izolare penicilina

8/13/2019 izolare penicilina

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Vo l . 8 PR EPA R ATI O N OF PENICILLIN

t r a t e s o f p e n i c i l l i nf r o m t h e m et abo l i s m s o l u t i o np r o d u c e db y t h e g r o w t ho f P . notum, a n d s ho we dt h a t t h e p r o d u c twas o f v a l u e i n t h e t r e a t m e n t o fc e r t a i n i n f e c t i v e c o n d i t i o n s .T h e s ep a p e r s a l s o d e -s c r i b e dt h e b a c t e r i o s t a t i ca n d b a c t e r i c i d a lp r o p e r t i e so f p e n i c i l l i n ,i n v i t r oa n d i n v i v o ,a n d t h e e f f e c t so fserum a n d o t h e r b i o l o g i c a lm a t e r i a l s on t h e a c t i v i t y .T h e e f f e c t so f p e n i c i l l i non l e u c o c y t e s . - a n dt i s s u e swere a l s o d e s c r i b e d ,t o g e t h e rw i t h r e s u l t s o f a b s o r p -t i o n a n d e x c r e t i o n e x p e r i m e n t si n m n a n d l a b o -r a t o r y a n i m a l s .

T h e me t h od o f i s o l a t i o n now d e s c r i b e d d i f f e r sr a d i c a l l y f r o m t h a t r e c o m m e n d e d b y t h e O x f o r dw o r k e r s ; i t i s more c o n v e n i e n t6 n d more e f f i c i e n tf o r l a r g e - s c a l e w o r k i n g ,a n d h a s been c a r r i e d o u ton a s u b s t a n t i a l s c a l e .

EXPERIMENTAL

C u l t i v a t i o no f t h emould

S e l e c t i o n o f 8 t r a i n .T h e f i r s ts t a g e o f t h e i n v e s t i -g a t i o n c o m p r i s e dt h e s e l e c t i o n o f t h e b e s t o f n i n ed i f f e r e n t s t r a i n s o f P . n o t a t u m p r o v i d e db y P r o f .H. R a i s t r i c k . T h e m o u l d swere grown on a m o d i f i c a -t i o n ,i n t r o d u c e db y Dr T u r l e y , o f t h e w e l l - k n o w nCzapek-Dox m e d i u m ; t h i sh a d t h e f o l l o w i n gcom-p o s i t i o n :

N a N O ,K H , P 0 4K C IM g S O 4. 7 H , O

3 - 0 g .1 - 0 g .

0 - 5 g .0 - 5 g .

F e S O 4 .7 H 1 0G l u c o s eD i s t i l l e dw a t e r t o

0 - 0 1g .4 0 0g .

1 0 0 0ml .

T h e s o l u t i o n s were d e c a n t e d f r o m t h e m o u l dm y c e l i aa n d t e s t e d f o r a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a g a i n s tS t a p h y l o c o c c u s ,S t r e p t o c o c c u s a nd P n e u m o c o c c u s .Fr o m t h e s e p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s ,s e v e r a l o ft h e s t r a i n swere s e l e c t e d f o r f u r t h e r e x a m i n a t i o n ,a n d t h e r e s u l t s i n d i c a t e dt h e m a r k e d s u p e r i o r i t yo fs t r a i n B 5 9 2 , o r i g i n a l l y o b t a i n e di n 1 9 2 9f ro m t h eM e d i c a lR e s e a r c h C o u n c i l ( N a t i o n a l I n s t i t u t e f o rM e d i c a lR e s e a r c h ) .

M a i n t e n a n c eo f s t o c k c u l t u r e s o f P e n i c i l l i u mn o t a -t u m . S t o c kc u l t u r e s o f P . n o t a t u m s t r a i n B : 5 9 2weregrown on s e v e r a l d i f f e r e n t m e d i a ,i n c l u d i n gC z a p e k -D o x a g a r , C z a p e k - T u r l e ya g a r , C z a p e k - D o xa g a rc o n t a i n i n gs u c r o s e i n s t e a d o fg l u c o s e , a n d m a l t o rw o r t a g a r . I t was f o u n dt h a t t h o s e c u l t u r e s grownon m a l t o r w o r t a g a r gave t h e m o s t r e l i a b l ea n dm o r p h o l o g i c a l l ys t a b l e m o u l d s .T h e m a l t a g a r. wasm a d e f rom a 5 s o l u t i o n o f c o m m e r c i a lm a l te x t r a c t a n d t h e w o r t a g a r f rom c o n c e n t r a t e dw o r t s p .g r . 1 - 0 4 0 ) .T h e s es t o c k c u l t u r e s were h e l d f o ra tl e a s t 3 m o n t h s b e f o r e b e i n gs u b c u l t u r e d ,a n d i t h a sb e e n our c u s t o m t h r o u g h o u tt o i n o c u l a t e our p r o -d u c t i o n b a t c h e s f r o m f r e s h s u b c u l t u r e s p r e p a r e df rom an o l d s t o c k c u l t u r e , t h e pa ren t c u l t u r e b e i n g

u s e d f o r a s l o n g a s p o s s i b l e , u m t i lg r o w t h l was e x -

h a u s t e d . C a r e w a s t a k e n , i n m a k i n gt h e s e s u b .c u l t u r e s ,t o t r a n s f e r o n l y t h e s p o r e s , a v o i d i n gt r a n s f e r o f t h e m y c e l i u ma s f a r a s p o s s i b l e ,f o r i tw a s f o u n d t h a t m y c e l i a l c u l t u r e s t e n d e d t o g i v ep o o r y i e l d s o f p e n i c i l l i n .T h e s u b c u l t u r e s , l i k et h es t o c k c u l t u r e s ,w e r e m a d e o n m a l t a g a r s l o p e s ,w h i c hw e r e i n c u b a t e da t 2 4 0 a n d u s e d f o rs o w i n gt h e b a t c h e sw h e n 7 d a y s o l d .C u l t i v a t i o no f t h em o u l d . Th e m e d i u m u s e d f o rp r o d u c t i o no f p e n i c i l l i nw a s T u r l e y ' s m o d i f i c a t i o no f t h e C z a p e k - D o xm e d i u m d e s c r i b e da b o v e . I n t h ee x p e r i m e n t a ls t a g e o f t h e w o r k , 4 0 0m l . p o r t i o n sw e r ei n t r o d u c e di n t o 1 1 .c o n i c a lf l a s k s ,w h i c hw e r ea u t o c l a v e d f o r j h r . a t a p r e s s u r e o f 1 5 l b . / s q . i n .I t i s k n o w n t h a t a u t o c l a v i n ga s o l u t i o no f t h i st y p ec a u s e s c h a n g e si n t h e g l u c o s e ,a n d t h e r o t a t i o n o ft h e a u t o c l a v e d m e d i u m c o r r e s p o n d e dw i t h a b o u t2 - 5 i n s t e a do f 4 o f g l u c o s e ;t h e c o p p e rr e d u c t i o nf i g u r ew a s e q u i v a l e n t t o 4 . A s u s p e n s i o no fs p o r e s , m a d e b y i n t r o d u c i n g 1 0 m l . o f C z a p e k -T u r l e y m e d i u m i n t o e a c h o f t h e s u b c u l t u r e s a n dd i s l o d g i n gt h e s p o r e s w i t h a s t e r i l es t a i n l e s ss t e e ls p a t u l a , w a s u s e d f o r i n o c u l a t i n gt h e f l a s k s ,t h ec o n t e n t s o f o n e c u l t u r e t u b e b e i n g d i s t r i b u t e da se v e n l y a s p o s s i b l ea m o n g f o u r f l a s k s ,w h i c hw e r et h e n s h a k e n a n d i n c u b a t e d i n t h e d a r k a t 2 4 g .S u b s e q u e n t l y ,h o w e v e r ,i t w a s f o u n dt o b e q u i c k e ra nd more c o n v e n i e n tt o t r a n s f e rt h e s p o r e sd i r e c t l yf r o mt h e s l o p e s b y me a I s o f a m o i s t e n e dp l a t i n u ml o o p .

Th e g r o w t ho f t h e m o u l dw a s c h a r a c t e r i s t i ca n dh a s n o t - v a r i e dg r e a t l y o v e r a l o n g p e r i o d ; o n l yo c c a s i o n a l l yh a s s e r i o u s t r o u b l e b e e n e x p e r i e n c e dt h r o u g ha f a l l i n go f fi n t h e y i e l d so f p e n i c i l l i n .Th ea b o v ep r e c a u t i o n sh a v e , h o w e v e r ,b e e n r i g i d l yf o l -l b w e d ;i t i s e s p e c i a l l yi m p o r t a n tt o u s e a s u b c u l t u r eo b t a i n e df r o ma n o l d s t o c kc u l t u r e .A f t e r 2 - 3 d a y st h e s u r f a c eo f t h e l i q u i di nt h e f l a s k sb e c a m ec o v e r e dw i t h a w h i t e f e l t ;t h i sg r a d u a l l yf o r m e df o l d s ,t h ec r e s t s o f w h i c h w e r e b l u e - g r e e n ;o r a n g e - y e l l o wt r a n s p i r a t i o n d r o p sa c c u m u l a t e di n t h e s e f o l d s .T h er e v e r s e s i d e w a s g o l d e n y e l lo wi n c o l o u r ,a n d t h ec o l o u r o f t h e s o l u t i o n g r a d u a l l y d e e p e n e dt o a ni n t e n s ey e l l o w. P e n i c i l l i np r o d u c t i o nw a s c o m p l e t ei n 1 0 - 1 4d a y s . D u r i n gt h i st i m e t h e a p p a r e n tc o n -c e n t r a t i o n o f g l u c o s ef e l ls t e a d i l y ,t h e o p t i c a lr o t a -t i o n r e a c h i n ga m i n i m u m v a l u e c o r r e s p o n d i n gt oa b o u t 0 - 5 . T h e p H o f t h e s o l u t i o n f e l lt o a b o u t 4i n t h e f i r s t4 - 5 d a y s a n d t h e n r o s e t o 7 - 0 - 7 - 6 .

T h e m e t h o do fa s 8 a yT h e t e s t i n go f p e n i c i l l i nw a s c a r r i e d o u t b y t h e

s e r i a ld i l u t i o n me th o d C l u t t e r b u c ke t a l . 1 9 3 2 ) .Each t e s t s o l u t i o n w a s s t e r i l i z e db y f i l t r a t i o nt h r o u g ha s m a l l S e i t zf i l t e r ,a n d d i l u t i o n swere m a d ei n t u b e s c o n t a i n i n g4 m l . o f d i g e s tb r o t h m e d i u m o fp H 7 - 2 ,t h e s e r i e sf o r m i n ga g e o m e t r i c a lp r o g r e s s i o nf r o m1 i n 1 0 t o 1 i n 2 5 6 0 . Each t u b e o f m e d i u m w a s

3 0 - 2

Vo I .3 8 4 5 3


3/8


4/8

Vol .8P R E PA R AT IO N OF PENICILLIN

T a b l e 2 . E f f e c to n p e n i c i U i np r o d u c t i o no f a d d i n gv a r i o u s s u p p l e m e n t st o t h eb a s a l m e d i u m

A d d i t i o n st o b a s a l m ed i um ( )

S o d i u m S o d i u mN a N O 3C u S O 4 5 H 2 0c i t r a t e a c e t a t e

0 4 0 - 0 0 1 7 5 0 - 2 0 - 2

0 - 4 0 - 0 0 1 7 5 0 00 - 3 0 - 0 0 1 7 5 0 00 * 3 0 0 - 2 0 - 20 - 3 0 0 . 0

T i t r e1 i n 6 4 0

1 i n 1 6 01 i n 8 01 i n 3 2 01 i n 1 6 0

L a t e r e x p e r i m e n t st h r e ws o m e d o u b to n t h e b e i l e -f i c i a le f f e c to f c o p p e r ;i t p r o v e dd i f f i c u l tt o - o b t a i nc o n c l u s i v ee v i d e n c eo n t h i s p o i n t , f o rt h e v a r i a t i o n sf r o mf l a s kt o f l a s k w e r e o f t h e s a m e o r d e r a s t h o s ee n c o u n t e r e db e t w e e nm e d i a w i t ha n d w i t h o u ta d d e dc o p p e r .T h e c o n c l u s i o nr e a c h e da f t e ra l a r g e numbe ro f e x p e r i m e n t sw a s t h a t w i t h s t r a i n B 5 9 2 t h ea d d i -t i o n o f c o p p e ri n c r e a s e dt h e m a x i m u mt i t r es l i g h t l yo r n o t a t a l l , b u t r e n d e r e dt h e y i e l d s o f p e n i c i l l i nmore c o n s i s t e n t ; i t u n d o u b t e d l yi n c r p a s e dt h e r a t ea n d d e g r e e o f s p o r u l a t i o n . T h e p r e s e n c eo f c o p p e ra l s o a p p e a r e dt o i n h i b i tt h e f o r m a t i o no f t h e y e l l o wp i g m e n tc h r y s o g e n i n ,f i r s td e s c r i b e db y C l u t t e r b u c ke ta l . ( 1 9 3 2 ) ;o n l yn e g l i g i b l ea m o u n t s o f t h i sp i g m e n tw e r e i s o l a t e d f r o mm e t a b o l i s ms o l u t i o n sc o n t a i n i n gc o p p e r+ a c e t a t e + c i t r a t e .

T h e e f f e c to f o t h e r s u b s t a n c e so n t h e y i e l d o fp e n i c i l l i na n d o n t h e m o r p h o l o g yo f t h e mo u ld w a sa l s os t u d i e d . T y r o s i n eu p t o 0 - 0 4 5 w a s w i t h o u te f f e c t ,. b u tt h e a d d i t i o n o f 0 - 0 1 o f a s p a r a g i n em a r k e d l yi n c r ea s e d t h ec o n c e n t r a t i o no f p e n i c i l l i n

p r o d u c e d d u r i n g1 1 d a y s ' i n c u b a t i o n . A s c o r b i ca c i d 0 - 1 ) an d n i c o t i n i ca c i d 0 - 1 ) w e r ew i t h o u te f f e c to n t h e t i t r e ,b u t t h e f o r m e rp r o d u c e da b l u e r f e l ta n d t h e l a t t e ri n c r e a s e dt h e g r o w t hr a t e . A n e u r i n 0 - 0 1 ) and r i b o f l a v i n 0 - 0 1 ) h a d l i t t l e o r n oe f f e c t .d l - A s p a r t i ca c i d 0 - 0 1 ) h a d n o e f f e c t ,b u t0 - 1 o f g l u t a m i ca c i d s p e e d e du p g r o w t ha n d l e dt o a s o me w h a t h i g h e rt i t r e .

T h e s i m u l t a n e o u sa d d i t i o no f a n e u r i n ,r i b o f l a v i n ,n i c o t i n i ca c i d ,a s c o r b i c a c i d a nd p i m e l i c a c i d h a dn o e f f e c to n t h e t i t r e ,t h e p H o r t h e r a t e o f g l u c o s ec o n s u m p t i o n .G u a n i d i n eh y d r o c h l o r i d e 0 - 0 0 1 )h a d a marked e f f e c to n t h e a p p e a r a n c eo f t h e mo u lda n d r e s u l t e d i n t h e r a p i d f o r m a t i o no f n u m e r o u st r a n s p i r a t i o n d r o p s ,b u t d i d n o t m a t e r i a l l yi n c r e a s et h e y i e l d o f p e n i c i l l i n .T h e e f f e c to f g u a n i n ea n da d e n i n eo n t h e t i t r ew a s n e g l i g i b l e ,w h i l s t t h e a d d i -t i o n o f u r a c i l( u p t o 0 . 0 5 ) g a v e a d a r k e r m e t a -b o l i s ms o l u t i o n w i t h o u ta f f e c t i n gt h e t i t r e .

I s o l a t i o n o f p e n i c i l l i nf r o mm e t a b o l i s ms o l u t i o n s

1 ) E x t r a c t i o nm e t h o d s .T h e f i r s ta t t e m p t st o i s o -l a t e p e n i c i l l i nf r o mt h e mo u l d m e t a b o l i s ms o l u t i o n( C z a p e k - T u r l e ym e d i u m )we r e m a d e b y t h e me th o do f A b r a h a m e ta l . 1 9 4 1 ) ,u s i n ge x t r a c t i o nw i t ha m y l

a c e t a t e a t pH 2 . Very t r o u b l e s o m ee m u l s i o n sw e r eo b t a i n e d ,h o w e v e r ,a n d a q u e o u se x t r a c t s f r o mt h eamyl a c e t a t e s o l u t i o n s w e r e o n l y s l i g h t l ya c t i v e .B e t t e r r e s u l t s w e r eo b t a i n e db y t h e e t h e r e x t r a c t i o nm e t h o d o f C l u t t e r b u c ke t a l . 1 9 3 2 ) .

P o r t i o n s 5 0 m l . )o f t h e s o l u t i o nw e r e e x t r a c t e d w i t ht h r e e 3 5 m l. p o rt i o n so f e t h e r ,a n d t h e e t h e r e a le x t r a c t ,

a f t e rc o n c e n t r a t i o nb y d i s t i l l a t i o ni n t h e p r e s e n c eo f w a t e r ,w a s t e s t e d a l o n g s i d et h e r e s i d u a lm e t a b o l i s ms o l u t i o n s .E x t r a c t i o nw a s o p t i m a la t p H 3 , s o m el o s so f p e n i c i l l i nt a k i n gp l a c e a t p H 2 . E x t r a c t i o nw a sf a c i l i t a t e db y a c i d i f i -c a t i o n t o p H 3 - 6a n d f i l t r a t i o nt o r e m o v ep r o t e i na n dc h r y s o g e m i n ,a s r e c o m m e n d e d b yC l u t t e r b u c ke t a l . 1 9 3 2 ) .T h e r e s u l t i n gi f i t r a t ed i d n o t f o r mp m u l s i o n sa s r e a d i l ya sd i d t h eo r i g i n a ls o l u t i o n .

T h e e t h e r e a l e x t r a c t o b t a i n e df r o m t h i sf i l t r a t ew a s e x -t r a c t e dw i t h d i l u t eN a H C O 3 ,a n d t h e a q u e o u ss o l u t i o na c i d i f i e da n d e x t r a c t e d w i t h e t h e r .T h e b a r i u m s a l to fp e n i c i l l i nw a s p r e p a r e d b y s h a k i n gt h i sw i t h a s u s p e n s i o no f e x c e s sB a C O 3 ,s e p a r a t i n go f ft h e a q u e o u sp h a s e ,f i l t e r i n ga n d e v a p o r a t i n gt h e f i l t r a t ei n t h e f r o z e n s t a t e .T h e s o l i d

s o o b t a i n e di n h i b i t e dg r o w t ha t a d i l u t i o no f 1 i n 4 x 1 0 6 ,a n d a 6 0 r e c o v e r yo f t h e o r i g i n a la c t i v i t yw a s o b t a i n e d .O n ed i s a d v a n t a g eo f t h i sp r o c e s sw a s e n c o u n t e r e dw h e n

i t w a s a p p l i e d t o m e t a b o l i s ms o l u t i o n so b t a i n e df r o m t h eW . P . R . L . m e d i u m .A c o n s i d e r a b l ea m o u n t o f a c e t i ca o i dw a s e x t r a c t e d a l o n g w i t h t h e p e n i c i l l i n ,s o t h a t c a l c i u ma c e t a t e w a s p r e s e n t i n t h e p r o d u c t , w h i c h w a st h e r e f o r el e s sa c t i v e p e r m g . t h a n s i m i l a rm a t e r i a l o b t a i n e d f r o mC z a p e k - T u r l e ym e d i u m .

2 ) A d s o r p t i o nm e t h o d s .I t w a s f o u n dt h a t p e n i -c i l l i nw a s q u a n t i t a t i v e l ya d s o r b e df r o mp r o t e i n - f r e em e t a b o l i s ms o l u t i o n s o f p 2 , 3 , 4 ,5 a n d 7 b ya c t i v a t ed c h a r c o alo r f u l l e r se a r t h ( 2 0 g . / l .o f m e t a -

b o l i s ms o l u t i o n ) ;t h e c h a r c o a lremoved t h e c o l o u ra sw e l l a s t h e a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y .L e s s c h a r c o a l ,e . g .1 0 g . / l . ,d i d n o tr emove t h e a c t i v i t yc o m p l e t e l y .T h e a c t i v i t y c o u l db e r e c o v e r e dq u a n t i t a t i v e l yf ro mt h e c h a r c o a l a d s o r b a t e b y e l u t i o n w i t h 8 0 o ra b s o l u t e e t h a n o l , o r w i t h m e t h a n o l ,a c e t o n e o rp y r i d i n e , b u t t h e d e g r e eo f c o n c e n t r a t i o ne f f e c t e db y a d s o r p t i o nan d e l u t i o n v a r i e d a c c o r d i n gt o t h epH a t w h i c ht h e a d s o r p t i o nw a s c a r r i e d o u t .

T h i s i s i l l u s t r a t e db y a n e x p e r i m e n ti n w h i c hp o r t i o n so ft h e s a m e m e t a b o l i s ms o l u t i o n ,a d j u s t e d t o v a r i o u s p Hv a l u e s ,w e r e a d s o r b e do n c h a r c o a l 2 0g . / l . ) ,a n d t h e t i t r e sa n d t o t a ls o l i d so f t h e e t h a n o l e l u a t e sd e t e r m i n e d .T h er e s u l t s T a b l e3 ) i n d i c a t e dt h a t t h e b e s tp H f o ra d s o r p t i o n

T a b l e 3 . E f f e c to f a i t e r a t i o n si n t h epH o f m e t a b o l i s ms o l u t i o no n r e c o v e r yo f p e n i c i l l i na n d o f t o t a ls o l i d sf r o mc h a r c o a la d s o r b a t e sb y e l u t i o n w i t h e t h a n o l

p H3456789

T i t r e1 / 1 6 01 / 3 2 01 / 3 2 01 / 3 2 01 / 3 2 01 / 1 6 01 / 1 6 0

To t a l s o l i d s g . / l . )1 - 21 . 1 51 - 0 50 - 7 50 - 7 50 - 7 50 - 6 5

Vo l .3 8 4 5 5


5/8

J . C . CLAYTON AND O T H E R Sw a s - 7 .When a v o l u m eo fe t h a n o le q u a l t o o n e - h a l ft h a to f t h em e t a b o l i s ms o l u t i o nw a su s e d ,m o s to ft h e a c t i v i t yw a s c o n t a i n e di n t h ef i r s te l u a t e ;t h ea m o u n to fp e n i c i l l i np r e s e n ti n t h et h i r d e l u a t ew a s n e g l i g i b l e .E l u t i o nw a sa l m o s t ,b u t n o tq u i t e ,c o m p l e t e w i tha v o l u m eo f e t h a n o lo n e - q u a r t e rt h a t o ft h e m e t a b o l i s ms o l u t i o n .A q u e o u sa c e t o n e( 2 0 ) , r e c o m m e n d e d b yt h e W . P. R . L .w o r k e r s ,w a sf o u n dt o b e a sg o o d a ne l u a n ta s e t h a n o l ,b u t a q u e o u se t h e rp r o v e dt ob e l e s ss a t i s f a c t o r y ,o n l y5 0 o f t h ea c t i v i t yb e i n g r e c o v e r e dw h e na v o l u m ee q u a lt ot h a to f t h eo r i g i n a ls o l u t i o nw a su s e d .

A n e w me th o d o f w o r k i n gu p m e t a b o l i s ms o l u t i o nw as b a s e don t h e s er e s u l t s .T h e s o l u t i o nw a s a c i d i f i e dt o p 3 - 6a n dp r e c i p i t a t e dp r o t e i na n d p i g m e n t w e r ef i l t e r e do f f . T h e f i l t r a t ew a s n e u t r a l i z e d ( p H 7 ) ,s t i r r e dw i t h 2 o f i t s w e i g h to f c h a r c o a l S u t c l i f f ea n d Spe a k ma n n o . 5 )a n d f i l t e r e d .Th e c h a r c o a lw a se l u t e d o n t h e f i l t e rw i t ha o n e - h a l fv o l u m eo f e t h a n o la n d t h e f i l t r a t ed i l u t e d w i t h a o n e - t e n t hv o lu me o fw a t e ra n d e v a p o r a t e du n d e rr e d u c e dp r e s s u r e , g r e a t

c a r e b e i n gt a k e n t o p r e v e n tt h e i n t e r n a l t e m p e r a t u r ef r o mr i s i n ga b o v e2 0 0 .A f t e r a c i d i f i c a t i o nt o pH 3 ,t h e a q u e o u ss o l u t i o nw a s e x t r a c t e d t h r e e t i m e sw i t ht w o - t h i r d si t sv o l u m eo fe t h e r ,t h e c o m b i n e de t h e r e a le x t r a c t s w e r e s h a k e nw i t h a s u s p e n s i o no f e x c e s sB a C O ,a n d t h e l o w e rl a y e r w a s s e p a r a t e do f f ,f i l t e r e da n d e v a p o r a t e di n t h e f r o z e ns t a t e .T h e s o l i ds o o b -t a i n e d i n h i b i t edc o m p l e t e ly t h eg r o w t ho f S t a p h y l o -c o c c u sa u r e u s a t a d i l u t i g no f 1 i n 0 -7 5 x 1 0 6t o 1 i n1 - 5x 1 0 6 ,a n d c o n t a i n e d2 0 - 4 0 o f t h e a c t i v i t y o ft h e o r i g i n a ls o l u t i o n .

W h e n t h i sp r o c e s sw a s a p p l i e d t o 2 0 1 . b a t c h e s ,t h e

y i e l d sw e r e c o n s i d e r a b l yb e l o w

2 0 . I tw a s

t h e n l e a r n e d t h a tD r C . G . Pope a t t h e W . P . R . L . ,u s i n g t h e same p r o c e s s , w a s o b t a i n i n gm u c h mores a t i s f a c t o r yr e c o v e r i e s ,a n d a c o m p a r i s o no f t h e t w om e t h o d ss h o w e dt h a t h e a d d e d c h l o r o f o r mt o t h em e t a b o l i s ms o l ut i o n t op r e v e n t b a c t e r i a l c o n t a m i -n a t i o n . I t w a s f o u n dt h a t t h e a d d i t i o no f c h l o r o f o r mt o o u r m e t a b o l i s ms o l u t i o n g r e a t l y f a c i l i t a t e dt h es u b s e q u e n te l u t i o n o f a c t i v i t yf r o m t h e c h a r c o a la d s o r b a t e , w h i l s t a d s o r p t i o n w a s i n n o w a y i m -p a i r e d .A l l t h e a c t i v i t y w a s t h e n r e c o v e r e df r o mt h e c h a r c o a lb y e l u t i o n w i t h a o n e - f i f t hv o l u m eo f2 0 a c e t o n e . Under t h e s e c o n d i t i o n s ,t h e c h a r c o a la d s o r p t i o n me t h o d g a v e b e t t e r y i e l d so f b e t t e rm a t e r i a l , n e e d e dl e s sb u l k o f m a t er i a lst h a n e x t r a c -t i o n w i t h e t h e r o r o t h e r s o l v e n t , a n d r e q u i r e d l e s sc o m p l i c a t e dp l a n t . M o r e o v e r ,w h e n s o d i u ma c e t a t ew a su s e di nt h e m e d i u m ,i t w a s a d v a n t a g e o u st o u s ec h a r c o a la d s o r p t i o nb e c a u s ei t d i d n o t r e s u l t i n c o n -t a m i n a t i o no f t h e f i n a lp r o d u c tw i t h c a l c i u ma c e t a t eo r b a r i u ma c e t a t e , a s d i d s o l v e n te x t r a c t i o n . Y i e l d sv a r i e d f r o m3 0 t o 6 0 , a n d t h e m a t e r i a l i n h i b i t e dg r o w t ha t d i l u t i o n s o f 1 i n 3 x 1 0 t o 1 i n 5 x 1 0 6 .

A d s o r p t i o no c c u r r e dm o r e e a s i l yw h e n t h e m e ta -b o l i s ms o l u t i o nw a s f i l t e r e dt h r o u g ha b e d o f c h a r c o a li n s t e a d o f b e i n g s t i r r e dw i t h c h a r c o a l a s i n t h eo r i g i n a lp r o c e s s . I n t h i s w a y n o t o n l y w a s t h e

a m o u n t o f c h a r c o a l r e q u i r e d r e d u c e df rom 2 0 t o4 g . / l . ,b u t e l u t i o n o f t h e a d s o r b a t ew a s e a s i e r ;e v e na q u e o u se t h e r g a v ec o m p l e t er e d o v e r y .T h e r e s u l t i n gp e n i c i l l i np r e p a r a t i o nw a s mo r e a c t i v e , a n d b a r i u ms a l t sw h i c hi n h i b i t e d g r o w t hi n a d i l u t i o n o f 1 i n1 5 x 1 0 6 ,e q u i v a l e n tt o 3 0 0 O x f o r du n i t s / m g . ,w e r eo b t a i n e d .T h i s o b s e r v a t i o nh a s n o tb e e n c o n f i r m e d

b y t h e W . P . R . L .w o r k e r s ,w h o o b t a i n e do n l yp a r t i a le l u t i o n u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s .With t h e s t r a i n o fP e n i c i U i nn o t a t u mu s e d a t t h e W . P . R . L .w e a l s of a i l e dt o o b t a i n c o m p l e t ee x t r a c t i o n ; w e c a n o n l yc o n c l u d et h a t o th e r s t r a i n s o f m o u l d p r o d u c ei m -p u r i t i e sw h i c ha f f e c ta d s o r p t i o na n d e l u t i o n .

T h e e f f e c to f t h e p r e s e n c eo f o r g a n i c s o l v en t sa n d o fi n o r g a n i cs a l t si n t h e a q u e o u ss o l u t i o no n t h e a d s o r p t i v ep o w e ro f t h e c h a r c o a lw a s n e x t s t u d i e d .T h e p e n i c i l l i nw a sa d s o r b e dw h e na s o l u t i o ns a t u r a t e d w i t h e t h e r w a s r u nt h r o u g h a b e do f c h a r c o a l ,b u t a s o l u t i o nc o n t a i n i n gi na d d i t i o n 1 - 2 o f N a C l r e t a i n e d i t s a c t i v i t yu n d e r t h es a m ec o n d i t i o n s .No p e n i c i l l i nw a s t h e n a d s o r b e db u t ac o n s i d e r a b l er e d u c t i o ni n t h e c o l o u r w a s e f f e c t e d ,w i t h ac o r r e s p o n d i n gi n c r e a s e i n t h e a c t i v i t yo f t h e r e s u l t i n gc a l c i u ms a l tf r o m 1 0 0 t o 1 4 0 u n i t s / m g .T h e p r o c e s sg a v es m a l l e rt o t a ly i e l d s ,h o w e v e r ,w h e na p p l i e dt o l a r g eb a t c h e s ,a n d w a sd i s c o n t i n u e d .

L a r g e - s c a t l ep r o d u z t i o no f p e n i c i l l i nT h e g e n e r a l p r o c e d u r ed e s c r i b e da b o v e i s n o w

b e i n go p e r a t e don a f a i r l yl a r g es c a l e .T h e m o u l d i sg ro w n i n s p e c i a lg l a s sf l a s k s P 1 .3 ) . T h e s e f l a s k sa r e s o d e s i g n e dt h a t s e v e r a l ca n b e s t a c k e d d u r i n gi n c u b a t i o n ; f o r f i l l i n ga nd s t e r i l i z a t i o nt h e y a r ea c c o mmo d a t e d i n s p e c i a l l yd e s i g n e dw i r e b a s k e t s ,e a c h o f w h i c h h o l d s 1 2 f l a s k s .T h i s r e d u c e s t h en e c e s s i t yf o rf r e q u e n th a n d l i n go f i n d i v i d u a lf l a s k s .

E a c hf l a s kh o l d s 8 0 0m l . o f W . P . R . L .m e d i u m ,w h i c hi si n t r o d u c e db y m e a n so f a l a r g et a p a t t a c h e dt o a m e a s u r i n gd e v i c e .T h e f l a s k sa r e t h e n p l u g g e dw i t h c o t t o n - w o o la n da u t o c l a v e df o r1 0 m i n . a t a p r e s s u r eo f 1 0 l b . / s q . i p .A f t e rc o o l i n go v e r n i g h t ,t h e f l a s k s - s t i l li n t h e w i r e b a s k e t s -a r e i n o c u l a t e db y means o f a w i r e l o o pw i t h s p o r e s o fP . n o t a t u mg r o w no n a w o r t - a g a rs l o p e ,t h e i n o c u l a t i o nb e i n g c a r r i e do u t i n a c l o s e dc a b i n e t .T h e f l a s k ss r e t h e nt a k e n f r o m t h e b a s k e t s a n d s t a c k e d o n r a c k s ,w h i c ha r ew h e e l e di n t oa n i n c u b a t o rr o o m m a i n t a i n e da t a c o n s t a n tt e m p e r a t u r eo f 25 1 0 .

A f t e r 1 4 d a y s i n c u b a t i o n ,t h e l i q u i di s f i l t e r e dt h r o u g h m u i s l i na nd t h e n r u n t h r o u g h a bed o fc h a r c o a la n d k i e s e l g u h r( w h i c hf a c i l i t a t e sf i l t r a t i o n )p r e p a r e do n a l a r g es t o n e w a r ef u n n e l ;5 g . o f c h a r -c o a l a r e u s e d f o re a c h l i t r eo f m e t a b o l i s ms o l u t i o n i .W h e n a l l t h e s o l u t i o n h a s f i l t e r e d ,t h e c h a r c o a l i sw a s h e dw i t h a l i t t l ew a t e r a n d t h e n s a t u r a t e d w i t hc h l o r o f o r m .T h e p e n i c i l l i ni s e l u t e d b y r u n n i n gt h r o u g ht h e c h a r c o a la v o lu me o f 2 0 a c e t o n ee q u a lt o o n e - t e n t ht h a t o f t h e o r i g i n a lm e t a b o l i s ms o l u -t i o n .T h e e l u a t e ,a c i d i f i e dt o p H 2 - 5 - 3 - 0w i t h 1 0 OH , 3 P O 4 ,i s e m u l s i f i e db y r a p i d s t i r r i n gw i t h a n e q u a lv o l u m eo f c h l o r o f o r m ,a n d t h e e m u l s i o nt h e n b r o k e nb y m e a n s o f a n A l f a - L a v a ls e p a r a t o r . T h e c h l o r o -

4 5 6 I 9 4 4


6/8

P L A T E3

4

. F ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ . .C '. . > _ -~ ~ ~ ~ ~ ~ I I

P h o t o g r a p hb y B e t r a m Park

M o u l dc u l t u r ef l a s k si n u s e f o rp e n i c i l l i np r o d u c t i o n .

BIOCHEMICALJOURNAL, V O L .3 8 ,NO. 5

;

I

| Wy S. . .

t


7/8

Vo l .8 PR EPAR AT I ON OF P ENI C LLI Nf o r m l a y e r i s c o l l e c t e ds e p a r a t e l y a n d s t i r r e d w i t h0 .5 NaHCO8. A l t e m a t i v e l y ,t h e c h l o r o f o r ms o l u -t i o n i s s h a k e nw i t h as u s p e n s i o no f C a C O 5t o g i v eas o l u t i o no f c a l c i u mp e n i c i l l i n .Both t h e s o d i u ms a l ta n d t h e c a l c i u ms a l t ,o b t a i n e d f r o m t h e s o l u t i o n sb y d r y i n ga t l o w t e m p e r a t u r e s( b e t w e e n - 3 0 a n d- 1 5 ) i n v a c u o , a r e b r i g h t y e l l o w a m o r p h o u s

p o w d e r s ,w h i c hg e n e r a l l yi n h i b i tg r o w t ha t a d i l u t i o no f a b o i t 1 i n1 0 x 1 0 6 ; t h i si se q u i v a l e n tt o a n a c t i v i t yo f 2 0 0O x f o r du n i t s / m g . ;1 0 0 01 .o f m e t a b o l i s ms o l u -t i o n a r ep r o d u c e da nd worked u p e a c h d a y , w i t h a na v e r a g e t i t r eo f 1 6 O x f o r du n i t s / m l . ,a n d 6 0 - 7 0 o f t h e t o t al a c t i v i t y i s r e c o v e r e d a s s o d i u mo rc a l c i u ms a l t .With a s o m e w h a t s m a l l e r i n s t a l l a t i o np r o d u c i n g2 0 0 1 . o f m e t a b o l i s ms o l u t i o n e a c h d a y ,y i e l d so f 7 5 - 8 0 a r e o b t a i n e d .

A t t e m p t e dp u r i f i c a t i no f c r u d ep e n i c i U i nVa r i o u sa t t e m p t sw e r em a d e t o p u r i f y f u r t h e r t h e

c r u d ep e n i c i l l i no b t a i n e df r o mt h e m e t a b o l i s ms o l u -t i o n b y c h a r c o a la d s o r p t i o na n d e l u t i o n .

a ) F o r m a t i o no f 8 a l t 8o f p e n i c i U i n .S e v e r a la t t e m p t sw e r e m a d et o o b t a i ns p a r i n g l ys o l u b l es a l t so fp e n i c i l l i n .An a q u e o u ss o l u t i o no f b a r i u mp e n i c i l l i n ,o n t r e a t m e n tw i t h b e n z y l - p s e u d o t h i u r o n i u mc h l o r i d e ,g a v ea y e l l o wp r e -o i p i t a t e ,w h i l s tt h e f i l t r a t ec o n t a i n e da l lt h ea c t i v i t yo ft h eo r i g i n a ls o l u t i o n .S i n c et h e a m o u n to fp r e c i p i t a t ef o r m e dw a sv e r ys m a l l ,h o w e v e r ,t h e d e g r e eo fp u r i f i c a t i o ne f f e c t e dw a si n s u f f i c i e n tt o j u s t i f yt h e r o u t i n eu s eo f t h i sp r o o e d u r e .

N o n eo ft h ef o l l o w i n gq u a t e r n a r yammo n i u m s a l t sg a v ei n s o l u b l e s a l t sw i t h p e n i c i l l i n .p y r i d i n i i i ma n d q u i n o l i n i u mm e t h i o d i d e , b e n z y l - q u i n o l i n i u mc h l o r i d e ,p - n i t r o b e n z y l -p y r i d i n i u mc h l o r i d ea n d m - n i t r o p h e n y l - t r i m e t h y la m .

m o n i u mi o d i d e . b ) M i s c e l l a n e o u .C a t c h ,C o o k H e i l b r o n 1 9 4 2 y ,b ym e a n so f t h e i rc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d ,i nw h i c hc o l u i m n so f s i l i c ag e lm i x e dw i t h a l k a l i n ee a r t hc a r b o n a t e sa r e u s e d ,s u c c e e d e di ni n c r e a s i n gt h ea c t i v i t yo fs o m eo f o u r m a t e r i a l ,c o n t a i n i n g2 0 0u n i t s / m g . ,t o o v e r 1 0 0 0O x f o r du n i t s / m g .

T r e a t m e n tw i t h a l u m i n i u ma m a l g a m ,r e c o m m e n d e db yA b r a h a me t a l . 1 9 4 1 ) ,w a s a p p l i e d t oo u r m a t e r i a la n dr e s u l t e di n a l m o s tc o m p l e t ed e c o l o r i z a t i o no ft h es o l u t i o n ;a l lt h e a c t i v i t yo f t h eo r i g i n a ls a l tw a sf o u n di n t h e s u p e r -n a t a n tl i q u i d , .a n ds o m ed e g r e eo fc o n c e n t r a t i o nw a se f f e c t e d .T h en e c e s s i t yf o re m p l o y i n gi n t h i sc o n n e x i o n t h et r o u b l e -s o m et h r e e - s t a g ec h r o m a t o g r p h i ct r e a t m e n tr e c o m m e n d e db y A b r a h a me ta l . ,a n dt h eg r e a t e r s u c c e s so f t h e c h r o m a t o -

g r a p h i cm e t h o do f

C a t c he t a l .

1 9 4 2 ) ,l e du s t o a b a n d o n

t h i sl i n eo f a t t a c k .P e n i c i l l i nc a n a l s ob e r e d u c e dw i t h o u tl o s so f a c t i v i t yb y c a t a l y t i ch y d r o g e n a t i o ni n p r e s e n c eo fp l a t i n u mo x i d e ,a n d b y e l e c t r o l y t i cr e d u c t i o nb y m e a n so fa m e r c u r yc a t h o d ea n d l e a da n o d ew i t h a d i a p h r a g m .

A t t e m p t st o i m p r o v et h e p u r i t yo f p e n i c i l l i nb y e l e c t r o -d i a l y s i si n a s i m p l ec e l lo r b y f o a m i n ga c o o r d i n gt o t h em e t h o do f S c h i i t z 1 9 3 7 ,1 9 4 2 )w e r eu n s u c c e s s f u l .

P o t e n c y . Th e b e s t s p e c i m p n so f p e n i c i l l i np r e -p a r e d b y u s a r e i n h i b i t o r yt o S t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa t a - d i l u t i o no f 1 i n 1 5 x 1 0 6t o 1 i n 2 0 x 1 0 6 ,b u t a r ep r o b a b l yn o t more t h a n 1 0 - 2 0 p u r e ; n o u s e f u lp u r p o s ew o u l db e s e r v e d b y a d e s c r i p t i o no f t h e i rc h e m i c a fa n d p h y s i c a lp r o p e r t i e s .

S t b i l i t y . I n a q u e o u ss o l u t i o n t h e a c t i v i t y o fc r u d ep e n i c i l l i ni su n c h a n g e do n s t a n d i n gf o rs e v e r a ld a y s a t pH 8 , b u t 5 0 o f t h e a c t i v i t y i s l o s ta tpH 3 - 6i n 8 h r . a t 2 0 0 o ri n 2 4 h r .a t 0 0 . I t i s a l s od e s t r o y e d b y s t a n d i n g o v e r n i g h t i n s o l u t i o n i ne t h a n o l o r m e t h a n o l .

T h e d r y b a r i u mo r c a l c i u ms a l tc a n b e h e a t e d i o r

1 h r .a t 1 0 0 0 n t a c u ow i t h o u tl o s so f a c t i v i t y ,t h o u g hs o m e o f o u r b a t c h e s p r o v e du n s t a b l e t o h e a t a nde v e n t o . c o o l s t o r a g e . An a q u e o u ss o l u t i o n o f t h es a l t si si n a c t i v a t e db y b o i l i n gf o r1 0 m i n . ,i n s t r i k i n gc o n t r a s t t o t h e s t a b i l i t yo f p e n i c i l l i ni n m e t a b o l i s ms o l u t i o n s ; t h e l a t t e rc a n b e b o i l e d i n a c o p p e r - f r e em e d i u m s e ea b o v e )f o r 1 0 m i n .w i t h o u tl o s s .

P e n i c i l l i ns o l u t i o n s a r e i n a c t i v a t e db y t i n , z i n c ,l e a d a nd f e r r i cs a l t s ,0 . 0 1 d e s t r o y i n gt h e a c t i v i t yc o m p l e t e l yi n 2 4 h r .a t 0 0 .C o p p e rh a s a n e v e nm o r es t r i k i n ge f f e c t ,0 - 0 0 1 b e i n gs u f f i c i e n tt o i n a c t i v a t ep e n i c i l l i ns o l u t i o n si n 2 4 h r .a t 0 0 . F e r r o u ss a l t sa r ec o m p a r a t i v e l yh a r m l e s s ,w h i l s ts i l v e ra p p e a r s t o b ei n e r t .T h e d e l e t e r i o u se f f e c to f c o p p e rw a s n o t i n h i -b i t e d b y a d d i t i o n o f 0 . 1 g l y c i n eo r c i t r a t e .T h ee f f e c to f c o p p e r i s r a t h e r s u r p r i s i n g , f o r , w h e r e a st h e p r e s e n c eo f u p t o 4 - 5 p . p . m . i n t h e m o u l d m e t a -b o l i s m s o l u t i o n a p p a r e n t l y d o e s n o h a r m , s o m e -w h a t l a r g e ra m o u n t s ,e . g .1 0 p . p . m . , a r e s u f f i c i e n tt o i n a c t i v a t e p u r i f i e dp r e p a r a t i o n so f p e n i c i l l i ni na f e w h o u r s . T h e p r e s e n c eo f v a r y i n ga m o u n t s o fc o p p e ro r f e r r i ci r o n i n o u r c a l c i u ms a l t sp r o b a b l ya c c o u n t s f o r t h e d i f f e r e n ts t a b i l i t yo f d i f f e r e n tb a t c h e s .

SUMMARY

1 . A s a t i s f a c t o r y m e t h o d o f c u l t i v a t i n g P e n i -c i i u m n o t a t u m ,an d a m e t h o d o f i s o l a t i n gc r u d ep e n i c i l l i nf r o m t h e m e t a b o l i s ms o l u t i o n ,a r e d e -s c r i b e d .

2 . P e n i c i l l i nc a n b e a d s o r b e df r o ma q u e o u ss o l ut i o n s b y a c t i v a t e dc h a r c o a lan d ca n b e e l u t e d f r o mt h e a d s o r b a t eb y c e r t a i n o r g a n i cs o l v e n t s ,o r m i x -t u r e s o f s o l v e n t sw i t h w a t e r .

3 . Th e p r o d u c t i o no f p r e p a r a t i o n so f p e n i c i l l i nc o n t a i n i n gu p t o 2 0 0 u n i t s / m g . ,b y a n a d s o r p t i o nan d e l u t i o n p r o c e s s , i s n o w b e i n gc a r r i e d o u t o n al a r g e s c a l e ,t h e mo u ld b e i n g g r o w n i n s p e c i a l l yd e s i g n e dg l a s sf l a s k s .

We t h a n k t h eD i r e c t o r s o f t h e T h e r a p e u t i cR e s e a r c hC o r p o r a t i o nL t d . f o rp e r m i s s i o nt o p u b l i s ht h i sa c c o u n to fo u r w o r k ,a n d w e a l s ow i s h t o r e c o r do u r g r a t i t u d et oP r o f .H . R a i s t r i c kf o rt h e v e r y c o n s i d e r a b l eh e l ph e h a sg i v e nu s t h r o u g h o u to u r i n v e s t i g a t i o n s .We h a v et o t h a n kt o o o u r c o l l e a g u e si nt h e T h e r a p e u t i cR e s e a r c hC o r p o r a t i o n ,e s p e c i a l l yD r J . W. T r e v a n a n d D r C . G . P o p eo f t h eWe l l c o m e , P h y s i o l o g i c a lRe s a r h L a b o r a t o r i e s ,w h o s ec o l l a -b o r a t i o nh a s b e e np a r t i o u l a r l yv a l u a b l e ;t h e i r r e s u l t sh a v eb e e nm a d ef r e e l ya v a i l a b l et o u s a n dh a v eg r e a t l yf a c i l i t a t e do u r w o r k .F i n a l l y ,w e h a v et o a o k n o * l e d g et h e h e l pg i v e n ,i nd e s i g n i n gt h e f l a s k s ,b y M r A .G . H o w k i n s ,a n di nt h el a b o r a -t o r yw o r kb y M e s s r sG . V . C a w t h o r n e ,H . H .S o m e r v i l l e ,a n dt h e

M i s s e sA . M .

H i l l ,J . A .

W i t h y c o m b ea n d J . Wa l d i e .

Vo l . 3 8 ; 7 2 Y


8/8

4 5 8 J . C . CL AY TO N AND O T H E R S I 9 4 4

REFERENCES

A b r a h a m ,E . P . ,C h a i n ,E . ,F l e t c h e r ,C .M . , F l o r Q y ,H . W . ,G a r d n e r ,A . D . , H e a t l e y, N . G . 4 J e n n i n g s ,M . A . 1 9 4 1 ) .L a n c e t ,2 , 1 7 7 .

C a t c h ,J . R . ,C o o k ,A . H . H e i l b r o n ,I . M . 1 9 4 2 ) .N a t u r e ,L o n d . ,1 5 0 ,6 3 3 .

C h a i n ,E . ,F l o r e y ,H . W . , G a r d n e r ,A . D . ,H e a t l e y, N . G . ,J e n n i n g s ,M .A . ,O r r - E w i n g ,J : & S a n d e r s ,A . G . 1 9 4 0 ) .L a n c e t ,2 , 2 2 6 .

C l u t t e r b u c k , P . W . , L o v e l l ,R . R a i s t r i c k ,H . 1 9 3 2 ) .B i o c h e m .J . 2 6 ,1 9 0 7 .

C o u l t h a r d ,C . E . , M i c h a e l i s ,R . , S h o r t ,W. F . , S y k e s , G . ,S k r i m s h i r e ,G . E . H . , S t a n d f a s t ,A . F . B . ,B i r k i n s h a w ,J . H . R a i s t r i c k ,H . 1 9 4 2 ) .N a t u r e ,L o n d . ,1 5 0 , 6 3 4 .

F l e m i n g ,A . 1 9 2 9 ) .B r i t .J . e x , p .P a t h . 1 0 , 2 2 6 .S c h u l t z ,F . 1 9 3 7 ) .N a t u r e ,L o n d . ,1 3 9 ,6 2 9 . 1 9 4 2 ) .T r a n s . F a r a d a yS o c .3 8 ,8 5 , 9 4 .

A C r i t i c a l E x a m i n a t i o no f L u g g ' sM e t h o d f o r t h eD e t e r m i n a t i o no f I - A s c o r b i cA c i d . 2

B Y G . A . SNOW A i m S . S . Z I LVA (Member o f t h e S c i e n t i f i cS t a f f ,M e d i c a lR e s e a r c hC o u n c i l ) ,D i v i a i o no f N u t r i t i on ,L i s t e r I n 8 t i t u t e ,London

( R e c e i v e d1 1 A u g u s t1 9 4 4 )

Ou r p r e v i o u sc o n t r i b u t i o nt o t Q h es u b j e c t ( S n o w Z i l v a ,1 9 4 3 )w a s d e v o t e dm a i n l yt o t h e s t u d y o f t h ek i n e t i c so f t h e c o m b i n a t i o no f p u r e a s c o r b i c a c i d ,r e d u c t i c a c i d an d r e d u c t o n ew i t h HCHO, a n d t h er e s u l t sw e r e u t i l i z e df o r t h e c o n s i d e r a t i o no f t h el i m i t a t i o n so f L u g g ' sm e t h o d 1 9 4 2 ) .F u r t h e ro b s e r -v a t i o n s m a d e u s a w a r e o f t h e f a c t t h a t c e r t a i nm d o p h e n o l - r e d u c i n gs u b s t a n c e sw h i c ha r e f o r m e do n h e a t i n g s o l u t i o n s c o n t a i n i n gg l u c o s ei n t h e p r e -s e n c e o fa l k a l ib e h a v e dd i f f e r e n t l yi nt h e i rc o m b i n a -t i o n w i t h HOHO t o p u r e r e d u c t o n e . I t t h e r e f o r eb e c a m ed e s i r a b l et o i n v e s t i g a t ei n d e t a i lt h e p r o b l e mt h a t a r o s e .T h e r e s u l t sw h i c ha r e r e p o r t e d i n t h i sc o m m u n i c a t i o n ,a p a r t f r o mr a i s i n gp o i n t so f t h e o r e -t i c a li n t e r e s t ,t h r o wf u r t h e r l i g h to n t h e l i m i t a t i o n so f t h e m e t h o d . A t e c h n i q u ew h i c hw e c o n s i d e ry i e l d st h e m o s ts a t i s f a c t o r y r e s u l t su n d e r t h e c i r -c u m s t a n c e si s d e s c r i b e d .

METHODS

R e a g e n t 81 - A 8 c o r b i ca c i da n dr e d u c t i ca c i d s e eS n o w Z i l v a ,1 9 4 1 ) .

R e d u c t o n e s e eS n o w Z i l v a ,1 9 3 8 ) .F o r m a l d e h y d e s e eS now Z i l v a ,1 9 4 3 ) .M e t 4 p h o 8 p h o r i ca c i d . L a b o r a t o r y r e a g e n t .S o l u t i o n s

p r e p a r e df r e s h l ye a c h d a y .P e c t i n .C o m m e r c i a ls p e c i m e np r e p a r e df r o m l e m o n s .

C o m p l e t e l ys o l u b l ei n w a t e r , g i v i n ga n a l m o s t c o l o u r l e s so p a l e s c e n ts o l u t i o n .p H o f 1 w / v s o l u t i o n =3 0 4 . F r e ea c i d - e q u i v a l e n t t o O - 9 8m l .N - N a O H / g .( i n d i c a t o r - p h e n o l -p h t h a l e i n ) .

G l y c i n e .A n a l a rr e a g e n t t w i c er e c r y s t a l l i z e df r o mw a t e r .E t h y l a m i n o a c e t a t eh y d r o c h l o r i d e .P r e p a r e d f r o m A n a l a r

g l y c i n ea n d r e c r y s t a l l i z e df r o me t h a n o l ;m . p . 1 4 3 0 .M e t h y l e n e a m i n b a c e t o n i t r i l e .D i m e r i cf o r m p r e p a r e d b y

t h e m e t h o do f K l a g e s 1 9 0 3 ) ;t w i c e r e c r y s t a l l i z e df r o me t h a n o l ;m . p . 1 2 9 0 .T h e m o l a rc o n c e n t r a t i o n so f t h i sc o m -

p o u n dg i v e ni nt h i sp a p e ra r e c a l c u l a t e do n t h e b a s i so f t h em o n o m e r i cf o r m u l a .

M e t h y l a m i n e .D i l u t e s o l u t i o n sp r e p a r e d f r o m a 3 3a q u e o u ss o l u t i o n .C o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n e db y t i t r a t i o nw i t h H C I .

A l a n i n e d l ) . S y n t h e t i cc o m m e r c i a ls p e c i m e n .G l u t a m i ca c i d .C o m m e r c i a ls p e c i m e nc o n t a i n i n ga m i x - ,

t u r e o ft h e e n a n t i o m o r p h s .O t h e rc o m p o u n d se m p l o y e dw e r ea l lA n a l a rr e a g e n t s .I n d o p h e n o lt i t r a t i o n .S o l u t i o n sc o n t a i n i n ga s c o r b i c a c i d

o r r e d u c t i ca c i d w e r et i t r a t e dd i r e c t l yw i t hm N - 2 : 6 - d i c h l o r o -

p h e n o l i n d o p h e n o l .W i t hr e d u c t o n eo r

a l k a l i - t r e a t e dg l u c o s e

s o l u t i o n s ,h o w e v e r , d i r e c tt i t r a t i o nw a s u n s a t i s f a c t o r yo w i n gt o t h e s lo w n e s s o ft h e r e a c t i o n .I n t h e s e c a s e s t h er e d u c i n gs o l u t i o nw a s r u n i n t oa n e x c e s so f a c i d i f i e di n d o -p h e n o ls o l u t i o n ,a l l o w e dt o r e ac t f o r1 m i n . , a n d t h e e x c e s so f t h e i n d i c a t o rb a c k - t i t r a t e dw i t h s t a b i l i z e dm N - a s c o r b i ca c i d s o l u t i o n .

T r a t m e n to f g l u c o s es o l u t i o n sw i t h v a r y i n gc o n c e n t r a t i o n so f s o d i u mh y d r o x i d e .2 0 m l . 2-5 w / v g l u c o s e s o l u t i o nt o g e t h e r w i t h s u f f i c i e n tw a t e r t o g i v e a t o t a lv o l u m eo f2 5 m l . a f t e rt h e a d d i t i o no ft h e n e c e s s a r yq u a n t i t yo f N aO Hw e r e p l a c e d i n a b o i l i n gt u b e i n a w a t e r - b a t ha t 9 1 . 5 0s 0t h a t t h e t e n p e r a t u r e i n s i d et h e t u b e w a s 9 0 .A f t e r t h ea d d i t i o no f NaOHt h e s o l u t i o n sw e r em i x e df o ra s h o r t t i m eb y a c u r r e n t o f n i t r o g e n ; c o n t i n u o u sb u b b l i n go f t h e g a sw a s u n d e s i r a b l eo w i n gt o e v a p o r a t i o n .At t h e e n d o f t h er e q u i r e dp e r i o dt h e r e a c t i o nw a s s t o p p e db y t h e a d d i t i o no f a s m a l l e x c e s s o f H C I . Th e s o l u t i o n sw e r e c o o l e di n a na t m o s p h e r eo f n i t r o g e n ,d i l u t e dt o a k n o w nv o l u m e ,a n dt h e r e d u c i n gv a l u e a s s e s s e db y i n d o p h e n o lt i t r a t i o n .

B u f f e r sF o r a d j u s t m e n tt o . . . p H 3 - 5 p H 1 - 5

m l .1 0 C C 1 3 C O 2 H 4 1 7 4 1 7g . N a C l 1 6 7 1 6 7g . K H 2 P O 4 2 3 - 3 2 3 - 3g . c i t r i ca c i d 3 6 3 6n i l .4 M - s o d i u ma c e t a t e 1 2 3 3 0 - 4W a t e r To 1 1 . T o l 1 .

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