Izabela Kern-Zdanowicz Struktura, rozprzestrzenianie i ewolucja ...‚ącznik nr 2... · Znajduje się je również w komórkach eukariontów – w mitochondriach i w cytoplazmie

Izabela Kern-Zdanowicz

Struktura, rozprzestrzenianie i ewolucja plazmidów warunkujących oporność na antybiotyki

Autoreferat

Izabela Kern-Zdanowicz Załącznik 2 Autoreferat

1

1. Imię i Nazwisko.

Izabela Maria Kern-Zdanowicz 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe– z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu

rozprawy doktorskiej.

1997 – stopień doktora nauk przyrodniczych w zakresie biochemii

Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

Tytuł rozprawy: „Wydzielanie streptokinazy ze Streptococcus equisimilis H46A

w bakteryjnym układzie homologicznym i heterologicznym”,

promotor dr hab. Piotr Cegłowski

1986 – stopień magistra biologii, specjalność biologia molekularna,

Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

praca wykonana pod kierunkiem prof. Ewy Bartnik

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych.

2007– asystent, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

1997 – 2007 adiunkt, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

1992 – 1997 asystent, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

1990 – 1992 asystent, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Akademii Medycznej

w Warszawie

1986 – 1990 biolog, Ośrodek Badawczo-Rozwojowy Biotechnologii w Warszawie 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.): a) tytuł osiągnięcia naukowego,

Struktura, rozprzestrzenianie i ewolucja plazmidów warunkujących oporność na antybiotyki

b) (autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa, recenzenci wydawniczy),

Na osiągnięcie naukowe składa się cykl sześciu prac eksperymentalnych. Sumaryczny impact factor publikacji wchodzących w skład osiągnięcia habilitacyjnego wynosi IF19,073

1. Dmowski M., Gołębiewski M., Kern-Zdanowicz I.#. 2018. Characteristics of the

conjugative transfer system of the IncM plasmid pCTX-M3 and identification of its putative regulators. J. Bacteriol. Accepted manuscript posted online 9 July 2018 , doi:10.1128/JB.00234-18 IF2016/2017 3,143 #

autor korespondujący

2. Wasyl D *, Kern-Zdanowicz I.*, Domańska-Blicharz K, Zając M, Hoszowski A. 2015.

High-level fluoroquinolone resistant Salmonella enterica serovar Kentucky ST198


2

epidemic clone with IncA/C conjugative plasmid carrying blaCTX-M-25 gene. Vet Microbiol.;175(1):85-91. IF2015 2,564

* jednakowy udział autorów

3. Zienkiewicz M., Kern-Zdanowicz I., Carattoli A., Gniadkowski M., Cegłowski P.

2013.Tandem multiplication of the IS26-flanked amplicon with the blaSHV-5 gene within plasmid p1658/97. FEMS Microbiol Lett. 341:27-36. IF2013 2,723

4. Zienkiewicz M., Kern-Zdanowicz I., Gołębiewski M., Żylińska J., Mieczkowski P.,

Gniadkowski M., Bardowski J. and Cegłowski P. 2007. Mosaic structure of p1658/97, a 125-kilobase plasmid harbouring an active amplicon with the extended-spectrum β-lactamase gene blaSHV-5. Antimicrob Agents Chemother. 51:1164-1171. IF2007 4,39

5. Gołębiewski M., Kern-Zdanowicz I. #, Zienkiewicz M., Adamczyk M., Żylińska J., Baraniak A., Gniadkowski M., Bardowski J. and Cegłowski P.2007. Complete nucleotide sequence of the pCTX-M3 plasmid and its involvement in spread of the extended-spectrum β-lactamase (ESBL) gene blaCTX-M-3. Antimicrob Agents Chemother. 51: 3789-3795. IF2007 4,39 #


6. Nowakowska B., Kern-Zdanowicz I. #, Zielenkiewicz U. and Cegłowski P. 2005.

Characterization of Bacillus subtilis clones surviving overproduction of Zeta, a pSM19035 plasmid-encoded toxin. Acta Biochim Polon. 52: 99–107. IF2005 1,862. #


c) omówienie celu naukowego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia wyróżniono pogrubionym drukiem, tylko pogrubionymi numerami wyróżniono publikacje jestem współautorką

Zakażenia szczepami bakterii opornych na leki przeciwbakteryjne stanowią obecnie

jeden z największych problemów współczesnej medycyny. Narastająca oporność na różne

grupy środków stosowanych w terapiach i rozprzestrzenianie oporności w populacjach

bakterii skłoniła Światową Organizację Zdrowia (WHO) do ustalenia listy bakterii

antybiotykoopornych o globalnym priorytecie (1). Lista taka pomaga ustalić preferencje dla

prowadzenia prac badawczo – rozwojowych w celu tworzenia nowych i rozwijania

istniejących terapii przeciwbakteryjnych. Jednocześnie systematycznie monitorowane są

bakterie oporne na antybiotyki, a pochodzące z zakażeń związanych z opieką zdrowotną, jak

też związanych z hodowlą zwierząt. Monitorowane jest także użycie dostępnych

antybiotyków. Obecnie prognozowane jest bowiem, że o ile nie nastąpi fundamentalna

zmiana w odkryciach nowych antybiotyków, czy opracowaniu alternatywnych terapii

przeciwbakteryjnych, do 2050 roku umierać może nawet 10 milionów ludzi rocznie z powodu

praktycznie nieuleczalnych zakażeń (3). Do grupy bakterii o najwyższym priorytecie, czyli do

krytycznie ważnych patogenów, zaliczone są oprócz Acinetobacter baumannii i Pseudomonas


3

aeruginosa, opornych na karbapenemy, także bakterie z rodziny Enterobacteriaceae oporne

na karbapenemy lub oporne na cefalosporyny III generacji.

Niniejsze opracowanie obejmuje cykl sześciu prac, których głównym celem była

charakterystyka plazmidów pochodzących ze szczepów bakterii wyizolowanych z zakażeń

klinicznych. Trzy z czterech analizowanych plazmidów (p1658/97, pCTX-M3 i p1643_10)

warunkują oporność bakterii na cefalosporyny III generacji, a zostały wyizolowane z

przedstawicieli Enterobacteriaceae i zaklasyfikowanych wg kryteriów WHO do krytycznie

ważnych patogenów. Badania prowadzone nad czwartym, chronologicznie najwcześniej

wyizolowanym plazmidem, pSM19035, dotyczyły wybranych aspektów jego biologii, które

można byłoby wykorzystać w poszukiwaniu nowych terapii przeciwbakteryjnych.

Plazmidy, cząsteczki pozachromosomalnego DNA, zdolnego do autonomicznej

replikacji, są ważnymi elementami ruchomej puli genów, zapewniają bakteriom dużą

zmienność i umożliwiają szybką adaptację do zmieniającego się środowiska. Ewolucja

szczepów bakterii zachodzi nieprzerwanie, jednak selekcja tych, które są oporne na

antybiotyki, powoduje znaczne jej przyspieszenie. Plazmidy występują powszechnie w

genomach bakterii i archeonów (4, 5), gdzie mogą stanowić nawet 45% genomowego DNA

(6). Znajduje się je również w komórkach eukariontów – w mitochondriach i w cytoplazmie u

grzybów oraz w mitochondriach u roślin (7, 8). Plazmidy biorą udział w horyzontalnym

transferze genów (HGT, ang. horizontal gene transfer) - jednym z jego mechanizmów jest

transfer koniugacyjny plazmidów. Konsekwencją tego ostatniego jest m. in.

rozprzestrzenianie się wśród bakterii genów kodujących oporność na chemioterapeutyki.

Szczególnie istotne są plazmidy koniugacyjne, rezydujące w komórkach bakterii bytujących w

środowiskach szpitalnych lub na fermach zwierząt, czyli wszędzie tam, gdzie presja

selekcyjna w postaci antybiotyków jest stosowana częściej i silniej, niż w innych niszach

ekologicznych. Właśnie z takich środowisk najczęściej izolowane są duże plazmidy

przenoszące geny oporności na wiele różnych środków przeciwbakteryjnych i te właśnie

środowiska są przede wszystkim monitorowane w kontekście rozprzestrzenianie się

antybiotykooporności w populacjach bakterii (9, 10).

Większość plazmidów występuje w komórce bakterii w postaci kowalencyjnie

zamkniętego koła, ale znane są także plazmidy liniowe (11). Plazmidy znacznie różnią się

wielkością – są plazmidy małe, kryptyczne, zawierające jedynie rejon odpowiedzialny za

replikację plazmidu czyli replikon, są również plazmidy duże, o wielkości ok. 100 - 200 tys.

par zasad, a największe to megaplazmidy występujące u Streptomyces, o wielkości nawet 1,8

miliona par zasad (12). Replikacja plazmidu w komórce gospodarza podlega precyzyjnej

regulacji, a liczba kopii w której plazmid występuje w komórce i zakres gospodarzy, w

których może on ulegać replikacji, są dla niego charakterystyczne. Zasadniczą regułą jest, że

małe plazmidy występują w dużej liczbie kopii w komórce, natomiast duże plazmidy mają w

komórce tylko kilka kopii (< 10). Gospodarzem plazmidu mogą być blisko ze sobą

spokrewnione bakterie, wtedy plazmid ma wąski zakres gospodarza albo szeroki, gdy może

on replikować w odległych filogenetycznie bakteriach (13, 14). W jednej komórce nie mogą

współegzystować, przy braku presji selekcyjnej, plazmidy o takim samym replikonie. W


4

jednej komórce może występować kilka plazmidów, o ile różnią się one replikonami – czyli

należą do różnych grup niezgodności (grupy Inc, ang. incompatibility).

Duże plazmidy występujące w komórce w niewielkiej liczbie kopii, są stabilnie

utrzymywane w populacji bakterii, dzięki kodowanym przez nie systemom stabilizującym

(15, 16). Najprostszy, system miejscowo specyficznej rekombinacji, rozdziela oligomery

plazmidu powstałe w trakcie replikacji i zwiększa w ten sposób liczbę oddzielnych jednostek

segregacyjnych dostępnych do podziału. Drugim jest system partycji, który prowadzi do

fizycznego przemieszczenia kopii plazmidu do rejonów komórki, które staną się centrami

przyszłych komórek potomnych (17). Trzeci z systemów, zwany systemem addykcji, uzależnia

komórki gospodarza plazmidu od plazmidu. W swojej klasycznej postaci składa się ze

stabilnej toksyny i nietrwałego antidotum, obu kodowanych w plazmidzie (18). Utrata

plazmidu skutkuje brakiem syntezy de novo białek plazmidowych. Obecne w cytoplazmie

antidotum ulega degradacji, uwalniając toksynę z kompleksu, w którym była nieaktywna lub

umożliwiając jej syntezę. Toksyna oddziałuje z celem w komórce, co prowadzi do śmierci i

eliminacji bezplazmidowej komórki z populacji.

Czwartym, dodatkowym systemem zapewniającym utrzymywanie plazmidów w

populacji jest system transferu koniugacyjnego, który każdą bezplazmidową komórkę

rozpoznaje jako potencjalnego biorcę plazmidu. System ten ma jeszcze większe znaczenie -

jest też odpowiedzialny jest za rozprzestrzenianie się plazmidów wśród bakterii. Znaczna

część dużych plazmidów występujących w bakteriach to plazmidy koniugacyjne. Tylko u

promieniowców (typ Actinobacteria) transportowi z dawcy do biorcy podlega dwuniciowy

DNA, a w transferze uczestniczy pojedyncze białko (19). U pozostałych bakterii i archeonów

DNA transportowany jest w postaci jednoniciowej (ssDNA) w kompleksie z białkami, a

transporter stanowi duży kompleks białkowy, odpowiedzialny za utworzenie par

koniugacyjnych dawcy i biorcy (Mpf, ang. mating pair formation), wytwarzany przez dawcę

plazmidu. Sam kompleks Mpf jest ewolucyjnie pokrewny systemowi transportu typu IV

białek (T4SS, ang. type IV secretion system), odpowiedzialnego m. in. za transport białek

istotnych w wirulencji z niektórych patogennych bakterii Gram-ujemnych do komórek

eukariotycznych (20). Przygotowanie DNA plazmidu do transferu polega na przecięciu jednej

z jego nici w specyficznym miejscu nic w obrębie sekwencji oriT (ang. origin of transfer) przez

kompleks relaksazy, która następnie związana kowalencyjnie z końcem 5’ pojedynczej nici

DNA jest transportowana do komórki biorcy. Współdziałanie kompleksów relaksazy i Mpf

zapewnia białko łącznikowe (CP, ang. coupling protein) (21).

Wśród T4SS, w tym również kompleksów Mpf plazmidów, można wyróżnić dwie

grupy filogenetyczne, IVA i IVB. Do pierwszej grupy zaliczane są takie jak np. system

koniugacyjny plazmidu F z grupy IncF, wykazujące podobieństwo ewolucyjne do

prototypowego systemu IVA, czyli systemu transferu onkogennego T-DNA z Agrobacterium

tumefaciens. Natomiast do drugiej grupy, IVB, należą te, które są podobne do białek Dot/Icm

tworzących system transportu białek zaangażowanych w patogenezę Legionella

pneumophila, bakterii wywołujących chorobę legionistów – tu należą systemy koniugacyjne

plazmidów z grupy IncI1, takie jak R64 czy ColIb-P9 oraz badany przeze mnie system


5

koniugacyjny plazmidu pCTX-M3, który zostanie omówiony poniżej. Systemy T4BSS są

znacznie słabiej scharakteryzowane niż T4ASS. Inny podział kompleksów Mpf plazmidów

koniugacyjnych wyróżnia osiem grup MPF, a oparty jest na filogenezie białka VirB4,

jedynego, którego homologi odnaleziono we wszystkich systemach koniugacyjnych (22).

Do tego, żeby plazmid mógł ulec transferowi koniugacyjnemu, musi zawierać

sekwencję oriT, a w komórce gospodarza plazmidu muszą być wytwarzane oba kompleksy –

kompleks relaksazy i Mpf, a także białko CP. Plazmidy koniugacyjne same kodują wszystkie

elementy niezbędne do transferu. Istnieją też inne plazmidy, plazmidy mobilizowalne, które

rezydując w tej samej komórce bakterii co plazmid koniugacyjny, mogą korzystać z ich

systemów Mpf lub Mpf i białka CP, wtedy plazmid koniugacyjny służy jako plazmid

pomocniczy dla plazmidu mobilizowalnego. Plazmidy by zostać zmobilizowane do transferu

mogą zawierać tylko sekwencję oriT, o ile jest zgodna z systemem koniugacyjnym plazmidu

pomocniczego obecnego w komórce bakterii (23). Podobnie struktury występujące w

genomach bakterii, takie jak wyspy genomiczne lub wyspy patogenności, o ile zawierają

przynajmniej pasujący rejon oriT, mogą być mobilizowane przez koegzystujące w komórce

plazmidy koniugacyjne lub elementy ICE (ang. integrative conjugative element, dawniej

nazywane transpozonami koniugacyjnymi) (24, 25).

W plazmidzie moduły genetyczne kodujące zdolność do replikacji, stabilnego

utrzymywania w populacji oraz transfer koniugacyjny stanowią jego szkielet (ang. backbone),

który jest zachowywany ewolucyjnie. Części zmienne, dodatkowe, nabywane w trakcie

ewolucji plazmidu zostały określone mianem ładunku (ang. load) (26). Ładunek ten, chociaż z

pewnością zwiększa nieco obciążenie metaboliczne komórki, w której plazmid rezyduje, to

odgrywa istotną rolą zwiększeniu zdolności adaptacyjnych gospodarza.

Jako ładunek, plazmidy przenoszą geny oporności na główne grupy środków

przeciwbakteryjnych takich jak β-laktamy, aminoglikozydy, tetracykliny, chloramfenikol,

sulfonamidy, trimetoprim, makrolidy i chinolony (27). W plazmidach kodowane są także

czynniki wirulencji, również w obrębie przenoszonych przez plazmidy wysp patogenności,

które zwiększają przewagę selekcyjną komórki gospodarza plazmidu (28, 29). Jednocześnie,

w komórce do plazmidów mogą integrować inne ruchome elementy genetyczne, takie jak

sekwencje insercyjne (IS) i transpozony (Tn), które odpowiedzialne są za mobilizację z

chromosomu bakterii genów oporności na antybiotyki (30). Należy również wspomnieć o

integronach, strukturach „zbierających” kasety genowe, swoistych naturalnych systemach

ekspresyjnych, które w połączeniu z innymi elementami ruchomymi, odpowiedzialne są za

rozprzestrzenianie całych zestawów genów oporności (31, 32).

Historia odkrycia genów oporności kodowanych w plazmidach sięga początku lat

pięćdziesiątych w Japonii – tam po wojnie dochodziło do epidemii czerwonki wywołanych

przez Shigella dysenteriae, które nawet w 80% przypadków były niewrażliwe na sulfonamidy,

dostępne środki przeciwbakteryjne, stosowane od 1937 roku (33). Przy tym już w połowie lat

pięćdziesiątych 10% tych szczepów było opornych równocześnie dodatkowo na

streptomycynę, chloramfenikol i tetracyklinę, antybiotyki odkryte zaledwie 10 lat wcześniej.

W 1959 roku w Japonii wykazano, że oporności te mogą być przekazane innym


6

przedstawicielom Enterobacteriaceae, oraz powiązano to zjawisko z episomami (34). W ten

sposób pokazano, że procesem istotnym w rozprzestrzenianiu się oporności na antybiotyki

wśród bakterii są plazmidy, a zachodzi to na drodze koniugacji, takiej, jak przekazywanie

plazmidu F odkryte przez Tatuma i Lederberga w 1946 roku.

W 1928 roku, w którym Flemming odkrył penicylinę, rozpoczęła się „złota era”

antybiotyków i trwała do końca XX w. Antybiotyki były niezaprzeczalnie najbardziej

skutecznymi chemioterapeutykami wprowadzonymi do lecznictwa w XX w. Niestety od lat

osiemdziesiątych XX w. amerykańska Agencja Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła o 90%

mniej nowych ogólnoustrojowych antybiotyków niż we wcześniejszych latach (3). Warto

wspomnieć, że nawet penicylina nie zdążyła być produkowana na szeroką skalę, kiedy w

latach czterdziestych XX w. wyizolowano pierwszy szczep produkujący enzym rozkładający

ten antybiotyk, a potem w 1963 wyizolowano szczep E. coli produkujący penicylinazę TEM

(TEM-1) kodowaną na plazmidzie (35).

Po odkryciu na początku lat pięćdziesiątych erytromycyny, antybiotyku z grupy

makrolidów, zaczęła być stosowana w leczeniu zakażeń w przypadkach, w których

niemożliwe było zastosowanie penicyliny, w konsekwencji doprowadziło to do powstania i

wyselekcjonowania szczepów, w tym szczepów bakterii Gram-dodatnich opornych na

makrolidy. W paciorkowcach, enterokokach i gronkowcach geny oporności na makrolidy,

linkozaminy i streptograminę (oporność krzyżowa MLSB), ale także na wankomycynę,

chloramfenikol lub antybiotyki aminoglikozydowe (kanamycyna, streptomycyna)

przenoszone są przez plazmidy z grupy Inc18 takie jak pIP501, pAMβ1, pRE25, pSM19035 i

inne (36, 37). Plazmidy te mają szerokie spektrum gospodarzy i ulegają replikacji w różnych

bakteriach Gram-dodatnich o niskiej zawartości par G+C w genomach, a niektóre z

plazmidów tej grupy to plazmidy koniugacyjne. Bakterie niosące plazmidy z grupy Inc18

izolowane były i nadal są izolowane ze środowisk szpitalnych, ale także z ferm zwierząt i od

pracowników tychże ferm (37–39). Co ciekawe, plazmidy tej grupy biorą udział w

przekazywaniu oporności na wankomycynę do Staphylococcus aureus: gen vanA na

transpozonie Tn1546 został najprawdopodobniej przekazany do opornych na metycylinę S.

aureus (MRSA) przez oporne na wankomycynę enterokoki, Enterococcus faecalis i

Enterococcus faecium (VRE) (40, 41). W szczepach VRE Tn1546 znajduje się właśnie na

plazmidach z rodziny Inc18 (36, 42, 43). Przy tym należy podkreślić, że wankomycyna należy

do antybiotyków ostatniej szansy i jest stosowana w leczeniu zakażeń powodowanych przez

MRSA, VRE czy pneumokoki oporne na penicyliny. W ostatnich latach (2013-2016), na

świecie obserwuje się wzrost odsetka inwazyjnych (izolowanych z krwi, płynu mózgowo-

rdzeniowego czy fizjologicznie jałowych części ciała) szczepów enterokoków opornych na

wankomycynę (9).

Problem oporności bakterii istotnych klinicznie na antybiotyki pogłębia się. Od czasu

odkrycia TEM-1, pierwszej β-laktamazy, opisano ponad 1300 wariantów β-laktamaz, w tym

167 wariantów β-laktamaz z rodziny TEM (http://www.mbled.uni-stuttgart.de/), pojawiły się

też β-laktamazy kilkudziesięciu innych rodzin, niektóre w licznych wariantach, z których

najpowszechniejsze to rodziny SHV, CTX-M, KPC, NDM, które, oprócz sekwencji


7

aminokwasowej, różnią się przede wszystkim spektrum hydrolizowanych grup antybiotyków

β-laktamowych (44). β-laktamazy zdolne do hydrolizy penicylin, cefalosporyn i

monobaktamów, czyli wszystkich antybiotyków β-laktamowych z wyjątkiem cefamycyn i

karbapenemów, takie jak np. β-laktamazy z rodziny CTX-M, zaliczane są do enzymów o

rozszerzonym spektrum (ESBL ang. extended spectrum β-lactamase). Geny kodujące EBSL,

ale także obserwowane od 2009 roku coraz częściej geny karbapenemaz, KPC czy metalo-β-

laktamazy NDM-1, znajdowane są na plazmidach należących do różnych grup niezgodności –

o szerokim spektrum gospodarzy jak plazmidy z grupy IncA/C, lub o wąskim spektrum – jak

te IncF, IncL/M, IncN czy IncI1 (45, 46). Przy tym najczęściej izolowanym na świecie jest

plazmid IncF z genem blaCTX-M-15 przenoszony przez wirulentny szczep E. coli O25:H4-ST131

(27, 47). Jak dotąd, wytwarzanie ESBL jest najistotniejszym klinicznie i najpowszechniejszym

mechanizmem oporności bakterii z rodziny Enterobacteriaceae (48).

Największym zagrożeniem są szczepy wielolekooporne (MDR, ang. multidrug

resistant) niosące geny oporności na kilka grup antybiotyków jednocześnie, szczególnie te,

kodowane w plazmidach koniugacyjnych (1). Na przykład, często producenci NDM-1 są

oporni na praktycznie wszystkie dostępne w lecznictwie antybiotyki, bo chociaż gen blaNDM-1

nadaje oporność na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, z wyjątkiem aztreonamu, to jednak

często występuje w towarzystwie genów innych determinant oporności, kodujących ESBL,

czy inne karbapenemazy, a także genów kodujących oporność na aminoglikozydy i inne

grupy chemioterapeutyków (49). W przypadku zakażeń wywołanych przez przedstawicieli

Enterobacteriaceae wytwarzających NDM-1 czy karbapenemazy lekiem ostatniej szansy jest

kolistyna, od 2011 roku w związku z wykryciem w Chinach, na fermie świń szczepu E. coli

niosącej plazmid z genem mcr-1, i rozprzestrzenianiem się plazmidów z tym genem w wielu

krajach, sytuacja stała się dramatyczna (50, 51).

Od początku prowadzenia badań nad opornością bakterii na antybiotyki jeden z

nurtów dotyczył czynników R (ang. resistance), czyli plazmidów które przenoszą geny

oporności na antybiotyki, biologia tych plazmidów szybko stała się gorącym tematem dla

mikrobiologów.

Plazmid pSM19035 (28 975 par zasad) z grupy Inc18, był jednym z pierwszych

plazmidów wyizolowanych z paciorkowców Streptococcus pyogenes (szczep 19035)

opornych na erytromycynę, wykazujących oporność typu MLSB. Plazmid ten był obiektem

zainteresowań badawczych mojego mentora, dr. hab. Piotra Cegłowskiego, w czasie gdy

dołączyłam do jego grupy i zainteresowałam się plazmidami. pSM19035 jest ciekawy

strukturalnie i sprawia wrażenie przyłapanego w trakcie ewolucji: plazmid w 80% składa się z

długich odcinków, które są odwróconymi powtórzeniami i kodują geny zaangażowane m. in.

w replikację i stabilne dziedziczenie, w jednym z unikalnych rejonów znajduje się gen ermB,

natomiast sekwencja drugiego była nieznana. Prace dotyczące biologii plazmidu prowadzone

były na spontanicznie uzyskanej, stabilnej pochodnej pSM19035 - plazmidzie pDB101 oraz

jego kolejnych pochodnych pBT233, zawierających tylko jeden z powtórzonych odcinków

(52, 53). Ustaliłam sekwencję nukleotydową tej unikalnej części plazmidu pSM19035 i

złożyłam pełną sekwencję plazmidu (GenBank AY357120.1). Stwierdziłam, że operon


8

koniugacyjny jest niekompletny – zawiera 10 z 15 genów znajdowanych w koniugacyjnych

plazmidach Inc18 (pIP501 i pAMβ1), nie zawiera nawet sekwencji oriT, pSM19035 nie jest

zatem plazmidem mobilizowalnym. Plazmid pSM19035 niesie systemy stabilizacyjne o

nietypowej strukturze: gen ω, kodujący białko wiążące DNA, element systemu partycyjnego

δ-ω, znajduje się w oddzielnej jednostce transkrypcyjnej niż gen δ, ale we wspólnym

operonie z genami ε i ζ, kodującymi system toksyna-antidotum (systemu TA) (54, 55).

Toksyna Zeta, produkt genu ζ, działa bakteriostatycznie na komórki bakterii Gram-ujemnych i

bakteriobójczo na komórki bakterii Gram-dodatnich z typu Firmicutes (56), ale mechanizm

takiego działania był nieznany, ani wymodelowana wówczas struktura tej toksyny nie

przypominała żadnej ze znanych.

Na podstawie wiedzy dotyczącej działania znanych systemów TA, została postawiona

hipoteza, że komórki Bacillus subtilis z genem ζ wprowadzonym do chromosomu pod

kontrolą promotora ksylozowego, które przeżyją indukcję produkcji toksyny, i w których

sekwencja genu ζ i promotora będzie niezmieniona, będę niosły mutację w genie, którego

produkt jest albo celem dla toksyny, albo jest zaangażowany w działanie tej toksyny. Przy

tym powstało założenie, że mutacje, możliwe do otrzymania w obrębie genu ζ, będą

dotyczyły rejonów, które są najistotniejsze w jej toksycznym działaniu. Znalezienie białek

komórkowych, które oddziałują z toksyną dałoby szansę na zidentyfikowanie nowego,

ważnego etapu procesu fizjologicznego komórki bakteryjnej, innego, niż te znane dotąd,

który mógłby posłużyć jako cel dla opracowania nowej terapii przeciwbakteryjnej – byłaby to

odpowiedź na problem narastającej oporności bakterii na antybiotyki. Wyniki badań zostały

przedstawione w pracy Nowakowska i wsp., 2005, poz. 6 (57). Wśród przeanalizowanych

kilkuset mutantów B. subtilis, które przeżywają indukcję produkcji toksyny Zeta nie było

mutanta, który miałby nieuszkodzony gen ζ. Wszystkie mutacje lokowały się w części 5’ genu

ζ, stąd został wysnuty wniosek o istotności końca aminowego dla toksyczności białka Zeta.

Przy tym jeden z uzyskanych mutantów (mutacja w genie ζ A248G powodująca w białku

substytucję Y83C) produkował toksynę Zeta o istotnie obniżonej toksyczności i na takim

właśnie zostały przeprowadzone badania dotyczące działania systemu Epsilon-Zeta (58).

Coraz mniejsza skuteczność terapii przeciwbakteryjnych, związana z narastającą

opornością na chemioterapeutyki w szczepach o pochodzeniu klinicznym zainteresował

wielu mikrobiologów, także mnie samą, problemem znaczenia plazmidów dla bakterii. W

1999 roku została utworzona grupa badawcza, której zainteresowania dotyczyły różnych

aspektów biologii plazmidów, kierownikiem jej był dr. hab. Piotr Cegłowski. We współpracy z

prof. Walerią Hryniewicz i dr. Markiem Gniadkowskim z Zakładu Epidemiologii i Mikrobiologii

Klinicznej Narodowego Instytutu Leków, zostały wybrane szczepy bakterii z rodziny

Enterobacteriaceae produkujące ESBL kodowane na plazmidach, a pochodzące z epidemii

szpitalnych o nietypowym obrazie. Po przedwczesnej śmierci mojego mentora w 2004,

badania grupy genomiki plazmidowej były pod moim kierownictwem kontynuowane i

rozszerzone. Plazmidy p1657/98 i pCTX-M3, zostały przez nas zsekwencjonowane i opisane

(59 - praca Zienkiewicz i wsp., 2007, poz. 4; 60 - praca Gołębiewski i wsp., 2007, poz. 5), a

biologia każdego z plazmidów analizowana w kolejnych publikacjach (61 - praca Zienkiewicz i


9

wsp., 2013, poz. 3; 62 - praca Dmowski i wsp., 2018, poz. 1), które zostały włączone do

niniejszego cyklu publikacji i zostaną omówione poniżej.

Plazmid p1658/97 został wyizolowany z jednego z 12 szczepów E. coli wytwarzających

ESBL z rodziny SHV, zebranych w czasie epidemii szpitalnej w 1997 roku. Ciekawym było to,

że wśród tych 12 wyizolowanych szczepów, w tym dwóch pochodzących od jednego

pacjenta, można było wyróżnić dwie grupy: „oporną” i „wrażliwą”, różniące się poziomem

oporności na antybiotyki β-laktamowe, ale o takiej samej wrażliwości na różne antybiotyki

aminoglikozydowe. Jednocześnie analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

RLFP (ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) przeprowadzona przy użyciu enzymu

XbaI, wykazała niemal identyczność całkowitego DNA obu grup, z wyjątkiem pojedynczego

prążka. Przy tym wykazano, że w grupie „opornej” poziom mRNA genu blaSHV jest znacznie

wyższy niż w grupie „wrażliwej” i, że jest to wynikiem zwiększenia się liczby kopii blaSHV (63).

Sekwencja plazmidu p1658/97, należącego do grupy „wrażliwej” została ustalona, a jego

struktura przeanalizowana i opisana w pracy Zienkiewicz i wsp., 2007, poz. 4 (59). Jest to

plazmid koniugacyjny o wielkości 125 491 par zasad, niesie dwa sprawne systemy

replikacyjne, FII i FIB. W swojej sekwencji zawiera integron, którego geny oporności

pokrywają spektrum klinicznie stosowanych antybiotyków aminoglikozydowych, przy tym

kodowana przez gen blaSHV β-laktamaza to wariant SHV-5, który hydrolizuje zdecydowaną

większość antybiotyków β-laktamowych, w tym nowsze cefalosporyny i monobaktamy. Na

podstawie analizy sekwencji nukleotydowej została zaproponowana historia powstania

p1658/97, jako plazmidu, który w swojej strukturze jest mozaiką plazmidów z grupy IncF,

takich jak F czy R100, a w części poza szkieletem plazmidowym, także plazmidów z grupy

IncM (takich jak pSEM czy pACM1) oraz z grupy IncI1 (plazmid R64). Gen blaSHV-5 znajduje się

w otoczeniu genów, które naturalnie występują w chromosomie Klebsiella pneumoniae, a

ten segment jest w plazmidzie ograniczony dwiema sekwencjami IS26; wielkość całego

segmentu (wliczając jedną sekwencję IS26) to 8817 par zasad. Sekwencje IS26

prawdopodobnie wzięły udział w zmobilizowaniu tego fragmentu z chromosomu K.

pneumoniae. Cały ten segment okazał się ulegać tandemowej multiplikacji, zwiększając

liczbę kopii do ponad 10, czyli powiększając długość plazmidu o prawie 100 tys. par zasad, a

proces ten zachodził niezależnie od genu recA gospodarza plazmidu (61, praca Zienkiewicz i

wsp., 2013; poz. 3). Multiplikacja rejonu otoczonego IS26 (amplikonu) prowadzi do wzrostu

poziomu oporności na antybiotyki β-laktamowe, np. ceftazydym (cefalosporyna III generacji)

od 4 µg/ml do 128 µg/ml. Przy tym wysokooporne klony pojawiają się spontanicznie. Delecja

czy też insercja w obrębie amplikonu okazała się hamować multiplikację, ale delecja nawet

tylko 10% długości amplikonu, nie mogła być komplementowana in trans. Amplikon mógł

włączyć się do innego plazmidu, na drodze rekombinacji, jeżeli plazmid ten niósł sekwencję

IS26. Jednak tam nie dochodziło już do multiplikacji amplikonu, co sugerowało, że istotna

jest topologia DNA plazmidu, w który rezyduje amplikon. Zjawisko multiplikacji amplikonu

zachodzące w p1658/97 okazało się nie być unikalne: w plazmidzie pSEM z Salmonella

enterica subsp. enterica serovar Typhimurium z grupy IncM obecny jest niemal taki sam

amplikon (99% identyczności sekwencji leżącej pomiędzy kopiami IS26, a 100% identyczności


10

IS26) i on również ulega multiplikacji co także zostało wykazane w pracy Zienkiewicz i wsp.,

2013, (61). Trzeba zatem podkreślić, biorąc pod uwagę wyniki naszych badań i powszechną

obecność sekwencji IS26 w genomach Enterobacteriaceae, że zachodząca multiplikacja

rejonu zawierającego blaSHV-5 może mieć istotne znaczenie w rozprzestrzenianiu tego genu

wśród tych bakterii.

Opisany w pracy Gołębiewski i wsp., 2007, poz. 5 (60) plazmid pCTX-M3 ze szczepu

Citrobacter freundii wyizolowanego w 1996 roku, był wektorem genu blaCTX-M-3, kodującego

wówczas nowy typ ESBL, CTX-M-3. Gen blaCTX-M-3, kodowany na dużych plazmidach o

podobnym profilu RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), został znaleziony w

przedstawicielach siedmiu gatunków Enterobacteriaceae w różnych szpitalach w Polsce (64),

i szybko stał się najbardziej powszechnym wariantem kodującym ESBL w naszym kraju (65).

W innych krajach Europy, w których prowadzono monitorowanie szczepów wytwarzających

ESBL, najbardziej powszechnym wariantem, podobnie jak na całym świecie, była β-laktamaza

CTX-M-15 kodowana na plazmidzie z grupy IncF. Sekwencja pCTX-M3 została ustalona,

przeanalizowana (60 - praca Gołębiewski i wsp., 2007, poz. 5). Plazmid ten (89 468 par

zasad) należy do grupy niezgodności IncM (dawniej IncL/M) i jest plazmidem koniugacyjnym.

Geny kodujące jego system koniugacyjny są zlokalizowane w dwóch fizycznie odległych

rejonach (tra i trb), wykazują syntenię oraz 30 - 60% identyczności z genami systemu

koniugacyjnego plazmidu R64 z grupy IncI1, zatem Mpf kodowany przez te geny należy do

słabo scharakteryzowane klasy T4BSS lub do grupy MPFI. Plazmid pCTX-M3 niesie gen blaCTX-

M-3 poprzedzony sekwencją ISEcp1. Źródłem genu blaCTX-M-3 był prawdopodobnie chromosom

enterobakterii Kluyvera ascorbata, z którego został on zmobilizowany do plazmidu przez

sekwencję ISEcp1. pCTX-M3 koduje liczne geny oporności na różne klasy antybiotyków, przy

tym niektóre geny znajdują się w integronie, niesie również strukturę zawierającą gen armA,

kodujący oporność na antybiotyki aminoglikozydowe. Okazało się, że za rozprzestrzenianie

genu blaCTX-M-3 odpowiedzialne są plazmidy podobne do pCTX-M3: z grupy IncM, zawierające

geny systemu koniugacyjnego, nawet jeśli dany plazmid utracił zdolność do transferu (60-

praca Gołębiewski i wsp., 2007, poz. 5). Interesującym jest fakt, że w przedstawicielach

Enterobacteriaceae wykryto plazmidy pokrewne, a ich analiza może wskazywać na drogę

ewolucji prowadząca do powstania pCTX-M3: pEL60 z Erwinia amylovora z Libanu, który

składa się wyłącznie ze szkieletu plazmidowego pCTX-M3, tzn. replikonu, genów systemów

stabilizujących i systemu koniugacyjnego, i nie zawiera genów oporności, oraz plazmid pCTX-

M360 z Klebsiella pneumoniae wyizolowanego w Chinach, który poza szkieletem

plazmidowym, niesie również strukturę ISEcp1 z genem blaCTX-M-3. Warto przy tym zaznaczyć,

że w Hongkongu ze szczepu E. coli wyizolowano plazmid pNDM-HK, który jest niemal

identyczny z pCTX-M3, ale w miejscu integronu zawiera gen blaNDM-1, kodujący metalo-β-

laktamazę NDM-1. Wyniki badań struktury plazmidu pCTX-M3, wskazują, że powstanie

rejonu, który rozdziela geny tra i trb, a zawierającego replikon oraz wszystkie, poza

wspomnianymi ISEcp1 i blaCTX-M-3, sekwencje insercyjne i transpozony, jak również ich

pozostałości oraz wszystkie geny oporności niesione przez ten plazmid, zapoczątkowała

integracja Tn1/Tn3, który wniósł blaTEM-1, tuż obok replikonu.


11

Biorąc pod uwagę przynależność systemu koniugacyjnego pCTX-M3 do słabiej

scharakteryzowanej grupy T4BSS można było zadać pytanie, czy wszystkie geny rejonów tra i

trb są istotne dla transferu koniugacyjnego lub do mobilizacji z udziałem pCTX-M3. Zostały

przygotowane plazmidy niosące mutacje w kolejnych genach transferu koniugacyjnego, oraz

w jego rejonie wiodącym (czyli tym, który wchodzi do komórek biorcy jako pierwszy),

przeanalizowano ich zdolność do transferu koniugacyjnego i przeprowadzono

komplementacja tych mutacji, co przedstawione zostało w pracy Dmowski i wsp., 2018, poz.

1 (62). Okazało się, że w pCTX-M3 wszystkie geny kodujące Mpf są niezbędne, co odróżnia

ten system koniugacji od tego z plazmidów ze wspomnianej grupy IncI1, gdzie inaktywacja

niektórych genów prowadzi jedynie do obniżenia wydajności koniugacji. Sugeruje to różnice

w budowie i funkcjonowaniu systemów Mpf, kodowanych przez te plazmidy. Jedynie delecja

trzech genów: orf35 z rejonu wiodącego, orf36 z rejonu tra lub orf46 z rejonu trb nie

wpływała na wydajność transferu koniugacyjnego badanych pochodnych plazmidu pCTX-M3.

Jednocześnie, delecja orf35 lub orf36 prowadziła do wzrostu wydajności mobilizacji

plazmidów mobilizowalnych. Przy czym delecja orf35 skutkowała zwiększeniem poziomu

transkrypcji genów zlokalizowanych w rejonie tra - nikA, nikB, traH i przypuszczalnie

kolejnych genów operonu. Delecja orf36 prowadziła do wzrostu poziomu transkrypcji genu

traH i genów położonych dalej, a nie wpływała na poziom transkrypcji genów nikA i nikB.

Warto podkreślić, że w sekwencji aminokwasowej przewidzianych produktów genów orf35 i

orf36 nie odnajduje się motywów podobnych do znanych motywów wiązania DNA, stąd

mechanizm takiej regulacji jest nieznany i jest on przedmiotem dalszych badań. Co ciekawe,

rodzaj gospodarzy, w których plazmid pCTX-M3 ulega replikacji i tych do których jego system

transferu koniugacyjnego może wprowadzić plazmid mobilizowalny różnią się. Zakres

gospodarzy dla replikonu jest ograniczony do przedstawicieli Enterobacteriaceae, natomiast

zakres biorców w transferze koniugacyjnym obejmuje przedstawicieli Alfa-, Beta- i

Gammaproteobacteria (62 - Dmowski i wsp., 2018, poz. 1). Plazmidy koniugacyjne, które

przejściowo, w trakcie koniugacji, generują ssDNA, indukują odpowiedź SOS i homologiczną

rekombinację oraz indukują produkcję integrazy, prowadząc do rearanżacji DNA. Postuluję

zatem, że plazmidy koniugacyjne, kodujące Mpf o szerokim spektrum gospodarza, takie jak

pCTX-M3, które nie kodują systemów anty-SOS, ale niosą geny integraz np. w integronach,

mogą mieć większe znaczenie w populacji bakterii, niż wcześniej podejrzewano. Badanie

regulacji ekspresji genów i oddziaływań białek systemu koniugacyjnego plazmidu pCTX-M3

jest przeze mnie kontynuowane, i może rozszerzyć wiedzę dotyczącą funkcjonowania

systemów sekrecji typuT4BSS.

Jednocześnie na podstawie zdobytej wiedzy, dotyczącej mobilizacji w obecności

pCTX-M3 z mutacją w orf35 jako plazmidu pomocniczego, został skonstruowany szczep S14,

który jest szczepem pomocniczym do mobilizacji plazmidów i który jest przedmiotem

zgłoszenia patentowego do UPRP nr PL400718.

W roku 2013 nawiązałam współpracę z dr. Dariuszem Wasylem z Państwowego

Instytutu Weterynaryjnego (PIWet-PIB), który w ramach projektu monitorowania szczepów

Salmonella opornych na cefalosporyny III generacji (wg kryteriów WHO, krytycznie ważne


12

patogeny), analizował kolekcję szczepów MDR Salmonella enterica subsp. enterica serovar

Kentucky wyizolowanych w Polsce w 2009 na fermach indyków. Wyizolowane S. Kentucky

należały do epidemicznego szczepu ST198, który jest oporny na fluorochinolony. Szczep S.

Kentucky ST198 niesie wariant wyspy patogenności SGI1, zawierającą integron klasy I, a w

mobilności tej wyspy biorą udział plazmidy z grupy IncA/C, mające szerokie spektrum

gospodarza. Zajęłam się analizą plazmidów niesionych przez te szczepy. Po pierwsze,

przeprowadziłam typowanie replikonów plazmidowych metodą PBRT. Wykryłam, że poza

plazmidami z grupy IncI1, typowymi dla bakterii z rodzaju Salmonella, w jednym z badanych

szczepów obecny był plazmid z grupy IncA/C, co zostało przedstawione w pracy Wasyl i

wsp., 2015, poz. 2 (66). Plazmid ten, p1643_10, został zsekwencjonowany, a jego struktura

przeanalizowana. Plazmid ma wielkość 167 779 par zasad, jest plazmidem koniugacyjnym i

75% jego sekwencji, szkielet plazmidu i kilka dodatkowych genów, ma strukturę identyczną

do opisanego plazmidu pTC2 z Providentia stuartii. Część różna to rejon ok. 40 tys. par zasad

o mozaikowej budowie. Analiza struktury tej części wskazuje na złożony przebieg procesu

ewolucji prowadzącego do powstania p1643_10, w tej części grupują się wszystkie geny

oporności na środki przeciwbakteryjne oraz wszystkie sekwencje insercyjne, transpozony i

ich pozostałości, niesione przez p1643_10. W plazmidzie odkryłam integron nowego typu,

zawierający kasetę blaOXA-21, oraz liczne kasety oporności, pokrywające całe spektrum

klinicznie stosowanych antybiotyków aminoglikozydowych. Plazmid p1643_10 niesie

niespotykany wcześniej ani w S. Kentucky, ani w plazmidach z grupy IncA/C, ani nigdy dotąd

w Polsce gen blaCTX-M-25, kodujący ESBL. W czasie ponownej inspekcji, przeprowadzonej po

kilku miesiącach na fermie, z której pobrane były próby w których znaleziono S. Kentucky,

żaden komensalny szczep E. coli wytwarzający CTX-M-25 nie został wyizolowany, co

sugeruje, że obecność p1643_10 w komórkach nie dawała bakteriom przewagi selekcyjnej.

Podsumowując, do moich osiągnięć należy:

1/ wykazanie, że dla toksyczności białka Zeta, toksyny systemu toksyna-antidotum

plazmidu pSM19035, jest istotny jego koniec aminowy,

2/ wykazanie zmienności strukturalnej plazmidu p1658/97 polegającej na multiplikacji

regionu zawierającego gen blaSHV-5 i scharakteryzowanie natury multiplikacji amplikonu

zawierającego gen blaSHV-5,

3/ wykazanie, że multiplikacja amplikonu zawierającego gen blaSHV-5 może być zjawiskiem

bardziej powszechnym niż pierwotnie przypuszczano, ponieważ wykazano, że zachodzi nie

tylko w plazmidzie p1658/97, ale także np. w plazmidzie pSEM z grupy IncM,

4/ wykazanie, że zjawisko multiplikacji amplikonu zawierającego gen blaSHV-5 może mieć

istotne znaczenie w rozprzestrzenianiu genu blaSHV-5, w oparciu o obserwację, że amplikon

może ulegać przeniesieniu do innych plazmidów niosących IS26,


13

5/ wykazanie, że plazmid pCTX-M3 i jego pochodne pełniły najistotniejszą rolę w

rozprzestrzenianiu genu blaCTX-M-3 wśród przedstawicieli Enterobacteriaceae, pochodzących

z zakażeń szpitalnych w Polsce od 1996,

6/ odkrycie regulatorów ekspresji genów tra systemu koniugacyjnego plazmidu pCTX-M3 z

grupy IncM, należącego do słabo scharakteryzowanej grupy T4BSS, oraz odkrycie, że

delecja tych regulatorów, genów orf35 i orf36, w plazmidzie pomocniczym zwiększa

wydajność mobilizacji plazmidów mobilizowalnych,

7/ odkrycie dla plazmidu pCTX-M3 różnicy w zakresie gospodarza pomiędzy systemem jego

replikacji – ulega replikacji tylko w przedstawicielach Enterobacteriaceae, a systemem

transferu koniugacyjnego – biorcami w koniugacji mogą być przedstawiciele Alfa-, Beta- i

Gammproteobacteria,

8/ odkrycie po raz pierwszy, i jak dotąd jedyny, genu blaCTX-M-25 w plazmidzie z grupy

IncA/C, po raz pierwszy tego genu w Salmonella Kentucky, a także po raz pierwszy w

Polsce, w wyniku analizy struktury i charakterystyki koniugacyjnego plazmidu p1643_10

pochodzącego z S. Kentucky.

Piśmiennictwo

1. Knols BG, Smallegange RC, Tacconelli E, Magrini N, Kahlmeter G, Singh N. 2016. Global Priority list of

antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. Lancet

Infect Dis 9:535–536.

2. O’Neill J. 2016. Tackling drug-resistant infections globally: the final report and recommendations. The

Review on Antimicrobial Resistance. https://amr-review.org/Publications.html

3. Shintani M, Sanchez ZK, Kimbara K. 2015. Genomics of microbial plasmids: classification and

identification based on replication and transfer systems and host taxonomy. Front Microbiol 6:242.

4. Wang H, Peng N, Shah SA, Huang L, She Q. 2015. Archaeal extrachromosomal genetic elements.

Microbiol Mol Biol Rev 79:117-152.

5. Galibert F, Finan TM, Long SR, Puhler A, Abola P, Ampe F, et al. 2001. The composite genome of the

legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science 293: 668–672.

6. Griffiths AJF. 1995. Natural plasmids of filamentous fungi. Microbiol Rev 59:673-85.

7. Gualberto JM, Mileshina D, Wallet C, Khan Niazi A, Weber-Lotfi F, Dietrich A. 2014. The plant

mitochondrial genome: dynamics and maintenance. Biochimie 100:107–120.

8. European Centre for Disease Prevention and Control. 2016. SURVEILLANCE REPORT. Surveillance of

antimicrobial resistance in Europe 2016.

9. Carattoli A. 2008. Animal reservoirs for extended spectrum β-lactamase producers. Clin Microbiol

Infect.14 Suppl 1:117–123.

10. Stewart PE, Byram R, Grimm D, Tilly K, Rosa PA. 2005. The plasmids of Borrelia burgdorferi: essential

genetic elements of a pathogen. Plasmid. 53:1-13.

11. Medema MH, Trefzer A, Kovalchuk A, Van Den Berg M, Mü Ller U, Heijne W, Wu L, Alam MT, Ronning


14

CM, Nierman WC, Bovenberg RAL, Breitling R, Takano E. 2010. The sequence of a 1.8-mb bacterial

linear plasmid reveals a rich evolutionary reservoir of secondary metabolic pathways. Genome Biol

Evol. 2:212-224.

12. Del Solar G, Espinosa M. 2002. Plasmid copy number control: an ever-growing story. Mol Microbiol

37:492–500.

13. Nordström K. 2006. Plasmid R1-Replication and its control. Plasmid 55:1-26.

14. Sengupta M, Austin S. 2011. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the

virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infect Immun 79:2502–2509.

15. Hayes F. 2003. The function and organization of plasmids. Methods Mol Biol 235:1–17.

16. Ebersbach G, Gerdes K. 2005. Plasmid segregation mechanisms. Annu Rev Genet 39:453–479.

17. Hayes F. 2003. Toxins-antitoxins: plasmid maintenance, programmed cell death, and cell cycle arrest.

Science 301:1496–1499.

18. Tiffert Y, Go B, Reuther J, Wohlleben W. 2007. Conjugative DNA transfer in Streptomyces: SpdB2

involved in the intramycelial spreading of plasmid pSVH1 is an oligomeric integral membrane protein

that binds to dsDNA. Microbiology 153:2976–2983.

19. Wallden K, Rivera-Calzada A, Waksman G. 2010. Type IV secretion systems: versatility and diversity in

function. Cell Microbiol 12:1203–1212.

20. Koraimann G, Wagner MA. 2014. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Front

Cell Infect Microbiol 4:54. doi: 10.3389/fcimb.2014.00054

21. Guglielmini J, Bertrand N, Abby SS, Garcillan-Barcia MP, de la Cruz F, Rocha EP. 2014. Key components

of the eight classes of type IV secretion systems involved in bacterial conjugation or protein secretion.

Nucleic Acids Res 42:5715–5727.

22. Ramsay JP, Firth N. 2017. Diverse mobilization strategies facilitate transfer of non-conjugative mobile

genetic elements. Curr Opin Microbiol 38:1–9.

23. Douard G, Praud K, Cloeckaert A, Doublet B. 2010. The Salmonella genomic island 1 is specifically

mobilized in trans by the IncA/C multidrug resistance plasmid family. PLoS One 5:e15302.

24. Waldor MK. 2010. Mobilizable genomic islands: going mobile with oriT mimicry. Mol Microbiol 78: 537-

540.

25. Thomas CM. 2000. Paradigms of plasmid organization. Mol Microbiol 37:485–491.

26. Carattoli A. 2009. Resistance plasmid families in Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother

53:2227–2238.

27. Villa L, García-Fernández A, Fortini D, Carattoli A. 2010. Replicon sequence typing of IncF plasmids

carrying virulence and resistance determinants. J Antimicrob Chemother 65:2518–2529.

28. Croxen MA, Finlay BB. 2010. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nat Rev

Microbiol 8:26–38.

29. Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2008. Genetic support of extended-spectrum β-lactamases. Clin

Microbiol Infect 14 Suppl 1: 75-81.

30. Mazel D. 2006. Integrons: agents of bacterial evolution. Nat Rev Microbiol 4:608–620.

31. Escudero JA, Loot C, Nivina A, Mazel D. 2014. The Integron: adaptation an demand. Microbiol

Spectrum 3:MDNA3-0019-2014.

32. Davies J. 1995. Vicious Circles: Looking Back on Resistance Plasmids.Genetics 139:1465-1468.

33. Watanabe T, Fukasawa T. 1961. Episome-mediated transfer of drug resistance in Enterobacteriaceae.

I. Transfer of resistance factors by conjugation. J Bacteriol 81:669-678.

34. Davies MR, Shera J, Van Domselaar GH, Sriprakash KS, McMillan DJ. 2009. A novel integrative

conjugative element mediates genetic transfer from group G Streptococcus to other β-hemolytic

Streptococci. J Bacteriol 191:2257-2265.


15

35. Werner G, Coque TM, Franz CM a P, Grohmann E, Hegstad K, Jensen L, van Schaik W, Weaver K. 2013.

Antibiotic resistant enterococci-tales of a drug resistance gene trafficker. Int J Med Microbiol 303:360–

379.

36. Kohler V, Vaishampayan A, Grohmann E. 2018. Broad-host-range Inc18 plasmids: occurrence, spread

and transfer mechanisms. Plasmid.In Press

37. Johnsen PJ, Østerhus JI, Sletvold H, Sørum M, Kruse H, Nielsen K, Simonsen GS, Sundsfjord A. 2005.

Persistence of animal and human glycopeptide-resistant Enterococci on two Norwegian poultry farms

formerly exposed to avoparcin is associated with a widespread plasmid-mediated vanA element within

a polyclonal Enterococcus faecium population. Appl Environ Microbiol 71:159–168.

38. Sletvold H, Johnsen PJ, Hamre I, Simonsen GS, Sundsfjord A, Nielsen KM. 2008. Complete sequence

of Enterococcus faecium pVEF3 and the detection of an omega-epsilon-zeta toxin-antitoxin module and

an ABC transporter. Plasmid 60:75–85.

39. Zhu W, Murray PR, Charles Huskins W, Jernigan JA, Mcdonald LC, Clark NC, Anderson KF, Mcdougal

LK, Hageman JC, Olsen-Rasmussen M, Frace M, Alangaden GJ, Chenoweth C, Zervos MJ, Robinson-

Dunn B, Schreckenberger PC, Reller LB, Rudrik JT, Patel JB. 2010. Dissemination of an Enterococcus

Inc18-like vanA plasmid associated with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob

Agents Chemother 54:4314–4320.

40. Icgen B. 2016. Van A-Type MRSA (VRSA) Emerged in Surface Waters. Bull Env Contam Toxicol 97:359–

366.

41. Rosvoll TCS, Pedersen T, Sletvold H, Johnsen PJ, Sollid JE, Simonsen GS, Jensen LB, Nielsen KM,

Sundsfjord A. 2010. PCR-based plasmid typing in Enterococcus faecium strains reveals widely

distributed pRE25-, pRUM-, pIP501- and pHTβ-related replicons associated with glycopeptide resistance

and stabilizing toxin-antitoxin systems. FEMS Immunol Med Microbiol 58:254–268.

42. Schwarz F V, Perreten V, Teuber M. 2001. Sequence of the 50-kb conjugative multiresistance plasmid

pRE25 from Enterococcus faecalis RE25. Plasmid 46:170–187.

43. Liu YY, Wang Y, Walsh TR, Yi LX, Zhang R, Spencer J, Doi Y, Tian G, Dong B, Huang X, Yu LF, Gu D, Ren

H, Chen X, Lv L, He D, Zhou H, Liang Z, Liu JH, Shen J. 2016. Emergence of plasmid-mediated colistin

resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: A microbiological and molecular

biological study. Lancet Infect Dis 16:161-168.

44. Bush K, Jacoby G. 2010. Updated functional classification of β-lactamases. Antimicrob Agents

Chemother 54:969–976.

45. Baraniak A, Izdebski R, Herda M, Fiett J, Hryniewicz W, Gniadkowski M, Kern-Zdanowicz I, Filczak K,

Łopaciuk U. 2009. Emergence of Klebsiella pneumoniae ST258 with KPC-2 in Poland. Antimicrob Agents

Chemother 53:4565–4567.

46. Hrabák J, Empel J, Bergerová T, Fajfrlík K, Urbásková P, Kern-Zdanowicz I, Hryniewicz W, Gniadkowski

M. 2009. International clones of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli with extended-spectrum β-

lactamases in a Czech hospital. J Clin Microbiol 47:3353–3357.

47. Carattoli A. 2013. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol 303:298–304.

48. Livermore DM, Canton R, Gniadkowski M, Nordmann P, Rossolini GM, Arlet G, Ayala J, Coque TM,

Kern-Zdanowicz I, Luzzaro F, Poirel L, Woodford N. 2007. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe.

J Antimicrob Chemother 59:165–174.

49. Poirel L, Ros A, Carricajo A, Berthelot P, Pozzetto B, Bernabeu S, Nordmann P. 2011. Extremely drug-

resistant Citrobacter freundii isolate producing NDM-1 and other carbapenemases identified in a

patient returning from India. Antimicrob Agents Chemother 55:447–448.

50. Zurfluh K, Nüesch-Inderbinen M, Klumpp J, Poirel L, Nordmann P, Stephan R. 2017. Key features of

mcr-1-bearing plasmids from Escherichia coli isolated from humans and food. Antimicrob Resist Infect

Control. 6:91. doi: 10.1186/s13756-017-0250-8.


16

51. Ceglowski P, Boitsov A, Karamyan N, Chai S, Alonso JC. 1993. Characterization of the effectors

required for stable inheritance of Streptococcus pyogenes pSM19035-derived plasmids in Bacillus

subtilis. Mol Gen Genet 241:579–585.

52. Cegłowski P, Alonso JC. 1994. Gene organization of the Streptococcus pyogenes plasmid pDB101:

sequence analysis of the orfη-copS region. Gene 145:33–39.

53. Dmowski M, Jagura-Burdzy G. 2011. Mapping of the interactions between partition proteins Delta and

Omega of plasmid pSM19035 from Streptococcus pyogenes. Microbiology 157:1009–1020.

54. Zielenkiewicz U, Ceglowski P. 2005. The toxin-antitoxin system of the streptococcal plasmid

pSM19035. J Bacteriol 187:6094–6105.

55. Brzozowska I, Brzozowska K, Zielenkiewicz U. 2012. Functioning of the TA cassette of streptococcal

plasmid pSM19035 in various Gram-positive bacteria. Plasmid 68:51–60.

56. Nowakowska B, Kern-Zdanowicz I, Zielenkiewicz U, Cegłowski P. 2005. Characterization of Bacillus

subtilis clones surviving overproduction of Zeta , a pSM19035 plasmid-encoded toxin. Acta Biochim

Polon 52:99–107.

57. Lioy VS, Martín MT, Camacho AG, Lurz R, Antelmann H, Hecker M, Hitchin E, Ridge Y, Wells JM,

Alonso JC. 2006. pSM19035-encoded zeta toxin induces stasis followed by death in a subpopulation of

cells. Microbiology 152:2365–2379.

58. Zienkiewicz M, Kern-Zdanowicz I, Gołębiewski M, Żylińska J, Mieczkowski P, Gniadkowski M,

Bardowski J, Cegłowski P. 2007. Mosaic Structure of p1658/97, a 125-Kilobase Plasmid Harboring an

Active Amplicon with the Extended-Spectrum- β-Lactamase Gene blaSHV-5. Antimicrob Agents

Chemother 51:1164–1171.

59. Gołębiewski M, Kern-Zdanowicz I, Zienkiewicz M, Adamczyk M, Żylińska J, Baraniak A, Gniadkowski

M, Bardowski J, Cegłowski P. 2007. Complete nucleotide sequence of the pCTX-M3 plasmid and its

involvement in spread of the extended-spectrum β-lactamase gene blaCTX-M-3. Antimicrob Agents

Chemother 51:3789–3795.

60. Zienkiewicz M, Kern-Zdanowicz I, Carattoli A, Gniadkowski M, Cegłowski P. 2013. Tandem

multiplication of the IS26-flanked amplicon with the blaSHV-5 gene within plasmid p1658/97. FEMS

Microbiol Lett 341:27–36.

61. Dmowski M, Gołębiewski M, Kern-Zdanowicz I. 2018. Characteristics of the conjugative transfer

system of the IncM plasmid pCTX-M3 and identification of its putative regulators. J Bacteriol 200 (18):

e00234-18

62. Pałucha A, Mikiewicz B, Gniadkowski M. 1999. Diversification of Escherichia coli expressing an SHV-

type extended-spectrum β-lactamase (ESBL) during a hospital outbreak: emergence of an ESBL-

hyperproducing strain resistant to expanded-spectrum cephalosporins Antimicrob Agents Chemother

43:393–396.

63. Baraniak A, Fiett J, Sulikowska A, Hryniewicz W, Gniadkowski M. 2002. Countrywide spread of CTX-M-

3 extended-spectrum β-lactamase-producing microorganisms of the family Enterobacteriaceae in

Poland. Antimicrob Agents Chemother 46:151–159.

64. Empel J, Baraniak A, Literacka E, Mrówka A, Fiett J, Sadowy E, Hryniewicz W, Gniadkowski M. 2008.

Molecular survey of β-lactamases conferring resistance to newer β-lactams in Enterobacteriaceae

isolates from Polish hospitals. Antimicrob Agents Chemother 52:2449–2454.

65. Wasyl D, Kern-Zdanowicz I, Domańska-Blicharz K, Zając M, Hoszowski A. 2014. High-level

fluoroquinolone resistant Salmonella enterica serovar Kentucky ST198 epidemic clone with IncA/C

conjugative plasmid carrying blaCTX-M-25 gene. Vet Microbiol. 175:85–91.

Documents

Izabela Kern-Zdanowicz Struktura, rozprzestrzenianie i ewolucja ...‚ącznik nr 2... · Znajduje się je również w komórkach eukariontów – w mitochondriach i w cytoplazmie