THESETHESE

En vue de l'obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSEDOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE

Délivré par L'Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spécialité :

Cancérologie

JURY

Pr Catherine SOULA, Professeur des Universités, Toulouse Présidente du Jury Pr Olivier COQUERET, Professeur des Universités, Angers Rapporteur Dr Claude COCHET, Directeur de Recherche, Grenoble Rapporteur Dr May MORRIS, Directeur de Recherche, Montpellier Rapporteur Pr Bernard DUCOMMUN, Professeur des Universités, Toulouse Directeur de thèse Dr Valérie LOBJOIS, Maitre de conférences, Toulouse Co-directrice de thèse

Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologies

Unité de recherche : Institut des Technologies en sciences Avancés du Vivant (ITAV) Directeur(s) de Thèse : Bernard Ducommun et Valérie Lobjois

Rapporteurs : Pr Olivier COQUERET, Dr Claude COCHET, Dr May MORRIS

Présentée et soutenue par Jennifer Laurent

Le 5 Décembre 2012

Titre :

Exploration des points de contrôle du cycle cellulaire dans un modèle 3D, le sphéroïde.

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Remerciements.  En premier  lieu, je tiens à remercier Messieurs Olivier Coqueret, Claude Cochet et Madame May Morris qui m’ont  fait  l’honneur  d’accepter  de  lire  et  de  juger  ces  travaux  de  thèse.  Je  remercie  également sincèrement Madame Catherine Soula pour avoir accepté de présider mon jury de thèse.  J’adresse  également ma  sincère  reconnaissance  au  Professeur  Bernard  Ducommun. Merci  beaucoup Bernard de m’avoir fait confiance il y a de çà trois ans, et de m’avoir permis de réaliser ce travail de thèse au sein de ton équipe de recherche.   Un  énorme merci  à  Valérie  pour  ton  soutien,  patience,  et  gentillesse. Merci  pour  ces  trois  dernières années passées en  ta compagnie, pour  tes conseils et encouragements, et pour  tout ce que  tu as  fait pour moi dans les domaines professionnels ou personnels.  Un grand merci à Céline et Martine sans qui ces travaux de thèse n’auraient pu aboutir. Merci pour votre participation active à ce projet. Merci beaucoup Céline de m’avoir initié et donné goût à la culture en 3D, c’était  super !! Merci pour  tes  conseils et  ton expertise  technique dans ce domaine : de  la culture des sphéroïdes aux immunofluorescences en passant par la joie des coupes à congélation !!! Un grand merci à Odile pour m’avoir initié aux joies de la Biologie Moléculaire lors de ma première année de thèse. Ce fut un plaisir et très agréable d’apprendre à tes côtés !!  Un clin d’œil à mes deux supers collègues de bureau Céline et Odile. Merci pour tous les bons moments qu’on  a  passé,  nos  longues  discussions,  votre  gentillesse,  et  votre  soutien  dans  les moments  les  plus difficiles.  Je  remercie également  tous  les membres de  l’équipe  IP3D pour  leur gentillesse,  leur  soutien, leurs encouragements,  leur esprit d’équipe et bonne humeur permanente. Vous êtes tous et toutes des personnes géniales alors merci pour tout !! Un merci tout particulier à mes copines (et copain !) de labo : Annaïck, Gwen, Steph et Rapha pour votre bonne humeur quotidienne,  tous  les bons moments et  fou rires passés ensemble. Merci sincèrement à tous de m’avoir soutenue dans les moments les plus difficiles, et n’oubliez pas « On va tous mûrir !!! ».  Un grand merci également à Fanny pour le temps passé à l’Arrayscan sur toutes ces longues analyses du pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  ou  le  Fucci‐vert  en  fonction  de  la  distance  à  la périphérie des sphéroïdes !!! Merci pour  ta participation active à  la  réalisation des macros qui ont été indispensables et qui ont vraiment facilité l’analyse et l’obtention de  mes résultats.  Je  remercie  également  tous mes  amis  (Lili,  Steph,  Emy,  Julia,  Elo, Marie‐Anaïs,  Juju,  et mes  anciens collègues  de  l’équipe  Cucu,  copain  Pierre  et  Leyre, ma  post‐doc  préférée !! Merci  à  tous  pour  votre soutien pendant ces trois dernières années et pour votre futur soutien pour  le concours car  je sais que vous  serez  toujours  là  dans  les  bons moments  pour  aller  enflammer  le  dance  floor  du  Planet  Rock, comme dans les moments les plus difficiles !!!  Enfin un grand merci à toute ma famille : mon chéri, ma sœurette, mes parents, ma grand‐mère, et ma belle famille pour leur soutien et encouragements tout au long de ces trois années de thèse.  Ces trois dernières années m’ont vraiment enrichi et permis de mûrir mon projet professionnel, grâce à la réalisation de vacations en Biologie Cellulaire à l’Université.  Il est maintenant temps pour moi de tourner  la page du monde de  la recherche, et de commencer une nouvelle aventure dans le monde de l’enseignement…   

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RESUME DES 

TRAVAUX 

             

    

                 

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Exploration des points de contrôles du cycle cellulaire dans un modèle 3D, le sphéroïde 

 

Directeurs de thèse : Bernard Ducommun et Valérie Lobjois 

Résumé : 

  Le décryptage des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire est essentiel pour comprendre  les mécanismes  régulateurs de  la prolifération ainsi que  leurs dérégulations au  cours du développement tumoral. Cependant, les données actuelles ont pour la plupart été acquises sur des modèles de culture cellulaire  en  monocouche  ne  permettant  pas  de  prendre  en  compte  les  interactions  cellulaires, l'hétérogénéité  tumorale  et  le  microenvironnement,  paramètres  déterminants  pour  la  croissance tumorale et dans la sensibilité aux agents anti‐cancéreux.    Les sphéroïdes sont des modèles de culture 3D multicellulaires caractérisés par  la mise en place au  cours  de  leur  croissance  de  gradients  de  nutriments,  d'hypoxie  et  de  prolifération  mimant l’organisation cellulaire de micro‐régions tumorales. Ainsi, le modèle sphéroïde permet de considérer les interactions et l'hétérogénéité cellulaire ainsi que le microenvironnement.   Dans ce contexte,  l'objectif de ce projet est d'étudier  la dynamique  spatiale et  temporelle de régulation  du  cycle  cellulaire  et  d'activation  des  points  de  contrôle  en  3D  dans  des modèles  de sphéroïdes.   Cette étude  a été  réalisée  sur des  sphéroïdes de  cellules d’adénocarcinome du pancréas de  la lignée Capan‐2. Nous avons  tout d'abord  caractérisé  la mise en place du gradient de prolifération au cours de la croissance grâce à des incorporations d’EdU, ou des marquages dirigés contre l’antigène Ki‐67. Grâce à des modèles originaux de sphéroïdes exprimant des marqueurs fluorescents indicatifs de la position dans le cycle cellulaire, les Fucci, nous avons caractérisé la distribution des cellules dans le cycle cellulaire ainsi que  la régionalisation de cette distribution au cours de  la croissance des sphéroïdes. La deuxième  partie  des  travaux  réalisés  a  été  consacrée  à  l'évaluation  de  l'utilisation  des modèles  de sphéroïdes Capan‐2/Fucci pour  l'exploration de  la dynamique spatiale et temporelle de  l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire en réponse à une exposition à divers types de stress comme une privation en  facteur de croissance, des traitements pharmacologiques ou des dommages à l’ADN induits par des radiations ionisantes.   Les  résultats  obtenus montrent  l’intérêt  de  l’utilisation  de  sphéroïdes  génétiquement modifiés pour étudier l’activation des points de contrôle au sein d’une population cellulaire tumorale hétérogène et régionalisée, prenant en compte les interactions cellulaires et l’importance du microenvironnement.   Cette étude ouvre la possibilité d’explorer les mécanismes moléculaires de l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire en 3D, ainsi que l’étude dynamique de la réponse à de nouveaux agents anti‐prolifératifs dans la perspective d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. 

Mots‐clés : Cycle cellulaire, points de contrôle, modèle 3D, sphéroïde.       

Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS3039, Centre Pierre Potier 1 place Pierre Potier ‐ BP 50624 

31106 TOULOUSE Cedex 1 

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Cell cycle checkpoints exploration in a 3D model, the spheroids 

 

PhD directors : Bernard Ducommun and Valérie Lobjois 

Abstract : 

  Deciphering  cell  cycle  control  mechanism  is  essential  to  understand  the  involvement  of  its deregulation  in  tumor development  and  to  identify new  therapeutic  targets. However, many  studies have been performed on monolayer‐cell based models  that do not allow considering cell  interaction, heterogeneity  and  tumor  microenvironment  that  are  essential  parameters  of  tumor  growth  and resistance to treatments.    Multi Cellular Tumor Spheroid  (MCTS) 3D model mimics  the organization of a non‐vascularized tumor micro‐region  and  is  considered  as  an  invaluable model  to  study  cancer  cell  biology  and  to evaluate new antiproliferative drugs.   In  that  context,  the objective of  this project  is  to  study  the  spatio‐temporal dynamics of  cell cycle regulation and checkpoints activation in 3D by using original spheroids models.   We used a model of tumor pancreatic Capan‐2 cells spheroid. In a first part, we characterized the proliferation gradient during the growth of spheroids by using EdU incorporation and KI‐67. By using an original genetically modified  spheroid model expressing  the  fluorescent Fucci  cell  cycle  reporters, we quantitatively  correlate  the  rate of proliferation  and  the distribution of  cells  in  the  cell  cycle phases depending on their position inside spheroids. In a second part, we evaluated the use of these models to explore  the  response  to  the  activation  cell  cycle  checkpoints  following  exposure  to  various  types  of stress like growth factor deprivation, pharmacological treatments or exposition to DNA damage induced by ionizing radiation.   Our data demonstrate  the  interest of using such genetically modified spheroids  to study at  the cellular  level  the  response  to  checkpoint  activation  in  a  regionalized  heterogeneous  tumor  cell population taking into account cell‐microenvironment interactions.   This study paves the way for the investigation of the molecular aspects of checkpoint response in 

3D models and the dynamic studies of the 3D response to novel antiproliferative agents.  

Key words : Cell cycle, checkpoints, 3D model, spheroïd.            

Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS3039, Centre Pierre Potier 1 place Pierre Potier ‐ BP 50624 

31106 TOULOUSE Cedex 

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TABLE DES MATIERES

 

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INTRODUCTION GENERALE............................................................................... 13

I. Cycle cellulaire et cancer...............................................................................................16

A) Contrôle du cycle cellulaire.............................................................................................................. 16 B) Les points de contrôle du cycle cellulaire ........................................................................................ 24

II. La tumeur, un véritable organe en forte interaction avec son microenvironnement.....40

A) Le microenvironnement est un paramètre essentiel du développement d’une tumeur................ 40 B) Les différents éléments du microenvironnement tumoral et résistance multicellulaire. ............... 42

III. Un modèle 3D de micro‐tumeur in vitro, le sphéroïde ..................................................48

A) Le modèle sphéroïde mime in vitro l'organisation d'une micro‐tumeur......................................... 50 B) Un modèle plus prédictif  de la réponse aux traitements ............................................................... 54 C) Le modèle de sphéroïde reproduit la résistance multicellulaire ..................................................... 54 D) Un modèle de choix pour l’évaluation de la réponse aux traitements............................................ 57

RESULTATS....................................................................................................... 61

I. Caractérisation de  la dynamique spatiale et  temporelle du contrôle du cycle cellulaire au cours de la croissance des sphéroïdes Capan‐2. ................................................................62

A) Mise en place du gradient de prolifération au cours de la croissance des sphéroïdes Capan‐2..... 62 B) Analyse de la répartition des cellules dans le cycle cellulaire au cours de la croissance des sphéroïdes Capan‐2.............................................................................................................................. 67

II. Obtention  et  caractérisation  d'un  modèle  de  sphéroïde  Capan‐2  exprimant  des rapporteurs de la position des cellules dans le cycle, les Fucci. ..............................................68

A) Validation de l'expression des rapporteurs Fucci dans les différentes phases du cycle au sein des sphéroïdes Capan‐2/Fucci. ................................................................................................................... 70 B) Caractérisation spatiale et temporelle de la répartition des cellules dans les différentes phases du 

cycle cellulaire dans les sphéroïdes Capan‐2/Fucci. ............................................................................ 72

III. Etude des modifications de  la dynamique du cycle cellulaire en  réponse à  l'activation des points de contrôle du cycle cellulaire en 3D.....................................................................76

A) Validation de la variation d'expression des rapporteurs Fucci dans les cellules Capan‐2 en réponse en réponse à l'activation des points de contrôle G1/S et G2/M.......................................................... 76 B) Activation des points de contrôle du cycle cellulaire en 3D. ........................................................... 80

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1)  Modification  de  la  dynamique  du  cycle  cellulaire  au  sein  des  sphéroïdes  en  réponse  à  une  carence  en  EGF.  .................................................................................................................................................  80  2)  Étude  de  la  réponse  à  un  arrêt  en  G1  induit  par  de  la  lovastatine  ...................................................  83  3)  Étude  de  l’arrêt  au  point  de  contrôle  G2/M  induit  par  l’étoposide  ..................................................  84  4)  Analyse  de  l'activation  des  points  de  contrôle  du  cycle  cellulaire  induit  par  l'exposition  à  des  radiations  ionisantes  en  3D  ..................................................................................................................  86  

DISCUSSION  ET  PERSPECTIVES  .........................................................................  99  

I.   Les  marqueurs  Fucci  pour  suivre  la  distribution  dans  le  cycle  cellulaire.  .....................  100  

II.   Caractérisation  de   la  mise  en  place  du   gradient  de  prolifération,   et   de  dynamique  du  cycle  cellulaire  associée,  au  cours  de  la  croissance  de  sphéroïdes  Capan-­‐2/Fucci.  ................  102  

III.  L’absence  d’EGF  induit  l’entrée  en  quiescence  des  sphéroïdes  Capan-­‐2/Fucci.  ...........  104  

IV.  Les   sphéroïdes  Capan-­‐2/Fucci,  modèles  pour   l’évaluation  de  molécules  à  activité  anti-­‐prolifératives  ......................................................................................................................  106  

V.  Analyse  de  la  réponse  aux  radiations  ionisantes.  ........................................................  108  

REFERENCES  BIBLIOGRAPHIQUES  ...................................................................  125  

PUBLICATION  ..................................................................................................  139  

13 

 

  

 

 

INTRODUCTION 

GENERALE 

 

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15 

 

Les cellules de notre organisme  sont continuellement exposées à divers agents physiques ou 

chimiques créant des dommages sur l’ADN. Des mécanismes de détection et de réparation des 

lésions sont mis en jeu pour maintenir l’intégrité du génome. Toutefois, lorsque l’exposition aux 

agents  carcinogènes est  trop  importante ou provoque des mutations  altérant  la  fonction de 

protéines  impliquées  dans  ces  mécanismes  protecteurs,  des  altérations  génomiques 

apparaissent pouvant conduire à  l’établissement et au développement   de cellules tumorales. 

Le  processus  tumoral  peut  être  décrit  comme  un  processus  constitué  de  plusieurs  étapes 

durant  lequel  les  cellules  cancéreuses  accumulent  de  multiples  altérations  génomiques 

consécutives  (Hanahan and Weinberg 2000). Au cours des dernières décennies, de nombreux 

oncogènes et suppresseurs de tumeurs dont les mutations et/ou dérégulations sont impliquées 

dans  le  processus  tumoral  ont  ainsi  été  identifiés.  Ces  altérations  génomiques  conduisent  à 

l’établissement  de  caractéristiques  de  la  physiologie  cellulaire  tumorale :  une  autosuffisance 

vis‐à‐vis  des  signaux  prolifératifs,  une  insensibilité  aux  signaux  antiprolifératifs,  une  capacité 

migratoire et  invasive des cellules tumorales dans  les tissus environnants, propriété  impliquée 

dans  la progression métastatique,  l’acquisition d’un potentiel réplicatif illimité,  l’activation des 

mécanismes d’angiogénèse et d’échappement à  la mort cellulaire programmée par apoptose 

(figure  1).  Virtuellement,  tous  les  cancers  doivent  acquérir  les  mêmes  caractéristiques, 

cependant, l’ordre d’apparition des différents événements est probablement très variable étant 

donné le large éventail de types de tumeurs.  

Comme  le montre  la  figure 1,  les dérégulations du contrôle de  la prolifération sont au 

cœur des événements associés à  l’apparition d’une  tumeur, aboutissant à une multiplication 

anarchique des cellules tumorales et donc à la progression de la tumeur. Un paramètre majeur 

du contrôle de  la prolifération étant  la régulation de  la progression des cellules dans  le cycle 

cellulaire,  l’étude  des mécanismes  de  contrôle  du  cycle  cellulaire  présente  donc  un  intérêt 

majeur pour  la compréhension des dérégulations  impliquées dans  le développement tumoral 

et pour le développement de stratégies thérapeutiques anti‐tumorales. 

  Les  travaux  réalisés portant  sur  l’utilisation de modèles  tumoraux multicellulaires pour 

l’étude de l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire, nous présenterons brièvement 

dans une première partie  les principaux mécanismes de  contrôle de  la progression du  cycle 

cellulaire.  

16 

 

I. Cycle cellulaire et cancer 

  Le  cycle  cellulaire  est  le  processus  fondamental  par  lequel  une  cellule  mère  donne 

naissance  à deux  cellules  filles  identiques. On  le décompose  classiquement en deux  grandes 

étapes,  l’interphase et  la mitose, dont  les  caractéristiques principales  sont  rappelées dans  la 

figure 2. 

A) Contrôle du cycle cellulaire  

 

1) Les complexes Cdk‐cyclines 

   Les mécanismes de  régulation du  cycle  cellulaire  eucaryote  sont  finement  régulés par 

l’activation  de  différents  complexes  enzymatiques  constitués  d’une  sérine/thréonine  kinase 

appelée  kinase  dépendante  des  cyclines  (Cycline‐dependent  kinase)  ou  Cdk  et  d’une  cycline 

régulatrice. Depuis l’identification initiale du M‐phase Promoting Factor (MPF) dans des extraits 

d’ovocytes de xénope et de nombreux gènes Cdc impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire 

chez  la  levure,  de  nombreuses  cyclines  et  Cdk  ont  été  caractérisées.  Le  prix  Nobel  de 

physiologie et de médecine a été attribué à Leyland Hartwell, Timothy Hunt, et Paul Nurse en 

2001  pour  leurs  travaux  pionniers  sur  le  décryptage  des  mécanismes  de  régulation  de  la 

progression  du  cycle  cellulaire.  L’ensemble  de  ces  travaux  a  permis  de  proposer  un modèle 

général du contrôle de  la progression dans  le cycle cellulaire, dans  lequel  les complexes Cdk‐

Cycline sont des oscillateurs centraux régulant la progression dans le cycle cellulaire. L’analyse 

globale du génome humain a permis l’identification de onze gènes codant pour des Cdk (Cdk1 à 

Cdk11), ainsi que 29 gènes  codant des protéines de  la  famille des  cyclines,  sur  la base de  la 

présence du domaine cyclin‐box, un enchaînement conservé de 150 acides aminés. Ce domaine 

très  conservé  constitue  la  signature  d’appartenance  à  la  famille  des  cyclines  et  permet  la 

fixation de protéines partenaires, notamment  les Cdk. Il est  important de noter qu’il existe un 

niveau de complexité supérieur au niveau de l’expression des cyclines, du fait de l’existence de 

différents isoformes des cyclines issus de gènes différents (Cycline A1 et A2 ; Cycline B1, B2 et 

B3 ; Cycline D1, D2 et D3 ; Cycline E1 et E2) (Malumbres and Barbacid 2009). 

 

17 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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1.1)  Le rôle des complexes Cdk‐Cyclines dans la progression du cycle 

cellulaire 

  Les complexes Cdk‐cyclines jouent un rôle essentiel dans le déclenchement, le contrôle et 

la  succession harmonieuse des différentes phases du  cycle  cellulaire.  Les Cdk  constituent  les 

sous‐unités catalytiques de ces complexes et ne sont actives que  lorsqu’elles sont associées à 

une cycline, sous‐unité régulatrice du complexe. L’expression des Cdk est constante durant  le 

cycle cellulaire, tandis que l’expression des cyclines varie en fonction de la progression dans le 

cycle  cellulaire  (figure  3).  Différents  complexes  Cdk‐cyclines  contrôlent  la  progression  des 

cellules au cours des différentes étapes du cycle cellulaire (figure 4). Les kinases Cdk4 et Cdk6 

associées à des cyclines de type D, régulent le déroulement de la phase G1. Le complexe Cdk2‐

cycline  E  contrôle  la  transition  G1/S,  suivie  par  Cdk2‐cycline  A  qui  assure  le  contrôle  de  la 

progression en phase S et en phase G2. Le complexe Cdk1‐cycline B régule la transition G2/M, 

ainsi que l’entrée des cellules en mitose (figure 4) (Malumbres and Barbacid 2009, 2005). 

1.2)  Régulation des complexes Cdk‐Cyclines 

  Sous  forme monomérique,  les  kinases Cdk  sont  inactives.  L’activation des Cdk  requiert 

l’association  avec  une  cycline  (figure  5).  La  liaison  d’une  cycline  à  une  Cdk monomérique 

stimule fortement son activité kinase in vitro (Connell‐Crowley et al. 1993). La liaison entre les 

deux protéines se fait principalement par  l’intermédiaire du domaine PSTAIRE de  la Cdk, et  le 

domaine cyclin box de  la cycline. L’oscillation de  la concentration en cycline dans  la cellule est 

en  partie  responsable  des  changements  d’activité  des  Cdk  observées  au  cours  du  cycle 

cellulaire (Pines 1999). A chaque étape clé de la progression dans le cycle cellulaire, le niveau de 

cycline  est  en  effet  contrôlé  par  de  nombreux  mécanismes  allant  de  la  régulation  de  la 

transcription  des  gènes  des  cyclines  (Breeden  2000),  à  la  dégradation  des  cyclines  par  un 

adressage au protéasome en fonction de la position dans le cycle cellulaire (Deshaies 1995).  

  Un  autre  niveau  de  régulation  des  complexes  Cdk‐cyclines  concerne  leur  localisation 

subcellulaire.  La  localisation  nucléaire  des  cyclines  A,  D  et  E  reflète  le  rôle  des  complexes 

auxquels elles appartiennent dans  le contrôle de  la transcription et de  la réplication de  l’ADN. 

Pendant la phase G2, la cycline B1 fait la navette entre le noyau et le cytoplasme avec un export  

19 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

20 

 

nucléaire  supérieur  à  l’import,  expliquant  sa  localisation  principalement  cytoplasmique  en 

phase G2 (Porter and Donoghue 2003). Ceci est lié d’une part à la présence d’une séquence CRS 

(Cytoplasmic Retention Signal) qui est nécessaire et suffisante pour retenir la cycline B1 dans le 

cytoplasme  (Pines and Hunter 1994), et d’autre part à  la présence d’une NES  (Nuclear Export 

Signal). A  l’entrée en mitose, une  fraction des  complexes Cdk1‐  cycline B1 est  relocalisée au 

centrosome  et  joue  un  rôle  primordial  dans  l’initiation  de  la mitose,  dans  la  séparation  des 

centrosomes et donc à l’établissement du fuseau mitotique (Schmitt et al. 2006; Boutros et al. 

2006; De Souza et al. 2000). La cycline B1 est également phosphorylée par la kinase Plk1 (Polo 

like  kinase  1)  (Toyoshima‐Morimoto  et  al.  2001),  conduisant  à  la  localisation  nucléaire  du 

complexe Cdk1‐cycline B1.  

  L’activité des complexes Cdk‐cyclines peut‐être négativement régulée par leur interaction 

avec des  inhibiteurs de Cdk,  les CKI (Cyclin‐dependant Kinase  Inhibitor). Chez  les mammifères, 

deux familles de CKI sont décrites : la famille Cip/Kip et la famille INK4 (Inhibitors of Cdk4). Les 

protéines de la famille Cip/Kip (p21Cip1, p27Kip1 et p57Kip2) s’associent à tous les complexes Cdk‐

cyclines, alors que les CKI de la famille des INK4 (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c et p19INK4d) inhibent 

les  complexes  Cdk4/6‐cycline  D.  Des  données  structurales  semblent  indiquer  un  mode 

d’interaction et d’inhibition différent selon  la famille d’inhibiteur. La famille des Cip/Kip en se 

fixant  sur  les  complexes  Cdk‐cyclines,  empêcheraient  la  fixation  de  l’ATP  au  niveau  du  site 

catalytique de la kinase, ainsi que la phosphorylation de la T‐loop par la kinase CAK, nécessaire 

à  l’activation  complète  du  complexe  Cdk‐cycline  (Lee  et  al.  1995).  Paradoxalement,  les 

inhibiteurs Cip/Kip ont également une action activatrice sur les complexes Cdk4/6‐cycline D, en 

favorisant leur assemblage. Les membres de la famille INK4 inhibent l’activité kinase des Cdk4/6  

en perturbant  la  liaison avec  la  cycline D.  Ils  se  lient à  la Cdk monomérique, entraînant une 

distorsion de la kinase qui altère la fixation de l’ATP et de la cycline.  

  Un  aspect  majeur  de  la  régulation  de  l’activation  des  complexes  Cdk‐cyclines  est  la 

phosphorylation/déphosphorylation de  résidus Thr et Tyr  (T14 et Y15 pour Cdk1)  localisés au 

niveau du  site catalytique. Ces  résidus  sont maintenus phosphorylés par  les kinases Wee1 et 

Myt1. Leur déphosphorylation, nécessaire à l’activation des complexes Cdk‐cycline, est réalisée 

par  les phosphatases de  la famille Cdc25, conservée au cours de  l’évolution. Un seul gène est 

présent chez la levure, tandis que trois isoformes ont été identifiés chez les mammifères : 

21  

 

Figure'5':'Représenta1on'schéma1que'de'l�ac1va1on'des'complexes'Cdk=cyclines''L�associa'on) entre) une) Cdk) et) sa) cycline) régulatrice) (Cyc)) s�effectue) par) l�intermédiaire) d�un)mo'f)conservé)des)Cdk,) le)domaine)PSTAIRE,)et)d�une)séquence)conservée)des)cyclines,) la)cyclin&box&(Cyc)Box).)CeHe)liaison)entraine)un)changement)conforma'onnel)qui)permet)une)réorienta'on)du) résidu) cataly'que) glutamate) et) l�accès) au) substrat) (S)) au) site) cataly'que.) La) fixa'on) de) la)cycline)permet)également)un)mouvement)de)la)TMloop,)exposant)un)résidu)thréonine)conservé,) la)Thr160,)161)ou)168)en)fonc'on)du)type)de)Cdk,)dont)la)phosphoryla'on)par)la)CAK)est)nécessaire)à)l�ac'va'on)de) la)Cdk.)Pour)achever) leur)ac'va'on,) les)Cdk)doivent)être)déphosphorylées)par) les)phosphatases)Cdc25)sur)deux)résidus)conservés,)correspondant)à)la)Thr14)et)à)la)Tyr15)de)Cdk1,)qui)se) situent) dans) la) région) de) fixa'on) de) l�ATP.) Les) Cdk) sont) maintenues) inac'ves) par) la)phosphoryla'on)de)ces)résidus)par)les)kinases)Wee1)et)Myt1.)''

T-loop

Figure'6':'Oscilla/on'de'l�ac/vité'des'complexes'APC/C'et'SCF'au'cours'du'cycle'cellulaire''Le#complexe#APC/C#est#principalement#ac4f#en#mitose#et#en#phase#G1,#tandis#que#le#complexe#SCF#est#ac4f#au#cours#des#phases#S#et#G2#du#cycle#cellulaire#

APC/C

Activité du complexe APC/C

SCF

APC/C

APC/C

SCF

Activité du complexe SCF

SCF

SCF

 

22 

 

Cdc25A,  B,  et  C,  chacune  possédant  des  variants  d’épissage.  Les  phosphatases  Cdc25  sont 

responsables  de  la  déphosphorylation  et  donc  de  l’activation  des  différents  complexes  Cdk‐

cyclines aux différentes  transitions clés du cycle cellulaire. Les phosphatases Cdc25  semblent 

impliquées dans  l’activation du complexe Cdk1‐cycline B1, dans des compartiments cellulaires 

distincts (Boutros et al. 2006). Il a en effet été montré que Cdc25B active les complexes Cdk1‐

cycline B1 localisés au centrosome (Lindqvist et al. 2005), puis que Cdc25A (Mailand et al. 2002) 

et  Cdc25C  (Karlsson  et  al.  1999)  permettent  une  activation  complète  au  niveau  nucléaire. 

D’autre part  les phosphatases Cdc25 sont phosphorylées par  les Cdk, créant ainsi une boucle 

d’auto‐amplification (Hoffmann et al. 1993; Izumi and Maller 1993). 

2) Rôle de la protéolyse dans la progression du cycle cellulaire 

  Les complexes APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) et SCF (Skp1, Culline and 

F‐box)  possèdent  une  activité  E3‐Ubiquitine  ligase  permettant  la  dégradation  d’un  grand 

nombre de protéine sur la base de l’ubiquitination de manière cycle cellulaire dépendante. Les 

complexes SCF et APC/C sont des substrats  l’un pour  l’autre  (Wei et al. 2004). Leurs activités 

oscillent de manière réciproque au cours du cycle cellulaire. Le complexe APC/C est actif en fin 

de mitose et en phase G1, alors que  le complexe SCF est actif en phase S et G2 (figure 6). Au 

cours  de  la  mitose,  le  complexe  APC/C  est  associé  à  la  protéine  Cdh1.  Ce  complexe  est 

maintenu inactif par la phosphorylation de Cdh1 par le complexe Cdk1‐cycline B. A la transition 

métaphase‐anaphase, l’APC/C se dissocie de Cdh1 pour s’associer à Cdc20. Le complexe APC/C‐

Cdc20  alors  actif  permet  la  dégradation  de  la  sécurine  et  de  la  cycline  B,  conduisant  à  la 

décondensation des chromosomes et à l’assemblage de l’enveloppe nucléaire, permettant ainsi 

la sortie de mitose. Le complexe SCF  inhibe par exemple  le complexe Cdk2‐cycline E en début 

de phase S, en dégradant la cycline E, afin d’éviter des phénomènes de re‐réplication. 

  A titre d’exemple, l’oscillation des protéines Cdt1 et geminine au cours du cycle cellulaire 

reflète  l’activité  réciproque des  complexes APC/C et SCF.  La protéine Cdt1 est un  facteur de 

réplication de  l’ADN,  impliquée dans  la formation des complexes de pré‐réplication au niveau 

des origines de  réplication. La geminine  inhibe  l’activité de Cdt1 au début de  la phase S afin 

d’assurer qu’il n’y est qu’une seule réplication au cours du cycle cellulaire (Wohlschlegel et al. 

2000; Machida et al. 2005). La protéine Cdt1 est un substrat spécifique du complexe SCF et est, 

par conséquent exprimée au cours de la phase G1 et dégradée en S/G2 et mitose. Au contraire,  

23 

 

24 

 

la geminine est un substrat du complexe APC/C est exprimée au cours des phases S, G2 et M et 

est dégradée à la transition métaphase/anaphase. 

 

B) Les points de contrôle du cycle cellulaire 

 

Les points de contrôle du cycle cellulaire, également appelés « checkpoints », sont des 

mécanismes  de  surveillance mis  en  place  par  la  cellule  pour  vérifier  que  tous  les  éléments 

essentiels  à  la  progression  du  cycle  cellulaire  soient  présents  et  fonctionnels  à  une  étape 

donnée, et permettent  le maintien de  l’intégrité du génome (Hartwell and Weinert 1989). Les 

points de  contrôle modulent  ainsi  la progression des  cellules  à  travers  le  cycle  cellulaire, en 

réponse à des signaux  intracellulaires, ou environnementaux (figure 7). Ces points de contrôle 

sont mis en place aux différentes transitions clés du cycle cellulaire afin qu’une cellule ne puisse 

pas entamer une phase, si les phases précédentes ne se sont pas correctement achevées ou si 

des lésions de l’ADN sont détectées.  

1) Le point de restriction « R » 

Le point de restriction (figure 8) est un point de non retour en phase G1 à partir duquel 

les  signaux mitogéniques ne  sont plus  requis pour  la progression dans  le cycle cellulaire. Les 

cellules ayant passé le point de restriction sont engagées de manière irréversible dans le cycle 

cellulaire  et  peuvent  proliférer  indépendamment  des  stimuli  mitogéniques.  Ce  point  de 

contrôle  a  été mis  en  évidence  par  des  expériences  de  privation  en  facteurs  de  croissance 

(Pardee 1974). Il divise la phase G1 en une phase G1 précoce et une phase G1 tardive. Dans des 

cellules en culture, le point de restriction se situe 3 à 4 heures après la mitose. En revanche, la 

phase G1 tardive (du point de restriction à la phase S) a une durée plus variable, de 1 heure à 

10  heures.  Cette  variabilité  explique  les  différences  qui  existent  dans  la  longueur  du  cycle 

cellulaire.  L’hyperphosphorylation de  la protéine Rb  (Retinoblastoma protein) médiée par  les 

Cdk, et  la  libération ainsi que  l’activation concomitante du  facteur de  transcription E2F,  sont 

des aspects importants du contrôle du point de restriction dans les cellules normales (figure 8). 

On  peut  considérer  que  la  cellule  passe  le  point  de  restriction  au moment  où  elle  a,  sous 

l’influence de facteurs de croissance, suffisamment synthétisé de cycline D et suffisamment mis  

25 

 

CycD

P

CycD CycE

P

Signaux mitogéniques

Insensibilité aux signaux

mitogéniques

Passage du point de restriction

Figure 8 : Représenta on schéma que du point de restric on En phase G1, les cellules reçoivent des signaux proliféra fs conduisant à la synthèse de la cycline D, qui s’associe à ces cyclines régulatrices Cdk4/6. Les complexes Cdk4/6‐cycline D une fois ac fs vont phosphoryler la protéine Rb, ce qui inhibe son ac vité. Le complexe Cdk2‐cycline E phosphoryle également la protéine Rb, ce qui conduit à son inhibi on totale et ainsi à la dissocia on du facteur de transcrip on E2F. La cellule devient ainsi insensible aux signaux mitogéniques et passe le point de restric on de la phase G1, et s’engage à poursuivre son cycle cellulaire.

26 

 

en place de  complexes Cdk2‐Cycline E phosphorylant pRb (Blagosklonny and Pardee 2002). Des 

signaux mitogéniques induisent la synthèse de la cycline D, ainsi que le transport  des protéines 

Cdk4 et Cdk6 vers le noyau (Sherr 1995). Les complexes Cdk4/6‐cycline D actifs phosphorylent 

et  inactivent  les membres de  la famille des protéines du rétinoblastome (pRb, p107, et p130) 

(Ho and Dowdy 2002). Cette inhibition conduit à la libération des facteurs de transcription E2F, 

et ainsi à la transcription de la cycline E, nécessaire pour le passage de la phase G1 à la phase S. 

Il semblerait que  les complexes Cdk4/6‐cycline D  initient ce processus de phosphorylation de 

pRb  (forme  hypophosphorylée),  permettant  dans  un  premier  temps  une  activation 

transcriptionnelle  partielle.  Une  phosphorylation  supplémentaire  de  pRb  (forme 

hyperphosphorlée) par  le complexe Cdk2‐cycline E permet  la  libération complète des facteurs 

E2F,  et  donc  leur  action maximale  comme  activateurs  transcriptionnels  (Boonstra  2003). Un 

composant clé dans la mise en place du point de restriction pourrait être l’activité de la kinase 

Cdk2 contrôlée par la cycline E. Lorsque l’activité de Cdk2 augmente rapidement en phase G1, 

elle  finie par atteindre un  taux à partir duquel elle devient  insensible aux  inhibiteurs CKI. Les 

cellules deviennent ainsi insensibles aux signaux mitogéniques et aux signaux anti‐prolifératifs. 

2) Les points de contrôles activés en réponse à des lésions de l’ADN 

En réponse à des dommages à l’ADN générés par différents types d'agents physiques ou 

chimiques,  un  réseau  complexe  de  voies  de  signalisation  est  activé  ayant  pour  but  ultime 

l’inactivation des complexes Cdk‐cyclines, régulateurs centraux de  la progression dans  le cycle 

cellulaire aboutissant à  l’arrêt des cellules à  la  transition G1/S, G2/M et en phase S  (Dai and 

Grant  2010).  Les  acteurs  de  ces  voies  de  signalisation  peuvent  être  classés  en  5  catégories 

(figure 9). Des protéines senseurs (complexe 9‐1‐1, Rad‐17/RFC, RPA et MRN) sont tout d’abord 

recrutées  au niveau des  sites de  cassures,  facilitant  le  recrutement des médiateurs  tels que 

BRCA1, 53BP1, MDC1, Claspine, ou H2AX (Bartek and Lukas 2007; Dai and Grant 2010).   ATM 

(Ataxia Telangiectasia Mutated) dont  l'altération homozygote conduit à  l'ataxie télangiectasie, 

une maladie  associée  à une  forte prédisposition  au  cancer, et ATR  (ATM‐ and Rad3‐related) 

constituent des transducteurs apicaux qui phosphorylent et activent  les transducteurs distaux 

que  sont  les  kinases  de  point  de  contrôle  (ou  Checkpoint)  Chk1  et  Chk2.  Il  fut  initialement 

proposé qu’ATM soit activée et phosphoryle Chk2 en réponse à des cassures doubles brins de 

l’ADN, et que Chk1 soit phosphorylée par ATR en présence d’ADN simple brin.  

27 

 

Figure 9 : Représenta on schéma que de l’organisa on des points de contrôle du cycle cellulaire Les dommages à l’ADN sont détectées grâce aux senseurs. La mise en place d d’une cascade de signalisa on conduit alors à l’arrêt des cellules dans le cycle cellulaire, ou à la répara on des dommages par l’ac va on ou l’inhibi on des effecteurs. Lorsque les dommages sont trop importants ou mal réparés, ce e voie de signalisa on abou t à l’induc on de la mort cellulaire programmée par apoptose.

DOMMAGES A L’ADN

SENSEURS

MEDIATEURS

TRANSDUCTEURS Apicaux

TRANSDUCTEURS Distaux

EFFECTEURS

Arrêt du cycle cellulaire

Répara on des dommages

Mort cellulaire par apoptose

28 

 

Il  est  maintenant  admis  qu’en  réponse  à  des  radiations  ionisantes  induisant  des  cassures 

doubles brins de l’ADN les kinases ATM et ATR participent à une même voie de signalisation et 

phosphorylent à  la  fois Chk1 et Chk2  (Cuadrado et al. 2006;  Jazayeri et al. 2006). L’activation 

des  kinases  Chk1  et  Chk2  est  facilitée  par  leur  recrutement  dépendant  de  l’activation  de 

ATM/ATR via des médiateurs sur  les sites de cassures  (Bartek and Lukas 2007; Dai and Grant 

2010). Les kinases Chk1 et Chk2 phosphorylent à leur tour plusieurs substrats. 

En réponse à une exposition à des radiations  ionisantes, ou à des UV en phase G1,  les 

kinases Chk1/2 phosphorylent les phosphatases Cdc25A  (Mailand et al. 2000), provoquant leur 

dégradation rapide par  le protéasome, après ubiquitylation par  le complexe SCF (Busino et al. 

2003)  (figure  10).  Cdc25A  une  fois  dégradée  ne  permet  plus  la  déphosphorylation  des 

complexes Cdk4/6‐cycline D, ou Cdk2‐cycline E maintenus inactifs, induisant respectivement un 

arrêt de  la progression  en G1, ou  empêchant  l’initiation de  la  réplication de  l’ADN  (Dai  and 

Grant  2010). Une  réponse  plus  tardive,  dépendante  du  facteur  de  transcription  p53  se met 

également en place pour assurer un maintien prolongé de l’arrêt en G1 initié par la dégradation 

de Cdc25A (figure 10). Cette réponse met en jeu une stabilisation de la protéine p53 suite à sa 

phosphorylation par ATM et sa dissociation de  la protéine mdm2. En effet,  la phosphorylation 

de mdm2  par  les  kinases Chk1/2  inhibe  l’interaction mdm2/p53  (Chene  2003;  Stommel  and 

Wahl 2004), la dégradation de mdm2 étant induite par sa fixation à p14ARF. La stabilisation de la 

protéine  p53  induit  une  augmentation  de  la  transcription  du  CKI  p21CIP1,  responsable  de 

l’inhibition  des  complexes  Cdk/cycline  (Kastan  and  Lim  2000; Wahl  and  Carr  2001;  Dai  and 

Grant). 

Les kinases Chk sont également impliquées dans les points de contrôle en phase S. Lors 

de la détection de dommages à l’ADN au niveau des fourches de réplication, les complexes 9‐1‐

1,  Rad17‐RFC  et  ATR‐ATRIP  (ATR  Interacting  Protein)  sont  recrutés  au  niveau  des  sites  de 

dommages, provoquant  le recrutement et l’activation de la kinase Chk1. Chk1 une fois activée 

induit  la  phosphorylation  de  la  phosphatase  Cdc25A,  conduisant  à  sa  dégradation 

protéolytique,  et  donc  comme  expliqué  précédemment  à  l’inhibition  des  complexes  Cdk2‐

cycline E/A,  inhibant ainsi  la progression en phase  S  (Xiao et al. 2003;  Sorensen et al. 2003) 

(figure 11). D’autre part, Chk1 semble impliqué dans la mise en place de ce point de contrôle de 

la réplication par un mécanisme indépendant de la phosphorylation de Cdc25A. En effet, des  

29 

 

 

30 

 

31 

 

travaux démontrent que Chk1  régulerait de manière négative  l’association des complexes de 

réplication au niveau des origines de réplication  (Liu et al. 2006). De manière  intéressante,  la 

voie  ATM/ATR/Chk1/Chk2/Cdc25A  semble  également  impliquée  dans  la  régulation  de  la 

réplication en absence de dommages à  l’ADN (Sorensen et al. 2004; Shechter et al. 2004). Par 

ailleurs,  l’apparition de  cassures doubles brins  indépendantes du processus de  réplication et 

générées à  l’extérieur des origines de réplication actives  (figure 12)  induit  le recrutement des 

médiateurs MDC1, 53BP1, BRCA1, permettant l’activation d’ATM, et de la claspine permettant 

l’activation d’ATR (Bartek et al. 2004). Deux voies de signalisation indépendantes sont décrites 

dans l’établissement de ce point de contrôle, toutes deux régulées par ATM (Falck et al. 2002; 

Yazdi  et  al.  2002;  Kim  et  al.  2002).  La  première  fait  intervenir  la  voie  ATM/ATR/Chk1/Chk2 

aboutissant  comme  décrit  ci‐dessus  à  la  dégradation  de  Cdc25A  et  donc  au  maintien  de 

l’inactivation du complexe Cdk2‐cycline A, empêchant  la progression en phases S  (Falck et al. 

2001).  La seconde voie est indépendante de la dégradation de Cdc25A, et fait intervenir ATM, 

NBS1, BRCA1 et SMC1  (Falck et al. 2002; Yazdi et al. 2002; Kim et al. 2002). La perte ou des 

mutations de ces protéines résulte en une atténuation du point de contrôle intra‐S, témoignant 

leur  implication  dans  ce  processus.  Enfin  le  point  de  contrôle  S/M  vérifie  qu’aucune  cellule 

n’atteigne la phase de mitose lorsque son ADN n’est pas totalement répliqué, afin d’éviter une 

ségrégation incorrecte du matériel génétique. La cible de ce point de contrôle est le complexe 

Cdk1‐cycline B (figure 13). Chez les levures, les mécanismes d’activation de ce point de contrôle 

font intervenir la même voie que celle du point de contrôle de la réplication. Toutefois chez les 

cellules de mammifères, un autre mécanisme que la voie ATM/ATR/Chk1/Chk2 serait impliquée 

dans  la mise en place de ce point de contrôle S/M (Weinert et al. 1994; Brown and Baltimore 

2003; Zachos et al. 2003).  

Un  arrêt  en  phase  G2  est  observé  dans  les  cellules  soumises  à  un  traitement 

génotoxique ou exposées à des radiations (Lee and Yang 2001; Smits et al. 2000). Une première 

réponse  rapide  se  met  en  place  faisant  intervenir  des  modifications  post‐traductionnelles 

(figure 14). Les kinases Chk1 et Chk2 une fois activées phosphorylent  les phosphatases Cdc25. 

La phosphorylation de Cdc25A sur  la sérine 124 provoque son ubiquitination par  le complexe 

SCF,  et  sa  dégradation  par  le  protéasome  (Busino  et  al.  2004;  Jin  et  al.  2003).  Chk1  régule 

également  Cdc25A  en  la  phosphorylant  sur  les  résidus  sérine  178  et  thréonine  507,  qui 

induisent la liaison de Cdc25A avec la protéine 14‐3‐3, diminuant ainsi la capacité de Cdc25A à 

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 lier la cycline B1 (Chen et al. 2003; Uto et al. 2004). D’autre part la phosphorylation de Cdc25C 

sur la sérine 216 induit son exclusion nucléaire, et sa rétention cytoplasmique par la liaison à la 

protéine 14‐3‐3, diminuant ainsi  l’accessibilité des substrats de Cdc25C tel que  la kinase Cdk1. 

Chk1 est également  impliquée dans  la phosphorylation de Wee1  induisant une augmentation 

de  l’activité  catalytique  de Wee1,  kinase  inhibitrice  du  complexe  Cdk1‐cycline  B  (Rothblum‐

Oviatt et al. 2001; Lee et al. 2001). La protéine Plk1,  impliquée dans  l’activation du complexe 

Cdk1‐cycline B et de Cdc25, et dans  l’inhibition de  la kinase Wee1, est aussi  inhibée  lors de  la 

mise en place du point de contrôle G2/M. En effet la kinase activatrice de Plk1, SLK est elle aussi 

phosphorylée et inhibée par les kinases Chk (Tsvetkov and Stern 2005). Ainsi en réponse à des 

dommages à l’ADN en G2, Plk1 est inhibée conduisant à l’inactivation du complexe Cdk1‐cycline 

B.  D’autre  part  il  a  été montré  que  l’activité  de  Plk1  est  essentielle  pour  la  relocalisation 

nucléaire de Cdc25B nécessaire pour l’entrée en mitose en conditions normales ou en réponse 

à un arrêt G2/M  induit par  la présence de dommages à  l’ADN  (Lobjois et al. 2009b). D’autre 

part la kinase Aurora‐A contrôle l’entrée des cellules en mitose en activant la kinase Plk1 (Seki 

et al. 2008), ce qui active  les phosphatases Cdc25 et par conséquent aboutit à  l’activation du 

complexe Cdk‐1‐cycline B. La kinase Aurora‐A est également impliquée dans  la phosphorylation 

de Plk1  sur  la  thréonine 210, nécessaire à  l’entrée des cellules en mitose après un arrêt des 

cellules au point de contrôle G2/M (Macurek et al. 2008). Aurora‐A phosphoryle également  la 

phosphatase Cdc25B sur la sérine 353 au niveau des centrosomes à la transition G2/M (Cazales 

et al. 2005).  Lorsque que  le point de  contrôle G2/M est activé en présence de dommages à 

l’ADN, la kinase Aurora‐A est inactive et incapable de phosphoryler la protéine Cdc25B (Cazales 

et al. 2005). Enfin  l’implication de  la protéine onco‐suppressive p53 dans  la mise en place du 

point de contrôle G2/M a également été démontrée. Lorsque la cellule détecte des dommages 

avant  l’entrée  en mitose  (Taylor  and  Stark  2001).  En  effet,  p53  induit  la  transcription  des 

facteurs p21Cip1, Gadd45, et de  la protéine 14‐3‐3. L’expression du CKI p21Cip1 va contribuer à 

inhiber  le complexe Cdk1‐cycline B et permet aussi d’inhiber  la phosphorylation activatrice de 

Cdk1  induite par  la  kinase CAK. Une autre  cible de p53 est  la protéine Gadd45, dont  le  rôle 

serait de dissocier  les complexes Cdk1‐cycline B en  s’associant avec Cdk1. Enfin p53 pourrait 

également réprimer la transcription de la cycline B1 (Taylor and Stark 2001). 

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3) Points de contrôle intra‐mitotiques 

La mitose est une phase du cycle cellulaire placée sous haute surveillance. En effet, les 

différents  points  de  contrôles  mitotiques  sont  essentiels  pour  permettre  une  répartition 

équitable du matériel génétique entre  les deux cellules filles au cours de  la division cellulaire, 

afin de maintenir  l’intégrité génomique de nos  cellules. Deux points de  contrôles mitotiques 

ayant  des  mécanismes  d’actions  bien  distincts  ont  été  bien  décrits  chez  les  eucaryotes 

supérieurs.  Le premier a  lieu en prophase, et est dépendant de  la protéine Chfr  (Checkpoint 

with FHA and Ring finger domain). Le second,  le SAC (Spindle Assembly Checkpoint) se met en 

place  au  cours  de  la  transition métaphase‐anaphase  et  contrôle  l’attachement  correct  des 

chromosomes au fuseau mitotique. 

La protéine Chfr, fréquemment mutée ou absente dans diverses  lignées tumorales, est 

constituée  de  trois  domaines  distincts :  un  domaine  FHA  (Forkhead‐associated  domain) 

généralement  retrouvé  sur  les  facteurs  de  transcription,  les  protéines  kinases  ainsi  que  de 

nombreuses  protéines  impliquées  dans  les  points  de  contrôle ;  un  domaine  « ring  finger » 

généralement présent  sur  les  enzymes  responsables de  l’ubiquitnation des protéines ;  et un 

domaine C‐terminal riche en cystéine dont la fonction reste encore inconnue. Cette protéine a 

été  identifiée  comme étant  impliquée dans  l’établissement d’un point de  contrôle mitotique 

précoce en réponse à l’exposition à un stress mitotique tel qu’une exposition à des poisons des 

microtubules  comme  le  nocodazole  ou  le  taxol  (Scolnick  and  Halazonetis  2000;  Cortez  and 

Elledge 2000).  Il  semblerait qu’une  fois activée par  ces  traitements,  la protéine Chfr, via  son 

activité  ubiquitine  ligase  inhibe  l’activité  des  protéines  kinases  Aurora‐A  et  Plk1  impliquées 

dans l’activation précoce du complexe Cdk1‐cycline B1 lors de l’entrée en mitose (Bothos et al. 

2003; Kang et al. 2002) (figure 15). L’inhibition de ces kinases empêche l’accumulation nucléaire 

du complexe Cdk1‐cycline B1 qui n’a pas alors accès à ses différents substrats, empêchant ainsi 

le  déroulement  de  tous  les  événements  précoces  de  l’entrée  en  mitose  tels  que  la 

condensation des chromosomes, ou la rupture de l’enveloppe nucléaire (Summers et al. 2005). 

Il semblerait toutefois que le protéasome ne soit pas impliqué dans l’établissement de ce point 

de  contrôle  mitotique,  mais  que  l’ubiquitination  des  protéines  kinases  Aurora‐A  et  Plk1 

joueraient ici un rôle dans la transduction du signal, plutôt que d’un adressage vers la 

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 dégradation protéolytique (Summers et al. 2005; Bothos et al. 2003). 

Après  la  réplication,  les  deux  chromatides,  restent  associées  grâce  à  des  complexes 

protéiques  nommées  cohésines.  En  début  d’anaphase,  afin  que  les  chromatides  sœurs  se 

séparent, la cohésine est détruite par une caspase particulière, la séparase. Jusqu’à l’anaphase, 

la séparase est en fait maintenue inactive, car séquestrée par la sécurine. Le complexe APC/C‐

Cdc20  induit  l’ubiquitination,  et  donc  la  destruction  protéolytique  de  la  sécurine  par  le 

protéasome.  La  destruction  de  la  sécurine  libére  et  active  la  séparase,  qui  va  dégrader  la 

cohésine, entrainant la séparation des chromatides sœurs. Un système de contrôle, appelé SAC 

(Spindle  Assembly  Checkpoint)  permet  la  vérification  de  l'attachement  correct  des 

chromosomes au fuseau mitotique, et empêche la cellule de rentrer en anaphase tant que tous 

les  chromosomes  ne  sont  ne  sont  pas  correctement  orientés  en  une  plaque métaphasique 

(Musacchio and Hardwick 2002; Malmanche et al. 2006) (figure 16). Ce mécanisme de contrôle 

couple  les  kinétochores  non‐attachés  à  l’APC/C,  le  complexe  protéique  responsable  de 

l’achèvement  de  la mitose,  comme  décrit  précédemment.  La  protéine Mad2  (Mitotic Arrest 

Deficient  2),  un  élément  sensible  à  l’attachement  des microtubules  au  kinétochore,  a  pour 

propriété principale de séquestrer Cdc20, la sous‐unité adaptatrice de l’APC/C, rendant l’APC/C 

inactif,  et  inhibant  ainsi  la  transition  métaphase/anaphase  (Nigg  2001).  L’interaction 

Mad2/Cdc20 semble être régulée par  les kinases Bub1 et 3, Plk1 et Aurora (Malmanche et al. 

2006; Tanaka and Hirota 2009). Dès que tous les kinétochores sont attachés correctement aux 

microtubules, Cdc20 est  libéré de Mad2, et peut donc ainsi activer  l’APC/C. L’APC/C une  fois 

actif  permet  la  destruction  de  la  sécurine,  et  donc  la  libération  de  l’enzyme  séparase.  La 

séparase va agir en dégradant la cohésine permettant ainsi la séparation des chromatides pour 

leur ascension polaire opposée.  

L’ensemble  des  connaissances  acquises  sur  les modalités  d’activation  des  points  de 

contrôle  a  largement  contribué  à  l’amélioration  de  leur  ciblage  en  chimiothérapie  et 

radiothérapie.  L'étude  des mécanismes moléculaires  du  contrôle  de  la  prolifération  et  leur 

ciblage dans des perspectives  radio‐ ou  chimio‐thérapeutiques,  reposent  le plus  souvent  sur 

l'analyse in vitro de modèles de lignées en forte prolifération et cultivées en monocouche (2D).  

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Cependant, l’utilisation de ces modèles de culture ne permet pas de considérer dans la réponse 

aux  dommages  à  l’ADN,  l’hétérogénéité  cellulaire  tumorale,  les  interactions  cellulaires  et 

l’importance  du microenvironnement,  paramètres  déterminants  dans  la  sensibilité  tumorale 

aux agents anti‐cancéreux (Desoize and Jardillier 2000; Dubessy et al. 2000).   

 

II. La  tumeur,  un  véritable  organe  en  forte  interaction avec son microenvironnement 

 

  Une micro‐région tumorale est constituée d'un ensemble de cellules en forte interaction 

entre  elles  et  avec  leur  microenvironnement  constitué  des  molécules  de  la  matrice 

extracellulaire, de différents types cellulaires, tels que les fibroblastes, des cellules du système 

immunitaire (macrophages,  lymphocytes) ou de cellules endothéliales, ainsi que de nombreux 

facteurs de croissance et cytokines (Allen and Louise Jones 2011) (figure 17).  

 

A) Le microenvironnement est un paramètre essentiel du développement d’une 

tumeur 

 

  Les  progrès  dans  la  compréhension  des  aspects  génétiques  de  la  tumorigénèse  ont 

conduit à proposer des modèles d'apparition et de développement d'une tumeur. Ces modèles 

basés  sur  les  altérations  génomiques  des  cellules  cancéreuses  ont  permis  d’identifier  de 

nombreux oncogènes et suppresseurs de tumeurs. Cependant des travaux pionniers, longtemps 

ignorés,  démontraient  l’importance  capitale  du  microenvironnement  tumoral  au  cours  du 

développement d’une tumeur au même titre que l’accumulation des altérations génétiques des 

cellules cancéreuses (Paget 1989; Bissell et al. 1982). Ce n’est que depuis quelques années que 

la tumeur est reconnue comme un « organe » communiquant avec d’autres entités cellulaires, 

enrobées  dans  un  tissu  que  l’on  appelle  stroma,  constituant  ainsi  le  microenvironnement 

tumoral. De manière similaire au développement et à la fonction d’organes, dans lesquels une 

communication réciproque entre les différents types cellulaires est établie, l’interaction des  

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cellules tumorales avec leur microenvironnement peut  largement déterminer  le phénotype de 

la  tumeur.  Ce  rôle  du microenvironnement  sur  le  développement  d’une  tumeur  fut mis  en 

évidence par des expériences basées sur l’injection d’un virus au potentiel oncogénique, le RSV 

(Rous Sarcoma Virus) dans des membres d’embryons de poulets (Dolberg and Bissell 1984). Les 

auteurs  ont montré  un  déroulement  correct  des  premières  phases  de  développement  des 

embryons  malgré  la  présence  d’un  oncogène  actif.  Cependant  lorsque  ces  membres  sont 

soustraits  à  leur  microenvironnement  d’origine  et  remis  en  culture,  ils  développent  un 

phénotype  cancéreux.  Ces  travaux  suggéraient  que  le  contexte  microenvironnemental  soit 

dominant sur l’influence oncogénique du virus (Stoker et al. 1990). Ainsi, au sein des tissus, un 

équilibre  dynamique  existe  entre  les  cellules  et  leur microenvironnement  (Bissell  and Hines 

2011;  Correia  and  Bissell  2012)  et  dans  des  conditions  d'homéostasie  normale,  le 

microenvironnement  exerce  une  action  suppressive  pour  réprimer  la  croissance  tumorale. 

Inversement,  lorsque  cet  équilibre  est  perturbé  ou  rompu,  le  microenvironnement  peut 

favoriser le développement et la progression tumorale. 

 

B) Les  différents  éléments  du  microenvironnement  tumoral  et  résistance 

multicellulaire. 

 

  Au  sein  d'une  tumeur,  les  cellules  en  prolifération  ne  représentent  qu’une  faible 

proportion  des  cellules  tumorales,  la majeure  partie  de  la  population  étant  constituée  de 

cellules quiescentes.   Cette hétérogénéité tumorale résultant de  l’action de différents signaux 

extracellulaires  tels  que  l’hypoxie.  L’hypoxie  intra‐tumorale  (Moulder  and  Rockwell  1987; 

Wilson and Hay; Tredan et al. 2007),  la présence de cellules quiescente  (St Croix et al. 1996; 

Durand  and  Vanderbyl  1989;  Tannock  1978;  Tannock  1994)  ou  encore  les  interactions 

cellulaires avec le microenvironnement (interactions cellule‐cellule ou cellule‐matrice) (Desoize 

and Jardillier 2000; Mellor et al. 2005) ont des  implications majeures dans  les mécanismes de 

résistance aux traitements anticancéreux conventionnels.  

 

 

43 

 

1) Hypoxie, gradient de nutriments et hétérogénéité cellulaire 

  Au  cours  de  la  croissance  d’une  tumeur,  les  cellules  voient  leur  apport  en  oxygène 

diminué.  Les  conséquences  de  la  présence  de  zones  hypoxiques  sont  multiples  : 

développement d’une néo‐vascularisation tumorale, phénotype tumoral plus agressif et associé 

à un mauvais pronostic, et résistance aux thérapies anticancéreuses conventionnelles (Moulder 

and Rockwell 1987; Wilson and Hay; Tredan et al. 2007). Il existe en effet, une corrélation entre 

le degré  d’hypoxie  au  sein d’une  tumeur et  l’échec  thérapeutique.  L’hypoxie  intra‐tumorale 

induit  la  stabilisation des  facteurs de  réponse à  l’hypoxie HIF  (Hypoxia  Inductible Factor), qui 

induisent la transcription de nombreux gènes impliqués dans des processus fondamentaux tels 

que la prolifération, la survie, l’angiogenèse, la migration, l’invasion, le métabolisme du glucose 

ou encore la régulation du pH (Harris 2002; Semenza 2003).   

  En  condition  hypoxique,  les  cellules  opèrent  un  «  switch  » métabolique,  favorisant  la 

production d’ATP essentiellement par  la voie de  la glycolyse au niveau cytoplasmique à partir 

de  glucose  (Semenza  et  al.  2001),  et  non  via  la  chaîne  respiratoire mitochondriale.  Comme 

rappelé ci‐dessus,  l’hypoxie  intra‐tumorale,  induit  l’activation  transcriptionnelle de nombreux 

gènes impliqués dans ce switch métabolique comme les transporteurs de glucose GLUT‐1 et 3, 

ou des enzymes de la voie glycolytique (Semenza 2003).  

  Au  cours  de  la  croissance  tumorale,  un  gradient  de  nutriments  s'établit  également. 

L’établissement  des  gradients  d’oxygène  et  de  nutriments  conduit  à  la mise  en  place  d’un 

gradient de prolifération. En effet,  les cellules situées à proximité des vaisseaux sanguins sont 

en  forte  prolifération,  et  arrêtent  de  proliférer  et  rentrent  en  quiescence  en  fonction  de 

l’éloignement de  la vasculature. La présence de cellules quiescentes au sein des  tumeurs, est 

impliquée dans la résistance aux traitements anti‐cancéreux. En effet, la plupart des molécules 

thérapeutiques  anti‐cancéreuses  ont  pour  cible  les  cellules  tumorales  en  forte  prolifération, 

tandis que  les cellules quiescentes, constituant  la plus grande partie de  la masse tumorales y 

sont  insensibles  (St  Croix  et  al.  1996;  Durand  and  Vanderbyl  1989;  Tannock  1978;  Tannock 

1994). 

 

 

44 

 

2) Interactions cellulaires avec le microenvironnement 

Une  cellule  à  l’intérieur  d’un  tissu  interagit  avec  ses  voisines  ainsi  qu’avec  la  matrice 

extracellulaire  à  travers  des  signaux  biochimiques  et  mécaniques.  Ces  interactions  cellule‐

cellule  et  cellule‐matrice  extracellulaire  établissent  un  réseau  de  communication  en  3D  qui 

maintient  la  spécificité et  l’homéostasie du  tissu. L’établissement de ces  interactions  joue un 

rôle fondamental dans de nombreux processus tels que la survie cellulaire, les mécanismes de 

réparation des dommages à l’ADN, ainsi que dans la résistance aux différents traitements anti‐

cancéreux, qualifiée de résistance multicellulaire (Desoize and Jardillier 2000).  

  Les interactions cellule‐cellule sont médiées principalement par la famille des cadhérines. 

Ces  interactions  intercellulaires sont capables de réguler des processus fondamentaux pour  la 

cellule  que  sont  la  survie  cellulaire  et  l’apoptose.  L’établissement  de  contacts  entre  cellules 

homologues, fut décrit pour la première fois en 1972 par Durand et Sutherland. Ces auteurs ont 

montré que des cellules cultivées sous forme d'agrégats cellulaires contenant 10 à 25 cellules, 

deviennent  plus  résistantes  à  la mort  cellulaire  induite  par  une  exposition  à  des  radiations 

ionisantes, que  les mêmes cellules cultivées en monocouches  (Durand and Sutherland 1972). 

L’établissement de contacts intercellulaires entre les cellules tumorales participe également à la 

résistance multicellulaire  en  limitant  la  diffusion  de  diverses  drogues  chimio‐thérapeutiques 

(Desoize and Jardillier 2000).  

  La matrice extracellulaire est un  réseau  complexe  composé d’une variété de protéines, 

telles  que  la  fibronectine,  le  collagène,  la  laminine  ou  l’élastine  et  de  polysaccharides,  les 

glycosaminoglycanes  ou  protéoglycanes  qui  sont  sécrétés  par  les  cellules.  Les  principaux 

récepteurs cellulaires  impliqués dans  la  liaison à  la matrice extracellulaire  sont des protéines 

transmembranaires  de  la  famille  des  intégrines  (Hynes  1987;  Ruoslahti  and  Pierschbacher 

1987).  La  liaison  des  intégrines  à  la matrice  permet  l’activation  d’effecteurs  cytoplasmiques 

capables de réguler divers processus essentiels tels que la prolifération, la survie, la migration, 

l’adhésion, ou encore la différentiation (Aplin et al. 1999; Clark and Brugge 1995; Giancotti and 

Ruoslahti 1999; Hotchin and Hall 1995; Hynes 1992). 

  Les  tumeurs sont caractérisées par une certaine rigidité de  la matrice extracellulaire, et 

sont  exposées  continuellement  à  différentes  forces  physiques  (Butcher  et  al.  2009).  Il  a 

45 

 

d’ailleurs  été  montré  que  des  dérégulations  des  propriétés  mécaniques  de  la  matrice 

extracellulaire  contribuent  à  la progression  tumorale, diminuent  l’efficacité  thérapeutique et 

augmente  le risque de développer un cancer  (Levental et al. 2009). La rigidité  tissulaire de  la 

matrice extracellulaire est également capable de modifier la progression dans le cycle cellulaire 

(Klein et al. 2009).  

D’autres  travaux  démontrent  que  lorsque  des  cellules  sont  cultivées  en  présence  de 

matrice extracellulaire, il se produit une activation de la voie de signalisation PI3K, via la liaison 

de la matrice à l’intégrine β1, ce qui inhibe l’apoptose et l’arrêt des cellules au point de contrôle 

G2/M induits par des traitements à l’étoposide ou à des radiations (Hodkinson et al. 2006). Ces 

effets  sont médiés par  l’inhibition des protéines  inhibitrices de  l’activité des  complexes Cdk‐

cyclines, p21 et p27, ainsi que par le maintien de l’expression des différentes cyclines. Ce travail 

démontre l’implication majeure de la matrice extracellulaire dans la régulation des mécanismes 

de  contrôle  de  la  progression  du  cycle  cellulaire.  Il  a  été  également  montré  un  rôle  de 

l’adhésion  cellulaire  à  la  matrice  extracellulaire  dans  la  progression  normale  d’un  cycle 

cellulaire en absence de dommages à  l’ADN (Kang and Krauss 1996). Ces auteurs démontrent 

en  effet  que  la  phosphorylation  de  la  protéine  pRB,  l’activité  de  Cdk2  et  l’expression  de  la 

cycline A sont modulées par l’adhésion cellulaire à la matrice. D’autre part une modulation de 

la  voie  de  signalisation  de  p53/p21  en  réponse  à  l’interaction  des  cellules  avec  la matrice 

extracellulaire a pu être observée (Wu and Schonthal 1997). En effet, lors de la perturbation de 

l’ancrage des cellules au substrat, il se produit une activation de p53, qui induit une activation 

transcriptionnelle de la protéine p21, régissant ainsi un arrêt des cellules en phase G1. 

  L’établissement de contacts entre  les cellules et  la matrice extracellulaire   est  impliqué 

dans  la  résistance multicellulaire  (Meredith et al. 1993; Schuetz and Schuetz 1993; Ruoslahti 

and  Reed  1994;  Montgomery  et  al.  1994;  Frisch  and  Francis  1994;  Kim  et  al.  1994).  De 

nombreuses  études,  montrent  que  la  présence  d’une  matrice  extracellulaire  augmente  la 

résistance à des agents génotoxiques (Damiano et al. 1999; Hazlehurst et al. 1999; Vlodavsky et 

al.  1980;  Cordes  and Meineke  2003). On  parle  ainsi  de  résistance  aux  drogues médiée  par 

l’adhésion  (CAM‐DR,  Cell Adhesion Mediated Drug  Resistance),  qui  a  pu  être  observée  dans 

divers modèles de  tumeurs  (Hazlehurst et  al. 1999;  Shain  and Dalton 2001). A  l'opposé,  il  a 

également  été  démontré  qu'une  perturbation  de  l’adhésion  des  cellules  à  la  matrice 

46 

 

extracellulaire restaurait la sensibilité à diverses molécules à activité anti‐tumorale (Kerbel et al. 

1996; St Croix et al. 1996; Kohno et al. 1994; Gardner et al. 1996) , de même que le ciblage de la 

famille des intégrines (Damiano 2002).  

L’idée que  les cellules stromales puissent promouvoir  le développement d’un cancer a 

été reconnue pour  la première  fois en 1863  lorsque Rudolph Virchow observa  la présence de 

leucocytes dans  le  stroma  d’un  tissu  néoplasique,  et  qu’il  émit  l’hypothèse  que  la malignité 

d’une tumeur se mettait en place aux sites d’inflammation chronique (Balkwill and Mantovani 

2001). Cette hypothèse prenait seulement en compte  l’aspect  inflammatoire et ne considérait 

pas la présence d’autres types cellulaires du stroma au contraire de l’hypothèse du « seed and 

soil » émise par Stephen Paget qui  suggérait  la prise en compte de  l’ensemble des éléments 

présents  au  sein  du  microenvironnement  tumoral  (Paget  1989).  Des  études  récentes  ont 

montré que  l’établissement de xénogreffes chez  la souris de cellules humaines de carcinomes 

mammaires  dépend  de  la  présence  de  fibroblastes  issus  du  microenvironnement  tumoral 

(Kuperwasser et al. 2004). D’autre part,  l’impact du stroma tumoral sur  le comportement des 

cellules épithéliales tumorales fut démontré de manière élégante par Olumi et collaborateurs. 

Ces auteurs ont en effet démontré, dans des modèles de co‐culture de cellules de carcinomes 

humains  prostatiques  avec  des  fibroblastes  issus  d’un  stroma  sain  ou  tumoral,  que  les 

fibroblastes  du  microenvironnement  tumoral  stimulent  la  progression  de  la  tumorigénèse 

(Olumi et al. 1999).  

Les  cellules  tumorales  modulent  leur  microenvironnement  en  produisant  un  grand 

nombre de facteurs de croissance qui vont moduler le stroma tumoral. Ceux‐ci incluent le bFGF 

(basic  Fibroblast  Growth  Factor),  le  VEGF  (Vascular  Endothelial  Growth  Factor),  le  PDGF 

(Platelet Derived Growth Factor), les ligands des EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), des 

interleukines, ou  encore  le  TGF‐β  (Transforming Growth  Factor‐  β). Ces  facteurs  agissent de 

manière paracrine afin d’induire des réactions stromales telles que l’angiogénèse (Bergers and 

Benjamin  2003),  ou  la  réponse  inflammatoire  (Coussens  and  Werb  2002).  Ces  différents 

facteurs  activent  aussi  les  cellules  stromales  tels que  les  fibroblastes  (De Wever  and Mareel 

2003),  les  cellules musculaires  ou  les  adipocytes  (Manabe  et  al.  2003).  L’activation  de  ces 

cellules aboutit à la sécrétion d’autres facteurs de croissance.  

47 

 

De manière  concomitante  avec  l’altération  de  l’expression  de  nombreux  facteurs  de 

croissance, les cellules tumorales ainsi que les cellules stromales sécrètent un grand nombre de 

protéases  (Mueller et  al. 2003;  Stetler‐Stevenson  and  Yu  2001). Ces  enzymes protéolytiques 

remodèlent  la matrice extracellulaire et  la membrane basale,  créant ainsi un environnement 

propice à la migration et à l’invasion cellulaire. Le remodelage de la matrice extracellulaire est 

largement médié par des protéases extracellulaires, et particulièrement par la famille des MMP 

(Matrix MetalloProteinases)  (Brinckerhoff  and Matrisian  2002)  qui  activent  des  facteurs  de 

croissance  liés à  la  surface cellulaire ou à  la matrice extracellulaire  (McCawley and Matrisian 

2001; Egeblad and Werb 2002), contribuant au maintien de la communication réciproque entre 

les cellules tumorales et leur microenvironnement. Les MMP ont été impliquées dans l’invasion 

des cellules  tumorales ainsi que dans  la progression métastasique. De plus  la dégradation de 

molécules de la matrice extracellulaire expose certains domaines protéiques, générant ainsi de 

nouveaux  fragments moléculaires ayant des  fonctions pro‐migratoires  aussi bien que pro ou 

anti‐angiogéniques (Kalluri 2002).  

Les fibroblastes sont parmi les cellules les plus abondantes du microenvironnement des 

tumeurs  solides,  et  particulièrement  dans  les  carcinomes  mammaires,  pancréatiques, 

prostatiques ou dans les mélanomes (Chauhan et al. 2003; Olumi et al. 1999; Skobe and Fusenig 

1998). Les CAF (Cancer Associated Fibroblasts), sont des fibroblastes modifiés par la tumeur et 

identifiables  par  immunocytochimie  de  part  l’expression  d’une  combinaison  spécifique  de 

différents marqueurs tels que l’α‐SMA (α‐Smooth Muscle Actin), la vimentine, la desmine ou la 

FAP (Fibroblast Activation Protein) (Garin‐Chesa et al. 1990; Lazard et al. 1993). Les TAM (Tumor 

Associated Macrophages)  sont  des macrophages  associés  à  la  tumeur,  abondants  dans  de 

nombreuses  tumeurs  solides.  L’ensemble  de  ces  cellules  contribuent  au  développement 

tumoral  en  sécrétant  différents  facteurs  de  croissance  (HGF,  VEGF,  EGF,…)  et  cytokines  qui 

favorisent la survie cellulaire, la migration et l’invasion (De Wever et al. 2004; Lewis et al. 2004; 

Li et al. 2003; De Wever and Mareel 2003). Les CAF participent au  remodelage de  la matrice 

extracellulaire  en  sécrétant  des  composants  de  la  matrice  extracellulaire  à  activité  pro‐

migratoire  tels  que  la  fibronectine,  ou  la  tenascine  (De Wever  et  al.  2004).  Les  fibroblastes 

associés au cancer sont aussi impliqués dans la surexpression de protéases comme les MMP ou 

l’uPA (urokinase Plasminogen Activator) qui vont dégrader la matrice extracellulaire, participant 

activement  à  son  remodelage  (Sieuwerts  et  al.  1998;  Sato  et  al.  2004).  Les  TAM  (Tumor 

48 

 

Associated  Macrophages)  augmentent  également  l’expression  des  facteurs  de  réponse  à 

l’hypoxie  HIF‐1  et  HIF‐2  (Burke  et  al.  2002;  Burke  et  al.  2003)  dans  un  environnement 

hypoxique, aboutissant à l’augmentation d’expression de gènes cibles comme le VEGF ou Tie‐2 

(Tyrosine kinase with  immunoglobulin and EGF homology domains)  (Venneri et al. 2007). Les 

cellules tumorales surexpriment de nombreuses cytokines inflammatoires qui vont permettre le 

recrutement  de  divers  types  cellulaires  du  système  immunitaire  comme  les  macrophages, 

lymphocytes ou neutrophiles (Coussens and Werb 2002; Pollard 2004). Ces différentes cellules 

vont agir en parallèle des TAM, en sécrétant également de nombreux facteurs pro‐tumoraux.  

Enfin,  il   a été montré,  in vivo, qu’en réponse à  l’exposition à des radiations  ionisantes 

ou  à  des  carcinogènes  chimiques,  le  stroma  tumoral  peut  développer  un  potentiel 

tumorigénique (Barcellos‐Hoff and Ravani 2000; Maffini et al. 2004). 

 

  L’ensemble des données décrites dans ce chapitre souligne  l’importance primordiale du 

microenvironnement  dans  le  développement  et  la  progression  d’une  tumeur,  démontrant 

l’intérêt  fondamental d’utiliser des modèles cellulaires plus prédictifs de  la  réponse cellulaire 

observée in vivo dans les tumeurs.  

 

III. Un modèle 3D de micro‐tumeur in vitro, le sphéroïde 

 

   Parmi  les différents modèles de culture multicellulaire en 3D (Pampaloni et al. 2007),  le 

sphéroïde est un modèle qui offre un niveau de complexité  intermédiaire entre  la culture en 

monocouche et l’utilisation de modèles animaux. Comme nous allons le voir, ce modèle permet 

de reproduire in vitro l'organisation d'une micro‐tumeur (figure 18) et il est maintenant admis 

49 

 

 

Proliferative zone

Oxygene

Quiescent zone

Secondary necrotic center

Pro

life

ratio

n

Nutriments

Zone proliféra ve

Zone quiescente

Cœur nécro que

DAPI Ki-67 DAPI E-cadhérine DAPI PARP

Figure 18 : Le modèle de sphéroïdes mime in vitro l’organisa on d’une micro‐tumeur A : Micrographies d’un sphéroïde en culture prise par un microscope à contraste de phase. B : Représenta on schéma que des différents gradients d’oxygène et nutriments qui s’établissent au cours de la croissance des sphéroïdes, abou ssant à la mise en place d’un gradient de proliféra on. C : Immunodétec on des cellules proliféra ves (Ki‐67, gauche), des interac ons intercellulaires (E‐cadhérine, centre), ou des cellules apopto ques (PARP, droite) sur des coupes à congéla on de sphéroïdes mesurant 600µm de diamètre, prises à des grossissements différents. Les noyaux sont détectés par le DAPI (bleu pour le Ki‐67 et la PARP, et rouge pour la E‐cadhérine).

A B

C

50 

 

 que ce modèle est plus prédictif de  la  réponse au  traitement que  les modèles de culture en 

monocouche. 

A) Le modèle sphéroïde mime in vitro l'organisation d'une micro‐tumeur  

 

1) Mise en place des gradients d'oxygène, de nutriments et de prolifération au cours de 

la croissance des sphéroïdes 

  La croissance des sphéroïdes s'accompagne de la mise en place d'un gradient décroissant 

d'oxygène  de  la  périphérie  vers  le  centre  où  peut  apparaître  une  région  hypoxique.  Des 

mesures de la tension en oxygène dans les sphéroïdes ont été réalisées grâce à l’utilisation de 

microélectrodes  (Sutherland 1988; Schwachofer et al. 1991). Malgré  l'existence de variations 

d’un modèle cellulaire à un autre (Mueller‐Klieser and Sutherland 1982; Acker et al. 1983), ces 

travaux ont démontré une diminution rapide de la tension en oxygène lorsque l'on pénètre au 

sein des sphéroïdes (Sutherland 1988). De manière  intéressante une diminution  inattendue et 

importante d’un facteur 3 à 4 de la consommation en oxygène a été mise en évidence lors de la 

croissance de sphéroïdes (Freyer and Sutherland 1986b, 1986a).  Il a été émis  l’hypothèse que 

cette diminution pouvait  résulter de  l’augmentation de  la  fraction de cellules quiescentes au 

cours  de  la  croissance  des  sphéroïdes.  Parallèlement  au  gradient  d'oxygène,  un  gradient  de 

glucose, de  facteurs de croissance ou d'hormones  se met en place,  tandis qu’un gradient de 

catabolites s’établie de manière inverse (Sutherland 1988; Friedrich et al. 2007a; Hirschhaeuser 

et al.2010). 

  Une  étude  a  récemment  montré  qu’une  transition  du  métabolisme  énergétique  se 

produit au cours de la croissance des sphéroïdes (Rodriguez‐Enriquez et al. 2008). Ces auteurs 

montrent  que  des  sphéroïdes  de  petite  taille  non  régionalisés  produisent  leur  énergie 

essentiellement via  les phosphorylations oxydatives de  la  chaîne  respiratoire mitochondriale, 

tandis  que  les  sphéroïdes  régionalisés  puisent  leur  énergie  principalement  par  la  voie 

glycolytique.  Ces  changements métaboliques  au  cours  de  la  croissance  des  sphéroïdes  sont 

associés à une augmentation de HIF‐1α, et semblent indiquer l’importance de la mise en place 

de zones hypoxiques dans le métabolisme cellulaire.  

51 

 

  La  mise  en  place  des  gradients  d’oxygène  et  de  nutriments  a  pour  conséquence 

l’établissement  d’un  gradient  de  cellules  prolifératives.  En  effet,  les  cellules  en  prolifération 

sont  localisées à  la périphérie, ou  l’oxygène et  le glucose ne sont pas  limitant (figure 18). Des 

analyses  sur  coupes  histologiques  ont  permis  de  montrer  la  présence  de  cellules  en 

prolifération  jusqu'à 100 à 220µm de  la périphérie en  fonction du modèle étudié  (Sutherland 

1988).  Les  cellules  plus  centrales  sont  décrites  pour  être  quiescentes.  Une  expression 

différentielle des  inhibiteurs de Cdk  fut démontré entre des modèles de culture cellulaire en 

monocouche ou en 3D de fibroblastes de rats (LaRue et al. 2004; LaRue et al. 1998). Ces mêmes 

auteurs  démontrent  que  l’expression  de  p18,  p21  et  p27  augmente  en  fonction  de  la 

proportion  de  cellules  quiescentes  dans  des  modèles  de  sphéroïdes  de  mélanomes  et  de 

carcinomes mammaires,  l’expression de p18 et p27 étant corrélée avec  l’arrêt de croissance, 

alors que  l’expression de p21 est prédominante dans  les  couches prolifératives  (LaRue et al. 

2004).  Lorsque  les  cellules  sont  privées  en  oxygène  et  nutriments,  elles  entrent  dans  un 

processus de mort cellulaire, conduisant à  l'apparition d'un cœur nécrotique. La distance à  la 

périphérie  à  partir  de  laquelle  cette mortalité  cellulaire  est  induite  peut  varier  entre  50  à 

300µm  en  fonction  du  modèle  cellulaire  utilisé,  de  la  concentration  et  du  taux  de 

consommation de substrats cellulaires comme l’oxygène ou le glucose, du degré de compaction 

cellulaire,  de  l’accumulation  de  catabolites  ou  d’une  augmentation  de  l’acidité  cellulaire 

(Carlsson  and  Acker  1988;  Sutherland  1988).  La mortalité  cellulaire  induite  peut  être  de  la 

nécrose ou de l'apoptose. En effet des travaux réalisés sur des sphéroïdes de cellules tumorales 

intestinales ont montré une induction de nécrose et d'apoptose au centre des sphéroïdes (Rak 

et  al.  1995).  Il  a  été  montré  qu’un  stress  environnemental  tel  que  l’hypoxie  induit  une 

augmentation  transitoire  en  glutathion,  ce  qui  pourrait  jouer  un  rôle  crucial  dans 

l’accumulation  de  cellules  apoptotiques  dans  des  sphéroïdes  de  fibroblastes  pulmonaires 

murins (Romero et al. 1997).  

L’ensemble de ces données montre que le modèle de sphéroïde permet de reproduire in vitro 

les différents gradients physiopathologiques présents au sein d’une tumeur, et mime ainsi une 

micro‐région tumorale ou des micro‐métastases (Sutherland 1988; Friedrich et al. 2007a).  

 

52 

 

2) Le  modèle  sphéroïde  reproduit  les  interactions  cellule‐cellule  et  cellule‐matrice 

extracellulaire 

  Au  cours de  la  formation des  sphéroïdes, des  interactions  cellule‐cellule  se mettent en 

place. Il a en effet été montré que l’expression d’un mutant dominant‐négatif de la E‐cadhérine 

dans  des  cellules  d’adénocarcinomes  mammaires  empêchent  la  formation  de  sphéroïdes 

(Vizirianakis et al. 2002). D’autres  travaux démontrent que  l’expression de  la E‐cadhérine est 

élevée,  et  distribuée  de  façon  homogène  dans  les  sphéroïdes,  de manière  similaire  à  celle 

décrite dans  le  tissu  tumoral  (Waleh et al. 1994; St Croix et al. 1998). D’autre part,    il a été 

montré  une  expression  différentielle  de  différentes molécules  d'adhésion  entre  des  cellules 

cultivées en monocouche ou sous forme de sphéroïdes (Rainaldi et al. 1999). 

  Différentes  études  rapportent  une  importante  sécrétion  de  molécules  de  la  matrice 

extracellulaire  telles  que  la  fibronectine  et  la  laminine  dans  des  modèles  de  sphéroïdes 

(Nederman et al. 1984; Glimelius et al. 1988; Bjerkvig et al. 1989). De manière intéressante, la 

matrice extracellulaire produite dans des modèles de  sphéroïdes de gliome, d’ostéosarcome, 

ou  de  mélanome  présente  un  profil  et  une  organisation  plus  similaire  à  la  matrice 

extracellulaire présente au sein de ces  tumeurs  in vivo, que  leur équivalent en monocouches  

(Nederman  et  al.  1984;  Paulus  et  al.  1994;  Davies  et  al.  1997).  Des  profils  d'expression 

différents des  intégrines entre des cellules en monocouche ou sous  forme de sphéroïdes ont 

été mis en évidence (Waleh et al. 1994). Ces auteurs montrent une diminution de l’expression 

des sous‐unités α6/β1 et β4 seulement dans les couches les plus internes des sphéroïdes, alors 

que  l’expression des  sous‐unités  α2/  α3  et  α5  restent uniformes  au  sein des  sphéroïdes.  La 

distribution non uniforme de certaines isoformes des intégrines dans les sphéroïdes ressemble 

fortement  au  profil  d’expression  des  intégrines  retrouvé  dans  les  tissus  sains  et  tumoraux. 

D’autres  travaux  réalisés  sur  des  sphéroïdes  provenant  de  cellules  tumorales  colorectales 

démontrent  que  l’expression  des  intégrines  dans  les  sphéroïdes  est  très  similaire  à  celle 

observée  dans  des  tumeurs  greffées  chez  la  souris,  en  comparaison  du  profil  d’expression 

trouvé sur les mêmes cellules cultivées en monocouches (Hauptmann et al. 1995). 

 

 

53 

 

3) Des modèles de sphéroïdes mixtes pour reproduire les interactions cellule‐stroma 

  Le  développement  de modèles  de  co‐cultures  en  3D  entre  différents  types  cellulaires 

permet d’accéder à un degré de complexité supplémentaire, et de se rapprocher encore un peu 

plus  de  la  réalité  physiologique  retrouvée  au  sein  de  tumeurs  in  vivo.  Il  existe  plusieurs 

techniques pour obtenir des co‐cultures de sphéroïdes, que l’on nomme également sphéroïdes 

mixtes (Friedrich et al. 2007a). Toutefois l’obtention de ces modèles de sphéroïdes mixtes reste 

relativement  compliquée du  fait du  taux de  génération qui diffère entre  les divers  types de 

cellules, permettant à certaines cellules de proliférer plus rapidement au sein des co‐cultures, 

au profit d’autres types cellulaires qui prolifèrent beaucoup plus lentement.  

   Différentes études  réalisées  in  vitro ou  in  vivo  sur des modèles de  cultures mixtes ont 

permis de montrer  l’importance et  l’influence qu’exercent différents types cellulaires tels que 

les  fibroblastes,  les  cellules  souches,  les  adipocytes  ou  d’autres  cellules  présentes  dans  le 

microenvironnement  tumoral  sur  la  progression  tumorale,  l’invasion  cellulaire  ou  encore  la 

progression métastasique. Il a été montré sur des modèles de co‐cultures de CAF et de cellules 

tumorales  prostatiques  enrichies  en  cellules  souches  cancéreuses,  que  la  présence  des  CAF 

améliore  la capacité à  former des sphéroïdes, ayant généralement une  taille plus  importante 

(Liao et al. 2010). Des expériences de greffes chez la souris de ces co‐cultures ont permis à ces 

auteurs de mettre en évidence  la  formation de  structure prostatique  glandulaire présentant 

une forte activité proliférative et de nombreuses lésions similaires à ce que l’on retrouve in vivo 

dans  les  tumeurs.  D’autres  travaux  ont  révélé  une  augmentation  de  l’expression  de  la 

cathepsine  B,  une  protéase  capable  de  dégrader  certains  composés  de  la  matrice 

extracellulaire,  lorsque des cellules d’adénocarcinomes coliques  sont cultivées  sous  forme de 

sphéroïdes  avec  des  monocytes  et  des  fibroblastes,  ce  qui  est  également  associé  à  une 

augmentation de  l’invasion  cellulaire  (Krueger  et  al.  2005). D’autres  travaux  réalisés  sur des 

modèles mixtes  ont  permis  de montrer  que  les  cellules  souches mésenchymateuses  et  les 

ostéoblastes  sont  impliqués  dans  la  prolifération  et  la  migration  des  cellules  souches 

hématopoïétiques  (de Barros et al. 2010). Enfin des modèles mixtes de  sphéroïdes entre des 

cellules  tumorales mammaires  et  des  cellules  souches mésenchymateuses  ou  des  CAF  ont 

montré  que  ces  deux  types  cellulaires  sensibilisent  les  cellules  cancéreuses  à  l’inhibiteur  de 

kinases RAF265 (Dittmer et al. 2011). 

54 

 

B) Un modèle plus prédictif  de la réponse aux traitements  

 

  Différentes  données  montrent  que  le  modèle  de  sphéroïdes  est  plus  prédictif  de  la 

réponse  observée  in  vivo  comparativement  aux  modèles  de  culture  en  monocouche. 

Différentes  études  montrent  clairement  que  les  cellules  cultivées  en  3D  présentent  une 

sensibilité plus faible vis‐à‐vis d’agents chimiothérapeutiques que  les mêmes cellules cultivées 

en monocouche et surtout similaire à celle observée pour des modèles de xénogreffes (Oloumi 

et  al.  2000). Dans  le  domaine  de  la  radiobiologie,  la  similarité  de  la  réponse  aux  radiations 

ionisantes entre les sphéroïdes et des xénogreffes chez la souris, rend également le modèle de 

sphéroïdes très attractif, et alternatif aux études réalisées in vivo (Dubessy et al. 2000). En effet, 

les  travaux pionniers de Sutherland et collaborateurs ont permis de montrer  la similarité des 

courbes de survie obtenues après irradiations de tumeurs in vivo ou de sphéroïdes (Sutherland 

et al. 1970; Sutherland et al. 1971). De même il a été montré que la croissance (Sutherland and 

Durand  1984),  la  réparation  des  dommages  à  l’ADN  et  la  survie  après  une  exposition  à  des 

irradiations  (Stuschke  et  al.  1992; West  and  Sutherland  1987)  sont  similaires  aux  données 

obtenues in vivo contrairement aux modèles de culture en 2D, peu prédictifs. Plus récemment, 

des  travaux  réalisés dans  le  groupe de Mina Bissell  sur des  cellules de  la  glande mammaire 

démontrent que l'utilisation du modèle de sphéroïdes apporte des informations proches de ce 

qui  est  observé  in  vivo.  Ces  travaux  ont mis  en  évidence  que  l’inhibition  des  β1  intégrines 

augmentait l’efficacité de radiations ionisantes, résultats qui ont pu être reproduits in vivo (Park 

et al. 2008). La radiorésistance des sphéroïdes a été associée à  leur capacité accrue à réparer 

les  dommages  à  l'ADN  (Durand  1984).  D’autres  études  démontrent  que  les  sphéroïdes 

présentent moins de mutations induites par une exposition à des radiations ionisantes que les 

cellules cultivées en monocouches exposées à la même dose (Durand and Olive 1979).   

 

C)  Le modèle de sphéroïde reproduit la résistance multicellulaire 

 

  La prédictivité du modèle sphéroïdes est en partie  liée au fait que ce modèle permet de 

reproduire  la  résistance multicellulaire  (Desoize  and  Jardillier  2000). De  part  sa  structure,  le 

sphéroïde limite la pénétration de certaines molécules, phénomène en partie responsable de la 

55 

 

résistance  observée  en  thérapie  anti‐tumorale.  Il  est  en  effet  largement  décrit  que  l’échec 

thérapeutique d’un grand de nombre de molécules à visée anticancéreuses est en partie dû à 

une mauvaise  distribution  de  la  drogue  au  sein  de  la  tumeur  du  fait  d’une  vascularisation 

anormale,  des  interactions  cellulaires,  de  la  densité  de  compaction  des  cellules  tumorales 

(Minchinton and Tannock 2006; Tredan et al. 2007; Grantab et al. 2006). D’autre part la mise en 

place des gradients d’oxygène et de nutriments aboutit   à  la présence de cellules hypoxiques 

et/ou quiescentes,  largement décrites pour  leur  implication dans  la progression d’une tumeur 

et des phénomènes de résistance associés.  

  La présence de régions hypoxiques au sein des sphéroïdes corrèle avec  la résistance aux 

traitements.  Il  a  par  exemple  été montré  que  des  sphéroïdes  d’adénocarcinome mammaire 

sont  résistants à  la doxorubicine,  via  l’augmentation de  l’expression du  transporteur Pgp  (P‐

glycoprotein) qui  va entrainer  l’efflux de  la drogue  cytotoxique dans  le milieu extracellulaire 

(Doublier  et  al.  2012).  Ces  auteurs  démontrent  que  l’induction  de  la  protéine  Pgp  est 

dépendante  de HIF‐1α  (Hypoxia  Inductible  Factor‐1α),  un  gène  de  réponse  à  l’hypoxie. Une 

autre  étude  montre  que  l’hypoxie  via  l’induction  des  gènes  HIF‐1α  et  VEGF  (Vascular 

Endothelial Growth Factor) améliore la fraction de survie de sphéroïdes après une exposition à 

des  radiations  ionisantes  (Zou  et  al.  2010).  Cependant  ces  mêmes  auteurs  observent  que 

l’inhibition des gènes HIF‐1α et VEGF par stratégie d’interférence à l’ARN n’influence pas l’effet 

des  radiations  ionisantes.  Ces  travaux  suggèrent  que  d’autres  gènes  de  réponse  à  l’hypoxie 

peuvent  être  induits  et  responsables  de  la  radiorésistance,  mais  également  que  d’autres 

paramètres peuvent modifier la résistance des sphéroïdes aux traitements comme la présence 

d’interactions cellulaires avec le microenvironnement ou la présence de cellules quiescentes. La 

présence de cellules quiescentes dans des modèles de culture tridimensionnelle démontre que 

ces cellules sont plus radio‐résistantes que  les cellules prolifératives du fait de  leur capacité à 

initier la réparation de dommages à l’ADN avant de ré‐entrer dans le cycle cellulaire (Luk et al. 

1986; Ng et al. 1987). 

  L’établissement du gradient de métabolites semble également  impliqué dans  la réponse 

cellulaire mise en  jeu  lors d’une exposition à des  radiations  ionisantes. En effet,  lorsque des 

sphéroïdes  d’adénocarcinome mammaire murin  sont  cultivés  dans  un milieu  contenant  une 

forte concentration en glucose, la fraction de cellules hypoxiques radio‐résistantes diminue, et 

56 

 

la sensibilité aux radiations  ionisantes est augmentée  (Luk and Sutherland 1987). Par ailleurs, 

des  inhibiteurs  des  phosphorylations  oxydatives  ou  de  la  glycolyse,  induisent  un  arrêt  de  la 

croissance des  sphéroïdes, avec un effet plus  important  lorsque  la glycolyse est  inhibée. Ces 

résultats  suggèrent que  ces deux voies métaboliques présentent un  intérêt potentiel dans  le 

ciblage thérapeutique.  Il a par exemple été montré que  le 2‐déoxy‐D‐glucose  (2‐DG)  inhibe  la 

consommation  de  glucose  et  la  production  de  lactate  de  70%  dans  les  sphéroïdes,  contre 

seulement 35% dans  les  cellules  cultivées en 2D.  Le 2‐DG  radio‐sensibilise  les  sphéroïdes en 

favorisant  l’induction  de  la  mort  cellulaire  programmée  par  apoptose,  accompagnée  d’un 

retard  en  phase G2,  tandis  qu’il  radio‐sensibilise  faiblement  les  cellules  en monocouche  en 

augmentant le nombre de catastrophes mitotiques (Khaitan et al. 2006).  

  L’impact du microenvironnement  sur  la  réponse  aux  radiations  ionisantes  a également 

été testé dans des modèles de culture tridimensionnelle dans  lesquels  les cellules épithéliales 

mammaires saines ou tumorales ont été cultivées en présence d'une matrice reconstituant  la 

composition de la lame basale. Dans ces conditions, les structures 3D obtenues reproduisent la 

morphologie  acinaire  typique  d’une  glande  mammaire  fonctionnelle  avec  la  présence  de 

cellules hautement polarisées. Ce modèle permet de distinguer, uniquement en culture 3D, les 

cellules  normales  des  cellules  tumorales  qui  dans  ces  conditions  conservent  leur  potentiel 

prolifératif  et  n’établissent  aucunes  connexions  formant  des  amas  cellulaires  totalement 

déstructurés (Barcellos‐Hoff et al. 1989; Weaver et al. 1995; Weigelt and Bissell 2008). D’autres 

travaux ont utilisé la capacité de ces cellules épithéliales mammaires à s’organiser en acini pour 

évaluer l’impact des radiations ionisantes sur ces interactions cellulaires (Park et al. 2003). Une 

diminution de la localisation de E‐cadhérine, de la β‐caténine ainsi que de la connexine‐43 ont 

pu être observées après une exposition à des radiations ionisantes. 

  D’autre  part,  l’organisation  tridimensionnelle  des  cellules  tumorales  au  sein  des 

sphéroïdes permet l’établissement de contacts cellulaires qui corrèle de manière positive avec 

la  résistance  aux  traitements.  En  effet,  lorsque  les  cellules  sont  cultivées  sous  forme  de 

sphéroïdes, elles développent une capacité de résistance aux traitements anticancéreux. Ainsi 

pour  obtenir  le  même  taux  d’inhibition  de  la  croissance  cellulaire  observée  in  vitro,  la 

concentration  en  drogues  doit  être  augmentée  (Desoize  and  Jardillier  2000).  L’utilisation 

d’anticorps  ciblant  de  manière  spécifique  la  E‐cadhérine  sensibilise  des  sphéroïdes  issus 

57 

 

d’adénocarcinome colorectal à  la chimiothérapie  in vitro (5‐fluorouracil, paclitaxel, vinblastine 

ou étoposide), par une voie médiée par  la PKC (Protein Kinase C) (Green et al. 2004). D’autres 

travaux démontrent que  les  interactions entre  les cellules tumorales et  leur matrice dans des 

modèles  de  cultures  3D  induisent  une  inhibition  de  l’apoptose  qui  s’accompagne  d’une 

résistance aux thérapies anti‐tumorales (Bates et al. 1995; Meredith et al. 1993).  

 

D) Un modèle de choix pour l’évaluation de la réponse aux traitements 

 

  Le modèle de sphéroïdes est un modèle développé il y a de nombreuses années, mais qui 

trouve  actuellement  un  intérêt majeur  grâce  à  la mise  au  point  de  techniques  de  culture 

permettant  l’obtention  de  sphéroïdes  de  taille  homogène  et  unique.  Cependant,  les  études 

fonctionnelles et les études sur sphéroïdes entiers sont trop souvent limitées par l’épaisseur et 

l’organisation  des  échantillons  qui  représentent  une  véritable  barrière  pour  les  techniques 

classiques  de  transfection  et  d’immunomarquage.  En  conséquence,  les  études  sur  des 

sphéroïdes reposent sur l’analyse de paramètres globaux comme l’augmentation du volume ou 

l’analyse par immunodétection sur coupes.  

  Une  des  premières  techniques  empiriques  utilisée  pour mesurer  l’impact  de  différents 

traitements sur des sphéroïdes est basée sur la mesure de l'augmentation de volume. Ce type 

d’évaluation  requiert  des mesures  à  long  terme, mais  reste  cependant  la  technique  la  plus 

souvent utilisée pour évaluer  l’impact de  traitement  favorisant ou  inhibant  la  croissance des 

sphéroïdes  (Friedrich et al. 2007a). A partir de  la mesure des  volumes des  sphéroïdes,  il est 

possible de déterminer plusieurs paramètres qui caractérisent  la  réponse des sphéroïdes aux 

radiations ionisantes ou aux drogues cytotoxiques (Dubessy et al. 2000). De nombreuses études 

utilisent  le  « re‐growth  delay »  qui  correspond  au  temps  nécessaire  à  la  reprise  d’une 

croissance  normale.  On  peut  également  mesurer  l’ID50  (50%  growth  inhibiting  dose)  qui 

représente la dose d’irradiation nécessaire pour réduire le volume des sphéroïdes de 50% à un 

temps  donné  après  irradiations. Cependant  la mesure  de  ces  paramètres  ne  permet  pas  de 

distinguer  la  viabilité  cellulaire,  la  survie,  ou  la  prolifération.  La  viabilité  cellulaire  est  un 

paramètre très souvent analysé en réponse à divers traitements. Elle peut‐être mesurée au sein 

58 

 

des  sphéroïdes  grâce  à  l’activité  respiratoire  cellulaire.  La  technique  la  plus  utilisée  pour 

mesurer  l’activité  respiratoire  est  le  test  MTT  (3‐[4,5‐diméthylthiazol‐2yl]‐2,5‐

diphényltétrazolium  bromide).  Ce  test  permet  une  quantification  rapide  et  sensible  de  la 

prolifération et de la viabilité cellulaire, mais repose cependant sur de la dissociation cellulaire, 

ne permettant donc pas de prendre en compte la régionalisation établie au sein des sphéroïdes 

au cours de leur croissance. La mesure de l’activité des phosphatases acides sur sphéroïdes est 

également indicative de la viabilité cellulaire. Un test permet de mesurer de manière rapide et 

reproductible cette activité, et utilise le para‐nitrophenyl phosphate comme substrat (Friedrich 

et al. 2007b). Ce test a déjà permis de caractériser  l’effet de différentes drogues cytotoxiques 

sur des modèles de sphéroïdes, sans  la nécessité de dissocier  les sphéroïdes. La mesure de  la 

mortalité cellulaire peut également nous renseigner quant à  la viabilité des cellules. En effet, 

l’activité de  la LDH (Lactate Deshydrogenase) dans  le surnageant est  indicative de  la mortalité 

des cellules. 

  L'analyse  et  le  tri  de  cellules  vivantes  à  partir  de  sphéroïdes  peut  être  réalisée  en 

cytométrie  de  flux.  L’utilisation  de  cette  technique  fut  proposée  pour  la  première  fois  par 

Freyer et collaborateurs en 1987  (Freyer et al. 1987). Une analyse en cytométrie de  flux des 

cellules constituant les sphéroïdes nécessite de réaliser une dissociation des cellules à l’aide de 

traitement à la trypsine ou à la collagénase, qui induisent donc une perte de la régionalisation 

et des  interactions cellulaires établies au cours de  la croissance des sphéroïdes. Les cinétiques 

de reprise de croissance de populations cellulaires  issues de différentes régions de sphéroïdes 

ont été caractérisées par dissociation sélective de sphéroïdes d’origines humaines et murines 

(Freyer  and  Schor  1989).  Ces  auteurs  ont  observé  que  plus  les  cellules  se  trouvent  en 

profondeur  dans  les  sphéroïdes,  plus  la  reprise  de  croissance  est  longue  lorsqu’elles  sont 

dissociées puis remises en culture en monocouche. Cette étude a également mis en évidence le 

fait  que  la  méthode  de  dissociation  sélective  permet  d’isoler  des  populations  de  cellules 

prolifératives  mais  également  des  cellules  quiescentes  de  manière  rapide  et  non  invasive. 

L’utilisation  de  la  technique  de  dissociation  sur  les  sphéroïdes  permet  d’acquérir  un  grand 

nombre d’informations quant à la réponse cellulaire mise en jeu en réponse à l’exposition à des 

traitements  anticancéreux  conventionnels  comme  la  radiothérapie ou  la  chimiothérapie. Elle 

permet en effet d’étudier  la dynamique de progression des cellules dans  le cycle cellulaire, et 

de  mesurer  l’activation  des  différents  points  de  contrôle.  On  peut  également  par  des 

59 

 

marquages  spécifiques  observer  la  prolifération,  la  mortalité  cellulaire,  l’induction  de 

dommages à  l’ADN. Cependant, cette méthode abroge  l’hétérogénéité cellulaire ainsi que  les 

interactions cellulaires, caractéristiques essentielles à prendre en compte  lors de  l’évaluation 

de  différents  traitements.  On  perd  ainsi  toutes  les  informations  liées  à  l’importance  de  la 

dynamique spatiale et temporelle établie au cours de la croissance des sphéroïdes.  

  Une  autre  technique  largement  utilisée  est  l’immunodétection  sur  des  coupes  de 

sphéroïdes.  Cette méthode  ne  nécessite  pas  de  dissociation  des  sphéroïdes,  et  ne  présente 

aucune  limite  quant  à  la  taille  des  échantillons.  Elle  repose  sur  la  réalisation  de  coupes 

histologiques  à  congélation  ou  en  paraffine  d’épaisseur  variée  de  sphéroïdes,  puis  en  la 

détection d’antigènes par des anticorps spécifiques. Pour la détection de l’induction de la mort 

cellulaire programmée par apoptose, l’immunodétection des caspases ou de la PARP (Poly ADP 

Ribose Polymerase) est très souvent utilisée (Bressenot et al. 2009). L’activation de la voie des 

dommages  à  l’ADN  est  classiquement  mise  en  évidence  par  la  détection  de  la  forme 

phosphorylée  de  la  protéine  histone  H2AX  au  niveau  de  foci  nucléaires  correspondant  aux 

sites  de  cassure  de  l’ADN  (Dufau  et  al.  2011).  La  prolifération  cellulaire  est majoritairement 

révélée  par  l’immunodétection  de  l’antigène  Ki‐67  sur  des  coupes  de  sphéroïdes. 

L’incorporation de thymidine marquée radioactivement, ou d’analogue de la thymidine tels que 

le BrdU  (Bromodésoxyuridine) permet de  révéler  les  cellules prolifératives  sur des  coupes de 

sphéroïdes.  La  position  des  cellules  dans  les  différentes  phases  du  cycle  cellulaire  peut 

également  être  mise  en  évidence  par  la  détection  des  protéines  cyclines,  spécifiques  des 

différentes phases du cycle cellulaire (Lobjois et al. 2009a). La réalisation d’immunodétections 

sur  coupes  de  sphéroïdes  permet  de  prendre  en  compte  dans  l’analyse  l’hétérogénéité 

cellulaire  ainsi  que  les  interactions  entre  les  cellules,  mais  elle  ne  permet  cependant  pas 

d’accéder à  la dynamique du modèle de sphéroïdes du fait de  l’utilisation d’échantillons fixés. 

La  capacité  des  sphéroïdes  à  former  des  excroissances  dans  des  matrices  3D,  ou  sur  des 

surfaces  coatées  par  une  matrice  extracellulaire  est  un  paramètre  reflétant  la  capacité 

migratoire  des  cellules  tumorales  au  sein  des  sphéroïdes,  phénomène  impliqué  dans  le 

développement  de  métastases  et  pouvant  être  modifié  en  réponse  à  des  traitements 

anticancéreux (Hirschberg et al. 2006; Lambert et al. 2004). Cependant ce paramètre peut être 

observé seulement pendant des  intervalles de  temps  relativement court,  inférieur à  la durée 

d’un cycle cellulaire. Cette approche permet donc d’étudier les cellules de sphéroïdes ayant des 

60 

 

capacités migratoires  rapides  comme  les  sphéroïdes  issus  de  gliomes  ou  de  glioblastomes 

(Hirschberg et al. 2006).  

Toutefois ces différentes approches nécessitent souvent  la dissociation des sphéroïdes, 

ou la fixation des échantillons, et par conséquent ne permettent pas d’avoir une vision intégrée 

tridimensionnelle  des  processus  cellulaires  et  de  la  réponse mise  en  jeu,  et  une  partie  de 

l’information est par conséquent perdue. Pour dépasser ces limitations, il faut faire appel à des 

approches  d’imagerie  permettant  l’étude  des  sphéroïdes  entiers.  Le microscope  à  feuille  de 

lumière,  ou  SPIM  (Single  Plane  Illumination Microscope),  apparaît  être  aujourd’hui  l’outil  le 

mieux adapté pour l’étude des sphéroïdes entiers (Pampaloni et al. 2007; Verveer et al. 2007). 

Cette nouvelle technologie permet d’augmenter considérablement les temps d’observations et 

ouvre donc la perspective de pouvoir imager des processus cellulaires en temps réel au sein des 

sphéroïdes.  Des  travaux  récents  de  notre  laboratoire  démontrent  que  le  SPIM  permet 

l’imagerie en temps réel de sphéroïdes d’adénocarcinome colique exprimant une protéine de 

fusion entre  l’histone H2B et une protéine  fluorescente,  la HcRed  (Lorenzo et  al. 2011). Ces 

travaux montrent comment  le déroulement de  la mitose en temps réel en 3D peut permettre 

l'évaluation dynamique de l'activité de molécules anti‐mitotiques (Lorenzo et al. 2011). 

En conclusion,  le sphéroïde est un modèle original et puissant pour étudier  l’impact des 

thérapies  anti‐cancéreuses  conventionnelles.  Le  principal  intérêt  de  ce  modèle  est  sa 

prédictivité  de  la  réponse,  de  par  la  mise  en  place  des  gradients  physiopathologiques  et 

l’établissement  de  contacts  intercellulaires.  De  plus  l’hétérogénéité  cellulaire  des  tumeurs 

solides  peut  être  reproduite  par  l’utilisation  de modèles  de  sphéroïdes mixtes  composés  de 

différents  types  cellulaires,  permettant  de  prendre  en  compte  les  interactions  entre  les 

différentes cellules et avec  la matrice extracellulaire. La similarité des réponses observées  lors 

d’une exposition à des radiations  ionisantes ou à des drogues chimio‐thérapeutiques entre  les 

sphéroïdes et  les modèles  in  vivo, démontre que  le  sphéroïde est un modèle de  choix pour 

étudier  l’impact  de  différents  traitements. Ces  différentes  techniques  ne  permettent  pas  de 

prendre en compte  la dynamique spatiale et temporelle de  la réponse mise en  jeu  lors d’une 

exposition  à  des  traitements  anti‐tumoraux.  Ainsi  l’utilisation  plus  large  du  modèle  de 

sphéroïdes  nécessite  le  développement  de  nouveaux  outils  et  techniques  d’imagerie 

permettant une analyse globale, plus quantitative des réponses observées. 

61 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RESULTATS  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

62 

 

 

L'objectif de mon projet de thèse était d'étudier et de caractériser les modalités d’activation 

des points de contrôle du cycle cellulaire dans un modèle de sphéroïdes. 

Dans un premier temps, nous avons caractérisé la dynamique de progression des cellules dans  le 

cycle cellulaire par des approches classiques d’immunohistologie dans des sphéroïdes de cellules 

Capan‐2, données préalables nécessaires à la réalisation de ce projet. Parallèlement à ces travaux 

nous avons développé et caractérisé un modèle de  sphéroïdes exprimant des  rapporteurs de  la 

position  des  cellules  dans  le  cycle  cellulaire. Nous montrerons  comment  ces modèles  peuvent 

permettre d’analyser en 3D au sein des sphéroïdes, des modifications de  la dynamique du cycle 

cellulaire en réponse à l’activation des différents points de contrôle. 

 

I. Caractérisation de la dynamique spatiale et temporelle du contrôle  du  cycle  cellulaire  au  cours  de  la  croissance des sphéroïdes Capan‐2. 

 

A) Mise en place du gradient de prolifération au cours de la croissance des 

sphéroïdes Capan‐2. 

 

Afin de caractériser  la mise en place du gradient de prolifération qui s’établit au cours 

de la croissance des sphéroïdes de la lignée d’adénocarcinome pancréatique Capan‐2, j’ai tout 

d'abord  réalisé des marquages avec un anticorps dirigé contre  l'antigène Ki67, classiquement 

utilisé pour marquer  les cellules en prolifération, sur des coupes de sphéroïdes de différentes 

tailles.  Ces marquages  nous  ont  permis  de mettre  en  évidence,  que  sur  des  sphéroïdes  de 

300µm de diamètre, les cellules Ki67 positives sont présentes sur toute l'épaisseur de la coupe. 

Par  contre,  sur  des  coupes  de  sphéroïdes  mesurant  plus  de  500µm  de  diamètre,  une 

régionalisation des cellules Ki67 positives est visible avec une diminution du nombre de cellules 

exprimant le marqueur Ki67 de la périphérie vers le centre du sphéroïde (figure 19‐A).   

 

63 

 

 

B

D

EdU / DAPI

Pimonidazole / DAPI

C

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Distance à la surface (µm)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 40 80 120 160 200 240 280

Figure 19 : Caractérisa on du gradient de proliféra on au cours de la croissance des sphéroides Capan‐2 A : Immunodétec on des cellules proliféra ves (Ki‐67, vert) sur des coupes à congéla on de sphéroïdes Capan‐2 mesurant 300µm (gauche) ou 500µm (droite). Les noyaux sont détectés par le DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Visualisa on des cellules proliféra ves après une incorpora on d’EdU pendant 24 heures (rouge) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2 mesurant 300µm (gauche) ou 500µm de diamètre (droite). Les noyaux sont détectés par le DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. C : Représenta on graphique du pourcentage de cellules proliféra ves après une incorpora on d’EdU pendant 24 heures, en fonc on de la distance à la surface, dans des sphéroïdes Capan‐2 mesurant 500µm +/‐ 20µm de diamètre. Les données correspondent à la moyenne +/‐ la SEM du pourcentage de cellules EdU posi ves, calculé sur 10 coupes de sphéroïdes similaires provenant de 4‐5 sphéroides différents. D : Visualisa on de l’hypoxie intracellulaire par la détec on du pimonidazole (vert) sur des coupes à congéla on de pe ts (gauche), ou gros sphéroïdes Capan‐2 (droite). Les noyaux sont détectés par le DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm.

A Ki-67 / DAPI

64 

 

Afin  de  compléter  ces  premières  observations,  j'ai  analysé  la  proportion  de  cellules 

ayant réalisé ou réalisant une phase de réplication de l'ADN en fonction de leur position au sein 

des  sphéroïdes.  Ces  cellules  ont  été  identifiées  en  réalisant  des  expériences  d'incorporation 

d'EdU, un analogue de la thymidine qui s’intègre dans l’ADN au cours de la réplication. Un point 

limitant  à  ces  expériences  est  la  capacité de pénétration de  l'EdU dans  toute  l'épaisseur du 

sphéroïde. Afin de déterminer le temps nécessaire pour que l’incorporation de l’EdU permette 

cette  pénétration,  j’ai  réalisé  des  incorporations  de  différentes  durées  (4,  16,  24,  48  ou  60 

heures)  et  analysé  l'évolution  du  pourcentage  de  cellules  ayant  incorporé  de  l'EdU  sur  des 

sphéroïdes mesurant 300µm de diamètre. Des micrographies montrant l’incorporation de l’EdU 

après ces différents  temps d'incubation  sont présentées en  figure 20‐A. Nous observons que 

pour  des  incorporations  inférieures  à  24  heures,  les  cellules  EdU  positives  sont  détectées 

uniquement dans  les  couches externes des  sphéroïdes,  tandis que  les  cellules Ki67 positives 

sont présentes sur toute l’épaisseur de la coupe. Pour des incorporations de 24 heures ou plus, 

nous observons que  les cellules EdU positives sont détectées de manière homogène sur toute 

la coupe. Nous avons également quantifié le pourcentage de cellules EdU positives en fonction 

du  temps  (figure 20‐B). Ce pourcentage augmente progressivement au  cours du  temps pour 

atteindre environ 70% pour une  incorporation d’EdU de 24 heures. Ce pourcentage continue 

ensuite  légèrement à augmenter et atteint environ 90% de cellules prolifératives  lorsque  l’on 

réalise des  incorporations plus  longues (72 heures). Cependant, nous observons parallèlement 

une augmentation de  la mortalité cellulaire, quantifiée par comptage des noyaux pycnotiques 

(critère tardif), de 10% pour des temps courts à 20% lors d’incorporation d’EdU longues (figure 

20‐B). 

  Nous avons donc choisi, pour la suite de nos travaux, de réaliser des incorporations d'EdU 

de 24 heures, ce qui permet de détecter une majorité des cellules en prolifération en évitant 

une induction trop élevée de la mortalité cellulaire, probablement due à la toxicité de l’EdU. 

Il est également  intéressant de noter que nous observons une augmentation d’environ 

10%  de  cellules  prolifératives  lors  d’incorporations  longues  d’EdU,  supérieures  à  48  heures, 

suggérant que  seule une petite  fraction de  cellules  a une durée de  cycle  cellulaire  comprise 

entre 24 et 48 heures. Ces  résultats  révèlent donc  la présence d’une  certaine hétérogénéité 

dans  la  durée  du  cycle  cellulaire  au  sein  de  cellules  cultivées  dans  un  environnement 

tridimensionnel. De plus, lorsque l’on examine uniquement les assises cellulaires les plus  

65 

 

 

Figure 20 : Quan fica on de la proliféra on et de la mortalité cellulaire au cours d’une ciné que d’incorpora on d’EdU A : Visualisa on de la proliféra on cellulaire après différents temps d’incorpora on d’EdU (rouge) sur des coupes de sphéroïdes mesurant 300µm de diamètre. Les noyaux sont marqués par le DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Quan fica on sur des coupes de sphéroïdes Capan‐2 mesurant 300µm de diamètre, du pourcentage de cellules proliféra ves (noir) et apopto ques (rouge) après différents temps au cours d’une d’incorpora on d’EdU, sans tenir compte de la posi on des cellules au sein des sphéroïdes. Chaque valeur correspond à la moyenne du pourcentage de cellules EdU posi ves calculée sur 3 coupes provenant de 3 sphéroïdes différents.

Incorpora

on de l’Ed

U (h

eures)

4h

16h

24h

48h

60h

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Temps (heures)

A B

66 

 

périphériques qui dans  le sphéroïde correspondent aux zones prolifératives, nous n’observons 

jamais  100%  de  cellules  EdU  positives  après  24h  d’incorporation  (figure  20‐A).  Ce  résultat 

suggère ainsi fortement que des cellules situées dans une même région des gradients établis au 

cours de la croissance du sphéroïde n’ont pas la même durée de cycle cellulaire.  

 

Les conditions optimales du marquage EdU ayant été établies, nous  les avons utilisées 

sur  des  sphéroïdes  Capan‐2  mesurant  300µm  ou  500µm  de  diamètre  afin  d’examiner  les 

relations  entre  ce  marquage,  reflet  de  la  prolifération,  et  la  mise  en  place  des  différents 

gradients  de  nutriments,  et  d’oxygène.  Comme  le montre  la  figure  19‐B  (gauche),  sur  des 

coupes à congélation de sphéroïdes mesurant 300µm de diamètre,  il n’y a pas de gradient de 

prolifération.  En  effet,  les  cellules  prolifératives  détectées  par  l’incorporation  d’EdU  sont 

observées sur l’ensemble de la coupe. En revanche, sur des coupes de sphéroïdes de 500µm de 

diamètre, nous observons la présence de cellules EdU positives seulement en périphérie (figure 

19‐B, droite). Afin de caractériser plus précisément ce gradient de prolifération qui s’établit au 

cours  de  la  croissance  des  sphéroïdes,  nous  avons  déterminé  le  pourcentage  de  cellules 

prolifératives  en  fonction  de  la  distance  à  la  surface  des  sphéroïdes  (figure  19‐C).  Nous 

montrons  sur  des  coupes  de  sphéroïdes  mesurant  500‐600m  de  diamètre,  la  présence 

d’environ  60%  de  cellules  EdU  positives  en  périphérie,  puis  nous  observons  une  diminution 

progressive du pourcentage de cellules EdU positives, qui est inférieur à 20% au‐delà de 150µm 

de distance à la périphérie des sphéroïdes.  

 

Enfin  nous  avons  également  analysé  la mise  en  place  du  gradient  d’hypoxie  au  cours  de  la 

croissance des sphéroïdes. Nous détectons l’hypoxie intracellulaire grâce au pimonidazole, une 

molécule dont la réduction dans un environnement hypoxique permet sa liaison aux protéines 

contenant des groupements SH. Comme  le montre  la  figure 19‐D, nous ne détectons aucune 

zone hypoxique sur des coupes de petits sphéroïdes,  tandis qu’un  fort marquage est détecté 

dans  les zones centrales des gros sphéroïdes. L'apparition du gradient d'hypoxie corrèle donc 

avec la mise en place du gradient de prolifération décrit précédemment. 

 

67 

 

L’ensemble de  ces  résultats nous a permis de  caractériser précisément  la mise en place du 

gradient  de  prolifération  grâce  à  l’incorporation  d’EdU,  au  cours  de  la  croissance  des 

sphéroïdes Capan‐2, et de le corréler avec la mise en place du gradient d’hypoxie.  

 

B) Analyse de la répartition des cellules dans le cycle cellulaire au cours de la 

croissance des sphéroïdes Capan‐2. 

 

Notre second objectif était d’étudier  la répartition des cellules dans  les différentes phases du 

cycle cellulaire en fonction de la position des cellules dans les sphéroïdes et au cours de la mise 

en place des différents gradients. Pour cela, nous avons  tout d’abord analysé  l’expression de 

régulateurs  clés  impliqués  dans  la  progression  du  cycle  cellulaire.  Nous  avons  réalisé  des 

analyses par immunofluorescence à l'aide d'anticorps dirigés contre les cyclines D, E, A et B sur 

des  coupes  à  congélation  de  sphéroïdes Capan‐2  de  différentes  tailles, mesurant  300µm  ou 

500µm de diamètre. Nous pouvons remarquer que l’expression de ces cyclines est restreinte à 

une  sous‐population  de  cellules,  ce  qui  est  en  accord  avec  le  fait  que  ces  protéines  sont 

exprimées de manière spécifique dans les différentes phases du cycle cellulaire.  

  Sur des coupes à congélation de sphéroïdes Capan‐2 mesurant 300µm de diamètre,  les 

cellules  exprimant  les  cyclines  D,  E,  A  ou  B  sont  réparties  de  façon  uniforme  sur  toute 

l'épaisseur de  la coupe  (figure 21, gauche,  respectivement pour  les cyclines D, E, A et B). En 

revanche, sur des coupes de sphéroïdes de 500µm de diamètre, nous observons la présence de 

cellules exprimant les cyclines D, E, A et B uniquement au niveau des assises cellulaires les plus 

périphériques (figure 21, droite, respectivement pour les cyclines D, E, A et B).  

  Ces  résultats montrent  une  régionalisation  de  l’expression  des  différentes  cyclines  qui 

accompagne la mise en place du gradient de prolifération, avec une expression sous forme de 

gradient allant des couches prolifératives situées en périphérie vers les couches quiescentes les 

plus profondes.  

 

Nous nous sommes également intéressés à la détection des cellules mitotiques dans les 

sphéroïdes en fonction de la position des cellules dans les différents gradients. Pour cela nous 

avons  réalisé  des  analyses  par  immunofluorescence  à  l'aide  d'un  anticorps  dirigés  contre 

68 

 

l’histone‐H3 phosphorylée (H3P). Nous observons sur des sphéroïdes de 300µm de diamètre la 

présence de cellules mitotiques  sur  toute  l’épaisseur des coupes  (figure 21, gauche). Sur des 

sphéroïdes mesurant 500µm de diamètre, nous observons la présence de cellules H3P positives 

seulement dans les couches les plus périphériques des sphéroïdes (figure 21, droite). 

   L’ensemble de ces  résultats montre une  régionalisation de  l’expression de  régulateurs 

de la progression du cycle cellulaire au cours de la croissance des sphéroïdes. Nous montrons 

en  effet  la  présence  de  cellules  en  mitose  ainsi  que  l’expression  des  différentes  cyclines 

seulement  dans  les  couches  périphériques  des  sphéroïdes  correspondant  aux  zones 

prolifératives. Ces résultats démontrent que l’expression de régulateurs clés impliqués dans la 

progression des cellules dans le cycle cellulaire est modulée par le microenvironnement et les 

interactions cellulaires mises en place dans ce modèle tridimensionnel. 

 

II. Obtention et caractérisation d'un modèle de sphéroïde Capan‐2 exprimant des rapporteurs de  la position des cellules dans le cycle, les Fucci. 

 

Les résultats précédents apportent des  informations  importantes sur  la répartition des 

cellules  dans  le  cycle  cellulaire  au  sein  des  sphéroïdes  Capan‐2.  Cependant  les  techniques 

classiques d’immunofluorescence indirecte sur les coupes de sphéroïdes ne permettent pas de 

prendre en compte l’aspect dynamique du cycle cellulaire.  

Récemment,  il  a été proposé que  la protéine Dnmt1  (DNA methyltransférase 1) et  la 

DNA Ligase I en fusion avec des protéines fluorescentes distinctes, puissent être utilisées pour 

suivre la position d’une cellule dans le cycle cellulaire (Easwaran et al. 2005). Les auteurs de ces 

travaux ont montré une distribution sous forme de foci en phase G2 de  la protéine Dmnt1, et 

sous forme dispersée de  la DNA Ligase  I. Au cours de  la phase S,  les deux protéines de fusion 

sont localisées au niveau de foci, et ce sur des cellules fixées ou vivantes.  

 

69 

 

 

 

 

Petits sphéroïdes Gros sphéroïdes

*

*

*

*

*

Cyc D

Cyc E

Cyc A

Cyc B

p-H3

Cyc D

Cyc E

Cyc A

Cyc B

p-H3

Figure 21 : Expression de régulateurs du cycle cellulaire au cours de la croissance des sphéroides Capan‐2 Immunodétec on des cyclines D, E , A, B et de l’Histone‐3‐phosphorylée (p‐H3) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2 mesurant 300µm (gauche) ou 500µm (droite). Les noyaux sont détectés par le DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. L’astérisque indique le centre des gros sphéroides, et les poin llés, la périphérie.

Cyc D

Petits sphéroïdes Gros sphéroïdes

*

*

*

*

*

Cyc D

Cyc E

Cyc A

Cyc B

p-H3

Cyc D

Cyc E

Cyc A

Cyc B

p-H3

70 

 

Cependant cette stratégie ne permet qu’une faible détection des modifications, avec une trop 

faible  dynamique  à  l’échelle  cellulaire,  et  ne  permet  pas  la  réalisation  d’études  dans  un 

contexte multicellulaire.  

Dans  l’optique  d’accéder  à  une  vision  plus  intégrée  et  plus  systématique  de  la 

dynamique  du  cycle  cellulaire,  nous  avons  développé  des modèles  de  sphéroïdes  Capan‐2 

exprimant  les  marqueurs  Fucci  (Fluorescent  Ubiquitinilation  Cell  Cycle  Indicator)  (Sakaue‐

Sawano  et  al.  2008a)  (figure  22).  Les  Fucci  sont  des marqueurs  fluorescents  permettant  de 

repérer la position des cellules dans le cycle cellulaire. Le  Fucci‐rouge (FR) est une protéine de 

fusion entre une région de la protéine Cdt1 (acides aminés 30 à 120) et la protéine fluorescente 

mKO2 (rouge), permettant de visualiser les cellules se situant en phase G1, et à la transition G1‐

S. Le Fucci‐vert (FV) est une protéine de fusion entre la geminine (acides aminés 1 à 110) et la 

protéine  fluorescente mAG  (vert),  permettant  de  visualiser  les  cellules  se  trouvant  dans  les 

phases  S,  G2  ou M  du  cycle  cellulaire.  Les  cellules  Capan‐2  exprimant  de  façon  stable  les 

rapporteurs Fucci ont été obtenues par transduction lentivirale (figure 22) (Dufau et al. 2011).

 

A) Validation de l'expression des rapporteurs Fucci dans les différentes phases du 

cycle au sein des sphéroïdes Capan‐2/Fucci. 

   

  Afin de valider la régulation de l'expression des marqueurs Fucci au cours de la progression 

du  cycle  cellulaire,  nous  avons  analysé  par  immunodétection  sur  des  coupes  de  sphéroïdes 

exprimant de  façon  stable  le Fucci‐rouge  (sphéroïdes Capan‐2/FR) ou  le Fucci‐vert  (sphéroïdes 

Capan‐2/FV) l'expression des  cyclines, D, E, A ou B (figure 23).  

Nous montrons  sur  des  coupes  de  sphéroïdes  Capan‐2/FR mesurant  300µm  ou  500µm  de 

diamètre, que la quasi‐totalité des cellules exprimant le rapporteur Fucci‐rouge co‐expriment la 

cycline D1  ou  la  cycline  E  dans  une  plus  faible  proportion. Aucune  cellule  ne  co‐exprime  le 

Fucci‐rouge et la cycline A ou la cycline B. Ces observations montrent que le rapporteur Fucci‐

rouge est exprimé dans  les cellules en phase G1 et à  la  transition G1/S dans  les modèles de 

sphéroïdes Capan‐2/FR. 

 

71 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 22 : Descrip on des marqueurs fluorescents Fuccis A : Les Fuccis sont des ou ls perme ant la visualisa on de la dynamique du cycle cellulaire grâce à des marqueurs fluorescents récemment développés. Le Fucci rouge consiste en la fusion d’une protéine cdt1 tronquée avec une protéine fluorescente rouge, perme ant de visualiser les cellules se trouvant en phase G1 et à la transi on G1/S. Le Fucci vert est une protéine de fusion entre une version tronquée de la geminine et une protéine fluorescente verte, perme ant de détecter les cellules en phases S/G2 et M du cycle cellulaire. D’après Sakaue‐Sawano et al., 2008.

Fucci Vert Phase S/G2/M

Fucci Rouge Phase G1 et transi on G1/S

Geminin (1‐110) mAG

Cdt1 (30‐120) mKO2

72 

 

Sur des coupes de sphéroïdes Capan‐2/FV, on observe quelques rares cellules co‐exprimant  le 

rapporteur Fucci‐vert et la cycline D1 ou la cycline E, alors que toutes les cellules exprimant la 

cycline  A  ou  la  cycline  B  co‐expriment  le  Fucci‐vert.  Ainsi,  le  rapporteur  Fucci‐vert  dans  les 

sphéroïdes Capan‐2/FV est exprimé dans les cellules en phase S, G2 et mitose. 

L’ensemble de ces résultats nous permet de conclure que le  Fucci‐rouge est exprimé en phase 

G1 et en début de phase S, et que le  Fucci‐vert est exprimé au cours des phases S, G2 et M du 

cycle cellulaire.  

 

B) Caractérisation  spatiale  et  temporelle  de  la  répartition  des  cellules  dans  les 

différentes phases du cycle cellulaire dans les sphéroïdes Capan‐2/Fucci. 

 

  Grâce  à  ces  modèles  de  sphéroïdes,  nous  pouvons  accéder,  de  façon  simple,  à  la 

répartition  des  cellules  dans  les  différentes  phases  du  cycle  cellulaire  au  cours  de  leur 

croissance. De façon cohérente avec les résultats précédemment obtenus, nous observons sur 

des coupes à congélation de sphéroïdes mesurant 300μm de diamètre  la présence de cellules 

exprimant  le Fucci‐rouge ou  le Fucci‐vert sur  l’ensemble de  la coupe  (figure 24‐A et C, haut), 

alors que  sur des  sphéroïdes de 600μm de diamètre nous observons  la présence de  cellules 

exprimant  le Fucci‐rouge ou  le Fucci‐vert seulement en périphérie des sphéroïdes (figure 24‐A 

et C, bas).  

  Afin d'analyser les modifications de répartition dans le cycle cellulaire qui accompagnent 

la mise en place des gradients au cours de la croissance des sphéroïdes, nous avons quantifié le 

pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge ou le Fucci‐vert  en fonction de la distance à la 

surface. Nous avons réalisé ces études en prenant soin de n’utiliser que des coupes passant par 

le centre de sphéroïdes. Ces graphes montrent que les cellules en phase G1, sont distribuées de 

manière homogène au sein de petits sphéroïdes mesurant 300μm de diamètre, tandis qu’une 

légère régionalisation est retrouvée au sein des sphéroïdes Capan‐2/FV (figure 24‐B et D, haut). 

En revanche sur des sphéroïdes mesurant 500µm de diamètre nous observons la mise en place 

d’une régionalisation au sein des sphéroïdes Capan‐2/FR ou Capan‐2/FV (figure 24‐B et D, bas). 

Les  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  sont  détectées  de  manière  homogène  au  sein  des 

sphéroïdes mesurant 300µm de diamètre avec la présence d’environ 50 à 60% de cellules 

73 

 

74 

 

exprimant  le Fucci‐rouge quelle que soit la position des cellules au sein de la coupe (figure 24‐

B,  haut).  Le  pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert  est  distribué  de manière moins 

homogène dans les petits sphéroïdes, avec la mise en place progressive d’un léger gradient de 

cellules  exprimant  le  Fucci‐vert  étant  déjà  visible,  avec  un  peu  moins  de  40%  de  cellules 

détectées en périphérie, et entre 15 et 20% dans  les couches  les plus centrales  (figure 24‐D, 

haut). Sur des coupes de sphéroïdes mesurant 600µm de diamètre, le pourcentage de cellules 

exprimant  le  Fucci‐rouge  diminue  progressivement  de  la  périphérie  vers  le  centre  des 

sphéroïdes. Nous détectons environ 65% de  cellules exprimant  le  Fucci‐rouge en périphérie, 

puis  ce  pourcentage  diminue  progressivement  jusqu'à  140µm  de  profondeur.  Au‐delà,  la 

proportion de cellules exprimant  le rapporteur Fucci‐rouge diminue nettement pour atteindre 

20%  des  cellules.  Plus  au  centre  du  sphéroïde,  nous  détectons  encore  10%  de  cellules 

exprimant  le Fucci‐rouge (figure 24‐B, bas). En périphérie des sphéroïdes mesurant 600µm de 

diamètre  le pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐vert est plus faible et représente 25%. 

Nous  observons  ensuite  une  diminution  légère  jusqu’à  150µm  de  profondeur  où  10%  des 

cellules  expriment  le  Fucci‐vert.  Au‐delà,  nous  observons  une  absence  totale  de  cellules 

exprimant le rapporteur Fucci‐vert (figure 24‐D, bas).  

  Les  marqueurs  fluorescents  Fucci  nous  ont  permis  de  caractériser  précisément  la 

répartition des cellules au sein du cycle cellulaire au sein de sphéroïdes Capan‐2 de différentes 

tailles,  reflétant  la mise  en  place  des  différents  gradients  qui  s’établissent  au  cours  de  la 

croissance de ce modèle en 3D. L’ensemble des  résultats obtenus  sur  les  sphéroïdes Capan‐

2/Fucci, nous ont permis de révéler l’importance de la mise en place de la régionalisation de 

la  prolifération  qui  s’établie  au  cours  de  la  croissance  des  sphéroïdes.  Cet  aspect  de  la 

régionalisation de  la prolifération  est un paramètre  essentiel à prendre  en  compte  lors de 

l’investigation  de  l’activation  des  points  de  contrôle  du  cycle  cellulaire  en  3D,  lors  de 

l’exposition à différents traitements perturbant la progression du cycle cellulaire.  

 

 

 

75 

 

 

 

B

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Distance à la surface (µm)Surface du sphéroïde

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 3000

10

20

30

40

50

60

70

80

0

20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

10

20

30

40

50

60

70

80

0

Centre du sphéroïde

A

C D

10

20

30

40

50

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 0

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0

10

20

30

40

50

0

Distance à la surface (µm)

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

pos

itive

s

Surface du sphéroïde

Centre du sphéroïde

Fucc

i-Rou

ge /

DA

PI

Fucc

i-Ver

t / D

AP

I

Figure 24 : Répar on des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire dans les sphéroides Capan‐2 exprimant les marqueurs Fucci rouge ou vert A, C : Visualisa on des cellules en phases G1 et S‐G2‐M sur des coupes à congéla on de pe ts sphéroides (haut) ou gros sphéroides (bas), exprimant les marqueurs Fucci rouge ou vert respec vement. Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B, D : Représneta on graphique du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge ou vert en fonc on de la distance à la périphérie de sphéroides Capan‐2 mesurant 340µm +/‐ 20µm (haut) or 580µm +/‐ 20µm (bas) de diamètre. La posi on rela ve du centre des sphéroides est indiquée. Les données correspondeant à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 7 ‐10 coupes issues de 3‐4 spheroides différents .

76 

 

 

III. Etude  des  modifications  de  la  dynamique  du  cycle cellulaire  en  réponse  à  l'activation  des  points  de contrôle du cycle cellulaire en 3D. 

 

A) Validation de la variation d'expression des rapporteurs Fucci dans les cellules 

Capan‐2 en réponse en réponse à l'activation des points de contrôle G1/S et 

G2/M. 

 

  Plusieurs  articles  récents  ont montré  une  dérégulation  de  l’expression  des marqueurs 

Fucci en réponse à l’exposition à divers agents génotoxiques (Sakaue‐Sawano et al.2011; Kaida 

et  al.2011).  Ces  travaux  indiquent  que  la  réponse  observée  dépend  de  la  lignée  cellulaire 

utilisée,  de  la  concentration  en  drogue,  ou  encore  de  la  position  des  cellules  dans  le  cycle 

cellulaire au moment du traitement. Au vu de ces résultats, il apparait donc essentiel de valider 

notre modèle cellulaire en vérifiant que les variations d’expression des Fucci en réponse à des 

modifications de la progression des cellules dans le cycle cellulaire à la suite de l’activation des 

points de contrôle, corrèle avec la position des cellules dans le cycle cellulaire.  

Nous  avons  traité  des  cellules  Capan‐2/Fucci  cultivées  en  monocouche  avec  des  drogues 

activant  les différents points de contrôle du cycle cellulaire. La  lovastatine, en ciblant  l’HMG‐

CoA‐réductase,  inhibe  la  synthèse  du  mévalonate,  un  intermédiaire  dans  la  synthèse  du 

cholestérol nécessaire à la production des groupements farnésyl‐farnésyl et géranyl‐géranyl. En 

induisant  une  déprivation  de  ces  groupements,  la  lovastatine  cause  une  inactivation  des 

protéines Rho et Ras. Il a été démontré que  la réduction de  la géranyl‐géranylation de Rho en 

présence  de  lovastatine,  induit  une  sur‐expression  de  p27,  responsable  de  l’inhibition  de 

l’activité de  la Cdk2,  résultant en un arrêt du cycle  cellulaire en phase G1  (Javanmoghadam‐

Kamrani and Keyomarsi 2008). Il a également été montré que la lovastatine induit un arrêt des 

cellules en phase G1 du cycle cellulaire en induisant l’expression des protéines p21 et p27, ainsi 

que leur redistribution, conduisant à l'inhibition de l’activité de la Cdk2, nécessaire pour passer 

la transition G1‐S (Rao et al. 1998). Un traitement de 48h à avec 60µM de lovastatine induit une 

77 

 

accumulation très nette des cellules Capan‐2 en phase G1, cellules qui expriment le rapporteur 

Fucci‐rouge  (figure  25‐A,  B).  Dans  ces  conditions  expérimentales,  nous  observons  une 

augmentation de 25% du pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐rouge, et une diminution 

de 40% du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐vert (figure 25‐C, gauche). Nous vérifions 

ainsi  que  les  cellules  arrêtées  en  phase  G1  du  cycle  cellulaire  après  un  traitement  à  la 

lovastatine expriment le marqueur Fucci‐rouge et pas le rapporteur Fucci‐vert.  

L’étoposide (ou VP‐16) est un inhibiteur de l’enzyme Topoisomérase II qui a un rôle essentiel au 

cours  de  la  réplication  de  l’ADN.  En  inhibant  cette  enzyme,  l’étoposide  provoque  une 

accumulation de cassures de  l’ADN au cours de  la phase S,  induisant  l’activation du point de 

contrôle G2/M. Après exposition des cellules Capan‐2 à  l'étoposide pendant 1 heure à 40µM, 

puis un relarguage pendant 16h, nous observons une accumulation de cellules avec un contenu 

en ADN de phase G2, dont nous avons vérifié qu'elles expriment  le Fucci‐vert (figure 25‐A, B). 

Dans ces conditions,  le pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐vert atteint plus de 80%, et 

nous observons parallèlement une diminution de 50% du pourcentage de cellules exprimant le 

Fucci‐rouge (figure 25‐C, droite). 

L’ensemble de ces résultats  indique que  les variations d’expression des Fucci corrèlent avec  la 

répartition des cellules dans le cycle cellulaire à la suite de l'activation des points de contrôle du 

cycle cellulaire induits par différents traitements.  

Les marqueurs fluorescents Fucci vont donc nous permettre d’accéder à la dynamique spatiale 

et temporelle de  la répartition des cellules dans  les différentes phases du cycle cellulaire au 

cours  de  la  progression  normale  du  cycle  cellulaire  ainsi  qu’en  réponse  à  l’activation  des 

différents points de contrôle du cycle cellulaire, au cours de la croissance des sphéroïdes. 

 

78 

 

 

AFu

cci-R

ouge

/ D

AP

I Fu

cci-V

ert /

DA

PI

Non traitée EtoposideLovastatine

Fucci Rouge : Non traitée

Traitée

Non traitéeFucci Vert :

Traitée

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Lovastatine Etoposide

Nom

bres

de

cellu

les

Contenu en ADN (n)

B

C

Figure 25 : Caractérisa on des effets de la lovasta ne et de l’étoposide sur les lignées Capan‐2 exprimant les marqueurs Fucci Les lignées Capan‐2 Fucci rouge ou vert, cul vées en monocouches sont traitées ou non avec de la lovasta ne (60µM pendant 48 heures), ou avec de l’étoposide (10µM pendant 1 heure). A : Visualisa on des cellules exprimant le Fucci‐rouge ou Fucci‐vert. Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). B :Analyse de la répar on des cellules dans le cycle cellulaire par cytométrie de flux, après un marquage de l’ADN au Draq5. C : Quan fica on du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouges ou le Fucci‐vert.

1 2 1 2 1 2

0

10

20

30

40

50

60

70

90

80

100

0

10

20

30

40

50

60

70

90

80

100

79 

 

 A

ugm

enta

tion

de v

olum

e (x

)

Temps (jours)

Figure 26 : Evolu on de la croissance des sphéroides Capan‐2 après la priva on en EGF A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci rouge sont traités pendant 6 jours en présence ou en absence d’EGF. Le volume des sphéroides des différentes condi ons est mesuré quo diennement. NT : non traités. B : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci vert sont traités pendant 6 jours en présence ou en absence d’EGF. Le volume des sphéroides des différentes condi ons est mesuré quo diennement. NT : non traités.

Non traités

Traités (‐EGF)

0 2 4 6 80

1

2

3

4

5

6

7

Non traités

Traités (‐EGF)

0 2 4 6 80

1

2

3

4

5

6

7A

B

80 

 

 

B) Activation des points de contrôle du cycle cellulaire en 3D. 

 

Afin d'étudier  la réponse à  l'activation des points de contrôle du cycle cellulaire d'une 

population de  cellules mimant une micro‐tumeur, nous  avons  analysé,  grâce  aux  sphéroïdes 

Capan‐2/Fucci,  les modifications de  la dynamique spatiale et  temporelle de contrôle du cycle 

cellulaire  après  privation  de  facteurs  de  croissance,  arrêt  du  cycle  en  G1  et  induction  de 

dommages à l'ADN. 

 

1) Modification  de  la  dynamique  du  cycle  cellulaire  au  sein  des 

sphéroïdes en réponse à une carence en EGF. 

 

  Les travaux récents de l'équipe ont montré que l'absence d'EGF dans le milieu de culture 

provoquait  un  arrêt  de  croissance  et  de  prolifération  des  sphéroïdes  Capan‐2  (Dufau  et  al. 

2011) démontrant la dépendance des sphéroïdes Capan‐2 à l'EGF au cours de leur croissance. 

Comme  le montre  la  figure 26,  les sphéroïdes Capan‐2/Fucci montrent  la même dépendance. 

En  effet,  nous  observons  une  croissance  identique  entre  les  sphéroïdes  non  traités,  et  ceux 

cultivés sans EGF jusqu’à 2‐3 jours après la suppression de l’EGF. Après 3 jours, nous observons 

une croissance ralentie pour les sphéroïdes cultivés en absence d’EGF et ce jusqu’à 7 jours. Au‐

delà de 7 jours, pour les deux lignées nous n’avons pas pu mesurer le volume des sphéroïdes du 

fait d’une très forte déstructuration induite par la privation en EGF. Nous remarquons pour les 

deux  lignées qu’à partir de  5  jours  après  la  suppression de  l’EGF,  les  sphéroïdes  cultivés  en 

absence d'EGF n’augmentent plus de volume, suggérant un arrêt des cellules dans  le cycle ou 

une sortie des cellules en phase G0 de quiescence.  

  Afin  de  caractériser  le  gradient  de  prolifération  et  ses  modifications  au  cours  de  la 

privation en EGF des sphéroïdes, des  incorporations d’EdU d’une durée de 24 heures ont été 

réalisées  de  manière  quotidienne  au  cours  de  l’expérience.  Nous  avons  quantifié,  comme 

précédemment, le pourcentage de cellules EdU positives, ou exprimant le Fucci‐rouge ou Fucci‐

vert en fonction de la position des cellules dans les sphéroïdes. Comme le montre la figure 27‐A  

81 

 

 

0 40 80 1200

1020

30

40

50

60

70

0 40 80 120 0 40 80 120 0 40 80 1200

1020

30

40

50

60

70

0

1020

30

40

50

60

70

0

1020

30

40

50

60

70

0

1020

30

40

50

60

70

0

1020

30

40

50

60

70

0

1020

30

40

50

60

70

0

1020

30

40

50

60

70

0 40 80 120 0 40 80 120 0 40 80 120 0 40 80 120

0

1020

30

40

50

0 40 80 120 0 40 80 120 0 40 80 120 0 40 80 1200

1020

30

40

50

0

1020

30

40

50

0

1020

30

40

50

Fucci-Rouge:

Contrôle -EGF

Contrôle -EGF

Fucci-Vert:

Contrôle -EGF

EdU : 2 jours 3 jours 5 jours 6 jours

Per

cent

age

of p

ositi

ve c

ells

Distance à la surface des spheroïdes (µm)

EdU / DAPI Fucci rouge / DAPI Fucci vert / DAPI

Non

trai

tés

A

B

Figure 27 : Arrêt en phase G1 et G2 en réponse à la priva on en EGF A : Visualisa on de l’incorpora on d’EdU (gauche), des cellules exprimant le Fucci‐rouge (milieu) ou le Fucci verte (droite) sur des coupes de sphéroides Capan‐2 contrôles (haut) ou 6 jours après la suppression de l’EGF. Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). L’EdU a été incorporé pendant 24 heures. Barre d’échelle: 50µm. B : Quan fica on du pourcentage de cellules EdU posi ves (haut), exprimant le Fucci‐rouge (milieu) ou le Fucci vert (bas) en fonc on de la distance à la périphérie des spheroides. Les intervalles de 0‐40µm, 40‐80µm and 80‐120µm sont considérés. Pour chaque condi on, les données correspond à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 10‐30 sec ons issues de 2ou 3 expériences indépendantes provenant de 5‐10 sphéroides différents.

6 jo

urs

san

s E

GF

82 

 

(gauche), aucune cellule n'ayant  incorporé  l'EdU n'est détectée après 6  jours de privation en 

EGF,  suggérant que  la plupart des cellules doivent  se  trouver en phase G0 de quiescence, et 

donc ne prolifèrent plus. L'évolution du pourcentage de cellules ayant incorporé l'EdU au cours 

de la privation en EGF en fonction de la distance des cellules à la périphérie des sphéroïdes est 

présentée en figure 27‐B (haut). Nous remarquons une diminution du pourcentage de cellules 

prolifératives  sous  forme d'un gradient  seulement 2  jours après  la  suppression de  l’EGF avec 

une très faible diminution dans  les couches périphériques et en revanche, une diminution qui 

atteint environ 40 à 50% dans  les couches  les plus profondes des sphéroïdes. Au  jour 3, nous 

observons  une  réponse  similaire mais  largement  accentuée  surtout  au  niveau  des  cellules 

périphériques. A partir de  5  jours, nous observons une  absence quasi‐totale d’incorporation 

d’EdU et ce quelque soit  la position des cellules dans  les sphéroïdes. En accord avec  la vision 

classique de  la  régulation de  la progression des  cellules dans  le  cycle  cellulaire,  ces  résultats 

suggèrent que  lorsque  l’on prive  les sphéroïdes Capan‐2 Fucci en EGF,  les cellules deviennent 

incapables de  passer  le  point  de  restriction,  et  s’arrêtent  en  phase G1,  avant  de  rentrer  en 

phase de quiescence G0.  

  Nous  avons  examiné  cette  hypothèse  en  analysant  la  distribution  du  pourcentage  de 

cellules exprimant  le Fucci‐rouge ou  le Fucci‐vert dans  les zones prolifératives des sphéroïdes, 

correspondant aux 120 premiers µm en périphérie, au cours des 6 jours d’expérience. Comme 

le montre la figure 27‐A (milieu et droite), on observe une très nette diminution du nombre de 

cellules exprimant le Fucci‐rouge ou le Fucci‐vert 6 jours après la privation en EGF par rapport à 

la condition non traitée. La quantification présentée en figure 27‐B montre que le pourcentage 

de cellules exprimant  le Fucci‐vert diminue de manière progressive  suite à  la  suppression de 

l’EGF, avec une diminution d’un facteur 2, 5  jours après  le début de  l’expérience. De manière 

surprenante, nous détectons  la présence d’environ 15% de cellules exprimant  le Fucci‐vert au 

jour 6, alors que l’incorporation de l’EdU est totalement abolie et qu'il n'y a plus de cellules en 

prolifération. L’évolution du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge est différente. En 

effet,  durant  les  trois  premiers  jours  après  la  privation  en  EGF,  nous  observons  une 

augmentation  du  pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge,  en  comparaison  avec  la 

condition  contrôle,  indiquant  que  les  cellules  s’accumulent  en  phase  G1  du  cycle  cellulaire 

quelle que soit  leur position dans  les sphéroïdes. Cependant au  jour 5, nous remarquons une 

diminution du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge, qui est encore plus importante 

83 

 

au  jour 6. La diminution du pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐vert ou  le Fucci‐rouge 

observée  aux  jours  5  et  6  illustre  la  sortie  du  cycle  cellulaire  et  l’entrée  en  phase  G0  de 

quiescence,  ce  qui  est  en  accord  avec  la  diminution  de  l’expression  des  protéines  Cdt1  et 

Geminine  constituant  les marqueurs  Fucci‐rouge  et  vert  respectivement,  lors  de  la mise  en 

quiescence de cellules par une privation en sérum  (Xouri et al. 2004). Ces résultats montrent 

que  l'entrée  en  quiescence  des  cellules  intervient  tardivement  après  la  privation  en  EGF. 

D’autre part,  le maintien d’un certain pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐rouge ou  le 

Fucci‐vert  à  ces  jours  tardifs,  alors que  l’incorporation de  l’EdU est quasiment nulle,  semble 

illustrer un arrêt prolongé des  cellules en phase G1 ainsi qu’en phase G2 du  cycle  cellulaire. 

L’arrêt des cellules en phase G1 suite à une privation en  facteur de croissance est  largement 

démontré,  tandis  que  l’arrêt  en  phase  G2  a  été  beaucoup  moins  étudié.  Cependant  nos 

résultats suggèrent que  la suppression de  l’EGF  ralenti  les cellules en G1, mais également en 

G2. Il a été proposé que la signalisation du récepteur à l’EGF puisse jouer un rôle au niveau de 

la transition G2/M du cycle cellulaire dans des cellules surexprimant ce récepteur (Walker et al. 

2007). Nos observations suggèrent que  lorsque  les cellules Capan‐2 sont cultivées en 3D, elles 

arrêtent ou ralentissent leur cycle cellulaire en phase G2 en absence d’EGF. 

 

2) Étude de la réponse à un arrêt en G1 induit par de la lovastatine 

 

  Le traitement des sphéroïdes avec la lovastatine induit un ralentissement de la croissance 

des  sphéroïdes, de manière dose‐dépendante  avec une  IC50 de  l’ordre de 5µM.  Lorsque  les 

sphéroïdes  sont  traités à des  concentrations plus élevées, au‐delà de 20µM, nous observons 

une  forte  induction de  la mortalité cellulaire accompagnée d’une déstructuration  importante 

des  sphéroïdes.  De  ce  fait  nous  avons  analysé  l’influence  d’un  traitement  à  la  lovastatine 

pendant 24 ou 48 heures à 10µM sur la répartition des cellules exprimant le Fucci‐rouge ou le 

Fucci‐vert dans les zones prolifératives des sphéroïdes Capan‐2. Comme illustré en figure 28‐A, 

nous  observons  une  diminution  du  nombre  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert  et  une 

augmentation  du  nombre  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge.  Les  quantifications  de  ces 

résultats montrent, après 24 heures de traitement, une  légère augmentation du pourcentage 

de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge,  accompagné  d’une  tendance  à  la  diminution  du 

84 

 

pourcentage de  cellules exprimant  le Fucci‐vert  (figure 28‐B, gauche). En  revanche, après 48 

heures de  traitement, nous observons une  réduction d’environ 40% de  cellules exprimant  le 

Fucci‐vert dans les 40 premiers µm situés en périphérie, puis une diminution moins importante 

lorsque  l’on  s’éloigne  de  la  surface,  en  réponse  au  traitement  à  la  lovastatine  (figure  28‐B, 

droite). En ce qui concerne l’expression du marqueur Fucci‐rouge, nous observons la présence 

d’environ 60% de cellules exprimant le Fucci‐rouge  quelque soit la position des cellules dans les 

sphéroïdes non  traités, et une  augmentation du pourcentage de  cellules exprimant  le  Fucci‐

rouge après 48 heures de  traitement à  la  lovastatine,  sur  les 40µm  situés en périphérie des 

sphéroïdes. Ainsi bien que 15% de cellules exprimant le Fucci‐vert soient encore détectées à 48 

heures,  l’augmentation  du  taux  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  indique  que  la 

lovastatine  induit  un  arrêt  en  phase  G1  du  cycle  cellulaire  dans  les  couches  les  plus 

périphériques des sphéroïdes. 

 

3) Étude de l’arrêt au point de contrôle G2/M induit par l’étoposide 

 

Nous  avons  analysé  la  réponse  à  un  traitement  à  l’étoposide  sur  la  dynamique  de 

répartition des cellules d’un sphéroïde dans les différentes phases du cycle cellulaire. Pour cela, 

les sphéroïdes ont été traités avec de l’étoposide (1 ou 5µM) pendant 24 ou 48 heures. Comme 

précédemment nous  avons quantifié  le pourcentage de  cellules exprimant  le  Fucci‐rouge ou 

vert  en  fonction  de  la  distance  des  cellules  à  la  périphérie.  Un  traitement  avec  1  ou  5µM 

d’étoposide  induit un  ralentissement dose‐dépendant de  la  croissance des  sphéroïdes. Nous 

avons  pu  observer  une  très  forte  cytotoxicité  à  des  concentrations  plus  élevées.  Les 

micrographies de  sphéroïdes  traités pendant 48 heures avec 5µM d’étoposide montrent une 

diminution  des  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge,  concomitante  avec  une  augmentation  des 

cellules exprimant le Fucci vert (figure 29‐A). Comme illustré par les quantifications (figure 29‐

B),  un  traitement  de  24  heures  à  1  ou  5µM  d’étoposide  induit  une  légère  tendance  à  la 

diminution du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge, accompagnée d’une tendance 

à  l’augmentation du pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐vert  (figure 29‐B, gauche). En 

revanche  après 48 heures de  traitement  à 5µM, nous observons une diminution de 30% de 

cellules exprimant le Fucci‐rouge sur les 120µm situés en périphérie, où l’on passe de 60% de  

85 

 

 

0 40 80 120

0

10

20

30

40

50

60

70

T=24h T=48h

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

pos

itive

s

Distance à la surface (µm)

Fucc

i rou

ge /

DA

PI

Fucc

i ver

t / D

AP

I

Non traités Lovastatine 10µM

A B

10

0

20

30

40

50

60

70

0 40 80 120

0

10

20

30

0 40 80 120

0

10

20

30

0 40 80 120

Fucci-Rouge: Non traités 10µM Lovastatine

Non traités 10µM LovastatineFucci-Vert :

Figure 28 : Arrêt en G1 induit par la lovasta ne A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant les marqueurs Fuccis sont traités ou non avec de la lovasta ne à 10µM pendant 48 heures. Visualisa on des cellules exprimant le Fucci‐rouge (haut) ou le Fucci‐vert (bas) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2. Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Les sphéroides Capan‐2 exprimant les marqueurs Fuccis sont traités ou non avec de la lovasta ne à 10µM pendant 24 ou 48 heures. Quan fica on du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge ou le Fucci‐vert en fonc on de la distance à la surface des sphéroides. Pour chaque condi on, les données correspond à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 10‐30 sec ons issues de 2 ou 3 expériences indépendantes provenant de 5‐10 sphéroides différents.

86 

 

cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  dans  la  condition  non  traitée,  quelque  soit  la  position  des 

cellules  dans  la  coupe,  à  30%  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  après  le  traitement 

génotoxique (figure 29‐B, droite). En parallèle, on observe une augmentation d’un facteur 2 du 

pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert  sur  les  40  premiers  µm  en  périphérie,  en 

réponse à un traitement à l’étoposide à 5µM pendant 48 heures. Le traitement à 1µM n’induit 

qu’une  très  légère  augmentation  du  pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert.  Nous 

avons également réalisé des analyses par immunofluorescence en utilisant des anticorps dirigés 

contre la protéine H2AX, afin de détecter la présence de dommages à l’ADN, et confirmons la 

présence  de  nombreuses  cellules  présentant  des  foci  H2AX  sur  toute  l’épaisseur  des 

sphéroïdes (figure 29‐C),  indiquant que  l’étoposide a pénétré, même dans  les couches situées 

en profondeur. L’ensemble de ces résultats nous permet de montrer que les sphéroïdes Capan‐

2/Fucci  établissent  un  point  de  contrôle  G2/M  dans  les  couches  les  plus  périphériques,  en 

présence de dommages à l’ADN induit par un traitement à l’étoposide. 

  L’ensemble des  résultats décrits ci‐dessus montre que  le modèle de  sphéroïdes Capan‐

2/Fucci permet de visualiser dans un modèle multicellulaire, les modifications de la répartition 

des cellules au sein du cycle cellulaire. En effet grâce à ce modèle nous mettons en évidence 

l’activation  des  points  de  contrôle  du  cycle  cellulaire  en  réponse  des  traitements 

pharmacologiques ciblant différents mécanismes  impliqués dans  la progression des cellules au 

sein du cycle cellulaire, causant ou non des dommages à l’ADN. 

 

4) Analyse de l'activation des points de contrôle du cycle cellulaire induit 

par l'exposition à des radiations ionisantes en 3D 

 

L’analyse de l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire dans le modèle de sphéroïdes  

démontre de manière globale un arrêt des cellules au point de contrôle G2/M (Ferrante et al. 

2006; Gliemroth et al. 2003). A notre connaissance, aucune donnée bibliographique ne décrit 

aujourd’hui  un  arrêt  des  cellules  constituant  les  sphéroïdes  au  point  de  contrôle  G1/S.  La 

caractérisation de l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire en 3D après irradiations 

ont été réalisées par des techniques essentiellement basée sur la dissociation des sphéroïdes et 

qui ne permettent pas de prendre en compte les interactions cellulaires ainsi que la  

87 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0 40 80 120

0

10

20

30

40

50

60

0

10

20

30

40

50

60

0 40 80 120

0

10

20

30

40

50

0 40 80 1200

10

20

30

40

50

0 40 80 120

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Distance à la surface (µm)

T=24h T=48hFu

cci R

ouge

/ D

AP

IFu

cci V

ert /

DA

PI

Non traités Etoposide 5µM

A B

Fucci-Rouge : Non traités 1µM and

Non traitésFucci-Vert :

5µM Etoposide

1µM and 5µM Etoposide

Figure 29 : Arrêt en G2 induit par l’étoposide A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant les marqueurs Fuccis sont traités ou non avec de l’étoposide à 5µM pendant 48 heures. Visualisa on des cellules exprimant le Fucci‐rouge (haut) ou le Fucci‐vert (bas) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2. Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Les sphéroides Capan‐2 exprimant les marqueurs Fuccis sont traités ou non avec de l’étoposide à 1 ou 5µM pendant 24 ou 48 heures. Quan fica on du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge ou le Fucci‐vert en fonc on de la distance à la surface des sphéroides. Pour chaque condi on, les données correspond à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 10‐30 sec ons issues de 2 ou 3 expériences indépendantes provenant de 5‐10 sphéroides différents. C : Les sphéroides Capan‐2/Fucci sont traités ou non avec de l’étoposide à 5µM pendant 48 heures. Visualisa on des cellules ΥH2AX posi ves (rouge) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2. Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm.

γH

2AX

/ DA

PI

C

88 

 

régionalisation établie au cours de la croissance des sphéroïdes. Ces techniques ne permettent 

pas d’accéder  à  la dynamique du  cycle  cellulaire en 3D, et d’avoir une  vision  intégrée de  la 

réponse cellulaire mise en  jeu  lors de modifications de  la répartition des cellules dans  le cycle 

cellulaire comme l’activation des points de contrôle.  

Nous postulons que l’utilisation de sphéroïdes exprimant les marqueurs Fucci permet de 

s’affranchir de telles limitations et d’accéder à la dynamique de répartition des cellules dans le 

cycle  cellulaire.  Afin  d’étudier  l’impact  des  radiations  ionisantes  sur  la  dynamique  du  cycle 

cellulaire  dans  les  sphéroïdes  Capan‐2/Fucci  en  fonction  de  la  position  des  cellules  dans  le 

gradient  de  prolifération,  nous  avons  dans  un  premier  temps  réalisé  des  expositions  à  des 

doses croissantes de radiations ionisantes (rayonnements  à 5, 10, 15, 20 et 25Gy). Nous avons 

pu observer que des doses supérieures à 10Gy  induisent une forte cytotoxicité dès 24h après 

irradiation. Nous avons donc étudié les modifications de répartition dans le cycle cellulaire des 

cellules  après  exposition  à  des  doses  de  2,  5,  8  et  10  Gy,  dans  des  sphéroïdes  Capan‐2 

exprimant les marqueurs Fucci‐rouge ou Fucci‐vert, mesurant 450 à 500µm de diamètre, taille à 

laquelle nous avons montré que le gradient de prolifération commence à se mettre en place.  

  Nous avons mesuré de manière quotidienne le volume des sphéroïdes suite à l’exposition 

aux  différentes  doses  de  radiations  ionisantes.  Comme  le  montre  la  figure  30,  pour  les 

différentes  doses  d’irradiations,  nous  observons  un  ralentissement  de  la  croissance  des 

sphéroïdes Capan‐2 Fucci‐rouge ou vert dès 24h après exposition à une dose de 10Gy et 48h 

après exposition à des doses de 5 et 8Gy.   L'effet sur  la croissance n'est visible que 72h après 

exposition à la dose de 2Gy.  Au‐delà de 72 heures après une exposition à 5, 8 ou 10 Gy, nous 

n’avons  pas  pu  mesurer  la  taille  des  sphéroïdes,  du  fait  d’une  trop  forte  induction  de  la 

mortalité cellulaire, associée à une déstructuration massive des sphéroïdes. Ainsi nous n’avons 

pas analysé les modifications de la répartition des cellules dans les différentes phases du cycle 

cellulaire au‐delà de 72 heures post‐irradiation. Nous observons qu’après une  irradiation de 2 

Gy, la croissance des sphéroïdes est ralentie mais ne s’interrompt pas.  

  Au vu de  l’effet cytotoxique observé dès 3  jours après une  irradiation de 5, 8 ou 10 Gy, 

nous avons analysé  la mortalité cellulaire 10min, 3h, 24h et 48h après exposition à 5 et 10Gy 

(figure 31‐A). Nous avons quantifié par  immunofluorescence, sans tenir compte de  la position 

des  cellules au  sein des  sphéroïdes,  le pourcentage de  cellules PARP positives,  reflétant une 

activation des mécanismes de mort cellulaire par apoptose (figure 31‐B). Nous observons 10  

89 

 

 

0

0,5

1,5

2,5

1

2

3

0 2 4 6 8 10 12

NT

2GY

5GY

8GY

10GY

Aug

men

tatio

n de

vol

ume

(x)

Temps (jours)

NT

2GY

5GY

8GY

10GY

0 2 4 6 8 10 120

0,5

1,5

2,5

1

2

3

Figure 30 : Evolu on de la croissance des sphéroides Capan‐2 après une exposi on à des radia ons ionisantes A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci vert sont exposés ou non à différentes doses de radia ons ionisantes (2,5,8 et 10Gy). Le volume des sphéroides des différentes condi ons est mesuré quo diennement. NT : non traités. B : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci rouge sont exposés ou non à différentes doses de radia ons ionisantes (2,5,8 et 10Gy). Le volume des sphéroides des différentes condi ons est mesuré quo diennement. NT : non traités.

A

B

90 

 

minutes après le traitement, sur des coupes de sphéroïdes non traités mesurant 450 à 500µm 

de diamètre, la présence de quelques cellules PARP positives au centre des coupes, témoignant 

de l’établissement du gradient de mort cellulaire qui se met en place au cours de la croissance 

des sphéroïdes (figure 31). Dix minutes et 3 heures après exposition à une dose de 10 Gy, nous 

n’observons  pas  de  modifications  du  pourcentage  de  cellules  PARP  positives.  Vingt‐quatre 

heures  après  irradiations,  nous  observons  une  augmentation  du  nombre  de  cellules  PARP 

positives  sur  toute  l’épaisseur des sphéroïdes, passant de 5% dans  la condition non  traitée à 

10%  après  une  irradiation  de  10  Gy.  Cependant  nous  remarquons  qu’il  n’y  a  pas  de 

modifications du pourcentage de cellules PARP positives 24 heures après une irradiation à 5 Gy. 

Ces  résultats  montrent  que  24  heures  après  une  exposition  à  des  radiations  ionisantes, 

l’induction de la mortalité cellulaire est dose‐dépendante. Lorsque l’on se place 72 heures après 

une  irradiation de 5 ou 10 Gy, nous observons une augmentation du pourcentage de cellules 

PARP positives de 5 et 10% respectivement. L’induction de  la mortalité cellulaire à 72 heures 

est aussi dose‐dépendante. Nous remarquons que 72 heures après une irradiation de 10 Gy, la 

taille des sphéroïdes est diminuée, et l’induction de la mortalité cellulaire est massive au niveau 

du centre des sphéroïdes, mais nous notons également une augmentation de la mortalité dans 

les couches les plus périphériques (figure 31‐A). 

  D’autre part, nous avons mis en évidence  la présence de dommages à  l’ADN  sur  toute 

l’épaisseur des sphéroïdes, en réponse aux radiations ionisantes, par immunofluorescence avec 

un anticorps dirigé contre H2AX sur des coups de sphéroïdes Capan‐2/Fucci‐rouge et Capan‐

2/Fucci‐vert  (figure  32‐A). Nous  pouvons  remarquer  la  présence  de  quelques  cellules  H2AX 

positives  sur  toute  l’épaisseur  dans  les  sphéroïdes  contrôle,  démontrant  que  les  sphéroïdes 

Capan‐2  Fuccis  présentent  des  dommages  à  l’ADN,  en  absence  de  traitement,  témoignant 

d’une  certaine  instabilité  génomique.  Comme  en  témoigne  les micrographies  ainsi  que  les 

quantifications, 3 heures après exposition à une dose de 10 Gy, nous observons une induction 

massive du nombre de cellules H2AX positives, en comparaison de la condition contrôle. Nous 

avons quantifié comme précédemment le pourcentage de cellules H2AX positives en fonction 

de  la distance à  la périphérie des  sphéroïdes en  réponse aux  irradiations  (figure 32‐B). Nous 

observons  une  augmentation  de  l’ordre  de  1,2  à  1,5  du  pourcentage  de  cellules  H2AX 

positives, 10 minutes après une exposition à 5 ou 10 Gy, et ce quelle que soit  la position des 

cellules au sein des sphéroïdes. Trois heures après irradiation nous pouvons observer une  

91 

 

 T=10min

T=3h

T=24h

T=72h

0

5

10

15

20

0

5

10

15

20

0

5

10

15

20

0

5

10

15

20

Non traités

5 GY

10 GY

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Non traités 10 GY DAPI / PARP

A B

Figure 31 : Induc on de la mortalité cellulaire dans les sphéroides après une exposi on à des radia ons ionisantes A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci vert sont exposés ou non à une dose de 10GY. Visualisa on des cellules PARP posi ves (rouge) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2 à différents temps après irradia ons (10min, 3h, 24h, ou 72h) Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Quan fica on du pourcentage de cellules PARP posi ves sans tenir compte de la distance à la surface des sphéroides après une irradia on à 5 ou 10GY. Pour chaque condi on, les données correspondent à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 10‐20 sec ons issues de 2‐3 expériences indépendantes provenant de 5‐10 sphéroides différents.

92 

 

 T=10min

T=3h

T=24h

T=72h

5 GY

10 GY

0 40 80 1201

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,40 40 80 120

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,40 40 80 120

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

0 40 80 1201

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

Aug

men

tatio

n du

taux

de

cellu

les

posi

tives

par

rapp

ort a

u no

n tra

ité

Distance à la surface (µm)

A BNon traités 10 GY

DAPI / ΥH2AX

Figure 32 : Induc on de dommages à l’ADN dans les sphéroides Capan‐2 Fucci vert après une exposi on à des radia ons ionisantes A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci vert sont exposés ou non à une dose de 10GY. Visualisa on des cellules ΥH2AX posi ves (rouge) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2 à différents temps après irradia ons (10min, 3h, 24h, ou 72h) Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Quan fica on du pourcentage de cellules ΥH2AX posi ves en fonc on de la distance à la surface des sphéroides après une irradia on à 5 ou 10GY. Pour chaque condi on, les données correspond à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 20‐30 sec ons issues de 3 expériences indépendantes provenant de 5‐10 sphéroides différents.

93 

 

augmentation de 2 à 2,5 fois des dommages à l’ADN par rapport à la condition contrôle, et ce 

sur toute l’épaisseur des sphéroïdes. Vingt‐quatre heures après irradiation, nous observons une 

augmentation  du marquage  H2AX  positives  de  1,8  à  2  fois  par  rapport  à  la  condition  non 

traitée, sur toute l’épaisseur des sphéroïdes. Il est intéressant de noter que l’augmentation de 

l’induction  des  dommages  à  l’ADN  après  une  exposition  à  5  ou  10Gy  est  dépendante  de  la 

position  des  cellules.  En  effet,  plus  la  distance  à  la  surface  augmente,  plus  l’induction  de 

dommages à l’ADN est élevée, 3 ou 24 heures après irradiation. D’autre part, à 24 heures nous 

remarquons une diminution des dommages à l’ADN par rapport au temps 3 heures, suggérant 

que  des mécanismes  de  réparation  de  l'ADN  soient  actifs,  et  cette  diminution  est  encore 

amplifiée  à  72  heures.  L’ensemble  de  ces  données  nous  a  permis  d’établir  la  cinétique 

d’apparition  et  de  disparition  des  dommages  à  l’ADN  en  réponse  à  une  exposition  à  des 

radiations ionisantes. 

  Du fait de  la diminution de croissance des sphéroïdes Capan‐2 exprimant  les marqueurs 

Fucci‐rouge ou vert et de l’induction des dommages à l’ADN observée 3 jours après irradiations, 

nous avons analysé  les modifications de  la répartition des cellules dans  les différentes phases 

du  cycle  cellulaire,  pouvant  refléter  l’activation  des  différents  points  de  contrôles.  Comme 

précédemment, nous avons quantifié le pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge ou le 

Fucci‐vert, en  fonction de  la distance à  la périphérie,    jusqu’à 72 heures après exposition aux 

doses de 5 et 10 Gy. 

Comme  illustré  sur  les  images  et  par  les  quantifications  présentées  en  figure  33‐A  et  B 

respectivement, nous n’observons pas de modifications de la répartition des cellules exprimant 

le Fucci‐vert 10 minutes ou 3 heures après une irradiation de 5 ou 10Gy au sein des sphéroïdes. 

Nous  observons  entre  35  et  40%  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert  en  périphérie,  et  cette 

valeur  diminue  progressivement  pour  atteindre  environ  15  à  20%  des  cellules  à  120µm  de 

profondeur, et ce dans les conditions traitées et non traitées. Il n'y a donc pas de modification 

du gradient de  la répartition des cellules en phases S‐G2‐M. Les résultats obtenus à partir des 

quantifications démontrent une augmentation du pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐

vert se  trouvant en phases S‐G2 et M,  localisées en périphérie des sphéroïdes 24h après une 

irradiation de 5 ou 10 Gy, en comparaison de la condition non traitée. Ces résultats suggèrent 

une activation du point de contrôle G2/M dans les temps précoces en réponse à une exposition 

à des radiations ionisantes.  

94 

 

   

Non traités 10 GY DAPI / Fucci Vert

T=10min

T=3h

T=24h

T=72h

0

10

20

30

40

50

0 40 80 120

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

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Distance à la surface (µm)

Non traités

5 GY

10 GY

0

10

20

30

40

50

0 40 80 120

0

10

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0 40 80 120

0

10

20

30

40

50

0 40 80 120

A B

Figure 33 : Répar on des cellules en S‐G2‐ et M dans les sphéroides après une exposi on à des radia ons ionisantes A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci vert sont exposés ou non à une dose de 10GY. Visualisa on des cellules Fucci vertes sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2. à différents temps après irradia ons (10min, 3h, 24h, ou 72h) Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Quan fica on du pourcentage de cellules Fucci vertes posi ves en fonc on de la distance à la surface des sphéroides, après une irradia on à 5 ou 10GY. Pour chaque condi on, les données correspond à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 20‐30 sec ons issues de 3 expériences indépendantes provenant de 5‐10 sphéroides différents.

95 

 

 

Nous  avons  également  quantifié  la  répartition  des  cellules  en  phase G1  grâce  au marqueur 

Fucci‐rouge. Nous montrons sur des micrographies, ainsi que sur des quantifications, qu’il n’y a 

aucune modification de la répartition des cellules en phase G1 en réponse à une irradiation de 

10Gy, aux temps étudiés (10 minutes, 24 et 72 heures) (figure 34‐A, B). Nous montrons en effet 

la présence d’environ 55% de cellules exprimant le Fucci‐rouge en périphérie des sphéroïdes, et 

environ 50% à 120µm de profondeur dans la condition contrôle et irradiée.  

  Parallèlement, nous avons réalisé des  incorporations d’EdU durant  les dernières 24 heures 

précédent  chaque  temps d’analyse, afin de  corréler  l’arrêt de prolifération avec  la présence de 

dommages à l’ADN, et la répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire.  

Comme le montrent les micrographies ainsi que les quantifications du pourcentage de cellules EdU 

positives en  fonction de  la distance à  la surface présentées en  figure 35‐A et B  respectivement, 

nous  n’observons  pas  de modifications  de  la  répartition  des  cellules  prolifératives,  jusqu’à  24 

heures après une  irradiation de 10Gy. Cependant  lorsque  l’on  se place 3  jours post‐irradiations 

(10Gy),  nous  observons  une  diminution  de  20%  des  cellules  en  prolifération  quelque  soit  leur 

position  au  sein  des  sphéroïdes.  Nous  pouvons  également  remarquer  une  légère  tendance  à 

l’augmentation du pourcentage de cellules EdU positives 24 heures après  le traitement, reflétant 

sûrement une  incorporation d’EdU  liée à des mécanismes de réparation des dommages à  l'ADN, 

plutôt qu’à de la réplication de l’ADN. En effet, les courbes de croissance présentées en figure 30 

démontrent  déjà  une  diminution  de  la  croissance  des  sphéroïdes  à  24  heures,  présageant  un 

ralentissement de la progression du cycle cellulaire dès 24 heures aux fortes doses. 

 

  Une  exposition  à  des  radiations  ionisantes  à  5  ou  10Gy  stoppe  la  croissance  des 

sphéroïdes  au  bout  de  3  jours,  ce  qui  corrèle  avec  la  forte  diminution  de  la  prolifération 

cellulaire et l'augmentation de la mortalité cellulaire. Or nous n’observons pas de modifications 

de la répartition des cellules exprimant les rapporteurs Fucci‐rouge ou vert, alors même que les 

points de contrôle du cycle cellulaire sont activés, comme en témoigne  la phosphorylation du 

variant  d'histone  H2AX.  Nous  avons montré  précédemment  qu’un  arrêt  des  cellules  en  G1 

s’accompagne  d’une  augmentation  du  pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  et 

d’une diminution du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐vert. Inversement, nous avons 

montré qu'un arrêt G2/M se traduisait par une augmentation du pourcentage de cellules  

96 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

T=10min

T=24h

T=72h

0 40 80 120

0

10

20

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40

50

60

70

0 40 80 120

0

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0 40 80 120

0

10

20

30

40

50

60

70

Non traités

5 GY

10 GY

Non traités 10 GY DAPI / Fucci Rouge

A B

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Distance à la surface (µm)

Figure 34 : Répar on des cellules en G1 dans les sphéroides après une exposi on à des radia ons ionisantes A : Les sphéroides Capan-2 exprimant le marqueur Fucci rouge sont exposés ou non à une dose de 10GY. Visualisation des cellules Fucci rouge positives sur des coupes à congélation de sphéroides Capan-2 à différents temps après irradiations (10min, 3h, 24h, ou 72h) Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Quantification du pourcentage de cellules Fucci rouge positives en fonction de la distance à la surface des sphéroides après une irradiation à 5 ou 10GY. Pour chaque condition, les données correspond à la moyenne +/-SEM du pourcentage de cellules positives sur 20-30 sections issues de 3 expériences indépendantes provenant de 5-10 sphéroides différents.

97 

 

 

 

 

 

 

 

T=10min

T=3h

T=24h

T=72h

Non traités

10 GY

Pou

rcen

tage

de

cellu

les

posi

tives

Distance à la surface (µm)

0

10

20

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40

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0 40 80 120

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70

0

10

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0 40 80 120

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0

10

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40

50

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60

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0

10

20

30

40

50

0 40 80 120

60

70

Non traités 10 GY DAPI / EdU

A B

Figure 35 : Caractérisa on du gradient de proliféra on dans les sphéroides après une exposi on à des radia ons ionisantes A : Les sphéroides Capan‐2 exprimant le marqueur Fucci vert sont exposés ou non à une dose de 10GY, et sont soumis à une incorpora on d’EdU pendant les denières 24 heures. Visualisa on des cellules EdU posi ves (rouge) sur des coupes à congéla on de sphéroides Capan‐2 à différents temps après irradia ons (10min, 3h, 24h, ou 72h) Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 50µm. B : Quan fica on du pourcentage de cellules EdU posi ves en fonc on de la distance à la surface des sphéroides après une irradia on à 5 ou 10GY. Pour chaque condi on, les données correspond à la moyenne +/‐SEM du pourcentage de cellules posi ves sur 20‐30 sec ons issues de 3 expériences indépendantes provenant de 5‐10 sphéroides différents.

98 

 

 

exprimant  le rapporteur Fucci‐vert. L’ensemble de ces observations nous encourage à penser 

qu’une  exposition  à  des  radiations  ionisantes  à  5  ou  10 Gy  dans  les  sphéroïdes,  induit  une 

activation concomitante des points de contrôle des dommages à l’ADN en G1/S, G2/M, et peut‐

être  aussi  en  intra‐S  se  traduisant  par  une  absence  de modifications  de  la  répartition  des 

cellules en G1 ou S‐G2 et M. Cependant 24 heures après une exposition à des doses de 5 ou 10 

Gy de radiations ionisantes, nous observons une augmentation de 10% de cellules exprimant le 

Fucci‐vert sur  les 120µm situés en périphérie des sphéroïdes,  laissant penser qu’à 24 heures, 

l’activation du point de contrôle G2/M serait plus importante que l’activation des autres points 

de contrôle. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

99 

 

 

 

 

DISCUSSION ET 

PERSPECTIVES  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

100 

 

 

Les  travaux  réalisés  ont  permis  d’aboutir  à  une  description  précise  de  la  variation  de 

différents  paramètres  du  cycle  cellulaire  qui  accompagne  la mise  en  place  du  gradient  de 

prolifération  au  cours  de  la  croissance  de modèles  3D  de  sphéroïdes  de  cellules  tumorales 

pancréatiques.  Ils  montrent  également  le  potentiel  que  présente  l’utilisation  de  modèles 

génétiquement modifiés  pour  évaluer  l’effet  sur  le  cycle  cellulaire  en  3D  de molécules  anti‐

prolifératives.  

 

I. Les marqueurs  Fucci  pour  suivre  la  distribution  dans  le cycle cellulaire. 

A  l’heure actuelle,  il  reste difficile de  suivre  la progression d’une  cellule dans  le  cycle 

cellulaire dans un contexte multicellulaire,  tout en ayant accès à des aspects dynamiques. En 

effet  la plupart des  techniques utilisées pour connaître  la position d’une cellule dans  le cycle 

cellulaire  consiste  en  l’incorporation  d’analogue  de  la  thymidine,  ou  en  la  détection  de 

marqueurs  spécifiques  de  la  position  des  cellules  dans  cycle  cellulaire.  Ces  techniques 

nécessitent  une  étape  de  fixation,  et  ne  permettent  pas  d’accéder  à  dynamique  spatiale  et 

temporelle de la progression des cellules dans le cycle cellulaire.  

Afin de  repérer  la position dans  le  cycle  cellulaire des  cellules au  sein de modèles de 

sphéroïdes, nous avons utilisé les rapporteurs Fucci rouge et vert (Sakaue‐Sawano et al. 2008). 

La  technologie  Fucci  permet  de  réaliser  de  l’imagerie  in  vivo  sur  la  dynamique  spatiale  et 

temporelle du contrôle du cycle cellulaire grâce à  la brillance de  la  fluorescence, ainsi que  le 

fort contraste entre les deux fluorophores. De nombreux travaux montrent que les marqueurs 

Fucci  peuvent  être  utilisés  dans  des  systèmes multicellulaires  pour  suivre  la  progression  du 

cycle  cellulaire  et  les  mécanismes  de  contrôle  du  cycle  cellulaire  durant  des  événements 

morphogénétiques  tels  que  la  gastrulation  ou  encore  des  processus  d’invagination  ou 

d’involution avec une meilleure résolution (Sakaue‐Sawano et al. 2008a; Sakaue‐Sawano et al. 

2008b;  Sugiyama  et  al.  2009).  Différentes  études  démontrent  que  l’expression  de  ces 

rapporteurs corrèle avec des modifications de la répartition des cellules dans le cycle cellulaire 

en réponse à divers traitements. Il a par exemple été montré qu’un inhibiteur spécifique de la 

101 

 

famille des PI3K,  induit un arrêt en G1 et  inhibe  la croissance de cellules tumorales exprimant 

les marqueurs Fucci, greffées chez la souris (Dan et al. 2012). L’expression des rapporteurs Fucci 

a  permis,  par  microscopie  intravitale,  de  suivre  la  distribution  des  cellules  dans  le  cycle 

cellulaire  et  de montrer  un  arrêt  des  cellules  en  phase  G1,  visualisé  par  la  diminution  du 

nombre de cellules exprimant le Fucci vert, accompagné d’une augmentation de l’apparition de 

cellules exprimant le Fucci rouge. De plus, une autre étude a montré que le marqueur Fucci vert 

permet de visualiser un arrêt des cellules au point de contrôle G2/M induit par une irradiation 

(rayons X ou rayonnement γ), qui corrèle parfaitement avec la progression des cellules dans le 

cycle cellulaire  (Ishikawa et al. 2009). Cependant des études  récentes ont également montré 

que  l’expression de  ces marqueurs  fluorescents peut‐être dérégulée  lorsque  les  cellules  sont 

exposées à divers types de stress, et que la réponse observée dépend de la drogue utilisée, de 

la concentration en drogue, de la lignée cellulaire ou encore de la position des cellules dans le 

cycle au moment du traitement (Sakaue‐Sawano et al. 2011; Kaida et al. 2011) . Il a par exemple 

été montré qu’un traitement au nocodazole induit un arrêt des cellules en G2/M, associé avec 

l’apparition  de  cellules  ayant  un  contenu  4N  en ADN  exprimant  le  Fucci  rouge  (Kaida  et  al. 

2011). Ainsi certains traitements perturbant  la régulation normale du cycle cellulaire peuvent 

causer une dérégulation de la cinétique de fluorescence des marqueurs Fucci. Ces observations 

démontrent  l’importance de  la caractérisation de  l’expression de ces marqueurs  fluorescents 

lors  de  l’utilisation  de  drogues modifiant  la  dynamique  de  répartition  des  cellules  dans  les 

différentes phases du cycle cellulaire. Cependant dans notre modèle cellulaire Capan‐2‐Fucci, 

nous  n’avons  pas  observé  de  variations  de  l’expression  des  rapporteurs  Fucci  en  réponse  à 

l’exposition à différents traitments qui perturbent la dynamique de répartition des cellules dans 

les  différentes  phases  du  cycle  cellulaire.  Ces  résultats    suggèrent  que  dans  notre modèle 

cellulaire  Capan‐2,  l’expression  des  marqueurs  fluorescents  Fucci  reflète  réellement  la 

progression des  cellules dans  le  cycle  cellulaire en  réponse  à des divers  agents,  ce qui nous 

permet de visuliser l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire. 

 

 

 

102 

 

II. Caractérisation  de  la  mise  en  place  du  gradient  de prolifération,  et  de  dynamique  du  cycle  cellulaire associée,  au  cours  de  la  croissance  de  sphéroïdes Capan‐2/Fucci. 

Dans  les modèles Capan‐2/Fucci, nous détectons environ 60% de cellules en prolifération 

dans  les  couches  les  plus  superficielles,  les  cellules  en  prolifération  active  étant  détectées 

jusqu’à 150µm de profondeur. Ce pourcentage diminue en profondeur pour atteindre moins de 

5%  à  250µm  de  profondeur.  Nos  résultats  sont  en  accord  avec  les  travaux  pionniers  de 

Sutherland  et  collaborateurs  sur  des  modèles  de  sphéroïdes  d’adénocarcinomes  coliques 

(Sutherland 1988). Ces  travaux montraient que  la pression partielle en oxygène est d’environ 

140mm de mercure dans  les  zones périphériques des  sphéroïdes. Cette PO2 chute  fortement 

sur  les  150  premiers µm  en  périphérie  pour  atteindre  des  valeurs  avoisinants  les  50mm  de 

mercure. Au‐delà de 200µm de distance à  la surface,  la PO2 présente des valeurs très basses, 

voir  quasi  nulles. Ces  travaux montraient  également  que  ces  distances  varient  selon  le  type 

cellulaire,  la taille des sphéroïdes et  l’état de compaction des cellules. Dans notre étude, nous 

détectons sur nos modèles de sphéroïdes Capan‐2/Fucci la présence de zones hypoxiques par la 

révélation  du  pimonidazole,  uniquement  dans  les  couches  les  plus  centrales  des  sphéroïdes 

mesurant 600µm de diamètre. Cependant ce type de détection est  indicatif de  l’hypoxie mais 

ne  présage  en  rien  des  valeurs  de  pression  en  oxygène  au  sein  de  nos modèles  de  culture 

tridimensionnelle.  

L’utilisation  des  sphéroïdes  Capan‐2/Fucci  nous  a  permis  de  révéler  des  différences  de 

répartition  des  cellules  en  phase  G1  versus  S/G2  et mitose  en  fonction  de  la  taille  et  par 

conséquent  de  l’existence  d’un  gradient  d’hypoxie.  Ainsi,  au  sein  de  sphéroïdes  non 

régionalisés, mesurant  300µm  de  diamètre,  nous  observons  une  répartition  homogène  des 

cellules exprimant le Fucci rouge, avec environ 50% de cellules exprimant le Fucci‐rouge quelle 

que soit la distance à la surface des cellules, tandis que la répartition des cellules exprimant le 

Fucci‐vert est différente, et  se présente  sous  la  forme d’un  léger gradient allant des couches 

périphériques  vers  les  couches  les  plus  centrales.  Lorsque  nous  analysons  la  répartition  des 

cellules au sein de sphéroïdes régionalisés, nous observons  la mise en place d’un gradient de 

cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  ou  Fucci‐vert  décroissant  des  couches  périphériques 

103 

 

prolifératives vers les couches situées plus en profondeur. L’expression du Fucci vert disparait à 

partir  de  150µm  de  distance  à  la  périphérie,  alors  qu’environ  10%  de  cellules  exprimant  le 

Fucci‐rouge sont toujours détectés à 250µm de profondeur. Bien que des travaux récents aient 

montré une variation de  la  fluorescence des protéines mAG et mKO2 en situation hypoxique 

(Kaida and Miura 2012b, 2012a) la persistance de cellules exprimant le rapporteur Fucci‐rouge 

suggère que les variations de pourcentages observées ne soient pas la conséquence d’un effet 

de  l’environnement  sur  l’émission  de  fluorescence  de  la  mKO2.  Ceci  nécessiterait  d'être 

complètement  validé en  analysant  la  stabilité de  la mKO2 en  fusion  avec une protéine dont 

l’expression n’est pas modifiée en fonction de la profondeur au sein des sphéroïdes. 

Ainsi, les résultats obtenus sont en accord avec l’hypothèse selon laquelle, en fonction de la 

distance  à  la  périphérie,  les  cellules,  en  réponse  à  l’appauvrissement  en  oxygène  et  en 

nutriments  de  leur microenvironnement,  ne  peuvent  plus  passer  le  point  de  restriction  et 

s’engager dans  le cycle cellulaire, conduisant à un allongement de  la durée de  la phase G1 et 

une augmentation de la durée du cycle cellulaire. Il a été montré que l’expression de différents 

acteurs clés  tels que  la cycline D1,  les protéines  inhibitrices des Cdk, p21 et p27, ainsi que  la 

phosphatase Cdc25A (Yuan et al. 2004; Goda et al. 2003; Hammer et al. 2007) est modifiée en 

réponse  à  l’hypoxie,  conduisant  à  un  arrêt  en  phase  G1.  De  manière  intéressante  une 

expression  différentielle  des  inhibiteurs  de  Cdk  fut  démontré  entre  des modèles  de  culture 

cellulaire  en monocouche  ou  en  3D  de  fibroblastes  de  rats  (LaRue  et  al.  1998).  Ces mêmes 

auteurs  démontrent  que  l’expression  de  p18,  p21  et  p27  augmente  en  fonction  de  la 

proportion  de  cellules  quiescentes  dans  des  modèles  de  sphéroïdes  de  mélanomes  et  de 

carcinomes mammaires,  l’expression de p18 et p27 étant corrélée avec  l’arrêt de croissance, 

alors que  l’expression de p21 est prédominante dans  les  couches prolifératives  (LaRue et al. 

2004).  Nous  pourrions  également  vérifier  l’expression  des  différents  CKI  en  réalisant  des 

immunomarquages sur coupes de sphéroïdes. 

Par ailleurs, nous avons montré dans  les expériences d’incorporation d’EdU, que même après 

24h  à  48h,  une  fraction  des  cellules  situées  dans  les  couches  les  plus  externes  n’était  pas 

marquée, suggérant que des cellules localisées dans les mêmes régions des gradients semblent 

avoir  des  durées  de  cycle  cellulaire  différentes  et  parfois même  relativement  longues.  Ces 

données suggèrent que l’entrée en quiescence des cellules se produit de façon progressive sur 

104 

 

les  150µm  les  plus  périphériques  des  sphéroïdes.  Les  travaux  de  LaRue  et  collaborateurs 

montrent une expression différentielle des CKI dans différents modèles de sphéroïdes avec une 

expression  prédominante  de  p21  dans  les  couches  périphériques  en  prolifération.  Nous 

pourrions  vérifier  cette  hypothèse  en  réalisant  des  immunomarquages  dirigés  contre  les 

différents CKI. L’hétérogénéité de  la durée du cycle cellulaire dans  les couches périphériques 

des sphéroïdes peut également résulter de la présence de cellules souches cancéreuses. Afin de 

vérifier cette hypothèse nous pourrions réaliser des immunomarquages contre des marqueurs 

spécifiques de ce type cellulaire. Cette hétérogénéité pourrait provenir de l’entrée progressive 

de certaines cellules périphériques dans un statut différencié.  Il a par exemple été démontré 

l’apparition  de  structures  pseudo‐glandulaires  différenciées  dans  les  couches  périphériques 

prolifératives  de  sphéroïdes  issus  d’adénocarcinomes  coliques  (Sutherland  1988).  Enfin  la 

présence d’une hétérogénéité de  la durée du cycle cellulaire dans  les zones périphériques est 

une question importante, mais difficile à aborder expérimentalement, qui pourrait être étudiée 

par une approche de modélisation mathématique utilisant les données que nous avons obtenu 

et prenant en  compte des paramètres physico‐chimiques  tels que  ceux  issus des  travaux de 

Sutherland. Il serait peut être ainsi possible de mieux appréhender les modalités qui conduisent 

à la régionalisation progressive des structures 3D.    

 

III. L’absence  d’EGF  induit  l’entrée  en  quiescence  des sphéroïdes Capan‐2/Fucci. 

  Les  travaux  réalisés  dans  l’équipe  avaient  mis  en  évidence  que  la  croissance  des 

sphéroïdes Capan‐2 était dépendante de la présence en EGF dans le milieu de culture (Dufau et 

al. 2011). Les résultats obtenus montrent une absence totale de cellules en prolifération active 

4 à 5  jours après élimination de  l’EGF du milieu de culture, suggérant que  les sphéroïdes sont 

alors  dans  un  état  quiescent.  L’analyse  de  l’expression  des  rapporteurs  Fucci  montre  une 

augmentation du pourcentage de cellules exprimant  le Fucci‐rouge 3  jours après  la privation, 

suivi d’une diminution du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐rouge ou le Fucci‐vert. Ces 

résultats suggèrent que  l’arrêt de croissance des sphéroïdes en  réponse à  l’absence d’EGF se 

caractérise par un arrêt en phase G1 prolongé suivi de l’entrée en phase G0 de quiescence des 

105 

 

cellules. Ce résultat est cohérent avec les observations de Xouri et collaborateurs montrant une 

diminution de l’expression de Cdt1 et de la geminine, les protéines constituant le Fucci rouge et 

vert respectivement, lors de la privation de cellules en sérum (Xouri et al. 2004). Cependant, de 

façon  surprenante,  nous  observons  également  la  persistance  d’un  faible  pourcentage  de 

cellules exprimant le Fucci‐vert 6 jours après la suppression de l’EGF. Il a été rapportée dans la 

littérature que  la signalisation du récepteur à  l’EGF pouvait également être  impliquée dans  le 

contrôle de  la  transition G2/M. En effet  il a été proposé que  la signalisation de ce  récepteur 

puisse  jouer  un  rôle  dans  l’arrêt  des  cellules  au  point  de  contrôle  G2/M  dans  un modèle 

cellulaire sur‐exprimant ce  récepteur  (Walker et al. 2007). Ainsi, nos  résultats suggèrent, que 

lorsqu’elles  sont  cultivées  en  3D  sous  forme  de  sphéroïdes,  les  cellules  Capan‐2  présentent 

également une dépendance vis‐à‐vis de l’EGF qui conduit à un arrêt du cycle cellulaire en phase 

G2. Une  surexpression de  l’EGF et de  ses  récepteurs a  fréquemment été  retrouvée dans des 

cancers pancréatiques (Yamanaka et al. 1993; Ueda et al. 2004). Du fait de la nécessité de l’EGF 

pour  la  croissance  des  sphéroïdes  Capan‐2,  le modèle  de  culture  tridimensionnelle  pourrait 

particulièrement  être  intéressant  pour  l’évaluation  thérapeutique  de  molécules  anti‐

cancéreuses  visant  à  inhiber  cette  voie  de  signalisation  dans  un  contexte  plus  proche  de  la 

réalité physiologique retrouvée  in vivo dans  les tumeurs. D’autre part du  fait de  la capacité à 

maintenir les sphéroïdes Capan‐2 dans un état de quiescence lors de la suppression de l’EGF, ce 

modèle de culture tridimensionnelle pourrait également présenter un  intérêt pour  le criblage 

de molécules anti‐tumorales visant à cibler  les cellules quiescentes. Enfin, ce modèle pourrait 

également permettre d’analyser  la dynamique spatio‐temporelle de reprise du cycle cellulaire 

des cellules sorties du cycle cellulaire en phase G0 de quiescence ou arrêtées dans  les phases 

G1 ou G2, lors de la ré‐administration de l’EGF. 

 

 

 

  

106 

 

IV. Les  sphéroïdes  Capan‐2/Fucci,  modèles  pour l’évaluation de molécules à activité anti‐prolifératives 

Nous  avons  réalisé  des  expériences  visant  à  démontrer  qu’il  était  pertinent  d’utiliser  le 

modèle de sphéroïdes Capan‐2/Fucci pour explorer  la réponse en 3D à différents traitements 

pharmacologiques  induisant  une  activation  des  points  de  contrôle  du  cycle  cellulaire.    Les 

traitements  choisis  pour  cette  étude,  Lovastatine  et  Etoposide  sont  représentatifs  de 

mécanismes différents conduisant à des arrêts selon des modalités spécifiques. 

La lovastatine est décrite, à partir d’expériences réalisées sur des modèles en monocouche, 

pour  induire  un  arrêt massif  des  cellules  en  phase G1  du  cycle  cellulaire  (Javanmoghadam‐

Kamrani  and  Keyomarsi  2008).  Nous  avons  obtenu  une  réponse  similaire  avec  les  cellules 

Capan‐2/Fucci  cultivées  en  monocouche.  Le  traitement  des  sphéroïdes  avec  la  lovastatine 

induit un  ralentissement de  la  croissance des  sphéroïdes, de manière dose‐dépendante avec 

une  IC50  de  l’ordre  de  5µM.  Lorsque  les  sphéroïdes  sont  traités  à  des  concentrations  plus 

élevées,  au‐delà  de  20µM,  nous  observons  une  forte  induction  de  la  mortalité  cellulaire 

accompagnée d’une déstructuration  importante des sphéroïdes. En réponse à un traitement à 

une  concentration  de  10µM  pendant  24  heures,  nous  observons  une  augmentation  du 

pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge,  qui  ne  s’accompagne  pas  de  variation  du 

pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert.  En  revanche  après  48  heures,  nous 

remarquons  une  augmentation  de  10%  des  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  sur  80µm 

d’épaisseur en périphérie des sphéroïdes, associé à une diminution équivalente du pourcentage 

de cellules exprimant le Fucci‐vert. Ces résultats suggèrent que la lovastatine induit un arrêt en 

phase  G1  du  cycle  cellulaire  dans  les  couches  les  plus  externes  des  sphéroïdes.  Au  vu  des 

résultats décrits par JavanMoghadam‐Kamrani et collaborateurs, un  impact plus  important du 

traitement à  la  lovastatine sur  la  répartition des cellules au sein du cycle cellulaire aurait été 

attendu. Deux hypothèses pourraient expliquer ces résultats. La première hypothèse est que la 

concentration nécessaire pour  induire un arrêt en G1 au sein des sphéroïdes est supérieure à 

celle  nécessaire  sur  des  cellules  en  2D.  La  deuxième  hypothèse,  qui  est  liée  à  la  première, 

repose sur une éventuelle limite de pénétration de la lovastatine dans les couches cellulaires les 

plus  profondes  des  sphéroïdes.  Ce  paramètre,  comme  nous  l’avons  vu  dans  l’introduction, 

107 

 

étant un des aspects de  la résistance multicellulaire,  il est essentiel de pouvoir  le prendre en 

compte dans l’étude de la réponse en pharmacologie cellulaire.  

Nous  avons  ensuite  testé  l’impact  d’agents  génotoxiques  sur  la  dynamique  du  cycle 

cellulaire dans  les sphéroïdes Capan‐2/Fucci. Pour cela nous avons traités des sphéroïdes avec 

de  l’étoposide  (1 ou 5µM pendant 24 ou 48 heures). Nous montrons qu’un  traitement de 24 

heures  à  5µM  induit  une  légère  diminution  du  pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐

rouge,  et  une  légère  augmentation  du  pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert. 

Cependant  lorsque  l’on  traite  les  sphéroïdes pendant 48 heures à 5µM, nous observons une 

diminution  de  30%  des  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  dans  les  zones  périphériques, 

accompagnée  d’une  augmentation  de  15  à  20%  des  cellules  exprimant  le  Fucci‐vert.  Ces 

résultats  suggèrent que  les  sphéroïdes Capan‐2/Fucci établissent un point de  contrôle G2/M 

dans les couches les plus périphériques.  

La protéine Cdt1 est un composant majeur du complexe de pré‐réplication. Elle permet  le 

recrutement des protéines MCM (Mini Chromosomes Maintenance) au niveau des origines de 

réplication.  Différents  travaux  démontrent  que  la  protéine  Cdt1  est  dégradée  lors  d’une 

exposition  à  des  agents  génotoxiques  chimiques  ou  physiques  (Stathopoulou  et  al.  2012; 

Roukos  et  al.  2011),  par  un  mécanisme  dépendant  du  PCNA.  Cette  dégradation  semble 

impliquée  dans  la  préservation  de  l’intégrité  génomique  et  empêche  tout  phénomène  de 

réplication en présence d’ADN endommagé. Le domaine responsable de la dégradation de Cdt1 

en présence de dommages à  l’ADN est  localisé dans  la partie N‐terminale de Cdt1, région qui 

est  tronquée  dans  le  rapporteur  Fucci‐rouge  (Nishitani  et  al.  2006),  suggérant  que  le  Fucci‐

rouge pourrait ne pas être dégradé en réponse à l’exposition à des agents génotoxiques tel que 

l’étoposide. Or nos résultats montrent une augmentation du pourcentage de cellules exprimant 

le Fucci‐vert après un traitement à  l’étoposide associé à une forte diminution du pourcentage 

de  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge.  Les  travaux  sur  les  mécanismes  impliqués  dans  la 

dégradation de  la protéine Cdt1 en réponse à  l’exposition à des agents génotoxiques ont été 

réalisés  sur  des  modèles  cellulaires  en  2D.  Il  est  donc  possible  que  l’organisation 

tridimensionnelle modifie les mécanismes mis en jeu dans la dégradation de Cdt1 en présence 

de dommages à l’ADN. Certains auteurs montrent que les cellules se trouvant dans les couches 

prolifératives  des  sphéroïdes  sont  beaucoup  plus  résistantes  à  l’étoposide  que  les  mêmes 

108 

 

cellules  cultivées  en  2D,  et  présentent  une  induction  de  dommages  à  l’ADN  plus  faible,  qui 

corrèle  avec  le  taux  de  survie  cellulaire  (Olive  et  al.  1993; Oloumi  et  al.  2000).  Ces  auteurs 

démontrent que  la résistance à  l’étoposide est dûe à une relocalisation de  la topoisomérase II 

au  niveau  cytoplasmique  dans  les  cellules  prolifératives  des  sphéroïdes.  Nous  avons  vérifié 

l’induction  de  dommages  à  l’ADN  sur  toute  l’épaisseur  des  sphéroïdes  par  une 

immunodétection dirigée contre la forme phosphorylée du variant d’histone H2AX, sans qu’une 

régionalisation de ce marquage ne soit visible sur  le modèle de sphéroïdes Capan‐2. Dans ce 

contexte,  il  serait donc  intéressant d’examiner  l‘induction de dommages à  l’ADN à différents 

temps et en  fonction de  la position des cellules dans des sphéroïdes Capan‐2  régionalisés, et 

d’établir ainsi une corrélation avec la survie cellulaire. Dans ces conditions, les marqueurs Fucci 

pourraient  nous  permettre  d’explorer  si  la  résistance  à  l’étoposide  est  corrélée  à  des 

paramètres particuliers du cycle cellulaire. 

 

V. Analyse de la réponse aux radiations ionisantes. 

Nous  avons  utilisé  les  sphéroïdes  Capan‐2/Fucci  pour  étudier  l’impact  des  radiations 

ionisantes en 3D. Nos résultats montrent une  induction massive du marquage H2AX dans  les 

sphéroïdes  dans  les  premières  heures  après  une  irradiation  de  5  ou  10Gy,  suggérant  une 

activation des points de contrôle en réponse à l'induction de dommages à l’ADN. Le marquage 

H2AX  diminue  au‐delà  de  24  heures  après  l’irradiation,  témoignant  de  l’activation  des 

mécanismes de réparation des  lésions. L’hypoxie favorise  l’instabilité génétique via l’inhibition 

des  mécanismes  de  réparation  des  mésappariements  ou  de  la  recombinaison  homologue 

(Bindra and Glazer 2007; Bindra et al. 2004). Il a récemment été montré que, 24 heures après 

une  irradiation de 10Gy, des cellules en condition d'hypoxie présentent plus de dommages à 

l’ADN que  les mêmes cellules cultivées en condition normoxique (Kumareswaran et al. 2012). 

Dans nos expériences,  les analyses réalisées ne nous permettent pas de conclure quant à une 

éventuelle régionalisation du marquage H2AX en relation avec  le gradient d'oxygène au sein 

des sphéroïdes.  

La  présence  de  dommages  à  l’ADN  corrèle  avec  l‘augmentation  de  la  mort  cellulaire, 

détectée  par  le  marquage  PARP,  24  et  72  heures  après  une  irradiation  de  10Gy.  Nous 

109 

 

remarquons également une très légère augmentation du pourcentage de cellules EdU positives, 

reflétant probablement une activation des mécanismes de réparation des dommages à l’ADN à 

24  heures.  Parallèlement,  nous  observons  une  augmentation  du  pourcentage  de  cellules 

exprimant  le  Fucci‐vert dans  les  couches périphériques des  sphéroïdes, 24 heures après une 

irradiation  de  10Gy,  indiquant  une  activation  du  point  de  contrôle G2/M.  Cependant,  nous 

n'observons  pas  parallèlement  de  variation  du  pourcentage  de  cellules  exprimant  le  Fucci‐

rouge.  Ceci  pourrait  s’expliquer  par  l’activation  concomitante  d’un  point  de  contrôle  à  la 

transition G1/S ou au cours de la phase S. Par ailleurs, la protéine Cdt1 tronquée pourrait être 

recrutée de manière très rapide au niveau des sites de cassures de l’ADN après irradiation, où 

elle ne pourrait pas être déradée de façon PCNA dépendante, comme expliqué précédemment 

(Roukos et al. 2011). 72 heures après l’irradiation, l’incorporation d’EdU révèle la présence d’un 

faible pourcentage de cellules prolifératives, ce qui corrèle avec  la diminution du volume des 

sphéroïdes  observée.  Nous  remarquons  également  une  absence  de  modifications  de  la 

répartition  des  cellules  exprimant  le  Fucci‐rouge  ou  le  Fucci‐vert  à  72  heures.  Ces  résultats 

semblent  indiquer une  activation des points de  contrôle G1/S,  intra‐S et G2/M, qui pourrait 

expliquer  l’absence de variation des marqueurs Fucci, et  la faible  incorporation d’EdU,  induits 

par l’arrêt des cellules dans le cycle. 

   L’ensemble de  ces  résultats  suggère une  activation préférentielle du point de  contrôle 

G2/M 24 heures après exposition à des  radiations  ionisantes et une activation des différents 

points de contrôle G1/S,  intra‐S et G2/M, 72 heures après une exposition à 10Gy. Différentes 

doses ont été testées dans les expériences réalisées et aucune différence nette d’activation des 

points  de  contrôle  en  fonction  de  la  dose  n’a  pu  être  mise  ne  évidence.  Afin  de  valider 

l’activation différentielle des points de contrôle du cycle cellulaire au cours de cette cinétique, 

une  première  étape  serait  d’analyser  par  immunofluorescence  sur  coupes  de  sphéroïdes  la 

phosphorylation  et  la  localisation  des  protéines  ATM,  ATR,  Chk1,  Chk2  ou  p53.  De  plus,  ce 

modèle  pourrait  permettre  d’évaluer  l’activité  et  les  effets  de  la  combinaison  de molécules 

modulant  l’activation du point de  contrôle G2/M et des  radiations  ionisantes. De même,  les 

mécanismes  impliqués  pourraient  être  étudiés  par  des  stratégies  de  perte  de  fonction  des 

acteurs des voies de signalisation des points de contrôle. 

  Les données de la littérature, obtenues dans des expériences reposant sur la dissociation 

des  sphéroïdes,  décrivent  préférentiellement  une  activation  du  point  de  contrôle  G2/M  48 

110 

 

heures  après  une  exposition  à  des  radiations  ionisantes  de  10  ou  15  Gy  respectivement 

(Ferrante et al. 2006; Gliemroth et al. 2003). Cependant nous ne pouvons pas exclure qu’il y ait 

une  activation  du  point  de  contrôle  intra‐S,  qui  se  traduirait  de  la même manière  par  une 

augmentation du pourcentage de cellules exprimant le Fucci‐vert. 

   

 

En conclusion, nos travaux ont permis de caractériser précisément la mise en place du gradient 

de prolifération au cours de la croissance des sphéroïdes Capan‐2, et de corréler ce gradient de 

prolifération avec  la répartition des cellules dans  les différentes phases du cycle cellulaire. De 

plus l’utilisation des sphéroïdes Capan‐2/Fucci nous a permis d’avoir une vision plus intégrée du 

contrôle  de  la  dynamique  du  cycle  cellulaire  en  3D.  Nous  montrons  que  les  sphéroïdes 

exprimant  les  marqueurs  fluorescents  Fucci  sont  des  modèles  de  choix  pour  visualiser 

l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire en réponse à divers traitements tels que la 

suppression de facteurs de croissance, l’exposition à des drogues ou à des radiations ionisantes. 

La généralisation de  l’expression de ces rapporteurs dans d’autres modèles tumoraux cultivés 

en 3D, permettrait d’obtenir une réponse plus intégrée concernant les mécanismes d’activation 

des  points  de  contrôle  du  cycle  cellulaire.  L’utilisation  de  ce  modèle  de  culture 

tridimensionnelle  permettrait  la  réalisation  de  criblage  de  molécules  anti‐cancéreuses  qui 

ciblent  les mécanismes  de  régulation  du  cycle  cellulaire,  ou  les  points  de  contrôle  du  cycle 

cellulaire, et pourrait ainsi potentiellement participer à l’amélioration du ciblage thérapeutique 

des tumeurs. 

 

 

 

 

 

 

111 

 

MATERIELS ET 

METHODES 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

112 

 

I. Culture cellulaire : 

a) Culture des cellules : 

  Les cellules Capan‐2 (adénocarcinome pancréatique) sont cultivées dans du milieu DMEM 

(Dubelco’s Modified  Eagle’s Medium)  contenant  4.5  g/L  de  glucose,  2mM  de  glutamine,  et 

complémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF), 100U/ml de pénicilline et 100µg/ml de 

streptomycine.  Les  cellules  Capan‐2  exprimant  les  rapporteurs  Fucci  ont  été  obtenues  par 

transduction  lentivirales  (Dufau  et  al.  2011)  et  sont maintenues  ne  culture  dans  les mêmes 

conditions. 

b) Obtention des sphéroïdes : 

  Les  sphéroïdes  sont  produits  dans  des  plaques    96  puits  à  fond  rond  préalablement 

coatées avec du polyHema (Sigma) à 20mg/ml afin d’empêcher l’adhésion des cellules, par une 

méthode par centrifugation. Dans chaque puits, 100µl d'une suspension de cellules Capan‐2 à 

10 000 cellules/ml de milieu défini DMEM‐F12 contenant 20ng/ml d'EGF (Invitrogen) et du B27  

(Invitrogen), sont déposés. Les plaques sont alors centrifugées 6 minutes à 200g à température 

ambiante. Cette technique permet  l'obtention d'un seul sphéroïde par puits et  la variation de 

taille entre les différents sphéroïdes est inférieure à 10%.  

c) Quantification du volume des sphéroïdes 

Le volume de chaque sphéroïde est déterminé en mesurant 2 diamètres orthogonaux (d1 et d2) 

à  l’aide d’un microscope  inversé équipé un oculaire réticulé gradué. Le volume est calculé en 

appliquant la formule: V = 4/3πr3 ou r = 1/2√d1x d2. 

 

II. Expositions des sphéroïdes aux radiations ionisantes 

Des plaques contenant des sphéroïdes de 300 µm ou 500 µm de diamètre sont déposées dans 

un cylindre métallique situé dans  l’enceinte d’un  irradiateur biologique Biobeam 8000 équipé 

d'une  source  de  Césium  Cs137  dont  la  dose  de  délivrance  est  de  3.8Gy/min  (Plateforme 

Anexplo  d’Exploration  Non‐Invasive  de  l’hôpital  Rangueil  à  Toulouse).  Une  fois  l’enceinte 

fermée,  le cylindre contenant  les échantillons tourne sur  lui‐même et est exposé directement 

113 

 

aux  rayonnements  ,  permettant  ainsi  une  irradiation  totalement  homogène  de  nos 

échantillons. Les sphéroïdes sont irradiés avec différentes doses (5 et 10 Gy), puis récupérés et 

fixés 10minutes/3h/24h et 72h après l’irradiation. 

 

III. Traitements par différentes drogues pour mesurer l’arrêt des cellules dans le cycle 

cellulaire 

Pour  réaliser  les  traitements  sur  cellules  en monocouche,  200.000  à  400.000  cellules  sont 

ensemencées  sur  des  lamelles  de  verre  dans  des  boîtes  de  35mm  de  diamètres.  24  heures 

après, les cellules sont traitées aux concentrations et au temps indiqués. Les molécules utilisées 

sont la lovastatine (Sigma), et l'étoposide (Sigma). Pour le traitement à l'étoposide, les cellules 

sont  traitées 1h à 40µM puis cultivées 18h en absence d'étoposide. Les cellules  sont ensuite 

fixées et analysées en cytométrie de flux ou en immunofluorescence. 

Pour  l'étude  en  3D,  des  sphéroïdes mesurant  450µm  de  diamètre  sont  traités  pendant  24 

heures ou 48 heures en présence de  lovastatine à 5 ou 10 µM ou pendant 24 heures ou 48 

heures en présence d’étoposide  (Sigma) à 1 ou 5 µM. Les sphéroïdes sont ensuite récupérés, 

lavés, fixés, coupés puis analysés en microscopie à fluorescence.  

 

IV. Mise en quiescence de sphéroïdes 

Les sphéroïdes Capan‐2 sont maintenus en culture dans du milieu défini. Au bout de 7 à 8 jours 

de croissance, les sphéroïdes sont lavés quatre fois pendant 30 minutes à 37°C  dans du DMEM 

F‐12 complémenté avec 10% de SVF, afin d’éliminer  toutes  traces d’EGF. Les sphéroïdes sont 

ensuite maintenus  en  culture  pendant  plusieurs  jours  en DMEM  F‐12  10%  SVF.  La mise  en 

quiescence  est  validée  par  l'arrêt  de  croissance  des  sphéroïdes  évaluée  par  la mesure  de 

l'évolution du volume. 

 

 

114 

 

V. Immunofluorescence 

a) Sur cellules en monocouches 

Les cellules cultivées  sur des  lamelles de verre préalablement coatées avec de  la polylysine 

sont lavées 2X 10 min à température ambiante par une solution de PBS avant fixation 10 min 

à  température ambiante avec de  la  formaline  (équivalent à 3,7%  formaldéhyde, Sigma). Les 

cellules  sont  ensuite  perméabilisées  pendant  5  min  à  température  ambiante  dans  une 

solution de PBS/0,25% de  triton X‐100 puis  incubées 45 min à  température ambiante dans 

une solution de PBS/1% BSA/0.1% triton X‐100. Les  lamelles sont ensuite  incubées 1h à 37°C 

ou  o/n  à  4°C  en  présence  de  l'anticorps  primaire  dilué  dans  une  solution  de 

PBS/0,1%BSA/0,1% triton. Après deux  lavages de 5 min,  les  lamelles sont mises en présence 

de  l’anticorps  secondaire  pendant  1h  à  37°C  à  l’obscurité.  Les  noyaux  sont marqués  par 

incubation des  lamelles dans une solution de DAPI  (0,1µg/ml) pendant 10 min à  l’obscurité. 

Enfin  les  lamelles sont  rincées puis séchées et montées sur des  lames de verres grâce à un 

milieu de montage (Dako Fluorescent Mounting Medium‐ Dako Cytomation). Les cellules sont 

ensuite  observées  à  l’aide  d’un  microscope  à  fluorescence  droit  (DM5000  Leica)  et 

l’acquisition des  images est réalisée avec une caméra CCD CoolSnapEZ   pilotée par  le  logiciel 

d’analyse d’images Metamorph (Molecular Devices). 

b) Sur coupes de sphéroïdes 

Après fixation 3h à 4°C dans de la formaline, les sphéroïdes sont rincés deux fois 5 min dans du 

PBS  puis  transférés  dans  un  bain  de  sucrose  à  15%  dans  du  PBS  pour  la  nuit  à  4°C.  Les 

sphéroïdes sont ensuite placés dans un bain de sucrose à 30% dans du PBS pendant au moins 3 

heures  à  4°C  avant  d’être  enrobés  dans  un  milieu  de  cryomontage  (tissue‐tek).  Les  blocs 

obtenus sont ensuite congelés dans un cryostat (Leica ‐ CM1950) à ‐60°C pendant 10 min. Des 

sections de 5µm d’épaisseur sont réalisées sur toute l’épaisseur de l’échantillon et déposées sur 

des  lames de verre puis placées sous vide à  température ambiante pour  la nuit, avant d'être 

stockées à ‐20°C.  

Pour réaliser les marquages en immunofluorescence, les coupes sont tout d’abord réhydratées 

dans un bain de PBS pendant 30 min. Les coupes sont ensuite soumises à une post‐fixation de 

20 min à 4°C dans une solution de formaline. Selon  les anticorps, un démasquage d’antigènes 

115 

 

est réalisé. Les lames sont placées dans un tampon citrate (1,8mM d'acide citrique et 8mM de 

citrate de sodium) et chauffées deux fois 10 min au micro‐ondes à 500 Watts. Les  lames sont 

ensuite laissées 15 min dans le bain de tampon citrate sur la paillasse puis lavées trois fois dans 

du PBS. Les  lames sont alors  incubées dans une solution de PBS/1% BSA/0.5% de triton X‐100 

avant  d'être  mises  en  présence  de  l'anticorps  primaire  puis  secondaire  comme  décrit 

précédemment. 

Les anticorps primaires utilisés sont les suivants: 

Anticorps anti PARP‐1 (rabbit, monoclonal, Epitomics, 1/1000) 

Anticorps anti H2AX S139‐phosphorylée (mouse, monoclonal, Upstate, 1/500) 

Anticorps anti Ki‐67 (rabbit, polyclonal, Santa Cruz, 1/200) 

Anticorps anti H3P (rabbit, polyclonal,Upstate, 1/1000) 

Anticorps anti Cycline A (mouse, monoclonal, Abcam, 1/50) 

Anticorps anti Cycline B (mouse, monoclonal, Abcam, 1/2000) 

Anticorps anti Cycline D (rabbit, monoclonal, Spring, 1/100) 

Anticorps anti Cycline E (rabbit, monoclonal, Epitomics, 1/250) 

 

Les anticoprs secondaires utilisés sont couplés à un alexa 488, 594, ou 687 (Molecular Probes, 

1/800). 

 

VI. Détection de l’hypoxie intracellulaire 

Afin de détecter  la présence de zones hypoxiques,    les sphéroïdes sont  incubés pendant 2h à 

37°C en présence de pimonidazole (100µM, Euromedex). Dans un environnement hypoxique, le 

pimonidazole  est  réduit  et  se  lie  aux  groupements  SH  des  protéines.  La  détection  du 

pimonidazole, se fait grâce à l’utilisation d’un anticorps spécifique couplé au FITC. 

 

 

116 

 

VII. Cytométrie de flux 

  Les culots cellulaires obtenus après trypsinisation et centrifugation à 1400 rpm pendant 3 

min à 4°C, sont fixés pendant 20 min à température ambiante dans de la formaline. Les cellules 

sont ensuite réhydratées pendant 5 min à 4°C dans du PBS/ 1% BSA, puis perméabilisées 7 min 

à  4°C  dans  du  tampon  PBS/  1%  BSA  contenant  0.25%  de  triton.  Les  cellules  sont  ensuite 

incubées 45 min à  l’obscurité dans du PBS contenant du draq5 (Cell Signaling) (5µM), et de  la 

RNAse (1 mg/ml). Les cellules sont ensuite analysées avec un cytomètre de flux (C6‐Accuri) et 

les données sont acquises et analysées à l’aide du logiciel fourni avec le cytomètre (CFlow Plus). 

 

VIII. Incorporation d’EdU  

L’EdU  (10 µM‐Molecular Probes), un analogue de  la  thymidine,   est ajouté dans  le milieu de 

culture  des  sphéroïdes  pendant  une  durée  de  24h.  Les  sphéroïdes  sont  ensuite  récupérés, 

lavés,  fixés et coupés au cryostat comme expliqué précédemment. Les coupes de sphéroïdes 

sont ensuite réhydratées pendant 30 min dans un bain de PBS, puis perméabilisées pendant 45 

minutes à température ambiante dans du PBS/ 0,5% Triton X‐100. Les échantillons sont ensuite 

lavés deux fois dans du PBS/ 3% BSA, puis les lames sont incubées dans le tampon de révélation 

de l’EdU (selon le protocole du kit « Click‐it EdU Imaging kits » de Molecular probes) 1 heure à 

température ambiante, à  l’abri de  la  lumière. Plusieurs  lavages  sont  réalisés avec du PBS/3% 

BSA avant d’incuber les lamelles dans une solution contenant 0,1µg/ml de DAPI pendant 10 min 

à  l’obscurité. Enfin après un  lavage  rapide dans du PBS puis de  l’eau,  les  lames sont séchées 

puis montées à l’aide du milieu de montage, et analysées au microscope à fluorescence comme 

précédemment indiqué. 

 

IX. Traitements des images par analyse à l’Arrayscan 

Afin d’analyser le pourcentage de cellules positives pour un marqueur donné (Fucci ou γH2AX), 

en fonction de la position des cellules au sein des coupes de sphéroïdes, nous avons réalisé nos 

analyses à l'aide du logiciel Arrayscan vHCS (Cellomics).  

117 

 

Nous avons utilisé  la BioApplications Compartmental Analysis V4. Brièvement,  chaque noyau 

est segmenté sur  la base de  l'intensité de  fluorescence du DAPI sur des  images de coupes de 

sphéroïdes.  Le masque  primaire  obtenu  est  transposé  sur  chacun  des  autres  canaux  utilisé 

(figure 36). 

Chaque image est analysée à l’aide de cette BioApplication, et les données sont extraites pour 

chaque coupe, nous donnant accès aux informations suivantes :   

X et Y centroid : coordonnées des centres de masse de chaque noyau 

Object Area Ch1 : aire de chaque noyau (Ch1) 

Object Total Intensity Ch1 : intensité totale du DAPI sur chaque noyau 

Object Average Intensity Ch1 : intensité moyenne du DAPI sur chaque noyau 

Object size Ch1 : taille de chaque noyau 

Circle  Total  Intensity  Ch2 :  intensité  totale  du  marqueur  (Ch2)  dans  le  cercle 

(correspondant au masque du noyau) 

Circle  Average  Intensity  Ch2 :  intensité  moyenne  du  marqueur  dans  le  cercle 

(correspondant au masque du noyau) 

 

Pour le marquage H2AX, nous extrayons des informations supplémentaires : 

Circle Spot Total  Intensity Ch2 :  intensité  totale des  spots détectés  (Ch2) dans  le cercle correspondant au masque du noyau 

Circle Spot Average  Intensity Ch2 :  intensité moyenne des  spots détectés  (Ch2) dans  le cercle correspondant au masque du noyau 

Circle  Spot  Total  Area  Ch2 :  aire  totale  des  spots  détectés  (Ch2)  dans  le  cercle correspondant  au masque du noyau  

Circle  Spot  Average  Area  Ch2 :  aire moyenne  des  spots  détectés  (Ch2)  dans  le  cercle correspondant au masque du noyau  

Circle Spot count : nombre de foyers (spots) γH2AX détecté dans un noyau 

 

 

118 

 

 

119 

 

Nous avons également déterminé les paramètres d'analyse permettant de détecter le contour 

de chaque coupe de sphéroïde, et qui nous donne les coordonnées X et Y centroid du centre de 

masse de chaque coupe (figure 37). 

 Ainsi ce logiciel grâce aux deux réglages de la BioApplication nous donne les coordonnées X et 

Y des centres de masse de chaque coupe ainsi que ceux de chaque noyau détecté sur la coupe. 

Ces coordonnées nous sont fournies par le logiciel en pixels. Afin d’analyser le pourcentage de 

cellules positives pour un marqueur donné en  fonction de  sa position  au  sein du  sphéroïde, 

nous avons besoin de connaitre pour chaque cellule : 

‐ Sa distance à la périphérie du sphéroïde (µm) 

‐ Si elle est positive ou non pour un marqueur donné en Ch2 

 

Pour cela nous convertissons les coordonnées des centres de chaque sphéroïde en microns, en 

prenant en compte l’objectif avec lequel les images ont été prises. Les coordonnées des centres 

de chaque noyau sur la coupe sont ensuite converties de la même façon. La position de chaque 

noyau par rapport au centre de la coupe (X et Y modifiés) est mesurée par :  

X modifié =  X centre de la coupe – X centre du noyau 

Y modifié = Y centre de la coupe – Y centre du noyau 

 

La distance au centre est ensuite calculée avec la formule suivante :  

√((X modifié* X modifié) + (Y modifié * Y modifié)) 

La distance à la périphérie (Dp) est obtenue en soustrayant à la distance au centre maximum de 

la coupe, la distance au centre de chaque noyau :  

Dp = D centre max – D centre de chaque noyau 

D’autre part un seuil de positivité est établi sur la base de l’intensité de la fluorescence (Circle 

Average Intensity Ch2) observée sur les images dans le Channel 2 pour les marqueurs Fucci, et  

120 

 

 

121 

 

sur  le nombre de spots par noyau détecté dans  le Channel 2 pour  le marquage   H2AX (Circle 

Spot count). Un exemple de l’ensemble des données obtenues sont présentées en figure 38. 

 

A  partir  de  la  distance  à  la  surface  de  chaque  cellule  et  de  leur  positivité,  grâce  au  logiciel 

GraphPad PRISM 5.0, nous pouvons accéder à  la  fréquence de distribution de  l’ensemble des 

cellules en faisant des pas de 20 ou 40µm à partir de la surface des sphéroïdes. Ceci nous donne 

le nombre de cellules totales ainsi que le nombre de cellules positives pour un marqueur donné 

en fonction de la distance à la périphérie des sphéroïdes (figure 39). 

 

A partir de ces informations, nous calculons le pourcentage de cellules positives en fonction de 

la distance à  la périphérie en  faisant des pas de 20 ou 40 µm, grâce au même  logiciel  (figure 

40). 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

122 

 

 

 

 

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Figure 39 : Obten on de la fréquence de distribu on des cellules en fonc on de la distance à la périphérie des sphéroïdes à par r des données extraites de l’analyse sur l’Arrayscan A : Tableau montrant la fréquence de distribu on obtenu grâce au logiciel GraphPad PRISM 5.0 de toutes les cellules ainsi que des cellules Fucci Vert posi ves en fonc on de la distance à la surface, sur une coupe de sphéroïde Capan‐2 Fucci Vert, 10 minutes après une irradia on de 2Gy. B : Représenta on graphique de la fréquence de distribu on présentée en A.

A B

Figure 40 : Obten on du pourcentage de cellules posi ves en fonc on de la distance à la périphérie des sphéroïdes à par r des données extraites sur le logiciel Prism A : Tableau montrant le pourcentage de cellules Fucci Verte posi ves en fonc on de la distance à la surface, sur une coupe de sphéroïde Capan‐2 Fucci Vert, 10 minutes après une irradia on de 2Gy. B : Représenta on graphique du pourcentage de cellules Fucci Verte posi ves du tableau présenté en A.

A B

124 

 

 

 

 

125 

 

 

 

 

 

REFERENCES 

BIBLIOGRAPHIQUES  

 

 

 

 

 

 

 

 

  

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PUBLICATION 

 

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 1

MULTICELLULAR   TUMOR   SPHEROID   MODELS   TO   EXPLORE   CELL   CYCLE  

CHECKPOINTS  IN  3D  

 

Jennifer  LAURENT1,2,  Céline  FRONGIA1,2,  Martine  CAZALES1,2,  Odile  MONDESERT1,2,  Bernard  

DUCOMMUN1,2,3    and  Valérie  LOBJOIS1,2    

 

Authors  affiliations  :  

1  -­‐  Université  de  Toulouse  ;  ITAV-­‐UMS3039,  F-­‐31106  Toulouse,  France  

2  -­‐  CNRS  ;  ITAV-­‐UMS3039,  F-­‐31106  Toulouse,  France  

3  -­‐  CHU  de  Toulouse;  F-­‐31059  Toulouse,  France  

 

Email  adresses:  

jennifer.laurent@itav-­‐recherche.fr  

celine.frongia@itav-­‐recherche.fr  

martine.cazales@itav-­‐recherche.fr  

odile.mondesert@itav-­‐recherche.fr  

bernard.ducommun@itav-­‐recherche.fr  

 

Corresponding  author:  

Dr  Valérie  LOBJOIS  

Centre  Pierre  Potier,  ITAV  -­‐  UMS3039,  1  place  Pierre  Potier,  BP  50624  

31106  Toulouse  Cedex  1,  France  

Tél:  +33  5  82  99  10  47  -­‐  Télécopie  :  +33  5  82  99  10  01  

Email  :  valerie.lobjois@itav-­‐recherche.fr  

   

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 2

Abstract  

Background   :  MultiCellular   Tumor   Spheroid   (MCTS)  mimics   the   organization   of   a   tumor  

and   is  considered  as  an   invaluable  model   to  study  cancer  cell  biology  and  to  evaluate  new  

antiproliferative  drugs.  Here  we  report  how  the  characteristics  of  MCTS  in  association  with  

new   technological   developments   can   be   used   to   explore   the   regionalization   and   the  

activation  of  cell  cycle  checkpoints  in  3D.    

Methods   :  Cell  cycle  and  proliferation  parameters  were   investigated   in  Capan-­‐2  spheroids  

by   immunofluorescence   staining,  EdU   incorporation  and  using   cells   engineered   to   express  

Fucci-­‐red  and  -­‐green  reporters.    

Results   :  We   describe   in   details   the   changes   in   proliferation   and   cell   cycle   parameters  

during  spheroid  growth  and  regionalization.  We  report  the  kinetics  and  regionalized  aspects  

of  cell  cycle  arrest  in  response  to  checkpoint  activation  induced  by  EGF  starvation,  lovastatin  

treatment  and  etoposide-­‐induced  DNA  damage.    

Conclusion  :  Our  data  present  the  power  and  the  limitation  of  spheroids  made  of  genetically  

modified   cells   to   explore   cell   cycle   checkpoints.   This   study   paves   the   way   for   the  

investigation   of   molecular   aspects   and   dynamic   studies   of   the   response   to   novel  

antiproliferative  agents  in  3D  models.    

 

 

Keywords:  

Spheroid;  3D;  Cell  Cycle;  Checkpoint;  Fucci  reporters  

 

 

   

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 3

Background  

Models  that  closely  mimic  human  cancer  are  essential  for  the  understanding  of  the  intimate  

growth   mechanisms   and   for   the   development   of   new   treatments.   MultiCellular   Tumor  

Spheroid  (MCTS)  is  a  3D  model  that  accurately  reproduces  the  organization  of  a  microtumor,  

recapitulating   cell-­‐cell   and   cell-­‐microenvironment     interactions   [1,   2].     While   growing,  

spheroids   display   a   gradient   of   proliferating   cells   that   are   located   in   the   outer   cell-­‐layers  

whereas  the  quiescent  cells  are  located  more  centrally.  This  cell  heterogeneity  is  similar  to  

what  is  found  in  microregions  of  a  tumor  [2-­‐4].  MCTS  is  therefore  considered  as  an  attractive  

model   to   evaluate   the   activity   of   new   antiproliferative   drugs   that   fills   the   gap   between  

monolayer   cultured   cells   and   animal   models   [4,   5].   A   number   of   reports   indicate   that  

evaluation   performed   with   MCTS   is   rather   predictive   of   the   efficiency   of   new   antitumor  

compounds  in  patients    and  has  proven  in  numerous  studies  to  be  of  tremendous  interest  in  

characterizing  the  effects  of  chemotherapeutics  [6].    

New   therapeutics   strategies   that   aim   at   targeting   the   cell   cycle   machinery   and   its  

checkpoints   are   currently   of   a   major   interest.   Cyclin-­‐Dependent   Kinases   and   their   cyclin  

regulatory   subunits,   as  well   as   other   relevant   cell   cycle   regulators   have   been   the   focus   of  

intensive   efforts   to   identify   selective   inhibitory   compounds   [7-­‐11].   Another   promising  

approach   toward   cell   cycle   regulatory   mechanisms   is   to   target   cell   cycle   checkpoint   that  

ensure   maintenance   of   the   genome   integrity   [12,   13].   In   line   with   this,   as   we   recently  

reported,  pancreatic  ductal  adenocarcinoma  cell  lines-­‐derived  MCTS  can  be  used  to  evaluate  

the  spatio-­‐temporal  effect  of  the  combination  between  gemcitabine  and  a  checkpoint  kinase  

1  inhibitor,  CHIR-­‐124  [14].  

The  use  of  MCTS   in   the  evaluation  and   in   the  pre-­‐clinical  development  of  new  compounds  

targeting   the   cell   cycle   and   checkpoint   machineries   strengthen   the   need   for   a   better  

knowledge   of   the   proliferation   parameters   in   such   3D  models,   and   for   the   engineering   of  

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 4

innovative  new  evaluation  models  that  could  provide  additional  information  on  the  effect  of  

the  evaluated  compounds.  How  are  the  overall  duration  of  cell  cycle,  proliferation  markers  

and   distribution   in   the   different   cell   cycle   phases  modulated   in   the   different   regions   of   a  

multicellular  tumor  spheroid  remains  poorly  known.    

Here   we   report   how   the   characterization   of   cell   cycle   parameters   changes   in   growing  

pancreatic   MCTS   by   various   type   of   cues   in   association   with   new   technological  

developments  can  be  used  to  explore  the  regionalization  and  to  monitor  the  activation  of  cell  

cycle  checkpoints  in  3D.    

 

 

   

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 5

Methods    

Cell  culture    

Capan-­‐2  pancreatic  cancer  cells  transduced  with  lentiviral  vectors  coding  for  mAG-­‐Geminin  

or  mKO2-­‐Cdt1[14]  were   cultured   in   DMEM/F12   (Invitrogen,   France)   containing   10%   FCS  

with   2   mmol/l   glutamine   and   penicillin/streptomycin   in   a   humidified   atmosphere   of   5%  

CO2  at  37  °C.      

 

Spheroid  generation  and  culture  

Spheroids  were  prepared  as  previously  described    in  poly-­‐HEMA-­‐coated  96-­‐well  plates  [14]  

and   cultured   in   DMEM/F12   (Invitrogen,   France)   supplemented   with   EGF   (20ng/ml,  

Invitrogen)  and  B27  (1x,   Invitrogen).  To  obtain  quiescent  spheroids,  EGF  was  removed  by  

washing  400µm  in  diameter  spheroids  three  times  with  media  containing  10%  FCS  and  then  

incubated  with  this  media  without  EGF  and  B27  for  1-­‐6  days.    

 

Immunofluorescence  on  frozen  sections    

Spheroids  were  fixed  for  2-­‐3hrs  with  formalin  (Sigma),  then  washed  with  PBS  and  stored  at  

4°C.   After   fixation,   spheroids   were   processed   for   5µm   frozen   sections.   Spheroids   were  

incubated   in   15%   then   30%   sucrose   in   PBS   for   24   h   at   4°C,   and  were   then   embedded   in  

Tissue-­‐Tek,   (Sakura   Finetek)   before   sectionning.   Sections  were   incubated  with   antibodies  

directed   against   Ki67   (rabbit   polyclonal,   Santa   Cruz,   1/200),   phosphorylated-­‐HistoneH3  

(rabbit   polyclonal,  Upstate,   1/1000),   Cyclin  A   (mouse  monoclonal,  Abcam,  1/50),   Cyclin  B  

(mouse  monoclonal,  Abcam,  1/2000),  Cyclin  D1  (rabbit  monoclonal,  Spring,  1/100)  or  Cyclin  

E  (rabbit,  monoclonal,  Epitomics,  1/250)  overnight  at  4°C.  After  washes  in  PBS/Triton  0.1%  

v/v,   the   secondary   antibody  was   applied   (Alexa   488-­‐anti-­‐mouse   or   Alexa   594-­‐anti-­‐rabbit,  

Molecular  Probes,  1/800,  for  1  h  at  room  temperature).  DNA  was  stained  using  DAPI.  

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 6

EdU  labelling  of  spheroids  

EdU  labelling  was  performed  by  using  the  Click-­‐it®  EdU  Alexa  Fluor®  imaging  kit  (Molecular  

Probes).   EdU  was   added   to   the   culture  media   to   a   10   µM   final   concentration.   After   a   24h  

incubation,   spheroids  were   rinsed   in   PBS   and   then   fixed.   EdU   detection,   based   on   a   click  

reaction   between   EdU   and   Alexa   FLuor®   488   or   594   dye,   was   performed   following  

manufacturer's  instructions.    

Hypoxia  detection  

Hypoxia  detection  was  performed  by  using  HypoxyprobeTM-­‐1  Plus  kit   (HPI).  Pimonidazole  

hypochloride   (HypoxyprobeTM-­‐1)   was   added   to   the   culture   media   to   a   100   µM   final  

concentration   for  2h   at   37°C.   Pimonidazole   forms   stable   adducts  with  proteins   in  hypoxic  

cells.  After  fixation,  spheroids  were  processed  for  frozen  sections  and  pimonidazole  adducts  

were   detected   by   incubating   sections   with   FITC   conjugated   MAb1   (monoclonal   antibody  

provided,  1/300)  for  2h  at  37°C.  After  PBS  washes,  DNA  was  stained  using  DAPI.    

 

Pharmacological  treatments  

Spheroids   measuring   350-­‐400µm   in   diameter   were   treated   by   adding   lovastatin   (10µM,  

Mevinolin,  Sigma)  or  etoposide  (1µM  or  5µM,  Sigma)  to  the  culture  medium.  At  the  indicated  

time   after   treament   (24h   or   48h),   spheroids  were   fixed   for   2-­‐3hrs  with   formalin   (Sigma),  

then  washed  with  PBS  and  stored  at  4°C.  

 

Images  acquisition  and  analysis    

Fluorescence   images   from   spheroid   sections   were   acquired   using   a   DM5000   (Leica)  

epifluorescence  microscope,  fitted  with  a  Roper  COOLsnap  ES  CCD  camera  coupled  using  a  

C-­‐mount  0.63X  adapter.  Using  a  X20  objective,  the  final  magnification  was  X12,5  and  allows  

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 7

visualizing  entire  sections  of  small  and  large  spheroids  in  the  field  of  view  with  image  quality  

high  enough  for  subsequent  analyses.  Images  were  processed  using  Metamorph  and  ImageJ  

softwares.  To  quantify  the  percentage  of  Fucci-­‐expressing  cells  depending  on  the  distance  to  

the   spheroid   surface,   images   were   analyzed   using   the   Cellomics   Technologies   software  

(Compartimental  Bioapplication-­‐Thermo  Scientific).  Briefly,  all  the  nuclei  from  each  section  

were   segmented   based   on   DAPI   fluorescence.   Then,   the   x   and   y   coordinates   and   the  

fluorescence   intensity   corresponding   to   Fucci-­‐Red   or   Fucci-­‐Green   channels   were  

automatically   extracted   for   each   individualized   object.   The   same   threshold   was   used   to  

identify   Fucci-­‐expressing   cells   on   all   the   spheroid   sections   from   a   single   experiment.  

Numeric   values   were   processed   using   Microsoft   Excel   and   Prism   software   packages.   For  

each  section,  the  percentage  of  positive  cells  at  a  given  distance  was  calculated  by  dividing  

the  number  of  Fucci-­‐expressing  cells  by  the  total  number  of  nuclei  included  in  the  indicated  

range  of  distance.  For  each  condition,  20  to  30  sections  from  8  to  10  spheroids  from  2  to  3  

independent  experiments  were  analyzed.    

 

Results    

Growing  Capan-­‐2  spheroids  display  a  proliferation  gradient    

Our   first   aim   was   to   examine   how   regionalization   of   proliferation   parameters   occurs   in  

Capan-­‐2  multicellular  tumor  spheroids.  To  address  this  issue  we  selected  two  representative  

spheroid  growth  stages  that  will  subsequently  be  referred  to  in  this  work  as  small  and  large  

spheroids.  These  stages  correspond  to  spheroids  of  an  average  diameter  of  300-­‐350  µm  and  

500-­‐600   µm,   respectively.   The   experiments   reported   below   were   performed   and   strictly  

restricted  to  spheroid  sections  that  were  identified  as  closely  passing  through  the  spheroid  

center.      

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 8

We   first   assessed   proliferation   using   the  widely   used   KI-­‐67   immunofluorescence   staining  

procedure.   As   shown   in   figure   1A   small   spheroids   display   a   homogeneous   KI-­‐67   positive  

cells  distribution  pattern,  while  in  contrast  on  large  spheroids  KI-­‐67  positive  cells  staining  is  

restricted   to   the   outmost   cell   layers.   This   first   result   illustrates   the   notion   of   an   existing  

proliferation  gradient  that  is  initially  absent  and  develops  as  multicellular  tumor  spheroids  

grow.  

To  refine  this  analysis,  we  sought  to  visualize  the  population  of  cells  that  are  engaged  in  cell  

cycle  progression  and  therefore  undergoing  S-­‐phase  replication.  To  this  aim  we  performed  

EdU  incorporation  for  24  hours.  As  shown  in  figure  1B,  while  in  small  spheroids  staining  was  

observed  in  the  whole  volume,  a  clear  regionalization  was  observed  in  large  spheroids  with  

EdU  incorporation  restricted  to  the  outmost  layers.  In  such  large  spheroid  quantification  of  

the  percentage  of  EdU  positive  cells  (Figure  1C)  as  a  function  of  the  distance  to  the  spheroid  

surface   displays   a   progressive   decrease   of   the   proportion   of   proliferative   cells   from   the  

surface  to  the  center  of  the  spheroid.  This  experiment  shows  that  approximately  60%  of  cells  

have   undergone   S-­‐phase   over   the   last   24   hours   and   can   be   considered   as   actively  

proliferating   in   the  outer  40µm  of   the  spheroid.  Strikingly,   in   the  same  conditions  one  can  

also   observe   a   rapid   decrease   with   less   than   20%   of   cells   that   had   undergone   DNA  

replication  150  µm  away  from  the  spheroid  surface  and  the  absence  of  any  EdU  positive  cell  

in  the  center  of  the  spheroid.    

Finally,  we   also   examined  whether   the   observed   regionalization  of  KI67   and  EdU   staining  

matched  the  hypoxia  gradient  that  progressively   takes  place   in  growing  spheroids.   Indeed,  

as   shown   in   figure   1D,   while   no   hypoxia   is   detected   in   small   spheroids,   a   strong  

Pimonidazole  staining  is  observed  in   large  spheroids  and  its  regionalization  matches  those  

of  the  proliferation  parameters.  

 

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 9

Cell  cycle  regionalization  within  growing  Capan-­‐2  spheroids  

The   observed   regionalization   of   KI-­‐67   staining   and   EdU   incorporation   in   large   spheroids  

indicates  that  the  ability  of  cells  to  progress  in  the  cell  cycle  is  dependent  on  their  position  to  

the  spheroid  surface  and  suggests  that  expression  of  cell  cycle  regulatory  proteins  might  be  

dependent   on   that   parameter.   We   therefore   explored   systematically   cyclins   expression,  

which   is   representative  of   the  distinct  phases  of   cell   cycle,   and  of     phospho-­‐histone  H3   to  

detect  mitotic  cells  on  small  and  large  spheroids  sections.  In  figure  2,  from  top  to  bottom  are  

presented  staining  observed  for  cyclin  D1,  cyclin  E,  cyclin  A,  cyclin  B  and  phospho-­‐Histone  

H3.    

Cyclin  levels  are  known  to  mirror  the  progression  of  a  cell  within  the  cell  cycle.  As  expected,  

in   small   spheroids   mainly   constituted   of   actively   proliferating   cells,   all   four   cyclins   were  

highly  expressed,  with  level  variations  reflecting  their  position  in  the  cell  cycle.  In  contrast,  

large  and  regionalized  spheroids  displayed  an  expression  pattern  of  all  cyclins  that  mirrored  

the  proliferation  gradient   reported  above.   Finally,   detection  of  phosphorylated  histone  H3  

allowed   the  detection  of  mitotic   cells   that   are   evenly   spread   in   small   spheroids   and   again  

restricted  to  the  outer  layers  in  large  spheroids.    

All   together   these   observations   led   us   next   to   investigate   whether   and   how   cell   cycle  

distribution  was   a   parameter   subjected   to   changes   upon   spheroid   growth   and   in   various  

layers  of  a   large  spheroid.  To  address   that  question   in  a  more  systematic  and  quantitative  

manner   than   immunostaining   detection,   we   developed   spheroid   models   expressing   Fucci  

(Fluorescence   Ubiquitination   Cell   Cycle   Indicators)   tools   that   allow   to   monitor   cell   cycle  

position   of   a   cell   [15].   Fucci-­‐red   (Cdt1-­‐mKO2)   is   expressed   and   stable   in   G1   cells,   while  

Fucci-­‐green   (Geminin-­‐mAG)   marks   S-­‐   and   G2-­‐phases.   We   cloned   these   constructs   and  

prepared  lentiviruses  particles  that  were  used  to  transduce  and  establish  stable  Capan-­‐2  cell  

lines  expressing  these  fluorescent  fusion  proteins  [14].  To  validate  the  cell  cycle  regulation  

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 10

of  these  reporters  in  3D  MCTS,  dynamics  of  Fucci-­‐green  and  –red  expression  was  examined  

by  co-­‐immunostaining  with  cyclin  antibodies  on  small  and   large  spheroids.  No  Fucci-­‐green  

positive  cells  (i.e.  S-­‐G2-­‐M  cells)  were  found  to  express   the  G1-­‐phase  cyclins  D  or  E,  and  no  

Fucci-­‐red  positive  cells  (i.e.  G1  cells)  were  found  to  express  the  G2-­‐phase  cyclins  A  or  B  (see  

Additional  file  1).    

Figures  3A  and  3C  present   typical  wide   field   fluorescence  microscopy   images  of  spheroids  

sections   illustrating   the   distribution   of   Fucci-­‐red   and   Fucci-­‐green   in   small   and   large  

spheroids.  As  shown,  an  even  distribution  of  both  markers   is  observed   in  small  spheroids,  

while  a  clear  gradient  of  both  Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  is  detected  in  large  spheroids.  These  

results  were  quantified  by  determining  the  percentage  of  Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  positive  

cells  as  a  function  of  the  distance  to  the  spheroid  surface.  These  graphs  drawn  at  the  same  

scale  for  small  and  large  spheroids  clearly   illustrate  the  fact  that  G1-­‐phase  cells  are  evenly  

spread  in  small  spheroids  (average  50%  of  positive  cells),  while  in  large  spheroids  a  gradient  

is  observed  with  a  noticeable  decay  approximately  150  µm  away  from  the  cell  surface  (figure  

3B).     The   percentage   of   Fucci   green   cells   (i.e.   S,   G2   and   mitosis)   is   less   homogenously  

distributed   in   small   spheroids   with   a   progressive   decrease,   while   in   large   spheroids   the  

percentage   of   positive   cells   is   reduced   and   no   detectable   Fucci-­‐green   positive   cells   are  

observed  approximately  120-­‐150  µm  away  from  the  surface  (figure  3D).  

Altogether,   these  data   indicate   that   the  proliferative  zone  of  a  spheroid   is  restricted  to   the  

outer  150  µm    where  KI-­‐67  staining  is  positive  and  EdU  incorporation  occurs.   Indeed  cells  

are  apparently  able  to  efficient  cell  cycle  commitment  and  to  proceed  in  S-­‐phase  in  this  area  

only,  confirming  the  above  results.  These  experiments   further  underline  the   importance  of  

the  growth  regionalization  aspect  occurring  upon  MCTS  growth  when  investigating  cell  cycle  

checkpoint  in  3D  using  a  drug  that  impairs  cell  cycle  progression.    

 

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 11

Cell  cycle  arrest  in  G1  and  G2  in  response  to  EGF  removal  

In  order  to  investigate  growth  factor  starvation  effect  on  cell  cycle  parameters  in  MCTS  we  

referred   to   our   recent   observation   of   the   dependence   of   Capan-­‐2   spheroid   growth   on   the  

presence   of   EGF   [14].   Capan-­‐2   Fucci-­‐red   and   –green   expressing   spheroids   grown   in  

DMEM/F12  media  were  deprived  of  EGF  in  the  presence  of  10%  serum  and  monitored  over  

6  days.  EdU  incorporation  was  performed  every  day  for  a  24h  duration  to  assess  the  ability  

of  the  cells  to  enter  S-­‐phase  during  that  time.    

As   shown   in   figure   4A   (left   panels)   EdU   incorporation   is   totally   abolished   after   6   days  

indicating  that  most  cells  are  likely  in  a  G0  quiescent  stage.  Quantification  of  the  evolution  of  

EdU  incorporation  overtime  as  a  function  of  the  distance  to  the  cell  surface  is  presented  in  

figure  4B  (top).  As  shown,  there  is  virtually  no  EdU  incorporation  after  5  days  and  a  major  

decrease  is  already  detected  in  EGF-­‐deprived  spheroids  at  day  2  in  the  deepest  layers  and  at  

day  3  on  the  outer  layers.    

According  to  the  classical  view  of  cell  cycle  regulation  such  result  suggests  that  upon  growth  

factor  removal  cycling  cells  are  unable   to  progress   in  G1,  do  not  pass   the  restriction  point  

and  are  arrested  in  G1  prior  to  enter  a  quiescent  G0  state.  We  examined  this  hypothesis  by  

looking   at   the   distribution   of   the   percentage   of   Fucci-­‐red   and   Fucci-­‐green   cells   in   the  

proliferative   zone   of   the   spheroid   during   this   6   days   experiment.   As   presented   in   the  

micrographs  shown  in  figure  4A  (middle  and  right  panels)  both  the  percentage  of  Fucci-­‐red  

and  Fucci-­‐green  positive  cells  are  diminished  after  6  days.  The  quantification  presented   in  

figure  4B  shows   that  percentage  of  Fucci-­‐green  (i.e.  S  and  G2  cells)  progressively  dropped  

and   is   decreased   by   a   two-­‐fold   factor   after   6   days.   However,   unexpectedly   about   15%   of  

positive   Fucci-­‐green   cells   are   still   detected   at   day   6,   while   as   indicated   above   EdU  

incorporation  is  totally  abolished.  The  evolution  of  the  percentage  of  Fucci-­‐red  positive  cells  

is   different.   During   the   first   three   days,   this   percentage   increases   as   compared   to   control  

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 12

spheroid,   indicating   that  cells  are  accumulating   in  G1-­‐phase.  However,  at  days  5  and  6  we  

observe  a  major  decrease  in  the  percentage  of  Fucci-­‐red  positive  cells,  illustrating  the  entry  

of  the  cells  in  a  G0  quiescent  stage  accompanied  by  the  loss  of  Fucci-­‐red  expression.    

Our   results   also   strongly   suggest   that   epidermal   growth   factor   removal   slows   down   cell  

cycle  progression  not  only  in  G1  but  also  in  G2.  The  progressive  changes  in  Fucci-­‐green  and  –

red   cells   percentage   thus   would   likely   reflect   a   combined   effect   and   its   progressive  

consequences  on  the  cell  cycle  distribution.    

 

Lovastatin-­‐induced  cell  cycle  arrest  in  G1    

Lovastatin   inhibition   of   mevalonate   synthesis   results   in   farnesyl-­‐   and   geranylgeranyl-­‐

pyrophosphate  deprivation  that  ultimately  causes  an  inactivation  of  Ras  and  Rho.  It  has  been  

demonstrated   that   up-­‐regulation   of   p27   mediated   by   the   reduction   of   Rho  

geranylgeranylation  is  responsible   for  the   inhibition  of  CDK2  activity  and  consequently   for  

the  arrest  of  the  cell  cycle  at  the  G1-­‐phase  [16,  17].  Accordingly,  we  observed  that  treatment  

of  a  2D  monolayer  culture  of  Capan-­‐2  cells  expressing  Fucci  with  lovastatin  (60µM)  results  

in   an   efficient   cell   cycle   arrest   in   G1   (85%)  with   about   90%   of   Fucci-­‐red   cells   and   10  %  

Fucci-­‐green  (see  Additional  file  2).    

When   applied   on   spheroids,   we   find   that   lovastatin   treatment   impairs   growth   in   a   dose-­‐

dependent  manner  with   an   IC50   of   5µM   and   induces   cell   death  with   spheroid   collapse   at  

high  concentration.  We  therefore  examined  the  effect  of  5µM  (data  not  shown)  and  10  µM  

lovastatin   after   24   hours   and   48   hours   treatment   of   Fucci-­‐red   and   –green   spheroids.   As  

illustrated  with  the  micrographs  shown  in  figure  5A  and  the  quantification  shown  in  figure  

5B,   the  percentage  of  Fucci-­‐green  cells  decreases  over   time  while  an   increase   in  Fucci-­‐red  

positive   cells   is   detected.   At   48   hours,  we   observe   a   nearly   40%   reduction   of   Fucci-­‐green  

positive   in   the   outmost   region   of   the   spheroid   and   in   parallel   in   the   same   region   the  

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 13

percentage  of  Fucci-­‐red  positive  cells  increases  from  57%  to  68%.  Thus,  albeit  about  15%  of  

Fucci-­‐green   cells   are   still   detected   after   48   hours,   a   high   level   of   Fucci-­‐red   positive   cells  

indicative  of  an  arrest  in  G1  is  observed  in  the  outmost  proliferative  layers.    

 

Monitoring  G2/M  checkpoint  activation  in  MCTS  treated  with  etoposide  

Etoposide  (VP-­‐16)  is  a  topoisomerase  inhibitor  that  can  be  used  to  induce  DNA  damage  and  

activate   cell   cycle   checkpoint.   As   this   is   the   case   with   many   other   cell   lines,   a   one   hour  

treatment   with   40   µM   etoposide   results   after   24   hours   in   the   massive   accumulation   of  

Capan-­‐2  cells  at  the  G2/M  checkpoint  that  can  be  detected  either  by  flow  cytometry  or  by  the  

observation   of   the   accumulation   of   90   %   of   Fucci-­‐green   positive   cells   with   a   very   low  

residual  percentage  of  Fucci-­‐red  (see  Additional  file  2).    

Since  it  is  not  technically  possible  to  wash  away  etoposide  from  a  treated  spheroid,  we  used  

continuous   treatment   with   a   1µM   and   5µM   concentration   for   24h   and   48   hours.   The  

micrographs  of  spheroids   treated   for  48  hours  (figure  6A)   illustrate   the  decrease   in  Fucci-­‐

red  cells  with  a  concomitant  increase  in  Fucci-­‐green    cells  percentage.    As  presented  in  the  

quantization  of  these  experiments  shown  in  Figure  6B,  while  modestly  affected  at  24h,  after  

a   48   hours   treatment  with   5µM   the   percentage   of   Fucci-­‐green   positive   cells   increases   by  

approximately  two-­‐fold  (25  %  to  45%)  and  in  parallel  the  percentage  of  Fucci-­‐red  positive  

cells  drops   from  60%  to  30%.  Strickingly,   this  effect   is  observed  up   to  120µm  deep   in   the  

spheroid.  Phospho  gamma  H2AX  staining  was  used  to  detect  DNA  damage  and  confirmed  the  

presence  of  numerous  positive  cells  in  the  whole  volume  of  the  spheroid,  thus  indicating  that  

etoposide  has  penetrated  in  the  spheroid  (data  not  shown).    One  can  therefore  conclude  that  

etoposide  treatment  of  3D  MCTS  efficiently  activates  a  DNA  damage  checkpoint  resulting  in  a  

global  change  in  cell  cycle  distribution  of  the  outmost  layers  of  the  spheroid.    

 

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 14

Discussion  

This  work  presents,   to   our  knowledge,   the   first   description  of   cell   cycle  parameters   in  3D  

MCTS  from  the  Capan-­‐2  pancreatic  adenocarcinoma  cell  line.  We  demonstrate  that  classical  

immunological  reagents,  as  well  as  engineered  cell  lines  with  Fucci  reporters  can  be  used  to  

precisely  describe   in   "cell   cycle  words"   the   complex   regionalization   that   is  observed  upon  

spheroid   growth   in   situ.   We   showed   that   in   this   Capan-­‐2   spheroid   model,   the   actively  

proliferating  cells  are  restricted  to  the  outer  150µm  of  the  spheroid.  The  observed  gradient  

is   similar   to   reported   proliferation   gradient   on   other   cell   types   spheroid   models   [2,   18].  

However   the   indicated   limit   from   the   surface   can   vary   upon   the   size   of   the   spheroid,   the  

relative  cell  packing  density  and  the  cell  type  [2].    

The  decrease  of  the  percentage  of  EdU  positive  cells  and  the  absence  of  proliferating  cells  at  

the  center  of  the  spheroid    are  likely  to  reflect  the  fact  that  as  function  of  the  distance  to  the  

spheroid   surface   (i.e.   away   from   nutrients,   oxygen,  …)   cells   are   increasingly   prevented   to  

pass   through   the   restriction   point   and   to   commit   into   the   cell   cycle,   resulting   in   a  

progressive   increase   in   G1   duration   and   consequently   in   the   enlargement   of   cell   cycle  

duration.  This  could  be  related  to  the  persistence  of  G1/Fucci-­‐red  expressing  cells   in   inner  

regions  where  there  is  no  more  S-­‐G2/Fucci-­‐green  expressing  cell.  Longer  EdU  incorporation  

(up  to  48  hours)  resulted  only  in  a  slight  (10%)  increase  in  the  percentage  of  EdU  positive  

cells,  thus  indicating  that  only  a  very  minor  fraction  of  cells  has  an  overall  cell  cycle  duration  

from  24   to  48  hours.  Additionally,   these  data  also  suggest   that  quiescence  associated  with  

loss  of  Fucci-­‐red  positivity,  according  to  Xouri  et  al.[19],  is  probably  progressively  occurring  

in  cells  located  from  120µm  to  the  center  of  the  spheroid.  This  progressive  G1  enlargement  

and   entry   into   quiescence   is   probably   associated   with   increase   Cyclin-­‐dependent   kinase  

inhibitors  (CKI)  expression  as  suggested  by  LaRue  et  al.  on  different  spheroid  models  [2,  18].    

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 15

Unfortunately,  none  of   the  antibodies  directed  against  CKIs  has  given  a  satisfying  signal   in  

our  experimental  conditions.  

 

We   reported   three   examples   of   treatment   that   result   in   quite   different   behavior   of   the  

spheroids   and   illustrate   that   major   discrepancies   can   be   observed   between   2D   and   3D  

evaluation.   EGF   deprivation   sensitivity   of   a   Capan-­‐2   spheroid   and   its   effect   on   cell   cycle  

distribution  could  not  have  been  predicted  on  a  2D  culture  as  cells  are  no  dependent  on  this  

growth  factor  when  grown  as  a  monolayer.  Our  results  showed  that  growth  arrest  of  Capan-­‐

2  spheroids  upon  EGF  removal  relies  on  a  cell  cycle  progression  slowdown  in  G1  but  also  G2.    

It   has   been  proposed   that  EGFR   signaling  might   play   a   role   in   the  G2/M  phase   of   the   cell  

cycle   in  human  tumor  cell  overexpressing  EGFR  [20].  Our  observations  suggest   that,  when  

grown   in   3D,   Capan-­‐2   cells   are   prone   to   arrest   or   slow   down   their   cell   cycle   in   G2   in  

response  to  EGF  deprivation.  The   limited  and  regionalized  effects  of   lovastatin  at   tolerable  

concentration  might   reflect   a   lovastatin   penetration   issue,   as   this   has   been   reported  with  

other  compounds   [21]  and   is  known  as  a   limitation  of   the  model.  Nevertheless,  one  might  

consider   the   penetration   in   3D  MCTS   as   an   essential   parameter   to   predict   the   ability   of   a  

candidate  drug  to  penetrate  in  the  deepest  domains  of  tumor  microregions.  Another  possible  

explanation   is   that   the   concentration   of   lovastatin   needed   to   observe   a  massive   cell   cycle  

effect   upon   depletion   of   mevalonate   is   higher   than   the   concentration   leading   to   the  

deleterious  effects  associated  with   inhibition  of  HMG-­‐CoA  reductase   in  3D  culture.  Finally,  

data  obtained  with   the   activation  of   the  DNA  damage   checkpoint  by   etoposide  provide   an  

example   of   detectable  modification   of   cell   cycle   suggesting   that   Capan-­‐2   Fucci   expressing  

spheroid  models  could  be  used  to  detect  or  to  investigate  the  effect  of  a  novel  DNA  damaging  

compound.  

 

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 16

Conclusion  

One   of   the  main   lessons   from   this   study   is   that   one   cannot   simplistically   extrapolate   cell  

cycle  effects  observed  in  2D  culture  to  3D  models  such  as  spheroids.  If  a  comparison  is  made,  

as   for   instance   with   the   effect   of   etoposide,   the   observed   result   in   3D   can   be   viewed   as  

moderate.  However,  our  study  warns  us  on  the   fact   that  we  should  completely  rethink  the  

way  we   interpreted  and  analyze   the  effect  of   a   given  drug  on   the   cell   cycle.  A   tumor,  or   a  

tumor  model   such  as   a  MCTS   is  not   a  population  of   exponentially   growing   cells   that   cycle  

from  G1  to  S,  G2  and  mitosis  without  any  constraint.  In  spheroid,  the  major  parameters  that  

have   to  be   taken   into   consideration  are   regionalization  and  above  all   heterogeneity  of   the  

cell   cycle   parameters   and   distribution   within   the   outermost   layers   constituting   the  

proliferating  zone.  

 

List  of  abbreviations:  

MCTS:   MultiCellular   Tumor   Spheroid,   Fucci;   Fluorescence   Ubiquitination   Cell   Cycle  

Indicators,  EGF:  Epidermal  Growth  Factor.  

 

Competing  interest  

The  authors  declare  that  they  have  no  competing  interests.  

 

Author’s  contribution  

JL,  CF,  OM  and  MC  performed  the  experiments.  VL  and  BD  initiated  the  project,  contributed  

with  data  analysis  and  wrote  the  manuscript.  All  authors  read  and  approved  the  final  

manuscript.  

 

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 17

Author  details  

1  -­‐  Université  de  Toulouse  ;  ITAV-­‐UMS3039,  F-­‐31106  Toulouse,  France  

2  -­‐  CNRS  ;  ITAV-­‐UMS3039,  F-­‐31106  Toulouse,  France  

3  -­‐  CHU  de  Toulouse;  F-­‐31059  Toulouse,  France  

4  –  INSERM  ;  CRCT  –  UMR1037,  F-­‐31000  Toulouse,  France  

 

Acknowledgements  

We  gratefully   acknowledge   the  members   of   our   group   for   discussions   and   support   of   this  

project.  JL  was  a  recipient  of  a  doctoral  fellowship  from  la  Ligue  Nationale  Contre  le  Cancer.  

The  authors  wish  to  acknowledge  Pierre  Cordelier  for  its  contribution  to  the  production  of  

the  Fucci   cell   lines,   the   support   of   the  BIVIC,  TRI   and   ITAV   imaging   facilities.   The   authors  

also   thank  Fanny  Grimal   for  her  help   for   image  analysis.   This  work  was   supported  by   the  

C.N.R.S,   l'Université   Paul   Sabatier,   la   Région   Midi-­‐Pyrénées,   la   fondation   InNaBioSanté,   la  

Ligue  contre  le  Cancer,  le  Cancéropôle  Grand  Sud-­‐Ouest  and  la  Fondation  pour  la  Recherche  

Médicale  (Equipe  FRM2011).    

 

 

 

   

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 18

References  

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8.   Cicenas  J,  Valius  M:  The  CDK  inhibitors  in  cancer  research  and  therapy.  J  Cancer  Res  Clin  Oncol  2011,  137(10):1409-­‐1418.  

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12.   Carrassa   L,   Damia   G:  Unleashing   Chk1   in   cancer   therapy.   Cell   Cycle  2011,  10(13):2121-­‐2128.  

13.   Ma  CX,  Janetka  JW,  Piwnica-­‐Worms  H:  Death  by  releasing  the  breaks:  CHK1  inhibitors  as  cancer  therapeutics.  Trends  Mol  Med  2011,  17(2):88-­‐96.  

14.   Dufau   I,   Frongia   C,   Sicard   F,   Dedieu   L,   Cordelier   P,   Ausseil   F,   Ducommun   B,   Valette   A:  Multicellular   Tumor   Spheroid  model   to   evaluate   spatio-­‐temporal   dynamics   effect   of  chemotherapeutics.   Application   to   the   gemcitabine   /   CHK1   inhibitor   combination   in  pancreatic  cancer.  BMC  cancer  2012,  12(1):15.  

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16.   Javanmoghadam-­‐Kamrani   S,   Keyomarsi   K:   Synchronization   of   the   cell   cycle   using  lovastatin.  Cell  Cycle  2008,  7(15):2434-­‐2440.  

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18.   LaRue   KE,   Khalil   M,   Freyer   JP:   Microenvironmental   regulation   of   proliferation   in  multicellular   spheroids   is   mediated   through   differential   expression   of   cyclin-­‐dependent  kinase  inhibitors.  Cancer  Res  2004,  64(5):1621-­‐1631.  

19.   Xouri   G,   Lygerou   Z,   Nishitani   H,   Pachnis   V,   Nurse   P,   Taraviras   S:   Cdt1   and   geminin   are  down-­‐regulated   upon   cell   cycle   exit   and   are   over-­‐expressed   in   cancer-­‐derived   cell  lines.  Eur  J  Biochem  2004,  271(16):3368-­‐3378.  

20.   Walker   F,   Zhang   HH,   Burgess   AW:   Identification   of   a   novel   EGF-­‐sensitive   cell   cycle  checkpoint.  Exp  Cell  Res  2007,  313(3):511-­‐526.  

21.   Frongia   C,   Lorenzo   C,   Gianni   F,   Prevost   GP,   Ducommun   B,   Lobjois   V:   3D   imaging   of   the  response   to   CDC25   inhibition   in   multicellular   spheroids.   Cancer   Biol   Ther   2009,  8(23):2230-­‐2236.  

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 19

Figure  legends  

Figure  1.    

Proliferation  gradient  characterization  during  Capan-­‐2  multicellular  tumor  spheroids  

growth.  

(A)   Immunodetection   of   proliferative   cells   (Ki-­‐67,   green)   on   a   frozen   section   of   a   small  

Capan-­‐2   spheroid   (300µm   in   diameter,   left)   or   a   large   Capan-­‐2   spheroid   (500µm   in  

diameter,  right).  Nuclei  are  stained  with  DAPI  (blue).  Scale  bar:  50µm.  

(B)   Visualization   of   proliferative   cells   after   24h   of   EdU   incorporation   (red)   on   a   frozen  

section  of  a  small  Capan-­‐2  spheroid  or  a  large  spheroid.  Nuclei  are  stained  with  DAPI  (blue).  

Scale  bar:  50µm.  

(C)   Graphic   representation   of   the   percentage   of   proliferative   cells   after   24h   of   EdU  

incorporation   related   to   the   distance   to   spheroid   center  within   Capan-­‐2  MCTS  measuring  

500µm  +/-­‐  20µm  in  diameter.  Data  correspond  to  the  mean  +/-­‐  SEM  of  percentage  of  EdU  

positive  cells  from  10  sections  similar  to  the  one  shown  in  (B)  from  4  different  spheroids.  

(D)  Visualization  of  the  hypoxia  by  pimonidazole  detection  (green)  on  frozen  sections  from  a  

small  spheroid  or  a  large  spheroid.  Nuclei  are  stained  using  DAPI  (blue).  Scale  bar:  50µm.  

 

Figure  2.    

Expression  of  cell  cycle  regulators  in  small  and  large  Capan-­‐2  spheroids.  

Immunofluorescence   staining  with   the   indicated   antibodies   and  DAPI   performed   on   small  

(left  column)  and  large  (right  column)  Capan-­‐2  spheroids  Scale  bar:  50µm.  The  star  indicates  

approximately  the  center  of  large  spheroids.    

 

 

 

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 20

Figure  3.    

Cell   cycle   distribution   in   Capan-­‐2   spheroids   expressing   the   Fucci-­‐Red   or   -­‐Green  

reporters.  

(A,  C):  Visualization  of  the  G1  and  S-­‐G2  cells  on  a  frozen  section  of  a  large  Capan-­‐2  spheroid  

expressing   the   Fucci-­‐red   and   Fucci-­‐green   reporters   respectively.   Nuclei   are   stained   with  

DAPI  (blue).  Scale  bar:  50µm.  

(B,  D):  Graphic  representations  of  the  percentage  of  cells  expressing  the  Fucci-­‐red  or  Fucci-­‐

green  reporters  related  to  the  distance  to  spheroid  center  within  Capan-­‐2  MCTS  measuring  

340µm  +/-­‐  20µm  (top)  or  580µm  +/-­‐  20µm  (bottom)   in  diameter.  The  relative  position  of  

the   spheroid   center   is   indicated.   Data   correspond   to   the   mean+/-­‐SEM   of   percentage   of  

positive  cells  on  7-­‐10  sections  from  3-­‐4  different  spheroids.  

 

Figure  4.    

Cell  cycle  arrest  in  G1  and  G2  in  response  to  EGF  removal  

(A):   Capan-­‐2   spheroids   control   or   6   days   after   EGF   removal.   Visualization   of   EdU  

incorporation  (left),    Fucci-­‐red  (middle)  and  Fucci-­‐green  (right)  expressing  cells.  Nuclei  are  

stained  with  DAPI  (blue).  EdU  has  been  incorporated  for  24  hours.  Scale  bar:  50µm.    

(B)   Quantification   of   the   percentage   of   EdU   (top),     Fucci-­‐red   (middle)   and   Fucci-­‐green  

(bottom)  expressing  cells  as  a  function  of  the  distance  to  the  spheroid  surface.  0-­‐40µm,  40-­‐

80µm  and  80-­‐120µm  intervals  are  considered.    For  each  condition,  data  correspond  to  the  

mean+/-­‐SEM   of   percentage   of   positive   cells   on   10-­‐30   sections   from   2   or   3   independent  

experiments  with  5  to  10  different  spheroids  each.  

 

Figure  5.    

Lovastatin-­‐induced  cell  cycle  arrest  in  G1    

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 21

 (A):  Capan-­‐2  spheroids   treated  or  not  with  10µM   lovastatin   for  48  hours.  Visualization  of  

Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  expressing   cells.  Nuclei   are   stained  with  DAPI   (blue).   Scale  bar:  

50µm.    

(B)  Capan-­‐2  spheroids  treated  or  not  with  10µM  lovastatin  for  24  or  48  hours.  Quantification  

of  the  percentage  of  Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  expressing  cells  as  a  function  of  the  distance  

to  the  spheroid  surface.    

 

Figure  6.    

G2/M  checkpoint  activation  in  MCTS  treated  with  etoposide  

(A):   Capan-­‐2   spheroids   treated   or   not   with   5µM   etoposide   for   48   hours.   Visualization   of  

Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  expressing   cells.  Nuclei   are   stained  with  DAPI   (blue).   Scale  bar:  

50µm.    

(B)   Capan-­‐2   spheroids   treated   or   not   with   1   µM   or   5µM   etoposide   for   24   or   48   hours.  

Quantification  of  the  percentage  of  Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  expressing  cells  as  function  of  

the  distance  to  the  spheroid  surface.  For  each  condition,  data  correspond  to  the  mean+/-­‐SEM  

of  percentage  of  positive  cells  on  10-­‐30  sections  from  2  or  3  independent  experiments  with  5  

to  10  different  spheroids  each.  

 

ADDITIONAL  FILES:  

Additional  file  1.pdf  

Characterization  of  Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  expressing  spheroids.    

Immunostaining   of   Fucci-­‐red   and   Fucci-­‐green   expressing   cells   with   antibodies   directed  

against  cyclin  D,  cyclin  E,  cyclin  A  and  cyclin  B  on  small  (A)  or  large  (B)  spheroids.    

 

Additional  file  2.pdf    

Laurent, J. et al. Submitted to BMC Cancer 22

Characterization   of   the   effects   of   lovastatin   and   etoposide   on   Capan-­‐2   cells   lines  

expressing  Fucci  reporters.  

Capan-­‐2   cell   lines   cultured   as   monolayers   and   treated   or   not   with   lovastatin   (60   µM,   48  

hours)   or   etoposide   (40µM,   1   hour).   (A)   Visualization   of   Fucci-­‐red   and   Fucci-­‐green  

expressing   cells.   (B)   Flow   cytometry   analysis   of   DNA   content   after   DRAQ5   staining.     (C)  

Quantification  of  the  percentage  of  Fucci-­‐red  and  Fucci-­‐green  expressing  cells.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

Figure 5

Figure 6

Additional files provided with this submission:

Additional file 1: Additional file 1.pdf, 2726Khttp://www.biomedcentral.com/imedia/1569442482775854/supp1.pdfAdditional file 2: Additional File 2.pdf, 869Khttp://www.biomedcentral.com/imedia/9452736207758543/supp2.pdf

Exploration des points de contrôles du cycle cellulaire dans un modèle 3D, le sphéroïde 

 

Directeurs de thèse : Bernard Ducommun et Valérie Lobjois 

Résumé : 

  Le décryptage des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire est essentiel pour comprendre les  mécanismes  régulateurs  de  la  prolifération  ainsi  que  leurs  dérégulations  au  cours  du développement tumoral. Cependant,  les données actuelles ont pour  la plupart été acquises sur des modèles  de  culture  cellulaire  en  monocouche  ne  permettant  pas  de  prendre  en  compte  les interactions  cellulaires,  l'hétérogénéité  tumorale  et  le  microenvironnement,  paramètres déterminants pour la croissance tumorale et dans la sensibilité aux agents anti‐cancéreux.    Les  sphéroïdes  sont des modèles de  culture 3D multicellulaires caractérisés par  la mise en place au cours de  leur croissance de gradients de nutriments, d'hypoxie et de prolifération mimant l’organisation cellulaire de micro‐régions tumorales. Ainsi, le modèle sphéroïde permet de considérer les interactions et l'hétérogénéité cellulaire ainsi que le microenvironnement.   Dans ce contexte,  l'objectif de ce projet est d'étudier  la dynamique spatiale et temporelle de régulation du cycle cellulaire et d'activation des points de contrôle en 3D dans des modèles de sphéroïdes.   Cette étude a été réalisée sur des sphéroïdes de cellules d’adénocarcinome du pancréas de la lignée Capan‐2. Nous avons tout d'abord caractérisé la mise en place du gradient de prolifération au cours de la croissance grâce à des incorporations d’EdU, ou des marquages dirigés contre l’antigène Ki‐67. Grâce à des modèles originaux de sphéroïdes exprimant des marqueurs fluorescents indicatifs de  la position dans  le  cycle  cellulaire,  les  Fucci, nous avons  caractérisé  la distribution des  cellules dans le cycle cellulaire ainsi que la régionalisation de cette distribution au cours de la croissance des sphéroïdes. La deuxième partie des travaux réalisés a été consacrée à l'évaluation de l'utilisation des modèles de sphéroïdes Capan‐2/Fucci pour  l'exploration de  la dynamique spatiale et temporelle de l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire en réponse à une exposition à divers types de stress  comme  une  privation  en    facteur  de  croissance,  des  traitements  pharmacologiques  ou  des dommages à l’ADN induits par des radiations ionisantes.   Les  résultats  obtenus  montrent  l’intérêt  de  l’utilisation  de  sphéroïdes  génétiquement modifiés pour étudier l’activation des points de contrôle au sein d’une population cellulaire tumorale hétérogène  et  régionalisée,  prenant  en  compte  les  interactions  cellulaires  et  l’importance  du microenvironnement.   Cette étude ouvre  la possibilité d’explorer  les mécanismes moléculaires de  l’activation des points  de  contrôle  du  cycle  cellulaire  en  3D,  ainsi  que  l’étude  dynamique  de  la  réponse  à  de nouveaux agents anti‐prolifératifs dans la perspective d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. 

Mots‐clés : Cycle cellulaire, points de contrôle, modèle 3D, sphéroïde.       

Institut des Technologies Avancées en sciences du Vivant (ITAV) UMS3039, Centre Pierre Potier 1 place Pierre Potier ‐ BP 50624 

31106 TOULOUSE Cedex 1