JENNYFER ANDREA ALDANA MEJÍA TRABAJO DE GRADO … · 5.2.2 Obtención de aceites esenciales, ... una subfracción con actividad inhibitoria de cada individuo sobre las cepas de interés

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I

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE FRACCIONES Y

SUBFRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE HOJAS DE Elaeagia utilis SOBRE

Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus acidophilus

JENNYFER ANDREA ALDANA MEJÍA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito para optar por al título de

BIÓLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGÍA

2.010

II





___________________________

INGRID SCHULER Ph.D.

Decana Académica

Facultad de Ciencias

______________________________

ANDREA FORERO

Directora Carera de Biología

Facultad de Ciencias

III





APROBADO

_____________________________

FREDY GAMBOA Ph.D.

DIRECTOR

_______________________________

NOHEMÍ TÉLLEZ ALFONSO Dr. Sc.

PAR ACADÉMICO

IV

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se

vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

V

AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Nohemí Téllez y al Doctor Fredy Gamboa, por su asesoría y apoyo.

Al Grupo de Investigación en Fitoquímica de la Pontificia Universidad Javeriana (GIFUJ), y al

Centro de Investigaciones Odontológicas por permitir el desarrollo de este trabajo en sus

laboratorios.

A la Pontificia Universidad Javeriana, por la financiación de este proyecto.

A Andrea Alvarado por su orientación e interés en el trabajo.

A la profesora Elizabeth Gil, por su gran colaboración.

A mi familia por su gran apoyo.

VI

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 2

2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................. 3

3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................... 4

3.1 Salud pública: El problema de acceso a los servicios ............................................................ 4

3.2 Caries dental .......................................................................................................................... 5

3.3 Fármacos sintéticos para el tratamiento de la caries ............................................................... 7

3.4 Productos naturales como nuevas alternativas en el tratamiento de enfermedades ................ 8

3.5 Extractos vegetales, aceites esenciales y actividad antimicrobiana ........................................ 8

3.6 Extractos vegetales y microorganismos de cavidad oral ........................................................ 9

4. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 11

4.1 Objetivo general ..................................................................................................................... 11

4.1 Objetivos específicos ............................................................................................................. 11

5. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 12

5.1 Sujeto de estudio: Elaeagia utilis ......................................................................................... 12

5.2 Obtención de fracciones ......................................................................................................... 12

5.2.1 Material vegetal .......................................................................................................... 12

5.2.2 Obtención de aceites esenciales, extractos y fracciones ............................................. 13

5.3 Métodos de caracterización química de subfracciones activas ........................................... 15

5.3.1 Pruebas cualitativas ...................................................................................................... 15

5.3.2 Cromatografía de Gases acoplada a Espectometria de Masas ..................................... 16

5.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de las fracciones ................................................. 16

5.4.1 Cepas a evaluar .............................................................................................................. 16

5.4.2 Evaluación de la actividad antimicrobiana: método de difusión en pozo ...................... 16

5.4.3 Evaluación del efecto antimicrobiano de la subfracción activa sobre el crecimiento de

las cepas de interés por Bioautografía ........................................................................... 17

6. RESULTADOS ........................................................................................................................ 17

6.1 Aceite esencial ..................................................................................................................... 17

VII

6.1.1 Evaluación microbiológica ............................................................................................. 17

6.1.2 Caracterización por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas ..... 18

6.2 Fracciones del extracto en éter de petróleo ........................................................................... 19

6.3. Fracciones floculo extracto etanólico ................................................................................... 19

6.4 Fracciones obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico ................. 20

6.5 Rastreo de la fracción CH2Cl2 en un segundo ejemplar de E. utilis ....................................... 21

6.6 Fraccionamiento de los extractos CH2Cl2 de EU1 y EU2 ..................................................... 23

6.7 Concentración mínima inhibitoria ......................................................................................... 26

6.8 Bioautografías ........................................................................................................................ 27

6.9 Estudio químico de las subfracciones activas ....................................................................... 28

6.9.1 Cromatografía en capa delgada ..................................................................................... 28

6.9.2 Estudio químico cualitativo de las subfracciones activas .............................................. 28

6.9.3 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas ..................................... 29

7. DISCUSIÓN .............................................................................................................................. 31

8. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 36

9. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 37

10. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 37

ANEXOS

VIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Marcha fitoquímica E. utilis (EU2) ............................................................................... 14

Figura 2. . Halo de inhibición del aceite esencial .......................................................................... 18

Figura 3. Acción antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir del fraccionamiento

líquido/líquido del extracto etanólico, a una concentración de 20mg/pozo .............................. 21


líquido/líquido del extracto etanólico de EU2, a una concentración de 20mg/pozo ................. 22

Figura 5. Halos de susceptibilidad presentados por L. acidophilus al ser enfrentado a las

fracciones CH2CL2 de EU1 (a) y EU2 (b), a una concentración de 20mg/pozo ....................... 22

Figura 6. Esquema de separación de clorofilas realizado a las fracciones de CH2Cl2 de EU1 y

EU2 ............................................................................................................................................ 23

Figura 7. Acción antimicrobiana de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción CH2Cl2 de

EU1 ............................................................................................................................................ 24


EU1 ............................................................................................................................................ 25

Figura 9. Halos de susceptibilidad presentados por (a) S. mutans, (b) S. sobrinus y (c) L.

acidophilus, al ser enfrentados a las Subfraccion No. 4 de CH2CL2 de EU1 ............................ 26

Figura 10. CCD (FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH (10:1)) revelada con vainillina, de las

subfracciones activas, obtenidas del fraccionamiento con Sephadex de la fracción CH2Cl2 de

EU2. Los recuadros indican los compuestos comunes entre las Sf. 2 y 3 ................................ 26

Figura 11. Halos de inhibición sobre S. mutans producidos por la MeOH:H2Ob de EU1 (a), y la

Sf. 3 de EU2 (b), bajo concentraciones de 1mg/pozo, 0.5mg/pozo y 0.1mg/pozo ................... 27

Figura 12. Bioautografía de la Sf. MeOH:H2Ob de EU1, con FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH

(9:1). A) Cromatografía revelada con Vainillina. B) Placa cromatográfica con indicador de

fluorescencia (254) bajo luz UV de onda larga, con los Rf de los compuestos fluorescentes. C

y D) Bioautografía de S. mutans y L. acidophilus, reveladas con MTT ................................... 28

Figura 13. CCD: A) Sfs. MeOH:H2Ob(s) (1) y MeOH:H2Ob (2) y Sf. 3 (3) (FE: RP-18, FM:

MeOH:H2O 10:1). B) Sfs. 3 (1) de EU2 y MeOH:H2Ob (2) de EU1 (FE: Sílica gel, FM:

CH2Cl2:MeOH 10:1), revelada con vainillina. C) Sfs. 3 (1) y MeOH:H2Ob (2) (FE: Sílica gel

F254, FM: CH2Cl2:MeOH 9:1), bajo luz UV de onda larga ...................................................... 29

IX

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Compuestos mayoritarios encontrados dentro del Aceite esencial ................................. 18

Tabla 2 Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus

al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo, a una

concentración de 10mg/pozo ................................................................................................... 19

Tabla 3. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus

al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del flóculo del extracto etanólico ..... 20

Tabla 4. Halos de susceptibilidad en mm (promedio de dos pruebas) presentados por S. mutans,

S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2,

AcOEt, AcOet(p), BuOH y BuOH(p), obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del

extracto Etanólico .................................................................................................................... 20


S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2,

AcOEt y BuOH, de EU2 obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto

Etanólico ................................................................................................................................. 22


al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU1, a una concentración de 10mg/pozo

................................................................................................................................................. 24


al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU2, a una concentración de

20mg/pozo, exceptuando a la Sf. 3, la cual fue evaluada a 10mg/pozo .................................. 25

Tabla 8. Halos de susceptibilidad presentadas por las cepas de interés, al ser evaluadas las

fracciones activas a diferentes concentraciones ...................................................................... 27

Tabla 9. Pruebas químicas cualitativas de las subfracciones activas de EU1 y EU2 .................... 29

Tabla 10. Compuestos de la Sf MeOH:H2Ob de EU1 .................................................................. 30

Tabla 11. Compuestos identificados en la Sf 3 de EU1 ................................................................ 31

X

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

μl Microlitros

ºC Grados Celsius

AcOEt Acetato de Etilo

ATCC American Type Cultur Collection

BuOH Butanol

CC Cromatografía en Columna

CCD Cromatografía en Capa Delgada

CCV Cromatografia en Columna al Vacío

CH2Cl2 Diclorometano

DMSO Dimetilsulfóxido

EtOH Etanol

FE Fase Estacionaria

FM Fase Móvil

Fr. Fracción

CG-EM Cromatografía de Gases acoplada a Espectrómetro de Masas

MeOH Metanol

m.s.n.m Metros sobre el nivel de mar

mg. Miligramos

ml Mililitros

MTT Sal de Tetrazolium

Rf Factor de retención

Sf. Subfracción

UV Ultravioleta

1

RESUMEN

Este estudio, enmarcado dentro de la investigación realizada por el Grupo de Investigación en

Fitoquímica (GIFUJ) y el Centro de Investigaciones Odontológicas (CIO), titulado “Evaluación

de la actividad antibacteriana de extractos y fracciones obtenidos de dos especies de la familia

Rubiaceae: Isertia laevis y Elaeagia utilis”, se evaluó la actividad antimicrobiana de extractos

obtenidos a partir de hojas de la especie Elaeagia utilis, colectadas en Albán (Cundinamarca).

La especie mostró actividad biológica del aceite esencial sobre S. mutans, del extracto petrol, del

floculo del extracto etanólico y de las fracciones del extracto etanólico obtenidas por

fraccionamiento líquido/líquido, sobre cepas relacionadas con la caries dental (Streptococcus

mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365). La fracción CH2Cl2 del

extracto etanólico fue la más activa biológicamente, por lo que fue rastreada en un segundo

individuo de la misma especie, colectado en otra localidad (Fusagasugá, Cundinamarca). A partir

de las fracciones CH2Cl2 del extracto etanólico de cada individuo de E. utilis, se llevaron a cabo

dos métodos diferentes de separación de clorofilas (uno para cada fracción), CCV con RP-18

(EU1), y Cromatografía en Columna con Sephadex LH-20 (EU2), obteniendo como resultado

una subfracción con actividad inhibitoria de cada individuo sobre las cepas de interés. Las

fracciones activas denominadas Sf. MeOH:H2Ob de EU1 y Sf. 3 de EU2, evidenciaron gran

similitud al ser monitoreadas con Cromatografía de Capa Delgada, y actividad biológica a

concentraciones hasta de 0.1mg/pozo. Por medio de técnicas químicas cualitativas se determinó

la presencia principalmente de terpenos y sesquiterpenlactonas en ambas fracciones, que también

fueron analizadas por CG-EM, encontrándose además la presencia de fenoles en la Sf.

MeOH:H2Ob.

PALABRAS CLAVE: Actividad antimicrobiana, Aceites esenciales, Caries dental, Extractos

vegetales, Rubiaceae.

2

1. INTRODUCCIÓN

El interés por la utilización de productos naturales para el tratamiento de enfermedades de

importancia pública ha sufrido un incremento en la actualidad, lo que en gran medida se sustenta

en la tendencia al desarrollo de tratamientos no convencionales que presenten resultados

efectivos a un menor costo, para que éstos puedan ser usados por la población que por barreras

económicas y geográficas, se ve seriamente afectada en el acceso a los servicios de salud.

Dentro de las enfermedades de mayor importancia tanto a nivel internacional como local, se

encuentra la caries dental, un proceso mediante el cual la microbiota (especialmente asociada a

los microorganismos de los géneros Streptococcus y Lactobacillus) como principal agente

etiológico, en interacción con el huésped y la dieta, generan la producción de ácidos que llevan a

la desmineralización de los dientes, y por tanto a la destrucción de los tejidos duros dentales

(Rodríguez & González, 2000). Varios agentes antisépticos entre los que se incluyen la

clorhexidina, los fluoruros y los derivados del fenol, se han utilizado extensamente en

odontología para inhibir crecimiento bacteriano, sin embargo en algunas ocasiones estas

sustancias acarrean efectos secundarios entre los que se incluyen diarrea, vomito y coloración de

mucosas y dientes, además del desarrollo de cepas resistentes a estos tratamientos (Aliviano &

Aliviano, 2009).

Una de las alternativas en la lucha contra la resistencia, es el desarrollo de nuevos compuestos

antimicrobianos a través de la obtención de principios activos o de compuestos de plantas que

puedan servir como antimicrobianos, brindando además de especificidad contra el patógeno, la

seguridad para el consumidor. De allí que el desarrollo a nivel científico que se ha dado en los

últimos años en la extracción y el estudio de fracciones vegetales, además de ser una potencial

fuente de desarrollo de nuevos agentes efectivos, produce una alta receptividad del público hacia

el posible uso de drogas o productos antimicrobianos derivados de plantas (Machado et al.,

2005).

Teniendo en cuenta la diversidad vegetal de nuestro país, y la utilización y reconocimiento de

algunas especies por parte de las comunidades, este proyecto plantea la evaluación

3

antimicrobiana de extractos, fracciones y subfracciones a través de la técnica de difusión en pozo,

de la especie Elaegia utilis, sobre los principales microorganismos envueltos en el desarrollo de

la caries dental, así como el estudio químico preliminar de la(s) fracción(es) activa(s), como un

preámbulo al reconocimiento de los metabolitos secundarios responsables de dicha actividad.

2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la actualidad se ha venido presentando una tendencia creciente en la utilización de productos

naturales para el tratamiento de enfermedades de importancia pública. Esta preferencia según

Hamburger y Hostettmann (1991), proviene de básicamente tres razones fundamentales: la

exploración y conocimiento de la naturaleza como fuente de una amplia variedad de moléculas

bioactivas, el interés en terapias no convencionales que dejen a un lado los productos sintéticos y

la eficacia demostrada de un gran número de preparaciones fitofarmacéuticas.

Una de las enfermedades públicas más comunes dentro de nuestro país es la caries dental, la cual

Rodríguez y González (2000) definen como un proceso patológico infecciosos localizado y

transmisible que resulta de la interacción de cuatro factores principales: la dieta, el huésped

(diente), la saliva y la microbiota bucal, siendo esta última de gran importancia; en particular,

para el desarrollo de esta enfermedad la microbiota se asocia a la presencia de especies de

estreptococos y Lactobacillus orales. Aunque existen productos químicamente sintéticos de gran

efectividad para la eliminación de los microorganismos mencionados, es conocido que su uso

excesivo puede llevar a la alteración de la flora oral benéfica, a alteración de la flora intestinal,

así como a procesos de resistencia bacteriana (Alvarado et al., 2008).

Los efectos negativos que se reconocen del tratamiento de la caries con productos sintéticos, ha

impulsado la necesidad de buscar nuevas alternativas provenientes de plantas, que presenten la

misma efectividad de los antibióticos comerciales. Precisamente, la realización de estudios

fitoquímicos ha permitido determinar la presencia de compuestos con actividad antimicrobiana en

algunas especies de la familia Rubiaceae contra microorganismos relacionados con la caries

(Alvarado et al., 2008). Aún cuando el género Elaeagia que pertenece a la familia Rubiaceae,

4

está ampliamente distribuido en nuestro país y es de fácil acceso para las comunidades quienes lo

reconocen por la generación de resinas que son utilizadas en actividades artesanales, no ha sido

corroborado bajo estudios fitoquímicos si sus especies tienen principios activos contra

microorganismos de importancia patológica.

El primer paso para el reconocimiento de la actividad biológica de moléculas o compuestos de

origen vegetal, está en la ejecución de estudios biodirigidos, en los cuales se utilizan extractos y

fracciones obtenidos del material vegetal con solventes orgánicos, para la evaluación biológica y

la posterior identificación de la presencia de metabolitos secundarios, que sean capaces de inhibir

el crecimiento de los patógenos de interés. Es por esto que en este proyecto se plantea evaluar la

actividad antimicrobiana de la especie Elaeagia utilis sobre los principales microorganismos

causantes de caries dental (Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus

acidophilus), para reconocer si esta especie presenta sustancias o compuestos químicos con dicha

propiedad, y siendo este el caso, para identificar cuál es la fracción activa y así caracterizarla

químicamente, lo cual contribuirá para el avance en la búsqueda de principios que tengan

actividad farmacológica y para la posterior generación de beneficios sociales y económicos para

la comunidad, a través del acercamiento a nuevas alternativas de tratamiento.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 Salud pública: El problema de acceso a los servicios

Son muchas las enfermedades de salud pública que afectan seriamente a las poblaciones

humanas, no solo desde el punto de vista de la salud, sino también desde el contexto económico y

social. Las consideraciones de equidad han estado presentes frecuentemente en las discusiones

sobre salud y en los avances en los indicadores de los sistemas de seguridad social, ya que sin

duda en nuestro país persisten desigualdades entre muchos grupos de la población, siendo el

acceso a servicios, una de las dimensiones en las cuales se observan mayores discrepancias

(Mejía-Mejía et al., 2007).

5

En el régimen subsidiado uno de los mayores causantes de la inequidad para el acceso a servicios

de salud, son las barreras económicas y geográficas que suponen un obstáculo importante, de

modo que aunque la persona pueda llegar a consulta médica, tiene dificultades para continuar y

finalizar de forma adecuada el proceso (Céspedes et al. 2000, Mejía-Mejía et al. 2007).

Esta problemática es evidente en los servicios de salud oral, en donde los indicadores sociales

muestran tener una asociación positiva y significativa con la frecuencia de lesiones severas de

caries; así, la caries es más frecuente en los grupos socioeconómicos bajos, mientras que los

niveles sociales más altos registran los valores más bajos de prevalencia (López et al., 2005).

Esta problemática se da por la dificultad en el acceso a la atención dental, servicio normalmente

de alto costo si no se dispone de un servicio asistencial brindado por alguna institución (Céspedes

et al., 2000), además por el bajo acceso a los fármacos tradicionalmente utilizados para el control

de la caries de origen sintético, como lo son las aplicaciones tópicas fluoruradas (Batellino et al.,

1997), o el uso constante de colutorios y demás productos orales que reduzcan la placa

bacteriana.

3.2 Caries dental

La caries dental se define como un proceso patológico infeccioso, localizado, poseruptivo y

transmisible, que termina con la destrucción de los tejidos duros dentales y que se origina como

resultado de cuatro factores principales como lo son la microbiota, el substrato (dieta), el huésped

(diente) y el medio ambiente (saliva) (Rodríguez & González, 2000). La destrucción del tejido

dental esta medida por ácidos que son producto de la fermentación de los carbohidratos de la

dieta por parte de los microorganismos de la placa bacteriana (Chaves et al., 2000).

Los microorganismos implicados en el proceso de la caries dental están localizados en un biofilm

complejo que cubre la superficie del diente, y de acuerdo a su potencial cariogénico, las bacterias

que ocupan esta capa pueden ser clasificadas, siendo los Estreptococos, los microorganismos más

estrechamente ligados con esta patología, especialmente Streptococcus mutans y Streptococcus

sobrinus, aunque también bacterias de tipo Lactobacillus spp y Actinomyces spp, juegan un papel

importante en el desarrollo de esta enfermedad (Chaves et al., 2000).

6

Se reconoce que dentro del grupo de estreptococos la especie mutans (especialmente el serotipo

c), y en menor proporción sobrinus, son las más relacionadas con caries (se ha demostrado que la

relación de S. mutans con caries dental en humanos está entre el 74% al 100%) (Chaves et al.,

2000). Los Streptococcus son microorganismos no móviles y esféricos, Gram positivos que

tienen un diámetro de 0.5 a 0.75μm y presentan formas variables entre coco y bacilo (Chaves et

al. 2000). Los factores de virulencia mas involucrados en la producción de caries por parte de

estas bacterias son: acidogenicidad (capacidad de producción de ácidos), acidofilicidad (apetencia

a los ácidos), aciduridad (tolerancia a los ácidos), síntesis de glucanos y fructanos, síntesis de

polisacáridos intracelulares, producción de dextranasa y fructanasa, y presencia de

glucosiltransferasas, proteínas de adhesión celular y proteínas fijadoras de glucano (Chaves et al.

2000, Delgado 2000). El poder cariógeno de los estreptococos del grupo mutans es, aunque con

algunas diferencias, muy similar en todas las especies y está ligado a la sacarosa, ya que tiene la

capacidad de metabolizarla mucho más rápidamente que cualquier otro microorganismo de la

cavidad oral (Liébana, 2000), desarrollando rápidamente la patología.

El grupo de los Lactobacillus, se constituye por microorganismos bacilares Gram positivos no

espolurados (Chaves et al., 2000), y aun cuando no es claro su papel en la iniciación de la caries,

se reconoce que son colonizadores primarios de las mucosas orales; para estas bacterias se

reconoce que los factores de cariogenicidad que relacionados son el poder acidogénico

(producción de acido láctico), el acidofílico y el acidúrico (Delgado, 2000).

La caries es una de las diez primeras causas de consulta, siendo la primera causa de morbilidad

entre las enfermedades de los dientes y tejidos de los niños de 5 a 14 años Gamboa (2000). En

Colombia el 60.4% de los niños de 5 años tiene historia de caries, acrecentando la proporción a

medida que la edad aumenta (a los 7 años es de 73.3%, a los 12 se presenta una ligera

disminución -71.9%-, y de los 15 a los 19 años aumenta hasta un 89.5%) (Gamboa, 2000).

Estos resultados muestran una alta prevalencia de caries en la población colombiana,

especialmente en estratos bajos (los mayores índices son en los estratos comprendidos entre 2.7 y

2.3), lo cual se constituye en un grave problema de salud pública, en la medida en que la

7

rehabilitación de estos pacientes constituye un costo económico muy grande para el país,

especialmente cuando no se brinda una cobertura total de asistencia (Gamboa, 2000).

3.3 Fármacos sintéticos para el tratamiento de la caries

La formación de la placa bacteriana es el inicio de una serie de acontecimientos que pueden

llevar a la aparición de la caries dental, así como de otras patologías bucales de importancia

(Rodríguez & González, 2000); existen múltiples grupos de sustancias químicas utilizadas en el

control de la placa bacteriana, a través de la detención o retraso de la proliferación bacteriana con

antimicrobianos; entre ellos los más utilizados son los antibióticos (penicilina, vancomicina,

espiramicina, etc.), compuestos de amonio cuaternario (cloruro de cetilpiridinio, cloruro de

benzalconio), el triclosán, los fluoruros, la hexetidina, la clorhexidina, los compuestos fluorados,

y los fenoles y aceites esenciales (Bascones & Morantes, 2006). Sin embargo, el uso de estas

sustancias químicas puede generar una serie de efectos colaterales indeseados en los pacientes.

Los antibióticos tradicionales como vancomicina y penicilina, que aunque son efectivos en el

control de placa bacteriana, debido a la tendencia hacia la automedicación y por tanto a una

terapia mal dirigida, han demostrado tener efectos que van desde diarreas y reacciones alérgicas,

hasta la muerte (Macín-Cabrera et al., 2006). El efecto adverso más común asociado al mal uso

de los medicamentos, es el aumento en las cepas resistentes de la flora endógena así como

alteración de la composición de la flora normal, con lo que se favorece la implantación de los

microorganismos patógenos (Macín-Cabrera et al., 2006).

Por su parte otro tipo de compuestos químicos para el tratamiento de la placa bacteriana también

presentan efectos negativos, como la tinción de los dientes (compuestos de amoniaco cuaternario,

clorhexidina, fenoles y aceites esenciales) o de las mucosas bucales (clorhexidina), sensación de

quemazón en la mucosa bucal (compuestos de amoniaco cuaternario), lesiones ulcerosas

(hexedetina), bajo efecto inhibitorio de la placa (triclosán, fluoruros), y efectos erosivos sobre el

esmalte (fenoles y aceites esenciales) (Enrile & Santos-Alemany 2005, Macín-Cabrera et al.

2006).

8

3.4 Productos naturales como nuevas alternativas en el tratamiento de enfermedades

El uso tradicional de plantas para tratar ciertas enfermedades es bastante reconocido en la historia

de la humanidad, y aún hoy las especies vegetales son la fuente más frecuente de medicamentos

para la mayoría de la población mundial (Hamburger & Hostettmann, 1991). Luego de décadas

de uso empírico de las preparaciones herbales, en el siglo XIX comienza el interés por aislar los

principios activos de ciertas especies de plantas, creando una nueva línea de investigación

fitoquímica que causó gran impacto, pero que fue reemplazado en los años 30 por el desarrollo de

una industria farmacéutica sintética (Phillipson, 2001).

Históricamente los productos de origen vegetal han pasado de tener un papel hegemónico en el

arsenal terapéutico occidental a un discreto segundo plano, para volver a tener, en las últimas

décadas, una presencia cada vez mayor (Cañigueral et al., 2003). Este nuevo auge en parte se ha

dado por el reconocimiento de una gran variedad de especies que proveen sustancias que

tradicionalmente se han usado para determinados fines, así como también por la demanda de

terapias no convencionales que se basan en la igualdad de efectividad y menor cantidad de

efectos colaterales, de los productos naturales (como la valeriana o el ginkgo) respecto a los

sintéticos, lo que originó que las compañías farmacéuticas mostraran un renovado interés en las

plantas como fuente de nuevas estructuras (Hamburger & Hostettmann, 1991), que puedan

utilizarse o al menos proveer guías para análogos sintéticos o semisintéticos (Phillipson, 2007).

3.5 Extractos vegetales, aceites esenciales y actividad antimicrobiana

Se reconoce que las plantas producen más de 100.000 productos naturales de bajo peso

molecular, también conocidos como metabolitos secundarios, que se diferencias de los primarios

en que no son esenciales para la vida del organismo (Domingo & López-Brea, 2003), y los cuales

han sido estudiados en busca de funciones particulares que puedan ser aplicadas en la industria

farmacológica.

Los estudios biodirigidos, son una fuente útil de reconocimiento de fracciones activas en las

cuales se reconocen metabolitos secundarios con actividad biológica; en éstos, el uso de

fracciones o extractos obtenidos del material vegetal (obtenidos a través del tratamiento o

contacto con solventes orgánicos de diferentes polaridades), permiten el fraccionamiento de

9

compuestos de acuerdo a la polaridad del solvente, para la posterior evaluación biológica y la

identificación de metabolitos secundarios de interés (Cos et al., 2006).

A la fecha han sido reportados muchos casos en los que se les atribuye a determinados

compuestos de origen vegetal una acción antimicrobiana, entre ellos los aceites esenciales, como

mezclas de compuestos naturales volátiles, que además de antifúngicos y antibacterianos,

también se han reportado como antiinflamatorios, antiespasmódicos y relajantes en humanos y

animales (Aliviano & Aliviano, 2009). Así mismo, compuestos particulares son reconocidos por

sus actividades biológicas, entre ellos las catequinas presentes en el té verde (Camellia sinensis),

que ejercen actividad frente a Vibrio cholereae, Streptococcus mutans entre otros

microorganismos, el mentol que se obtiene de la menta (Menta piperita), la capsaicina del chile

(Capsicumm annuum), ambos compuestos fenólicos simples, y los taninos presente en el

eucalipto (Eucalyptus globulus) quienes también puede inhibir bacterias y hongos (Domingo y

López-Brea, 2003).

El descubrimiento de una acción antimicrobiana de sustancias o moléculas de origen vegetal, ha

impulsado una industria farmacéutica natural que cada vez tiene más seguidores; entre 1983 y

1984, de las 520 nuevas drogas aprobadas el 39% fueron productos naturales o sus derivados, y

además se reconoce que del 60 a 80% de drogas antibacterianas como la sinvastatina, lovastatina,

enalapril, ciprofloxacina y ciclosporina, y de anticancerígenos como el taxol y el docetaxol, son

derivados de productos naturales (Araújo & Salas, 2008).

3.6 Extractos vegetales y microorganismos de cavidad oral

Muchas sustancias obtenidas a partir de especies vegetales ya han demostrado su alta actividad

antimicrobiana y son actualmente comercializadas en forma masiva, entre estas están la

sanguinarina, mentol y timol, sustancias que forman parte de productos para el cuidado bucal; sin

embargo para el caso de la sanguinarina, el uso industrial se ha reducido ya que esta sustancia ha

sido asociada con la lesiones precancerosas orales, por lo que definitivamente se ha hecho

necesaria la búsqueda de otros agentes antibacterianos naturales que a su vez sean seguros para

los humanos y específicos para los patógenos orales (Chung et al., 2006)

10

La búsqueda de sustancias que cumplan los criterios antes mencionados, es la principal razón

para el continuo estudio de especies vegetales relacionadas con la inhibición de patógenos orales,

fijando la atención especialmente en las plantas del “Nuevo mundo”, particularmente las de las

regiones tropicales, debido a la alta diversidad biológica presente en ellas y al hecho de que aún

hoy permanezcan en parte desconocidas (Lapenna et al., 2003).

A nivel latinoamericano con base en antecedentes etnobotánicos, se han realizado varios estudios

con especies nativas, entre ellos se encuentra el caso de Rubus urticaefolius (mora), de la cual se

evaluaron extractos hidroalcohólicos de frutos, hojas y tallos para tratamiento de afecciones

orales en centro y Suramérica (De Paula & Martínez, 2005). En el estudio antes mencionado se

demostró que el fruto en especial, produce halos de inhibición en cultivos de Bacillus subtillis,

Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus. En Brasil

estudios fitoquímicos de las especies Mikania laevigata y Mikania glomerata, evidenciaron

inhibición del crecimiento y adherencia celular de Streptococcus mutans, S. sobrinus y S.

cricetus, debido a la presencia de los ácidos coumárico, curpesénico, diterpénico y kaurenoico, en

la fracción hexano (Yatsuda et al., 2005).

En Colombia, también se han efectuado estudios para evaluar fracciones vegetales contra

microorganismos orales, uno de estos es el de Alvarado et al. (2008), quienes a partir de

fracciones de Isertia laevis (Rubiaceae), realizaron una evaluación fitoquímica y microbiológica

contra 18 cepas bacterianas pertenecientes a los géneros Streptococcus, Lactobacillus y

Actinomyces, encontrando actividad en la fracción Metanol-Agua sobre todas las cepas, tanto con

métodos de difusión como de dilución lo que es un buen indicador de actividad in vivo. Estos

resultados indican la presencia de compuestos presentes en diferentes especies vegetales que

tienen efecto antimicrobiano contra microorganismos orales, abriendo la puerta hacia el estudio

de alternativas naturales para el tratamiento de patologías bucales de importancia, como lo es la

caries dental.

11

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos, fracciones y subfracciones obtenidas a partir de

hojas de Elaeagia utilis sobre las cepas bacterianas de cavidad oral Streptococcus mutans ATCC

25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, la cuales se encuentran asociadas a la caries

dental.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtener extractos y fracciones a partir de las hojas de dos individuos de la especie Elaeagia

utilis, colectadas en dos localidades del departamento de Cundinamarca, Albán y Fusagasugá.

Obtener el aceite esencial, a partir de hojas de uno de los individuos de la especie de estudio.

Evaluar el efecto antimicrobiano sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L.

acidophilus 903 ATCC 4365, de las fracciones obtenidas a partir de hojas de Elaeagia utilis.

Evaluar el efecto antimicrobiano sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 de los aceites

esenciales obtenidos a partir de hojas de Elaeagia utilis.

Realizar un estudio químico cualitativo preliminar a la fracción o fracciones que resulten activas

contra S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, para reconocer los

tipos de metabolitos secundarios presentes en los mismos.

Determinar la concentración mínima inhibitoria de la fracción(es) activa(s), contra Streptococcus

mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365.

12

5. METODOLOGÍA

5.1 Sujeto de estudio: Elaeagia utilis

Esta especie pertenece a la familia Rubiaceae, una de las familias más diversas ecológica y

taxonómicamente a nivel mundial, lo cual implica una alta riqueza de especies y presencia en

diversidad de ecosistemas, especialmente en los bosques andinos y húmedos tropicales (Mendoza

et al., 2004).

El género se distribuye a lo largo de Centro América, Cuba, Colombia, Venezuela, Guyana,

Suriname, Ecuador, Perú, Brasil y Bolivia, con alrededor de 19 especies, de las cuales se hallan

unas 11 en Colombia, la mayoría de ellas en la región Andina, aunque también se encuentran en

la Amazonía y el Chocó biogeográfico, creciendo entre los 100 y los 2.600 m de altitud (Taylor

& Steyermark 2004, Mendoza et al. 2004).

La especie Elaeagia utilis, en nuestro país se distribuye ampliamente desde los 100 a los 3000m,

en los departamentos de Antioquia, Boyacá, Chocó, Cundinamarca, Huila, Meta, Nariño,

Putumayo, Risaralda, Santander, Tolima y Valle del Cauca (Jiménez, 2002). En el sur de

Colombia se le conoce como “Barniz” o “Mopa-mopa”, por su particularidad de producir resina;

según Mendoza et al. (2004) esta especie es utilizada como maderable para construcciones o

postes.

5.2 Obtención de fracciones

5.2.1. Material vegetal

Se colectaron en campo muestras de hojas de Elaeagia utilis, en el Departamento de

Cundinamarca, Municipio de Albán, Verdeda Java, en la Fundación Granjas Infantiles del Padre

Luna. La determinación taxonómica para este ejemplar fue realizada por N. García del Herbario

de la Pontificia Universidad Javeriana como Elaeagia utilis (Goudot) Wedd, encontrándose un

ejemplar depositado en el Herbario de esta institución, con el No. HPUJ 27413. El material de

hojas fue secado a temperatura ambiente, y posteriormente molido y pulverizado con la ayuda de

un molino de cuchillas.

13

5.2.2 Obtención de aceites esenciales, extractos y fracciones

El aceite esencial, extractos y fracciones a partir de las hojas de Elaeagia utilis se obtuvieron en

el Laboratorio de Fitoquímica de Facultad de Ciencias Básicas de la Pontificia Universidad

Javeriana, de acuerdo al siguiente protocolo:

- Obtención del aceite esencial: A partir de 200g de hojas secas y molidas de E. utilis, se realizó

el montaje de destilación en corriente de vapor, para la extracción del aceite esencial.

Obteniéndose aproximadamente 2.4 mg en peso seco del mismo.

- Obtención de extracto éter de petróleo: Del material vegetal seco y molido por maceración en

frio con éter de petróleo, se obtuvo un extracto en éter de petróleo para ambos individuos, que se

concentró en un rotavapor a presión reducida para posteriormente ser llevado a sequedad. El

extracto seco fue pesado y disuelto en éter de petróleo para ser floculado con EtOH durante 24

horas, luego de las cuales fue filtrado y concentrado en rotavapor hasta llevar a sequedad.

- Obtención de extracto etanólico: Del marco desengrasado, por maceración en frío con Etanol

(EtOH), se obtuvo un extracto etanólico, el cual fue concentrado a presión reducida en rotavapor

para conocer el peso seco del mismo. El extracto seco fue disuelto en etanol y fue floculado con

agua destilada durante 24 h, para posteriormente ser filtrado y concentrado en rotavapor hasta

sequedad.

- Obtención de las fracciones:

a) A partir del extracto en éter de petróleo, se tomó 1g que se pasó por una columna

cromatográfica al vacío con fase estacionaria sílica gel H-60, en proporción 30:1 de Fase

Estacionaria:Muestra, eluyéndose con solventes de diferentes polaridades, Éter de petróleo

(Petrol, 100ml), Petrol:Diclorometano (Petrol:CH2CL2, 150ml), CH2CL2 (200ml),

CH2CL2:Acetato de Etilo (CH2CL2:AcOEt, 100ml), AcOEt (100ml), AcOEt:Etanol

(AcOEt:EtOH, 150ml) y EtOH (150ml) (Figura 1).

b) El flóculo obtenido a partir del extracto etanólico, también fue fraccionado por columna

cromatográfica al vacío con fase estacionaria sílica gel H-60, en proporción 30:1 de Fase

14

Estacionaria:Muestra, eluyéndose con Petrol (100ml), Petrol: CH2CL2 (200ml), CH2CL2 (100ml),

CH2CL2:AcOEt (100ml), AcOEt (150ml), AcOEt:EtOH (100ml) y EtOH (100ml), para la

obtención final de las fracciones Petrol, Petrol: CH2CL2 , CH2CL2:AcOEt, AcOEt, AcOEt:EtOH

y EtOH.

Figura 1. Marcha fitoquímica E. utilis.

c) A partir del extracto etanólico obtenido, se realizó fraccionamiento líquido/líquido continuo

(Figura 1), con Éter de petróleo, CH2CL2, AcOEt y Butanol (BuOH). Cada una de las fracciones

fue concentrada a 40ºC, bajo presión reducida en rotavapor hasta llevarlas a sequedad.

15

5.3 Métodos de caracterización química de subfracciones activas

5.3.1. Pruebas cualitativas

A la subfracción activa se le realizaron las siguientes pruebas químicas cualitativas:

a) Prueba de Baljet (terpenos y esteroles): 3 o 4 gotas de una mezcla de dos soluciones (A: 1g

ácido pícrico y 100ml de etanol y B: 10g NaOH en 100ml de H2O), fueron agregadas a las

fracciones a evaluar. Se presenta un cambio de coloración que varía de naranja a rojo oscuro

cuando la detección resulta positiva (Domínguez, 1973).

b) Lieberman – Burchard (Esteroides y esteroles): El reactivo compuesto por 1ml de Anhídrido

acético y 1ml de cloroformo, fue agregado junto con una gota de H2SO4. De ser positiva se

producen cambios de coloración (rosa, violeta, azul y verde) (Domínguez, 1973).

c) Salkowsky (Terpenos): 1-2 mg de muestra se disolvieron en 1 ml de cloroformo. A la solución

se le agregó 1ml de H2SO4. La prueba positiva evidencia cambios de color amarillo o rojo

(Domínguez, 1973).

d) Molibdato de amonio (Diterpenos): Se preparó un reactivo con 10g de Molibdato de Amonio

en 100ml de H2SO4, con el cual se reveló una placa cromatográfica con la muestra. El cambio

a coloración azul indica la presencia de diterpenos.

e) Cloruro Férrico (FeCl3) (Flavonoides y fenoles): a 1-2mg de muestra en etanol, se agregaron

entre 3 y 4 gotas de FeCl3. Se debe producir un cambio a color verde intenso cuando el

resultado es positivo.

f) Dragendorff (Alcaloides): se disolvieron 8 g de Bi(NO3)3 5H2O en 20ml de HNO3 al 30% y

27.2g de KI en 50ml de agua. Se mezclaron las dos soluciones y se dejan reposar 24 horas. De

ser positivo se presenta un precipitado naranja a rojizo (Domínguez, 1973).

g) Prueba de espuma (Saponinas): En un tubo de ensayo se disolvió extracto en 10ml de agua

destilada; se agitó por 30 segundos. La aparición de espuma mayor por más de 15 minutos

luego de la agitación indica la presencia de estos compuestos en la muestra.

h) Antrona (Glicósidos): En un tubo de ensayo con extracto se deja resbalar una solución de no

más de 24 horas de Antrona al 0.01% en ácido sulfúrico concentrado. La presencia de

glicósidos se evidencia por un anillo azul verdoso en la interfase.

i) Hidroxamato férrico (Sesquiterpenlactonas): A la solución o extracto se añadió una gota de

una solución metanólica 2N de clorhidrato de hidroxilamina y una gota de solución metanólica

2N de hidróxido de potasio. La mezcla se calentó a baño de María, y se aciduló con ácido

16

clorhídrico 0.5N, añadiéndose una gota de cloruro férrico al 1%. Se presenta un cambio a

color café o violeta cuando se detectan estos compuestos (Domínguez, 1973).

5.3.2. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas

La subfracción activa así como el aceite esencial obtenido a partir de hojas de E. utilis, se

analizaron en un cromatógrafo de gases Agilent Technology 6850 serie II acoplado a un

espectrómetro de masas Agilent 5975B, empleando un método de inyección manual con

temperatura inicial de 800C durante 2 minutos, seguido de una rampa de calentamiento de 10

0C

por minuto hasta 2800C donde se mantuvo durante 5 minutos. Modo de inyección Split 15:1,

columna capilar de sílice fundida, TR-50MS de 30 m x 0,25 mm (d.i.) x 0,25 μm (df) con fase

estacionaria 0%fenilpolisilfenilenesiloxano. Gas de arrastre: Helio 99% Aga Fano, S.A. flujo

constante 1ml/min. Espectros de masas se obtuvieron por impacto de electrones (EI) de energía

de 70eV. Reconocimiento de compuestos por comparación con los registrados en la base de

datos Willey7

5.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de las fracciones

5.4.1 Cepas a evaluar

Tres cepas de cavidad oral (Streptococcus mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903

ATCC 4365), suministradas por el Centro de Investigaciones Odontológicas (CIO) de la

Pontificia Universidad Javeriana fueron evaluadas.

5.4.2 Evaluación de la actividad antimicrobiana: método de difusión en pozo

La actividad antimicrobiana de los extractos, fracciones y subfracciones así como de los aceites

esenciales frente a las bacterias, se realizó de acuerdo al método de difusión en pozo descrito por

Dobner et al. (2003), en el cual a partir de un cultivo puro de cada una de las bacterias a evaluar,

se realizó una suspensión ajustada por turbidimetría a la escala 0.5 de Mac Farland. De esta

suspensión se tomaron 100 ul que se agregaron a 20 ml de agar Mueller Hinton (líquido), que se

mezcló y se sirvió en cajas de Petri. Luego de solidificar y después de esperar un lapso de 20 -

30 minutos, se realizaron pozos de 0.5 cm de diámetro sobre el agar usando una pipeta de Pasteur

de vidrio previamente esterilizada. En cada pozo en forma independiente se aplicaron 50 µl del

extracto, fracción o subfracción disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO), utilizando como control

17

positivo 50 µl de Vancomicina y como control negativo 50 µl DMSO. Seguidamente, las cajas

se incubaron a 37º C durante 24 horas, tiempo después del cual se revelaron las cajas, agregando

a su superficie sal de tetrazolium (MTT) como indicador de viabilidad de las bacterias (Thorn et.

al, 1993), preparada con solución acuosa a una concentración de 2.5mg/ml, dejándose incubar

durante seis horas más. Después de la incubación, se determinó la presencia o ausencia de zonas

de inhibición y el tamaño de las mismas. Cada ensayo se realizó por duplicado.

5.4.3 Evaluación del efecto antimicrobiano de la subfracción activa sobre el crecimiento de las

cepas de interés por Bioautografía

La subfracción que resultó positiva para la actividad antimicrobiana por el método de difusión en

pozo, también fue evaluada mediante Inmersión de Bioautografía, método descrito por Cos et. al

(2006) y Valgas et al. (2007) en donde se siembran placas cromatográficas de 7,5 cm de largo x

2,5 cm de ancho, con la fracción de interés. Se utilizó como FE: sílica gel y como FM:

CH2Cl2:MeOH (9:1). Las placas cromatográficas fueron expuestas a radiación U.V (λ 260nm)

durante 30 minutos, como método de esterilización.

Se siguió el mismo método de suspensión e inoculación bacteriana en el medio, que el ya

descrito. Se sirvieron 10 ml del agar inoculado en cada caja de petri, en donde previamente se

colocaron las placas cromatográficas. Posterior a 24 horas de incubación, se revelaron las

bioautografías con MTT, incubando durante 6 horas más. Finalmente a las zonas de inhibición

de la placa cromatográfica que no presentaban coloración por el MTT, les fue medido el Rf

(distancia recorrida por el soluto/distancia recorrida por el solvente).

6. RESULTADOS

6.1 Aceite esencial

6.1.1 Evaluación microbiológica

La evaluación microbiológica del aceite esencial extraído a partir de hojas de E. utilis, fue

realizada solamente sobre S. mutans, a una concentración final de 1mg/pozo, debido al bajo

18

rendimiento obtenido en la extracción. El aceite esencial mostró un halo de inhibición que

alcanzaba los 9mm de diámetro (Figura 2).

Figura 2. Halo de inhibición del aceite esencial, a una concentración de 1mg/pozo.

6.1.2 Caracterización por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas

Se analizó por CG-EM, una muestra de 1μL del aceite esencial de E. utilis, cuyos cromatograma

y espectros de masas de los compuestos mayoritarios identificados se encuentran en el Anexo 2.

La Tabla 1 relaciona los trece compuestos mayoritarios, con un porcentaje de coincidencia mayor

al 90%, identificados por CG-EM en dichas mezcla.

Tabla 1. Compuestos mayoritarios encontrados dentro del Aceite esencial de E. utilis.

TR Pico

No. Nombre

% del

área

total

Coincidencia Tipo de

compuesto

6.786 25 Ácido 2-hidroxibenzoico, metil ester 7.666 96 Ester

aromático

8.824 47 3-Alil-6-metoxifenol 4.403 98 Fenol

8.824 47 Eugenol 4.403 97 Fenol

8.824 47 2 metoxi-4-(1-propenil)fenol (isoeugenol) 4.403 97 Fenol

19.439 105 Ácido 2-hidroxi benzoico, fenilmetil ester 4.247 94 Ester

aromático

12.437 81 17-Octadecenal 3.685 91 Aldehído

12.437 81 Hexadecanal 3.685 95 Aldehído

graso

8.884 48 Ionona 2.874 91 Terpeno

5.039 6 Linalol 2.596 Terpeno

8.614 45 1-(2,6,6-Trimetil-1,3-ciclohexadien-1-il)-

2-buten-1-ona 2.482 98 Cetona

8.427 43 Betaionona 2.420 94 Terpeno

9.970 60 Irisona 2.113 93 Terpeno

4.158 1 Acido hexanoico 2.048 90 Ácido graso

19

6.2 Fracciones del extracto en éter de petróleo

Se realizó la evaluación microbiológica del extracto en éter de petróleo, así como de las

fracciones obtenidas por CCV del mismo (Petrol:CH2CL2, CH2CL2, CH2CL2:AcOEt, AcOEt,

AcOEt: EtOH y EtOH) (Cromatografías en el Anexo 5, Figura 1), sobre tres microorganismos de

referencia Gram-positivos de cavidad oral asociados con caries dental, S. mutans ATCC 25175,

S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, a una concentración de 10mg/pozo (Tabla 2),

encontrándose actividad en el extracto total, así como en las fracciones obtenidas con solventes

de mediana a alta polaridad.

Tabla 2 Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus

al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo, a una

concentración de 10mg/pozo.

Fracción S. mutans

ATCC 25175 S. sobrinus

L. acidophilus

903 ATCC

4365

Extracto total Extracto Éter de Petróleo 9,5 9 9

Fracciones

Petrol:CH2CL2 0 0 0

CH2CL2 0 0 0

CH2CL2:AcOEt 11 9 9

AcOEt 8,5 9 7

AcOEt: EtOH 15 8,5 8

EtOH 11 8,5 8,5

Control positivo Vancomicina 19 17 19

Control negativo DMSO 0 0 0

6.3. Fracciones floculo extracto etanólico

Se realizó el ensayo microbiológico al flóculo del extracto etanólico, y a las fracciones obtenidas

del mismo por CCV (Petrol, Petrol: CH2CL2 , CH2CL2:AcOEt, AcOEt, AcOEt:EtOH y EtOH)

(Cromatografías en el Anexo 5, Figura 2), a una concentración final de 10mg/pozo (Tabla 3). Se

encontró actividad en el flóculo total, así como en las fracciones de polaridad baja a media,

20

siendo la fracción CH2CL2:AcOEt a, la que presentó una mayor actividad contra los tres

microorganismos.


al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del flóculo del extracto etanólico.

Fracción S. mutans


L. acidophilus

903 ATCC

4365

Extracto total Flóculo 9 9,5 9,5

Fracciones

Petrol:CH2CL2 10 10 9

CH2CL2:AcOEt a 15,5 15,5 15

CH2CL2:AcOEt b 9 10,5 9,5

AcOEt 9,5 10 9,5

AcOEt: EtOH a 0 0 0

AcOEt: EtOH b 0 0 0

EtOH 9 9 8,5

Control positivo Van 21,5 20,5 19,5

Control negativo DMSO 0 0 0

6.4 Fracciones obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico

Del fraccionamiento líquido/líquido realizado al extracto etanólico, se obtuvieron las fracciones

de Éter de petróleo, CH2Cl2, AcOEt y BuOH, además de unos precipitados obtenidos con el

fraccionamiento con AcOEt y BuOH, a los cuales se denominaron AcOEt(p) y BuOH(p). Se

realizó la evaluación, a una concentración final de 20 mg por pozo (Tabla 4, Figura 3).


S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2, AcOEt,

AcOet(p), BuOH y BuOH(p), obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto

Etanólico.

Fracción S. mutans


L. acidophilus

903 ATCC 4365

Frac. Éter de Petróleo 11,5 12 12

Frac. CH2CL2 15 17 20

Frac. AcOEt 13,5 11 13

Precipitado AcOEt 15,5 12 15,5

21

Frac. BuOH 13,5 11 12

Precipitado BuOH 0 0 0

Vancomicina 19 17 18

DMSO 0 0 0


líquido/líquido del extracto etanólico, a una concentración de 20mg/pozo.

6.5 Rastreo de la fracción CH2Cl2 en un segundo ejemplar de E. utilis

Debido a la actividad antimicrobiana presentada por las fracciones Éter de petróleo, CH2Cl2,

AcOEt y BuOH del extracto etanólico de E. utilis, se decidió realizar una comparación de las

mismas con fracciones obtenidas a partir de un segundo individuo de la misma especie,

colectado en una localidad diferente, Corregimiento La Aguadita, Fusagasugá, Cundinamarca.

La clasificación taxonómica de este segundo ejemplar fue realizada por J. Aguirre-Santoro del

Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia como Elaeagia utilis

(Goudot) Wedd, encontrándose una muestra depositada en el Herbario Nacional Colombiano con

el No. COL: 512351. Para este segundo individuo, se siguió una marcha fitoquímica similar,

para la obtención de cuatro fracciones a partir del extracto etanólico (Éter de petróleo, CH2Cl2,

AcOEt y BuOH). Debido a que se trabajó con dos ejemplares de la misma especie, se denominó

al colectado en Albán como EU1, y al colectado en Fusagasugá EU2.

Posteriormente, se realizó el montaje para evaluar la acción antimicrobiana de las cuatro

fracciones del fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico de EU2, sobre los mismos

0

5

10

15

20H

alo

s d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Fracciones evaluadas

S. mutans

S. sobrinus

L. acidophilus

22

microorganismos, bajo la misma concentración (20mg/pozo) (Tabla 5, Figura 4). La Figura 5

muestra los halos de inhibición de la fracción CH2Cl2, de EU1 y EU2 sobre L. acidophilus, luego

de ser revelados con MTT.


S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2, AcOEt

y BuOH, de EU2 obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto Etanólico.

Fracción S. mutans


L. acidophilus

903 ATCC 4365

Frac. Éter de Petroleo 12,5 13 10,5

Frac. CH2CL2 11 8,5 9

Frac. AcOEt 16 12 13

Frac. BuOH 10 10 9


DMSO 0 0 0


líquido/líquido del extracto etanólico de EU2, a una concentración de 20mg/pozo.

0

5

10

15

20

Petrol CH2CL2 AcOEt BuOH Van DMSO

Halo

s d

e in

hib

ició

n

Fracciones evaluadas

S. mutans

S. sobrinus

L. acidophilus

(a) (b)

23

Figura 5. Halos de susceptibilidad presentados por L. acidophilus al ser enfrentado a las

fracciones CH2CL2 de EU1 (a) y EU2 (b), a una concentración de 20mg/pozo.

6.6 Fraccionamiento de los extractos CH2Cl2 de EU1 y EU2

Debido a la actividad antimicrobiana presentada por las fracciones CH2Cl2 tanto de EU1 como de

EU2, se procedió a efectuar la separación de clorofilas de ambas, para reconocer si éstas eran las

responsables de la actividad. Se llevaron a cabo bajo dos métodos de separación, uno para cada

ejemplar; EU1 fue tratado con el método de retención por CCV con RP-18, y EU2 con el método

de exclusión por Cromatografía en Columna con Sephadex (Figura 6).

Figura 6. Esquema de separación de clorofilas realizado a las fracciones de CH2Cl2 de EU1 y

EU2.

La fracción CH2Cl2 de EU1 fue tratada por CCV, con FE: RP-18 y FM: MeOH:H2O (1500ml),

MeOH (100ml) y MeOH:CH2Cl2 (40ml), bajo una proporción 30:1, FE:Muestra. De esta

Elaeagia utilis

EU1

Fracción CH2Cl2

MeOH: H2O a

MeOH: H2O b

MeOH: H2O b (sobrenadante)

MeOH: H2O c

MeOH: H2O d

MeOH: H2O e

MeOH: H2O f

MeOH: CH2Cl2

CCV

FE: RP-18

FM: MeOH:H2O,

MeOH: CH2Cl2

Fraccionamiento L/L

EU2

Fracción CH2Cl2

Fr. 0

Fr. 1

Fr. 2

Fr. 3

Cromatografía en Columna

FE: Sephadex LH-20

FM: MeOH

Fraccionamiento L/L

24

columna se obtuvieron ocho subfracciones (MeOH:H2Oa, MeOH:H2Ob, MeOH:H2Oc,

MeOH:H2Od, MeOH:H2Oe, MeOH:H2Of y MeOH:CH2Cl2), que a pesar de ser en su mayoría

eluídas con el mismo solvente, bajo monitoreo en CCD, demostraron ser diferentes y se dejaron

como independientes (Cromatografías en el Anexo 5, Figura 3). Todas estas subfracciones

también fueron evaluadas microbiológicamente (Tabla 6, Figura 7). Se encontró una gran

actividad en las Sf. MeOH:H2Ob, la cual fue dividida en un precipitado (denominado

MeOH:H2Ob), y un sobrenadante llamado MeOH:H2O b(sobrenadante).


al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU1, a una concentración de 10mg/pozo.

Subfracción S. mutans


L. acidophilus

903 ATCC 4365

MeOH:H2O a 11,5 11,5 11,5

MeOH:H2O b 15 20 19,5

MeOH:H2O b(s) 17,5 16,5 16

MeOH:H2O c 0 0 0

MeOH:H2O d 0 0 0

MeOH:H2O e 0 0 0

MeOH:H2O f 0 0 0

MeOH:CH2Cl2 0 0 0

Van 21,5 19,5 18

DMSO 0 0 0

0

5

10

15

20

Halo

s d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Subfracciones evaluadas

S. mutans

S. sobrinus

L. acidophilus

25


EU1.

Para la fracción CH2Cl2 de EU2, se separaron las clorofilas por medio de Cromatografía en

Columna con FE: Sephadex LH- 20 y FM: MeOH, con una proporción 30:1, FE:Muestra. De

este fraccionamiento se obtuvieron 4 subfracciones (denominadas 0, 1, 2 y 3), que fueron

evaluadas sobre S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, a una

concentración de 20mg/pozo, exceptuando la Sf. 3, la cual debido a la cantidad obtenida tuvo que

ser ensayada a 10mg/pozo (Tabla 7, Figura 8 y 9). Los resultados arrojaron buena actividad para

la subfraccion 3 a pesar de que esta se ensayó a una concentración más baja, sin embargo debido

a la actividad biológica que también presentaron las Sfs. 1 y 2, éstas fueron monitoreadas por

CCD (Sílica gel, CH2Cl2:MeOH 10:1), y reveladas con vainillina (Figura 10), evidenciándose la

presencia de compuestos con Rf similares en las Sfs. 2 y 3, siendo la última una fracción libre de

clorofilas y otros componentes.


al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU2, a una concentración de 20mg/pozo,

exceptuando a la Sf. 3, la cual fue evaluada a 10mg/pozo.

Subfracción No. S. mutans


L. acidophilus

903 ATCC 4365

0 0 0 0

1 9,5 9,0 8,0

2 14,5 13 14

3 16 17 15


DMSO 0 0 0

26


EU1.

Figura 9. Halos de susceptibilidad presentados por (a) S. mutans, (b) S. sobrinus y (c) L.

acidophilus, al ser enfrentados a las Subfraccion No. 4 de CH2CL2 de EU1.

Figura 10. CCD (FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH (10:1)) revelada con vainillina, de las

subfracciones activas, obtenidas del fraccionamiento con Sephadex de la fracción CH2Cl2 de

EU2. Los recuadros indican los compuestos comunes entre las Sf. 2 y 3.

0

5

10

15

20

Sf 0 Sf 1 Sf 2 Sf 3 Van DMSOHalo

s d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Subfracciones probadas

S. mutans

S. sobrinus

L. acidophilus

(a) (b) (c)

1 2 3

27

6.7 Concentración mínima inhibitoria

Luego de reconocer la actividad antimicrobiana de las subfracciones MeOH:H2Ob de EU1 y Sf. 3

de EU2, sobre S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, se continuo

haciendo un tamizaje de la mismas fracciones a concentraciones de 1mg/pozo, 0.5mg/pozo y

0.1mg/pozo. En la tabla 8 y la figura 9 se observan los resultados de esta evaluación.

Tabla 8. Halos de susceptibilidad presentadas por las cepas de interés, al ser evaluadas las

fracciones activas a diferentes concentraciones.

Concentración

(mg/pozo)

1 0.5 0.1

EU1 EU2 EU1 EU2 EU1 EU2

S. mutans 16 13 15 11,5 12 9,5

S. sobrinus 17 12 12 10 10 9

L. acidophilus 18 12,5 10 9,5 9 8

Figura 11. Halos de inhibición sobre S. mutans producidos por la MeOH:H2Ob de EU1 (a), y la

Sf. 3 de EU2 (b), bajo concentraciones de 1mg/pozo, 0.5mg/pozo y 0.1mg/pozo.

(a) (b)

28

6.8 Bioautografías

La fracción MeOH:H2Ob de EU1, fue sembrada en placas de sílica gel, con FM: CH2Cl2:MeOH

(9:1), para la realización de pruebas bioautográficas contra S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y

L. acidophilus 903 ATCC 4365. Se logró observar un halo de inhibición, alrededor de los

compuestos que bajo UV de onda larga fluorecen con colores amarillo y rosado, y que poseen Rf

de 0,44 y 0,49 respectivamente (Figura 10).

Figura 12. Bioautografía de la Sf. MeOH:H2Ob de EU1, con FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH

(9:1). A) Cromatografía revelada con Vainillina. B) Placa cromatográfica con indicador de

fluorescencia (254) bajo luz UV de onda larga, con los Rf de los compuestos fluorescentes. C y

D) Bioautografía de S. mutans y L. acidophilus, reveladas con MTT

6.9 Estudio químico de las subfracciones activas

6.9.1 Cromatografía en capa delgada

Las subfracciones de CH2Cl2 más activas de EU1 (MeOH:H2Ob y MeOH:H2Ob(s)) y EU2 (Sf. 4)

fueron comparadas mediante CCD (Figura 11), evidenciándose una gran similaridad entre las

subfracciones MeOH:H2Ob de EU1 y la Sf. 3 de EU2.

6.9.2 Estudio químico cualitativo de las subfracciones activas

En la tabla 9 se presenta el análisis químico cualitativo realizado a las subfracciones activas de

EU1 y EU2 (correspondiente a MeOH:H2Ob y Sf. 3 respectivamente). En este se evidencia la

Rf: 0,49

Rf: 0,63

Rf: 0,12

Rf: 0,44

Rf: 0,40

D A B C

29

presencia de terpenos y sesquiterpenlactonas para Sf 3, y de diterpenos, saponinas y

sesquiterpenlactonas para MeOH:H2Ob (Registros fotográficos en Anexo 5, Figuras 4 y 5).

Figura 13. CCD: A) Sfs. MeOH:H2Ob(s) (1) y MeOH:H2Ob (2) y Sf. 3 (3) (FE: RP-18, FM:

MeOH:H2O 10:1). B) Sfs. 3 (1) de EU2 y MeOH:H2Ob (2) de EU1 (FE: Sílica gel, FM:

CH2Cl2:MeOH 10:1), revelada con vainillina. C) Sfs. 3 (1) y MeOH:H2Ob (2) (FE: Sílica gel

F254, FM: CH2Cl2:MeOH 9:1), bajo luz UV de onda larga.

Tabla 9. Pruebas químicas cualitativas de las subfracciones activas de EU1 y EU2.

Prueba Resultado

EU1 EU2

Baljet (terpenos y esteroles) + +

Lieberman-Burchard (esteroides y terpenos) - -

Salkowski (terpenos) + +

Molibdato de amonio (diterpenos) + -

Cloruro férrico (FeCl3) (flavonoides y fenoles) - -

Dragendroff (Alcaloides) - -

Prueba de la espuma (Saponinas) + -

Antrona (Glicósidos) - -

Hidroxamato férrico (Sesquiterpenlactonas) + +

6.9.3 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas

A B C

1 2 3 1 2 1 2

30

La Tabla 10, muestra los compuestos encontrados en la Sf. MeOH:H2Ob de EU1 por CG-EM;

solo aquellos con más de un 90% de coincidencia fueron identificados. El cromatograma y los

espectros de masas de algunos compuestos identificados se encuentran en el Anexo 3.

Tabla 10. Compuestos de la Sf MeOH:H2Ob de EU1, hallados mediante CG-EM.

TR Pico

No. Nombre

%

del

área

total


compuesto

2.427 66 4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2-

metoxifenol 9.443 97 Fenol

15.096 57 No identificado 5.111



9.807 14 2-metoxi-4-vinilfenol 2.427 96 Fenol

16.483 69 1,Z-5,E-7-Dodecatrieno 2.344 90 Trieno






16.973 73 Acido benzoico, 2-hidroxi-fenil metil

ester 1.846 91 Ácido

5.885 4 Benzyl alcohol 1.793 97 Alcohol


7.475 7 Acido benzoico 1.409 94 Acido

carboxílico








8.491 8 4-vinilfenol 1.186 91 Fenol

8.504 8 2,3-dihidrobenzofurano 1.186 90 Benzofurano



13.483 42 2,5-dimetil-(3-methoximetil)-p-

benzoquinona 1.116 90 Benzoquinona



31

16.662 70 Loliolido 0.808 97 Lactona

13.732 46 2,6-dimetoxi-4-(2-propenil) fenol 0.553 97 Fenol

11.775 30 3-metoxi-4-hidroxi- benzaldehído

(vainillina) 0.430 94 Aldehído

De la Sf. 3 de EU2, los compuestos identificados con más de un 90% de coincidencia fueron los

relacionados en la Tabla 11. Los demás picos del cromatograma se clasificaron como no

identificados por su bajo porcentaje de coincidencia con la librería del equipo (Anexo 4).

Tabla 11. Compuestos identificados en la Sf 3 de EU1 bajo análisis con CG-EM.

TR Nombre

% del

área

total


compuesto

2.351 N-Benzoil-3(hidroximetil)piperidina 38.191 99 Amina

heterocíclica

45.472 No identificado 15.862







15.579 Acido hexanoico 94 Ácido graso

7. DISCUSIÓN

Entre el 60 y el 90% de los niños en edad escolar y de adultos de los países industrializados, se

ven seriamente afectados por la prevalencia de caries dental (Petersen, 2003). La Organización

Panamericana de la Salud (1997), asegura que la salud oral es un aspecto fundamental de las

condiciones generales de salud debido a la importancia que tiene la morbilidad oral, los costos

relacionados con su tratamiento y la posibilidad de aplicar medidas eficaces de prevención. Sin

embargo, en los países en desarrollo a pesar de la alta incidencia de esta enfermedad, el acceso a

los servicios de salud oral es limitado, lo que a largo plazo genera en los pacientes perdida de los

dientes, y por tanto un decremento en la calidad de vida de los mismos (Petersen, 2003).

32

La caries se define como un proceso o enfermedad dinámica que ocurre en la estructura dentaria

en contacto con los depósitos microbianos, debido al desequilibrio entre la sustancia dental y el

fluido de placa circundante, lo que da como resultado una pérdida de mineral de la superficie

dental y por tanto la destrucción localizada de tejidos duros (Sosa, 2003). Aunque la etiología de

la caries es multifactorial, los microorganismos organizados en una biopelícula, denominada

placa dental, constituyen un factor determinante en el desarrollo de la lesión de caries (Figueroa-

Gordón et al., 2009).

Los principales microorganismos asociados a la producción de caries dental son en orden de

frecuencia: S. mutans y en menor proporción S. sobrinus y S. gordonii, y especies de

Lactobacillus y Actinomyces; el reconocimiento de la importancia de estos microorganismos en la

iniciación y progresión de la caries, conduce a diseñar medidas dirigidas hacia la eliminación o

disminución de estas bacterias en la cavidad oral (Alvarado et al., 2008). Aunque en su mayoría

el control y prevención de la aparición de la flora patógena bucal, se realiza mediante el

tratamiento con productos químicos, existe un elevado índice de resistencia, además de la

consecución de efectos no deseados que afectan la seguridad de los pacientes (diarreas, vómitos,

coloración de mucosas, irritaciones, etc.), de allí la importancia de explorar nuevas alternativas de

control.

Los compuestos naturales con efectos antimicrobianos, son la base de una línea de investigación

dedicada al descubrimiento de componentes estructurales y funcionales, también llamados

principios activos, que en su mayor parte son metabolitos secundarios (Araújo & Salas, 2008).

La investigación de estos compuestos se encamina como una opción para el desarrollo de

medicamentos eficaces y accesibles, para el tratamiento de enfermedades de importancia pública.

Extractos o fracciones vegetales de diversas familias, han mostrado actividad antimicrobiana

frente a patógenos bucales como S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus. Miembros de las

familias Myristicaceae (Chung et al., 2006), Amaryllidaceae (Bakri & Douglas, 2005),

Asteraceae (Yatsuda et al., 2005), han demostrado actividad biológica de sus extractos, así como

otros ejemplares muestran actividad antimicrobiana de sus aceites esenciales, como sucede las

familias Verbenaceae (Botelho et al., 2007) y Euphorbiaceae (Alviano et al., 2005). Una de las

http://es.wikipedia.org/wiki/Amaryllidaceae

33

familias botánicas más ampliamente distribuidas en nuestra región es la Rubiaceae, de la cual se

ha demostrado actividad antimicrobiana ante patógenos bucales de algunos individuos como

Isertia laevis (Alvarado et al., 2008), lo que hace de los ejemplares de esta familia una fuente

interesante de estudio.

Este trabajo que hace parte del proyecto de investigación titulado “Evaluación de la actividad

antibacteriana de extractos y fracciones obtenidos de dos especies de la familia Rubiaceae: Isertia

laevis y Elaeagia utilis”, llevado a cabo por el esfuerzo conjunto de GIFUJ y el CIO, financiado

por la Pontificia Universidad Javeriana, evaluó la actividad antimicrobiana de la especie Elaeagia

utilis, sobre cepas de patógenos orales. Se evaluaron microbiológicamente contra cepas de S.

mutans, S. sobrinus y L. acidophilus, el aceite esencial y las fracciones obtenidas a partir del

extracto en éter de petróleo, y del floculo del extracto etanólico.

El aceite esencial extraído a partir de hojas de E. utilis, fue evaluado tan solo contra S. mutans

debido al bajo rendimiento de la extracción, sin embargo se evidenció actividad antimicrobiana a

una baja concentración (1mg/pozo). El análisis por CG-EM, reveló que entre los compuestos

mayoritarios de esta mezcla se encuentran algunos reportados para los aceites esenciales de otros

individuos de la familia como el linalol, la ionona, la Betaionona y el ácido hexanoico (Baser et.

al, 2004). Además, también se encontraron fenilpropenos como el Eugenol, Isoeugenol y 3-Alil-

6-metoxifenol, compuestos que se conoce son producidos por las plantas como mecanismos de

defensa antibacteriana y como toxina para predadores (Koeduka et. al, 2006).

El Eugenol, se reconoce por ser un compuesto con propiedades analgésicas y antimicrobianas, así

mismo se reconoce el uso de este como integrante del cemento dental (Dai-Chian et. al 2008,

Koeduka et. al 2006). Se ha comprobado que el eugenol, presenta actividad biológica contra

bacterias transmitidas mediante los alimentos como Salmonella typhimurium, Staphylococcus

aureus and Vibrio parahaemolyticus (Karapinar & Esen, 1987); Hemaiswarya & Doble (2009),

reportan daño de la membrana celular bacteriana al contacto con el eugenol. Sin embargo se

reconoce que tanto eugenol como isoeugenol, tienen actividad pro y antioxidante, y que sus

efectos secundarios como alergias y reacciones inflamatorias se deben precisamente a su

actividad pro-oxidante (Atsumi et. al, 2005). Además, algunos estudios demuestran que a

34

concentraciones de 1.25 y 2.5 mmol/L, el eugenol interfiere con la actividad bactericida de los

neutrófilos, contra patógenos orales como S. mutans y Actinobacillus actinomycetemcomitans

(Chian et. al, 2008).

Por su parte, las fracciones de mediana a alta polaridad del extracto en éter de petróleo,

presentaron actividad antimicrobiana, mientras que para las del floculo las de polaridad baja a

media evidenciaron halos de inhibición. Los cuatro extractos obtenidos mediante extracción

líquido/líquido (Petrol, CH2Cl2, AcOEt y BuOH), a partir del extracto etanólico también

presentaron actividad antimicrobiana, sin embargo la alta actividad biológica presentada por la

fracción CH2Cl2, dirigió la investigación hacia el rastreo de la misma, en otro individuo de la

misma especie colectado en otra localidad. Para el segundo ejemplar de E. utilis (EU2), se siguió

una marcha similar para la obtención y evaluación de los cuatro extractos del fraccionamiento

líquido/líquido (Petrol, CH2Cl2, AcOEt y BuOH), corroborándose la actividad biológica de los

mismos aún cuando la fracción CH2Cl2, no presentó la mayor actividad antimicrobiana de las

fracciones evaluadas, como si fue el caso de EU1.

A la fracción CH2Cl2 de cada individuo, se le realizó un método diferente de separación de

clorofilas. Para el individuo EU1, se elaboró una CCV con FE: RP-18, F: MeOH:H2O, para la

obtención de ocho subfracciones. La Sf. MeOH:H2Ob fue divida en un precipitado al que se le

dio el mismo nombre, y un sobrenadante que fue denominado MeOH:H2Ob(s); fueron estas

subfracciones las que presentaron una actividad antimicrobiana considerable, aunque la Sf.

MeOH:H2Ob presentó halos de inhibición mayores. Bajo monitoreo por CCD (FE: RP-18, FM:

MeOH:H2O) de las subfracciones MeOH:H2Ob y MeOH:H2Ob(s), se encontró una gran

similitud, aunque la primera se mostraba con una menor cantidad de componentes, por lo que fue

seleccionada como la subfracción activa de EU1.

La separación de clorofilas de la fracción CH2Cl2 de EU2, se llevó a cabo con Sephadex LH-20;

se obtuvieron cuatro subfracciones (Sf. 0, 1, 2 y 3), tres de ellas con actividad contra las cepas de

estudio (Sf. 1, 2 y 3). El monitoreo con CCD demostró similitud entre las Sfs. 2 y 3, siendo la 2,

la fracción poseedora de clorofila. Debido a que la Sf. 3 pesar de ser probada a la mitad de la

35

concentración de las otras tres, presentó la mayor actividad antimicrobiana, se infiere que la

presencia de clorofila en la Sf. 3, es un interferente de la actividad biológica.

Las Sfs activas encontradas para EU1 y EU2, fueron comparadas bajo CCD (FE: RP-18, FM:

MeOH:H2O), mostrando gran semejanza, aún cuando la Sf MeOH:H2Ob presenta una mayor

mezcla de compuestos. Además, ambas subfracciones presentan una alta actividad

antimicrobiana a bajas concentraciones, presentándose halos de inhibición a 0.1mg/pozo, por lo

que la CMI de estas fracciones activas debe estar por debajo de este valor.

Las bioautografías realizadas con la Sf MeOH:H2Ob, mostraron que los compuestos que bajo luz

UV presentaban Rf de 0,44 y 0,49, son los causantes de la actividad; es importante recalcar que

al ser revelados con vainillina, no se diferencia la presencia de dos compuestos, por el contrario

se muestra una sola marca amarrilla en la placa.

El estudio químico cualitativo determinó la presencia principalmente de terpenos y

sesquiterpenlactonas en ambas fracciones, pero además de saponinas para la Sf MeOH:H2Ob de

EU1, que presentó halos de inhibición un poco más grandes que la Sf. 3 de EU2, lo que tal vez

indique sinergismo en la mezcla ante la presencia de este tipo de compuestos. De Rosa et al.

(2000) y Zhao et al. (1997), reportan la presencia de saponinas triterpénicas en especies

pertenecientes a esta familia, mientras que Kloucek et al. (2005), afirman que especies

pertenecientes a la familia Rubiaceae con actividad antimicrobiana frente a microorganismos

patógenos presentan triterpenos como componente mayoritario.

El análisis por CG-EM para la Sf. 3 de EU2, tan solo detectó la presencia de N-Benzoil-

3(hidroximetil)piperidina (amina) y de ácido hexanoico (ácido graso), mientras que para la Sf.

MeOH:H2Ob de EU1, reveló la presencia de varias clases de compuestos entre los que se

destacan fenoles (4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2-; 2-metoxi-4-vinilfenol; 4-vinilfenol; 2,6-

dimetoxi-4-(2-propenil) fenol), ácidos (Acido benzoico, 2-hidroxi-fenil metil ester y ácido

benzoico), y otros compuestos derivados de benceno (2,5-dimetil-(3-methoximetil)-p-

benzoquinona y 2,3-dihidrobenzofurano). Friedman et. al (2006), reportan que benzaldehídos

benzoicos (4-hidroxi-3-metoxi benzaldehído) y ácidos benzoicos (Acido benzoico, 2-hidroxi-

36

fenil metil ester) muestran actividad antimicrobiana de cepas transmitidas por alimentos como

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Sin embargo, existe en la

muestra una serie de compuestos no identificados por CG-EM, que pueden estar relacionados con

la actividad biológica de esta subfraccion.

8. CONCLUSIONES

Los extractos y fracciones totales aislados de hojas de ambos individuos de Elaeagia utilis,

evidenciaron actividad antimicrobiana contra las cepas de Streptococcus mutans, Streptococcus

sobrinus y Lactobacillus acidophilus, lo que hace de esta especie una importante fuente de

compuestos con actividad antimicrobiana frente a patógenos orales.

Se lograron obtener subfracciones activas altamente similares de ambos individuos de E. utilis, a

partir de la fracción CH2Cl2 del extracto etanólico. Esto mediante la ejecución de dos métodos

diferentes: Cromatografía en Columna al Vacío con RP-18 y Cromatografía en Columna con

Sephadex LH-20.

Se comprobó la similitud química y antimicrobiana de las subfracción de la fracción CH2Cl2, de

dos individuos de E. utilis, colectados en localidades diferentes.

La Separación de clorofilas mediante Cromatografía en Columna con Sephadex LH-20, resultó el

método más eficaz para la obtención de la Subfracción activa contra S. mutans, S. sobrinus y L.

acidophilus, debido a que la retención de los compuestos no clorofílicos en esta Fase

Estacionaria, permitió la obtención de los compuestos activos en un menor grado de mezcla que

el proporcionado por la Cromatografía en Columna al Vacío con RP-18.

Las subfracciones activas de la fracción CH2Cl2 de ambos individuos poseen una concentración

mínima inhibitoria por debajo de los 0.1mg/pozo.

Los compuestos con Rf de 0,44 y 0,49 son probablemente los responsables de la actividad

inhibitoria presentada por las subfracciones activas de la fracción CH2Cl2 de EU1 y EU2.

37

El Aceite Esencial extraído a partir de hojas de E. utilis, evidenció actividad antimicrobiana en

contra de S. mutans, a una baja concentración. Se destaca la presencia de fenilpropenos a los

cuales se les ha demostrado actividad bactericida, dentro del aceite esencial, sin embargo el alto

grado de mezcla de la fracción no permite aseverar que estos compuestos sean los únicos

responsables de la actividad biológica.

9. RECOMENDACIONES

Aislar, purificar e identificar los componentes activos de la mezcla de las fracciones activas, para

la elucidación y cuantificación final de los compuestos responsables de la actividad biológica.

Evaluar microbiológicamente las subfracciones activas, contra otras cepas bacterianas patógenas

orales.

Someter a las subfracciones activas a un estudio in vivo, donde se ponga a prueba la actividad

antimicrobiana contra el biofilm o placa bacteriana.

Evaluar el efecto toxicológico que las subfracciones activas halladas puedan tener sobre células

humanas sanas.

Fraccionar y evaluar biológicamente, los extractos y fracciones totales que también presentaron

actividad antimicrobiana y que no fueron analizados en este estudio.

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1

ANEXOS

ANEXO 1

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Tabla 1. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del extracto en éter

de petróleo.

Eter de

Petróleo

Petrol:

CH2Cl2 CH2Cl2

CH2Cl2:

AcOEt AcOEt AcoEt:EtOH EtOH Vancomicina DMSO

S. mutans 10 0 0 10 8 15 11 18 0

9 0 0 12 9 15 11 20 0

Media 9,50 0,00 0,00 11,00 8,50 15,00 11,00 19,00 0,00

Desviación

estándar 0,71 0,00 0,00 1,41 0,71 0,00 0,00 1,41 0,00

Varianza de la

muestra 0,50 0,00 0,00 2,00 0,50 0,00 0,00 2,00 0,00

% Inhibición 50,00 0,00 0,00 57,89 44,74 78,95 57,89 100,00 0,00

S. sobrinus 9 0 0 9 9 9 8 19 0

9 0 0 9 9 8 9 15 0

Media 9,00 0,00 0,00 9,00 9,00 8,50 8,50 17,00 0,00

Desviación

estándar 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,71 0,71 2,83 0,00

Varianza de la

muestra 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,50 8,00 0,00

% Inhibición 52,94 0,00 0,00 52,94 52,94 50,00 50,00 100,00 0,00

L. acidophilus 9,00 0,00 0,00 8,00 7,00 7,00 8,00 20,00 0

9,00 0,00 0,00 10,00 7,00 9,00 9,00 18,00 0

Media 9,00 0,00 0,00 9,00 7,00 8,00 8,50 19,00 0,00

Desviación

estándar 0,00 0,00 0,00 1,41 0,00 1,41 0,71 1,41 0,00

Varianza de la

muestra 0,00 0,00 0,00 2,00 0,00 2,00 0,50 2,00 0,00

% Inhibición 47,37 0,00 0,00 47,37 36,84 42,11 44,74 100,00 0,00

2

Tabla 2. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del flóculo del

extracto etanólico.

Flóculo

Petrol:

CH2Cl2

CH2Cl2:

AcOEt a

CH2Cl2:

AcOEt b AcOEt

AcoEt:

EtOH

a

AcoEt:

EtOH b EtOH Vancomicina DMSO

S. mutans 9 10 16 10 10 0 0 9 21 0

9 10 15 8 9 0 0 9 22 0

Media 9,00 10,00 15,50 9,00 9,50 0,00 0,00 9,00 21,50 0,00

Desviación

estándar 0,00 0,00 0,71 1,41 0,71 0,00 0,00 0,00 0,71 0,00

Varianza de la

muestra 0,00 0,00 0,50 2,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00

% Inhibición 41,86 46,51 72,09 41,86 44,19 0,00 0,00 41,86 100,00 0,00

S. sobrinus 10 10 16 11 10 0 0 9 22 0

9 10 15 10 10 0 0 9 19 0

Media 9,50 10,00 15,50 10,50 10,00 0,00 0,00 9,00 20,50 0,00

Desviación

estándar 0,71 0,00 0,71 0,71 0,00 0,00 0,00 0,00 2,12 0,00

Varianza de la

muestra 0,50 0,00 0,50 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 4,50 0,00

% Inhibición 46,34 48,78 75,61 51,22 48,78 0,00 0,00 43,90 100,00 0,00

L. acidophilus 9 10 15 10 9 0 0 9 20 0

10 8 15 9 10 0 0 8 19 0

Media 9,50 9,00 15,00 9,50 9,50 0,00 0,00 8,50 19,50 0,00

Desviación

estándar 0,71 1,41 0,00 0,71 0,71 0,00 0,00 0,71 0,71 0,00

Varianza de la

muestra 0,50 2,00 0,00 0,50 0,50 0,00 0,00 0,50 0,50 0,00

% Inhibición 48,72 46,15 76,92 48,72 48,72 0,00 0,00 43,59 100,00 0,00

Tabla 3. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del fraccionamiento

líquido/líquido del extracto etanólico de EU1.

Éter de

Petróleo CH2Cl2 AcOEt

Precipitado

AcOEt BuOH

Precipitado

BuOH Vancomicina DMSO

S. mutans 13 10 13 16 13 0 18 0

10 20 14 15 14 0 20 0

Media 11,50 15,00 13,50 15,50 13,50 0,00 19,00 0,00

Desviación estándar 2,12 7,07 0,71 0,71 0,71 0,00 1,41 0,00

Varianza de la muestra 4,50 50,00 0,50 0,50 0,50 0,00 2,00 0,00

% Inhibición 60,53 78,95 71,05 81,58 71,05 0,00 100,00 0,00

S. sobrinus 13 16 11 12 10 0 17 0

11 18 11 12 9 0 15 0

3

Media 12 17 11 12,00 9,5 0,00 16 0,00



% Inhibición 75,00 106,25 68,75 70,59 59,38 0,00 100,00 0,00

L. acidophilus 10 20 13 16 12 0 17 0

14 20 13 15 12 0 19 0

Media 12,00 20,00 13,00 15,50 12,00 0,00 18,00 0,00



% Inhibición 66,67 111,11 72,22 86,11 66,67 0,00 100,00 0,00

Tabla 4. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del

fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico de EU2.

Petrol CH2Cl2 AcOET Butanol Vancomicina DMSO

S. mutans 12 11 16 10 17 0

13 11 16 10 19 0

Media 12,50 11,00 16,00 10,00 18,00 0,00

Desviación estándar 0,07 0,00 0,00 0,00 1,41 0,00

Varianza de la

muestra 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 0,00

% Inhibición 69,44 61,11 88,89 55,56 100,00 0,00

S. sobrinus 13 9 12 10 19 0

13 8 12 10 19 0

Media 13,00 8,50 12,00 10,00 19,00 0,00


Varianza de la

muestra 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00

% Inhibición 68,42 44,74 63,16 52,63 100,00 0,00

L. acidophilus 10 9 13 9 19 0

11 9 13 9 19 0

Media 10,50 9,00 13,00 9,00 19,00 0,00


Varianza de la

muestra 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

% Inhibición 55,26 47,37 68,42 47,37 100,00 0,00

4

Tabla 6. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las subfracciones de CH2Cl2 de

EU1.

MeOH:

H2O a

MeOH:

H2O b

MeOH:

H2O b(s)

MeOH:

H2O c

MeOH:

H2O d

MeOH:

H2O e

MeOH:

H2O f

MeOH:

CH2Cl2 Vancomicina DMSO

S. mutans 12 16 17 0 0 0 0 0 21 0

11 14 18 0 0 0 0 0 22 0

Media 11,50 15,00 17,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 21,50 0,00

Desviación

estándar 0,71 1,41 0,71 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,71 0,00

Varianza de la

muestra 0,50 2,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00

% Inhibición 53,49 69,77 81,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 100,00 0,00

S. sobrinus 11 20 16 0 0 0 0 0 20 0

12 20 17 0 0 0 0 0 19 0

Media 11,50 20,00 16,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 19,50 0,00

Desviación

estándar 0,71 0,00 0,71 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,71 0,00

Varianza de la

muestra 0,50 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00

% Inhibición 58,97 102,56 84,62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 100,00 0,00

L. acidophilus 12 20 17 0 0 0 0 0 16 0

11 19 15 0 0 0 0 0 20 0

Media 11,50 19,50 16,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 18,00 0,00

Desviación

estándar 0,71 0,71 1,41 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,83 0,00

Varianza de la

muestra 0,50 0,50 2,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8,00 0,00

% Inhibición 63,89 108,33 88,89 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 100,00 0,00

Tabla 7. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las subfracciones de CH2Cl2 de

EU2.

Sf 0 Sf 1 Sf 2 Sf 3 Vancomicina DMSO

S. mutans 0 10 14 16 20 0

0 9 15 16 20 0

Media 0,00 9,50 14,50 16,00 20,00 0,00


Varianza de la

muestra 0,00 0,50 0,50 0,00 0,00 0,00

% Inhibición 0,00 47,50 72,50 80,00 100,00 0,00

S. sobrinus 0 9 12 16 22 0

0 9 14 18 22 0

5

Media 0,0 9,0 13,0 17,0 22,0 0,0


Varianza de la

muestra 0,0 0,0 2,0 2,0 0,0 0,0

% Inhibición 0,0 40,9 59,1 77,3 100,0 0,0

L. acidophilus 0 8 15 15 22 0

0 8 13 15 20 0

Media 0,00 8,00 14,00 15,00 21,00 0,00


Varianza de la

muestra 0,00 0,00 2,00 0,00 2,00 0,00

% Inhibición 0,00 38,10 66,67 71,43 100,00 0,00

ANEXO 2

ESTUDIO QUÍMICO

COMPUESTOS DEL ACEITE ESENCIAL IDENTIFICADOS POR CG-EM

TR Pico

No. Sustancia

%

del

area

total

Coincidencia

6.786 25 Ácido 2-hidroxibenzoico, metil ester 7.666 96

8.824 47 3-Alil-6-metoxifenol 4.403 98

8.824 47 Eugenol 4.403 97

8.824 47 2 metoxi-4-(1-propenil)fenol (isoeugenol) 4.403 97

19.439 105 Ácido 2-hidroxi benzoico, fenilmetil ester 4.247 94

12.437 81 17-Octadecenal 3.685 91

12.437 81 Hexadecanal 3.685 95

8.884 48 Ionona 2.874 91

5.039 6 Linalol 2.596 93

8.614 45 1-(2,6,6-Trimetil-1,3-ciclohexadien-1-il)-2-buten-

1-ona 2.482 97

8.427 43 Betaionona 2.420 94

9.970 60 Irisona 2.113 93

4.158 1 Ácido hexanoico 2.048 90

5.452 8 Bencil alcohol 1.613 96

5.452 8 p-nitrofenil ester N-Cbz-glicilglicina 1.613 90

15.285 91 Ciclohexadecano 1.601 98

15.285 91 1-Nonadecanol 1.601 95

15.285 91 Ciclotetradecano 1.601 94

15.285 91 Ácido acético, cloro-, octadecil ester 1.601 94

15.285 91 Ácido 2 cloropropionico, pentadecil ester 1.601 94

15.285 91 Ácido tricloroacetico, pentadecil ester 1.601 94

15.285 91 Ácido tricloroacetico, tetradecil ester 1.601 94

6

15.285 91 2-Tetradeceno, (E)- 1.601 93

15.285 91 1,2-octadecadeniol 1.601 92

15.285 91 Ácido heptafluorobutirico, n-pentadecil ester 1.601 91

15.285 91 Ácido cloroacetico, pentadecil ester 1.601 91

15.285 91 Ácido heptafluorobutirico, n-octadecil ester 1.601 91

15.285 91 Ácido acético, cloro-, hexadecil ester 1.601 91

15.285 91 Ácido dicloroacetico, heptadecil ester 1.601 90

10.239 64 Heptadecano 1.501 95

6.604 23 2-Decenal, (E)- 1.486 90

6.196 18 octen-1-ol 3,7-dimetil-6 1.338 96

7.513 34 2,4-decadienal, (E, E)- 1.264 95

22.865 110 Heptacosano 1.259 96

22.865 110 Acido 1,2-Bencenodicarboxílico, mono(2-etilhexil)

ester 1.259 91

14.222 88 6,10,14-trimetil-2-pentadecanona 1.075 91

7.672 36 Megastigma-4,6 (E), 8 (E) -trieno 0.923 98

13.335 83 n-hexil salicilato 0.888 94

10.752 69 Tridecanal 0.884 91

10.752 69 Tetradecanal 0.884 91

6.158 17 Feniletil alcohol 0.854 91

11.837 78 Octadecano 0.668 95

4.874

4.880 5 cis-linaloloxido 0.574 90

4.874

4.880 5

5-etiltetrahidro-2-furanmetanol, alfa.,.alfa., 5-trimetril-,

cis- 0.574 90

7.739 37 1-metoxi-4-(propenil)-Benceno 0.517 97

7.739 37 Estragol 0.517 93

13.732 86 Dietil ftalato 0.514 95

20.508 107 Octacosano 0.503 91

20.508 107 Eicosano 0.503 91

20.508 107 11-(1-ethylpropyl)-Heneicosano 0.503 91

20.508 107 Tetracosano 0.503 91

20.508 107 Tetratetracontano 0.503 91

20.508 107 9-octyl-Heptadecano 0.503 91

20.508 107 Nonacosano 0.503 91

10.328 65 3-Heptadeceno, (z) 0.451 99

10.328 65 4-Heptafluorobutiriloxihexadecano 0.451 91

10.328 65 1-Heptadeceno 0.451 91

10.328 65 3-Hexadeceno, (z)- 0.451 91

10.328 65 4-Trifluoroacetoxihexadecano 0.451 91

10.328 65 9-Eicoseno, (E)- 0.451 91

10.328 65 9-Octadeceno, (E)- 0.451 91

10.328 65 Ácido bromoacetico, hexadecil ester 0.451 91

10.328 65 1-Hexadecanol 0.451 91

12.845 82 5,6,7,7a-tetrahidro-4,4,7a-trimetil-2 (4H)-

Benzofuranona, 0.443 94

17.147 98 6,10,14-trimetil-5,9,13-pentadecatrien-2-ona 0.439 90

14.096 87 1,6-dimetil-4-(1-metiletil)-Naftaleno 0.438 98

7

11.198 71 2-metoxi-Naftaleno 0.404 93

28.765 114 Ácido 6-etiloct-3-il 2-etilhexil ester ftálico 0.396 91

30.798 117 Escualeno 0.395 95

30.798 117 2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaeno, 2,6,10,15,19,23-

hexametil-, (all-E)- 0.395 98

11.765 77 Ácido hexil ester benzoico 0.363 93

13.539 84 Nonadecano 0.357 97

9.614 56 2,7-dimetil-Naftaleno 0.341 91

6.565 22 Tetradecano 0.332 97

4.632 3 Ácido 3-hexanoico (E) 0.331 95

4.637 3 Ácido 2-hexanoico 0.331 90




22.447 109 Acido 2,2,2-tricloro etil ester octadecyl Carbonico 0.274 91

22.447 109 Bacteriochlorofil-c-estearil 0.274 91

22.447 109 9-Eicoseno, (E)- 0.274 91

17.059

20.508

97

107 Heneicoseno

0.170

0.503

98

91

20.789 108 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,1,4a-trimetil-7-(1-

metiletil)-, (4aS-trans)-Fenantreno 0.164 97

18.029 101 Ácido decil isobutil ester ftálico 0.154 90

17.654 100 Bencil benzoato 0.117 93

8

ESTUDIO QUÍMICO

CG-EM ACEITE ESENCIAL DE EU1

9

1. Espectro de masas del Ácido 2-hidroxi benzoico, metil ester

10

2. Espectro de masas de 3-Alil-6-metoxifenol

11

2. Espectro de masas del Eugenol

12

2. Espectro de masas de 2 metoxi-4-(1-propenil)fenol

13

3. Espectro de masas de 17 Octadecenal

14

4. Espectro de masas del Ácido 2-hidroxi benzoico, fenilmetil ester

15

ANEXO 3

ESTUDIO QUÍMICO

CG-EM Sf MeOH:H2Ob de EU1

6. Acido benzoico, 2-hidroxi-fenil metil ester

16

1. Espectro de masas de Benzyl alcohol

17

2. Espectro de masas del Ácido benzoico

18

3. Espectro de masas de 2,3-dihidrobenzofurano

19

3. Espectro de masas de 4-vinilfenol

20

4. Espectro de masas de 2-metoxi-4-vinilfenol

21

5. Espectro de masas de 4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2-metoxifenol

22

ANEXO 4

ESTUDIO QUÍMICO

CG-EM Sf. 3 EU2

23

1. N-Benzoil-3(hidroximetil)piperidina

24

2. Espectro de masas del Ácido hexanóico

25

ANEXO 5

REGISTROS FOTOGRÁFICOS

Figura 1. Fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo: 1) Petrol:CH2CL2, 2)

CH2CL2, 3) CH2CL2:AcOEt, 4) AcOEt, 5) AcOEt: EtOH y 6) EtOH. FE: Sílica gel H60.

Figura 2. Fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo: 1) Petrol:CH2CL2, 2)

CH2CL2:AcOEta 3) CH2CL2:AcOEtb, 4) AcOEt, 5) AcOEt: EtOHa, 6) AcOEt: EtOHb y 7)

EtOH. FE: Sílica gel H60

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7

26

Figura 3. Subfracciones de CH2CL2 de EU1: 1) MeOH:H2Oa, 2) MeOH:H2Ob, 3) MeOH:H2Oc,

4) MeOH:H2Od, 5) MeOH:H2Oe, 6) MeOH:H2Of y 7) MeOH:CH2Cl2. FE: RP-18

Originales Baljet Salkowski FeCl3 Dragendroff Molibdato

de amonio

EU1

EU2

Figura 4. Pruebas químicas cualitativas preliminares, realizadas a las subfracciones activas de

EU1 y EU2.

Originales Antrona Hidroxamato férrico

Figura 5. Pruebas químicas cualitativas preliminares, Antrona e Hidroxamato férrico, realizadas

a las subfracciones activas de EU1 y EU2

EU1 EU2 EU1 EU2 EU1 EU2

EU2 EU1

1 2 3 4 5 6 7

Documents

JENNYFER ANDREA ALDANA MEJÍA TRABAJO DE GRADO … · 5.2.2 Obtención de aceites esenciales, ... una subfracción con actividad inhibitoria de cada individuo sobre las cepas de interés