankin et
al., 1974; Hankin and Sands, 1974 dalam Hankin and Anagnostakis,
1977). CMC dengan DS 0,4 baik digunakan untuk mendeteksi enzim
selulase pada beberapa fungi yang tidak dapat efektif mendegradasi
CMC dengan DS 0,9. CMC dengan DS 0,9 dapat digunkan untuk
mendeteksi secara efektif enzim selulase pada semua mikroorganisme.
Tidak
ada perbedaan yang nyata antara laju degradasi CMC pada media
padat dengan media cair (Hankin and Anagnostakis, 1977). Hal ini
dapat diduga karena enzim selulase disekresikan pada lingkungan
sekitar yang mengandung selulosa. 2.5 Mikroorganisme Pendegradasi
Selulosa (Bakteri Selulotik) Bakteri pendegradasi karbohidrat
sering diisolasi dari tanah yang mengandung seresah daun. Hal ini
disebabkan karena tanah mengandung bahan organik yang relatif kaya
dan terdapat seresah daun mengandung polisakarida yang relatif
komplek. Kondisi tersebut menyebabkan tanah dan seresah daun
menjadi habitat yang baik untuk berbagai mikroorganisme (William
and Govind, 2003). Pada penelitian yang dilakukan oleh Hatami et
al., (2008) diketahui bahwa jumlah bakteri yang berhasil diisolasi
pada tanah hutan lebih banyak dibandingkan dengan yang berhasil
diisolasi pada lahan pertanian. Dari total bakteri yang berhasil
diisolasi juga diketahui bahwa jumlah total isolat bakteri
pendegradasi selulosa lebih banyak dibandingkan dengan yang
diisolasi dari lahan pertanian. Hal ini terjadi karena terdapat
perbedaan material organik yang terdapat pada hutan dan lahan
pertanian. Hutan memiliki keanekaragaman material organik yang
lebih tinggi dibandingkan dengan lahan pertanian. Pada penelitian
yang dilakukan oleh Hatami et al., (2008) diketahui bahwa rata-rata
pada ratio Hydrolisys Capacity (HC) isolat yang diisolasi pada
lahan pertanian lebih besar dibandingkan dengan ratio HC yang
diisolat pada hutan. Ratio HC yang diperoleh pada hutan adalah 1,6
sedangkan pada lahan pertanian ratio HCnya adalah 2.1. Hal ini
menunjukkan bahwa isolat bakteri pendegradasi selulosa pada lahan
pertanian memiliki potensi yang lebih besar dibandingkan dengan
isolat bakteri yang diperoleh pada hutan untuk digunakan dalam
mendegradasi material selulosa. Sellulosa adalah polimer
karbohidrat yang terbanyak yang terdapat di alam (Han and Chen,
2007). Oleh karena itu mikroorganisme pendegradasi selulosa
ditemukan di berbagai ekosistem. Enzim selulosa dapat dihasilkan
oleh berbagai bakteri dan fungi, aerob dan anerob, mesofil
dan termofil. Fungi aerob yang dapat mendegradasi selulosa
diantaranya adalah Trichoderma viride, Trichoderma reesi,
Penicillium pinophilum, Sporotrichum pulvelentum, Fusarium solani,
Tolaromyces emersonii, dan Trichoderma koningii. Hanya sedikit
mikroorganisme yang digolongkan ke dalam kelompok seperti fungi
termofilik aerobik ( Sporotrichum thermophile, Thermoascus
aurantiacus, Chetomium thermophile, Humicola insolens), fungi
mesofil anaerobik (Neocallimastix frontalis, Piromonas communis,
Sphaeromonas communis), bakteri mesofilik dan termofilik aerobik
(Cellumonas sp, celvibrio sp, Microbispora bispora, Thermomonospora
sp),bakteri mesofilik dan termofilik anaerobik (Acentivibrio
cellulolyticus, Bacteriodes cellulosolvent, Bacteriodes
succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens dan
Clostridium termocellum). Bakteri pendegradasi selulosa termofil
dapat menghasilkan enzim selulase yang relatif stabil (tahan pada
kondisi asam atau basa dan pada suhu tinggi hingga 90C) (Bhat, and
Bhat, 1997). Organisme dapat mendegradasi selulosa dan menjadikan
selulosa sebagai sumber karbon tunggal yang secara ekologi menjadi
sangat penting, dan sebagian besar proses degradasi selulosa
terjadi dalam keadaan aerob. Hanya 5-10% degrdasi yang berlansung
secara anaerob. Bakteri selulotik yang ditemukan terdapat pada
filum Thermotogae, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes,
Firmicutes, Fibrobacteres and Bacteroides. Diperkirakan 80% isolat
yang diperoleh ditemukan pada filum Firmicutes dan Actinobacteria
dan mayoritas bakteri pendegradasi selulotik Gram positif masuk ke
dalam kelas Clostridia dan genus Clostridium yang termasuk ke dalam
Filum Firmicutes (Levin et al., 2009). Simbiosis antara hewan
(ruminansia) dan mikroorganisme adalah hubungan yang saling
menguntungkan. Polimer karbohidrat tidak dapat dicerna oleh
kebanyakan hewan tetapi dapat dihidrolisis dan difermentasi oleh
mikroorganisme yang terdapat di rumen. Hasil akhir yang diperoleh
adalah asam lemak yang digunakan dalam metabolisme rumennansia.
Mikroorganisme pendegradasi selulosa yang terdapat pada
rumennasia antara lain adalah Butyrivibrio fibrisolvens,
Fibrobacter succinogenes, Neocallimastix frontalis, Neocallimastix
patriciarum, Orpinomyces jayanii, Orpinomyces sp, Piromyces equi,
Piromyces Untuk mengokimalkan metabolisme bakteri pendegradasi
selulosa pada keadaan minimal nutrient, setiap bakteri mempunyai
strategi yang berbeda-beda. Besar hasil akhir yang diperoleh pada
proses degradasi tergantung kepada beberapa faktor yaitu pH, akses
terhadap karbon (kecocokan konformasi enzim dengan subtrat), reaksi
redok yang terjadi, konsentrasi produk. Dan untuk mengoktimalkan
hasil yang diperoleh maka diperlukan pengetahun tentang genetika
mikroorganisme yang digunakan, enzimatik, dan termodinamika dalam
mekanisme aliran karbon (karbon flow). Detail pengetahuan mengenai
hubungan antara genome content, gen dan produk ekpresi gen, pathway
utilization, dan hasil akhir yang diperoleh akan sangat penting
untuk diketahui dalam degradasi selulosa (Levin et al., 2009). 2.6
Enzim Selulase Di alam, enzim selulase ditemukan di berbagai
ekosistem, terutama ditemukan pada dekomposisi serasah daun pada
tabah, hingga keadaan anaerobik pada rumenansia (Denman et al.,
1996). Sistem enzim sellulosa sangat penting karena berperan dalam
mengubah sellulosa menjadi gula sederhana. Sellulosa relatif sulit
diubah menjadi gula sederhana, namun jumlah sellulosa yang melimpah
menjadikan sellulosa menjadi bahan yang potensial untuk digunakan
dalam produksi bioetanol (Himmel et al.,1997 dalam William and
Govind, 2003). Enzim sellulase terdiri dari enzim Endosellulase ,
Eksosellulase, dan glukosidase (tabel 2.1). Enzim selulase adalah
enzim yang dapat mengkatalisis dan menghidrolisis ikatan glukosidik
pada sellulosa (ikatan yang paling banyak di sellulosa) (Bhat,
2000). Enzim endosellulase (EC 3.2.1.4) terdiri dari satu jenis
enzim yaitu 1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases (Bhat dan Bhat, 1997 ;
Wood, 1985). Endoglucanases atau yang sering disebut dengan
CM-cellulases (carboxymethylcellulose) atau Cx enzim,
sp. E2, Piromyces rhizinflata, Prevotella ruminocola,
Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens, dan Prevotella
albensis (Krause, et al. 2003). menghidrolisis secara acak ikatan
pada serat selulosa (Wood, 1985). Hal ini mengakibatkan rantai
polisakarida yang telah terpotong (oligosakarida) mempunyai panjang
rantai yang berbeda-beda (Bhat, 2000). Hasil dari hidrolisis serat
sellulosa adalah glukosa, cellobiose, cellotriose, dan
oligosakarida yang lebih tinggi (Wood, 1985). Enzim endoselulase
sangat aktif pada degradasi derivat selulosa seperti
carboxymethylcellulose dan hydroxyethylcellulose, dalam degradasi
ini endoselulase bekerja sama dengan exoselulase (Mattinen, 1998).
Enzim eksoselllulase (EC 3.2.1.91) terdiri dari 1,4D-glucan
glucanohydrolases (lebih dikenal dengan cellodextrinases)
dan1,4-D-glucan cellobiohydrolases (cellobiohydrolases). Enzim
eksoselulase adalah enzim yang aktif pada sisi crystalline selulosa
(Mattinen, 1998). -glucoside glucohydrolases lebih dikenal sebagai
-glukosidase. Cellobiohydrolyase, yang seing disebut dengan
exoglucanse, adalah enzim pendegradasi selulosa yang ditemukan pada
mayoritas fungi yang dapat mendegradasi selulosa (Wood, 1985).
Cellobiohydrolyase dapat menghidrolisis microcrystalline namun
tidak dapat menghidrolisis CMC (carboxymethylcellulose) (Kim and
Kim, 1995). -glukosidase adalah enzim yang digunakan untuk
menghidrolisis cellobiose dan pada beberapa kasus dapat
menghidrolisis cello-oligosakarida menjadi glukosa. Enzim
endogluconases dan glukosidase dapat menghirolisis selulosa menjadi
glukosa. -glukosidase di butuhkan untuk menghidrolisis inhibitor
cellobiose (Wood, 1985).
Tabel 2.4 Jenis-jenis enzim selulase (Bhat dan Bhat, 1997)
Jenis enzim Kode EC Endo-(1EC 4)--D3.2.1.4 selulase
Sinonim Endoselulase atau endoglukanase
Mekanisme reaksi -G-G-G-G-
Ekso-(1-4)-Dselulase
EC Selobiohidrolas 3.2.1.91 e atau eksoselulase
Memutuskan ikatan secara acak G-G-G-GMelepaskan selobiosa baik
yang reducing atau nonreducing end G-G-G-G Melepaskan glukosa dari
non-reducing end G-G, G-G-GMelepaskan glukosa dari selobiosa atau
rantai cellooligosakarida pendek
Ekso-(1-4)-Dselulase
EC Eksoglukanase 3.2.1.74 atau glukohidrolase
EC Selobiose glukosidase 3.2.1.21
Luas permukaan adalah faktor yang berprngaruh dalam proses
degadasi serbuk selulosa crystalline. Hal ini dapat dilihat bahwa
luas permuaan mempengaruhi kontak enzim selulase dengan permukaan
selulosa (Weimer et al., 1993 dalam Rodrigues et al., 2003).
Degradasi selulosa dengan menggunakan meadow hay (rumput-rumputan)
menunjukkan bahwa dalam degradasi selulosa perlekatan dari bakteri
memainkan peran yang penting dalam mendegradasi selulosa (Sequeira
and Sequiera, 1993) Enzim selulase dapat menghidrolisis subtrat
selulosa melalui sistem reaksi komplek yang terdiri dari beberapa
tahapan (Lee and Fan, 1982). Tahapan reaksi tersebut adalah : 1.
Transfer enzim dari bulk aqueous phase ke permukaan substrat
selulosa 2. Adsopsi enzim dan pembentukan komplek
enzim-substrat
3. Hidrolisis sellulosa 4. Transfer sellodextrins, glukosa dan
sellobiosa ke bulk aqueous phase 5. Hidrolisis sellodextrins dan
sellobiosa menjadi glukosa Fase adsopsi dan pembentukan komplek
enzim-substrat adalah fase kritis di dalam hidrolisis selulosa
(Bledman et al, 1988). Tahapan hidrolisis selulosa tergantung
kepada struktur selulosa, interaksi anatara enzim selulase dan
serat selulosa, mekanisme hidrolisis enzim tersebut di alam dan
inhibitor yang terbentuk (Coughlan, 1985). Glukosa dan sellobiose
adalah inhibitor enzim dalam menghidrolisis selulosa. Sellobiosa
menghambat enzim sellobiohidrolase pada komplek enzim selulase dan
glukosa menghambat enzim penghidrolisis sellobiosa . Sellobiose
mempunyai potensi menjadi inhibitor yang lebih kuat dibandingkan
dengan glukosa pada mekanime hidrolisis selulosa (Marsden and Gray,
1986). Dua mekanisme inhibibisi yaitu inhibitor kompetitif dan
inhibitor non kompetitif (Lee and Fan, 1982). Laju hidrolisis enzim
selulase ditentukan oleh struktur enzim dan struktur substrat
(Mandels, 1985), dimana struktur Kristal dari selulosa relatif
lebih sulit dihidrolisis dibandingkan dengan struktur amorf (
Coughlan, 1985). Karena struktur kristal lebih sulit didegradasi
dibandingkan dengan struktur amorf, maka enzim selulase (enzim
endosellulase) menghidrolisis struktur amorf. Mekanisme skematis
kerja enzim selulase seperti pada Gambar 2.3.
memiliki komplek seperti cellulosome dengan ukuran yang lebih
besar (Fanutti et al., 1995; Denman et al., 1996; Dijkerman et al.,
1996). Kedua tipe enzim dapat melepaskan ikatan 1,4-glukosida
dengan menggunakan enzim endo atau exoglukonase yang spesifik yang
didasarkan atas topologi dari sisi aktif.
Gambar 2.3 Skematis mekanisme degradasi selulasa (Beguin and
Aubert, 1994)
Bakteri selulotik dapat bekerja pada variasi keadaan lingkungan
yang berbeda-beda dalam mendegradasi seresah daun pada tanah
(Beguin and Aubert, 1994; Denman et al., 1996 dalam Linder dan
Teeri, 1997). Mikroba ini dapat mendegradasi melekul komplek,
keadaan dimana subtrat tidak larut dalam air dengan menggunakan
berbagai enzim melalui berbagai cara didalam memutuskan bagian yang
berbeda di dalam substrat. Efisiensi degradasi kayu dengan
menggunakan mikorganisme sepeti fungi filamentus, merupakan tipe
yang mengsekresikan dan mengsinergikan aksi enzim selulase dimana
bakteri menggunakan komplek enzim (cellulosome) yang bekerja pada
permukaan substrat (Tomme et al., 1995; Bayer et al., 1996 dalam
Linder dan Teeri, 1997). Hal ini juga terjadi pada fungi anaerob
dimana Enzim ada yang mempunyai singgel Binding Domain dan ada yang
mempunyai dua atau lebih Binding Domain. Namun hampir semua enzim
selulase memiliki multidomain. Berdasarkan perbedaan enzim selulase
beberapa lebih memilih mendegradasi substrat selulosa pada bagian
amorphous dibandingkan bagian yang lain yaitu bagian kristalin.
Beberapa penelitian yang dilakukan terhadap enzim
2.7 Cellulose Binding Domain (CBD) CBD pertama kali ditemukan
pada Trichoderma reesei. Sekarang telah behasil diidentifikasi 120
CBD dan diklasifikasikan menjadi 10 families (I-X). Ada dua
families (II dan III) yang memiliki anggota yang banyak sehingga
dibagi menjadi subfamilies (IIa, IIb, IIIa dan IIIb). Sebagian
besar CBD termasuk ke dalam families I, II dan III, pada beberapa
families hanya mengandung beberapa anggota dan pada families yang
lain hanya memiliki satu anggota. Families I hanya mengandung CBD
yang berasal dari fungi dan semua CBD yang termasuk ke dalam
families II-V, IX-X semuanya merupakan CBD yang berasal dari
bakteri (Mattinen, 1998). CBD yang termasuk ke dalam families I
adalah CBD yang berukuran kecil dan tersusun oleh peptide yang
kompak, mengandung 32-36 asam amino. CBD fungi memiliki kemiripan
yang sangat tinggi antara yang satu dengan yang lain. Contoh
terbaik CBD families I adalah yang terdapat pada Trichoderma
reesei. CBD bakteri yang termasuk ke dalam families II tersusun
dari asam amino yang lebih banyak yaitu 95-108. CBD yang termasuk
ke dalam families III adalah dihasilkan oleh bakteri yang dapat
menghasilkan cellulosome (Mattinen, 1998). Klasifikasi dari CBD
dari organisme yang berbeda disajikan pada Lampiran 12.
selulase yang berbeda dapat digunakan untuk mengidentifikasi
enzim mana yang kemungkinan pada masa yang akan datang digunakan
untuk mendegradsi selulosa pada bagian kristalin (Wilson and
Mertens, 1995; Davies and Henrissat, 1995; Teeri, 1997 dalam Linder
dan Teeri, 1997). Salah satu yang menjadi perhatian utama adalah
mengenai adsopsi yang berhubungan dengan aktifitas
katalitik pada substrat padat (Klyosov, 1990 dalam Linder dan
Teeri, 1997). Karasteristik struktural dari berbagai enzim selulase
didasarkan pada pengetahuan mengenai melekuler yang merupakan
bagian terpenting dalam memahami degradsi selulosa. Kebanyakan,
namun tidak semua enzim selulase efektif mendegradasi selulosa
berdasarkan model struktur penyusun sehingga tempat perlekatan sisi
katalitik berkaitan dengan cellulose-binding domain (CBD) (Tomme et
al., 1995). Mirip dengan enzim selulase, pemindahan substrat
binding domain aktifitasnya meningkat pada subtrat yang tidak larut
namun tidak pada substrat yang larut (Blaak and Schrempf, 1995
dalam Linder dan Teeri, 1997). Hal ini menunjukan bahwa struktur
modular domain memiliki keuntungan yang signifikan dalam
mengdegradasi substrat yang tidak larut (Linder dan Teeri, 1997).
2.8 Rumput Gajah (Pennisetum purpureum Schum) Rumput gajah adalah
tanaman yang termasuk ke dalam kelompok tanaman rumputrumputan.
Rumput gajah banyak dimanfaatkan pada bidang peternakan yaitu
sebagai makanan hewan ternak seperti sapi, kambing dan kuda.
Umumnya rumput gajah yang digunakan diindonesia adalah rumput yang
tumbuh secara liar. Namun untuk peternakan yang relatif besar maka
rumput yang digunakan adalah rumput yang sengaja ditanaman atau
dipelihara secara khusus. Hal ini dilakukan untuk memenuhi
kebutuhan pakan ternak. Rumput-rumputan dipilih karena merupakan
tanaman yang produktifitasnya tinggi dan memiliki sifat yang dapat
memperbaiki kondisi tanah (Gonggo et al., 2005). Rumput-rumputan
yang ditanam pada suatu lahan dapat memperbaiki kondisi tanah.
Tanaman tumput-rumputan membuat tanah menjadi lebih gembur. (Gonggo
et al., 2005). Hal ini dapat meningkatkan porositas, yang
menyebabkan terjadi aerasi yang lebih baik terhadap lahan yang
ditanami oleh rumputrumputan (Handayani, 2002). Banyaknya pori juga
membantu terjadinya degradasi oleh mikroorganisme dari guguran
daun. Potensi untuk mendapatkan isolat bakteri pendegradasi
selulosa menjadi cukup besar . Lahan yang ditanami rumput juga
tahan terhadap kekeringan, hal ini terjadi karena perakaranya yang
dalam (Rismunandar, 1989 dalam Gonggo et al., 2005). Tanaman
penutup tanah dari jenis rumput-rumputan dapat juga berfungsi
sebagai pelindung permukaan tanah dari daya disperse dan daya
penghancur oleh butiran-butir air hujan, memperlambat aliran
permukaan (Kartasapoetra et al., 2000 dalam Gonggo et al., 2005).
Sumber energi yang ramah lingkungan dan ekonomis menjadi perhatian
utama pengembangan teknologi dalam bidang energi. Pada saat ini
biomassa adalah menjadi perhatian utama dalam pengembangan energi
terbarukan. Fokus utama yang menjadi pertimbangan dalam memilih
biomassa adalah bahan tersebut mudah diperbaharui dan energi yang
dapat diperoleh. Biomassa adalah sumber energi terbarukan yang
melimpah dan dapat diperoleh dari berbagai industri sebagai
sampah/limbah seperti pertanian, industri gula, limbah industri
yang menggunakan kayu, dan industri makanan. Selain menggunakan
bahan yang merupakan limbah dari industri lain energi terbarukan
dapat berasal dari tanaman yang ditanam sebagai sumber energi
(sumber karbon) (Strezos et al., 2008). Salah satu tanaman yang
mempunyai potensi dijadikan sumber biomassa pada energi terbarukan
adalah rumput gajah (Pennisetum Purpureum Schum). Berikut adalah
klasifikasi dari Pennisetum purpureum Schum. Kingdom Phlum Class
Ordo Family Genus Spesies : Plantae : Spermatophyta : Monokotil :
Poales : Poaceae : Pennisetum : Pennisetum purpureum Schum
(Tjitrosoepomoe, 2004) Rumput gajah (Pennisetum purpureum Shaum)
berasal dari afrika tropik, tumbuh berumpun dan tingginya dapat
mencapai 3 m lebih. Permukaan buluhnya licin dan pada buluh yang
masih muda bisanya ditutupi oleh sejenis zat lilin tipis.
Pelepahnya licin atau berbulu pada waktu muda dan kemudian
berbulu-bulu tersebut gugur. Daunnya berbentuk garis,
pangkalnya
lebar dan ujungnya lancip sekali. Tepi daun kasar. Perbungaan
berupa tandan tegak yang panjangnya sampai 25 cm. gagang-gagangnya
berbulu. Bulir-bulirnya berkelompok, terdiri dari 3-4 buliran tiap
kelompoknya dan bergagang pendek sekali. Pangkal bulirnya
bulirannya berbulu panjang dan halus. Perbanyakan dapat dilakukan
dengan pemecahan rumpun dan potongan-potongan buluhnya. Dapat
tumbuh hingga pada ketinggian 1500 m dpl (www.flickr.com).
45 ton per hektar berat kering pada daerah subtropis dan 80 ton
per hektar berat kering pada daerah tropis (Woodard and Prine,
1993). Rumput gajah dapat hidup pada daerah dengan kandungan
nutrisi yang minimal. Dalam satu tahun rumput gajah dapat dipanen
hingga empat kali. Menurut Okaraonye dan Ikewuchi (2009) analisis
kandungan kimia dari rumput gajah ada pada Tabel 2.5.Tabel 2.5
Analisisa kandungan kimia rumput gajah (Pennisetum purpureum
Shaum)
Parameter Kandungan air Jumlah abu Protein kasar Lemak kasar
Jumlah total karbohidrat Serat kasar
Berat basah 89,0 2,00 2,97 1,63 3,40 1,00
Berat kering 18,18 27.00 14.82 30,91 9,09
Sedangkan menurut Strevoz (2008) kandungan mineral pada rumput
gajah ada pada Tabel 2.6.Table 2.6 Analisis kandungan mineral pada
rumput gajah
Analisis kandungan mineral pada abu Silikon Almunium Besi
Kalsium Magnesium Natrium Kalium Titanium Mangan Fosfor Belerang
Strontium Barium Zink Vanadium
Mineral yang dianalisis dalam bentuk senyawa SiO2 Al2O3 Fe2O3
CaO MgO Na2O K2O TiO2 Mn5O4 P2O5 SO3 SrO BaO ZnO V2O5
Gambar 2.4 Rumput gajah (Pennisetum purpureum Shaum)
(www.flickr.com)
Penamaman tanaman seperti rumput gajah mengalami kompetisi
perebutan lahan dengan tanaman pangan seperti jagung. Oleh karena
itu, untuk meminimalkan kompetisi penggunaan lahan kritis perlu
ditingkatkan. Lahan kritis umumnya tidak banyak digunakan sebagai
lahan pertanian. Di dunia terdapat 2 Gha lahan kritis yang tidak
dapat ditanami tanaman pangan. Lahan kritis yang tidak digunakan
memiliki kecenderungan mengalami kerusakan yang lebih parah seperti
erosi. Penanaman tanaman penghasil energi dapat memperbaiki
kualitas tanah (Strezos et al, 2008). Rumput gajah adalah tanaman
yang berasal dari afrika yang dapat mencapai hingga
Jumlah senyawa dari total berat abu yang dianalisis 43
