Upload
dangcong
View
223
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Jessica Caprioli Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri Centro di ricerche cliniche per le Malattie Rare
Aldo e Cele Daccò, Ranica
Dipartimento di Medicina Molecolare
Genetica: metodi di studio e
applicazioni in medicina
Come è organizzata questa lezione
• Introduzione
• Diapositive teoriche: sfondo blu • Diapositive relative ad un esempio
reale: sfondo azzurro
Che cosʼè la genetica • Eʼ la scienza che studia i geni e in
particolare la loro: • Struttura • Funzione • Trasmissione
Si occupa inoltre di identificare le alterazioni dei geni che producono malattie e come queste alterazioni vengono trasmesse.
Gregor Mendel (1822-1884) pubblica il suo lavoro “Experiments in Plant Hybridisation” e stabilisce le leggi dellʼereditarietà.
- dominanza (F1 omogenea per un dato carattere)
- segregazione dei caratteri (incrociando individui della F1 in carattere recessivo ricompare nella F2)
- assortimento independente dei caratteri (segue la trasmissione di due caratteri diversi nelle generazioni)
1866
Archibald E. Garrod (1857-1936) postula che i difetti genetici causano molte malattie ereditarie.
1908
A causa di un difetto genetico, i pazienti con alcaptonuria sono privi di un enzima del metabolismo. Il risultato di tale deficit è un accumulo di un composto chimico che rende scure le urine.
James Watson e Francis Crick scoprono la struttura tridimensionale del DNA e subito dopo ne deducono il meccanismo di replicazione.
DNA
1953
LA STRUTTURA DEL DNA • Lineare, a doppia elica: due
catene attorcigliate, orientate in senso opposto lʼuna rispetto allʼaltra
• Struttura portante di ciascuna catena è composta da un polimero costante: zucchero-fosfato-zucchero-fosfato
• Ad ogni zucchero (desossiribosio) si lega una base o nucleotide
• 4 basi: Adenina (A) Citosina (C) Guanina (G) Timina (T)
Ogni uomo è formato da 100 miliardi di cellule
Ogni cellula contiene nel proprio nucleo 46 cromosomi: 23 di origine paterna e 23 di origine materna
Ogni cromosoma è un piccolo bastoncello formato da una lunga molecola attorcigliata su se stessa, il DNA
DNA
Il codice genetico è il manuale di istruzioni per il corretto funzionamento della cellula
…..AGCTAACTGGTACTAGTCAGGTACTCCTAGCA…..
15 February 2001
Il genoma è organizzato in 46 cromosomi (capitoli del codice) e i geni sono contenuti nei cromosomi. Ciascun cromosoma è lungo circa 50 mm e quindi in ogni cellula sono contenuti circa 2 m di DNA.
16February 2001
CHE COSA SONO I GENI
I geni sono le istruzioni necessarie alla cellula per compiere tutte le sue funzioni vitali
DNA
…..AGCTAACTGGTACTAGTCAGGTACTCCTAGCA…..
Il codice genetico è il manuale di istruzioni per il corretto funzionamento della cellula
La funzione principale di ogni gene è la formazione di proteine
Funzioni di una proteina: - strutturale - enzimatica - di controllo
Transcription
Transcribed strain
Nucleus
Cytoplasm
Growing polypeptide
chain
Anticodon
tRNA
Codon Translation
Dal gene alla proteina
GENI PROTEINE
Gene alterato Proteine alterate
Predisposizione alla malattia
Malattia
Le mutazioni
Come si possono identificare le mutazioni?
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
Individuazione del gene mutato 3) Studio del DNA e identificazione della mutazione 4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione
A compiere una diagnosi corretta
A identificare i soggetti a rischio (medicina preventiva)
A cosa serve identificare le mutazioni?
sono causate da un singolo gene
1) Studio delle famiglie
LA SINDROME EMOLITICO-UREMICA
Malattia multisistemica caratterizzata da anemia emolitica e trombocitopenia, con predominante, ma non esclusivo, coinvolgimento renale.
Ripercorriamo con un esempio quanto visto finora
= affected = probably affected = unaffected to date
= spontaneous abortion
male female = dead
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
- Quali sono le caratteristiche della patologia?
- Eʼ possibile supporre che alcune proteine e quindi alcuni geni possano essere coinvolti? In altre parole, abbiamo uno o più geni candidati?
I MARCATORI POLIMORFICI
PRIMER PRIMER RIPETIZIONI CA
24 ripetizioni 23 ripetizioni 22 ripetizioni 21 ripetizioni
b a c d individui I MICROSATELLITI
2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage
La PCR
Denaturazione a 94°
Annealing dei primers
Ripetendo questo procedimento per 20-35 volte si ottengono più di 2.000.000 di copie del frammento di DNA di interesse che può essere visualizzato facilmente e utilizzato per il sequenziamento.
2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage
I due soggetti affetti ereditano dal padre lo stesso tratto cromosomico nellʼintorno del gene di interesse: è probabile quindi che questo sia il gene responsabile della malattia in questa famiglia.
D1S412 D1S2816 D1S413 D1S2738
3 5 2 3 2 7 2 2
7 1 3 2 7 6 2 3
5 1 3 2 7 6 2 3
F M F M F M
3 7 2 3 2 7 2 2 F M
3 7 2 3 2 7 2 2 F M
1q32
Chromosome 1
Gene di interesse
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
- A volte non è possibile individuare alcun gene candidato.
- In questi casi è possibile estendere lʼanalisi di linkage a tutto il genoma, fino ad individuare la regione candidata. Allʼinterno di tale regione si cercherà poi il gene responsabile della malattia.
La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse
Individuazione del gene mutato 3) Studio del gene e identificazione della mutazione 4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione
Il sequenziamento
TCT TTC ATC ATG TTC TCC
TCT TTC ATC ACG TTC TCC
Ser Phe Ile Met Phe Ser
Ser Phe Ile Thr Phe Ser
Normale
Mutato
Normale G A C A C A A T T G T C T G T Asp Thr Ile Val Cys Mutato A A T T G T C T G T G A Asn Cys Leu Stop
Caso clinico
Paziente di 21 anni in emodialisi in seguito a ripetuti episodi di SEU Fratello con storia di SEU Genitori sani
Analisi genetiche
COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA?
Individuazione del genotipo
Terapia mirata
Comprensione del difetto biologico
Fattore H
C3b MCP Fattore B
Il sistema del complemento non si attiva Le cellule dell’organismo sono protette
C3b Fattore B
Il sistema del complemento si attiva Cellula batterica
Cellula umana nucleo
Fattore H
Prodotto principalmente dalle cellule del fegato
Fattore H
COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA?
Individuazione del genotipo
Terapia mirata: il trapianto di rene non funziona, ma è possibile ad esempio infondere la proteina normale (come
lʼinsulina nel caso dei diabetici)
Comprensione del difetto biologico
Cellula umana nucleo
C3b C3b inattivato
MCP
+ Fattore I
Cellula umana nucleo
MCP
Cellula umana nucleo
MC
P, m
edia
na d
ell’i
nten
sità
di
fluor
esce
nza
0 5
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Pazi
ente
Controlli dializzati
Controlli sani
Padr
e
Frat
ello
Madre Soggetti con mutazione
(33.1-39.6) (45.3-46.5)
MCP normale
MCP alterato
MCP
E’ possibile che la disfunzione in MCP, che e’ una proteina di membrana
altamente espressa nel rene, possa essere corretta trapiantando un rene
normale?
CASO CLINICO: B.A. una giovane donna con SEU Agosto 1994, a 25 anni:
Diagnosi: SEU
Progressivo deterioramento della funzione renale Severa, intrattabile ipertensione Nefrectomia bilaterale:
Remissione completa dei processi microangiopatici Pressione sanguigna normalizzata, emodialisi
Riceve un trapianto di rene Nessun segno di ricorrenza, fino ad oggi buona funzione renale
Nessuna mutazione al Fattore H Mutazione nel gene di MCP
Gennaio 1995:
Giugno 1995:
Ottobre 2003: analisi genetiche
COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA?
Individuazione del genotipo
Terapia mirata
Comprensione del difetto biologico
Details of a Single Feature