Jhenifer Kliemchen Rodrigues - Coordenação de Aperfeicoamento de Pessoal de …capes.gov.br/images/stories/download/pct/premios/226771.pdf · 2016-01-19 · Agradeço a minha tia

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Jhenifer Kliemchen Rodrigues

Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios

esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulatta cultivados

individualmente em matrix 3-D

Ribeirão Preto/SP

2014


Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios

esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulatta cultivados

individualmente em matrix 3-D

Tese apresentada ao Departamento de Ginecologia e

Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, para obtenção de

título de Doutor em Ginecologia e Obstetrícia.

Área de concentração: Biologia da Reprodução

Orientação: Paula Andrea de Albuquerque Salles Navarro (MD, MSc, PhD)

Ribeirão Preto/SP

2014

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Rodrigues, Jhenifer Kliemchen

Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3-D. Ribeirão Preto, 2014.

160 p.

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Biologia da Reprdução.

Orientador: Andrea de Albuquerque Salles Navarro, Paula.

1. Foliculogênese. 2. Androgênios. 3. Cultivo folicular 3D. 4. Esteróides. 5. Testosterona. 6. Dihidrotestosterona.


Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios esteróides

e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulatta cultivados individualmente em matrix 3-D

Tese apresentada ao Departamento de Ginecologia e

Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, para obtenção de

título de Doutor em Ginecologia e Obstetrícia, Área

de concentração: Biologia da Reprodução.

Aprovado (a) em: ___/___/___

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________________

Julgamento: ___________________________ Assinatura: ___________________________









Dedicatória

Dedico este trabalho a humanidade e as pessoas que possam se beneficiar dos conhecimentos através dele desenvolvidos.

Dedico este trabalho também a minha família, meus queridos pais, irmão, marido e futuro filho.

Agradecimentos

Agradeço antes de tudo a Deus, pela inspiração e pela força, por eu ter encontrado na

ciência um caminho, por meio do qual eu posso contribuir para o desenvolvimento da

humanidade, e também ter encontrado o caminho para minha realização pessoal.

Agradeço aos meus pais, Antonio Claret Rodrigues e Sirleney Kliemchen Rodrigues, pelo

amor e apoio incondicionais desde o dia do meu nascimento, durante os dias em que eu

estava em terras distantes realizando este trabalho e até este momento.

Agradeço ao meu irmão querido, Jhonatan Kliemchen Rodrigues, pelo incentivo, e pelo

apoio e cuidado aos meus pais quando ambos mais precisaram e

eu estava distante.

Agradeço a minha tia e madrinha Leneide Kliemchen, pelo amor e carinho

imensuráveis dedicados a minha mãe quando ela precisou e

eu não podia estar perto.

Agradeço ao meu Puppy, pela alegria de todas as horas, e por ter me proporcionado

tantos momentos agradáveis em que eu precisava me tranquilizar.

Agradeço ao amor da minha vida, Nivaldo Ulisses Agostinho, pela paciência nos dias e

noites em que precisei trabalhar, pelos fins de semana que não pude ir ao clube,

pela ajuda quando precisei formatar um gráfico/tabela ou ajeitar a figura de um artigo,

pelo carinho e atenção nas horas que eu precisei e pelo amor incondicional

que eu posso sentir a cada instante em que está ao meu lado.

Agradeço especialmente ao meu futuro filho Miguel, que a quatro semanas

do dia do seu nascimento já está encarando grandes desafios.

Sem nem mesmo ter consciência de sua importância na minha vida,

já me deu muita força para enfrentar os desafios que surgiram no meu caminho.

Te amo muito meu anjo!

Agradeço a minha querida orientadora Dra. Paula Andrea de Albuqerque Salles Navarro,

pela orientação, pelos conselhos , atenção e carinho sempre prestados, e também

pela oportunidade de me permitir estar nos Estados Unidos

durante o período do meu Doutorado, com o intuito de adquirir novos

conhecimentos e novas experiências.

Paula tornou-se uma amiga muito querida, com quem sei que posso

contar sempre que eu precisar não somente em relação a

questões profissionais. Ela sempre estará em meu coração.

Agradeço a Mary Zelinski, que foi uma mentora para a realização deste trabalho,

pelo carinho com que fui recebida desde o momento em que cheguei nos Estados Unidos,

pelo cuidado em sempre mostrar-se preocupada com meu bem estar, pelos momentos únicos

vividos ao lado dela e sua família, e pelo incentivo e inspiração

para a realização deste trabalho.

Para mim, Mary foi muito mais do que uma mentora. Considero-a como parte de

minha família e sempre a terei presente no meu coração.

Agradeço a Richard Stouffer, que foi um mentor para a realização deste trabalho,

pela atenção com que fui recebeida e pelo carinho com que fui tratada

por ele, por sua esposa e integrantes de seu laboratório,

em especial Cecily Bishop e Ted Molkness.

Durante o perído em seu laboratório, pude vivenciar o que é ser um verdadeiro cientista.

Aprendi valiosas lições de vida. São amigos que sempre irei lembrar por toda a vida.

Com Dick, minha maior lição foi como fazer as perguntas certas, e que muitas vezes

um bom resultado em um trabalho científico depende esscialmente de uma boa pergunta.

Agradeço ao Conn, que foi o responsável por proporcionar minha ida aos Estados Unidos

através da aprovação do meu currículo e cartas de referência,e concessão da

bolsa Fogarty, muito importante para minha estadia fora do país.

Agradeço também a Janete Anselmo Franci, que por sua vez,

foi iluminada e guiada por forças maiores, que me fez o convite e insistiu para que eu fosse.

Sempre terei ambos como figuras muito importantes em minha vida.

Agradeço a todos os meus amigos do Oregon National Research Primate Center/

Oregon Health & Science University, pelo carinho com que fui recebida

e sempre tratada por todos, desde a equipe do laboratório

Jing Xu, Alison Ting, Dick Yeoman, Maralee Lowson, Cecily Bishop, Ted Molkness, Traci,

Jenniffer, Jay, Lee, e as equipes dos outros labratórios, que também tornaram-se amigas.

Um agradecimento muito especial a Jing Xu, que me ensinou como isolar um bom folículo, e

pela contínua ajuda até os dia de hoje com os artigos que escrevemos juntas,

e com os experimentos que desenvolvo no Brasil.

Um agradecimento especial a Francis Pau, diretor da Divisão de Estudos de

Endocrinologia, pela atenção nas horas de discussão para

interpretação de resultados e padronização de testes hormonais.

Pela paciência, que deve ter trazido dos tempos em que viveu na China, em me ouvir falar

de minha mãe e da saudade que tinha da minha terra.

Agradeço a todas as minhas queridas amigas da USP, Jacira Ribeiro Campos,

Michele da Broi, Luciana Azôr Dib, Juliana Meola e Daiane Bulgarelli,

pelo carinho, força e incentivo.

Agredeço aos membros da banca: Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani,pela oportunidade de

ingressarno Laboratório e por ter acreditado na minha capacidade;

Profa. Dra. Ana Carolina Japur de As Rosa e Silva, pela atenção sempre prestada

e pela parceria em nossa importante missão dentro da Rede Brasileira de

Oncofertilidade/Brazilian Oncofertility Consortium;

Profa. Dra. Adriana Bos Mikich, por ter aceito o convite e por

ser sempre uma inspiração para a realização de meus trabalhos;

Prof. Dr. Ricardo Mello Marinho, pelo carinho e atenção sempre prestados,

por ter me recebido na Pró-Criar de portas abertas e por sempre confiar em meu trabalho, e

pela precisa ajuda e trabalho diário para a organização da Rede Brasileira de

Oncofertilidade/Brazilian Oncofertility Consortium e em nossa missão de

contribuir para a preservação da fertilidade em pacientes com câncer.

Agradeço ao Departamento de Ginecologia e Obstetrícia/FMRP/USP, em especial

a secretária Suelen,pela disponibilidade em ajudar sempre, e também pela concessão da

bolsa institucional CAPES, tão importante para a concretização deste trabalho.

Epígrafe

“O cientista não é o homem que fornece as verdadeiras respostas,

é quem faz as verdadeiras perguntas”.

(Claude Lévi-Strauss)

RESUMO

RODRIGUES, JK. Papel dos androgênios na sobrevida, crescimento e secreção de hormônios esteróides e anti-mülleriano por folículos de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. INTRODUÇÃO: Por muito tempo, os androgênios foram considerados como prejudiciais a maturação folicular. Todavia, resultados de estudos com diferentes espécies de mamíferos e humanos tem contribuído para que este paradigma tenha sofrido mudanças consideráveis nos últimos anos. Fortes evidências sugerem que os androgênios possuem ações parácrinas e autócrinas no ovário, e que promovem crescimento folicular precoce. Contudo, a ação androgênica nos folículos pode ser estágio ou dose dependente, e muito pouco se sabe ainda sobre a ação local androgênica no folículo em desenvolvimento. OBJETIVOS: O presente estudo teve como objetivo geral avaliar os efeitos da ablação da produção de esteróides e o papel dos androgênios (testosterona e dehidrosterona) no desenvolvimento de folículos secundários de primatas não humanos (Macaca mulatta) isolados de tecido ovariano a fresco e cultivados in vitro por 40 dias em matrix 3D de alginato. METODOLOGIA: Quatorze fêmeas adultas de Macaca mulata, com ciclos menstruais regulares, foram usadas neste estudo. O córtex ovariano foi cortado em pequenos cubos e os folículos secundários foram mecanicamente isolados e cultivados individualmente durante 40 dias em matriz 3D a base de alginato em meio de cultivo contendo FSH, soro, transferrina, fetuína, insulina e selenito de sódio. Foram realizados 3 experimentos: Experimento 1: Ablação da produção de esteróides, com o uso do trilostano (TRL). Folículos de 6 animais foram distribuídos em 3 grupos – Controle (recebeu veículo), TRL (recebeu TRL desde o início do cultivo) e TRL2 (recebeu TRL após 2 semanas de cultivo); Experimento 2: Reposição de testosterona. Folículos de 4 animais foram distribuídos em 4 grupos: Controle (recebeu veículo), TRL (recebeu TRL desde o início do cultivo), Testosterona (T) baixa (recebeu TRL e testosterona 20 ng/mL), T alta (recebeu TRL e testosterona 50 ng/mL); Experimento 3: Reposição de dehidrotestosterona (DHT). Folículos de 4 animais foram distribuídos em 4 grupos: Controle (recebeu veículo), TRL (recebeu TRL desde o início do cultivo), DHT (recebeu DHT 50 ng/mL), DHT + TRL (recebeu TRL e DHT 50 ng/mL). As variáveis analisadas foram a sobrevida, o crescimento, o desenvolvimento (formação de antro e morfologia) e a produção de hormônios esteróides pelos folículos, além do grau de maturação e qualidade oocitária. RESULTADOS: A porcentagem de folículos sobreviventes em cultivo, o crescimento e a formação de antro foi menor em presença de TRL em todos os experimentos, em comparação com o grupo controle. A reposição de T e DHT, na presença de TRL, recuperaram a sobrevida, o crescimento, a formação de antro, a produção hormonal, e a qualidade e maturidade oocitária, comparáveis ao grupo controle. CONCLUSÕES: Este estudo apresentou evidências do papel local essencial dos androgênios desde o início da foliculogênese em primatas não humanos, fortalecendo a existência de mecanismos moleculares que regulam a atividade androgênica, e trazendo a perspectiva de novas possíveis interações entre os androgênios e outros hormônios esteróides. Nossos achados mostraram claramente que a T e a DHT podem recuperar a sobrevida, o crescimento, a formação de antro, a produção hormonal e a viabilidade oocitária de folículos pré-antrais cultivados in vitro em matrix 3D de alginato, expostos a ablação da produção de esteróides. Os novos conhecimentos oriundos deste estudo contribuem para o melhor entendimento da dinâmica da foliculogênse em primatas, que ainda é muito pouco compreendida, além de auxiliar na identificação das condições ótimas para o cultivo folicular in vitro, cuja melhoria é fundamental para propiciar a obtenção de oócitos maduros saudáveis após o descongelamento do tecido ovariano de pacientes oncológicas que desejam preservar sua fertilidade futura. Palavras-chave: Foliculogênese; androgênios; cultivo folicular 3D; primatas; esteróides; testosterona; dihidrotestosterona

ABSTRACT

RODRIGUES, JK. Role of androgens on survival, growth and secretion of steroid hormones and anti-mülleriano by follicles of Macaca mulata cultured indivuadually in 3D matrix. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. INTRODUCTION: For the longest, androgens have been considered detrimental to follicle maturation. However results from studies with different species of mammals and humans has contributed for this idea has being undergone considerable changes in recent years. Strong evidence suggests that androgens have autocrine and paracrine actions in the ovary, and that promote early follicular growth. However, androgen action on specific stages of follicles may be dose dependent, and very little is known about the androgen local action in the developing follicle. OBJECTIVES: The present study had as main objective to evaluate the effects of ablation of steroid production and the role of androgens (testosterone and dehydrotestosterone) in the development of secondary follicles of non-human primates (rhesus monkeys - Macaca mulatta) isolated from fresh ovarian tissue and cultivated for 5 weeks in 3D alginate matrix. MATERIAL AND METHODS: Fourteen adult female of Macaca mulatta, exhibiting regular menstrual cycles were used in this study. The ovarian cortex was cut into small cubes and secondary follicles were mechanically isolated and cultured for 5 weeks in a 3D alginate matrix and culture medium containing FSH, serum, transferrin, fetuin, insulin and sodium selenite. Experiment 1: Ablation of steroid production with use of trilostane (TRL). Follicles of 6 animals were divided into 3 groups - control (receiving vehicle), TRL (TRL received since the start of culture) and TRL2 (TRL received after 2 weeks of culture); Experiment 2: Testosterone replacement. Follicles of 4 animals were divided into 4 groups: control (receiving vehicle), TRL (TRL received since the start of culture), T Low (TRL + testosterone 20 ng/mL ), high T (TRL + testosterone 50 ng/mL ); Experiment 3: Reinstatement of dihydrotestosterone (DHT). Follicles of 4 animals were divided into 4 groups: control (receiving vehicle), TRL (TRL received since the beginning of culture), DHT (DHT 50 ng/mL), DHT + TRL (TRL + DHT 50 ng/mL). The variables analysed were: survival, growth, follicle development (antrum formation and morphology) and the steroid hormone production), and also the oocyte degree of maturation and viability. RESULTS: The percentage of surviving follicles in culture, growth and antrum formation was lower in the presence of TRL in all experiments, compared with the control group. Replacement of T and DHT in the presence of TRL, recovered the survival, growth, antrum formation, hormone production, and the oocyte quality and maturity. CONCLUSIONS: This in vitro study showed evidence of the essential role of androgens in the early follicular phase in primates, reinforcing the existence of molecular links that regulate the activity of ARs and androgenic activity and possible new interactions between androgens with other steroid hormones. Our findings clearly demonstrated that T and DHT can restore the survival, growth, antrum formation, the hormone production and oocyte viability of preantral follicles cultured in vitro in a 3D alginate matrix exposed to ablation steroid production. The new knowledge that can be obtained by this type of study can help in understanding the dynamics of follicular development process that is still poorly understood and to contribute to the improvement of this in vitro technique that can be used as an alternative for young cancer patients wish to preserve their fertility. Keywords: Folliculogenesis; androgens; 3D follicle culture; primates; steroids; testosterone; dihydrotestosterone

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Síntese e mecanismo de ação dos hormônios esteróides no folículo ovariano ... 26

Figura 2. Esquema ilustrativo das diferentes classes de desenvolvimento folicular .......... 32

Figura 3. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a sobrevida folicular e a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ................................... 56

Figura 4. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a produção de progesterona e pregnenolona por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ................................... 58

Figura 5. Efeito da reposição de T sobre a sobrevida e formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas .......................................................................................................... ...59

Figura 6. Efeito da reposição de T sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas .................................................................................... 61

Figura 7. Efeito da reposição de T sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. ... 61

Figura 8. Efeito da reposição de T e DHT sobre a sobrevida de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ...... ...64

Figura 9. Efeito da reposição de T e DHT sobre a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ............................................................................................................. 65

Figura 10. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ..................................................................................... 67

Figura 11. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas ............................................................................................................. 68

Figura 12. Folículo secundário em desenvolvimento até a obtenção de embrião................. 70

LISTA DE TABELAS

Tabela I. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata na quarta semana cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. .......... 57

Tabela II. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG). ....................................................................................... 58

Tabela III. Efeito da reposição de T sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.. ................................................................................... 60

Tabela IV. Efeito da reposição de T nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).). .................. 63

Tabela V. Efeito da reposição de T e DHT sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas .................................................... 66

Tabela VI. Efeito da reposição de T e DHT nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG) ...... 69

LISTA DE SIGLAS

3D – Tridimencional

3-βHSD - 3-beta-hidroxiesteróide desidrogenase

AMH - Hormônio anti-Mulleriano

ARs – Receptores androgênicos

ART - Assisted Reproductive Technology

CGs – Células da granulosa

CRTL – Controle

DHEA – Dehidroepiandrosterona

DHT – Dididrotestosterona

EGF - Fator de crescimento epidérmico

ERs – Receptores estrogênicos

FIV – Fertilização in vitro

FSH – Hormônio folículo estimulante

hCG - Gonadotrofina coriônica humana

ICSI - Injeção intracitoplasmática do espermatozoide

IGF-1 - Fator semelhante a insulina

LH – Hormônio luteinizante

MAPK - kinase ativada por mitógenos

MI – Metáfase I

MII – Metáfase II

MPF - Fator promotor da maturação

ONPRC - Oregon National Primate Research Center

PRs – Receptores progestagênicos

S-DHEA - Sulfato de dehidroepiandrosterona

SOP – Síndrome dos ovários policísticos

T – Testosterona

TRL – Trilostano

TRL2 – Trilostano 2

TZPs - Projeções transzonais

VG – Vesícula germinativa

ZP – Zona pelúcida

SUMÁRIO

Introdução ............................................................................................................................... 19

Revisão da Literatura ............................................................................................................. 22

Foliculogênese .......................................................................................................................... 23

Hormônios ................................................................................................................................ 24

Estradiol .................................................................................................................................... 27

Progesterona ............................................................................................................................. 28

Androgênios ............................................................................................................................. 29

Classificação de folículos ovarianos ........................................................................................ 31

Folículos primordiais ................................................................................................................ 32

Folículos primários ................................................................................................................... 33

Folículos secundários ............................................................................................................... 34

Folículos terciários ou antrais ................................................................................................... 35

Folículo pré-ovulatório ............................................................................................................. 36

Maturação oocitária .................................................................................................................. 37

Ciclo ovariano em primatas não-humanos ............................................................................... 38

Técnicas de isolamento folicular .............................................................................................. 38

Cultivo folicular ........................................................................................................................ 40

Cultivo folicular em humanos .................................................................................................. 44

Objetivos .................................................................................................................................. 47

Objetivo Geral .......................................................................................................................... 48

Objetivos Específicos ............................................................................................................... 48

Material e Métodos ................................................................................................................. 49

Animais e coleta ovariana......................................................................................................... 50

Isolamento folicular, encapsulamento e cultivo ....................................................................... 51

Experimento 1: Ablação da esteroidogênese ............................................................................ 52

Experimento 2: Reposição de testosterona ............................................................................... 52

Experimento 3: Reposição de dihidrotestosterona ................................................................... 52

Sobrevida folicular, crescimento e formação de antro ............................................................. 53

Classificação do Crescimento folicular .................................................................................... 53

Dosagem de esteróides ovarianos e AMH ................................................................................ 53

Coleta de oócitos, maturação e fertilização .............................................................................. 54

Análise estatística ..................................................................................................................... 54

Resultados ............................................................................................................................... 55

Experimento 1 - Ablação da esteroidogênese........................................................................... 56

Experimento 2 – Reposição de testosterona ............................................................................. 59

Experimento 3 – Reposição de dihidrotestosterona ................................................................. 64

Discussão ................................................................................................................................. 71

Conclusões ............................................................................................................................... 80

Referências .............................................................................................................................. 82

Anexos .................................................................................................................................... 101

Anexo A - Manuscrito Title: Direct actions of androgen on the survival, growth and secretion of steroids and anti-mullerian hormone by individual follicles from rhesus monkeys during 3-D culture ................................................................................................... 102

Anexo B - Artigo de revisão submetido In vitro follicle maturation: potential for fertility preservation in patients with cancer ....................................................................................... 131

Introdução

Introdução | 20

Além do reconhecido papel dos androgênios como precursores do hormônio esteróide,

estradiol, e possíveis ações endócrinas no sexo feminino, evidências consideráveis sugerem

que os androgênios possuem ações parácrinas e autócrinas no ovário, particularmente no

folículo em desenvolvimento (ALBERTINI et al., 2001; KIMURA et al., 2007; LENIE,

SMITZ, 2009; WALTERS et al., 2008; 2012). Estudos recentes reportando a expressão de

receptores de androgênio (ARs) em folículos em desenvolvimento (KIMURA et al., 2007;

LENIE, SMITZ, 2009) são consistentes com o papel essencial dos androgênios na fisiologia

reprodutiva do sexo feminino (WALTERS et al., 2008; WALTERS et al., 2010; LEBBE,

WOODRUFF, 2013). Evidências da presença e atividade de ARs em todos os estágios do

crescimento folicular em diferentes espécies (WALTERS et al., 2008; 2012) incluindo

murinos (TETSUKA et al., 1995; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2012; 2013), suínos

(CAMPO et al., 1985a; CÁRDENAS, POPE, 2002), bovinos (BRAW-TAL, YOSSEFI, 1997;

HAMPTON et al., 2004; GLISTER, et al., 2010), primatas não-humanos (HILLIER et al.,

1997; WEIL et al., 1998; DUFFY et al., 1999; MCEWAN et al., 2010) e humanos (HORIE et

al., 1992; SUZUKI et al., 1994; KIM et al., 2011) sugerem que os androgênios possuem

efeitos ao longo do desenvolvimento folicular. Por meio de observações em camundongos

fêmea, foi descoberto que a inativação de ARs resulta em falência ovariana prematura (FOP),

indicando que o processo de foliculogênese normal requer ação androgênica mediada por

receptores androgênicos (KIMURA et al., 2007; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2013).

Em ovários humanos, pode ser observada a expressão proteica de ARs nas células da

granulosa, células da teca e células do estroma durante quase todos os estágios do ciclo

menstrual. Contudo, existe uma diferença entre as observações em relação a intensidade

imunohistoquímica observada nos estudos que comprovam este fato (HORIE et al., 1992), o

que pode estar relacionado a uma expressão variável destes receptores, que depende do status

do desenvolvimento folicular (DRUMMOND, 2006).

Evidências sugerem que os androgênios promovem crescimento folicular precoce

(HILLIER, DE ZWART, 1981; DURLINGER et al., 2000; YOUNG et al., 2012). Em

sistemas de cultivo in vitro de folículos de camundongo, a exposição a androgênios contribuiu

para o desenvolvimento de folículos pré-antrais (MURRAY et al., 1998); e aumentou o

diâmetro folicular (WANG et al., 2001). Outros estudos também observaram que doses

farmacológicas de testosterona promovem desenvolvimento precoce em folículos de bovinos

(YANG, FORTUNE, 2006) e macacos (HARLOW et al., 1986; 1988; VENDOLA et al.,

1999a). Estes dados reforçam os esforços clínicos em determinar se o pré-tratamento com

testosterona transdérmica contribuí para o aumento da resposta ovariana a gonadotrofinas em

Introdução | 21

pacientes má-respondedoras em ciclos de fertilização in vitro (FIV) (BALASCH et al., 2006;

FÁBREGUES et al., 2009; SONMEZER et al., 2009a; SÖNMEZER et al., 2009b; WISER et

al., 2010).

Contudo, a ação androgênica nos folículos pode ser estágio e/ou dose dependente. Por

exemplo, a ação androgênica pode se tornar prejudicial em folículos antrais, mostrando

efeitos anti-maturação e anti-crescimento neste estágio (HILLIER, DE ZWART, 1981;

DURLINGER et al., 2000; YOUNG et al., 2012). Desta forma, foi proposto que as ações dos

androgênios podem ser, dependendo do estágio folicular, promotores ou inibidores do

crescimento folicular (HILLIER, TETSUKA, 1997; VENDOLA et al., 1998). A ação

androgênica pode também depender de seus níveis intrafoliculares, com baixos níveis

exigidos para uma foliculogênese normal e níveis aumentados causando uma disfunção

folicular. Estudos com mulheres portadores da síndrome dos ovários policísticos (SOP),

frequentemente sugerem que a hiperandrogenia afeta negativamente o desenvolvimento

folicular e a maturação oocitária (DUMESIC et al., 2008; LEBBE, WOODRUFF, 2013).

Estudos mais detalhados são necessários para definir os efeitos diretos dos

androgênios nos folículos (HARLOW et al., 1988; VENDOLA et al., 1999a, YANG,

FORTUNE, 2006) e seus oócitos (VENDOLA et al., 1999b) em estágios específicos da

foliculogênese, principalmente em primatas, o que estimulou a realização do presente estudo.

O sistema de cultivo tridimensional (3D), usando folículos individuais encapsulados no

biomaterial alginato (XU et al., 2009b; XU et al., 2010), podem contribuir para estudos sobre

as ações diretas de hormônios e fatores locais na foliculogênese em primatas. Recentemente

este sistema de cultivo foi usado por nosso grupo para o desenvolvimento de folículos de

primatas (macacos rhesus) a partir do estágio pré-antral (secundário) até estágio antral de

pequeno diâmetro, com a obtenção de função esteroidogênica e maturação oocitária (XU et

al., 2009a,b; 2010). O presente estudo teve como objetivo, avaliar pela primeira vez as ações

dos androgênios no desenvolvimento folicular (sobrevida, formação de antro, produção

hormonal e maturação oocitária), em folículos pré-antrais individuais de primatas (macacos

rhesus), usando o sistema de cultivo em matrix 3D, por meio da ablação da produção de

esteróides e reposição de testosterona (T) e dihidrotestosterona (DHT).

Revisão da Literatura

Revisão da Literatura | 23

Foliculogênese

O desenvolvimento folicular ovariano consiste em um processo cíclico e contínuo,

dependente de sinais endócrinos, parácrinos e autócrinos. Apesar de diferentes fatores

envolvidos no crescimento folicular já terem sido identificados e caracterizados, permanece

desconhecido o motivo pelo qual um ou mais folículos, dependendo da espécie, chega ao

estágio dominante e o restante regride (VAN DEN HURK, ZHAO, 2005).

O ovário é uma estrutura compartimentalizada, com diferentes e variáveis

propriedades biológicas. Em resposta à secreção cíclica de Hormônio Folículo Estimulante

(FSH) e Hormônio Luteinizante (LH), os compartimentos somático e germinativo do folículo

ovariano interagem de forma altamente integrada para desempenhar duas funções principais:

uma endócrina, produção e liberação dos hormônios esteróides e outros peptídios, e a outra

gametogênica, produção de um oócito fertilizável (NAVARRO et al., 2012).

Em humanos, com aproximadamente 20 semanas de gestação, 6 a 7 milhões de células

germinativas, 70% de oócitos primários e 30% de oogônias, estão presentes nos ovários (BAKER,

1963). A perda pré-natal da maioria dos oócitos parece ser um mecanismo universal. As oogônias

que não são transformadas em oócitos primários passarão por atresia com rápido declínio durante

a vida fetal, resultando em um total de 1 a 2 milhões de folículos primordiais ao nascimento.

Como a mitose de células germinativas supostamente não ocorre após o nascimento e a atresia

folicular continua, apenas 300 a 500 mil células germinativas estão presentes nos ovários durante

a puberdade (BAKER, 1963). Esta população finita de folículos representa o capital de células

germinativas disponíveis para entrar no ciclo folicular. Apesar do conceito bem estabelecido sobre

o estoque finito e não renovável de células germinativas, estudos recentes mostram indícios da

continuidade da oogênese e foliculogênese no período pós-natal, pela diferenciação de células-

tronco (JOHNSON et al., 2004). Todavia ainda não se sabe se ela realmente ocorre naturalmente e

em quais condições (NAVARRO et al., 2012).

A foliculogênese inclui o desenvolvimento do folículo primordial em primário,

secundário, pré-antral, antral inicial e pré-ovulatório (ou De Graff). Do estágio pré-antral ao

pré-ovulatório, tem duração média estimada em 100 dias no ovário humano (GOUGEON,

1996). Tem sido demonstrado que a influência relativa do oócito na foliculogênese é maior

nos folículos primordiais e pré-antrais, enquanto o componente somático, células da granulosa

e as gonadotrofinas, exercem sua maior influência durante as últimas fases do

desenvolvimento folicular (NAVARRO et al., 2012).

Nos primeiros dias do ciclo menstrual, os níveis circulantes de FSH aumentam, e por

consequência, um grupo de folículos antrais não sofre mais o processo de apoptose, que os levariam


à atresia folicular. Dentro deste grupo, alguns folículos começam a crescer mais rapidamente e a

produzir maiores quantidades de estrógeno e inibina. Um deles é dominante e então selecionado à

ovulação. O folículo selecionado torna-se altamente sensível ao FSH, devido à expressão aumentada

de receptores de FSH e LH, produzindo mais estrógeno do que os folículos remanescentes.

O aumento de estradiol e inibina desencadeia um mecanismo de feedback negativo,

que previne outros folículos de continuar seu desenvolvimento (MCGEE, HSUEH, 2000;

ZELEZNIK et al., 1981). As células da teca e da granulosa também apresentam um papel

importante, uma vez que são responsáveis pela produção de hormônios esteróides, necessários

para um normal crescimento folicular. Além disso, fatores de crescimento ovarianos, citocinas

e neuropeptídios, como por exemplo, os fatores fator de crescimento epidermal (EGF), fator

de crescimento transformante alpha (TGF- α), o fator ligante de heparina semelhante ao EGF

(HB-EGF), a anfiregulina, fator semelhante a insulina (IGF-I) participam como reguladores

do desenvolvimento folicular (PICTON et al., 2008; TESONE et al., 2009).

O decréscimo nos níveis de FSH gera uma diminuição da atividade da aromatase

dependente do FSH, o que limita a disponibilidade de estrógeno para os folículos menos

maduros, levando-os à atresia, enquanto no folículo dominante, a teca torna-se mais

vascularizada, gerando um maior fornecimento de FSH ao folículo, o que resulta na

estimulação da proliferação das células da granulosa (TESONE et al., 2009).

O microambiente do antro do folículo dominante facilita o acesso de FSH e LH, e com

isso, amplifica os sinais autócrinos e parácrinos do ovário. A síntese de hormônios esteróides,

androgênios, estrogênios e progestagênios, é compartimentalizada entre os folículos no ovário

(MCNATTY et al., 1979; HILLIER et al., 1980). As células da granulosa, em resposta às

gonadotrofinas, produzem progesterona, que se difunde pelas células da teca, que serve como

substrato para síntese de androgênio sob o controle do LH (MCNATTY, 1980). Os

androgênios se difundem através da membrana basal para as células da granulosa, onde são

aromatizados em estrogênios sob o controle do FSH (MOON et al., 1978).

Enquanto dentro de um mesmo folículo todas as células estão expostas a um mesmo

microambiente, existem outros folículos no ovário em diferentes estágios de crescimento e

desenvolvimento.

Hormônios

Hormônios esteróides são moléculas lipídicas que têm como precursor comum o

colesterol, sintetizados por desidrogenases e enzimas do citocromo P450. Há quatro grandes

classes de hormônios esteroidais: progestinas, androgênios, estrogênios e corticoides. Todos


eles estão relacionados ao processo da foliculogênese. Apesar do grande número de trabalhos

relacionados com o estudo dos esteróides, alguns aspectos relativos à síntese e ao mecanismo

de ação destes hormônios ainda permanecem pouco esclarecidos.

Estudos demonstram que o estradiol pode inibir a apoptose de células foliculares e luteais

em suínos (MURDOCH, 1998) e promover o crescimento in vitro de folículos ovarianos bovinos

(HULSHOF et al., 1995). Além disso, este hormônio, em associação ao FSH, é capaz de manter a

viabilidade folicular em caprinos após sete dias de cultivo in vitro (LIMA-VERDE et al., 2010). A

progesterona, além de regular os níveis de gonadotrofinas, pode ser capaz de inibir a apoptose de

células da granulosa e da teca em camundongos (PELUSO, 2006). Alguns estudos com primatas

mostraram que os androgênios são reguladores positivos do desenvolvimento folicular,

aumentando os receptores para FSH em células da granulosa e promovendo o crescimento de

pequenos folículos (VENDOLA et al., 1998; WEIL et al., 1999).

Sob a ação do LH nas células da teca, o colesterol circulante é captado e convertido

em pregnenolona, e esta em progesterona, por meio da enzima 3β-hidroxidesidrogenase

(VALDEZ et al., 2005; MIZRACHI, AUCHUS, 2009; Fig. 1). A StAR (proteína reguladora

aguda da esteroidogênese) faz o transporte do colesterol para dentro da mitocôndria, onde se

encontra a enzima desmolase, pertencente ao complexo enzimático P450, que participa da

conversão do colesterol em pregnenolona (GIOMETTI et al., 2009). Após ser produzida, a

progesterona poderá exercer suas funções biológicas no organismo ou servir como substrato

para a produção de androstenediona, mediante a atuação da enzima 17,20-liase. Assim como a

progesterona, a androstenediona poderá atuar nas suas funções orgânicas ou ser convertida em

outro androgêno, a testosterona, sob a ação da 17β-redutase.

Este hormônio, por sua vez, poderá atuar no organismo, convertendo-se em di-

hidrotestosterona pela enzima 5α-redutase ou penetrar nas células da granulosa e ser

convertido em estradiol pela enzima aromatase, que tem sua atividade estimulada pela atuação

do FSH nas células da granulosa (DRUMMOND, FINDLAY, 1999; YARAK et al., 2005;

STOCCO, 2008). O estradiol também pode ser produzido por uma segunda via, na qual a

androstenediona sofre aromatização nas células da granulosa e é convertida em estrona, e esta

em estradiol, pela enzima 17β-redutase (YARAK et al., 2005). As altas concentrações de

estradiol antes da ovulação inibem a ação do FSH nas células da granulosa e promovem o

estímulo para a produção de mais progesterona, devido ao início do processo de luteinização,

no qual este hormônio é produzido em grandes quantidades. A figura 1 resume a síntese e o

mecanismo de ação dos hormônios esteróides no folículo ovariano.


Figura 1. Síntese e mecanismo de ação dos hormônios esteróides no folículo ovariano.

Nota. LH: Hormônio luteinizante; FSH: Hormônio folículo estimulante; P450: Enzima responsável pela conversão de pregnenolona em 17-α-hidroxipregnenolona. (LIMA-VERDE et al., 2010).


O IGF-1, por meio de seu receptor em CG, promove o aumento dos níveis de

gonadotrofinas e estimula a atividade da aromatase, provocando a diferenciação de células da

granulosa, e suprimindo a apoptose folicular (MCGEE, HSUEH, 2000; MINEGISHI, et al.,

2000). Dependendo do estágio de desenvolvimento folicular, a esteroidogênese nas células da

granulosa pode aumentar ou diminuir. Em folículos pré-antrais, a atividade P450 é baixa, mas

com altos níveis de expressão dos receptores de androgênios. A androstenediona se difunde a

partir das células da teca para as células da granulosa, onde é convertida em testosterona. A

testosterona ativa, então, os receptores de androgênios, levando a um aumento da expressão

de IGF-1 e, consequentemente, à estimulação da proliferação das células da granulosa e ao

aumento dos efeitos do FSH induzidos pela P450 (VENDOLA et al., 1999b).

A ação dos esteróides nas suas células-alvo se dá via receptores nucleares específicos,

presentes nos ovários de diferentes espécies, tais como ovinos (JUENGEL et al., 2006),

primatas (SAUNDERS et al., 2000), bovinos (VAN DEN BROECK et al., 2002) e suínos

(CARDENAS, POPE, 2002). Além disso, foi relatado que estes hormônios podem atuar

através de canais de cálcio na membrana celular, em regiões onde seus receptores não estão

presentes (GUTIERREZ et al., 2008). Dessa forma, os efeitos dos esteróides nas células

podem ocorrer pelo método clássico, via receptores, e pelo método não genômico, que não

envolve a modificação de atividade gênica (DODE, GRAVES, 2003).

Estradiol

Os efeitos biológicos do estradiol (E2) foram inicialmente identificados como sendo

relacionados com a reprodução e a fertilidade. As funções fisiológicas do E2 compreendem

desenvolvimento de características sexuais secundárias, regulação da secreção de

gonadotrofinas para a ovulação, síntese de lipoproteínas, preparação dos tecidos para

responder à progesterona, manutenção da massa óssea, prevenção da atrofia do trato

urogenital e manutenção das funções cognitivas (NELSON, BULUN, 2001).

A capacidade dos folículos de produzirem estrogênios aparece primeiramente em

estádios pré-antrais avançados. Apesar de ser relatada atividade aromática em pequenos

folículos pré-antrais, a produção de E2 neste estágio de desenvolvimento é limitada pela

incapacidade de produção de substratos para os androgênios necessários para a aromatização

do E2 (DRUMMOND, FINDLAY, 1999). Apesar disso, já foi demonstrada a produção de

estradiol por folículos pré-antrais durante o cultivo in vitro (BISHONGA et al., 2001; XU et

al., 2010).


Apesar da ação do E2 ser mediada por receptores, existem evidências de que o E2

pode atuar diretamente nos oócitos produzindo mudanças nos seus mecanismos de liberação

de Ca, supostamente envolvido na maturação citoplasmática (CHIAN et al., 1999).

As ações proliferativas do E2 e do FSH foram primeiro relatadas em ratas

hipofisectomizadas, nas quais o tratamento com E2 exógeno resultou na proliferação de

células da granulosa em pequenos folículos pré-antrais e uma concomitante redução da atresia

(WILLIAMS, 1940; PAYNE, HELLBAUM, 1955), mas não na formação de antro

(GOLDENBERG et al., 1972). Também foi demonstrado que a combinação E2 e FSH ou

androgênio e FSH pode estimular a proliferação de células da granulosa in vitro, e este efeito

pode ser amplificado pela insulina ou IGF-1 (BLEY et al., 1997). Bolamba et al. (2006)

cultivaram folículos pre-antrais avançados e folículos antrais para MIV e demonstraram haver

interação entre E2, FSH, LH e fator de crescimento epidermal (EGF) na promoção e expansão

das células do cumulus. Rao et al. (2002) obtiveram altas taxas de maturação oocitária

utilizando soro de ovelha em estro, FSH, LH e E2.

Progesterona

A progesterona (P4) é um hormônio esteróide sintetizado pelo ovário, com sua

quantidade secretada dependendo dos estímulos das gonadotrofinas e do status fisiológico do

ovário. Além disso, células da granulosa, células da teca, do estroma e luteais secretam P4 em

diferentes níveis (GORE-LANGTON, ARMSTRONG, 1988; DULEBA et al., 1999). Uma

vez secretada pelo ovário, a P4 atua no eixo hipotalâmico-hipofisário regulando a secreção de

gonadotrofinas e, consequentemente, o crescimento folicular, a ovulação e a luteinização

(PELUSO, 2006).

Os efeitos da P4 no ovário são mediados indiretamente, via eixo hipotalâmico-

hipofisário, ou diretamente, via interações com os seus receptores no ovário

(SLOMCZYNSKA et al., 2000). Existem duas formas funcionais de receptores para a P4:

PRA e PRB (GAVA et al., 2004). Ovários de camundongos com deficiência do receptor PRA

contêm vários folículos anovulatórios e uma redução no número de ovulações (MULAC-

JERICEVIC et al., 2000). Comparativamente, camundongos com deficiência do PRB

desenvolvem ovários funcionais normais, os quais ovulam em resposta às gonadotrofinas e

geram crias normais (MULAC-JERICEVIC et al., 2003). Em humanos e outros primatas,

PRA e PRB são expressos igualmente nas CG de folículos pré-ovulatórios (SUZUKI et al.,


1994; DUFFY, STOUFFER, 1995), e ambos continuam a ser expressos no corpo lúteo

durante a fase luteal do ciclo (OTTANDER et al., 2000).

Estudos in vitro mostraram que a P4 aumenta a sua própria secreção pelas células da

granulosa (SCHREIBER et al., 1980), suprime a produção de E2 (FORTUNE, VINCENT,

1983) e reduz a taxa mitótica nessas células (PELUSO, PAPPALARDO, 1998). Com relação

à maturação oocitária, já foi demonstrado que a suplementação do meio de MIV com E2 ou

P4 isolados aumentou a taxa de oócitos maduros (MII) em caninos (KIM et al., 2005). A

suplementação do meio com E2 e P4 juntos pode aumentar ou reduzir a taxa de MII,

dependendo da concentração de P4 (melhores resultados em altas concentrações). Também

em cadelas, a suplementação do meio de MIV com 20 ug/mL de P4 aumentou as taxas de

maturação oócitária na presença de co-cultivo com células do oviduto (VANNUCCHI et al.,

2006). Em primatas não humanos, a suplementação com P4 na presença ou ausência de

gonadotrofinas não melhorou a maturação nuclear oocitária, mas melhorou o

desenvolvimento embrionário após MIV-FIV (ZHENG et al., 2003).

Androgênios

Os androgênios são os esteróides sexuais circulantes mais abundantes, tanto no

homem quanto na mulher, e são precursores obrigatórios na biossíntese dos estrogênios. Na

mulher, circulam em concentrações na faixa do nanomolar enquanto os estrogênios têm

concentração na faixa do picomolar (GOETZ et al., 2010).

Durante a foliculogênese, os androgênios são sintetizados pelas células da teca de

folículos em crescimento em resposta ao LH. São secretados cinco androgênios: testosterona,

sulfato de dehidroepiandrosterona (S-DHEA), dehidroepiandrosterona (DHEA),

androstenediona e androstenediol, que possui atividade androgênica e estrogênica. S-DHEA,

DHEA e androstenediona são precursores da testosterona, sendo que apenas a testosterona e

seu metabólito ativo, a dehidrosterona (DHT), possuem atividade androgênica direta, ativando

receptores androgênicos (GOETZ et al., 2010).

Os androgênios se difundem através da membrana basal do folículo e nas células da

granulosa, atuando como substrato da aromatase, sendo precursores de estradiol; e como

hormônio, via receptores, potencializam a ação do FSH nas enzimas estrogênicas (CHENG et

al., 2002; TANIGUCHI et al., 2007). Os androgênios são os esteróides predominantes

produzidos durante o desenvolvimento folicular inicial e estão presentes em altas

concentrações no fluido folicular.


Os receptores de androgênios (ARs) já foram localizados em célula da granulosa de

folículos em desenvolvimento de ovelhas (CAMPO et al., 1985b), galinhas (YOSHIMURA et

al., 1993), macacas (HILD-PETITO et al., 1991) e mulheres (HORIE et al., 1992), e em

folículos pré-antrais e antrais de ratas (TETSUKA et al., 1995). Esses receptores também

foram encontrados no corpo lúteo de porcas (SLOMCZYNSKA et al., 2000) e macacas

(DUFFY et al., 1999). Além disso, foi demonstrado que a presença de androgênios causou um

aparecimento rápido de Ca no citoplasma de células da granulosa luteinizadas em mulheres,

sugerindo que a ação desses hormônios pode ocorrer também via canais de cálcio na

membrana plasmática (MACHELON, NOME, TESARIK, 1998).

Algumas evidências sugerem que os ARs podem ter efeitos no citoplasma das células,

mimetizando a ação de alguns fatores de crescimento (CATO, PETERZIEL, 1998). O

tratamento de camundongos fêmea com androgênios aumentou o número de folículos

primários no ovário e a expressão do RNAm para receptores de IGF-1 (IGF-1R) em oócitos

de folículos primordiais (VENDOLA et al., 1999). Além disso, foi demonstrado que os

androgênios induzem o aparecimento de receptores para fatores de crescimento (GDF-9,

TGFβ) nas células da granulosa e no oócito (HICKEY et al., 2005).

No ovário, as células da granulosa são altamente responsivas aos androgênios,

notadamente à T e à DHT. Estes são absorvidos pelas secreções das células da teca ou são

produzidos internamente por meio da conversão enzimática de precursores de androgênios

(YARAK et al., 2005). Já a androstenediona possui baixa afinidade com os ARs, apesar de

estar em grande quantidade na circulação. Este hormônio pode mediar sua ação através de sua

conversão intrácrina a um androgênio mais potente, como a T ou a DHT, que possuem maior

afinidade aos ARs (GOYENECHE et al., 2002).

Em folículos pré-antrais, existe uma baixa atividade da aromatase e altos níveis de

expressão de AR. Conforme o desenvolvimento folicular progride, ocorre uma modificação

no ambiente de androgênio dominante para estrogênio dominante, e o folículo, então, chega

aos estágios antral e pré-ovulatório (HICKEY et al., 2004). Desta forma, a maturação folicular

do estágio pré-antral até o pré-ovulatório é marcada por uma transição no papel dos

androgênios de hormônio a substrato (COUSE, HEWITT, KORACH, 2006). Se esta transição

falha, o nível intrafolicular de andrógenos fica acima da capacidade esteroidogênica das

células da granulosa, levando a um acúmulo e, posterior atresia (GOYENECHE et al., 2002;

ZELEZNIK et al., 2004).

Alguns estudos com primatas mostraram que os androgênios são reguladores positivos

do desenvolvimento folicular, aumentando os receptores para FSH em células da granulosa e


promovendo o crescimento de pequenos folículos (VENDOLA et al., 1998; WEIL et al.,

1999). Além disso, Yang e Fortune (2006) demonstraram que a adição de testosterona ao

meio de cultivo de folículos pré-antrais bovinos estimula o crescimento destes. No entanto, os

androgênios podem aumentar a responsividade de folículos em desenvolvimento ao FSH,

resultando em uma secreção prematura de estradiol. Tal fato pode levar à inibição da secreção

de FSH e à consequente parada do desenvolvimento desses folículos (KAIPIA, HSUEH,

1997; Pradeep et al., 2002). Ainda, os androgênios podem exercer efeitos antagonistas na

função folicular quando presentes em altas concentrações, inibindo o desenvolvimento

folicular (GOYENECHE et al., 2002; ZELEZNIK et al., 2004).

Classificação de folículos ovarianos

Os folículos ovarianos pré-antrais podem ser classificados de acordo com: o tamanho,

pela medida do diâmetro folicular; o grau de evolução, observando-se o número de camadas

de células da granulosa (CGs); e a viabilidade, como normais ou atrésicos. A classificação dos

folículos pré-antrais foi inicialmente proposta por Mandl e Zuckerman (1951), que

caracterizaram os folículos em estágios de acordo com o número de camadas de CGs ao redor

do oócito: 1, oócito rodeado por uma camada simples de CGs achatadas; 2, oócito em

crescimento rodeado por uma camada simples de CGs cuboidais; 3, oócito em crescimento

rodeado por duas camadas de CGs cuboidais; 4, oócito em crescimento rodeado por três

camadas de CGs cuboidais; 5, oócito em crescimento rodeado por quatro ou mais camadas de

CGs cuboidais, mas sem cavidade antral. Em 1994, Hulshof et al. classificaram os folículos

pré-antrais em primordiais, primários e secundários, estabelecendo que os folículos

primordiais e primários não poderiam ser distinguidos pelo diâmetro, mas sim, por diferenças

morfológicas. Segundo este estudo, os folículos primordiais apresentavam um oócito rodeado

por uma camada de 4 a 8 CGs achatadas, os primários mostravam um oócito rodeado por uma

camada de 11 a 12 CGs cuboidais e os secundários, mais de uma camada de CGs cuboidais.

Os folículos pré-antrais podem também ser classificados segundo alguns autores em

primordial inativo, primordial ativado, primário e secundário (FAIR et al., 1997). Mas em

geral, a literatura descreve os folículos primordiais com poucas CGs achatadas ao redor do

oócito, enquanto os folículos primários são caracterizados por oócitos rodeados por uma

camada completa de CGs cuboidais (VAN DEN HURK et al., 1998; PICTON, 2001). A

figura 2 ilustra as diferentes classes de desenvolvimento folicular.


Quando classificados de acordo com seu grau de viabilidade, os folículos pré-antrais

podem ser: saudáveis, quando apresentam lâmina basal intacta, oócito com até 3 vacúolos

citoplasmáticos pequenos, vesícula germinativa e nucléolo intactos; folículos em atresia

inicial estágio I, quando possuí oócito com mais de 3 vacúolos citoplasmáticos e em início de

descondensação da cromatina; folículos em atresia moderada estágio II, quando no oócito o

nucléolo e o citoplasma apresentam-se em fragmentação e a cromatina altamente condensada;

ou folículos com atresia acentuada estágio III, quando o oócito está completamente

fragmentado ou ausente (BUTLER, 1970; WANDJI et al., 1996).

Figura 2. Esquema ilustrativo das diferentes classes de desenvolvimento folicular (LIMA−VERDE et al., 2010).

Folículos primordiais

Os gametas femininos são armazenados em estado quiescente no ovário na forma de

folículos primordiais constituídos de um oócito imaturo de aproximadamente 25 µm de

diâmetro, em estágio de vesícula germinativa (VG) ou diplóteno da Prófase I, uma única

camada de células pré-granulosas pavimentosas e a membrana basal, a qual confere limitado

acesso ao sistema endócrino (HUTT, MCLAUGHLIN, HOLLAND, 2006). No folículo

primordial, iniciam-se, dentre outros eventos, a expressão gênica para a síntese de proteínas

constituintes da zona pelúcida. Nesta fase a esteroidogênese é independe de gonadotrofinas; o

oócito e as células da granulosa ainda não expressam receptores e o controle da

esteroidogênese se dá por meio de mecanismos autócrinos e parácrinos (NAVARRO et al.,

2012).


O folículo primordial representa o estágio a partir do qual os folículos são recrutados

para o crescimento e, cada um apresenta um oócito rodeado por uma camada de células da

granulosa (CGs) achatadas, envolvida por uma membrana basal (TELFER et al., 2000).

Nestes folículos, o núcleo do oócito ocupa uma posição central e o nucléolo é

evidente. As organelas são uniformemente distribuídas no citoplasma ou bem próximas ao

núcleo. A organela mais evidente é a mitocôndria, predominantemente redonda, o retículo

endoplasmático liso e o Complexo de Golgi são pouco desenvolvidos e várias vesículas estão

espalhadas pelo citoplasma (LUCCI et al., 2001).

Quando a população de folículos primordiais é estabelecida, grupos de folículos,

gradualmente deixam o “pool” bloqueado e entram em fase de crescimento. Os fatores que

determinam a ativação folicular ou processo pelo qual dão origem ao seu crescimento, sua

diferenciação e acúmulo de organelas citoplasmáticas, e a seleção de alguns folículos

primordiais, enquanto outros permanecem bloqueados ainda são pouco compreendidos

(FORTUNE et al., 2000). Portanto, os mecanismos envolvidos na ativação do folículo

primordial, representam uma importante linha de pesquisa da biologia ovariana

(JEWGENOW, GÖRITZ, 1995).

Folículos primários

O mecanismo de recrutamento de um folículo primordial para o pool de crescimento

ainda e desconhecido. A ativação folicular é um processo irreversível pelo qual os folículos

primordiais iniciam o crescimento e remodelamento das células granulosas de pavimentosas a

cuboidais. Este evento da foliculogênese ocorre continuamente e parece não estar associado

ao padrão cíclico de liberação das gonadotrofinas, podendo ocorrer espontaneamente in vitro

em algumas espécies (NAVARRO et al., 2012).

O desenvolvimento dos folículos pré-antrais parece estar relacionado ao aumento do

diâmetro do oócito, bem como a proliferação das células da granulosa (FIGUEIREDO et al.,

1994). A atividade de proliferação destas celulas resulta na formação de uma camada de

células cuboidais ao redor do oócito que caracterizam o folículo primário. A partir deste

momento, as células da granulosa tornam-se mais volumosas e multiplicam-se por mitoses.

A zona pelúcida (ZP) aparece primeiramente ao redor do oócito do folículo primário,

como ilhas de material fibrilar situadas em espaços entre as células da granulosa adjacentes e

a superfície do oócito. Estudos demostraram através de análise radioautográfica da biossíntese

e renovação de glicoproteínas do folículo em desenvolvimento, que a ZP resulta


exclusivamente da atividade secretória do oócito (HADDAD, NAGAI, 1977; WOLGEMUTH

et al., 1984). A comunicação entre as células da granulosa e o oócito no folículo primordial e

primário, são mediadas por endocitose, sinalizadas pelas numerosas invaginações e vesículas

(HYTTEL et al., 1997; ALBERTINI et al., 2001).

Além das usuais organelas, os oócitos dos folículos primários também contém

numerosas mitocôndrias redondas, da mesma forma que nos folículos primordiais. Estas vão

tornando-se alongadas à medida que o folículo se desenvolve (LUCCI et al., 2001).

A partir da ativação do folículo primordial ocorre a formação do folículo primário que

é caracterizado pela mudança na conformação das células da granulosa de pavimentosas para

cuboidais e aumento no diâmetro do oócito de 25 µm para 40 µm, podendo apresentar uma

zona pelúcida (ZP) em formação (NAVARRO et al., 2012).

Folículos secundários

A transição para o estágio secundário é marcada pelo aparecimento de uma segunda

camada de células da granulosa. O diâmetro do folículo aumenta progressivamente até

aproximadamente 200 µm, e paralelamente, o oócito cresce em diâmetro alcançando 40-60

µm, e o índice mitótico das células da granulosa aumenta. Concomitante ao aumento do

metabolismo oocitário, há um acréscimo no número de junções gap entre o oócito e as células

da granulosa, estabelecendo uma via de intercâmbio metabólico e nutricional para

transferência de nucleotídeos, aminoácidos, fatores de estimulação e/ou inibição da meiose,

além de fatores de crescimento, neurotrofinas e hormônios (FORTUNE, 2003; NAVARRO et

al., 2012).

Os folículos são denominados secundários quando atingem um estágio com mais de

duas camadas de células da granulosa cuboidais. O folículo secundário atinge de 60 a 200 µm

de diâmetro em bovinos (BECKERS et al., 1996), 150 a 180 µm em camundongos (XU et al.,

2006), 125 a 225 µm em macacos (XU et al, 2010) e tamanho semelhante em humanos (XU

et al., 2009a), como descrito previamente. Durante a fase de crescimento do folículo

secundário, fibras de tecido conectivo se posicionam paralelamente à membrana basal para

formar a camada tecal. (HUANG, WELLS, 2011).

O tipo de interação entre as células da granulosa e entre as estas células e o oócito

neste estágio de desenvolvimento passa a ser realizado também por “Gap junctions”. À

medida que o oócito aumenta de diâmetro, a ZP evolui para uma fina camada que aumenta

com o crescimento folicular, tornando-se densa e com filamentos interconectados ao redor do


oócito, separando-o das células da granulosa. A comunicação entre o oócito e as células é

mantida por projeções transzonais (TZPs), que foram caracterizadas em folículos pré-antrais

de mamíferos como extensões das células da granulosa que atravessam a ZP e terminavam

sobre a superfície do oócito (HERTING, ADAMS, 1967). Foi demonstrado que as TZPs

sofrem alterações dinâmicas durante as diferentes fases do desenvolvimento folicular

(MOTTA et al., 1994) e servem para modular informações entre o oócito e as células da

granulosa. Após a formação do antro, estas projeções se retraem e se mantêm como pequenas

conecções terminais.

Com base em diferentes estudos sobre as comunicações entre o oócito e as células da

granulosa, foi proposto um modelo explicativo, no qual o transporte de diferentes fatores de

crescimento e hormônios entre as células da granulosa e o oócito ocorre através de vesículas

de endocitose em regiões de contato entre a ZP e as células da granulosa e por junções tipo

Gap entre os microvilos do oócito e as TZPs das células da granulosa (ALBERTINI et al.,

2001). Além disso, o núcleo do oócito passa de uma posição central no oolema dos folículos

primordiais para uma região excêntrica no folículo secundário, ou seja, situado na região entre

a zona pelúcida e o centro do oócito. As organelas também se movem e no folículo secundário

se encontram mais próximas à periferia (HYTTEL et al., 1997). O retículo endoplasmático

liso aumenta de tamanho no folículo secundário e a maioria das mitocôndrias são alongadas

(LUCCI et al., 2001).

A foliculogênese pré-antral é descrita como um processo independente de

gonadotrofinas e parece ser regulada principalmente por efetores parácrinos, com participação

fundamental do oócito (Tabela 1). Contudo, receptores de FSH foram detectados em folículos

primários bovinos e aumento do crescimento de folículos pré-antrais foi observado após

adição de FSH ao meio de cultura em bovinos (XU et al., 1995) e primatas não-humanos (XU

et al. 2010), sugerindo um papel de coadjuvante do FSH no controle do estágio pré-antral (XU

et al., 1995; XU et al., 2010; NAVARRO et al., 2012).

Folículos terciários ou antrais

A partir deste estágio, o diâmetro folicular aumenta acentuadamente devido ao

crescimento do oócito, à multiplicação das células da granulosa, das células da teca e ao

aumento do fluido antral, este último importante para os mecanismos de regulação e

modulação de substâncias secretadas pelas células foliculares e da comunicação endócrina

que o folículo começa a estabelecer. A formação do antro em mamíferos é observada quando


o folículo atinge 200 a 400 µm, contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de sinalização

responsáveis por este processo. Paralelamente, o aumento da vascularização do folículo

possibilita a atuação de sinais endócrinos e a sensibilidade às gonadotrofinas é configurada.

As células da teca aumentam o número de receptores de LH, iniciando a síntese de

andrógenos, convertidos em estrógenos pela enzima P450 aromatase que, por sua vez,

aumentam o número de receptores de FSH nas células da granulosa, amplificando a ação

desta gonadotrofina no folículo (BUCCIONE, SCHROEDER, EPPIG, 1990). Os grandes

folículos antrais, com diâmetro acima de 3 mm, contêm células da granulosa diferenciadas em

células do cumulus e células murais, muitas camadas de células da teca, um grande espaço

contendo fluido folicular e um oócito com diâmetro aproximado de 150 µm, meioticamente

competente, capaz de ser fertilizado e desenvolver-se em blastocistos (NAVARRO et al.,

2012).

Folículo pré-ovulatório

No folículo pré-ovulatório, as principais modificações morfológicas compreendem a

proliferação terminal seguida de diferenciação das células da granulosa e aumento no volume

do fluido folicular. Em todas as espécies de mamíferos, a formação de folículos pré-

ovulatórios ou de De Graaf ocorre geralmente a partir da puberdade e a ação proeminente de

fatores secretados pelas células da granulosa, como o estradiol e o fator de crescimento

epidérmico (EGF - epidermal growth factor), em associação com as gonadotrofinas, é

essencial para a maturação terminal do folículo pré-ovulatório. O FSH é o indutor hormonal

da foliculogênese terminal, exercendo um papel importante na expressão de seus próprios

receptores e dos receptores de LH, bem como na diferenciação das células da granulosa. O

folículo destinado a ser dominante passa a expressar maior concentração de receptores de

FSH na sua superfície através do mecanismo de autoregulação positiva, o que o torna mais

sensível a pequenas doses de FSH. Em contrapartida, há queda na produção do FSH pela

hipófise, determinada pela inibina e estradiol secretados pelo folículo dominante, e em

conseqüência, todos os demais folículos, não dominantes, iniciam o processo de atresia a

partir deste momento.

O estabelecimento da dominância folicular depende da transição da dependência

folicular do FSH para o LH. Ao final da fase folicular pode-se identificar o aparecimento de

receptores de LH na superfície das células da granulosa induzido pelo FSH. As células da

granulosa desses folículos param de se multiplicar em resposta ao LH e iniciam uma fase final


de diferenciação, deflagrando o processo de luteinização. Dentre as funções do LH está a

reativação da meiose oocitária, a luteinização da granulosa, a expansão do cumulus e a síntese

de prostaglandinas, estas últimas apresentando papel importante na extrusão do oócito

(PELLICER et al., 2005).

O rápido aumento do antro é determinado pela síntese e/ou acúmulo de proteoglicanas

osmoticamente ativas no fluido folicular. O aumento do volume de fluido folicular, que

promove aumento da pressão intra-folicular, associado à ação de prostaglandinas locais que

levam à contração da musculatura lisa peri-folicular, promove a rotura do estigma ovulatório

e extrusão do oócito caracterizando a ovulação propriamente dita. Após a ovulação, o folículo

vazio originará o corpo lúteo também por ação do LH, com objetivo de secretar progesterona

para desenvolvimento e diferenciação endometrial a fim de promover adequada receptividade

endometrial e manutenção da gestação inicial (PELLICER et al., 2005; NAVARRO et al.,

2012).

Maturação oocitária

Desde o nascimento, os oócitos humanos têm seu núcleo detido no estagio de

dictióteno da prófase I meiótica, ou estagio de vesícula germinativa. Na puberdade, uma série

de estímulos hormonais desencadeia a saída dos oócitos desse estado de quiescência e, assim,

tem início a retomada e progressão da meiose (ZHANG, OUYANG, XIA, 2009).

A maturação nuclear inicia-se após o pico do LH, que desencadeia a ativação de

diversas moléculas reguladoras do ciclo celular, como o Fator promotor da maturação (MPF)

e a Proteína kinase ativada por mitógenos (MAPK). Tais moléculas irão coordenar desde a

dissolução do envelope nuclear, condensação cromossômica até a formação da placa

metafásica e extrusão do segundo corpúsculo polar, na segunda divisão meiótica. Ainda que

ocorra simultaneamente à maturação nuclear em alguns momentos, a maturação

citoplasmática tem seu início ainda na fase de crescimento do oócito e diversos transcritos

presentes no citoplasma foram produzidos ainda na fase de prófase I, da primeira divisão

meiótica, quando a cromatina apresentava-se descondensada (FERREIRA et al., 2009).

Diferentes marcadores de maturação nuclear e citoplasmática têm sido avaliados na

tentativa de se predizer a qualidade oocitária. Como principal indicador da maturidade nuclear

oocitária, ou seja, de que o oócito atingiu a metáfase II, utiliza-se a visualização da extrusão

do primeiro corpúsculo polar observada à microscopia óptica. Como principais marcadores de

maturação citoplasmática, destacam-se a redistribuição e remodelamento de organelas


citoplasmáticas; e a presença de alguns transcritos e proteínas no citoplasma do oócito como a

glutationa, enzima do sistema antioxidante (FERREIRA et al., 2009).

Ciclo ovariano em primatas não-humanos

Assim como os humanos, todos os primatas não-humanos exibem um ciclo ovariano

que compreende uma fase de crescimento folicular, a ovulação e uma fase lútea. A expressão

destes eventos cíclicos, porém varia, consideravelmente de acordo com as espécies. Existem

diferenças na duração do ciclo e suas fases, sob influência ou não da sazonalidade, e na

ocorrência ou não de mestruação (HODGES, 1987).

Os macacos rhesus (Macaca mulatta) possuem menstruação, duração do ciclo e

variações dos níveis hormonais similares às apresentadas pelas mulheres em idade

reprodutiva. A duração do ciclo ovariano nesta espécie é muito semelhante a das mulheres,

durando em média 28 dias. A gestação, diferentemente dos humanos, dura em média 6 meses.

Uma diferença importante é que esta espécie apresenta sazonalidade, tendo o ciclo

reprodutivo somente durante o inverno.

Alguns aspectos da foliculogênese são semelhantes entre macacas e mulheres.

Todavia, o tamanho dos ovários e dos folículos são distintos entre as duas espécies. Enquanto

um folículo dominante em humanos atinge diâmetro próximo a 20 mm, estes folículos em

macacos rhesus atingem apenas cerca de 6 mm.

Apesar das diferenças no ciclo ovariano citadas anteriormente entre humanos e

macacos rhesus, existem diversas semelhanças, tornando este modelo animal um excelente

modelo translacional para o estudo da foliculogênese e cultivo folicular in vitro.

Técnicas de isolamento folicular

O objetivo primário das técnicas de cultivo folicular in vitro é o estabelecimento da

melhor metodologia de isolamento dos folículos de forma a se obter o maior número, com a

melhor viabilidade possível, para então se proceder as técnicas de crescimento e cultivo in

vitro (TELFER, 1996). Grandes avanços na pesquisa sobre folículos pré-antrais ocorreram em

diferentes espécies de mamíferos, na tentativa de se definir a melhor metodologia de

isolamento.

Existem basicamente três tipos de isolamento de folículos pré-antrais: isolamento

mecânico (EPPIG, SCHROEDER, 1989; EPPIG, TELFER, 1993; HULSHOF et al., 1994;


WANDJI et al., 1996; KATSKA, RYNSKA, 1998); digestão proteolítica pelo uso de

enzimas (GREENWALD, MOOR, 1989; DURRANT et al., 1998); ou isolamento mecânico

em combinação com dissociação enzimática parcial (FIGUEIREDO et al.,1993, OKTAY et

al., 1997).

Nos procedimentos mecânicos, a fragmentação da estrutura do estroma ovariano pode

ser feita através de diferentes instrumentos para promover o isolamento de folículos pré-

antrais. Os primeiros relatos com isolamento desses folículos foram descritos utilizando

agulhas ultra-finas para dissociar ovários de camundongo (TORRANCE, TELFER,

GOSDEN, 1989) e de felinos (JEWGENOW, PITRA, 1993; JEWGENOW, 1996). Outros

autores também relataram o uso de bisturis, pinças e pipetas de Pasteur (HIRAO, MIYANO,

KATO, 1990), para promover a fragmentação do tecido ovariano.

Alguns estudos tem processado as amostras de tecido ovariano com o “Tissue

Chopper”, que consiste em um cortador de tecidos automático, seguido de sucessivas

pipetagens, em bovinos (FIGUEIREDO et al., 1993) ou uso de cortador de tecido específico

(tissue chopper) e posterior isolamento mecânico com agulhas (XU et al., 2009a; XU et al.,

2009b; XU et al., 2010; TING et al., 2011). O procedimento consiste no corte do tecido

ovariano, utilizando o cortador com intervalos entre cortes determinados, o que permite o

isolamento de folículos primários e secundários. O método mecânico utilizando este aparato

para o isolamento de folículos pré-antrais tem proporcionado a recuperação de um grande

número de folículos pré-antrais com baixa porcentagem de oócitos desnudos, devido à menor

ocorrência de ruptura dos folículos, uma vez que desta forma é possível se preservar a

membrana basal (FIGUEIREDO et al., 1993; TELFER, GOSDEN, 1987; XU et al., 2009a,b;

TING et al., 2011) Porém, apesar dos folículos parecerem normais morfologicamente após o

isolamento mecânico, a porcentagem de folículos viáveis pela coloração com “Trypan Blue” é

de somente 77% (GUPTA et al., 2002), e a sobrevida folicular é de aproxidamente 50%

quando cultivados folículos de macacos na presença de FSH (XU et al., 2010), e folículos

humanos chegam a 75% de sobrevida em até 30 dias de cultivo (XU et al., 2009a).

No que se refere ao tratamento enzimático, existem muitas considerações a respeito do

efeito de enzimas como a tripsina, pronase e colagenase, na viabilidade dos folículos isolados

no que concerne à degradação da membrana basal, podendo resultar em separação das células

da granulosa e a denudação do oócito (TELFER et al., 1999). No entanto, a colagenase tem se

mostrado mais eficiente e menos deletéria aos oócitos, apesar dos folículos ficarem

desprovidos das células da teca e constituírem um complexo de CGs-oócito sob uma

membrana basal parcialmente degradada (BUCCIONE, SCHROEDER, EPPIG, 1990).


Apesar disso, esta técnica de dissociação enzimática pela colagenase resultou em grande

número de folículos pré-antrais a partir de ovários de camundongos (TORRANCE, TELFER,

GOSDEN, 1989) e a colagenase associada à DNAse, por 1 hora a 37ºC, não causou danos

morfológicos aos folículos pré-antrais de humanos (ROY, TREACY, 1993) e de cães

(BOLAMBA et al., 2002). Estudos afirmam que o isolamento por dissociação enzimática de

folículos compromete a sobrevivência de oócitos bovinos, e que fragmentos isolados

mecanicamente do córtex ovariano sobrevivem melhor no mesmo meio de cultivo (WANDJI

et al, 1996).

Se a integridade do folículo é comprometida, o seu potencial de desenvolvimento será

baixo. Portanto, a utilização de enzimas para obtenção de folículos deve ser questionada,

principalmente se o objetivo é a maturação de folículos in vitro. Para o cultivo, os folículos

necessitam estar íntegros e apresentar uma membrana basal intacta para que possam se

desenvolver adequadamente. Os sistemas de manipulação in vitro de folículos pré-antrais

devem ter o cuidado de tentar manter intactas as comunicações entre as células foliculares e o

oócito, no sentido de preservar sua integridade estrutural.

Cultivo folicular

O desenvolvimento folicular é um processo regulado por interações complexas entre

gonadotrofinas e fatores locais (GOUGEON, 1996) como descrito previamente. Progressos no

entendimento do desenvolvimento folicular precoce tem sido conquistados, particularmente

em camundongos em longos períodos de cultivo (ANCKAERT et al., 2009), e através de

manipulação genética (MATZUK, 2000; DRUMMOND, 2006).

O desenvolvimento de um sistema in vitro que suporte o crescimento do folículo pré-

antral em humanos é ambicioso, já que o desenvolvimento folicular em primatas ocorre em

um tempo muito mais longo (XU et al.,2010) comparando com animais de laboratório, como

ratos e camundongos (XU et al., 2009b). Além disso, enquanto um folículo de camundongo

tem que crescer em torno de 400 µm in vitro, o folículo pré-antral de primatas tem que crescer

aproximadamente 800 µm (TELFER et al., 2000; XU et al., 2009b; XU et al.,2010).

Os primeiros folículos pré-antrais a serem cultivados in vitro foram isolados a partir de

ovários de hamster. Os folículos foram cultivados em grupo sobre uma monocamada de gel de

ágar para prevenir a adesão dos folículos à superfície do plástico e foram cobertos com meio

de cultivo. A sobrevida dos folículos, bem como a aquisição de sítios de ligação para LH nas

células da granulosa parecem estar correlacionados com a presença de insulina no meio de


cultivo. Além disso, a taxa de divisão celular aumenta em função da adição do soro sanguíneo

ao meio (ROY, GREENWALD, 1989).

Existem diversos tipos de sistema de cultivo folicular atualmente. Os sistemas de

cultivo de folículos pré-antrais de suínos são mais avançados que nas outras espécies de

grandes animais. Os oócitos de folículos pré-antrais destes animais são desenvolvidos com

uma matriz de gel de colágeno e se tornam competentes meioticamente se atingem um

diâmetro de ao menos 100 µm (HIRAO et al., 1994).

Nos sistemas de cultivo de bovinos por exemplo, ocorre um maior grau de crescimento

no começo do cultivo e esse crescimento vai diminuindo com o tempo de cultivo em todas as

classes de folículos pré-antrais (GUPTA et al., 2002). Folículos pré-antrais grandes de

bovinos tiveram um maior crescimento in vitro do que folículos pré-antrais menores

(KATSKA, RYNSKA, 1998). Telfer et al. (1999) também observaram maior crescimento em

folículos pré-antrais grandes (170 µm) que em pequenos (40-90 µm). Entretanto, em búfalos,

a classe de folículos pré-antrais que teve maior crescimento in vitro foi entre 37 e 90 µm,

folículos maiores e menores que isso, tiveram um menor desenvolvimento (GUPTA et al.,

2002).

As gonadotrofinas exógenas, como o FSH, e diversos fatores de crescimento têm

demonstrado atuar positivamente na estimulação da esteroidogênese in vitro (ROY,

TREACY, 1993; CECCONI et al., 1999), e no crescimento de folículos pré-antrais em cultivo

in vitro em diferentes espécies (WANDJI et al., 1996; GUPTA et al., 2002; XU et al., 2010).

Estudos indicam que o FSH e essencial para a sobrevida in vitro de folículos pre-

antrais de primatas (WRIGHT et al., 1999; XU et al., 2010) e que promove o crescimento de

folículos em roedores (XU et al., 2006), em primatas não-humanos (XU et al., 2010) e em

humanos (XU et al., 2009a). O FSH é conhecido por estimular o crescimento folicular e

manter a integridade das células da granulosa em suínos (HIRAO et al., 1994), ovinos

(CECCONI et al., 1999), bovinos (SAHA et al., 2000) e primatas humanos (ROY,

TREACY, 1993; XU et al., 2009a) e não humanos (XU et al., 2010).

Dados conflitantes têm sido apresentados no que se refere ao FSH no meio de cultivo

de folículos pré-antrais. Existem relatos de que o FSH não tem nenhum efeito no crescimento

de folículos bovinos in vitro (BRAW-TAL, YOSSEFI, 1997). Porém esses dados diferem de

outros pesquisadores que observaram um efeito positivo do FSH nos meios de cultivo, como

em ovelhas (CECCONI et al., 1999), búfalos (GUPTA et al., 2002), primatas não humanos

(macacos rhesus) (XU et al., 2010) e humanos (ROY, TREACY, 1993; XU et al., 2009a).


Evidências sugerem que receptores de FSH são expressos em folículos pré-antrais

durante o seu desenvolvimento in vivo em várias espécies, incluindo primatas (GOUGEON,

1996; FINDLAY, DRUMMOND, 1999). Baseados em dados com roedores, reportados

recentemente, folículos cultivados in vitro com níveis fisiológicos de FSH (níveis baixos),

tendem a apresentar expressão gênica em oócitos e células do cumulus compatíveis com a

expressão de oócitos e células do cumulus de folículos in vivo (SANCHEZ et al., 2010). Em

contraste, níveis suprafisiológicos de FSH alteram a expressão dos genes transcritos por

oócitos e células do cumulus (SANCHEZ et al., 2010). Dessa forma, níveis fisiológicos de

FSH promovem diferenciação das células do cumulus regulada pela atividade oocitária, bem

como suporta o crescimento folicular.

Diversos estudos tem demonstrado que a adição de determinados componentes no

meio de cultivo de maturação in vitro podem ser o diferencial para uma boa taxa de sobrevida

e um bom desenvolvimento. A insulina, por exemplo, promove o crescimento das células da

granulosa (FIGUEIREDO et al., 1994; GUTIERREZ et al., 2000; GUPTA et al., 2002), e o

soro fetal bovino, adicionado ao meio, melhora a porcentagem de folículos pré-antrais em

crescimento em longos tempos de cultivo folicular de suínos (TELFER et al., 2000). A

adição de fatores como soro e fetuina também tem mostrado contribuir para um melhor

desenvolvimento folicular. Durante a maturação espontânea de oócitos murinos em meio livre

de soro, a zona pelúcida torna-se enrijecida (DE FELICI, SIRACUSA, 1962). Uma zona

pelúcida enrijecida e resistente a penetração espermática, dificulta o processo de fertilização,

sendo este fenômeno também caracterizado em oócitos de primatas não-humanos

(VANDEVOORT et al., 2007) e humanos (SCHIEWE et al., 1995). O soro, incluindo o soro

fetal bovino tem se mostrado efetivo em prevenir o enrijecimento da zona pelúcida do oocito

em roedores (SCHROEDER et al., 1986). A fetuina, a maior glicoproteína encontrada no soro

e no fluido folicular também contribui para o não enrijecimento da zona pelúcida durante a

maturação espontânea oocitária em roedores (SCHROEDER, 1990). Recentes estudos

realizados com primatas não-humanos tambem demostraram que a fetuína e imporante para o

desenvolvimento folicular in vitro (XU et al., 2010).

A concentração de oxigênio é outro importante parâmetro para determinar as

condições de cultivo dos folículos pré-antrais. Entretanto, o efeito exercido por altas ou baixas

concentrações de oxigênio (O2) é ainda controverso. Os folículos são usualmente cultivados

sob tensão de 20% de O2 (XU et al., 2010), que equivale a cerca de 140 mmHg. Contudo, a

pressão parcial de O2 na cavidade peritoneal onde os ovários estão localizados é cerca de 40

mmHg (TSAI et al., 1998), que corresponde a aproximadamente 5% de O2. A baixa tensão de


O2 (5%) aumenta a viabilidade de células do cumulus caninas (SILVA et al., 2009) e promove

o desenvolvimento e competência de oócitos suínos durante maturação in vitro (IWAMOTO

et al., 2005). Além disso, uma tensão de O2 baixa, durante o cultivo de folículos pré-antrais

murinos beneficia a viabilidade e maturação oocitária, ativação partenogenética e fertilização

(HEISE et al., 2009). Eppig e Wiigglesworth (1995) reportaram que em 5% de O2, oócitos de

camundongo adquirem competência para se desenvolver, e Cecconi et al. (1999) também

obtiveram melhores resultados de crescimento folicular em 5% do que em 20% de O2 em

cabras. Porém, Smitz et al. (1996) observaram um menor grau de crescimento dos folículos

cultivados in vitro quando utilizando 5% de O2 em camundongos. Apesar de controverso,

hipotetiza-se que o cultivo folicular sob uma tensão de O2 a 5% teria uma influencia positiva

durante o desenvolvimento folicular in vitro.

A formação de antro em folículos pré-antrais cultivados in vitro oriundos de folículos

pré-antrais foi conseguida em suínos (HIRAO et al., 1994), ovinos (CECCONI et al., 1999),

caprinos (HUANMIN, YONG, 2000) e bovinos (GUTIERREZ et al., 2000; ITOH et al.,

2002). Além disso, a formação de antro também foi atingida em folículos de macacos (XU et

al., 2010) e de humanos cultivados in vitro a partir do estágio secundário (ROY, TREACY,

1993; Xu et al., 2009a). Em búfalos, mesmo com 40 dias de cultivo, não foi possível observar

a formação de antro (GUPTA et al., 2002).

Sistemas de cultivo para folículos pré-antrais bovinos não têm sido um sucesso no que

se refere a produzir oócitos meioticamente competentes (TELFER, 1996), mas um pequeno

número de oócitos de folículos ovinos cultivados in vitro têm atingido o estádio de metáfase II

(CECCONI et al., 1999). E em estudos realizados com macacos, esta dificuldade também está

presente, mas já foi possível a obtenção de oócitos em metáfase II, e um embrião de 2 células

24 horas após ICSI (Injeção intracitoplasmática do espermatozoide) (XU et al., 2011).

Em suínos, Wu et al. (2001) conseguiram cultivar folículos pré-antrais em meio

acrescido de soro suíno e FSH até o estágio antral de desenvolvimento, tendo sido obtidos

alguns oócitos em metáfase II que foram fertilizados, alguns atingindo o estágio de

blastocisto. O método de isolamento folicular utilizado neste experimento e no experimento

com macacos, descrito anteriormente, foi o mecânico.

Em roedores, os sistemas de cultivo de folículos pré-antrais têm tido êxito na produção

de grande número de oócitos meioticamente competentes, inclusive com a obtenção de

nascimentos (EPPIG, SCHROEDER, 1989; XU et al., 2006). O tempo requerido para o

cultivo de folículos pré-antrais de camundongos para desenvolver a folículo de Graaf é de

apenas 6 dias (BOLAND et al., 1993). No entanto, em humanos e animais domésticos, o


desenvolvimento folicular in vivo é um processo muito lento, levando até seis meses desde o

início do crescimento folicular até formação de um folículo pré-ovulatório (LUSSIER,

MATTON, DUFOUR, 1987). Nesses casos, sistemas de cultivo vêm sendo testados a fim de

atingir um modelo de desenvolvimento folicular que mantenha a integridade do oócito e sua

capacidade de ser ovulado e fecundado in vitro. A evolução destas pesquisas requer um

completo entendimento da biologia celular na fase de desenvolvimento do folículo, como

também o estabelecimento de sistemas eficientes de isolamento e cultivo in vitro que

suportem o crescimento folicular até o estágio de maturação meiótica (GIOMETTI, 2003).

Com a obtenção de desenvolvimento embrionário a partir de folículos pré-antrais de

suínos e primatas, novas perspectivas são geradas em relação à técnica de cultivo folicular in

vitro em humanos.

Cultivo folicular em humanos

A dinâmica da regulação da foliculogênese em primatas ainda continua pouco

compreendida (CHAND et al., 2010). Recentemente, desenvolveu-se baseado em princípios

de bioengenharia de tecidos, uma matriz 3D capaz de suportar o crescimento de folículos, o

que já foi demostrado com sucesso em camundongos (XU, et al. 2006; WEST et al., 2007).

Este sistema de cultivo 3D, permite o desenvolvimento de folículos in vitro até o estágio

antral, capazes de dar origem a oócitos maduros, que quando inseminados podem ser

fertilizados, dando origem a embriões e até nascidos vivos (XU et al., 2006).

Aplicando a técnica de cultivo encapsulado em matriz 3D em primatas, é possível

propiciar o crescimento de folículos de primatas não-humanos (macacos rhesus) desde o

estágio preantral até o estágio de folículo antral de pequeno diâmetro, com produção de

apreciáveis níveis de hormônios esteróides (XU et al., 2009b; XU et al., 2010).

Acredita-se que o encapsulamento do folículo em gel de alginato é capaz de mimetizar

a matriz extracelular in vivo em termos de facilitar a troca de moléculas entre o folículo e o

meio de cultivo, além da flexibilidade do gel, que proporciona uma boa proliferação celular.

Porém, a rigidez do gel poderia inibir o crescimento folicular e reduzir a esteroidogênese, o

que já foi reportado com folículos murinos embebidos em gel de alginato a 1 e 1,5%. Mas

quando utilizado gel a 0.5% foram obtidos oócitos que apresentaram crescimento completo

(XU et al., 2009a).

Em alguns tipos de cultivo, como de bovinos, usa-se gel de colágeno, e neste caso, já

foi demonstrado a ocorrência de diferenciação folicular, e quando usado com uma


combinação de meio de cultivo bem suplementado associado ao uso de membranas de

microporo, um bezerro foi obtido a partir do cultivo de folículos imaturos cultivados in vitro

por 14 dias (HIRAO et al, 2004).

Como mencionado anteriormente, existem evidências de que níveis adequados de

determinados hormônios são essenciais para o crescimento e saúde dos folículos cultivados in

vitro (PICTON et al., 2008). O FSH, por exemplo, é responsável por promover o crescimento

folicular in vitro, além de manter a integridade morfológica de folículos pré-antrais caprinos,

e estimular a ativação de folículos primordiais em macacos (MATOS et al., 2007). Estudos

tem demostrado que em sistemas de matriz 3D, o FSH aumenta o diâmetro de folículos de

camundongo (XU et al., 2006), macacos (XU et al., 2009b; XU et al., 2010) e humanos (XU

et al., 2009a; AMORIN et al., 2011). No cultivo de folículos de macaco, o FSH tem se

mostrado essencial para a sobrevivência de folículos secundários (125 – 225 µm de diâmetro)

no cultivo 3D com gel de alginato (XU et al., 2010).

Além disso, em estágios mais avançados durante o cultivo, folículos de macacos

cultivados em meio suplementado com LH tendem a produzir mais estradiol, o que pode ser

atribuído a presença aumentada de células da teca (XU et al., 2009b).

Sistemas de cultivo designados para o suporte do desenvolvimento de folículos

humanos individuais precisam aprimorar aspectos como: definição do estágio do folículo em

que ele deve ser coletado; tipo do material necessário para a manutenção da unidade do

folículo in vitro; o período de cultivo; e essencialmente a composição do meio de cultivo

usado.

Muitos esforços tem sido direcionados no sentido de promover o desenvolvimento

folicular in vitro de humanos, obtendo-se folículos tanto a partir de tecido fresco (TELFER et

al., 2008a,b; SMITZ et al., 2010), quanto a partir de córtex ovariano criopreservado

(HOVATTA et al., 1997; PICTON, GOSDEN, 2000; TELFER et al., 2008a, b; TING et al.,

2011). Para um completo desenvolvimento de oócitos humanos maturados in vitro, um cultivo

pautado em múltiplos passos ainda precisa ser desenvolvido. Este tipo de cultivo deve

preservar as funções do folículo, tanto endócrinas quanto a de suportar o crescimento e

amadurecimento de um oócito. Na otimização de um sistema de cultivo como este, o foco

deve ser no desenvolvimento oocitário, não requerindo necessariamente uma grande estrutura

folicular, e sim a manutenção apropriada de células somáticas diferenciadas em contato com o

oócito em amadurecimento.

Um meio de cultivo capaz de promover a ativação e crescimento folicular desde os

estágios iniciais de desenvolvimento ainda precisa ser desenvolvido. O meio de cultivo para


maturação folicular mais usado nos dias de hoje possui dentre seus componentes, FSH,

albumina sérica humana, e uma combinação de insulina, selenito e transferrina, com a adição

de ácido ascórbico em alguns casos na intenção de minimizar a morte celular (TELFER et al.,

2000; SCOTT, ZHANG, HOVATTA, 2004), sendo usualmente o meio base utilizado o alpha-

MEM. Este meio básico parece suportar ativação e crescimento folicular in vitro, e a adição

de fatores de crescimento como insulina também parecem contribuir para uma maior ativação

(DING et al., 2010).

Estudos mostram que folículos que estão em crescimento in vitro, não sobrevivem

quando são cultivados ainda dentro do córtex, o que aparenta apresentar um efeito inibitório

sobre o desenvolvimento do folículo, que resulta em perda da integridade e impacto negativo

na sobrevida do oócito (HOVATTA et al., 1999; TELFER et al., 2008b). Portanto a remoção

do estroma ao redor do folículo e o cultivo dos mesmos individualmente seria a técnica mais

adequada (TELFER et al., 2008a; TELFER, MCLAUGHLIN, KINI, 2009; TELFER et al.,

2008b).

Esta técnica promove um valioso modelo in vitro para estudo do processo de

regulação da foliculogênese em folículos de primatas. A sua otimização é altamente desejável,

pois potencialmente permitiria a mimetização de condições patológicas in vitro para o estudo

de diversos tipos de doenças ovarianas, além de sua aplicação para a preservação da

fertilidade em pacientes com câncer. Contudo, ainda são necessários muitos avanços para o

desenvolvimento de um adequado ambiente in vitro para que o crescimento e diferenciação

folicular possam promover a competência oocitária necessária para a fertilização e posterior

desenvolvimento embrionário.

Objetivos

Objetivos | 48

Objetivo Geral

O presente estudo teve como objetivo geral avaliar os efeitos da ablação da produção

de esteróides e o papel dos androgênios (testosterona e dehidrosterona) no desenvolvimento

de folículos secundários de primatas não humanos (macaco rhesus – Macaca mulatta)

isolados de tecido ovariano a fresco e cultivados in vitro por 40 dias em matrix 3D.

Objetivos Específicos

1. Avaliar os efeitos da ablação da produção de hormônios esteróides por meio da inibição da

enzima 3-βHSD (3-beta hidroxiesteroide-desidrogrnase) pelo trilostano (TRL),

administrado durante a maturação in vitro de folículos secundários de primatas não

humanos isolados de tecido ovariano a fresco (desde o início do cultivo ou após 2 semanas

de cultivo), cultivados por 40 dias, sobre:

a) a sobrevida, o crescimento, o desenvolvimento (formação de antro e morfologia) e a

produção de hormônios esteróides pelos folículos.

b) o grau de maturação oocitária.

2. Avaliar o impacto da reposição de duas diferentes doses de testosterona (10 ng/mL e 50

ng/mL), administrada durante a maturação in vitro de folículos secundários de primatas

não humanos isolados de tecido ovariano a fresco cultivados em meio de maturação padrão

acrescido de trilostano ou veículo por 40 dias, sobre:




c) fertilização.

3. Avaliar o impacto da reposição de dihidrotestosterona (50 ng/mL) administrada durante a

maturação in vitro de folículos secundários de primatas não humanos isolados de tecido

ovariano a fresco cultivados em meio de maturação padrão acrescido de trilostano ou

veículo por 40 dias, sobre:




c) fertilização.

Material e Métodos

Material e Métodos | 50

Animais e coleta ovariana

A habitação e o cuidado com os animais, macacos rhesus, foram fornecidos pela

Divisão de Recursos Animais, no Oregon National Primate Research Center (ONPRC). Os

animais foram mantidos dentro de gaiolas, em pares, a temperatura (22oC) e luminosidade (12

horas claro/escuro) controladas. A dieta oferecida foi a ração Purina (Ralston Purina-,

Richmond, IN, EUA) ideal para alimentação de macacos, fornecida duas vezes ao dia,

acrescida de frutas frescas ou vegetais, uma vez por dia e água ad libitum. Os animais foram

tratados de acordo com o Instituto Nacional de Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de

Animais de Laboratório, dos Estados Unidos, e os protocolos foram aprovados pelo Comite

Institucional de Cuidados aos Animais do Centro de Pesquisas com Primatas da Universidade

do Oregon (Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science

University).

Quatorze fêmeas adultas de macacos rhesus (idade média 9 anos), que exibiam ciclos

menstruais regulares de 28 dias, sendo o primeiro dia de menstruação considerado o dia 1 do

ciclo, foram usadas neste estudo. Dez animais foram recrutados especificamente para este

estudo, e ovários de quatro animais adicionais foram coletados no momento de necrópsia após

o término de outros estudos ou razões não relacionadas a saúde reprodutiva. A ooforectomia

foi realizada sob anestesia, por laparoscopia, durante a fase folicular precoce do ciclo (entre

os dias 1 e 4), como previamente descrito (DUFFY, STOUFFER, 2002). Os ovários, após

removidos, foram imediatamente transferidos para meio Hepes buffered holding media

(CooperSurgical, Inc., Trumbull, CT, USA), suplementado com 0.2% de soro humano

proteico (SPS, CooperSurgical, Inc.) e 10 µg/ml de antibiótico gentamicina (Sigma-Aldrich,

St Louis, MO, USA) e mantidos a 37oC até o momento do isolamento folicular (XU et al.,

2010; 2011).

Os meios de cultivo e reagentes utilizados foram adquiridos da Sigma Aldrich

Company (St. Louis, MO, USA), exceto quando indicado, e o Trilostano (Vetoryl – trilostane

Capsules Letter), da FDA U.S. Food and Drug Administration. O Trilostano foi preparado

como uma solução estoque, em que 2.5 mg de trilostano foi diluido em 10 mL de etanol

(veículo), armazenada a 4oC, que era diluída em meio de cultivo folicular, semanalmente na

ocasião da preparação dos meios para o cultivo, de modo que sua concentração fosse 250

ng/mL.


Isolamento folicular, encapsulamento e cultivo

O isolamento, encapsulamento e o cultivo in vitro dos folículos individuais foram

realizados conforme já previamente descrito (XU et al., 2010). Resumidamente, o córtex

ovariano foi cortado em pequenos cubos de 1 × 1 × 1 mm, e os folículos foram

mecanicamente isolados em meio de manipulação (Heppes buffered holding media) com o

uso de agulhas calibre 31. Folículos secundários de diâmetros entre 125-225 mm e que

apresentavam as seguintes características foram selecionados para o encapsulamento: (i)

membrana basal intacta, (ii) duas a três camadas de células da granulosa e (iii) um oócito

saudável visível que fosse arredondado e localizado centralmente no interior do folículo, sem

a presença de vacúolos ou citoplasma escuro. Os folículos obtidos individualmente de cada

um dos animais foram divididos randomicamente entre os grupos de tratamento com 12/24

folículos por grupo.

Os folículos foram transferidos individualmente para gotículas de 5 µL 0.25% (w/v) de

alginato de sódio estéril (FMC BioPolymers, Philadelphia, PA, USA) e solução tamponada

PBS (phosphate-buffered saline - 137 mM NaCl, 10 M phosphate, 2.7 mM KCl, Invitrogen,

Carlsbad, CA, USA). As gotas foram colocadas sobre uma tela de polipropileno (0,1 mm de

abertura; McMaster-Carr, Atlanta, GA), que foi então invertida e gentilmente batida sobre

uma solução cross-linking (50 mM CaCl2, 140 mM NaCl e 10 nM HEPES solution - pH 7.2),

fazendo com que as gotas caíssem na solução, sendo mantidas nela por 30 segundos. Cada

folículo encapsulado em alginato foi transferido para poços individuais em uma placa de 48

poços contendo 300 µL do meio αMEM (alpha minimum essential médium - Invitrogen)

suplementado com 0.3% (v/v) de soro sintético substituto (SSS), 0.5 mg/ml de fetuína bovina

purificada, 5 µg/ml de insulina, 5 µg/ml de transferrina e 5 ng/ml de selenito de sódio (Sigma-

Aldrich).

Os folículos foram cultivados a 37oC e 5% de oxigênio (em 6% CO2/89% N2), com

FSH recombinante humano (rh) (NV Organon, Oss, Netherlands) a uma dose de 3ng/mL

durante os primeiros 20 dias de cultivo, e 0.3 ng/mL pelo período de cultivo restante.

Folículos que atingiram o estágio antral foram tratados com gonadotrofina coriónica humana

recombinante (hCG) (Merck Serono, Geneva, Switzerland) (100 ng/ml) por 34 h para iniciar a

maturação meiótica do oócito. Após este período, os oócitos foram coletados com a finalidade

de se determinar o grau de maturação e competência oocitária. Amostras de meios de cultivo

(150 µL) foram coletadas, repostas a cada 2 dias e armazenadas a – 20oC para posterior

análise de hormônios esteroides ovarianos e hormônio anti-Mulleriano (AMH).


Experimento 1: Ablação da esteroidogênese

Com a finalidade de avaliar o papel dos esteróides na foliculogênese de primatas in

vitro, foi utilizado um inibidor da síntese de esteróides (trilostano, TRL) que atua no bloqueio

da ação da enzima 3-beta-hidroxiesteróide desidrogenase (3-βHSD), responsável pela

conversão de pregnenolona em progesterona, 17-hidroxipregnenolona em 17-hidroxi-

progesterona e dehidroepiandrosterona em androstenediona. O TRL foi acrescido ao meio de

cultivo folicular na dose de 250 ng/mL, que efetivamente bloqueia a produção de

progesterona por células foliculares de primatas in vitro (DUFFY et al., 1996).

Folículos secundários obtidos de 6 animais (4 advindos de necrópsia, 2 de

laparoscopia) foram divididos em três grupos: (1) grupo controle: folículos (n = 174)

cultivados em meio padrão acrescido do veículo do TRL (etanol) até o final do cultivo (40

dias); (2) grupo TRL: folículos (n = 173) cultivados em presença de TRL do início ao fim do

cultivo (40 dias); (3) grupo TRL2: folículos (n = 169) cultivados em meio onde TRL foi

adicionado após 2 semanas e mantido até o fim do cultivo.

Experimento 2: Reposição de testosterona

Para avaliar o papel da testosterona na foliculogênese, foi realizado um segundo

experimento, por meio da reposição de duas diferentes doses de testosterona (T; 10 ou 50

ng/mL, grupos T baixa e T alta) em meio de cultivo com TRL, TRL utilizado desde o início

do cultivo até o final (40 dias), grupos controle (veículo) e TRL, TRL utilizado desde o início

do cultivo até o final (40 dias).

Folículos secundários obtidos de 4 animais foram cultivados em meio padrão

contendo: (1) veículo por 40 dias (grupo controle; n = 85); (2) TRL na dose de 250 ng/mL

desde o início do cultivo até o final (40 dias) (grupo TRL; n = 82); (3) TRL e 10 ng/mL de

testosterona por 40 dias (grupo T baixa; n = 84); (4) TRL e 50 ng/mL de testosterona por 40

dias (grupo T alta; n = 86).

Experimento 3: Reposição de dihidrotestosterona

Com o intuito de confirmar o papel androgênicona foliculogênese de primatas,

independentemente de uma possível conversão a estrógeno, um terceiro experimento foi


realizado, por meio da adição de dihidrotestoserona (DHT) (50 ng/mL) ao meio de cultivo

com TRL ou DHT isoladamente, e grupos controle (veículo) e TRL.

Folículos secundários de 4 animais foram cultivados em meio padrão contendo: (1)

veículo (grupo controle; n = 72); (2) TRL na dose de 250 ng/mL desde o início até o fim do

cultivo (40 dias) (grupo TRL; n = 66); (3) DHT isoladamente (50 ng/mL) (grupo DHT; n =

69); (4) DHT acrescido de TRL (grupo TRL + DHT; n = 66).

Sobrevida folicular, crescimento e formação de antro

A sobrevida folicular, o diâmetro e a formação de antro foram avaliados por meio de

um microscópio invertido Olympus CK40 (Tóquio, Japão) com luz transmitida e objetivas de

fase, e uma câmera digital Olympus DP11 anexada (Olympus Imaging America Inc., Center

Valley, PA, USA) e software de imagem ImageJ 1.44 p (National Institutes of Health,

Bethesda, MD, USA) (XU et al., 2010, 2011). Os folículos foram medidos a partir da camada

externa de células, e as medidas incluíram uma medida no maior diâmetro do folículo e uma

segunda medição perpendicular à primeira. A média destes valores foi calculada e

considerada como o diâmetro do folículo. Os folículos foram considerados degenerados e em

processo de atresia quando o oócito estava escuro ou não estava cercado por células da

granulosa, as células da granulosa se tornaram escuras e fragmentadas, ou o diâmetro do

folículo estava diminuído (XU et al., 2009b; XU et al., 2010).

Classificação do Crescimento folicular

Os folículos foram divididos em três categorias de acordo com o seu padrão de

crescimento até a quinta semana de cultivo (XU et al., 2010; 2011): (1) crescimento rápido:

aqueles que atingiram um diâmetro de 500 µm ou mais; (2) crescimento lento: aqueles que

atingiram entre 230 e 500 µm de diâmetro; (3) sem crescimento: aqueles que não excederam

um diâmetro de 230 µm ao final da quinta semana de cultivo.

Dosagem de esteróides ovarianos e AMH

Amostras de meio coletadas semanalmente durante todo o período de cultivo foram

analisadas para a determinação das concentrações de estradiol (E2), progesterona (P4) e

pregnenolona (P5) para o Experimento 1, e E2, P4 e AMH para os Experimentos 2 e 3. As


análises das concentrações de E2, P4 e P5 foram realizadas pelo laboratório de ensaios

hormonais do ONPRC, Endocrine Technology Support Core (XU et al., 2010; 2011), por

meio do método de quimioluminescencia, usando um Immulite 2000, com técnica

previamente validada para meios de cultivo folicular de macacos, reportados previamente

(XU et al., 2009b). O AMH foi analisado pelo método de ELISA, por meio do Kit DSL-10-

14400 (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.) baseado nas instruções do fabricante e

validado previamente para meio de cultivo de folículos de macacos (XU et al., 2010).

Coleta de oócitos, maturação e fertilização

Os oócitos coletados foram fotografados e classificados de acordo com o estágio de

maturação nuclear (XU et al., 2011). Foi realizada coleta de sêmen e fertilização in vitro

convencional nos oócitos em metáfase II (MII) dos experimentos de Reposição de T e DHT,

pelo Laboratório de Reprodução Assistida (Assisted Reproductive Technology

(ART)/Embryonic Stem Cell Support Core) no ONPRC (XU et al., 2011). A fertilização in

vitro convencional foi realizada nos oócitos MII como previamente descrito (XU et al., 2011;

2013). O zigoto resultante foi transferido para 500 µL de meio de cultura embrionária

hamster-9 com 5% de FBS e cultivados a 37 º C a 6% CO2, 5% O2 e 89% de N2 (SCHRAMM,

PAPROCKI, 2000). O embrião foi fotografado diariamente durante seu desenvolvimento.

Reagentes e protocolos para a cultura de embriões foram fornecidos pelo núcleo ART/

ONPRC (MENG, WOLF, 1997a, b).

Análise estatística

A significância estatística foi analisada por meio do software R 2.15.3, usando uma

regressão binomial logística para as análises de sobrevida e formação de antro, e regressão

marginal log-linear para a análise de hormônios esteroides e AMH. Diferenças foram

consideradas significativas quando p < 0.05 e valores foram representados como média ± erro

padrão. A sobrevida folicular e a formação de antro representaram 6 (Experimento 1) ou 4

(Experimentos 2 e 3) animais individualmente para cada grupo de tratamento. O crescimento

folicular, a produção de esteroides e AMH, e a maturação oocitária foram analisados para

cada folículo individualmente.

Resultados

Resultados | 56

Experimento 1 - Ablação da esteroidogênese

A) Efeito sobre a sobrevida folicular e a formação de antro

A porcentagem de folículos sobreviventes em cultivo (Fig. 3A) foi menor em presença

de TRL (p < 0.05) comparado com a porcentagem obtida no grupo controle (folículos tratados

com veículo). A porcentagem de folículos que atingiram a formação de antro (Fig. 3B)

também foi menor do que no grupo controle quando TRL foi adicionado no início do cultivo

(p < 0.05), mas não quando foi adicionado após 2 semanas de cultivo.

Figura 3. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a sobrevida folicular e a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Sobrevida; B. Formação de antro; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL de TRL desde o inicio do cultivo); TRL2: trilostano 2 (250 ng/mL de TRL a partir da segunda semana até o final do cultivo). Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).

B) Efeito sobre o crescimento folicular

Porcentagens similares de folículos sem crescimento e com crescimento lento foram

observadas nos grupos controle e TRL2 (TRL adicionado na semana 2). Contudo foi

observada uma diferença significativa na porcentagem de folículos que apresentou

crescimento rápido entre estes grupos, sendo que no grupo Controle houve maior

porcentagem de folículos que cresceu mais rapidamente (Controle: 28%; TRL2: 19% - Tabela

I). Em contraste, folículos de crescimento rápido não foram observados no grupo TRL, e a

porcentagem de folículos sem crescimento foi maior neste grupo em relação aos grupos

CTRL TRL TRL20

20

40

60

80

100

A

B

Su

rviv

al (

%)

B

CTRL TRL TRL20

20

40

60

80

100

A A,BA

ntr

um

fo

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ion

(%

)

B

A. B.

So

bre

vid

a (%

)

Fo

rmaç

ão d

e an

tro

(%)

TRL2CTRL TRL TRL2CTRL TRL

Resultados | 57

Controle e TRL2, atingindo 27% (Tabela I). Além disso, apesar de todos os folículos que

apresentaram crescimento lento iniciarem o cultivo com um diâmetro equivalente em todos os

grupos, os folículos que apresentaram este padrão de crescimento, atingiram apenas um

diâmetro de 235 ± 17 µm ao final da quinta semana durante o tratamento com TRL, mas eram

maiores (p < 0.05) e possuíam tamanhos equivalentes nos grupos controle e TRL2 (330 ± 11

vs. 283 ± 17 µm).

Tabela I. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata na quarta semana cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.

Cultivo folicular Total Sem Crescimento N (%)

Crescimento lento N (%)

Crescimento rápido N (%)

CTRL

TRL

TRL2

98

26

49

11 (11%)a

7 (27%)b

7 (14%)a

60 (61%)a

19 (73%)b

33 (67%)a,b

27 (28%)a

0 (0%)b

9 (19%)c

Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo; N: número; %: porcentagem; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05).

C) Efeito sobre a produção de esteróides ovarianos

As concentrações de P4 no meio de cultivo coletado após a formação de antro foram

maiores nos folículos que apresentaram crescimento lento do grupo controle (Fig. 4A),

quando comparado aos dois grupos expostos ao TRL. Achados similares ocorreram quando

comparamos níveis de P4 de folículos de crescimento rápido entre os grupos controle e TRL2

(6.3 ± 1.0 vs. 0.2 ± 0.1 ng/ml, p < 0.05). Ressaltamos novamente que o grupo TRL não

apresentou folículos de crescimento rápido. Notavelmente, a exposição ao TRL também

reduziu os níveis de E2 em relação ao grupo controle, principalmente por folículos de

crescimento lento (dados não mostrados; ver Exp. 2 e 3).

Por outro lado, os níveis de P5 foram baixos para os folículos de crescimento lento

(Fig. 4B), porém marcadamente aumentados nos grupos TRL e TRL2. Da mesma maneira, os

níveis de P5 para folículos de crescimento rápido foram 29 vezes mais altos no grupo TRL2,

quando comparados com os níveis encontrados no grupo controle (1.17 ± 0.42 vs. 0.04 ± 0.04

ng/ml, p < 0.05).

Resultados | 58

Figura 4. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL sobre a produção de progesterona e pregnenolona por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Progesterona; B. Pregnenolona; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL de TRL desde o inicio do cultivo); TRL2: trilostano 2 (250 ng/mL de TRL a partir da segunda semana até o final do cultivo). Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).

D) Efeitos sobre o grau de maturação e qualidade oocitária

No grupo controle, folículos antrais deram origem tipicamente a oócitos saudáveis (12

em 13 folículos), porém eles raramente reiniciaram a maturação meiótica em resposta ao hCG

para atingir o estágio MII (1 em 12). O diâmetro do oócito MII obtido foi maior do que o

diâmetro encontrado nos oócitos VGs. Apenas um oócito foi coletado do grupo TRL e

encontrava-se degenerado. Quatro de sete oócitos coletados do grupo TRL2 estavam

saudáveis, mas não atingiram o estágio MII (Tabela II).

Tabela II. Efeito da ablação esteroidogênica pela adição de TRL nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).

Cultivo folicular

Número (n) de Diâmetro (µm)* Folículos analisados

Oócitos coletados

Oócitos degenerados

Oócitos saudáveis Oócitos VG

Oócitos MII VG MII

CTRL 13 13 1 11 1 111 ± 2a 117

TRL 2 1 1 0 0 - -

TRL2 10 7 3 4 0 92 ± 18a - Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); VG: vesícula germinativa, MII: metáfase II. * Valores expressos em média ± erro padrão, com cada diâmetro oocitário como um dado individual; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05). O número de folículos analisados corresponde ao número de folículos que atingiram o diâmetro médio de 1 mm, e receberam hCG.

Resultados | 59

Experimento 2 – Reposição de testosterona


A adição de dose alta de T ao TRL aumentou a sobrevida comparado com o grupo

TRL (Fig. 5A). Diferentemente do que foi observado no Exp. 1, alguns folículos atingiram a

formação de antro no grupo TRL (Fig. 5B), porém a porcentagem de folículos antrais no

grupo T alta + TRL (83 ± 8%) foi maior em relação ao grupo que recebeu TRL isoladamente

(65 ± 22%, p < 0.05). Além disso, a porcentagem de folículos antrais no grupo T baixa + TRL

(92 ± 8%) também foi maior do que no grupo TRL.

Figura 5. Efeito da reposição de T sobre a sobrevida e formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Sobrevida; B. Formação de antro; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).


Como observado no Exp. 1, a porcentagem de folículos sem crescimento foi maior no

grupo TRL, em relação aos grupos TRL + T baixa e TRL + T alta (Tabela III, Reposição de

T). Contudo, também foi evidente a observação de folículos de crescimento rápido neste

grupo, o que não foi observado no Exp. 1. Notavelmente, folículos sem crescimento não

foram observados nos grupos de reposição de baixa ou alta dose de T, e a porcentagem de

folículos que apresentam crescimento rápido atingiu, pela primeira vez, mais do que 30% da

população folicular total em ambos os grupos com reposição de T, e apresentou diferença

significativa (p < 0,05) entre os grupos TRL (21%) e TRL + T baixa (38%). O diâmetro

folicular dos folículos de crescimento lento, tanto no grupo de reposição de baixa e alta dose

Resultados | 60

de T (350 ± 15 or 361 ± 14 µm) foi maior em relação ao grupo TRL (260 ± 12 µm, p < 0.05),

e comparável a média do diâmetro encontrado no grupo controle (318 ± 14 µm). Em

contraste, a alta dose de T diminuiu (p < 0.05) o diâmetro de folículos de crescimento rápido

(572 ± 42 µm) comparado ao diâmetro no grupo controle (773 ± 56 µm).

Tabela III. Efeito da reposição de T sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.

Cultivo folicular

Total Sem

Crescimento N (%)

Crescimento lento N (%)

Crescimento rápido N (%)

Reposição de T CTRL 47 3 (6%)a,b 31 (66%)a,b 13 (28%)a,b

TRL 23 5 (22%)b 13 (57%)b 5 (21%)a TRL + T baixa 47 0 (0%)a 29 (62%)a,b 18 (38%)b

TRL + T alta 53 0 (0%)a 37 (70%)a 16 (30%)a,b Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05).

C) Efeito sobre a produção de esteróides ovarianos e AMH

Como esperado no Exp. 1, o TRL adicionado isoladamente diminuiu os níveis de P4

produzidos por folículos de crescimento lento (dados não mostrados) e rápido (Fig. 6A).

Inesperadamente, a adição de baixa dose de T, reestabeleceu os níveis de P4 para níveis

semelhantes aos do grupo controle, especialmente para folículos de crescimento rápido. Em

contraste, os níveis de P4 apresentaram-se diminuídos (p < 0.05) no grupo T alta em relação

ao grupo controle, a concentrações que se assemelham as encontradas no grupo TRL.

Quando E2 foi mensurado como um marcador de função folicular esteroidogênica,

observou-se que o TRL administrado isoladamente reduziu a concentração de E2 em relação

ao grupo controle (63 ± 13 vs. 247 ± 47 pg/mL, p < 0.05) em folículos de crescimento lento.

Mas a exposição a doses baixa ou alta de T na presença de TRL marcadamente elevaram os

níveis de E2 (2734 ± 338 e 18723 ± 1758 pg/mL) respectivamente. Os resultados para

folículos de crescimento rápido exibiram uma tendência similar (Fig. 6B), exceto que o TRL

adicionado isoladamente não diminuiu os níveis de E2, aumentados em 14 vezes em

comparação com os folículos de crescimento lento. Apesar disso, observou-se um aumento

dependente da dose (p < 0.05) nos níveis de E2, com a adição de T, em relação ao grupo TRL.

Resultados | 61

Figura 6. Efeito da reposição de T sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).

Quando o AMH foi mensurado como um marcador de função folicular parácrina, não

foi observada nenhuma diferença nos níveis entre os grupos para folículos de crescimento

lento (dados não mostrados). Contudo, para folículos de crescimento rápido (Fig. 7), o TRL

isolado não alterou os níveis de AMH, mas a adição de alta dose de T reduziu (p < 0.05) os

níveis de AMH produzido por folículos antrais em relação aos grupos controle e TRL + T

baixa na quinta semana de cultivo.

Figura 7. Efeito da reposição de T sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).

Resultados | 62

D) Efeitos sobre o grau de maturação, qualidade oocitária e fertilização

Como observado no Exp. 1, poucos folículos antrais e seus oócitos foram analisados

após exposição ao hCG durante a exposição ao TRL (Tabela IV; Reposição de T). Porém, a

exposição a T durante o tratamento com TRL recuperou a formação de folículos antrais, que

de forma consistente deram origem a oócitos saudáveis, embora sua maioria se encontrasse no

estágio de vesícula germinativa (GV). Ambos os grupos T baixa e controle apresentaram

folículos que deram origem a 1 oócito MI, e os grupos T alta e controle apresentaram

folículos que deram origem a oócitos MII após a exposição ao hCG. Os diâmetros de ambos

os oócitos MII obtidos eram superiores a 130 µm. Após FIV, a fertilização foi confirmada

pela presença de 2 corpúsculos polares e 2 pro-núcleos (dados não mostrados). Entretanto, os

zigotos mantiveram-se sem apresentar divisão celular.

Resultados | 63

Tabela IV. Efeito da reposição de T nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).

Cultivo folicular Número (n) de Diâmetro (µm)*

Folículos analisados

Oócitos coletados



Oócitos MI

Oócitos MII VG MI MII

Reposição de T CTRL 15 15 2 12 1 1 119 ± 5a 143 131

TRL 4 4 2 2 0 0 117 ± 2a - -

TRL + T baixa 16 16 1 13 1 0 119 ± 14a 131 -

TRL + T alta 13 13 0 12 0 1 102 ± 14a - 147 Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); VG: vesícula germinativa; MI: metáfase I; MII: metáfase II. * Valores expressos em média ± erro padrão, com cada diâmetro oocitário como um dado individual; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05); O número de folículos analisados corresponde ao número de folículos que atingiram o diâmetro médio de 1 mm, e receberam hCG.

Resultados | 64

Experimento 3 – Reposição de dihidrotestosterona


A adição de DHT em presença do TRL recuperou a porcentagem de folículos

sobreviventes para os níveis encontrados no grupo controle (Fig. 8B); a resposta foi similar ao

observado após adição de T (Fig. 8A). Notavelmente, a administração de DHT isoladamente

contribuiu para o aumento da porcentagem de folículos que sobreviveram para mais do que

80%, acima (p < 0.05) do que foi observado para o grupo controle.

Figura 8. Efeito da reposição de T e DHT sobre a sobrevida de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Reposição de T; B. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).

Além disso, a porcentagem de folículos antrais no grupo que recebeu DHT

isoladamente (grupo DHT) (93 ± 3%) foi superior (p < 0.05) a porcentagem encontrada no

grupo controle (82 ± 4%) (Fig. 9B).

A. B.

CTRL TRL TRLTL TRLTH0

20

40

60

80

100

B

A,B

A

A,B

Su

rviv

al (

%)

CTRL TRL DHT DT0

20

40

60

80

100

AA,C

CS

urv

ival

(%

)

B

So

bre

vid

a (%

)

So

bre

vid

a (%

)

TRL+T baixa TRL+T alta CTRL TRL DHT TRL+DHTCTRL TRL

Resultados | 65

Figura 9. Efeito da reposição de T e DHT sobre a formação de antro de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Reposição de T; B. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).


Diferentemente do que foi observado nos Exp. 1 e 2, a exposição ao TRL

isoladamente não alterou as porcentagens de folículos sem crescimento ou que apresentam

crescimento lento ou rápido, e a reposição de DHT não apresentou um efeito positivo aparente

(Tabela V; Reposição de DHT). Entretanto, a adição isolada de DHT reduziu o

número/porcentagem (7%) de folículos sem crescimento, comparado com os grupos controle,

TRL e TRL + DHT. O TRL novamente diminuiu o diâmetro de folículos de crescimento lento

em relação aos folículos controle (315 ± 13 vs. 357 ± 16 µm, p < 0.05), porém essa diferença

desapareceu quando o tratamento com TRL foi combinado com a adição de DHT (373 ± 14

µm). DHT administrada isoladamente não apresentou efeito no diâmetro de folículos de

crescimento lento (dados não mostrados), mas contribuiu para a diminuição do tamanho de

folículos de crescimento rápido comparado aos controles (607 ± 29 vs. 726 ± 50 µm, p <

0.05).

Resultados | 66

Tabela V. Efeito da reposição de T e DHT sobre as características de crescimento folicular de folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas.

Cultivo folicular Total Sem

crescimentoCrescimento

lento Crescimento

rápido Reposição de T

CTRL 47 3 (6%)a,b 31 (66%)a,b 13 (28%)a,b TRL 23 5 (22%)b 13 (57%)b 5 (21%)a

TRL + T baixa 47 0 (0%)a 29 (62%)a,b 18 (38%)b TRL + T alta 53 0 (0%)a 37 (70%)a 16 (30%)a,b

Reposição de DHT CTRL 51 9 (18%)a 22 (43%)a 20 (39%)a

TRL 30 5 (17%)a,b 16 (53%)b 9 (30%)b,c DHT 58 4 (7%)c 35 (60%)c 19 (33%)b

TRL + DHT 51 11 (22%)d 26 (51%)b,d 14 (27%)c Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05).

C) Efeito sobre a produção de esteróides ovarianos e AMH

Como no Exp. 2, TRL diminuiu (p < 0.05) os níveis de P4 produzidos por folículos de

crescimento lento e a reposição com DHT recuperou os níveis produzidos, tornando-os

similares aos níveis encontrados no grupo controle (dados não mostrados). Da mesma forma,

nem a adição de DHT (Fig. 10C) ou T (Fig. 10A) alteraram a produção de P4 quando

combinados com o TRL. Contudo, a adição de DHT isoladamente aumentou os níveis de P4

produzidos por folículos de crescimento lento (dados não mostrados), e de crescimento rápido

(Fig. 10C). Diferente da adição de T (Fig. 10B), a adição de DHT + TRL reduziu

significativamente o E2 produzido por folículos de crescimento lento (dados não mostrados) e

de crescimento rápido (Fig. 10D) quando comparados ao grupo controle. Além disso, DHT

administrado de forma isolada replicou este mesmo efeito, também quando comparado ao

grupo controle.

Resultados | 67

Figura 10. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de progesterona e estradiol por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A e B. Reposição de T; C e D. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).

Os níveis de AMH produzidos por folículos de crescimento rápido e crescimento lento

(dados não mostrados), foram marcadamente reduzidos quando DHT foi administrada

isoladamente (Fig. 11B), quando comparado com controles. A adição de DHT em presença de

TRL diminuiu (p < 0.05) os níveis de AMH em relação ao grupo TRL.

Resultados | 68

Figura 11. Efeito da reposição de T e DHT sobre a produção de AMH por folículos secundários de Macaca mulata cultivados individualmente em matrix 3D por 5 semanas. Nota. A. Reposição de T; B. Reposição de DHT; CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); DHT: 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; TRL + DHT: 250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de dihidrotestosterona, desde o início do cultivo; Diferentes letras (A, B, C) indicam diferença significativa (p < 0,05).

D) Efeitos sobre o grau de maturação, qualidade oocitária e fertilização

Como notado para os primeiros experimentos, poucos oócitos saudáveis foram

coletados a partir de folículos antrais no grupo TRL, comparado ao grupo controle (Tabela

VI; Reposição de DHT). Em contraste, o grupo de reposição de DHT apresentou folículos que

deram origem tipicamente a oócitos saudáveis (10 de 13), incluindo um oócito em estágio

MII. Notavelmente, o diâmetro dos oócitos VG obtidos a partir do grupo de reposição de

DHT (grupo TRL + DHT) foi maior (p < 0.05) do que os obtidos no grupo controle. A

exposição a DHT isoladamente (grupo DHT) deu origem a oócitos com características

semelhantes aqueles obtidos no grupo controle ou de reposição de DHT, exceto que nenhum

oócito MII foi observado. A Figura 12 ilustra um folículo secundário (Fig. 12A)

desenvolvendo-se em cultivo até o estágio antral semana 3 (Fig. 12B). Oócitos foram

coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (Fig. 12C). Após FIV em 3 oócitos MII

(Fig. 12D; 2 obtidos do grupo controle e 1 do grupo TRL + DHT), a fertilização foi

confirmada pela presença de 2 corpúsculos polares e 2 pro-núcleos (dados não mostrados).

Um dos oócitos fertilizados do grupo controle sofreu clivagem e o embrião desenvolve-se até

o estágio de mórula no dia 5 de cultivo após a FIV (Fig. 12E).

Resultados | 69

Tabela VI. Efeito da reposição de T e DHT nas características de oócitos coletados de folículos antrais na semana 5 de cultivo (34 h após administração de hCG).

Cultivo folicular Número (n) de Diâmetro (µm)*

Folículos analisados

Oócitos coletados



Oócitos MI

Oócitos MII VG MI MII

Reposição de T CTRL 15 15 2 12 1 1 119 ± 5a 143 131

TRL 4 4 2 2 0 0 117 ± 2a - -

TRL + T baixa 16 16 1 13 1 0 119 ± 14a 131 -

TRL + T alta 13 13 0 12 0 1 102 ± 14a - 147

Reposição de DHT CTRL 21 21 6 13 0 2 110 ± 2a - 123 ± 3

TRL 8 8 6 2 0 0 112 ± 2a,b - -

DHT 10 10 4 6 0 0 116 ± 4a,b - -

TRL + DHT 13 13 3 9 0 1 118 ± 2b - 117 Nota. CTRL: controle (veículo); TRL: trilostano (250 ng/mL desde o inicio do cultivo); TRL + T baixa (250 ng/mL de trilostano + 10 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); TRL + T alta (250 ng/mL de trilostano + 50 ng/mL de testosterona, desde o início do cultivo); VG: vesícula germinativa; MI: metáfase I; MII: metáfase II. * Valores expressos em média ± erro padrão, com cada diâmetro oocitário como um dado individual; Diferentes letras (a, b, c) dentro da mesma coluna indicam diferença significativa (p < 0,05); O número de folículos analisados corresponde ao número de folículos que atingiram o diâmetro médio de 1 mm, e receberam hCG.

Resultados | 70

Figura 12. Folículo secundário em desenvolvimento até a obtenção de embrião. Nota. A: dia 1; B: semana 3 de cultivo; C: semana 5 de cultivo; D: oócito MII; E: embrião em estágio de mórula no dia 5 de desenvolvimento Experimento 3.

Discussão

Discussão | 72

Muitos estudos (ZELINSKI et al., 1993; HILLIER, TETSUKA, 1997; VENDOLA et

al., 1998; GOERLICH et al., 2010; GLEICHER et al., 2011) suportam o conceito de que os

androgênios são detrimentais para a maturação gamética e folicular. Contudo, estudos

recentes com roedores (TETSUKA et al., 1995; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2012;

2013), e outras espécies de mamíferos (CAMPO et al., 1985a,b; HILLIER et al., 1997; WEIL

et al., 1998; DUFFY et al., 1999; CÁRDENAS, POPE, 2002; HAMPTON et al., 2004;

MCEWAN et al., 2010; GLISTER et al., 2010) incluindo humanos (HORIE et al., 1992;

SUZUKI et al., 1994; KIM et al., 2011), ampliaram esta visão no sentido de considerar que os

androgênios possuem ações positivas durante o desenvolvimento folicular. Estes estudos

estabeleceram que ARs são expressos nos folículos desde os estágios iniciais de crescimento

(KIMURA et al., 2007; LENIE, SMITZ, 2009) e desempenham um papel essencial na

foliculogênese (WALTERS et al., 2008; 2010; LEBBE, WOODRUFF, 2013). Entretanto,

estudos adicionais são necessários para se definir os efeitos diretos dos androgênios nos

folículos de mamíferos, (HARLOW et al., 1988; VENDOLA et al., 1999a, YANG,

FORTUNE, 2006) e seus oócitos (VENDOLA et al., 1999b) em estágios específicos da

foliculogênese, incluindo primatas. Um sistema de cultivo folicular 3D, onde folículos são

encapsulados individualmente usando biomateriais a base de alginato (KREEGER et al.,

2006; XU et al., 2006; WEST et al., 2007; SHIKANOV et al., 2009), foi aplicado

recentemente por nosso grupo para o cultivo de folículos de primatas (XU et al., 2009b; XU et

al., 2010), e poderia ser um sistema valioso para estudos relacionados com ação androgênica

local. Este sistema 3D é capaz de suportar o crescimento dos folículos, permitindo o

desenvolvimento folicular in vitro desde os estágios iniciais (folículos secundários) até o

estágio antral de pequeno diâmetro (1 mm), com produção de hormônios esteróides em

humanos (XU et al., 2009a) e primatas não humanos (macacos rhesus) (XU et al., 2009b; XU

et al., 2010; XU et al., 2011a) e em alguns casos oócitos maduros, que quando inseminados

são fertilizados, dando origem a embriões em estágio de clivagem (macacos; XU et al.,

2011a) e mesmo a nascidos vivos (camundongos; XU et al., 2006; WEST et al., 2007).

A proposta do presente estudo foi investigar pela primeiravez, o papel dos androgênios

no desenvolvimento folicular (sobrevida, formação de antro, produção hormonal e maturidade

oocitária), de folículos pré-antrais frescos de primatas não-humanos cultivados

individualmente, em sistema de cultivo in vitro em matrix 3D por meio da ablação da

produção de esteróides e reposição de T e DHT.

A ablação da produção de esteróides pode ser atingida pela administração de TRL, que

é uma droga que inibe a ação da enzima 3β-hidroxidesidrogenase nas células da teca

Discussão | 73

(SCHANE et al., 1979). Com o bloqueio desta enzima, a formação de progesterona, 17-

hidroxi-progesterona, androstenediona e testosterona pode ser diretamente suprimida. Desta

forma, a formação dos substratos que dão origem ao E2 e DHT nas células da granulosa pode

ser comprometida (KIMURA et al., 2007). Com base em experiências prévias positivas com o

uso desta droga em estudos in vitro (DUFFY et al., 1996) e in vivo (HIBBERT et al., 1996), o

TRL foi usado no presente estudo com o objetivo de induzir a ablação de esteróides em

folículos cultivados individualmente in vitro. As concentrações suprimidas de P4 e E2 no

Exp. 1, demonstraram que o uso do TRL foi efetivo no bloqueio da conversão de

pregnenolona, cujos níveis encontrados foram elevados, em progesterona e outros esteróides

como a androstenediona (dados não mostrados) e estradiol, afetando diretamente a cascata

esteroidogênica. Após a formação de antro, folículos de crescimento lento e rápido

produziram apreciáveis níveis de P4 no grupo controle, enquanto que os níveis foram

marcadamente reduzidos pela exposição ao TRL. Ao mesmo tempo, folículos de crescimento

lento e rápido que receberam TRL desde o início e após 2 semanas de cultivo, apresentaram

concentrações de pregnenolona bastante aumentadas. Notavelmente, a exposição ao TRL

também reduziu as concentrações de E2. Os resultados deste estudo são consistentes com

achados obtidos em estudos in vivo com macacas, que mostraram que um dos efeitos da ação

do TRL parece ser a inibição da produção/ação da progesterona, uma vez que a administração

do TRL conjunta com o hCG, bloqueou a ovulação, enquanto que a administração

concomitante de progestina (R5020) preveniu a ação anti-ovulatória. Estudos prévios in vitro

também mostraram que a administração do TRL efetivamente inibiu a produção de P4 e

reduziu o número de células positivas para receptores de progesterona (PRs) (DUFFY et al.,

1996).

Estes efeitos são consistentes com a atividade conhecida do TRL como inibidor do

sistema enzimático 3β-hidroxiesteroide desidrogenase (POTTS et al., 1978). A exposição ao

TRL desde o início do cultivo para a sustentação de um ambiente pobre em esteróides,

realmente afeta a sobrevida, o crescimento e a formação de antro dos folículos. A

porcentagem dos folículos sobreviventes em cultivo e que atingiram a formação de antro foi

menor na presença de TRL quando o mesmo foi adicionado no início do cultivo e quando

comparado com o grupo controle. Além disso, quando a droga foi adicionada, não houve a

formação de folículos de crescimento rápido, os folículos de crescimento lento não cresceram

o esperado e a porcentagem de folículos que não cresceram foi alta. Os efeitos do bloqueio da

esteroidogênese também puderam ser observados na qualidade oocitária e grau de maturação.

No grupo controle, apesar dos oócitos obtidos terem reiniciado a maturação meiótica

Discussão | 74

raramente em resposta ao hCG, eles eram tipicamente saudáveis. Em contrante, poucos

folículos desenvolveram-se ao estágio antral durante a exposição ao TRL e apenas um oócito

foi coletado neste grupo, e cerca de metade dos oócitos coletados no grupo TRL2 não eram

saudáveis. Estes achados são consistentes com o conceito de que os esteróides ovarianos

possuem um papel local crítico no crescimento e desenvolvimento dos folículos de primatas

desde o início da foliculogênese. Notavelmente, os efeitos da ablação da produção de

esteróides podem dever-se a perda da ação local dos progestagênios, androgênios ou

estrogênios, individualmente ou em conjunto. Além dos ARs (CAMPO et al., 1985b; HILD-

PETITO et al., 1991; HORIE et al., 1992; DUFFY et al., 1999), há evidências da presença de

PRs (PELUSO et al., 1998; GAVA et al., 2004; PELUSO, 2006), e ERs (CHIAN et al., 1999;

BISHONGA et al., 2001) em folículos de primatas com possíveis ações locais

(progestagênios - DULEBA et al., 1999; SLOMCZYNSKA et al., 2000; PELUSO, 2006;

estrogênios – DRUMMOND, FINDLAY, 1999; NELSON, BULUN, 2001). Neste estudo

inicial, optamos por focar nos possíveis papéis dos androgênios, por meio da reposição de T e

DHT.

A adição de testosterona ao meio de cultivo desprovido de esteróides, contribuiu

marcadamente para o aumento da sobrevida e formação de antro de folículos pré-antrais

individuais de primatas não-humanos cultivados in vitro. A adição de testosterona em

presença de TRL também deu origem a oócitos maduros e saudáveis. Um maior número de

folículos antrais foi formado tanto quando uma dose baixa (remanescente aos níveis

circulantes em primatas) ou uma dose alta (como encontrado no fluido folicular de folículos

maduros de primatas) de testosterona foi adicionada no meio de cultivo, em relação ao

número de folículos antrais formados no grupo TRL. O crescimento também foi recuperado

para o padrão observado no grupo controle tanto para folículos de crescimento lento como

rápido, que apresentaram diâmetros superiores aos encontrados para o grupo TRL em

comparação com os controles, e além disso, evidenciado pela ausência de folículos sem

crescimento tanto no grupo T baixa como T alta e pelo fato de que os folículos de crescimento

rápido constituíram pela primeira vez mais de 30% da população total de folículos. Oócitos

saudáveis foram produzidos após exposição a T durante o tratamento com TRL, nos estágios

VG, MI e MII e dois embriões foram formados. Estes dados sugerem que a reposição de

androgênios pode promover a maturação e viabilidade oocitária, e que a ação androgênica no

folículo pode estar relacionada a interações entre o oócito e células somáticas via fatores

secretados pelo oócito (DRUMMOND, 2006).

Discussão | 75

Da mesma forma que o TRL reduziu de forma efetiva os níveis de esteróides em

relação ao grupo controle, o E2 apresentou-se marcadamente aumentado na exposição a doses

baixa e alta de T em presença de TRL. Concentrações elevadas de E2 foram observadas tanto

para folículos de crescimento lento quanto crescimento rápido, presumidamente devido a

aromatização de T por células da granulosa de folículos antrais (XING et al., 2012). Efeitos

locais do E2 nos folículos tem sido reportados e parecem ser espécie dependentes. O E2

parece ser importante em eventos envolvidos na foliculogênese, especialmente em roedores

(DRUMMOND, FINDLAY, 1999; BISHONGA et al., 2001; BOLAMBA et al., 2006; XU et

al., 2010), porém seu papel em folículos de primatas ainda está pouco claro (CHIAN et al.,

1999; BOLAMBA et al., 2006). A recuperação da sobrevida, formação de antro e crescimento

nos grupos com reposição de T, podem ser devido em parte pela possível conversão de T em

E2 pela aromatase P450, e sinalização estrogênio-receptor no folículo. Experimentos

anteriores, nos quais altas doses de T foram administradas (HILLIER, ROSS, 1979;

NANDEDKAR, MUNSHI, 1981), permitiram que fosse proposto que os efeitos

“androgênicos” eram mediados por estrogênios que foram convertidos por meio de ERs e não

por meio de ARs. Contudo, os androgênios também podem ser produzidos pelo ovário, e a

testosterona reposta poderia ser convertida em dihidrotestosterona pela enzima 5α-redutase

nas células da granulosa ou ter efeitos diretos sobre os folículos, sendo responsáveis em parte

pela restauração da sobrevida, formação de antro e crescimento observados em nosso

experimento in vitro. Com o intuito de testar esta hipóstese, a DHT, um androgênio não-

aromatizável, foi adicionado ao cultivo dos folículos, conforme descrito no Experimento 3.

Assim como para a exposição a T, a DHT em conjunto com TRL recuperou a

habilidade dos folículos em se desenvolver e a produzir oócitos maduros. A adição de DHT

com TRL recuperou a porcentagem de folículos sobreviventes aos níveis encontrados no

grupo controle. Como esperado, o diâmetro de folículos com crescimento lento foi reduzido

na presença de TRL administrado isoladamente, comparado aos controles, mas a diferença

desapareceu quando DHT foi adicionada ao cultivo, como aconteceu quando T foi adicionada.

Para folículos que cresceram rápido, a DHT (isoladamente) diminuiu o tamanho dos folículos

comparado com controles, o que foi similarmente observado quando uma dose alta de T foi

administrada em presença de TRL. Os níveis de P4 foram encontrados reduzidos em folículos

de crescimento lento quando TRL foi adicionado isoladamente, e os níveis foram restaurados

aqueles encontrados no grupo controle quando DHT foi reposta, de forma similar como o que

foi observado quando uma dose baixa de T foi adicionda ao cultivo para folículos de

crescimento rápido. Da mesma forma, foi observado um efeito positivo em relação a

Discussão | 76

qualidade oocitária quando os folículos foram expostos a DHT. De forma consistente com a

reposição de T, a maioria dos oócitos coletados de folículos antrais quando DHT foi reposta

foi saudável, incluindo um oócito MII. É importante ressaltar que o diâmetro dos oócitos VG

saudáveis foi superior no grupo DHT comparado com os controles, e a exposição a DHT

isoladamente deu origem a oócitos com características similares as observadas no grupo

controle ou de reposição de DHT, exceto que oócitos MII não foram observados. Estes

reultados suportam fortemente a idéia de que as ações dos androgênios promovem

crescimento folicular precoce, esteroidogênese e desenvolvimento oocitário em folículos de

primatas desde o início da foliculogênese.

Diferentemente da adição de T, a combinação de DHT com TRL, não contribuiu para

o aumento da produção de E2 por folículos de crescimento lento e rápido comparados com os

grupos controle e TRL (isoladamente), dando suporte a conclusão de que a T, e não a DHT, é

aromatizada no folículo. Como notado, muitas mudanças causadas por T, foram mimetizadas

por DHT. Desta forma, muitos dos efeitos positivos no desenvolvimento folicular encontrados

após a reposição de T, provavelmente não são devidos a ação estrogênica. Sendo assim, é

possível inferir que os androgênios apresentam um papel local essencial durante o

desenvolvimento e maturação folicular em primatas não humanos. Corroborando nossos

resultados em folículos de primatas, o tratamento de folículos de camundongo com

hidroxiflutamida ou bicalutamida, dois componentes anti-androgênicos, reduziu o

crescimento folicular durante o estágio pré-antral, alterou a função esteroidogênica, e impediu

a maturação meiótica de oócitos em resposta ao hCG (LENIE, SMITZ, 2009).

Alguns dos efeitos androgênicos observados podem ser inibitórios a funções

foliculares. Em relação ao Hormônio Anti-Mulleriano (AMH), uma glicoproteína produzida

pelas células da granulosa no ovário e que está relacionada com a regulação do crescimento e

desenvolvimento dos folículos (ILIODROMITI, NELSON, 2013; DEWAILLY et al., 2014),

a adição de uma dose alta de T contribuiu para a redução dos níveis de AMH produzidos por

folículos antrais quando comparados com controles na semana 5 de cultivo. Resultados

similares foram observados após a adição de DHT ao TRL, que também reduziu os níveis de

AMH comparado com o grupo TRL. Além disso, os níveis de AMH também foram reduzidos

em folículos de crescimento lento e rápido quando DHT foi adicionado isoladamente. Estes

dados demonstram o efeito dose dependente dos androgênios, mostrando níveis baixos de

AMH em presença de altas doses de T e DHT, mas não dose baixa de T, comparado com

controles. Este efeito dependente da dose pode significar que concentrações altas de

androgênios apresentam ações adicionais negativas nos folículos, reforçando o conceito de

Discussão | 77

que altos níveis de androgênios no estágio antral devem estar associados com efeitos

negativos para o desenvolvimento folicular, e concentrações apropriadas de AMH seriam um

sinal de um adequado desenvolvimento folicular (NARDO et al., 2009). Em contraste, isto

também poderia significar que os androgênios podem ser reguladores de uma excessiva

síntese de AMH pelas células da granulosa, responsável por causar paralização do

desenvovimento folicular, baseado em estudos com pacientes com SOP.

Nossos resultados suportam a evidência de que ação dos androgênios no folículo pode

ser estágio e/ou de dose-dependente. Estudos tem evidenciado o papel dos androgênios no

estágio folicular pré-antral (KIMURA et al., 2007; LENIE, SMITZ, 2009). Contudo, como

frequentemente observado em estudos in vivo com pacientes com SOP (DUMESIC et al.,

2008; LEBBE, WOODRUFF, 2013), os androgênios podem apresentar efeitos negativos

sobre os folículos dependendo de seus níveis intrafoliculares, especialemente se eles são altos,

afetando o desenvolvimento folicular e a maturação oocitária (HILLIER, TETSUKA, 1997;

VENDOLA et al., 1998). Além disso, existem estudos reportando que a apoptose pode ser

induzida por androgênios em células da granulosa em ratas (BILLIG et al., 1993),

evidenciando também um efeito prejudicial de níveis de T excessivos. Particularmente

perplexo neste experimento, é a evidência de que uma dose baixa de T (e DHT), mas não uma

dose alta de T, restaurou os níveis de P4 aos níveis encontrados no grupo controle, apesar da

presença de TRL. Neste caso, a T demonstra um efeito dose dependente, onde uma baixa dose

de T contribuí para a manutenção de níveis adequados de P4, e uma dose alta afeta

negativamente a produção de P4. Entretanto, os possíveis mecanismos envolvidos na

conversão ativa de androgênios em progesterona, ou na sinalização de receptores

androgênicos que promovem a produção de 3-β-HSD independente da progesterona não são

claros.

Notavelmente, a administração isolada de DHT replicou muitos dos efeitos observados

quando T ou DHT foi adicionado em conjunto com TRL. A porcentagem de folículos

sobreviventes e a porcentagem de formação de folículos antrais foi maior do que o observado

no grupo controle. Em relação aos efeitos no crescimento de folículos de crescimento rápido,

DHT administrada isoladamente, diminuiu o tamanho dos mesmos, o que também foi

observado quando uma dose alta de T foi adicionada em presença de TRL. A adição isolada

de DHT também reduziu a porcentagem de folículos sem crescimento, comparado com

controles ou quando DHT estava presente em conjunto com TRL. Em contraste ao observado

quando DHT e T foram adicionados com TRL, a adição de DHT isoladamente aumentou os

níveis de P4 produzidos por folículos de crescimento lento e rápido. Estes resultados também

Discussão | 78

são consistentes com a idéia de que os androgênios são essenciais na foliculogênese, e que

androgênios endógenos não provocam um efeito máximo durante a cultura de folículos. A

adição de DHT no meio de cultivo padrão, com a função de contribuir para o crescimento

folicular, poderia ser sugerido como uma tentativa de melhoramento nas condições de cultivo.

Um estudo que examinou in vitro o efeito da DHT na síntese e secreção de progesterona por

células foliculares em resposta ao FSH e IGF-I, mostrou que a DHT contribuiu

significativamente para a proliferação de células da granulosa estimulada por IGF-I, e teve

uma influência variável na secreção de progesterona. Os autores concluíram que a atividade

mediada por androgênio-receptor nas células da granulosa de folículos antrais é dependente

do tamanho do folículo, e influenciada pela proximidade das células e do oócito, e

possivelmente envolve tanto mecanismos de ação esteroidogênica clássicos como não-

clássicos (HICKEY et al., 2005).

Apesar de outros androgênios estarem presentes no ovário, apenas a T e seu

metabólito DHT, possuem atividade androgênica direta por meio de ARs (KIRILOVAS et al.,

2003; HICKEY et al., 2005). Diversos estudos documentam a expressão de ARs em ovários

de mamíferos (TETSUKA et al., 1995; SEM, HAMMES, 2010; XUE et al., 2012; 2013;

CAMPO et al., 1985a, b; HILLIER et al., 1997; WEIL et al., 1998; DUFFY et al., 1999;

CÁRDENAS, POPE, 2002; HAMPTON et al., 2004; MCEWAN et al., 2010; GLISTER et

al., 2010; HORIE et al., 1992; SUZUKI et al., 1994; KIM et al., 2011), e a ação dos

androgênios durante a foliculogênese ovariana, mostrando que são indispensáveis para um

processo de foliculogênese normal (HU et al., 2004; SHIINA et al., 2006). Contudo, a

conexão molecular entre os reguladores da foliculogênese ovariana e as reações sob controle

de ARs ainda permacecem pouco conhecidas. Existem muitos genes alvo de AR nos ovários,

porém não existem muitos estudos que os testaram ainda. Entretamento, a regulação

androgênica positiva destes genes que codificam o receptor de FSH (WEIL et al., 1999), fator

semelhante a insulina (IGF-1) e o receptor IGF-1 (VENDOLA et al., 1999a, b; WEIL et al.,

1999) é evidente ao nível de mRNA nas células foliculares de primatas e outras espécies

(HICKEY et al., 2005).

Este estudo in vitro apresentou novas evidências do papel local essencial dos

androgênios desde os estágios inicias da foliculogênese de primatas não humanos,

fortalecendo a existência de mecanismos moleculares que regulam a atividade de ARs, a

atividade androgênica (KIRILOVAS et al., 2003; LENIE, SMITZ, 2008), e novas possíveis

interações entre androgênios com outros hormônios esteróides. Nossos achados mostraram

claramente que a T e a DHT podem recuperar a sobrevida, o crescimento, a formação de

Discussão | 79

antro, a produção hormonal e a viabilidade oocitária de folículos pré-antrais cultivados in

vitro em matrix 3D de alginato, expostos a ablação da produção de esteróides. Novos

conhecimentos obtidos através deste estudo, podem ajudar no entendimento da dinâmica do

processo do desenvolvimento folicular, que ainda é muito pouco compreendida,

principalmente em primatas (CHAND et al., 2010). O melhor entendimento da foliculogênese

em primatas não humanos, pode desempenhar um papel crucial no entendimento da

etiopatogênese de distúrbios ovulatórios humanos, com destaque para a SOP, além de

favorecer a identificação das condições ótimas para o crescimento de folículos de primatas in

vitro, com inúmeras aplicabilidades clínicas, com destaque para a obtenção de oócitos

maduros saudáveis após o descongelamento do tecido ovariano em pacientes oncológicas

(WOODRUFF, 2007; SHEA et al., 2008; WEST et al., 2009; ZELINSKI, 2010; DONNEZ,

DOLMANS, 2011; SILBER, 2012; TELFER, ZELINSKI, 2013).

Conclusões

Conclusões | 81

A exposição ao TRL durante o cultivo de folículos secundários de primatas não humanos

cultivados individualmente em matrix 3D afeta negativamente a sobrevida, o crescimento e a

formação do antro folicular, assim como a qualidade e o grau de maturação oocitário. O bloqueio

mais precoce da 3-βHSD pelo TRL, administrado desde o início do cultivo interfere de modo

expressivamente mais negativo sobre estas variáveis. Estes achados são consistentes com o

conceito de que os esteróides ovarianos possuem um papel local crítico no crescimento e

desenvolvimento dos folículos de primatas não humanos desde o início da foliculogênese e que

quanto mais precoce o bloqueio, mais significativo seu impacto deletério.

A adição de T em dose baixa ou alta ao meio de cultivo na presença de TRL,

contribuiu expressivamente para o aumento da sobrevida, crescimento e formação de antro

folicular, comparáveis ao grupo controle. Além disto, deu origem a oócitos maduros e

saudáveis, e interferiu positivamente na produção hormonal, reestabelecendo as concentrações

de E2 e P4 a valores encontrados no grupo controle, com efeito dose-dependente. Estes dados

sugerem que a reposição de testosterona ao meio de cultivo desprovido de esteróides,

favorece a sobrevida, o crescimento e a formação de antro folicular, assim como a produção

de hormônios esteróides, e a maturação e viabilidade oocitária. Estes achados reforçam o

papel crítico dos esteróides ovarianos na foliculogênese precoce de primatas não humanos,

sem permitir, todavia, a definição do papel da testosterona ou seus metabólitos.

A adição de DHT promoveu a recuperação da sobrevida folicular, formação de antro,

produção hormonal e maturação oocitária. A adição de DHT ao meio de cultivo com TRL

recuperou a porcentagem de folículos sobreviventes aos níveis encontrados no grupo controle,

assim como a recuperação do crescimento, formação de antro, produção hormonal e

maturação oocitária. Contudo, a concentração de E2 não foi tão elevada como após a

reposição de T, dando suporte a conclusão de que a T, e não a DHT, é aromatizada no

folículo. Estes resultados suportam fortemente a idéia de que os androgênios promovem

crescimento folicular desde os estágios iniciais da foliculogênese, esteroidogênese e

participam na maturação oocitária.

Nossos achados demonstram que a T e a DHT podem reestabelecer a sobrevida, o

crescimento, a formação de antro, a produção hormonal e a viabilidade oocitária de folículos

pré-antrais cultivados in vitro em matrix 3D de alginato, expostos a ablação da produção de

esteróides. Estes achados são essenciais para o entendimento do processo da foliculogênese e

podem auxiliar na otimização da técnica de cultivo folicular in vitro em matrix 3D para

aplicação em diferentes tipos de estudo e futuramente para obteção de oócitos saudáveis para

pacientes com câncer que desejam preservar seus gametas.

Referências

Referências | 83

ALBERTINI, D. F. et al. Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development. Reproduction, v.121, n. 5, p 647-53, 2001.

AMORIN, C. A. et al.Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Human Reproduction, v. 24, n. 1, p. 92-99, 2009.

ANCKAERT, E. et al. Unaltered imprinting establishment of key imprinted genes in mouse oocytes after in-vitro follicle culture under variable follicle stimulating hormone exposure. Int J Dev Biol, v. 53, p. 541-548, 2009.

BAKER, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proc R Soc Lond B Biol Sci, v. 158, p. 417-33, 1963.

BALASCH, J. et al. Pretreatment with transdermal testosterone may improve ovarian response to gonadotrophins in poor-responder IVF patients with normal basal concentrations of FSH. Human Reproduction, v. 21, n. 7, p. 1884-1893, 2006.

BECKERS, J. F. et al. The ovarian follicle in cow: in vivo growth and in vitro culture. Reprod. Dom. Anim, v.31, p.543-548, 1996.

BILLIG, H. et al. Estrogens inhibit and androgens enhance ovarian granulosa cell apoptosis. Endocrinology, v. 133, p. 2204-2212. 1993

BISHONGA, C. et al. In vitro growth of mouse ovarian preantral follicles and the capacity of their oocytes to develop to the blastocyst stage. J Vet Med Sci, v.63, p.619-624, 2001.

BLEY, M. A., SARAGÜETA, P. E., BARAÑAO, J. L. Concerted stimulation of rat granulosa cell deoxyribonucleic acid synthesis by sex steroids and follicle-stimulating hormone. J Ster Biochem Molec Biol, v.62, p.11-19, 1997.

BOLAMBA, D. et al. Durrant BS. In vitro maturation of bitch oocytes from advanced preantral follicles in synthetic oviduct fluid medium: serum is not essential. Theriogenology, v.58, p.1689-1703, 2002.

BOLAMBA, D. et al. Effects of epidermal growth factor and hormones on granulose expansion and nuclear maturation of dog oocytes in vitro. Theriogenology, v.65, p.1037-1047, 2006.

BRAW-TAL, R., YOSSEFI, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicular growth in the bovine ovary. J. Reprod. Fertil., v.109, p.165-171, 1997.

Referências | 84

BUCCIONE, R., SCHROEDER, A. C., EPPIG, J.J. Interactions between somatic cells and germ cells throughout mammalian oogenesis. Biol. Reprod., v.43, p.543-547, 1990.

BUTLER, H. W. Ultrastructual studies on mitocondrial swelling. J. Biochem., v.118, p.883-886, 1970.

CAMPO, S. M., CARSON, R. S., FINDLAY, J. K. Distribution of specific androgen binding sites within the ovine ovarian follicle. Mol Cell Endocrinol, v. 39, p. 255-265, 1985a.

CAMPO, S. M., CARSON, R. S., FINDLAY, J. K. Acute effect of PMSG on ovarian androgen-binding sites in the intact immature female rat. Reprod Fertil Dev, v.4, p.55-65, 1985b.

CÁRDENAS, H., POPE, W. F. Androgen receptor and follicle-stimulating hormone receptor in the pig ovary during the follicular phase of the estrous cycle. Mol Reprod, v. 62, n. 1, p. 92-8, 2002.

CÁRDENAS, H., HERRICK, J. R., POPE, W. F. Increased ovulation rate in gilts treated with dihydrotestosterone. Reproduction, v. 123, n. 4, p. 527-33, 2002.

CATO, A. C. B., PETERZIEL, H. The androgen receptor as mediator of gene expression and signal transduction pathways. Trends Endocrinol Metab, v.9, n. 4, p. 150-4, 1998.

CECCONI, S. et al. In vitro development of sheep preantral follicles. Biol. Reprod, v. 60, n. 3, p. 594-601, 1999.

CHAND, A. L., HARRISON, C. A, SHELLING, A. N. Inhibin and premature ovarian failure. Human Reproduction Update, v. 16, p. 39-50, 2010.

CHENG, G. et al. A role for the androgen receptor in follicular atresia of estrogen receptor beta knockout mouse ovary. Biol Reprod, v.66, p.7784, 2002.

CHIAN, R. C. et al. Production of steroids from human cumulus cells treated with different concentrations of gonadotropins during in vitro culture. Fertil Steril, v.71, p.61-66, 1999.

COUSE, J. F., HEWITT, S. C., KORACH, K. S. Steroid receptors in the ovary and uterus. In: Neill J.D. (Ed.). Knobil and Neill´s physiology of reproduction. San Diego, CA: Elsevier Science, p.593-678, 2006.

Referências | 85

DEWAILLY, D. et al.The physiology and clinical utility of anti-Mullerian hormone in women. Hum Reprod Update, 2014. [Epub ahead of print]

DING, C. C. et al. Activin A inhibits activation of human primordial follicles in vitro. J assist Reprod Genet, v. 27, p. 141-7, 2010.

DODE, M. A., GRAVES, C. N. Role of estradiol-17 on nuclear and cytoplasmic maturation of pig oocytes. Anim Reprod Sci, v.78, p.99-110, 2003.

DONNEZ, J. 2nd World Congress of Fertility Preservation. Miami. 2011

DONNEZ, J., DOLMANS, M. M. Preservation of fertility in females with haematological malignancy. British Journal of Haematology. 2011.

DRUMMOND, A.E. The role of steroids in follicular growth. Reprod. Biol. Endocrinol, v. 4, n.16, 2006.

DRUMMOND, A. E., FINDLAY, J.K. The role of estrogens in folliculogenesis. Mol Cell Endocrinol, v.151, p.57-64, 1999.

DUFFY, D. M. et al. Androgen receptor mRNA expression in the rhesus monkey ovary. Endocrine. v. 11, n. 1, p. 23-30, 1999.

DUFFY, D. M., STOUFFER, R. L. Progesterone receptor messenger ribonucleic acid in the primate corpus luteum during the menstrual cycle: possible regulation by progesterone. Endocrinology, v.136, p.1869-1876, 1995.

DUFFY, D. M., MOLSKNESS, T. A., STOUFFER, R. L. Progesterone receptor messenger ribonucleic acid and protein in luteinized granulosa cells of rhesus monkeys are regulated in vitro by gonadotropins and steroids. Biol Reprod, v. 54, n. 4, p. 888-95, 1996.

DUFFY, D. M., STOUFFER, R. L. Follicular administration of a cyclooxygenase inhibitor can prevent oocyte release without alteration of normal luteal function in rhesus monkeys. Hum Reprod, v. 17, n. 11, p. 2825-31, 2002.

DULEBA, A. J. et al. Divergent mechanisms regulate proliferation/survival and steroidogenesis of theca-interstitial cells. Mol Hum Reprod, v.5, p.193-198, 1999.

DUMESIC, D. A., PADMANABHAN, V., ABBOTT, D. H. Polycystic ovary syndrome and oocyte developmental competence. Obstet Gynecol Surv. V. 63, n. 1, p. 39-48, 2008.

Referências | 86

DURLINGER, A. L. et al. Apoptotic and proliferative changes during induced atresia of pre-ovulatory follicles in the rat. Hum Reprod, v. 15, n. 12, p. 2504-11, 2000.

DURRANT, B. S. et al. Isolation and characterization of canine advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology, v. 49, p. 917-932, 1998.

EPPIG, J. J., SCHROEDER, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation and fertilization in vitro. Biol. Reprod., v.41, p. 268-276, 1989.

EPPIG, J. J., TELFER, E. E. Isolation and culture of oocytes. Meth. Enzymol., v. 225, p. 77-84, 1993.

EPPIG, J. J., WIIGGLESWORTH, K. Factors affecting the developmental competence of mouse oocytes grown in vitro: oxygen concentration. Mol. Reprod, v.42, p. 447-456, 1995.

FÁBREGUES, F. et al. Transdermal testosterone may improve ovarian response to gonadotrophins in low-responder IVF patients: a randomized, clinical trial. Hum Reprod, v. 24, p. 349-359, 2009.

FAIR, T. et al. Nucleus ultraestructure and transcriptional activity of bovine oocytes in preantral and early antral follicles. Mol. Reprod, v. 46, p. 817-832, 1997.

FERREIRA, E. M. et al. Cytoplasmic maturation of bovine oocytes: Structural and biochemical modifications and acquisition of developmental competence. Theriogenology, v. 71, n. 836-848, 2009.

FIGUEIREDO, J. R. et al. Preservation of oocyte and granulosa cell morphology in bovine preantral follicles cultured in vitro. Theriogenology, v. 41, p. 1333-1346, 1994.

FORTUNE, J. E., VINCENT, S. E. Progesterone inhibits the induction of aromatase activity in rat granulosa cells in vitro. Biol Reprod, v. 28, p. 1078-1089, 1983.

FORTUNE, J. E et al. The primordial to primary follicle transition. Mol. Cel. Endocrinol., v. 163, p. 53-60, 2000.

FORTUNE, J. E. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Anim Reprod Sci, v. 78, p. 135-63, 2003.

GAVA, N. et al.Expression of progesterone receptors A and B in the mouse ovary during the estrous cycle. Endocrinology, v. 145, p. 3487-3494, 2004.

Referências | 87

GIOMETTI I, C. et al. Controle local e endócrino do desenvolvimento e da regressão do corpo lúteo bovino. Rev Bras Reprod Anim, v. 33, p. 34-52, 2009.

GLISTER, C., SATCHELL, L., KNIGHT, P. G. Changes in expression of bone morphogenetic proteins (BMPs), their receptors and inhibin co-receptor betaglycan during bovine antral follicle development: inhibin can antagonize the suppressive effect of BMPs on thecal androgen production. Reproduction, v. 140, n. 5, p. 699-712, 2010.

GOLDENBERG, R. .L, VAITUKAITIS, J. L., ROSS, G. T. Estrogen and follicle-stimulating hormone interactions on follicle growth in rats. Endocrinology, v. 90, p. 1492-1498, 1972.

GORE-LANGTON, R. E., ARMSTRONG, D. T. Follicular steroidogenesis and its control. In: Knobil E, Neill JD (Ed.). Physiology of reproduction. New York: Raven Press, v.1, p.331-385, 1988.

GOUGEON, A. Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypotheses. Endocrine Reviews, v. 17, p. 121-155, 1996.

GOYENECHE, A. A. et al. Androstenedione interferes in luteal regression by inhibitingapoptosis and stimulating progesterone production. Biol Reprod, v. 66, p.1540-1547, 2002.

GREENWALD, G. S., MOOR, R. M. Isolation and preliminary characterization of pig primordial follicles. J. Reprod. Fertil., v.87, p.561-571, 1989.

GUPTA, P. S. P. et al. In vitro culture of buffalo (Bubalus bubalis) preantral follicles. Theriogenology, v.57, p.1839-1854, 2002.

GUTIERREZ, C. G. et al. Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long term culture in vitro. Biol. Reprod., v.62, p.1322-1328, 2000.

GUTIÉRREZ, S. et al. Estradiol interacts with insulin through membrane receptors to induce an antimitogenic effect on lactotroph cells. Steroids, v.73, p.515-527, 2008.

HADDAD, A., NAGAI, M. E. Radioautographic study of glicoprotein biosynthesis and renewal in the ovarian follicles of mice and the origin of the zona pellucida. Cell Tissue Res., v. 177, p. 347-369, 1977.

HAMPTON, J. H. et al. Androgen receptor mRNA expression in the bovine ovary. Domest Anim Endocrinol, v. 27, p. 81–88, 2004.

Referências | 88

HARLOW, C. R., HILLIER, S. G., HODGES, J. K. Androgen modulation of follicle-stimulating hormone-induced granulosa cell steroidogenesis in the primate ovary. Endocrinology, v. 119, n. 3, p. 1403-5, 1986.

HARLOW, C. R. et al. Factors influencing follicle-stimulating hormone-responsive steroidogenesis in marmoset granulosa cells: effects of androgens and the stage of follicular maturity. Endocrinology, v. 122, n. 6, p. 2780-7, 1988.

HERTING, A. T., ADAMS, E. C. Studies on the human oocyte and its follicle. I. Ultraestructural and histochemical observations on the primordial follicle stage. J. Cell Biol., v.34, p.647-675, 1967.

HIBBERT, M. et al. Midcycle administration of a progesterone synthesis inhibitor prevents ovulation in primates. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, v. 93, n. 5, p. 1897-901.

HICKEY, T. E. et al.Androgens augment the mitogenic effects of oocyte-secreted factors and growth differentiation factor-9 on porcine granulose cells. Biol Reprod, v.73, p.825-832, 2005.

HILD-PETITO, S. et al. Localization of androgen receptor in the follicle and corpus luteum of the primate ovary during the menstrual cycle. Biol Reprod, v.44, p.561-568, 1991.

HILLIER, S. G., DE ZWART, F. A. Evidence that granulosa cell aromatase induction/activation by follicle-stimulating hormone is an androgen receptor-regulated process in-vitro. Endocrinology, v.109, n. 4, p.1303-5, 1981.

HILLIER, S. G., TETSUKA, M. Role of androgens in follicle maturation and atresia. Baillieres Clin Obstet Gynaecol, v.11, n. 2, p. 249-60, 1997.

HILLIER, S. G. et al. Alterations in granulosa cell aromatase activity accompanying preovulatory follicular development in the rat ovary with evidence that 5alpha-reduced C19 steroids inhibit the aromatase reaction in vitro. J Endocrinol, v. 84, p. 409-19, 1980.

HILLIER, S.G., ROSS, G.T. Effects of exogenous testosterone on ovarian weight, follicular morphology and intraovarian progesterone concentration in estrogen-primed hypophysectomized immature female rats. Biol. Reprod, v. 20, 261-268, 1979.

HILLIER, S. G., TETSUKA, M., FRASER, H. M. Location and developmental regulation of androgen receptor in primate ovary. Hum Reprod, v.12, n., p. 107-11, 1997.

Referências | 89

HIRAO, Y., MIYANO, T., KATO, S. Fertilization of in vitro growth mouse oocytes. Theriogenology, v.34, p.1071-1077, 1990.

HIRAO, Y. et al. In vitro growth on maturation of pig oocytes. J. Reprod. Fertil., v.100, p.333-339, 1994.

HIRAO, Y. et al. In vitro growth and development of bovine oocyte granulosa cell complexes on the flat substratum effects of high polyvinyrrolidone concentration in culture medium. Biol Reprod, v. 70, p. 83-91, 2004.

HORIE, K. et al. Immunohistochemical localization of androgen receptor in the human ovary throughout the menstrual cycle in relation to oestrogen and progesterone receptor expression. Hum Reprod, v. 7, p. 184–190, 1992.

HOVATTA, O. et al.Extracellular matrix improves survival of both stored and fresh human primordial and primary ovarian follicles in long term culture. Human Reprod, v.12, p.1032-6, 1997.

HOVATTA, O. et al. Human primordial, primary and secondary ovarian follicles in long-term culture: effect of partial isolation. Human Reprod, v.14, p. 2519-24, 1999.

HUANMIN, Z., YONG, Z. In vitro development of caprine ovarian preantral follicles. Theriogenology, v.54, p.641-650, 2000.

HUANG, Z., WELLS, D. Molecular aspects of follicular development. Reproductive biology and cryobiology. In: Principles and practice of Fertility Preservation. Eds. Donnez J & Jim S. 2011.

HULSHOF, S. C. J. et al. Isolation and characterization of preantral follicles from fetal bovine ovaries. Vet. Quart., v.16, p.78-80, 1994.

HULSHOF, S. J. et al. Effects of fetal bovine serum, FSH and 17β-estradiol on the culture of bovine preantral follicles. Theriogenology, v.44, p.217226, 1995.

HUTT, K. J., MCLAUGHLIN, E. A., HOLLAND, M. K. Kit ligand and c-Kit have diverse roles during mammalian oogenesis and folliculogenesis. Mol Hum Reprod, v. 12, p. 61-69, 2006.

HYTTEL, P. et al. Oocyte growth, capacitation and final maturation in catle. Theriogenology, v.47, p.23-32, 1997.

Referências | 90

ILIODROMITI, S., NELSON, S. M. Biomarkers of ovarian reserve. Biomark Med, v. 7, n. 1, p. 147-58, 2003.

ITOH, T. et al. Growth, antrum formation, and estradiol production of bovine preantral follicles cultured in a serum-free medium. Biol. Reprod., v.67, p.1099-1105, 2002.

JEWGENOW, K., GÖRITZ, F. The recovery of preantral follicles from ovaries of domestic cats and their characterization before and after culture. Anim. Reprod. Sci., v.44, p.183-193, 1995.

JEWGENOW, K., PITRA, C. Hormone-controlled culture of secundary follicles of domestic cats. Theriogenology, v.39, p.527-535, 1993.

JEWGENOW, K. Impact of peptide growth factors on the culture of small preantral follicles of domestic cats. Theriogenology, v.45, p.889-895, 1996.

JOHNSON, J. et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature, v. 428, n. 6979, p. 145-50, 2004.

JUENGEL, J. L. et al. Oestrogen receptor a and b, androgen receptor and progesterone receptor mRNA and protein localization within the developing ovary and in small growing follicles of sheep. Reproduction, v.131, p.81-92, 2006.

KAIPIA, A., HSUEH, A. J. Regulation of ovarian follicle atresia. Annu Rev Physiol, v.59, p.707-724, 1997

KATSKA L., RYNSKA, B. The isolation and in vitro culture of bovine preantral and early antral follicles of different size classes. Theriogenology, v.50, p.213-222, 1998.

KIM, M. K. et al. Effects of estradiol-17β and progesterone supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Theriogenology, v.63, p.1342-1353, 2005.

KIM, S. S. General overview of ovarian cryobanking. In. Donnez J, Kim SS., editors. Principles and Practice of Fertility Preservation. 1st ed. Cambridge University Press, p. 328–41, 2011.

KIMURA, S. et al. Androgen receptor function in folliculogenesis and its clinical implication in premature ovarian failure. Trends Endocrinol Metab, v. 18, n. 5, p. 183-9, 2007.

Referências | 91

KIRILOVAS, D. et al.Effects of androgens on aromatase activity and 11C-vorozole binding in granulosa cells in vitro. Acta Obstet Gynecol Scand, v. 82, n. 3, p. 209-15, 2003.

KREEGER, P. K. et al.The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials, v. 27, n. 5, p. 714-23, 2006.

LEBBE, M., WOODRUFF, T. K. Involvement of androgens in ovarian health and disease. Mol Hum Reprod. 2013 [Epub ahead of print].

LENIE, S., SMITZ, J. Functional AR signaling is evident in an in vitro mouse follicle culture bioassay that encompasses most stages of folliculogenesis. Biol Reprod, v. 80, n. 4, p. 685-95, 2009.

LIMA-VERDE, I. B. et al. Interaction between estradiol and follicle-stimulating hormone promotes in vitro survival and development of caprine preantral follicles. Cells Tissues Organs, v.191, p.240247. 2010.

LUCCI, C. M. et al. Light microscopical and ultrastructural characterization of goat preantral follicles. Small Rumin. Res., v.41, p.61-69, 2001.

LUSSIER, J.G., MATTON, P., DUFOUR, J.J. Growth rates on follicles in the ovary of the cow. J. Reprod. Fertil., v.81, p.301-307, 1987.

MACHELON, V., NOME, F., TESARIK, J. Nongenomic effects of androstenedione on human granulosa luteinizing cells. J Clin Endocrinol Metab, v.83, p.263-269, 1998.

MANDL, A. M., ZUCKERMAN, S. The relation of age to numbers of oocytes. J. Endocrinol., v.7, p.190-193, 1951.

MATOS, M. H. et al. Essential role of follicle stimulating hormone in themaintenance of caprine preantral follicle viability in vitro. Zygote, v.15, p.173-182, 2007.

MATZUK, M.M. Revelations of ovarian follicle biology from gene knockout mice. Molecular and Cellular Endocrinology, v.163, p. 61-66, 2000.

MCEWAN, I. J. et al. Identification of androgen receptor phosphorylation in the primate ovary in vivo. Reproduction, v. 140, n. 1, p. 93-104, 2010.

MCGEE, E. A., HSUEH, A. J. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Ver, v. 21, p. 200-14, 2000.

Referências | 92

MCNATTY, K. P. et al. The Production of progesterone, androgens, and estrogens by granulosa cells, thecal tissue, ans stromal tissue from humano varies in vitro. J Clin Endocrinol Metab, v. 49, p. 687-99, 1979.

MCNATTY, K. P. et al. Effects of luteinizing hormone on steroidogenesis by thecal tissue from human ovarian follicles in vitro. Steroids, v. 36, n. 1, p. 53-63, 1980.

MENG, L., WOLF, D. P. Sperm-induced oocyte activation in the rhesus monkey: nuclear and cytoplasmic changes following intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. V. 12, n. 5, p. 1062-8, 1997

MENG, L. et al. Rhesus monkeys produced by nuclear transfer. Biol Reprod, v. 57, n.2, p. 454-9, 1997.

MINEGISHI, T. et al. A role of insulin-like growth factor I for follicle-stimulating hormone receptor expression in rat granulosa cells. Biol Reprod, v.62, p.325-333, 2000.

MIZRACHI, D., AUCHUS, R. J. Androgens, estrogens and hydroxysteroid dehydrogenases. Mol Cell Endocrinol, v.301, p.37-42, 2009.

MOON, Y. S. et al. 17 beta Estradiol biosynthesis in cultured granulosa and thecal cells of human ovarian follicles: stimulation by follicle-stimulating hormone. J Clin Endocrinol Metab, v. 47, p. 263-7, 1978.

MULAC-JERICEVIC, B. et al. Subgroup of reproductive functions of progesterone mediated by progesterone receptor-B isoform. Science, v.289, p.1751-1754, 2000.

MULAC-JERICEVIC, B. et al.Defective mammary gland morphogenesis in mice lacking the progesterone receptor-B isoform. Proc Natl Acad Sci USA, v.100, p.9744-9749, 2003.

MURDOCH, W. J. Inhibition by oestradiol of oxidative stress-induced apoptosis in pig ovarian tissues. J Reprod Fertil, v.114, p.127-130, 1998.

MURRAY, A. A. et al. Effect of androgens on the development of mouse follicles growing in vitro. J Reprod Fertil, v. 113, n. 1, p. 27-33, 1998.

NARDO, L. G. et al. The relationships between AMH, androgens, insulin resistance and basal ovarian follicular status in non-obese subfertile women with and without polycystic ovary syndrome. Hum Reprod, v. 24, n. 11, p.2917-23, 2009.

Referências | 93

NANDEDKAR, T.D., MUNSHI, S.R. Effect of dihydrotestosterone on follicular development, ovulation and reproductive capacity of mice. J. Reprod. Fertil, v. 62, p. 21–24, 1981.

NAVARRO, P. A. et al. Foliculogênese, fisiologia do oócito e marcadores de qualidade oocitária. In Dzik A, Esteves S, Donadio N, Nagy P, editors. Atlas de Reprodução Humana Vol. II. Campo Belo (SP): SEGMENTO FARMA EDITORES LTDA, P 51-58.2012.

NELSON, L. R., BULUN, S.E. Estrogen production and action. J Am Acad Dermatol, v.45, p.116-124, 2001

OKTAY K. et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertil. Steril., v. 67, p. 481-486, 1997.

OTTANDER U. et al. A putative stimulatory role of progesterone acting via progesterone receptors in the steroidogenic cells of the human corpus luteum. Biol Reprod, v. 62, p. 655-663, 2000.

PAYNE R. W., HELLBAUM A.A. The effects of estrogens on the ovary of the hypophysectomised rat. Endocrinology, v. 57, p. 193-199, 1955.

PELLICER A., SILVA A. C. J. S. R., SILVA J. C. R. Aspectos fisiológicos de la LH en la foliculogénesis. Cuadernos de Medicina Reproductiva, v. 11, p. 17-26, 2005.

PELUSO J. J. Multiplicity of progesterone´s actions and receptors in the mammalian ovary. Biol Reprod, v. 75, p. 2- 8, 2006.

PELUSO J. J., PAPPALARDO A. Progesterone mediates its anti-mitogenic and anti-apoptotic actions in rat granulosa cells through a progesterone-binding protein with gama aminobutyric acidA receptor-like features. Biol Reprod, v. 58, p. 1131-1137, 1998.

PICTON H. M., GOSDEN R. G. In vito growth of human primordial follicles from frozen banked ovarian tissue. Mol Cell Endocrinol, v. 166, p. 27-35, 2000.

PICTON H. M. et al. The in-vitro growth and maturation of follicles. Reproduction, v.136, p.703-715, 2008.

POTTS G. O. et al. Trilostane, an orally active inhibitor os steroid biosynthesis. Steroids, v. 32, p. 257, 1978.

Referências | 94

PRADEEP P. K. et al. Dihidrotestosterone inhibits granulosa cell proliferation by decreasing the cyclin D2 mRNA expression and cell cycle arrest at G phase. Endocrinology, v. 143, p. 2930-2935, 2002.

RAO B. S. et al. In vitro maturation of sheep oocytes in different media during breeding and non-breeding seasons. Small Rumin Res, v. 43, p. 31-36, 2002.

ROY S. K., GREENWALD G.S. Hormonal requeriments for the growth and differentiation of hamster preantral follicles in long-term culture. J. Reprod. Fertil., v. 87, p. 103-114, 1989.

ROY S. K., TREACY B.J. Isolation and long term culture of human preantral follicles. Fertil. Steril., v. 59, p. 783-790, 1993.

SAHA S. et al. In vitro culture of bovine preantral follicles. Anim. Reprod. Sci., v. 63, p. 27-39, 2000.

SAUNDERS P. T. et al. Differential expression of estrogen receptor-alpha and -beta and androgen receptor in the ovaries of marmosets and humans. Biol Reprod, v. 63, p. 1098–1105, 2000.

SCHRAMM R. D., PAPROCKI A. M. Birth of rhesus monkey infant after transfer of embryos derived from in-vitro matured oocytes: short communication Hum Reprod., v. 15, p. 2411-2414, 2000.

SCHREIBER J. R., NAKAMURA K., ERICKSON G. F. Progestins inhibit FSH-stimulated steroidogenesis in cultured rat granulosa cells. Moll Cell Endocrinol, v. 19, p. 165-173, 1980.

SCHIEWE M. C. et al. Enzymatic characterization of zona pellucida hardening in human eggs and embryos. J Assist Reprod Genet, v. 12, p. 2-7, 1995.

SCHROEDER A. C. et al. Fetuin inhibits zona pellucida hardening and conversion of ZP2 to ZP2f during spontaneous mouse oocyte maturation in vitro in the absence of serum. Biol Reprod., v. 43, p. 891-897, 1990.

SCOTT J. E., ZHANG P., HOVATTA O. Brenefits of 8-bromo-guanosine 3`,5`-cyclic monophosphate (8-br-cGMP) in human ovarian cortical tissue culture. Reprod Biomed Online, v. 8, p. 319-324, 2004.

SEN A., HAMMES S. R. Granulosa cell-specific androgen receptors are critical regulators of ovarian development and function. Mol Endocrinol, v. 7, p. 1393-1403, 2010.

Referências | 95

SHEA L. D., WOODRUFF T. K., LOWE M. P. Perspectives on oncofertility: preserving fertility for young cancer patients. Endocrine News, v. 33, p. 14-19, 2008.

SHIKANOV A., XU M., WOODRUFF T. K., SHEA L. D. Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development. Biomaterials, v. 30, p. 5476-5485, 2009

SILBER S. J. Ovary cryopreservation and transplantation for fertility preservation. Molecular Human Reproduction, vol. 18, p. 59–67, 2012

SILVA A. E. et al. The influence of oxygen tension on cumulus cell viability of canine COCs matured in high-glucose medium. Reprod Domest Anim, v. 2, p. 259-262.

SLOMCZYNSKA M., KROK M., PIERSCINSKI A. Localization of the progesterone receptor in the porcine ovary. Acta Histochem, v.102, p.183-191, 2000.

SMITZ J., CORTVRINDT R., VAN STERTEGHEM A. C. Normal oxygen atmosphere is essential for the solitary long-term culture of early preantral mouse follicles. Mol. Reprod. Dev., v. 45, p. 466-475, 1996.

SMITZ J. et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle developm ent and transplantation: implications for fertility preservation. Human Reproduction Update, v.16, n. 4, p. 395–414, 2010.

SÖNMEZER M., CIL A. P., OKTAY K. Ongoing pregnancies from early retrieval of prematurely developing antral follicles after DHEA supplementation. Reprod Biomed Online, v.19, n. 6, p. 816-819, 2009b.

SÖNMEZER M. et al. Dehydroepiandrosterone supplementation improves ovarian response and cycle outcome in poor responders. Reprod Biomed Online, v. 19, n. 4, 2009a.

STOCCO C. Aromatase expression in the ovary: hormonal and molecular regulation. Steroids, v. 73, p. 473-487, 2008.

SUZUKI T. et al. Immunohistochemical distribution of progesterone, androgen and oestrogen receptors in the human ovary during the menstrual cycle: relationship to expression of steroidogenic enzymes. Hum Reprod, v. 9, p. 1589-1595, 1994.

TANIGUCHI F. et al. Estrogen receptor-α mediates an intraovarian negative feedback loop on thecal cell steroidogenesis via modulation of Cyp17α1 (cytochrome P450, steroid 17α-hydroxylase/17,20 lyase) expression. FASEB J, v. 21, p. 586-595, 2007.

Referências | 96

TELFER E. E. The development of methods for isolation and culture of preantral follicles from bovine and porcine ovaries. Theriogenology, v. 45, p. 101-110, 1996.

TELFER E. E. et al. In vitro development of oocytes from porcine and bovine primary follicles. Mol Cell Endocrinol, v. 163, p. 117-123, 2000.

TELFER E. E., GOSDEN R.G. A quantitative cytological study of polyovular follicles in mammalian ovaries with particular reference to the domestic bitch (Canis familiaris). J Reprod Fertil, v. 81 p.137-147, 1987.

TELFER E. E. et al. New approaches to increasing oocyte yield from ruminants. Anim. Sci., v. 68, p. 285-298, 1999.

TELFER, E. E. et al. In vitro development of oocyte from porcine and bovine primary follicles. Mol. Cel. Endocrinol., v. 163, p. 117-123, 2000.

TELFER E. E. et al. A two step serum free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reprod, v. 5, p. 1151-1158, 2008a.

TELFER E. E. et al. Accelerated development of primordial follicles from vitrified human ovarian tissue a two step serum free culture system. Human Reprod, v. 23, p. 0-239 2008b

TELFER E. E., ZELINSKI M. B. Ovarian follicle culture: advances and challenges for human and nonhuman primates. Fertil Steril, v. 99, p. 1523-1533, 2013.

TESONE M., et al. Autocrine and Paracrine Regulation of the Ovary. Reproductive Endocrinology. Pedro J. Chedrese Editor, 2009.

TETSUKA M. et al. Developmental regulation of androgen receptor in rat ovary. J Endocrinol, v. 145, p. 535-543, 1995.

TING A. Y. In vitro development of secondary follicles from cryopreserved rhesus macaque ovarian tissue after slow-rate freeze or vitrification. Human Reproduction, v. 26, n. 9 p. 2461–2472, 2011.

TORRANCE C., TELFER E. E., GOSDEN R. G. Quantitative study of the development of isolated mouse pre-antral follicles in collagen gel culture. J. Reprod. Fertil., v. 87, p. 367-374, 1989.

Referências | 97

VALDEZ K. E. et al. The role of thecal androgen production in the regulation of estradiol biosynthesis by dominant bovine follicles during the first follicular wave. J Anim Sci, v. 83, p. 597-603, 2005.

VAN DEN BROECK W. et al. Cell-specific distribution of progesterone receptors in the bovine ovary. Reprod Domest Anim, v. 37, p. 164-170, 2002.

VAN DEN HURK R., ZHAO J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology, v. 63, p. 1717-1751, 2005.

VANDEVOORT C. A., HUNG P. H., SCHRAMM R. D. Prevention of zona hardening in non-human primate oocytes cultured in protein-free medium. J Med Primatol, v. 36, p. 10-16, 2007.

VANNUCCHI C. I. et al. In vitro canine oocyte nuclear maturation in homologous oviductal cell co-culture with hormone-supplemented media. Theriogenology, v.66, p. 1677-1681, 2006

VENDOLA K. A. et al. Androgens stimulate early stages of follicular growth in the primate ovary. J Clin Invest, v.101, p. 2622-2629, 1998.

VENDOLA K. et al. Androgens promote insulin-like growth factor-I and insulin-like growth factor-I receptor gene expression in the primate ovary. Hum Reprod., v. 14, p. 2328-2332.

VENDOLA K. Androgens promote oocyte insulin-like growth factor I expression and initiation of follicle development in the primate ovary. Biol Reprod, v. 61, p. 353-357, 1999b.

XING D. et al. Estrogen modulates NFκB signaling by enhancing IκBα levels and blocking p65 binding at the promoters of inflammatory genes via estrogen receptor-β. PLoS One, 2012.

XU M. et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction, v. 24, p. 2531-2540, 2009a.

XU M. et al. Encapsulated three-dimensional culture supports development of nonhuman primate secondary follicles. Biology of Reproduction, v. 81, p. 587-594, 2009b.

Referências | 98

XU J. et al. Survival, growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older adult rhesus monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins and insulin. Reproduction, v. 140, p. 685-97, 2010.

XU M. et al. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Engineering, v. 12, p. 2739–2746, 2006.

XU J. et al. Secondary follicle growth and oocyte maturation during encapsulated three-dimensional culture in rhesus monkeys: effects of gonadotrophins, oxygen and fetuin. Hum. Reprod., v. 26, p. 1061-1072, 2011.

XU J. et al. Fibrin promotes development and function of macaque primary follicles during encapsulated three-dimensional culture. Hum Reprod., v. 28, p. 2187-2200.

XU Z. et al. Expression of folliclestimulating hormone and luteinizing hormone receptor messenger ribonucleic acids in bovine follicles during the first follicular wave. Biol Repro., v. 53, p. 951-957, 1995.

XUE K. et al. Orphan nuclear receptor NR4A1 is a negative regulator of DHT-induced rat preantral follicular growth. Mol Endocrinol, v. 26, p. 2004-2015, 2012.

XUE K., et al. Insulin-like 3 induced rat preantral follicular growth is mediated by growth differentiation factor 9. Endocrinology, p.156-167, 2014.

YANG M. Y., FORTUNE J.E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biol Reprod, v. 75, p. 924-932, 2006.

YARAK S. et al. Hiperandrogenismo e pele: síndrome do ovário policístico e resistência periférica à insulina. Anais Bras Dermatol, v. 80, p. 395-410, 2005.

YOUNG J. M. et al. Activin B is produced early in antral follicular development and suppresses thecal androgen production. Reproduction, v. 143, p. 637-650, 2012.

YOSHIMURA Y. et al. Immunolocalization of androgen receptor in the small, preovulatory and postovulatory follicles of laying hens. Gen Comp Endocr, v. 91, p. 81-89, 1993.

ZELEZNIK A. J., SHULER H. M., REICHERT L. E. JR. Gonadotropin-binding sites in the rhesus monkey ovary: role of the vasculature in the selective distribution of human chorionic gonadotropin to the preovulatory follicle. Endocrinology, v. 109, p. 356-362, 1981.

Referências | 99

ZELEZNIK A. J., LITTLE-IHRIG L., RAMASAWAMY S. Administration of dihydrotestosterone to rhesus monkeys inhibits gonadotropin-stimulated ovarian steroidogenesis. J Clin Endo Metab, v. 89, p. 860-866, 2004.

ZELINSKI-WOOTEN M. B. et al. Administration of an aromatase inhibitor during the late follicular phase of gonadotropin-treated cycles in rhesus monkeys: effects on follicle development, oocyte maturation, and subsequent luteal function. J Clin Endocrinol Metab, v. 76, p. 988-995, 1993.

ZHANG M., OUYANG H., XIA G. The signal pathway of gonadotrophins induced mammalian oocyte meiotic resumption. Mol Hum Reprod, v. 15, p. 399-409, 2009.

WALTERS K. A., ALLAN C. M., HANDELSMAN D. J. Androgen actions and the ovary. Biol Reprod, v. 78, p. 380-389, 2008.

WALTERS K. A., SIMANAINEN U., HANDELSMAN D. J. Molecular insights into androgen actions in male and female reproductive function from androgen receptor knockout models. Hum Reprod Update, v. 16, p. 543-558, 2010.

WALTERS K. A. et al. Targeted loss of androgen receptor signaling in murine granulosa cells of preantral and antral follicles causes female subfertility. Biol Reprod, v. 87, 2012.

WANDJI S. A. et al. Initiation in vitro of growth of bovine primordial follicles. Biol. Reprod., v. 55, p. 942-948, 1996.

WANG H. et al. Effect of adrenal and ovarian androgens on type 4 follicles unresponsive to FSH in immature mice. Endocrinology, v. 142, p. 4930–4936, 2001.

WEIL S. J. et al. Androgen receptor gene expression in the primate ovary: cellular localization, regulation, and functional correlations. J Clin Endocrinol Metab, v. 83, p. 2479-2485, 1998.

WEIL S. et al. Androgen and follicle-stimulating hormone interactions in primate ovarian follicle development. J Clin Endocrinol Metab, v. 84, p. 2951-2956, 1999.

WEST E. R. et al. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials, v. 28, p. 4439–4448, 2007.

WEST E. R. et al. Preserving female fertility following cancer treatment: current options and future possibilities. Ped. Blood Cancer, v. 53, p. 289-295, 2009.

Referências | 100

WILLIAMS P. C. Effect of stilboestrol on the ovaries of hypophysectomized rat. Nature, v.145, p. 388-389, 1940.

WISER A. et al. Addition of dehydroepiandrosterone (DHEA) for poor-responder patients before and during IVF treatment improves the pregnancy rate: a randomized prospective study. Hum Reprod., v. 25, p. 2496-2500, 2010.

WOLGEMUTH D. J. et al. Formation of the zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development. Develop. Biol., v. 106, p. 1-14, 1984.

WOODRUFF T. K. The emergence of a new interdiscipline: oncofertility. Cancer Treat Res., v. 138, p. 3-11, 2007.

WU J., EMERY B. R., CARRELL D. T. In vitro growth, maturation, fertilization, and embryonic development of oocytes from porcine preantral follicles. Biol. Reprod., v. 64, p. 375-381, 2001.

ZHENG P. et al. 17β-estradiol and progesterone improve in vitro cytoplasmic maturation of oocytes from unstimulated prepubertal and adult rhesus monkeys. Hum Reprod, v. 18, p. 2137-2144, 2003.

Anexos

Anexos | 102

ANEXO A

Title: Direct actions of androgen on the survival, growth and secretion of steroids and

anti-mullerian hormone by individual follicles from rhesus monkeys during 3-D culture

Authors: Jhenifer Kliemchen Rodrigues (BSc, MSc)1,2,3, Paula Andrea Navarro (MD, MSc,

PhD)2, Richard Yeoman (PhD)1, Mary Beth Zelinski (PhD)1, Richard L Stouffer (PhD)1, Jing

Xu (PhD)1

1 Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University,

Beaverton, Oregon, USA 2 Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto,

University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil 3 Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, Pró-Criar Medicina Reprodutiva, Belo

Horizonte, Minas Gerais, Brazil

Address for correspondence:

Pró-Criar Medicina Reprodutiva

Rua Bernardo Guimarães, 2063, Lourdes.

Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil

Zip code: 30140-082

[email protected]/ [email protected]

Anexos | 103

Introduction

In addition to androgen’s role as a precursor for the steroid hormone, estradiol, and

possible endocrine actions in the female, considerable evidence suggests that androgen has

local, paracrine/autocrine actions in the ovary, particularly in the developing follicle. Recent

studies reporting androgen receptor (AR) expression in developing follicles (Kimura et al.,

2007; Lenie and Smitz, 2009) are consistent with an essential role for androgen in female

reproductive physiology (Walters et al., 2008; Walters et al., 2010; Lebbe and Woodruff,

2013). Evidence for ARs in all stages of growing follicles from several species (Walters et al.,

2008; 2012) including murine (Tetsuka et al., 1995; Sen and Hammes, 2010; Xue et al., 2012;

2013), porcine (Campo et al., 1985; Cárdenas and Pope, 2002), bovine (Hampton et al.,

2004; Glister, Satchell and Knight, 2010), nonhuman primate (Hillier et al., 1997; Weil et al.,

1998; Duffy et al., 1999; McEwan et al., 2010) and human (Horie et al., 1992; Suzuki et al.,

1994; Kim et al., 2011) suggest that the androgen has effects throughout follicular

development. Observations in female mice discovered that inactivation of ARs results in

premature ovarian failure (POF), indicating that normal folliculogenesis requires AR-

mediated androgen action (Kimura et al., 2007; Sen and Hammes, 2010; Xue et al., 2013). In

human ovaries, AR protein expression can be observed in granulosa cells, theca cells and

stromal cells of follicles during almost all stages of the menstrual cycle. However there is a

difference among observations regarding immunohistochemical staining intensity (Horie et a.,

1992), what can be related to the fluctuating expression levels that depends on the

developmental status of the follicle (Drummond, 2006).

Considerable evidence suggests that androgens promote early follicular growth (Hillier

and De Zwart, 1981; Durlinger et al., 2000; Young et al., 2012). In culture systems of mouse

follicles, androgen exposure contributed to the development of the preantral follicles (Murray et

al., 1998); androgen treatment increased the diameter of mouse follicles during in vitro culture

(Wang et al., 2001). Other studies also observed that pharmacological doses of testosterone

promote early development in bovine (Yang and Fortune, 2006) and macaque (Harlow, Hillier e

Hodges, 1986; Harlow et al., 1988 Vendola et al., 1999a) follicles. These data support the clinical

effort to determine if pretreatment with transdermal testosterone improves ovarian response to

gonadotrophins in “poor-responder” IVF patients (Balasch et al., 2006; Fábregues et al., 2009;

Sonmezer et al., 2009; Sönmezer Cil and Oktay, 2009; Wiser et al., 2010).

However, androgen action in the follicle may be stage- or dose- dependent. For

example, androgen action may become detrimental in antral follicles, showing anti-maturation

Anexos | 104

and anti-growth effects at this stage (Hillier and De Zwart, 1981; Durlinger et al., 2000; 2002;

Young et al., 2012). Thus, it is proposed that the actions of androgens can be, depending on

the follicular stage, promoters or inhibitors of the follicular growth (Hillier and Tetsuka, 1997;

Vendola et al., 1998). Androgen action may also depend on its intrafollicular levels, with

lower levels required for a normal folliculogenesis and increased levels causing follicular

dysfunction. Notably, studies of women with polycystic ovary syndrome (PCOS) often

suggest that hyperandrogenemia adversely affects follicular development and oocyte

maturation (Dumesic et al., 2008; Lebbe and Woodruff, 2013).

More detailed studies are needed to define the direct effects of androgen in follicles

(Harlow et al., 1988; Vendola et al., 1999a, Yang and Fortune, 2006) and their oocytes

(Vendola et al., 1999b) at specific stages of folliculogenesis especially in primates. The 3D

culture system, using individual follicles encapsulated in alginate biomaterials (Xu et al.,

2009b; Xu et al., 2010), may contribute to studies on the direct actions of hormones and local

factors on folliculogenesis in primates. We recently used this culture system to develop

primate (macaque) follicles from the early (secondary) preantral to small antral stage, with

achievement of steroidogenic function and oocyte maturation (Xu et al., 2009a). The present

study was to assess for the first time, the actions of androgen on follicular development

(survival, antrum formation, hormone production and oocyte maturity), in individual primate

(macaque) preantral follicles, using the 3D matrix culture system, through steroid ablation and

replacement of testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT).

Materials and Methods

Animals and ovary collection

The general care and housing of rhesus macaque monkeys was provided by the

Division of Comparative Medicine at the Oregon National Primate Research Center

(ONPRC). Animals were pair caged in a temperature controlled (22Co) light-regulated 12

L:12 D room. Diet consisted of Purina monkey chow (Ralston-Purina, Richmond, IN, USA)

provided twice a day, supplemented with fresh fruit or vegetables once a day and water ad

libitum. Animals were treated according to the National Institutes of Health Guide for the

Care and Use of Laboratory Animals, and protocols were approved by the ONPRC

Institutional Animal Care and Use Committee.

Anexos | 105

Fourteen adult, female rhesus monkeys, exhibiting regular menstrual cycles (the first

day of menstruation considered day 1 of the cycle) were used in the study. Ten animals were

assigned specifically to the study; ovariectomies were conducted on anesthetized monkeys by

laparoscopy at early follicular phase, day 1– 4 of the cycle, as previously described (Duffy

and Stouffer, 2002). Ovaries were also collected from 4 additional animals at necropsy

following termination for other studies or reasons unrelated to reproductive health. Ovaries

were immediately transferred into Hepes buffered holding media (CooperSurgical, Inc.,

Trumbull, CT, USA) supplemented with 0.2% (v/v) human serum protein supplement (SPS,

CooperSurgical, Inc.) and 10 µg/ml gentamicin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), and

kept at 37oC upon to follicle isolation (Xu et al., 2010; 2011).

Follicle isolation, encapsulation and culture

Isolation, encapsulation and in vitro culture of individual follicles as performed as

previously described (Xu et al., 2010). Briefly, ovarian cortex was cut into 1 × 1 × 1 mm

cortical cubes. Follicles were mechanically isolated in the holding media using 31- gauge

needles and secondary follicles with diameters of 125–225 mm that displayed the following

characteristics were selected for encapsulation: (i) an intact basement membrane, (ii) two to

three layers of granulosa cells and (iii) a visible, healthy oocyte that was round and centrally

located within the follicle, without vacuoles or dark cytoplasm. Follicles from individual

monkeys were divided among the treatment groups with 12–24/monkey follicles per group.

Follicles were transferred individually into 5 µL 0.25% (w/v) sterile sodium alginate

(FMC BioPolymers, Philadelphia, PA, USA)-phosphate-buffered saline (PBS) (137 mM

NaCl, 10 M phosphate, 2.7 mM KCl, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and the droplets were

cross-linked in 50 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 10 mM HEPES solution (pH 7.2) for 1 min.

Each alginate-encapsulated follicle was transferred into individual wells of 48-well plates

containing 300 µL alpha minimum essential medium (αMEM, Invitrogen) supplemented with

0.3% (v/v) SPS, 0.5 mg/ml purified bovine fetuin, 5 µg/ml insulin, 5 µg/ml transferrin and 5

ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich).

Follicles were cultured at 37 oC in a 5 % oxygen environment (in 6% CO2/89% N2)

with recombinant human (rh) FSH (NV Organon, Oss, Netherlands) at 3ng/mL during the

first 20 days, and then decreased to 0.3 ng/mL for the remainder of the culture interval.

Follicles that reached the antral stage were treated with human chorionic gonadotrophin

(hCG) (Serono, Geneva, Switzerland) (100 ng/mL) to initiate meiotic maturation of the

Anexos | 106

oocyte. After 34 h, the oocytes were collected to determine the stage of oocyte meiotic

maturation. Samples of the culture media (150 µL) were collected and replaced every other

day and stored at – 20oC until analyzed for ovarian steroid hormones and AMH.

Experiment 1: Steroid ablation

In order to evaluate the role of steroids in primate folliculogenesis in vitro, we used a

steroid synthesis inhibitor (trilostane, TRL) that acts by blocking the action of the enzyme 3

beta-hydroxysteroid dehydrogenase (3bHSD), which is responsible for converting

pregnenolone to progesterone. TRL was added to the follicle culture medium at a dose of 250

ng/ml that effectively blocks progesterone production by primate follicular cells in vitro

(Duffy et al., 1996).

Secondary follicles obtained from ovaries of 6 animals (4 at necropsy; 2 at surgery)

were divided into three groups: (1) control group: follicles (n = 174) grown in control medium

plus the TRL vehicle (ethanol) until the end of culture (40 days); (2) TRL group: follicles (n =

173) grown in presence of TRL from the beginning to the end of culture (40 days); (3) TRL2

group: follicles (n = 169) grown in TRL added to the medium after two weeks of culture and

maintained until the end of culture.

Experiment 2: Testosterone replacement

To evaluate the role of testosterone in folliculogenesis, the second experiment was

performed by adding back two different doses of testosterone (T; 10 or 50 ng/mL, groups T

low and T high) in the culture media with TRL, plus control (vehicle) and TRL alone.

Secondary follicles obtained from 4 animals were cultured in control medium

containing: (1) vehicle (control group; n = 85) for 40 days; (2) TRL at a dose of 250 ng/mL

from the beginning until the end of culture (40 days) (TRL group; n = 82); (3) TRL and 10

ng/mL testosterone for 40 days (T low group; n = 84); (4) TRL and 50 ng/mL testosterone (T

high group; n = 86) for 40 days.

Experiment 3: Dihydrotestosterone replacement

To confirm the role of androgen, independent of possible conversion to estrogen, in

primate folliculogenesis, the third experiment was performed, adding dihydrotestosterone

Anexos | 107

(DHT) (50 ng/mL) to the culture media with TRL, or DHT by itself, plus control (vehicle)

and TRL alone.

Secondary follicles from ovaries of 4 animals were grown in control medium

containing: (1) vehicle (control group; n = 72); (2) TRL at a dose of 250 ng/mL from the

beginning of the culture until the end (40 days) (TRL group; n = 66); (3) DHT (50 ng/mL) by

itself (DHT group; n = 69); (4) TRL and DHT (TRL+DHT group; n = 66).

Follicle survival, growth and antrum formation

Follicle survival, diameter and antrum formation were assessed weekly using an

Olympus CK40 inverted microscope, an Olympus DP11 digital camera (Olympus Imaging

America Inc., Center Valley, PA, USA) and ImageJ 1.44 p software (National Institutes of

Health, Bethesda, MD, USA) (Xu et al., 2010, 2011). Follicles were measured from the outer

layer of cells which included a measurement at the widest diameter of the follicle and a

second measurement perpendicular to the first. The mean of the values was calculated and

reported as the follicle diameter. Follicles were considered to undergo atresia if the oocyte

was dark or not surrounded by a layer of granulosa cells, the granulosa cells became dark and

fragmented, or the diameter of the follicle decreased (Xu et al., 2009b; Xu et al., 2010).

Classification of follicular growth

Follicles were divided into three categories according to their growth at the fifth week

of culture (Xu et al., 2010, 2011): (1) fast-grow: those reaching 500 µm diameter or more; (2)

slow-grow: those reaching between 230 and 500 µm in diameter; (3) no-grow: those not

exceeding the diameter of 230 µm by the fifth week of culture.

Ovarian steroid and AMH measurements

One media sample collected weekly during culture weeks 1–5 was analyzed for

estradiol (E2), progesterone (P4) and pregnenolone (P5) concentrations for Experiment 1, and

E2, P4 and AMH for Experiment 2 and 3, by the Endocrine Technology Support Core at

ONPRC (Xu et al., 2010, 2011). An Immulite 2000 chemiluminescence based automatic

clinical platform (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA) was used for steroid

assays which was validated for macaque follicle culture media as reported previously (Xu et

Anexos | 108

al., 2009b). AMH was analyzed by ELISA using a DSL-10-14400 kit (Diagnostic Systems

Laboratories, Inc.) based on the manufacturers’ instructions and validated for macaque follicle

culture media (Xu et al., 2010).

Oocyte retrieval, maturation and fertilization

Retrieved oocytes were photographed and classified according to their meiotic

maturation stage (Xu et al., 2011). Semen were collected by the Assisted Reproductive

Technology (ART) Support Core at ONPRC (Xu et al., 2011).Conventional IVF were

performed for MII oocytes as previously described (Xu et al., 2011; 2013). The resulting

zygote was transferred to 500 µL hamster embryo culture medium-9 with 5% FBS and

cultured at 37oC in 6%CO2, 5%O2 and 89% N2 (Schramm and Paprocki, 2000). The embryo

was photographed daily to document development. Reagents and protocols for embryo culture

were provided by the ART Core (Meng and Wolf, 1997).

Statistical analysis

Statistical significance was analyzed by R 2.15.3 software using binomial logistic

regression to analyze survival and antrum formation data between groups, and marginal log-

linear regressions to analyze steroid hormone and AMH data. Differences were considered

significant at p < 0.05 and values were presented as mean ± SEM. Follicle survival and

antrum formation represent 6 (Experiment 1) or 4 (Experiment 2 and 3) individual animals in

each treatment group. Follicle growth, steroid and AMH production, and oocyte maturation

were analyzed for each individual follicle.

Results

Experiment 1: steroid ablation

The percentage of follicles surviving in culture (Fig. 1A) was less in the presence of

TRL (p < 0.05) compared to vehicle-treated controls. The percentage of follicles achieving

antrum formation (Fig. 1B) was less than controls when TRL was added at time 0 (p < 0.05)

but not after 2 weeks of culture.

Anexos | 109

Similar percentages of slow- and fast-grow follicles were noted in the control and

TRL2 (added at week 2) groups (Table I). In contrast, fast-grow follicles were absent in the

TRL group (added at time 0), with the percentage of no-grow follicles reaching 27%.

Moreover, though starting at equivalent sizes at time 0, the slow-grow follicles only reached

235 ± 17 µm diameter during TRL treatment, but were larger (p < 0.05) and comparable size

in control and TRL2 groups (330 ± 11 vs. 283 ± 17 µm).

Levels of P4 in culture media after antrum formation were appreciable in control

cultures of slow-grow follicles (Fig. 2A), and markedly reduced by TRL exposure. Similar

findings occured when comparing P4 levels from fast-grow follicles between control and

TRL2 groups (6.3 ± 1.0 vs. 0.2 ± 0.1 ng/ml, p < 0.05). Recall fast-grow follicles were absent

from the TRL group. Notably, TRL exposure also reduced E2 levels compared controls,

especially by slow-grow follicles (data not shown; see Exp. 2 and 3).

Conversely, P5 levels were low in slow-grow follicles after antrum formation (Fig.

2B), but markedly increased in the TRL and TRL2 groups. Likewise, P5 concentrations in

fast-grow follicles were 29-fold higher in the TRL2 group, compared to controls (1.17 ± 0.42

vs. 0.04 ± 0.04 ng/ml, p < 0.05).

In the control group, antral follicles typically provided healthy oocytes (12 of 13

follicles; Table II), although they rarely reinitiated meiotic maturation in response to hCG to

achieve MII stage (1 of 12). One oocyte was retrieved from the TRL group and was

degenerating. Four of 7 oocytes retrieved from the TRL2 group were healthy and none

achieved the MII stage.

Experiment 2: Testosterone replacement

Addition of high T dose with TRL, increased follicle survival compared to TRL only

group (Fig. 3A). Unlike in Exp. 1, a number of follicles achieved antrum formation with TRL

alone but the percentage of antral follicles in the high T + TRL group (83 ± 8%) was greater

than with TRL alone (65 ± 22%, p < 0.05). Moreover, the percentage of antral follicles in the

low T + TRL group (92 ± 8%) was also greater than TRL.

As in Exp. 1, the percentage of no-grow follicles was greatest in the TRL alone group

(Table III, T replacement), although some fast-grow follicles (correlating with antrum

formation) were evident. Remarkably, no-grow follicles were absent from both the low and

high dose T replacement groups, and the percentage of fast-grow follicles reached, for the

first time, more than 30% of the total population. For slow-grow follicles, their diameters in

Anexos | 110

low or high T replacement (350 ± 15 or 361 ± 14 µm) were greater than in TRL alone (260 ±

12 µm, p < 0.05), and comparable to controls (318 ± 14 µm). In contrast, high T levels

decreased (p < 0.05) the diameter of fast-grow follicles (572 ± 42 µm) compared to other

groups (e.g., controls, 773 ± 56 µm).

As expected from Exp. 1, TRL alone decreased P4 levels generated by slow-grow (not

shown) and fast-grow follicles (Fig. 4A). Unexpectedly, addition of low-dose T restored P4

levels to that of controls, especially in fast-grow follicles. In contrast, P4 levels were

diminished (p < 0.05) in high-dose T group compared to controls to concentrations

reminiscent of TRL alone.

When measuring E2 as a marker of follicular steroidogenic function, TRL alone reduced

media E2 concentration compared to controls (63 ± 13 vs. 247 ± 47 pg/ml, p < 0.05) in slow-grow

follicles. But exposure to low or high dose T markedly increased E2 levels (2734 ± 338 or 18723

± 1758 pg/ml, respectively) in the presence of TRL. Results from fast-grow follicles displayed a

similar trend (Fig. 4B) except TRL alone did not decrease the 14-fold higher E2 levels compared

to slow grow follicles. Nevertheless, there was a dose-dependent increase (p < 0.05) in E2 levels,

compared to TRL alone, following the addition of T.

When measuring AMH as a marker of follicular paracrine function, no differences

were noted in AMH levels between groups for slow-grow follicles (data not shown).

However, for fast-grow follicles (Fig. 5A), TRL alone did not alter AMH levels, but addition

of high-dose T reduced (p < 0.05) AMH levels produced by antral follicles compared to

controls at week 5 of culture.

As in Exp. 1, few antral follicles and hence oocytes were anlayzed after hCG exposure

during TRL exposure (Table IV; T replacement). However, T exposure during TRL treatment

restored antral follicles that consistently provided healthy oocytes, albeit at the GV-intact

stage. Both the low-dose T and control groups generated follicles that yielded two and one MI

oocytes respectively, and the high-dose T and control groups generated a follicle that yielded

a MII stage oocyte after hCG exposure. Notably, the diameters of these two MII oocytes were

greater than 130 µm. Following IVF, fertilization was confirmed by the presence of 2 polar

bodies and 2 pronuclei (data not shown). However, the zygotes arrested without cell division.

Experiment 3: DHT replacement

Addition of DHT with TRL returned the percent survival of follicles to control levels

(Fig. 3B); the response was similar to that by T exposure (Fig. 3A). Notably, the addition of

Anexos | 111

DHT alone increased the percent surviving follicle to over 80%, above (p < 0.05) the control

group. Moreover, the percentage of antral follicles in the DHT alone group (93 ± 3%) was

greater (p < 0.05) than in the controls (82 ± 4%).

Unlike in Exp. 1 and 2, TRL alone did not alter the no-grow, slow-grow or fast-grow

follicles, and replacing androgen with DHT had no apparent effect (Table III; DHT

replacement). However, addition of DHT alone reduced the number/percent (7%) of no-grow

follicles, compared to controls or TRL ± DHT. TRL again reduced the diameter of slow-grow

follicles compared to controls (315 ± 13 vs. 357 ± 16 µm, p < 0.05), but this difference

disappeared with combined TRL and DHT treatment (373 ± 14 µm). Notably, DHT alone had

no effect on the diameter of slow-grow follicles (data not shown), but decreased the size of

fast-grow follicles compared to controls (607 ± 29 vs. 726 ± 50 µm, p < 0.05).

As in Exp. 2, TRL alone decreased (p < 0.05) P4 levels produced by slow-grow

follicles and DHT replacement restored levels to those of controls (data not shown). Likewise

neither DHT (Fig. 4C) or T (Fig. 4A) altered P4 levels when combined with TRL. However,

the addition of DHT alone increased P4 levels produced by slow-grow (data not shown), or

fast-grow (Fig. 4C) follicles. Unlike T addition (Fig. 4B), the combination of DHT + TRL

significantly reduced E2 produced by slow-grow (data not shown) or fast-grow (Fig. 4D)

follicles compared to controls. Moreover DHT alone replicated this effect compared to

control.

Notably, DHT alone (Fig. 5B) markedly reduced AMH levels produced by fast-grow,

as well as slow-grow (data not shown), follicles compared to controls. Addition of DHT to

TRL also decreased (p < 0.05) AMH levels compared to the TRL alone group.

As noted in prior experiments, few healthy oocytes were derived from antral follicles

in the TRL group, compared to controls (Table IV; DHT replacement). In contrast, DHT

replacement yielded follicles with typically (10 of 13) healthy follicles, including one MII-

stage oocyte. Notably, the diameter of healthy GV-intact oocytes from the DHT replacement

group was greater (p < 0.05) than controls. Exposure to DHT alone yielded oocytes with

similar characteristics to those of controls or DHT replacement, except no MII oocyte was

observed. Figure 6 illustrates a secondary follicle (Fig. 6A) developing to the antral stage at

culture week 3 (Fig. 6B). Oocytes were harvested from antral follicles at week 5 (Fig. 6C).

After IVF for 3 MII oocytes (Fig. 6D; 2 from control group and 1 from TRL + DHT group),

fertilization was confirmed by the presence of 2 polar bodies and 2 pronuclei (data not

shown). One of the fertilized oocyte from the control group cleaved and the embryo

developed to the morula stage at day 5 post-IVF (Fig. 6E).

Anexos | 112

Discussion

For the longest, androgens have been considered detrimental to follicle maturation.

Due to observations in rodents (Tetsuka et al., 1995; Sen and Hammes, 2010; Xue et al.,

2012; 2013), other mammalian species (Campo et al., 1985; Hillier et al., 1997; Weil et al.,

1998; Duffy et al., 1999; Cárdenas and Pope, 2002; Hampton et al., 2004; McEwan et al.,

2010; Glister et al., 2010;) and humans (Horie et al., 1992; Suzuki et al., 1994; Kim et al.,

2011), this view has, however, in recent years undergone considerable change. It is known

that androgens participates on folliculogenesis and recent studies have shown that ARs are

expressed in developing follicles (Kimura et al., 2007; Lenie and Smitz, 2009) and has an

essential role in female reproductive physiology (Walters et al., 2008; Walters et al., 2010;

Lebbe and Woodruff, 2013). However, more detailed studies are needed to define the direct

effects of androgens in the follicles of primates (Harlow et al., 1988; Vendola et al., 1999a,

Yang and Fortune, 2006) and their oocytes (Vendola et al., 1999b) in specific stages of

folliculogenesis.

The 3D follicular culture system, follicle encapsulated using alginate biomaterials,

recently developed based in tissue bioengineering principles and previously reported by our

group in primates (Xu et al., 2009b; Xu et al., 2010), may contribute to studies related to this

issue. This 3D matrix is capable of supporting the growth of follicles, allowing in vitro follicle

development from early stages (secondary follicles) up to the small diameter antral stage, with

production of good levels of steroid hormones in humans (Xu et al., 2009a) and non-human

primates (rhesus monkeys) (Xu et al., 2009b; Xu et al., 2010; Xu et al., 2011a) and capable of

originating mature oocytes in monkeys, that when inseminated may be fertilized, giving

origin to embryos (Xu et al., 2011a) and even live born in mice (Xu et al., 2006; West et al.,

2007).

The proposal of the present study was to access for the first time, the role of the

androgens on follicular development (survival, antrum formation, hormone production and

oocyte maturity), in individual fresh non-human primate preantral follicles, using the 3D

matrix in vitro culture system, thought the steroid ablation and replacement of testosterone (T)

and dihydrotestosterone (DHT).

Steroid ablation can be reached by the administration of trilostane (TRL), which is a

drug that inhibits the enzyme 3β-hydrodydesidrogenase in the theca cells (Schane et al.,

1979). Blocking this enzyme, the formation of progesterone, 17-hydroxy-progesterone,

androstenedione and testosterone could be directly affected (Fig x). Then, the formation of the

Anexos | 113

substrates which give rise to estradiol (E2) and dihydrotestosterone (DHT) in the granulosa

cells may be compromised (Kimura et al., 2007). Based on this, we decided to use this drug

for our study with the goal of steroid ablation in the individual follicles cultured in vitro. In

this study, the steroid ablation could be observed after TRL addition, since production of E2,

P4 and P5 was dramatically affected. The survival, growth and antrum formation were also

markedly reduced, and the oocytes quality showed clearly the negative effects of the steroid

ablation.

The detected levels of P4, P5 and E2 in the first experiment clearly show that the drug

was effective on block the conversion of pregnenolone into progesterone and the other

reactions previously mentioned, directly affecting the steroidogenic cascade. After antrum

formation, slow and fast-grow follicles have produced P4 in appreciable levels in control

group while were markedly reduced by TRL exposure. At the same time, slow and fast-grow

follicles that received TRL at time 0 and after 2 weeks of culture show P5 levels markedly

increased, and notably, TRL exposure also reduced E2 levels. Our results are consistent with

findings obtained from in vivo studies with pregnant monkeys that showed that the

mechanism of the action of trilostane appears to be inhibition of progestin production since

the administration of trilostane together with hCG blocked the gonadotropic effect of the hCG

and induced menstruation. Also they have found that concurrent administration of

progesterone prevented the interceptive action of the drug (Schane et al., 1979). Also, as

showed by our results (increased levels of pregnenolone on TRL and TRL2 groups), this in

vivo study showed that trilostane caused a significant increase in circulating pregnenolone

levels. Studies in vitro also showed that the administration of TRL effectively inhibited P4

production and reduced the number of progesterone receptors (PRs) positive cells (Duffy et

al., 1996). These effects are consistent with the known activity of trilostane as an inhibitor of

the 3β-hydroxysteroid dehydrogenase system (Potts et al., 1978). Also being consistent with

the fact that steroid hormones have an essential local role on follicle development, the results

from the Exp. 1 show that the addition of trilostane to the beginning of the culture really

affects the survival, growth and antrum formation. The percentage of follicles surviving in

culture and of follicles achieving antrum formation was less in the presence of TRL when

added at beginning of culture compared to vehicle-treated controls. Also when the drug was

added fast-grow follicles were absent, slow-grow follicles didn`t grow much and the

percentage of no-grow follicles were high. The effects of the steroidogenesis blockade could

be also observed on oocytes quality and degree of maturation as mentioned previously. In the

control group, despite oocytes obtained rarely reinitiated meiotic maturation in response to

Anexos | 114

hCG, they were typically healthy, while only one degenerating oocyte was retrieved from the

TRL group and about half of the oocytes from TRL2 were unhealthy. Notably , the effects of

steroid ablation could be due to loss of local actions of progestins, androgens or estrogens,

alone or in concert, since there is evidence for the presence of PR (Peluso et al., 1998; Gava et

al., 2004; Peluso, 2006), AR (Hild-Petito et al., 1991; Horie et al., 1992; Duffy et al., 1999)

and ER (Chian et al., 1999; Bishonga et al., 2001) in follicles and possible local actions.

Testosterone addition to the follicle culture media proved in our hands to be important

to the survival and antrum formation of nonhuman primate individual preantral follicles

cultured in vitro. Moreover, addition of testosterone in presence of TRL have restored

hormonal production and gave rise to mature and healthy oocytes. The replacement of high

dose T showed us that the survival and antrum formation can be restored in the media that has

trilostane. Also, a greater number of antral follicles can be formed when a low dose of T was

added to media with TRL related to the number of antral follicles formed in the control group.

The growth was also recovered to the pattern observed in control group both for slow and

fast-grow follicles that had the diameters greater than TRL and comparable to controls, and

also evidenced by the absence from both low and high T replacement groups of no-grow

follicles and by the fact that fast-grow follicles constituted for the first time more than 30% of

the total population. Healthy oocytes were provided by T exposure during TRL treatment at

GV, MI and MII stages and an embryo, proving that androgen replacement can be related also

to oocyte maturity and viability, and that the androgen action in the follicle could be possibly

related to oocyte-secreted factors (Drummond, 2006).

In the Exp. 2 the drug was effective as for Exp. 1 in reduce E2 levels in TRL group

compared to controls, but E2 presented markedly increased on the exposure to low or high

dose T in presence of TRL both for slow and fast-grow follicles, observing a dose-dependent

increase in the levels according the addition of T, compared to TRL alone. It is well known

about the local effects of E2 on the follicles. The recovery of the survival rate, antrum

formation and growth in the groups with replacement of T, could be derived in part from the

possible conversion of testosterone in estradiol by P450 aromatase in the granulosa cells. In

animal experiments conducted in the 1980s, in which high doses of T were administered

(Hillier and Ross, 1979; Nandedkar and Munshi, 1981), it was thought that the androgenic

effects were mediated by the androgenic activity of converted estrogens through ERs and not

through ARs. However androgens can also be produced by the ovary, and the testosterone

replaced could be converted on dihydrotestosterone by the enzyme 5α-reductase in the

granulosa cells or have a direct effect on the follicles, being responsible in part for the

Anexos | 115

restoration of survival, antrum formation and growth that was found in our in vitro

experiment. E2 is proven to be important for all those events involved in folliculogenesis

(Drummond e Findlay, 1999; Bishonga et al., 2001; Bolamba et al., 2006; Xu et al., 2010), but

T and/or DHT might have an important parcel to contribute for the complete follicle

development.

In contrast and as evidenced by our results that showed decrease on the diameter of

fast-grow follicles from T high group, androgen action in the follicle may be stage- or dose-

dependent. As frequently observed in in vivo studies with PCOS woman (Dumesic et al.,

2008; Lebbe and Woodruff, 2013), androgens can have negative effects in the follicles

depending on its intrafollicular levels especially if they are high, affecting follicular

development and oocyte maturation (Hillier and Tetsuka, 1997; Vendola et al., 1998). Also

there are studies reporting that apoptosis can be inducible by androgens in granulosa cells in

rats (Billig et al., 1993), also evidencing a detrimental effect of the excessive levels of T. The

high dose T was still showing a negative effect for the follicle development when hormone

production was analysed. The levels of P4 were diminished compared to controls to

concentrations reminiscent of TRL alone in high T group, and unexpectedly, addition of low-

dose T restored P4 levels to that of controls, especially in fast-grow follicles. In this case,

testosterone is showing a dose-dependent effect, where a low dose contribute to the

maintenance of the appropriate levels of P4 and a high dose negatively affect P4 production.

However any route of conversion of testosterone into progesterone was reported yet. Then our

study is reporting for the first time a possible existence of a not known route of conversion of

androgens to progesterone, or a route of activation of ARs that can induce the production of

progesterone.

The effects of androgens on folliculogenesis in several species were inferred by

observing AR expression in the ovary. Many studies in different animal models have shown

an essential role for androgen in female reproductive physiology (Walters et al., 2008;

Walters et al., 2010; Lebbe and Woodruff, 2013), particularly in the early stages of

folliculogenesis (Vendola et al., 1998; Cardenas et al., 1997; 2002). However, to make sure

that the effects of restoration of survival, growth, antrum formation, hormone production and

oocyte recovery it was really in part from androgen (testosterone) action mediated by AR

signal and not just from testosterone as a substrate for its conversion into estradiol and

resulted in estrogen/ER signaling, DHT, which is a biologically active metabolite of the

testosterone hormone, was replaced to the culture of follicles that received TRL in Exp. 3.

Anexos | 116

As for T exposure, DHT in combination with TRL restored the ability of the follicles

in to develop and to produce mature oocytes. Addition of DHT with TRL returned the percent

survival of follicles to control levels. As expected, the diameter of slow-grow follicles were

reduced in presence of TRL alone compared to controls, but this difference disappeared when

DHT was added to the culture, as happened when T was added. For follicles that grow faster,

DHT (alone) decrease the size compared to controls, what is a similar effect of what was

observed on Exp. 2 when high dose T was added in presence of TRL. P4 levels were found

reduced in slow-grow follicles when TRL alone was added, as was also observed in Exp. 2,

and the levels were restored to those of controls when DHT was replaced, similarly of what

was observed when low dose T was added to the culture for fast-grow follicles. Again, this

result could be interpreted as a sign of possible existence of a route of ARs activation by

androgens responsible to induce P4 production.

Regarding the Anti-Mullerian hormone (AMH), a glycoprotein produced in the

granulosa cells of the ovary and having regard to the regulation of growth and development of

follicles, no differences were noted in the levels between groups for slow-grow follicles in

Exp.2.. However for fast-grow follicles, while TRL alone did not alter the levels, addition of

high-dose T reduced AMH levels produced by antral follicles compared to controls at week 5

of culture. The same was noted with the addition of DHT to TRL, that also decreased AMH

levels compared to the TRL alone group. And AMH levels were found reduced by slow and

fast-grow follicles when DHT alone was added. Those data is also consistent with the

mentioned about the dose dependent effect of androgens, showing lower levels of AMH in

presence of high T compared to controls and the same in presence of DHT. Those events

could mean that a high dose of androgens could be not good for the follicle, reinforcing the

concept that high levels of androgens at antral stage may be associated with detrimental

effects to the follicle development, and appropriate levels of AMH is a sign of follicle

development (Nardo et al., 2009). In contrast this also could mean that androgens can be

regulators of the excessive synthesis of AMH by granulose cells responsible for causing

follicular arrest, based in studies with PCOS woman and the results founded in our

experiment. We found that in the presence of TRL and addition of low and high doses of T or

DHT, follicle survival, antrum formation, growth and oocyte maturity could be resettled. And

studies examining the connection between AMH and PCOS, considered them having

significantly higher levels of AMH as compared with healthy woman (Broekmans et al.,

2008; Nardo et al., 2009; Parahuleva et al., 2012; 2013). The higher levels of AMH present in

those patients could be related to the great number of antral follicles that can not go further in

Anexos | 117

their development, and the high serum levels of T also usually founded in PCOS could be a

reflection of an attempt to reestablish the development of these follicles by granulose cells,

since an excessive granulosa cell activity may be implicated in the abnormal follicular

dynamic of the syndrome (Nardo et al., 2009).

A positive effect on oocyte quality was observed when the follicles were exposed to DHT.

Being consistent with T replacement in Exp. 2, mostly healthy oocytes were collected from antral

follicles when DHT was replaced, including one MII oocyte. It is important note that the diameter

of the healthy GV oocytes collected was greater in the DHT group than controls, and the exposure

to DHT alone yielded oocytes with similar characteristics to those of controls or DHT

replacement, except MII oocytes were not observed. A detrimental effect on oocyte quality was

still showing in Exp. 3 when TRL was added to the culture. Only few healthy oocytes were

derived from antral follicles in the TRL group, as also noted in Exp. 1 and 2.

Unlike T addition, the combination of DHT with TRL significantly reduced E2

produced by slow or fast-grow follicles compared to controls. According to those

observations, we could conclude that in Exp. 2, part of the added T was being converted in

E2, since the levels of it were founded markedly elevated compared to controls for both slow

and fast-grow follicles. Thus, the positive effects of T replacement for follicle development

was probably derived in part of estrogen action. However, those positive effects were also

present in Exp. 3, when DHT was replaced or added alone and E2 levels were lower. Then, it

was possible to infer that androgens have also an essential local role on the follicle.

DHT administrated alone replicated many of the effects observed when T or DHT was

added with TRL. AMH levels were low in slow and fast-grow follicles culture and the

exposure to DHT gave rise to GV healthy oocytes. Moreover the percent surviving follicles

was over 80%, above the control group, and the percentage of antral follicles was greater than

in the controls. Regarding effects on growth and as already mentioned, for fast-grow follicles,

DHT (alone) decrease the size of them, what was also observed on Exp. 2 when high dose T

was added in presence of TRL. Addition of DHT alone reduced the percent of no-grow

follicles, compared to controls or when DHT was present with TRL. In contrast of what

happened when DHT and T were added with TRL, the addition of DHT alone increased P4

levels produced by slow or fast-grow follicles. The androgen replacement have recovered the

P4 levels to similar levels found in controls, maybe by activation of ARs or possible not

known route of conversion of androgen in progestin as already discussed previously. It is

believed that the same could be happening when DHT alone was added. However in this case,

the levels were higher since TRL is not present, what reinforce our suggestion of the existence

Anexos | 118

of a route of conversion of androgen in progestin. Those results are also consistent with the

idea that androgens are important for early folliculogenesis, and that endogenous androgen

does not elicit a maximal effect during follicle culture, and DHT addition to the standard

culture media could be suggested as an attempt to improve the culture conditions.

Corroborating our findings in all three experiments, studies with treatment of follicles with

hydroxyflutamide or bicalutamide, two model antiandrogenic compounds, resulted in reduced

follicular growth during the preantral phase, altered steroidogenic environment, and arrest in

oocyte meiotic maturation in response to hCG (Lenie and Smitz, 2008).

Despite other androgens are present in the ovary, only T and its active metabolite DHT

have direct androgenic activity connecting to androgen receptors. Several studies document

AR expression in mammalian ovaries (Tetsuka et al., 1995; Sen and Hammes, 2010; Xue et

al., 2012; 2013; Campo et al., 1985; Hillier et al., 1997; Weil et al., 1998; Duffy et al., 1999;

Cárdenas and Pope, 2002; Hampton et al., 2004; McEwan et al., 2010; Glister et al., 2010;

Horie et al., 1992; Suzuki et al., 1994; Kim et al., 2011), and the actions of androgens during

ovarian folliculogenesis, showing that they are indispensable for a normal folliculogenesis

process (Hu et al., 2004; Shiina et al., 2006). The molecular link between the regulators of

ovarian folliculogenesis and the reactions controlled by ARs remains largely unknown. There

are many AR target genes in the ovaries, although there are not many studies that have tested

them yet. However, upregulation of the genes encoding granulosa FSH receptor (Weil et al.,

1999), insulin-like growth factor (IGF-1) and IGF-1 receptor (Vendola et al., 1999; Weil et

al., 1999) by activated AR is evident at the mRNA level in primate follicles and oocytes.

This in vitro study presents evidence of the essential local role of androgens on early

folliculogenesis in primates, strengthening the existence of molecular links that regulate ARs

activity and androgen action (Lenie and Smitz, 2008), and new possible interactions between

androgens with other steroid hormones. Our findings showed clearly that T or DHT could restore

the survival, growth, antrum formation, hormone production and oocyte viability of preantral

follicles cultured in vitro in the 3D alginate matrix that were exposed to steroid ablation.

The new knowledge that can be obtained from this kind of study could help the

understanding of the dynamic process of follicle development, what is still little

comprehended (Chand et al., 2010). This would be crucial for the studies about PCOS and to

identify the optimal conditions for in vitro growth of follicles of primates, prior to application

in humans with the goal on assist cancer patients as an excellent alternative to be offered to

them after the thawing of the tissue (Woodruff, 2007; Shea et al., 2008; West et al., 2009;

Telfer and Zelinski, 2013).

Anexos | 119

References

Balasch J, Fábregues F, Peñarrubia J, Carmona F, Casamitjana R, Creus M, Manau D, Casals

G, Vanrell JA. Pretreatment with transdermal testosterone may improve ovarian response to

gonadotrophins in poor-responder IVF patients with normal basal concentrations of FSH.

Human Reproduction. 2006; 21(7): 1884 – 1893.

Billig, H. et al. (1993) Estrogens inhibit and androgens enhance ovarian granulosa cell

apoptosis. Endocrinology 133, 2204–2212.

Bishonga C, Takahashi Y, Katagiri S, Nagano M, Ishikawa A. In vitro growth of mouse

ovarian preantral follicles and the capacity of their oocytes to develop to the blastocyst stage.

J Vet Med Sci, v.63, p.619-624, 2001.

Bolamba D, Russ KD, Harper SA, Sandler JL, Durrant BS. Effects of epidermal growth factor

and hormones on granulose expansion and nuclear maturation of dog oocytes in vitro.

Theriogenology, v.65, p.1037-1047, 2006.

Broekmans FJ, Visser JA, Laven JS, Broer SL, Themmen AP, Fauser BC. Anti-Müllerian

hormone and ovarian dysfunction. Trends Endocrinol Metab. 2008 Nov;19(9):340-7. doi:

10.1016/j.tem.2008.08.002. Epub 2008 Sep 18.

Campo SM, Carson RS, Findlay JK. Distribution of specific androgen binding sites within the

ovine ovarian follicle. Mol Cell Endocrinol 1985; 39:255–265.

Cardenas, H. et al. (2002) Increased ovulation rate in gilts treated with dihydrotestosterone.

Reproduction 123, 527–533.

Cárdenas H, Pope WF. Androgen receptor and follicle-stimulating hormone receptor in the

pig ovary during the follicular phase of the estrous cycle. Mol Reprod. 2002;62(1):92 – 8.

Cardenas, H. and Pope, W.F. (1997) Administration of testosterone from day 13 of the estrous

cycle to estrus increased the number of corpora lutea and conceptus survival in gilts. J. Anim.

Sci. 75, 202–207.

Anexos | 120

Chian RC, Asangla A, Clarke HJ, Tulandi T, Tan SL. Production of steroids from human

cumulus cells treated with different concentrations of gonadotropins during in vitro culture.

Fertil Steril, v.71, p.61-66, 1999.

Drummond, A.E. (2006) The role of steroids in follicular growth. Reprod. Biol. Endocrinol. 4,

16.

Drummond AE, Findlay JK. The role of estrogens in folliculogenesis. Mol Cell Endocrinol,

v.151, p.57-64, 1999.

Durlinger AL, Kramer P, Karels B, Grootegoed JA, Uilenbroek JT, Themmen AP. Apoptotic

and proliferative changes during induced atresia of pre-ovulatory follicles in the rat. Hum

Reprod. 2000; 15(12):2504 – 11.

Duffy DM, Molskness TA, Stouffer RL. Progesterone receptor messenger ribonucleic acid

and protein in luteinized granulosa cells of rhesus monkeys are regulated in vitro by

gonadotropins and steroids. Biol Reprod. 1996 Apr;54(4):888-95.

Fábregues F, Peñarrubia J, Creus M, Manau D, Casals G, Carmona F, Balasch J. Transdermal

testosterone may improve ovarian response to gonadotrophins in low-responder IVF patients:

a randomized, clinical trial. Hum Reprod. 2009;24(2):349 – 59.

Gava N, Clarke CL, Byth K, Arnett-Mansfield RL, DeFazio A. Expression of progesterone

receptors A and B in the mouse ovary during the estrous cycle. Endocrinology, v.145, p.3487-

3494, 2004.

Glister C, Satchell L, Knight PG. Changes in expression of bone morphogenetic proteins

(BMPs), their receptors and inhibin co-receptor betaglycan during bovine antral follicle

development: inhibin can antagonize the suppressive effect of BMPs on thecal androgen

production. Reproduction. 2010; 140(5):699 – 712.

Hampton JH, Manikkam M, Lubahn DB, Smith MF, Garverick HA. Androgen receptor

mRNA expression in the bovine ovary. Domest Anim Endocrinol 2004; 27:81–88.

Anexos | 121

Harlow CR, Hillier SG, Hodges JK. Androgen modulation of follicle-stimulating hormone-

induced granulosa cell steroidogenesis in the primate ovary. Endocrinology. 1986

;119(3):1403 – 5.

Hild-Petito S, West NB, Brenner RM, Stouffer RL. Localization of androgen receptor in the

follicle and corpus luteum of the primate ovary during the menstrual cycle. Biol Reprod, v.44,

p.561-568, 1991.

Hillier SG, De Zwart FA. Evidence that granulosa cell aromatase induction/activation by

follicle-stimulating hormone is an androgen receptor-regulated process in-vitro.

Endocrinology. 1981; 109(4):1303 – 5.

Hillier, S.G. and Ross, G.T. (1979) Effects of exogenous testosterone on ovarian weight,

follicular morphology and intraovarian progesterone concentration in estrogen-primed

hypophysectomized immature female rats. Biol. Reprod. 20, 261–268.

Horie K, Takakura K, Fujiwara H, Suginami H, Liao S, Mori T. Immunohistochemical

localization of androgen receptor in the human ovary throughout the menstrual cycle in

relation to oestrogen and progesterone receptor expression. Hum Reprod 1992; 7:184–190.

Hu, Y.C. et al. (2004) Subfertility and defective folliculogenesis in female mice lacking

androgen receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11209–11214.

Kimura S, Matsumoto T, Matsuyama R, Shiina H, Sato T, Takeyama K, Kato S. Androgen

receptor function in folliculogenesis and its clinical implication in premature ovarian failure.

Trends Endocrinol Metab. 2007 Jul;18(5):183-9. Epub 2007 Apr 17.

Lebbe M, Woodruff TK. Involvement of androgens in ovarian health and disease. Mol Hum

Reprod. 2013 [Epub ahead of print].

Lenie S, Smitz J. Functional AR signaling is evident in an in vitro mouse follicle culture

bioassay that encompasses most stages of folliculogenesis. Biol Reprod. 2009;80(4):685 – 95.

Anexos | 122

Nandedkar, T.D. and Munshi, S.R. (1981) Effect of dihydrotestosterone on follicular

development, ovulation and reproductive capacity of mice. J. Reprod. Fertil. 62, 21–24.

Nardo LG, Yates AP, Roberts SA, Pemberton P, Laing I. The relationships between AMH,

androgens, insulin resistance and basal ovarian follicular status in non-obese subfertile

women with and without polycystic ovary syndrome. Hum Reprod. 2009 Nov;24(11):2917-

23. doi: 10.1093/humrep/dep225. Epub 2009 Jul 18.

Parahuleva N, Pehlivanov B, Dimitrakova E, Malinova M, Mladenova M. Anti-Mullerian

hormone- its role in the pathogenesis of the polycystic ovary syndrome. Akush Ginekol

(Sofiia). 2012;51(6):22-6.

Parahuleva N, Pehlivanov B, Orbecova M, Deneva T, Uchikova E. Serum levels of anti-

muller hormone in women with polycystic ovary syndrome and healthy women of

reproductive age. Akush Ginekol (Sofiia). 2013;52 Suppl 1:16-23.

Peluso JJ. Multiplicity of progesterone´s actions and receptors in the mammalian ovary. Biol

Reprod, v.75, p.2- 8, 2006.

Peluso JJ, Pappalardo A. Progesterone mediates its anti-mitogenic and anti-apoptotic actions

in rat granulosa cells through a progesterone-binding protein with gama aminobutyric acidA

receptor-like features. Biol Reprod, v.58, p.1131-1137, 1998.

Potts GO, Creange JE, Harding HR, Schane HP. Trilostane, an orally active inhibitor os

steroid biosynthesis. Steroids. 1978;32:257.

Schane HP, Potss GO, Creange JE. Inhibition of ovarian, placental and adrenal

steroidogenesis in the rhesus monkey by trilostane. Fertility and Sterility. 1979;32(4):464–

467.

Sen A, Hammes SR. Granulosa cell-specific androgen receptors are critical regulators of

ovarian development and function. Mol Endocrinol. 2010;24(7):1393 – 403.

Anexos | 123

Shea LD, Woodruff TK, Lowe MP. Perspectives on oncofertility: preserving fertility for

young cancer patients. Endocrine News. 2008; 33 14 –19.

Shiina, H. et al. (2006) Premature ovarian failure in androgen receptordeficient mice. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 103, 224–229.

Sönmezer M, Cil AP, Oktay K. Ongoing pregnancies from early retrieval of prematurely

developing antral follicles after DHEA supplementation. Reprod Biomed Online.

2009b;19(6):816 – 9.

Sönmezer M, Ozmen B, Cil AP, Ozkavukçu S, Taşçi T, Olmuş H, Atabekoğlu CS.

Dehydroepiandrosterone supplementation improves ovarian response and cycle outcome in

poor responders. Reprod Biomed Online. 2009a;19(4):508 – 13.

Telfer EE, Zelinski MB. Ovarian follicle culture: advances and challenges for human and

nonhuman primates. Fertil Steril. 2013;99(6):1523 – 33.

Tetsuka M, Whitelaw PF, Bremner WJ, Millar MR, Smyth CD, Hillier SG. Developmental

regulation of androgen receptor in rat ovary. J Endocrinol 1995; 145:535–543.

Vendola KA, Zhou J, Adesanya OO, Weil SJ, Bondy CA. Androgens stimulate early stages of

follicular growth in the primate ovary. J Clin Invest 1998; 101:2622 – 2629.

Vendola K, Zhou J, Wang J, Bondy CA. Androgens promote insulin-like growth factor-I and

insulin-like growth factor-I receptor gene expression in the primate ovary. Hum Reprod.

1999a; 14(9):2328 – 32.

Vendola K, Zhou J, Wang J, Famuyiwa OA, Bievre M, Bondy CA. Androgens promote

oocyte insulin-like growth factor I expression and initiation of follicle development in the

primate ovary. Biol Reprod 1999b;61:353 – 357.

Xu M, Barrett SL, West-Farrell E, Kondapalli LA, Kiesewetter SE, Shea LD, Woodruff TK. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction 2009a;24:2531–2540.

Anexos | 124

Xu M, West-Farrell ER, Stouffer RL, Shea LD, Woodruff TK, Zelinski MB. Encapsulated

three-dimensional culture supports development of nonhuman primate secondary follicles.

Biology of Reproduction; 2009b;81: 587 – 594.

Xu J, Bernuci MP, Lawson MS, Yeoman RR, Fisher TE, Zelinski MB,2 Stouffer RL.

Survival, growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older

adult rhesus monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins

and insulin. Reproduction. 2010;140(5):685 – 97.

Xu J, Lawson MS, Yeoman RR, Pau KY, Barrett SL, Zelinski MB, Stouffer RL. Secondary

follicle growth and oocyte maturation during encapsulated three-dimensional culture in rhesus

monkeys: effects of gonadotrophins, oxygen and fetuin. Hum. Reprod. 2011a;26:1061 – 72.

Xue K, Liu JY, Murphy BD, Tsang BK. Orphan nuclear receptor NR4A1 is a negative

regulator of DHT-induced rat preantral follicular growth. Mol Endocrinol. 2012;26(12):2004

– 15.

Xue K, Kim JY, Liu JY, Tsang BK. Insulin-like 3 induced rat preantral follicular growth is

mediated by growth differentiation factor 9. Endocrinology. 2013; 29 [Epub ahead of print].

Yang MY, Fortune JE. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in

bovine follicles in vitro. Biol Reprod 2006; 75:924 – 932.

Young JM, Henderson S, Souza C, Ludlow H, Groome N, McNeilly AS. Activin B is

produced early in antral follicular development and suppresses thecal androgen production.

Reproduction. 2012;143(5):637 – 50.

Walters KA, Allan CM, Handelsman DJ. Androgen actions and the ovary. Biol Reprod 2008;

78:380 – 389.

Walters KA, Simanainen U, Handelsman DJ. Molecular insights into androgen actions in

male and female reproductive function from androgen receptor knockout models. Hum

Reprod Update 2010; 16:543–558.

Anexos | 125

Walters KA, Middleton LJ, Joseph SR, Hazra R, Jimenez M, Simanainen U, Allan CM,

Handelsman DJ. Targeted loss of androgen receptor signaling in murine granulosa cells of

preantral and antral follicles causes female subfertility. Biol Reprod. 2012; 27;87(6):151.

Weil, S. et al. (1999) Androgen and follicle-stimulating hormone interactions in primate

ovarian follicle development. J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 2951–2956.

Weil SJ, Vendola K, Zhou J, Adesanya OO, Wang J, Okafor J, Bondy CA. Androgen receptor

gene expression in the primate ovary: cellular localization, regulation, and functional

correlations. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83:2479–2485.

West ER, Zelinski MB, Kondapalli LA, Gracia C, Chang J, Coutifaris C, Critser J, Stouffer

RL, Shea LD, Woodruff TK. Preserving female fertility following cancer treatment: current

options and future possibilities. Ped. Blood Cancer. 2009;53, 289 – 95.

Wiser A, Gonen O, Ghetler Y, Shavit T, Berkovitz A, Shulman A. Addition of

dehydroepiandrosterone (DHEA) for poor-responder patients before and during IVF treatment

improves the pregnancy rate: a randomized prospective study. Hum Reprod.

2010;25(10):2496 – 500.

Woodruff TK. The emergence of a new interdiscipline: oncofertility. Cancer Treat Res.

2007;138:3 – 11.

Anexos | 126

Anexos | 127

Anexos | 128

Anexos | 129

Table I. Growth characteristics of follicles at week 4.

Follicle culture Total No-grow Slow-grow Fast-grow

Control

TRL

TRL2

98

26

49

11 (11%)a

7 (27%)b

7 (14%)a

60 (61%)a

19 (73%)b

33 (67%)a,b

27 (28%)a

0 (0%)b

9 (19%)c

Note: a, b Different letters indicate significant differences within the column (P < 0.05).

Table II. Characteristics of oocytes retrieved from antral follicles at week 5 (34 hrs after addition of hCG).

Follicle culture Number (n) of Diameter (µm)*

Follicles harvested

Oocytes retrieved

Degenerate oocytes

Healthy oocytes GV oocytes

MII oocytesGV MII

Control 13 13 1 11 1 111 ± 2a 117

TRL 2 1 1 0 0 - -

TRL2 10 7 3 4 0 92 ± 18a -

* Values are the mean ± SEM with each oocyte diameter as an individual data point.

Table III. Follicle characteristics at week 5. Follicle culture Total No-grow Slow-grow Fast-grow

T replacement Control 47 3 (6%)a,b 31 (66%)a,b 13 (28%)a,b

TRL 23 5 (22%)b 13 (57%)b 5 (21%)a TRL + T Low 47 0 (0%)a 29 (62%)a,b 18 (38%)a,b TRL + T High 53 0 (0%)a 37 (70%)a 16 (30%)a,b

DHT replacement Control 51 9 (18%)a 22 (43%)a 20 (39%)a

TRL 30 5 (17%)a,b 16 (53%)b 9 (30%)b,c DHT 58 4 (7%)c 35 (60%)c 19 (33%)b

TRL + DHT 51 11 (22%)d 26 (51%)b,d 14 (27%)c Note: a, b Different letters indicate significant differences within the column (P < 0.05).

Anexos | 130

Table IV. Characteristics of oocytes retrieved from antral follicles at week 5 (34 hrs after addition of hCG).

Follicle culture Number (n) of Diameter (µm)*

Follicles harvested

Oocytes retrieved

Degenerate oocytes

Healthy oocytes GV oocytes

MI oocytes

MII oocytesGV MI MII

T replacement Control 15 15 2 12 1 1 119 ± 5a 143 131

TRL 4 4 2 2 0 0 117 ± 2a - -

TRL + T Low 16 16 1 13 1 0 119 ± 14a 131 -

TRL + T High 13 13 0 12 0 1 102 ± 14a - 147

DHT replacement Control 21 21 6 13 0 2 110 ± 2a - 123 ± 3

TRL 8 8 6 2 0 0 112 ± 2a,b - -

DHT 10 10 4 6 0 0 116 ± 4a,b - -

TRL + DHT 13 13 3 9 0 1 118 ± 2b - 117

* Values are the mean ± SEM with each oocyte diameter as an individual data point. a, b Different letters indicate significant differences within the column (P < 0.05).

Anexos | 131

ANEXO B

IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY

PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER

Jhenifer Kliemchen Rodrigues (BSc, MSc)1,2,3, Jing Xu (PhD)2, Ricardo Mello Marinho (MD,

MSc, PhD)3,4, João Pedro Junqueira Caetano (MD, MSc, PhD)3,4, Mary B Zelinski (PhD)2,

Richard L Stouffer (PhD)2, Paula Andrea Navarro (MD, MSc, PhD)1

1 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto/SP, Brazil 2 Oregon National Primate Research Center/ Oregon Health & Science University,

Beaverton/OR, United States of America 3 Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, Pró-Criar Medicina Reprodutiva, Belo

Horizonte/MG, Brazil 4 Instituto de Pós-graduação – Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais, Belo

Horizonte/MG, Brazil




Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, Zip code: 30140-082

Phone number: (55 – 31) 8325 – 7959/ (55 – 31) 2533 – 3815 / (55 – 31) 3292 – 5299

Fax number: (55 – 31) 3292 – 5299

[email protected] or [email protected]

There is no conflict of interest for any of the submitting authors to the submitted material.

Submission to: Journal of Assisted Reproduction and Genetics

Anexos | 132

IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY

PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER

Abstract

The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservation option

for young women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer

therapy. Currently, the only available option to restore fertility using this cryostored/thawed

tissue is by transplantation, which involves the theoretical risk of cancer recurrence since

tumor cells may be reintroduced into the patient’s body. In contrast, in vitro maturation of

cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization of their oocytes and embryo transfer,

excludes this risk, and may provide a larger number of mature oocytes. However, meiotically

competent human oocytes with the ability to fully develop have yet to be obtained following

the culture of preantral follicles. Thus, many challenges remain to develop a complete culture

system that supports human oocyte development. This review outlines the major advances in

cryopreservation of ovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM)

in nonhuman primates and women, with emphasis on the remaining challenges before IFM

can be applied to fertility preservation in patients with cancer.

Keywords: Follicle culture; fertility preservation; human oocyte; IFM; ovarian

cryopreservation; primordial follicle

Anexos | 133

Introduction

An earlier diagnosis, plus advances in cancer treatment, has increased the likelihood for

restoration of patient health and a consequent increased chance for long survival. However,

the cytotoxicity and cell damage caused by chemotherapeutic drugs and radiotherapy can

impair the ovarian reserve and normal function of the ovary, possibly leading to premature

ovarian failure and infertility [75, 90, 105]. After cancer treatment, many women express the

wish to become mothers [128], but may not fulfill this dream because of impairment of their

ovaries caused by cancer therapy. Consequently, investigators are pursuing methods to either

protect the ovaries from the cytotoxic effects of cancer therapies [76, 140] or to restore

ovarian function by promoting the development and function of follicles, and thus maintain or

restore fertility [45, 107, 123].

The current accepted approaches for the preservation of female fertility in clinical practice are

limited to protection of the ovaries against radiation (oophoropexy) [31, 74] or ovarian

stimulation for oocyte collection followed by oocyte and/or embryo cryopreservation [13, 20,

26, 27, 41, 95, 110]. Other approaches for fertility preservation in cancer patients are being

extensively discussed and investigated in animal models and to a lesser extent in primates [12,

20, 63]. No “gold standard” technique is currently available to be applied to all types of

patients desiring this care. Some women are candidates for ovarian stimulation and

oocyte/embryo freezing before cancer treatment [26]. For this procedure, however, a patient

must have no urgent need to begin cancer treatment which allows enough time for the ovarian

stimulation protocol. A patient with a hormone (steroid)-dependent cancer may face a higher

theoretical risk of tumor growth during ovarian stimulation [14, 17, 89]. Moreover, a patient

must have a partner as a sperm donor in order to produce embryos [40]. There is an ongoing

debate on whether to cryopreserve mature oocytes and/or embryos following “emergency”

ovarian stimulation or alternatively cryopreserve ovarian tissue [24]/immature oocytes [23,

28, 60, 139] for future ART procedures to restore fertility.

For prepubertal girls and women who require immediate treatment or have a hormone-

dependent cancer, the ideal approach may be to freeze immature oocytes, isolated follicles or

ovarian tissue [9, 12, 62, 75, 79]. Cryopreserved ovarian tissue could be transplanted back to

the patient after cancer treatment to promote timely puberty and fertility. Although this

procedure is considered experimental, the results are promising with 24 reported cases of live

Anexos | 134

births obtained following transplantation of cryopreserved/thawed ovarian tissue [18, 35, 38,

41, 43, 61, 64, 83, 96]. However, tissue transplantation raises the theoretical risk of cancer

recurrence since untreated cells are reintroduced into the patient [34], though thus far disease

recurrence after transplantation has not been reported [33]. Alternatively, in vitro follicle

maturation (IFM), followed by in vitro fertilization and embryo transfer, would eliminate this

risk. In addition, this approach could be advantageous by being associated with a greater

possibility of achieving successful pregnancy, since a large number of oocytes could be

obtained from a small ovarian sample [117, 127, 130]. As such, cryopreservation of ovarian

tissue samples followed by IFM is an emerging option for the reestablishment of fertility,

especially for patients undergoing cancer treatment who are not suitable for ovarian

stimulation (or it is contraindicated) or cryopreservation of oocytes and/or embryos [63, 109].

IFM could be an excellent alternative to transplantation for patients after ovarian tissue

thawing. However, it is still considered to be an experimental technique. There are studies

showing excellent results from nonprimate species such as mice [46, 87], with reports of live

births generated from oocytes originated from in vitro matured follicles of mice [77, 137],

cows [51, 111], sheep [114], pigs [115, 118] and goats [22, 45, 101] (Table 1). However,

there is a still limited success in producing early-stage embryos in the studies on nonhuman

primates, such as rhesus monkeys [119, 120, 121, 131, 132, 133, 138] and baboons [136].

Also, there are few reports to date describing human preantral follicle growth in vitro [9, 16,

135], with no studies (y) yielding meiotically competent human oocytes (Table 1). Reasons

for limited success include: (1) the difficulty in obtaining nonhuman primate and human

tissue for experiments, (2) apparent species differences in the regulation of early

folliculogenesis, and (3) the larger size of antral follicle needed to generate a competent

oocyte. Moreover, most studies to date have used follicles from fresh, as opposed to

cryopreserved/thawed, ovarian tissue.

The present paper reports the recent advances in the cryopreservation of ovarian tissue and the

first extensive efforts to perform research on IFM in nonhuman primates and humans, with

emphasis on the challenges on applying this emerging technique to fertility preservation in

cancer patients.

Anexos | 135

Cryopreservation of ovarian tissue

The cryopreservation of ovarian tissue and the subsequent thawing following cancer treatment

for fertility preservation is an evolving technique which requires additional evaluation,

including characterization of the structure-function of cryo-thawed ovarian cortex. Based on

extensive animal studies, the technique was first applied to humans in 1996, with cryo-thawed

ovarian tissue transplanted into a patient who had received chemotherapy [41, 68]. Since then,

clinical researchers have published case reports and small experimental trials, including

reimplantation of cryopreserved/thawed ovarian tissue to the original site (orthotopic) and

ectopic (heterotopic) sites such as the abdominal wall or the forearm [10, 36, 37, 44, 67, 88].

Successful return of ovarian function after reimplantation, albeit for a finite interval of time,

was reported. In some cases, oocyte aspiration was possible following stimulation of

heterotopic ovary implants [10, 36, 37, 44]. In 2004, the first spontaneous pregnancy resulting

from orthotopic transplantation was reported in Belgium [106]. To date, 24 live births have

been reported using the technique of ovarian tissue cryopreservation and subsequent thawing

for transplantation [18, 38, 42,43, 61, 64, 96, 99]. As a result, various medical centers

routinely perform ovarian tissue cryopreservation for cancer patients around the world, with

the subsequent plan to offer transplantation or other ARTs for fertility improvement after

treatment [50]. Currently, many patients are awaiting results from their oncologists that

validate reimplantation of ovarian tissue for improvement of endocrine and reproductive

function.

To date, the majority of livebirths in women originated from ovarian tissue cryopreserved by

the slow freezing technique [38]. The main characteristic of slow freezing is that the

temperature is reduced gradually. A freezing curve of 0.3°C per minute is usually applied to

tissue samples such as ovarian cortex [65, 100]. In order to obtain equilibrium among various

cell types, low concentrations of cryoprotectants are used in the attempt to prevent the

formation of intracellular ice crystals [80]. However, the protocol may not completely

eliminate water inside the ovarian sample, with the consequent formation of ice crystals that

generate cell damage.

Although slow freezing for ovarian tissue cryopreservation was initially used, the vitrification

technique recently gained attention because of encouraging results in oocyte and embryo

Anexos | 136

cryopreservation [1, 25, 26, 27, 70]. However, vitrification requires high concentrations of

cryoprotectant agents that may induce cytotoxicity and osmotic trauma [47]. High freezing

velocity, necessary for oocyte and embryo vitrification, is not required for ovarian tissue

vitrification, in which slower cooling rates are needed to prevent fracturing [48, 84, 119].

Successful ovarian tissue vitrification was reported using nonhuman primates. Heterotopic

transplants of vitrified ovarian tissue resulted in ovarian development in baboons [8], as well

as recovery of MII oocytes, and formation of early cleavage embryos in cynomolgus [112]

and rhesus [71, 119, 120, 121] monkeys. Ongoing studies with human ovarian tissue are

showing promising results with the use of vitrification technique [55]. Notably, the first

human live birth derived from ovarian tissue vitrification and ART was recently reported [64].

Cryopreservation issues. Nevertheless, many parameters regarding cryoprocedures remain

poorly understood such as the ideal quantity of tissue sample to be cryopreserved, the choice

of cryoprotectants for executing the procedure and the time of tissue exposure, the choice of

cryopreservation protocol, and the use of open or closed system. Thus, studies, combined with

rigorous analyses comparing ovarian tissue structure-function before and after thawing, are

needed to establish the ideal technique and protocol of ovarian tissue cryopreservation.

There are ongoing studies defining the optimal conditions to vitrify macaque ovarian cortex

by testing different kind of cryoprotectants, cryoprotectant exposure times and systems (open

or closed) [119, 121]. Recently, a study reported that dense stroma and preantral follicles were

preserved using a vitrification solution containing 27% glycerol, 27% ethyleneglycol and

0.8% polymers with cooling in liquid nitrogen vapor and a two-step warming. BrdU uptake

was evident in granulosa cells of growing follicles in fresh and vitrified tissues, showing

viability in both tissue types [119]. Higher cooling and warming rates led to fracturing, i.e.,

evidence that the temperature curve is a critical part of the whole process. The use of

polymers in the vitrification solution [53, 119], combined with advances on the concentration

of cryoprotectants and the use of a closed system to avoid contamination, has improved the

ovarian tissue vitrification technique, as demonstrated for the first time by the development of

antral follicles during three-dimensional (3D) culture using primate vitrified-thawed ovarian

cortex [119].

Transplant issues. Transplant of ovarian tissue is also a technique that still needs detailed

investigation. There are few studies evaluating the consequences of tissue transplantation on

ovarian structure-function in humans or even following xenografting [7, 55]. The possible

Anexos | 137

presence of malignant cells in the grafted tissue, the use of specific components (e.g., matrix

or growth factors) or procedures that might reduce tissue ischemia and improve ovarian

function, the definition and standardization of the best transplant site, and the duration of

resumed ovarian endocrine and gametogenic function are some of the important points which

require further studies.

Although transplantion of ovarian cortex using fresh monkey tissue [72], as well as fresh and

cryopreserved human tissue [32, 35, 64, 104], culminated in the birth of healthy offspring,

only IFM has the advantage of eliminating the reintroduction of cancer cells into the patients.

Although studies have not reported disease recurrence in transplant cases [33, 34, 38, 79], a

theoretical risk could not be ruled out or minimized without further long term investigations

[107].

IFM

Investigators have tried for several years [2, 3, 4, 30, 69, 102, 108, 117] to grow follicles in

vitro to examine follicular/oocyte development and function with some success. Two-

dimensional (2D) culture supports the complete growth of murine preantral follicles to the

preovulatory stage which provide meiotically competent oocytes [30, 46]. However,

comparable results have not been achieved in other mammals such as cattle [51], sheep [114],

and humans [3]. Only in experiments with goats early embryos were produced [102] (Table

1). One of the main reasons is that 2D culture does not maintain the natural architecture of the

antral follicle of large mammals [78]. During culture, granulosa cells become disconnected

from each other and from the oocyte because they spread on the bottom of the culture dish

[78].

Based on principles of tissue bioengineering, a 3D matrix capable of supporting follicle

growth was developed and demonstrated success in mice [54, 126, 137]. In mice, the 3D

culture system permitted the in vitro development of preantral follicles up to the preovulatory

stage with the ability of producing mature oocytes which, once inseminated, progressed to

embryos and live births [137] (Table 1). Follicle encapsulation in alginate gel is able to mimic

the characteristics of the extracellular matrix in vivo, that facilitates the exchange of

molecules between the follicle and culture medium. In addition, the flexibility of gel favors

Anexos | 138

cell proliferation, which is essential for follicle survival and development [126, 134].

However, the stiffness of the gel may inhibit follicular growth and reduce steroidogenesis, as

reported for murine follicles embedded in 1 and 1.5% alginate gel. When 0.5% gel was used,

oocytes showing full growth were obtained [138].

In addition, this 3D matrix permits culture, and hence study, of individual follicles. Research

indicates that larger (secondary) preantral follicles do not survive when they are cultured in

ovarian cortical slices, despite their 3D architecture; as such, neighboring stroma or follicles

may have an inhibitory effect on follicular development. Added to this is the fact that oxygen

diffusion becomes limiting in isolated tissue slices that are placed in the incubator, so that

only follicles on the edges of the thinner slices can survive, resulting in loss of integrity and a

negative impact on oocyte survival [59, 116]. Thus, culturing individual follicles without

large portions of surrounding stroma may be a better baseline of study [82, 116, 132]. This

IFM approach allows studies to directly determine the effects of co-culture using multiple

follicles at known developmental stages or stromal cells.

Investigators are also testing the value of various matrix components in 3D follicle culture.

For example, collagen gel was used during cattle IFM and follicular differentiation was

demonstrated. When this method was applied with a combination of defined supplemented

culture medium and micropore membranes, a calf was obtained from immature follicles

cultured for 14 days [56]. When a 3D alginate-based matrix was applied to nonhuman primate

(rhesus monkey) IFM, it was possible to grow individual preantral (secondary) follicles

collected from both the fresh and cryopreserved tissue, to the small (~1 mm diameter) antral

stage, with the production of appreciable levels of steroid hormones [119, 120, 121, 131, 133,

138]. Typically, the small antral follicles did not respond to a gonadotropin bolus by

reinitiating oocyte meiosis, but in rare (10%) instances a large, fast-grow follicle could

provide a metaphase II (MII)-stage oocyte that was fertilized in vitro [132, 133] (Table 1).

The dynamics and regulation of folliculogenesis in primates is still poorly understood [21],

which challenges the rapid refinement and translation of the IFM technique for human

follicles and their oocytes. This technique of 3D follicle encapsulation is currently being used

to test potential endocrine and paracrine factors that may promote follicle development and

oocyte maturation in primates. For example, recent evidence supports the concept that

appropriate levels of certain hormones are essential for the growth and health of preantral

follicles during culture [92, 97, 131, 133, 136].

Anexos | 139

Gonadotropic Hormones. The presence of exogenous follicle-stimulating hormone (FSH)

promotes preantral follicular growth in vitro, in addition to maintaining the morphological

integrity of preantral follicles in goats [80], and stimulating the activation of primordial

follicles in monkeys [4, 5]. Studies demonstrated that FSH exposure increases the diameter of

follicles in mice [137], monkeys [131, 138] and humans [135] during 3D culture. In rhesus

monkey, FSH was essential for the survival of secondary follicles (125–225 µm in diameter)

during 3D culture with alginate gel [131]. In contrast, FSH did not show beneficial effects on

baboon follicle growth in 3D culture [136]. This may be due to the inclusion of matrigel in the

matrix that contains unknown growth factors which could contribute to follicle growth. These

data indicate that 3D encapsulated follicles offer a valuable model for examining FSH actions,

including the expression and signaling of FSH receptors, during early follicle development.

Luteinizing hormone (LH) may play a role during follicle development in vitro particularly

for steroidogenesis in mammalian species such as mouse [15, 29], cattle [111], goats [10] and

primates, but the effects differed between slow- and fast-grow antral follicles from monkeys

[131, 133]. The addition of LH at day 30 of culture increased progesterone (P4),

androstenedione (A4) and estradiol (E2) production by slow-grow follicles between pre-LH

(week 4) and post-LH (week 5) exposure in the presence of high-dose FSH. In contrast, with

low-dose FSH exposure, LH treatment increases P4 and A4, but not E2, at week 5 compared

to FSH alone. LH supplementation at day 30 has no effect on the patterns or levels of steroids

produced by fast-grow follicles during week 5 regardless of culture conditions [131, 133].

This may be due to their high steroid production prior to the LH addition which prevents

further stimulation. Also, continuous LH exposure during monkey follicle culture decreased

P4, without having effect on A4 and E2 production [138]. This may result from the

desensitizing of LH receptors by continuous LH exposure or not distinguishing slow- from

fast-grow follicles. The LH responsiveness suggests the presence of theca cells in in vitro-

developed primate antral follicles, which was recently demonstrated using

immunocytochemical detection of steroidogenic enzymes in theca versus granulosa cells

[132]. Further studies of the stage-specific actions of LH on primate follicles in vitro during

growth and maturation are warranted.

Steroid Hormones. It is also apparent that encapsulated follicles produce a number of

endocrine and local factors during culture, that may be vital to follicular growth and

maturation. For example, individually cultured macaque follicles differed in the ability to

produce ovarian steroids, such as P4, A4, and E2, which are detectable in the culture media.

Anexos | 140

Steroid production correlated positively with follicle growth rate and was promoted by

exogenous gonadotropins [131, 133, 138]. Therefore, studies were initiated to test whether

these steroid hormones have local actions to mediate or modulate gonadotropin actions in

primate follicles.

Notably, addition of a 3β-hydroxysteroid dehydrogenase inhibitor (Trilostane, TRL) to

prevent the conversion of pregnenolone to P4, as well as downstream production of androgens

and estrogens, reduced survival and growth of macaque secondary follicles during 3D culture.

Co-administration of low (10 ng/mL) or high (50 ng/mL) doses of testosterone increased

follicle survival to control level. Follicles that received testosterone reached similar sizes and

percentage of antrum formation, as well as oocyte meiotic maturation (MII stage), as control

follicles [97]. Studies with rodents also showed that androgens have distinct physiological

functions within the growing follicle [73, 85, 98]. Immunohistochemical analysis revealed

that cytoplasmic androgen receptor (AR) protein translocated to the nucleus of granulosa and

theca cells in mouse follicles in response to endogenous androgen production by theca cells

during preantral follicular development and during the antral stage in vitro [73]. AR was also

differentially expressed in mural versus cumulus cells, implying an oocyte-mediated

regulation [73].

Studies are ongoing to determine if P4 and/or estrogen have critical roles during

folliculogenesis in primates [86, 94] and other mammalian species, e.g., cow [11, 103, 124].

Dynamic changes were observed in the protein expression of P4 receptors following in vitro

maturation or in response to supplementation with LH, FSH, or P4 suggesting an important

role during bovine oocyte maturation [11]. Detailed experiments using encapsulated macaque

follicles should better define the role(s) of each steroid hormone at various stages of follicle

development and maturation in primates.

Recent studies also observed the stage-specific production of other local factors, e.g., the

angiogenic factors VEGF-A and ANGPTs [49, 131, 132] and AMH [131, 132, 133] by

encapsulated monkey follicles, plus the correlation of their production with follicle growth

and oocyte maturation. Further studies on these and other local factors will increase our

understanding of the regulation and function of folliculogenesis in primates and optimize

conditions for IFM for clinical application.

IFM in humans. Efforts are addressing the promotion of IFM after obtaining human follicles

from both fresh [16, 107, 116] and cryopreserved [58, 91, 116] ovarian cortex or

Anexos | 141

cryopreserved follicles [16]. To date, only four studies have evaluated the applicability of the

alginate matrix and 3D system to human preantral follicle culture [9, 16, 122, 135]. Three

experiments cultured primordial-stage follicles for seven days, and the follicles [9, 122] and

their oocytes [16] doubled in size. Follicle culture from secondary stage permitted

development up to the small antral stage and production of steroid hormones [135]. These

results are promising, but culture systems that support development of individual human

preantral follicles still need refinement in many aspects, such as definition of the

developmental stage of harvested follicles, the culture media and hormones/local factors

necessary for the maintenance and growth of the follicle in vitro, and the interval of culture

needed to produce antral follicles with meiotically competent oocytes. Due to the large (>10

mm diameter) size of the dominant, preovulatory follicle in women, it remains unclear if IFM

can generate an antral follicle of sufficient maturation to yield a fertilizable oocyte or

subsequent developing embryo. However, live infants have been derived from oocytes

contained within follicles < 6 mm following IVM and ICSI [52], demonstrating that the

diameter of the human follicle capable of producing a competent oocyte is considerably

smaller than the preovulatory follicle.

Tests growing primate primordial and primary follicles are valuable since they are the most

abundant cohorts in the ovary, and are very resistant to damage by cryopreservation and

chemotherapeutics [57]. It was found that primate ovarian tissue can be maintained for up to

24 h at 4°C without compromising tissue or follicle health. Also, follicle survival and

morphology were more optimal when isolated primordial follicles were cultured in 2%

alginate compared with 0.5% alginate; apparently primordial follicles require a rigid physical

environment to survive and grow in vitro [57, 129]. Moreover, primary follicle culture yielded

MII oocyte in rhesus monkeys [132]. Primordial and primary human follicles, either fresh or

after being cryopreserved, which were isolated and embedded in alginate can survive and

grow for seven days in culture [19, 122], indicating that human preantral follicles can be

successfully cryopreserved without impairing their ability to survive and grow in vitro.

Other groups are focusing on developing primordial follicles to preantral stage from vitrified

tissue using cortical strips. A high proportion of viable follicles in vitrified ovarian strips were

obtained after culture for seven days, showing an increase on (in?Jing) the percentage of

secondary and primary follicles, and a decrease on (in) the number of primordial and

transitory follicles [66], however the proportions of the different classes of follicles prior to in

vitro culture is unknown. This could be an alternative, valuable three-step approach which

Anexos | 142

first uses culture of ovarian strips to obtain primary from primordial follicles, followed by

culture of isolated primary and secondary follicles, and then aspiration of the cumulus-oocyte

complex for final in vitro oocyte maturation. A culture system based on multiple steps (e.g.,

further in vitro maturation of oocytes obtained from follicle culture [82, 116, 117]) may be

necessary for full development of human oocytes capable of normal fertilization and

embryogenesis. The culture system is expected to preserve the endocrine and paracrine

functions of the follicles (which may be critical for oocyte development), as well as their

ability to support the growth and both the nuclear and cytoplasmic maturation of an oocyte.

For the optimization of culture systems, further focus on cumulus-oocyte development, which

may not necessarily require a large follicular structure, is warranted rather than simply

appropriate maintenance of differentiated somatic cells in the follicle wall.

The IFM of cryopreserved human follicle, followed by ARTs, would be an alternative for the

restoration of fertility in cancer patients when tissue transplantation or other techniques

cannot be applied, i.e., young girls for which ovarian tissue cryopreservation is their only

option. In addition, IFM provides a valuable in vitro model to study the processes and

regulation of primate folliculogenesis and permits the mimicking of pathological conditions in

vitro for the study of various types of ovarian diseases.

Conclusion

The current data support the applicability of ovarian tissue cryopreservation and possible

future use of the IFM technique for fertility preservation in cancer patients.

Ovarian tissue cryopreservation is a particularly important technique for children and

prepubertal adolescents who are not candidates for oocyte and/or embryo cryopreservation,

which are well established techniques [26, 39, 79, 93, 113, 125]. An additional advantage of

ovarian tissue cryopreservation is that it avoids certain religious, ethical or legal issues, such

as the fate of cryopreserved embryos in case of divorce, serious diseases or death of one of the

spouses [6].

In view of the growing number of studies on possible alternatives for fertility preservation in

cancer patients, ovarian tissue cryopreservation could be considered by oncologists, for later

Anexos | 143

transplantation or possible IFM. Thus, the real concern provoked by the possibility that

patients may not be able to have children would be considerably minimized, and the patients

would have better opportunities to be mothers in the future after the cancer treatment. Before

cancer treatment (gonadotoxic or radiation therapy, gonadectomy), patients could be provided

with counseling regarding available and future options for fertility preservation. Fertility

preservation may be offered by programs in reproductive medicine clinics in partnership with

oncological care centers designed to support cancer patients [6, 90].

Although IFM offers promise, further advances are needed to understand and develop an in

vitro environment that promotes appropriate follicular growth and differentiation, plus the

oocyte competence necessary for fertilization and subsequent embryonic development. Thus,

continued investigations on nonprimate, primate and human folliculogenesis are critical for

translation to improvement in fertility treatment for women, including female cancer patients.

Acknowledgments

Acknowledgments to the support received from National Institute of Health (NIH) U54

RR024347, RL1HD058294, PL1EB008542 (The Oncofertility Consortium), NIH-NICHD

through cooperative agreement as part of the Specialized Cooperative Center Program in

Reproduction and Infertility Research U54HD018185, NIH ORWH/NICHD 2K12HD043488

(Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health), NIH Fogarty International

Center TW/HD-00668 (to P. Michael Conn) and Oregon National Primate Research Center

8P51OD011092.

Anexos | 144

REFERENCES

1. Abdelhafez FF, Desai N, Abou-Setta AM, Falcone T, Goldfarb J. Slow freezing,

vitrification and ultra-rapid freezing of human embryos: a systematic review and meta-

analysis. Reprod Biomed Online. 2010;20(2):209–22. doi: 10.1016/j.rbmo.2009.11.013.

2. Abir R, Fisch B, Raz A, Nitke S, Ben-Rafael Z. Preservation of fertility in women

undergoing chemotherapy: current approach and future prospects. J Assist Reprod Genet.

1998;15(8):469–77.

3. Abir R, Franks S, Mobberley MA, Moore PA, Margara RA, Winston RML.

Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertil.

Steril. 1997;68(4):682–8.

4. Abir R, Nitke S, Ben-Haroush A, Fisch B. In vitro maturation of human primordial

ovarian follicles: clinical significance, progress in mammals, and methods for growth

evaluation. Histol Histopathol. 2006;21(8):887–98.

5. Adhikari D. In vitro activation of dormant follicles for fertility preservation. Adv Exp

Med Biol. 2013;761:29 – 42. doi: 10.1007/978-1-4614-8214-7_4.

6. Amato P, Brzyski R, Benward J, Stein A, Steinbock B, Wilder B, Reindollar R,

Francis L, Zoloth L, McCullough L, Gates E, Robertson J, Daar J, Fisseha S, Ralston S, Sauer

M, Spillman M, Rebar R, Tipton S; The Ethics Committee of the American Society for

Reproductive Medicine. Fertility preservation and reproduction in patients facing gonadotoxic

therapies. Fertil Steril. 2013;100(5):1224–31. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.08.041.

7. Amorim CA, Dolmans MM, David A, Jaeger J, Vanacker J, Camboni A, Donnez J,

Van Langendonckt A. Vitrification and xenografting of human ovarian tissue. Fertil Steril.

2012;98(5):1291–8.e1-2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.07.1109.

8. Amorim CA, Jacobs S, Devireddy RV, Van Langendonckt A, Vanacker J, Jaeger J,

Luyckx V, Donnez J, Dolmans MM. Successful vitrification and autografting of baboon

(Papio anubis) ovarian tissue. Hum Reprod. 2013;28(8):2146–56. doi:

10.1093/humrep/det103.

Anexos | 145

9. Amorim CA, Van Langendonckt A, David A, Dolmans MM, Donnez J. Survival of

human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in

vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum. Reprod. 2009;24(1):92–9. doi:

10.1093/humrep/den343.

10. Andersen CY, Rosendahl M, Byskov AG, Loft A, Ottosen C, Dueholm M, Schmidt

KL, Andersen AN, Ernst E. Two successful pregnancies following autotransplantation of

frozen/thawed ovarian tissue. Hum Reprod. 2008;23(10):2266–72. doi:


11. Aparicio IM, Garcia-Herreros M, O'Shea LC, Hensey C, Lonergan P, Fair T.

Expression, regulation, and function of progesterone receptors in bovine cumulus oocyte

complexes during in vitro maturation. Biol Reprod. 2011;84(5):910–21. doi:

10.1095/biolreprod.110.087411.

12. Ayensu-Coker L, Bauman D, Lindheim SR, Breech L. Fertility preservation in

pediatric, adolescent and young adult female cancer patients. Pediatr Endocrinol Rev.

2012;10(1):174–87.

13. Bedoschi G, Oktay K. Current approach to fertility preservation by embryo

cryopreservation. Fertil Steril. 2013;99(6):1496–502. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.03.020.

14. Bedoschi GM, de Albuquerque FO, Ferriani RA, Navarro PA. Ovarian stimulation

during the luteal phase for fertility preservation of cancer patients: case reports and review of

the literature. J Assist Reprod Genet. 2010;27(8):491–4. doi: 10.1007/s10815-010-9429-0.

15. Belli M, Vigone G, Merico V, Redi CA, Zuccotti M, Garagna S. Towards a 3D culture

of mouse ovarian follicles. Int J Dev Biol. 2012;56(10-12):931–7. doi:

10.1387/ijdb.120175mz.

16. Bian J, Li T, Ding C, Xin W, Zhu B, Zhou C. Vitreous cryopreservation of human

preantral follicles encapsulated in alginate beads with mini mesh cups. J Reprod Dev.

2013;59(3):288–95.

17. Cakmak H, Katz A, Cedars MI, Rosen MP. Effective method for emergency fertility

preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertil Steril. 2013;100(6):1673–80.

doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.

Anexos | 146

18. Callejo J, Salvador C, González-Nuñez S, Almeida L, Rodriguez L, Marqués L, Valls

A, Lailla JM. Live birth in a woman without ovaries after autograft of frozen-thawed ovarian

tissue combined with growth factors. J Ovarian Res. 2013;6(1):33. doi: 10.1186/1757-2215-6-

33.

19. Camboni A, Van Langendonckt A, Donnez J, Vanacker J, Dolmans MM, Amorim

CA. Alginate beads as a tool to handle, cryopreserve and culture isolated human

primordial/primary follicles. Cryobiology. 2013;67(1):64–9. doi:

10.1016/j.cryobiol.2013.05.002.

20. Cardoso F, Loibl S, Pagani O, Graziottin A, Panizza P, Martincich L, Gentilini O,

Peccatori F, Fourquet A, Delaloge S, Marotti L, Penault-Llorca F, Kotti-Kitromilidou AM,

Rodger A, Harbeck N; European Society of Breast Cancer Specialists. The European Society

of Breast Cancer Specialists recommendations for the management of young women with

breast cancer. Eur J Cancer. 2012;48(18):3355–77. doi: 10.1016/j.ejca.2012.10.004.

21. Chand AL, Harrison CA, Shelling AN. Inhibin and premature ovarian failure. Hum

Reprod Update. 2010;16(1):39 –50. doi: 10.1093/humupd/dmp031.

22. Chaves RN, Duarte AB, Rodrigues GQ, Celestino JJ, Silva GM, Lopes CA, Almeida

AP, Donato MA, Peixoto CA, Moura AA, Lobo CH, Locatelli Y, Mermillod P, Campello CC,

Figueiredo JR. The effects of insulin and follicle-simulating hormone (FSH) during in vitro

development of ovarian goat preantral follicles and the relative mRNA expression for insulin

and FSH receptors and cytochrome P450 aromatase in cultured follicles. Biol Reprod.

2012;87(3):69.

23. Chian RC, Uzelac PS, Nargund G. In vitro maturation of human immature oocytes for

fertility preservation. Fertil Steril. 2013;99(5):1173–81. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.01.141.

24. Chung K, Donnez J, Ginsburg E, Meirow D. Emergency IVF versus ovarian tissue

cryopreservation: decision making in fertility preservation for female cancer patients. Fertil

Steril. 2013;99(6):1534–42. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.11.057.

25. Cobo A, Domingo J, Perez S, Crespo J, Remohi J, Pellicer A. Vitrification: an

effective new approach to oocyte banking and preserving fertility in cancer patients. Clin

Transl Oncol 2008;10(5):268–73.

Anexos | 147

26. Cobo A, Garcia-Velasco JA, Domingo J, Remohí J, Pellicer A. Is vitrification of

oocytes useful for fertility preservation for age-related fertility decline and in cancer patients?.

Fertil Steril. 2013;99(6):1485–95. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.02.050.

27. Cobo A, Meseguer M, Remohi J, Pellicer A. Use of cryo-banked oocytes in an ovum

donation programme: a prospective, randomized, controlled, clinical trial. Hum Reprod

2010;25(9):2239–46. doi: 10.1093/humrep/deq146.

28. Combelles CM, Chateau G. The use of immature oocytes in the fertility preservation

of cancer patients: current promises and challenges. Int J Dev Biol. 2012;56(10-12):919–29.

doi: 10.1387/ijdb.120132cc.

29. Cortvrindt R, Hu Y, Smitz J. Recombinant luteinizing hormone as a survival and

differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating

hormone-supplemented mouse preantral follicle culture. Hum Reprod. 1998;13(5):1292–302.

30. Cortvrindt R, Smitz J. Early preantral mouse follicle in vitro maturation: oocyte

growth, meiotic maturation and granulosa-cell proliferation. Theriogenology.

1998;49(4):845–59.

31. Denschlag D, Reed NS, Rodolakis A. Fertility-sparing approaches in gynecologic

cancers: a review of ESGO task force activities. Curr Oncol Rep. 2012;14(6):535–8. doi:

10.1007/s11912-012-0261-9.

32. Dittrich R, Lotz L, Keck G, Hoffmann I, Mueller A, Beckmann MW, van der Ven H,

Montag M. Live birth after ovarian tissue autotransplantation following overnight

transportation before cryopreservation. Fertil Steril. 2012;97(2):387–90. doi:

10.1016/j.fertnstert.2011.11.047.

33. Dolmans MM, Luyckx V, Donnez J, Andersen CY, Greve T. Risk of transferring

malignant cells with transplanted frozen-thawed ovarian tissue. Fertil Steril.

2013;99(6):1514–22. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.03.027.

34. Dolmans MM, Marinescu C, Saussoy P, Van Langendonckt A, Amorim C, Donnez J.

Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic

leukemia is potentially unsafe. Blood. 2010;116(16):2908–14. doi: 10.1182/blood-2010-01-

265751.

Anexos | 148

35. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, Martinez-Madrid

B, Van Langendonckt A. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian

tissue. Lancet. 2004;364(9443):1405–10.

36. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, Martinez-Madrid

B, Van Langendonckt A. Restoration of ovarian function after orthotopic (intraovarian and

periovarian) transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a woman treated by bone

marrow transplantation for sickle cell anaemia: case report. Hum Reprod. 2006;21(1):183–8.

37. Donnez J, Dolmans MM, Martinez-Madrid B, Demylle D, Van Langendonkt A. The

role of cryopreservation for women prior to treatment of malignancy. Curr Opin Obstet

Gynecol. 2005;17(4):333–8.

38. Donnez J, Dolmans MM, Pellicer A, Diaz-Garcia C, Sanchez Serrano M, Schmidt KT,

Ernst E, Luyckx V, Andersen CY. Restoration of ovarian activity and pregnancy after

transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil


39. Donnez J, Dolmans MM. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue. Clin

Obstet Gynecol. 2010;53(4):787–96. doi: 10.1097/GRF.0b013e3181f97a55.

40. Donnez J, Dolmans MM. Preservation of fertility in females with haematological

malignancy. Br J Haematol. 2011;154(2):175–84. doi: 10.1111/j.1365-2141.2011.08723.x.

41. Donnez J, Jadoul P, Donnez O, Eyck AV, Squifflet J, Dolmans M. Cryopreservation

of ovarian tissue: an overview. In Chian R, Quinn P., editors. Fertility Cryopreservation.

Cambridge Cambridge University Press; 2010. pp. 189–99.

42. Donnez J, Jadoul P, Pirard C, Hutchings G, Demylle D, Squifflet J, Smitz J, Dolmans

MM. Live birth after transplantation of frozen-thawed ovarian tissue after bilateral

oophorectomy for benign disease. Fertil Steril. 2012;98(3):720–5. doi:

10.1016/j.fertnstert.2012.05.017.

43. Donnez J, Silber S, Andersen CY, Demeestere I, Piver P, Meirow D, Pellicer A,

Dolmans MM. Children born after autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue. a

review of 13 live births. Ann Med. 2011;43(6):437–50. doi: 10.3109/07853890.2010.546807.

Anexos | 149

44. Donnez J, Squifflet J, Van Erick AS, Demylle D, Jadoul P, Van Langendonckt A,

Dolmans MM. Restoration of ovarian function in orthotopically transplanted cryopreserved

ovarian tissue: a pilote experience. Reprod Biomed Online. 2008; 16(5): 694–704.

45. Duarte AB, Araújo VR, Chaves RN, da Silva GM, Luz VB, Haag KT, Magalhães-

Padilha DM, Almeida AP, Lobo CH, Campello CC, de Figueiredo JR. Insulin-like growth

factor II (IGF-II) and follicle stimulating hormone (FSH) combinations can improve the in

vitro development of grown oocytes enclosed in caprine preantral follicles. Growth Horm IGF

Res. 2013;23(1-2):37–44. doi: 10.1016/j.ghir.2012.12.002.

46. Eppig JJ, O'Brien M J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial

follicles. Biol Reprod. 1996; 54(1):197–207.

47. Fahy GM, Lilley TH, Linsdell H, Douglas MS, Meryman HT. Cryoprotectant toxicity

and cryoprotectant toxicity reduction: in search of molecular mechanisms. Cryobiology. 1990;

27(3):247–68.

48. Fahy GM. Vitrification: a new approach to organ cryopreservation. Prog Clin Biol

Res. 1986;224:305–35.

49. Fisher TE, Molskness TA, Villeda A, Zelinski MB, Stouffer RL, Xu J. Vascular

endothelial growth factor and angiopoietin production by primate follicles during culture is a

function of growth rate, gonadotrophin exposure and oxygen milieu. Hum Reprod.

2013;28(12):3263–70 doi: 10.1093/humrep/det337.

50. Greve T, Schimidt KT, Kristensen SG, Ernest E, Andersen CY. Evaluation of the

ovarian reserve in women transplanted with frozen and thawed ovarian cortical tissue. Fertil

Steril, 2012; 97(6):1394–8.e1. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.02.036.

51. Gutierrez CG, Ralph JH, Telfer EE, Wilmut I, Webb R. Growth and antrum formation

of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. Biol. Reprod. 2000;62(5):1322–8.

52. Guzman L, Ortega-Hrepich C, Albuz FK, Verheyen G, Devroey P, Smitz J, De Vos

M. Developmental capacity of in vitro-matured human oocytes retrieved from polycystic

ovary syndrome ovaries containing no follicles larger than 6 mm. Fertil Steril.

2012;98(2):503–7. e 1-2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.01.114.

Anexos | 150

53. Hashimoto S, Suzuki N, Yamanaka M, Hosoi Y, Ishizuka B, Morimoto Y. Effects of

vitrification solutions and equilibration times on the morphology of cynomolgus ovarian

tissues. Reprod Biomed Online. 2010;21(4):501–9. doi: 10.1016/j.rbmo.2010.04.029.

54. Heise M, Koepsel R, Russell AJ, McGee EA. Calcium alginate microencapsulation of

ovarian follicles impacts FSH delivery and follicle morphology. Reprod Biol Endocrinol.

2005;3:47.

55. Herraiz S, Novella-Maestre E, Rodríguez B, Díaz C, Sánchez-Serrano M, Mirabet V,

Pellicer A. Improving ovarian tissue cryopreservation for oncologic patients: slow freezing

versus vitrification, effect of different procedures and devices. Fertil Steril. 2013. pii: S0015-

0282(13)03269-X. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.11.016. [Epub ahead of print]

56. Hirao Y, Itoh T, Shimizu M, Iga K, Aoyagi K, Kobayashi M, Kacchi M, Hoshi H,

Takenouchi N. In vitro growth and development of bovine oocyte granulosa cell complexes

on the flat substratum effects of high polyvinyrrolidone concentration in culture medium. Biol

Reprod. 2004;70(1):83–91.

57. Hornick JE, Duncan FE, Shea LD, Woodruff TK. Isolated primate primordial follicles

require a rigid physical environment to survive and grow in vitro. Hum Reprod.

2012;27(6):1801–10. doi: 10.1093/humrep/der468.

58. Hovatta O, Silve R, Abir R, Krausz T, Winston RM. Extracellular matrix improves

survival of both stored and fresh human primordial and primary ovarian follicles in long term

culture. Human Reprod. 1997;12(5):1032–6.

59. Hovatta O, Wright C, Krausz T, Hardy K, Winston RM. Human primordial, primary

and secondary ovarian follicles in long-term culture: effect of partial isolation. Human

Reprod. 1999;14(10):2519–24.

60. Imesch P, Scheiner D, Xie M, Fink D, Macas E, Dubey R, Imthurn B. Developmental

potential of human oocytes matured in vitro followed by vitrification and activation. J

Ovarian Res. 2013; 18;6(1):30. [Epub ahead of print]

61. Isachenko V, Isachenko E, Keck G, Dittrich R, Montag M, van der Ven H, Mallmann

P, Müller A, Distler W, Beckmann MW, Rahimi G. First live birth in germany after re-

transplantation of cryopreserved ovarian tissue: original device for initiation of ice formation.

Clin Lab. 2012;58(9-10):933–8.

Anexos | 151

62. Jadoul P, Kim SS; ISFP Practice Committee (Kim S, Donnez J, Barri P, Pellicer A,

Patrizio P, Rosenwaks Z, Nagy P, Falcone T, Andersen C, Hovatta O, Wallace H, Meirow D,

Gook D, Kim SH, Tzeng CR, Suzuki S, Ishizuka B, Dolmans MM). Fertility considerations in

young women with hematological malignancies. J Assist Reprod Genet. 2012;29(6):479–87.

doi: 10.1007/s10815-012-9792-0.

63. Jeruss JS, Woodruff TK. Preservation of fertility in patients with cancer. N Engl J

Med. 2009;360(9):902–11. doi: 10.1056/NEJMra0801454.

64. Kawamura K, Cheng Y, Suzuki N, Deguchi M, Sato Y, Takae S, Ho C, Kawamura N,

Tamura M, Hashimoto S, Sugishita Y, Morimoto Y, Hosoi Y, Yoshioka N, Ishizuka B, Hsueh

AJ. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility

treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(43):17474–9. doi: 10.1073/pnas.1312830110.

65. Keros V, Xella S, Hultenby K, Pettersson K, Sheikhi M, Volpe A, Hreinsson J,

Hovatta O. Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian

tissue. Hum Reprod. 2009;24(7):1670–83. doi: 10.1093/humrep/dep079.

66. Khosravi F, Reid RL, Moini A, Abolhassani F, Valojerdi MR, Kan FW. In vitro

development of human primordial follicles to preantral stage after vitrification. J Assist

Reprod Genet. 2013;30(11):1397–406. doi: 10.1007/s10815-013-0105-z.

67. Kim SS. Assessment of long term endocrine function after transplantation of frozen-

thawed human ovarian tissue to the heterotopic site: 10 year longitudinal follow-up study. J

Assist Reprod Genet. 2012;29(6):489–93. doi: 10.1007/s10815-012-9757-3.

68. Kim SS. General overview of ovarian cryobanking. In. Donnez J, Kim SS., editors.

Principles and Practice of Fertility Preservation. 1st ed. Cambridge University Press;

2011:328–41.

69. Ksiazkiewicz LK. Recent achievements in in vitro culture and preservation of ovarian

follicles in mammals. Reprod Biol. 2006;6(1):3–16.

70. Kuwayama M, Vajta G, Kato O, Leibo SP. Highly efficient vitrification method for

cryopreservation of human oocytes. Reprod Biomed Online. 2005;11(3):300–8.

71. Lee DM, Ting A, Thomas C, Bishop C, Xu F, Zelinski M. Heterotopic transplants of

vitrified ovarian tissue in macaques: assessment of follicular function, embryonic

Anexos | 152

development and a novel microbubble assay for blood flow. 68th Annual Meeting, American

Society of Reproduction Medicine, San Diego, CA; Fertil Steril. 2012;98:S69,O–232.

72. Lee DM, Yeoman RR, Battaglia DE, Stouffer RL, Zelinski-Wooten MB, Fanton JW,

Wolf DP. Live birth after ovarian tissue transplant. Nature. 2004;428(6979):137–8.

73. Lenie S, Smitz J. Functional AR signaling is evident in an in vitro mouse follicle

culture bioassay that encompasses most stages of folliculogenesis. Biol Reprod.

2009;80(4):685–95. doi: 10.1095/biolreprod.107.067280.

74. Leporrier M, von Theobald P, Roffe JL, Muller G. A new technique to protect ovarian

function before pelvic irradiation. Heterotopic ovarian autotransplantation. Cancer.

1987;60(9):2201–4.

75. Levine J. Fertility preservation in children and adolescents with cancer. Minerva

Pediatr. 2011;63(1):49–59.

76. Li F, Turan V, De Sutter P, Oktay K. Sphingosine-1-phosphate prevents

chemotherapy-induced human primordial follicle death. Hum. Reprod. 2014; 29(1):107–13.

doi: 10.1093/humrep/det391.

77. Liu J, Van der Elst J, Van den Broecke R, Dhont M. Live offspring by in vitro

fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo

transplantation and in vitro maturation. Biol Reprod. 2001;64(1):171–8.

78. Lunardi FO, Araújo VR, Bernuci MP, Lunardi LO, Gonçalves RFB, Carvalho AA,

Figueiredo JR, Rodrigues APR. Restoring fertility after ovarian tissue cryopreservation: a half

century of researh. Zygote: 2012;21(4):394–405. doi: 10.1017/S0967199412000573.

79. Luyckx V, Scalercio S, Jadoul P, Amorim CA, Soares M, Donnez J, Dolmans MM.

Evaluation of cryopreserved ovarian tissue from prepubertal patients after long-term

xenografting and exogenous stimulation. Fertil Steril. 2013;100(5):1350–7. doi:

10.1016/j.fertnstert.2013.07.202.

80. Maltaris T, Dimmler A, Müller A, Hoffmann I, Beckmann MW, Dittrich R.

Comparison of two freezing protocols in an open freezing system for cryopreservation of rat

ovarian tissue. J Obstet Gynaecol Res. 2006.;32(3):273–9.

Anexos | 153

81. Matos MH, Lima-Verde IB, Luque MC, Maia JE Jr, Silva JR, Celestino JJ, Martins

FS, Ba´o SN, Lucci CM, Figueiredo JR. Essential role of follicle stimulating hormone in the

maintenance of caprine preantral follicle viability in vitro. Zygote. 2007;15(2):173–82.

82. McLaughlin M, Patrizio P, Kayisli U, Luk J, Thomson TC, Anderson RA, Telfer EE,

Johnson J. mTOR kinase inhibition results in oocyte loss characterized by empty follicles in

human ovarian cortical strips cultured in vitro. Fertil Steril. 2011;96(5):1154–9. e 1. doi:

10.1016/j.fertnstert.2011.08.040.

83. Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, Hardan I, Fridman E, Zalel Y, Schiff E, Dor J.

Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian

failure after chemotherapy. N Engl J Med. 2005;353(3):318–21.

84. Milenkovic M, Diaz-Garcia C, Wallin A, Brännström M. Viability and function of the

cryopreserved whole rat ovary: comparison between slow-freezing and vitrification. Fertil


85. Murray AA, Gosden RG, Allison V, Spears N. Effect of androgens on the

development of mouse follicles growing in vitro. J Reprod Fertil. 1998;113(1):27–33.

86. Nakamura Y, Tamura H, Takayama H, Kato H. Increased endogenous level of

melatonin in preovulatory human follicles does not directly influence progesterone

production. Fertil Steril. 2003;80(4):1012–6.

87. O'Brien MJ, Pendola JK, Eppig JJ. A revised protocol for in vitro development of

mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental

competence. Biol Reprod.2003; 68(5):1682–6.

88. Oktay K, Buyuk E, Rosenwaks Z, Rucinski J. A technique for transplantation of

ovarian cortical strips to the forearm. Fertil Steril. 2003;80(1):193–8.

89. Ozkaya E, San Roman G, Oktay K. Luteal phase GnRHa trigger in random start

fertility preservation cycles. J Assist Reprod Genet. 2012;29(6):503–5. doi: 10.1007/s10815-

012-9752-8.

90. Pfeifer S, Goldberg J, Lobo R, Thomas M, Pisarska M, Widra E, Licht M, Sandlow J,

Collins J, Cedars M, Vernon M, Davis O, Dumesic D, Gracia C, Catherino W, Odem R,

Thornton K, Rebar R, La Barbera A; The Practice Committee of the American Society for

Anexos | 154

Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or

gonadectomy: a committee opinion. Fertil Steril. 2013;100(5):1214–23. doi:

10.1016/j.fertnstert.2013.08.012.

91. Picton HM, Gosden RG. In vito growth of human primordial follicles from frozen

banked ovarian tissue. Mol Cell Endocrinol. 2000; 166(1): 27–35.

92. Picton HM, Harris SE, Muruvi W, Chambers EL. The in-vitro growth and maturation

of follicles. Reproduction. 2008;136(6):703–15. doi: 10.1530/REP-08-0290.

93. Prentice JR, Anzar M. Cryopreservation of mammalian oocyte for conservation of

animal genetics. Vet Med Int. 2010;2011. doi: 10.4061/2011/146405.

94. Puttabyatappa M, Brogan RS, Vandevoort CA, Chaffin CL. EGF-like ligands mediate

progesterone's anti-apoptotic action on macaque granulosa cells. Biol Reprod. 2013;88(1):18.

doi: 10.1095/biolreprod.112.103002.

95. Reddy J, Oktay K. Ovarian stimulation and fertility preservation with the use of

aromatase inhibitors in womenwith breast cancer. Fertil Steril. 2012;98(6):1363–9. doi:

10.1016/j.fertnstert.2012.09.022.

96. Revelli A, Marchino G, Dolfin E, Molinari E, Delle Piane L, Salvagno F, Benedetto C.

Live birth after orthotopic grafting of autologous cryopreserved ovarian tissue and

spontaneous conception in Italy. Fertil Steril. 2013;99(1):227–30. doi:

10.1016/j.fertnstert.2012.09.029.

97. Rodrigues JK, Xu J,Yeoman RR, Zelinski MB, Stouffer RL. Testosterone promotes

survival and growth of primate preantral follicles cultured individually in a three-dimensional

matrix. Fertil Steril Supplement, 2012;l98(6):S201–02.

98. Romero S, Smitz J. Exposing cultured mouse ovarian follicles under increased

gonadotropin tonus to aromatizable androgens influences the steroid balance and reduces

oocyte meiotic capacity. Endocrine. 2010;38(2):243–53. doi: 10.1007/s12020-010-9380-y.

99. Rosendahl M, Schmidt KT, Ernst E, Rasmussen PE, Loft A, Byskov AG, Andersen

AN, Andersen CY. Cryopreservation of ovarian tissue for a decade in Denmark: a view of

the technique. Reprod Biomed Online. 2011;22(2):162–71. doi:

10.1016/j.rbmo.2010.10.015.

Anexos | 155

100. Sanfilippo S, Canis M, Romero S, Sion B, Déchelotte P, Pouly JL, Janny L, Smitz J,

Brugnon F. Quality and functionality of human ovarian tissue after cryopreservation using an

original slow freezing procedure. J Assist Reprod Genet. 2013;30(1):25–34. doi:

10.1007/s10815-012-9917-5.

101. Saraiva MV, Celestino JJ, Araújo VR, Chaves RN, Almeida AP, Lima-Verde IB,

Duarte AB, Silva GM, Martins FS, Bruno JB, Matos MH, Campello CC, Silva JR, Figueiredo

JR. Expression of follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) in goat ovarian follicles and

the impact of sequential culture medium on in vitro development of caprine preantral follicles.

Zygote. 2011;19(3):205–14. doi: 10.1017/S0967199410000511.

102. Saraiva MV, Rossetto R, Brito IR, Celestino JJ, Silva CM, Faustino LR, Almeida AP,

Bruno JB, Magalhães DM, Matos MH, Campello CC, Figueiredo JR. Dynamic medium

produces caprine embryo from preantral follicles grown in vitro. Reprod Sci.

2010;17(12):1135–43. doi: 10.1177/1933719110379269.

103. Shimizu T, Kaji A, Murayama C, Magata F, Shirasuna K, Wakamiya K, Okuda K,

Miyamoto A. Effects of interleukin-8 on estradiol and progesterone production by bovine

granulosa cells from large follicles and progesterone production by luteinizing granulosa cells

in culture. Cytokine. 2012;57(1):175–81. doi: 10.1016/j.cyto.2011.11.007.

104. Silber SJ, DeRosa M, Pineda J, Lenahan K, Grenia D, Gorman K, Gosden RG. A

series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical

versus microvascular) and cryopreservation. Hum Reprod. 2008;23(7):1531–7. doi:


105. Silber SJ. Ovary cryopreservation and transplantation for fertility preservation.

Molecular Human Reproduction. 2012;18(2): 59–67. doi: 10.1093/molehr/gar082.

106. Smitz J, Cortvrindt R. First childbirth from transplanted cryopreserved ovarian tissue

brings hope for cancer survivors. Lancet. 2004;364(9443):1379–80.

107. Smitz J, Dolmans MM, Donnez J, Fortune JE, Hovatta O, Jewgenow K, Picton HM,

Plancha C, Shea LD, Stouffer RL, Telfer EE, Woodruff TK, Zelinski MB. Current

achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle

development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Update.

2010;16(4):395–414. doi: 10.1093/humupd/dmp056.

Anexos | 156

108. Smitz JE, Cortvrindt RG. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction.

2002;123(2):185–202.

109. Snyder KA. Oncofertility and the social sciences. In. Oncofertility, fertility

preservation for cancer survivors. Woodruff TK, Snyder KA., editors. New York: Springer.

2008;137–148.

110. Sonmezer M, Oktay K. Fertility preservation in female patients. Hum Reprod Update.

2004;10(3):251–66.

111. Sun J, Li X. Growth and antrum formation of bovine primary follicles in long-term

culture in vitro. Reprod Biol. 2013;13(3):221–8. doi: 10.1016/j.repbio.2013.06.003.

112. Suzuki N, Hashimoto S, Igarashi S, Takae S, Yamanaka M, Yamochi T, Takenoshita

M, Hosoi Y, Morimoto Y, Ishizuka B. Assessment of long-term function of heterotopic

transplants of vitrified ovarian tissue in cynomolgus monkeys. Hum Reprod.

2012;27(8):2420–9. doi: 10.1093/humrep/des178.

113. Syntichaki P, Tavernakis N. Death by necrosis: Uncontrollable catastrophe, or is there

order behind the chaos? EMBO reports. 2002;3(7):604–9.

114. Tambe SS, Nandedkar TD. Steroidogenesis in sheep ovarian antral follicles in culture

– time-course study and supplementation with a precursor. Steroids. 1993;58(8):379–83.

115. Telfer EE, Binnie JP, McCaffery FH, Campbell BK. In vitro development of oocytes

from porcine and bovine primary follicles. Mol Cell Endocrinol. 2000;25;163(1-2):117–23.

116. Telfer EE, McLaughlin M, Dung C, Thong KJ. A two step serum free culture system

supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin.

Hum Reprod. 2008;23(5):1151–8. doi: 10.1093/humrep/den070.

117. Telfer EE, Zelinski MB. Ovarian follicle culture: advances and challenges for human

and nonhuman primates. Fertil Steril. 2013;99(6):1523–33. doi:

10.1016/j.fertnstert.2013.03.043.

118. Telfer EE. In vitro development of pig preantral follicles. Reprod Suppl. 2001;58:81–

90.

Anexos | 157

119. Ting AY, Yeoman RR, Campos JR, Lawson MS, Mullen SF, Fahy GM, Zelinski MB.

Morphological and functional preservation of pre-antral follicles after vitrification of macaque

ovarian tissue in a closed system. Hum Reprod. 2013;28(5):1267–79. doi:


120. Ting AY, Yeoman RR, Lawson MS, Zelinski MB. In vitro development of secondary

follicles from cryopreserved rhesus macaque ovarian tissue after slow-rate freeze or

vitrification. Hum Reprod. 2011;26(9):2461–72. doi: 10.1093/humrep/der196.

121. Ting AY, Yeoman RR, Lawson MS, Zelinski MB. Synthetic polymers improve

vitrification outcomes of macaque ovarian tissue as assessed by histological integrity and the

in vitro development of secondary follicles. Cryobiology. 2012;65(1):1–11. doi:

10.1016/j.cryobiol.2012.04.005.

122. Vanacker J, Luyckx V, Amorim C, Dolmans MM, Van Langendonckt A, Donnez J,

Camboni A. Should we isolate human preantral follicles before or after cryopreservation of

ovarian tissue?. Fertil Steril. 2013;99(5):1363–8. e 2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.12.016.

123. Vanacker J, Luyckx V, Dolmans MM, Des Rieux A, Jaeger J, Van Langendonckt A,

Donnez J, Amorim CA. Transplantation of an alginate-matrigel matrix containing isolated

ovarian cells: first step in developing a biodegradable scaffold to transplant isolated preantral

follicles and ovarian cells. Biomaterials. 2012;33(26):6079–85. doi:

10.1016/j.biomaterials.2012.05.015.

124. Vasconcelos RB, Salles LP, Oliveira e Silva I, Gulart LV, Souza DK, Torres FA,

Bocca AL, Rosa e Silva AA. Culture of bovine ovarian follicle wall sections maintained the

highly estrogenic profile under basal and chemically defined conditions. Braz J Med Biol Res.

2013;46(8):700–7. doi: 10.1590/1414-431X20133024.

125. Wang X, Catt S, Pangestu M, Temple-Smith P. Live offspring from vitrified

blastocysts derived from fresh and cryopreserved ovarian tissue grafts of adult mice.

Reproduction. 2009;138(3):527–35. doi: 10.1530/REP-09-0148.

126. West ER, Xu M, Woodruff TK, Shea LD. Physical properties of alginate hydrogels

and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 2007;28(30):4439–48.

127. West ER, Zelinski MB, Kondapalli LA, Gracia C, Chang J, Coutifaris C, Critser J,

Stouffer RL, Shea LD, Woodruff TK. Preserving female fertility following cancer treatment:

Anexos | 158

current options and future possibilities. Pediatr Blood Cancer. 2009;53(2):289–95. doi:

10.1002/pbc.21999.

128. Wo JY, Viswanathan AN. Impact of radiotherapy on fertility, pregnancy, and neonatal

outcomes in female cancer patients. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009;73(5):1304–12. doi:

10.1016/j.ijrobp.2008.12.016.

129. Woodruff TK, Shea LD. A new hypothesis regarding ovarian follicle development:

ovarian rigidity as a regulator of selection and health. J Assist Reprod Genet. 2011;28(1):3–6.

doi: 10.1007/s10815-010-9478-4.

130. Woodruff TK. The emergence of a new interdiscipline: oncofertility. Cancer Treat

Res. 2007;138:3–11.

131. Xu J, Bernuci MP, Lawson MS, Yeoman RR, Fisher TE, Zelinski MB,2 Stouffer RL.

Survival, growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older

adult rhesus monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins

and insulin. Reproduction. 2010;140(5):685–97. doi: 10.1530/REP-10-0284.

132. Xu J, Lawson MS, Yeoman RR, Molskness TA, Ting AY, Stouffer RL, Zelinski MB.

Fibrin promotes development and function of macaque primary follicles during encapsulated

three-dimensional culture. Hum Reprod. 2013;28(8):2187–200. doi: 10.1093/humrep/det093.

133. Xu J, Lawson MS, Yeoman RR, Pau KY, Barrett SL, Zelinski MB, Stouffer RL.

Secondary follicle growth and oocyte maturation during encapsulated three-dimensional

culture in rhesus monkeys: effects of gonadotrophins, oxygen and fetuin. Hum. Reprod.

2011;26(5):1061–72. doi: 10.1093/humrep/der049.

134. Xu J, Xu M, Bernuci MP, Fisher TE, Shea LD, Woodruff TK, Zelinski MB, Stouffer

RL. Primate follicular development and oocyte maturation in vitro. Adv Exp Med Biol.

2013;761:43–67. doi: 10.1007/978-1-4614-8214-7_5.

135. Xu M, Barrett SL, West-Farrell E, Kondapalli LA, Kiesewetter SE, Shea LD,

Woodruff TK. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte

growth. Hum. Reprod. 2009;24(10):2531–40. doi: 10.1093/humrep/dep228.

136. Xu M, Fazleabas AT, Shikanov A, Jackson E, Barrett SL, Hirshfeld-Cytron J,

Kiesewetter SE, Shea LD, Woodruff TK. In vitro oocyte maturation and preantral follicle

Anexos | 159

culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod.

2011;84(4):689–97. doi: 10.1095/biolreprod.110.088674.

137. Xu M, Kreeger PK, Shea LD &Woodruff TK. Tissue-engineered follicles produce

live, fertile offspring. Tissue Eng. 2006;12(10):2739–46.

138. Xu M, West-Farrell ER, Stouffer RL, Shea LD, Woodruff TK, Zelinski MB.

Encapsulated three-dimensional culture supports development of nonhuman primate

secondary follicles. Biol Reprod. 2009;81(3):587–94. doi: 10.1095/biolreprod.

139. Yazdanpanah F, Khalili MA, Eftekhar M, Karimi H. The effect of vitrification on

maturation and viability capacities of immature human oocytes. Arch Gynecol Obstet.

2013;288(2):439–44. doi: 10.1007/s00404-013-2777-0.

140. Zelinski MB, Murphy MK, Lawson MS, Jurisicova A, Pau KY, Toscano NP, Jacob

DS, Fanton JK, Casper RF, Dertinger SD, Tilly JL. In vivo delivery of FTY720 prevents

radiation-induced ovarian failure and infertility in adult female nonhuman primates. Fertil

Steril. 2011;95(4):1443–5;e1-7. doi: 10.1016/ j.fertnstert.2011.01.012.

Journal of Assisted Reproduction and Genetics

IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATIONIN PATIENTS WITH CANCER

--Manuscript Draft--

Manuscript Number:

Full Title: IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATIONIN PATIENTS WITH CANCER

Article Type: Review Article

Keywords: follicle culture; fertility preservation; human oocyte; in vitro follicle maturation;ovarian cryopreservation; primordial follicle

Corresponding Author: Jhenifer Kliemchen Rodrigues, B.Sc., M.Sc.Pró-Criar Medicina Reprodutiva and FMRP/Universidade de São PauloBRAZIL

Corresponding Author SecondaryInformation:

Corresponding Author's Institution: Pró-Criar Medicina Reprodutiva and FMRP/Universidade de São Paulo

Corresponding Author's SecondaryInstitution:

First Author: Jhenifer Kliemchen Rodrigues, B.Sc., M.Sc.

First Author Secondary Information:

Order of Authors: Jhenifer Kliemchen Rodrigues, B.Sc., M.Sc.

Jing Xu, Ph.D.

Ricardo Mello Marinho, M.D., M.Sc., Ph.D.

João Pedro Junqueira Caetano, M.D., M.Sc., Ph.D.

Mary Beth Zelinski, Ph.D.

Richard Lee Stouffer, Ph.D.

Paula Andrea Navarro, M.D., M.Sc, Ph.D.

Order of Authors Secondary Information:

Abstract: The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservationoption for young women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer therapy. Currently, the only available option to restore fertility using thiscryostored/thawed tissue is transplantation, which involves the theoretical risk ofcancer recurrence since tumor cells may be reintroduced into the patient's body. Incontrast, in vitro maturation of cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization oftheir oocytes and embryo transfer, excludes this risk, and may provide a larger numberof mature oocytes. However, meiotically competent human oocytes with the ability tofully develop have yet to be obtained following the culture of preantral follicles. Thus,many challenges remain to develop a complete culture system that supports humanoocyte development. This review outlines the major advances in cryopreservation ofovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM) in nonhumanprimates and women, with emphasis on the remaining challenges before IFM can beapplied to fertility preservation in patients with cancer.

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1

IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN

PATIENTS WITH CANCER

Abstract

The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservation option for young

women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer therapy. Currently, the only

available option to restore fertility using this cryostored/thawed tissue is transplantation, which involves

the theoretical risk of cancer recurrence since tumor cells may be reintroduced into the patient’s body. In

contrast, in vitro maturation of cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization of their oocytes

and embryo transfer, excludes this risk, and may provide a larger number of mature oocytes. However,

meiotically competent human oocytes with the ability to fully develop have yet to be obtained following

the culture of preantral follicles. Thus, many challenges remain to develop a complete culture system that

supports human oocyte development. This review outlines the major advances in cryopreservation of

ovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM) in nonhuman primates and

women, with emphasis on the remaining challenges before IFM can be applied to fertility preservation in

patients with cancer.

Keywords: follicle culture; fertility preservation; human oocyte; in vitro follicle maturation; ovarian


Abstract

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

1

IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN

PATIENTS WITH CANCER

Abstract

The cryostorage of ovarian cortical biopsies may be offered as a fertility preservation option for young

women who will receive potentially sterilizing treatments, such as anti-cancer therapy. Currently, the only

available option to restore fertility using this cryostored/thawed tissue is transplantation, which involves

the theoretical risk of cancer recurrence since tumor cells may be reintroduced into the patient’s body. In

contrast, in vitro maturation of cryopreserved follicles, followed by in vitro fertilization of their oocytes

and embryo transfer, excludes this risk, and may provide a larger number of mature oocytes. However,

meiotically competent human oocytes with the ability to fully develop have yet to be obtained following

the culture of preantral follicles. Thus, many challenges remain to develop a complete culture system that

supports human oocyte development. This review outlines the major advances in cryopreservation of

ovarian tissue and the recent research on in vitro follicle maturation (IFM) in nonhuman primates and

women, with emphasis on the remaining challenges before IFM can be applied to fertility preservation in

patients with cancer.

Keywords: follicle culture; fertility preservation; human oocyte; in vitro follicle maturation; ovarian


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http://www.editorialmanager.com/jarg/viewRCResults.aspx?pdf=1&docID=3926&rev=0&fileID=50892&msid=BBA2D232-E0E8-45F4-917C-08BFA7E11608

2

Introduction

An early diagnosis, plus advances in cancer treatment, has increased the likelihood for

restoration of patient health and a consequent increased chance for long survival. However, the

cytotoxicity and cell damage caused by chemotherapeutic drugs and radiotherapy can impair the ovarian

reserve and normal function of the ovary, possibly leading to premature ovarian failure and infertility [75,

90, 105]. After cancer treatment, many women express the wish to become mothers [128], but may not

fulfill this dream because of impairment of their ovaries caused by cancer therapy. Consequently,

investigators are pursuing methods to either protect the ovaries from the cytotoxic effects of cancer

therapies [76, 140] or to restore ovarian function by promoting the development and function of follicles,

and thus maintain or restore fertility [45, 107, 123].

The current accepted approaches for the preservation of female fertility in clinical practice are

limited to protection of the ovaries against radiation (oophoropexy) [31, 74] or ovarian stimulation for

oocyte collection followed by oocyte and/or embryo cryopreservation [13, 20, 26, 27, 41, 95, 110]. Other

approaches for fertility preservation in cancer patients are being extensively discussed and investigated in

animal models and to a lesser extent in primates [12, 20, 63]. No “gold standard” technique is currently

available to be applied to all types of patients desiring this care. Some women are candidates for ovarian

stimulation and oocyte/embryo freezing before cancer treatment [26]. For this procedure, however, a

patient must have no urgent need to begin cancer treatment which allows enough time for the ovarian

stimulation protocol. A patient with a hormone (steroid)-dependent cancer may face a higher theoretical

risk of tumor growth during ovarian stimulation [14, 17, 89]. Moreover, a patient must have a partner as a

sperm donor in order to produce embryos [40]. There is an ongoing debate on whether to cryopreserve

mature oocytes and/or embryos following “emergency” ovarian stimulation or alternatively cryopreserve

ovarian tissue [24]/immature oocytes [23, 28, 60, 139] for future ART procedures to restore fertility.

For prepubertal girls and women who require immediate treatment or have a hormone-dependent

cancer, the ideal approach may be to freeze immature oocytes, isolated follicles or ovarian tissue [9, 12,

62, 75, 79]. Cryopreserved ovarian tissue could be transplanted back to the patient after cancer treatment

to promote timely puberty and fertility. Although this procedure is considered experimental, the results

are promising with 24 reported cases of human live births obtained following transplantation of

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

3

cryopreserved/thawed ovarian tissue [18, 35, 38, 41, 43, 61, 64, 83, 96]. However, tissue transplantation

raises the theoretical risk of cancer recurrence since untreated cells are reintroduced into the patient [34],

though thus far disease recurrence after transplantation has not been reported in humans [33].

Alternatively, in vitro follicle maturation (IFM), followed by in vitro fertilization and embryo transfer,

would eliminate this risk. In addition, this approach could be advantageous by being associated with a

greater possibility of achieving successful pregnancy, since a large number of oocytes could be obtained

from a small ovarian sample [117, 127, 130]. As such, cryopreservation of ovarian tissue samples

followed by IFM is an emerging option for the reestablishment of fertility, especially for patients

undergoing cancer treatment who are not suitable for ovarian stimulation (or it is contraindicated) or

cryopreservation of oocytes and/or embryos [63, 109].

IFM could be an excellent alternative to transplantation for patients after ovarian tissue thawing.

However, it is still considered to be an experimental technique. There are studies showing excellent

results from nonprimate species such as mice [46, 87], cows [51, 111], sheep [114], pigs [115, 118] and

goats [22, 45, 101], with reports of live births generated from oocytes originated from in vitro matured

follicles of mice [77, 137] (Table 1). However, there is a still limited success in producing early-stage

embryos in the studies on nonhuman primates, such as rhesus monkeys [119, 120, 121, 131, 132, 133,

138] and baboons [136]. Also, there are few reports to date describing human preantral follicle growth in

vitro [9, 16, 135], with no study yielding meiotically competent human oocytes (Table 1). Reasons for

limited success include: (1) the difficulty in obtaining nonhuman primate and human tissue for

experiments, (2) apparent species differences in the regulation of early folliculogenesis, and (3) the larger

size of antral follicle needed to generate a competent oocyte. Moreover, most studies to date have used

follicles from fresh, as opposed to cryopreserved/thawed, ovarian tissue.

The present paper reports the recent advances in the cryopreservation of ovarian tissue and the

first extensive efforts to perform research on IFM in nonhuman primates and humans, with emphasis on

the challenges on applying this emerging technique to fertility preservation in cancer patients.

Cryopreservation of ovarian tissue

The cryopreservation of ovarian tissue and the subsequent thawing following cancer treatment

for fertility preservation is an evolving technique which requires additional evaluation, including

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

4

characterization of the structure-function of cryo-thawed ovarian cortex. Based on extensive animal

studies, the technique was first applied to humans in 1996, with cryo-thawed ovarian tissue transplanted

into a patient who had received chemotherapy [41, 68]. Since then, clinical researchers have published

case reports and small experimental trials, including reimplantation of cryopreserved/thawed ovarian

tissue to the original site (orthotopic) and ectopic (heterotopic) sites such as the abdominal wall or the

forearm [10, 36, 37, 44, 67, 88]. Figure 1 illustrates fertility preservation options after the process of

ovarian tissue cryopreservation.

Successful return of ovarian function after reimplantation, albeit for a finite interval of time, was

reported. In some cases, oocyte aspiration was possible following stimulation of heterotopic ovary

implants [10, 36, 37, 44]. In 2004, the first spontaneous pregnancy resulting from orthotopic

transplantation was reported in Belgium [106]. To date, 24 live births have been reported using the

technique of ovarian tissue cryopreservation and subsequent thawing for transplantation [18, 38, 42,43,

61, 64, 96, 99]. As a result, various medical centers routinely perform ovarian tissue cryopreservation for

cancer patients around the world, with the subsequent plan to offer transplantation or other ARTs for

fertility improvement after treatment [50]. Currently, many patients are awaiting results from their

oncologists that validate reimplantation of ovarian tissue for improvement of endocrine and reproductive

function.

To date, the majority of livebirths in women originated from ovarian tissue cryopreserved by the

slow freezing technique [38]. The main characteristic of slow freezing is that the temperature is reduced

gradually. A freezing curve of 0.3°C per minute is usually applied to tissue samples such as ovarian

cortex [65, 100]. In order to obtain equilibrium among various cell types, low concentrations of

cryoprotectants are used in the attempt to prevent the formation of intracellular ice crystals [80].

However, the protocol may not completely eliminate water inside the ovarian cells, with the consequent

formation of ice crystals that generate cell damage.

Although slow freezing for ovarian tissue cryopreservation was initially used, the vitrification

technique recently gained attention because of encouraging results in oocyte and embryo cryopreservation

[1, 25, 26, 27, 70]. However, vitrification requires high concentrations of cryoprotectant agents that may

induce cytotoxicity and osmotic trauma [47]. High freezing velocity, necessary for oocyte and embryo

vitrification, is not required for ovarian tissue vitrification, in which slower cooling rates are needed to

prevent fracturing [48, 84, 119].

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

5

Successful ovarian tissue vitrification was reported using nonhuman primates. Heterotopic

transplants of vitrified/thawed ovarian tissue resulted in ovarian development in baboons [8], as well as

recovery of MII oocytes, and formation of early cleavage embryos in cynomolgus [112] and rhesus [71,

119, 120, 121] monkeys. Ongoing studies with human ovarian tissue are showing promising results with

the use of vitrification technique [55]. Notably, the first human live birth derived from ovarian tissue

vitrification and ART was recently reported [64].

Cryopreservation issues. Nevertheless, many parameters regarding cryoprocedures remain

poorly understood such as the ideal quantity of tissue sample to be cryopreserved, the choice of

cryoprotectants for executing the procedure and the time of tissue exposure, the choice of

cryopreservation protocol, and the use of open or closed system. Thus, studies, combined with rigorous

analyses comparing ovarian tissue structure-function before and after thawing, are needed to establish the

ideal technique and protocol of ovarian tissue cryopreservation.

There are ongoing studies defining the optimal conditions to vitrify macaque ovarian cortex by

testing different kind of cryoprotectants, cryoprotectant exposure times and systems (open or closed)

[119, 121]. Recently, a study reported that dense stroma and preantral follicles were preserved using a

vitrification solution containing 27% glycerol, 27% ethyleneglycol and 0.8% polymers with cooling in

liquid nitrogen vapor and a two-step warming. BrdU uptake was evident in granulosa cells of growing

follicles in fresh and vitrified tissues, showing viability in both tissue types [119]. Higher cooling and

warming rates led to fracturing, i.e., evidence that the temperature curve is a critical part of the whole

process. The use of polymers in the vitrification solution [53, 119], combined with advances on the

concentration of cryoprotectants and the use of a closed system to avoid contamination, has improved the

ovarian tissue vitrification technique, as demonstrated for the first time by the development of antral

follicles during three-dimensional (3D) culture using primate vitrified-thawed ovarian cortex [119].

Transplant issues. Transplant of ovarian tissue is also a technique that still needs detailed

investigation. There are few studies evaluating the consequences of tissue transplantation on ovarian

structure-function in humans or even following xenografting [7, 55]. The possible presence of malignant

cells in the grafted tissue, the use of specific components (e.g., matrix or growth factors) or procedures

that might reduce tissue ischemia and improve ovarian function, the definition and standardization of the

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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best transplant site, and the duration of resumed ovarian endocrine and gametogenic function are some of

the important points which require further studies.

Although transplantion of ovarian cortex using fresh monkey tissue [72], as well as fresh and

cryopreserved human tissue [32, 35, 64, 104], culminated in the birth of healthy offspring, only IFM has

the advantage of eliminating the reintroduction of cancer cells into the patients. Although studies have not

reported disease recurrence in transplant cases in humans [33, 34, 38, 79], a theoretical risk could not be

ruled out or minimized without further long term investigations [107].

IFM

Investigators have tried for several years [2, 3, 4, 30, 69, 102, 108, 117] to grow follicles in vitro

to examine follicular/oocyte development and function with some success. Two-dimensional (2D) culture

supports the complete growth of murine preantral follicles to the preovulatory stage which provide

meiotically competent oocytes [30, 46]. However, comparable results have not been achieved in other

mammals such as cattle [51], sheep [114], and humans [3]. Only in experiments with goats early embryos

were produced [102] (Table 1). One of the main reasons is that 2D culture does not maintain the natural

architecture of the antral follicle of large mammals [78]. During culture, granulosa cells become

disconnected from each other and from the oocyte because they spread on the bottom of the culture dish

[78].

Based on principles of tissue bioengineering, a 3D matrix capable of supporting follicle growth

was developed and demonstrated success in mice [54, 126, 137]. In mice, the 3D culture system permitted

the in vitro development of preantral follicles up to the preovulatory stage with the ability of producing

mature oocytes which, once inseminated, progressed to embryos and live births [137] (Table 1; Figure 2

A). Follicle encapsulation in alginate gel is able to mimic the characteristics of the extracellular matrix in

vivo, that facilitates the exchange of substances between the follicle and culture medium. In addition, the

flexibility of gel favors cell proliferation, which is essential for follicle survival and development [126,

134]. However, the stiffness of the gel may inhibit follicular growth and reduce steroidogenesis, as

reported for murine follicles embedded in 1 and 1.5% alginate gel. When 0.5% gel was used, oocytes

showing full growth were obtained [138].

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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In addition, this 3D matrix permits culture, and hence study, of individual follicles. Research

indicates that larger (secondary) preantral follicles do not survive when they are cultured in ovarian

cortical slices, despite their 3D architecture; as such, neighboring stroma or follicles may have an

inhibitory effect on follicular development. Added to this is the fact that oxygen diffusion becomes

limiting in isolated tissue slices that are placed in the incubator, so that only follicles on the edges of the

thinner slices can survive, resulting in loss of integrity and a negative impact on oocyte survival [59, 116].

Thus, culturing individual follicles without large portions of surrounding stroma may be a better baseline

of study [82, 116, 132]. This IFM approach allows studies to directly determine the effects of co-culture

using multiple follicles at known developmental stages or stromal cells.

Investigators are also testing the value of various matrix components in 3D follicle culture. For

example, collagen gel was used during cattle IFM and follicular differentiation was demonstrated. When

this method was applied with a combination of defined supplemented culture medium and micropore

membranes, a calf was obtained from immature follicles cultured for 14 days [56]. When a 3D alginate-

based matrix was applied to nonhuman primate (rhesus monkey) IFM, it was possible to grow individual

preantral (secondary) follicles collected from both the fresh and cryopreserved tissue, to the small antral

(~1 mm diameter) stage, with the production of appreciable levels of steroid hormones [119, 120, 121,

131, 133, 138]. Typically, the small antral follicles did not respond to a gonadotropin bolus by reinitiating

oocyte meiosis, but in rare (10%) instances a large, fast-grow follicle could provide a metaphase II (MII)-

stage oocyte that was fertilized in vitro [132, 133] (Table 1; Figure 2B).

The dynamics and regulation of folliculogenesis in primates is still poorly understood [21],

which challenges the rapid refinement and translation of the IFM technique for human follicles and their

oocytes. This technique of 3D follicle encapsulation is currently being used to test potential endocrine and

paracrine factors that may promote follicle development and oocyte maturation in primates. For example,

recent evidence supports the concept that appropriate levels of certain hormones are essential for the

growth and health of preantral follicles during culture [92, 97, 131, 133, 136].

Gonadotropic Hormones. The presence of exogenous follicle-stimulating hormone (FSH)

promotes preantral follicular growth in vitro, in addition to maintaining the morphological integrity of

preantral follicles in goats [80], and stimulating the activation of primordial follicles in monkeys [4, 5].

Studies demonstrated that FSH exposure increases the diameter of follicles in mice [137], monkeys [131,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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138] and humans [135] during 3D culture. In rhesus monkey, FSH was essential for the survival of

secondary follicles (125–225 µm in diameter) during 3D culture with alginate gel [131]. In contrast, FSH

did not show beneficial effects on baboon follicle growth in 3D culture [136]. This may be due to the

inclusion of matrigel in the matrix that contains unknown growth factors which could contribute to

follicle growth. These data indicate that 3D encapsulated follicles offer a valuable model for examining

FSH actions, including the expression and signaling of FSH receptors, during early follicle development.

Luteinizing hormone (LH) may play a role during follicle development in vitro particularly for

steroidogenesis in mammalian species such as mouse [15, 29], cattle [111], goats [10] and primates, but

the effects differed between slow- and fast-grow follicles from monkeys [131, 133]. The addition of LH

at day 30 of culture increased progesterone (P4), androstenedione (A4) and estradiol (E2) production by

slow-grow follicles between pre-LH (week 4) and post-LH (week 5) exposure in the presence of high-

dose FSH. In contrast, with low-dose FSH exposure, LH treatment increases P4 and A4, but not E2, at

week 5 compared to FSH alone. LH supplementation at day 30 has no effect on the patterns or levels of

steroids produced by fast-grow follicles during week 5 regardless of culture conditions [131, 133]. This

may be due to their high steroid production prior to the LH addition which prevents further stimulation.

Also, continuous LH exposure during monkey follicle culture decreased P4, without having effect on A4

and E2 production [138]. This may result from the desensitizing of LH receptors by continuous LH

exposure or not distinguishing slow- from fast-grow follicles. The LH responsiveness suggests the

presence of theca cells in in vitro-developed primate antral follicles, which was recently demonstrated

using immunocytochemical detection of steroidogenic enzymes in theca versus granulosa cells [132].

Further studies of the stage-specific actions of LH on primate follicles in vitro during growth and

maturation are warranted.

Steroid Hormones. It is also apparent that encapsulated follicles produce a number of endocrine

and local factors during culture, that may be vital to follicular growth and maturation. For example,

individually cultured macaque follicles differed in the ability to produce ovarian steroids, such as P4, A4,

and E2, which are detectable in the culture media. Steroid production correlated positively with follicle

growth rate and was promoted by exogenous gonadotropins [131, 133, 138]. Therefore, studies were

initiated to test whether these steroid hormones have local actions to mediate or modulate gonadotropin

actions in primate follicles.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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Notably, addition of a 3β-hydroxysteroid dehydrogenase inhibitor (Trilostane, TRL) to prevent

the conversion of pregnenolone to P4, as well as downstream production of androgens and estrogens,

reduced survival and growth of macaque secondary follicles during 3D culture. Co-administration of low

(10 ng/mL) or high (50 ng/mL) doses of testosterone increased follicle survival to control level. Follicles

that received testosterone reached similar sizes and percentage of antrum formation, as well as oocyte

meiotic maturation (MII stage), as control follicles [97]. Studies with rodents also showed that androgens

have distinct physiological functions within the growing follicle [73, 85, 98]. Immunohistochemical

analysis revealed that cytoplasmic androgen receptor (AR) protein translocated to the nucleus of

granulosa and theca cells in mouse follicles in response to endogenous androgen production by theca cells

during preantral follicular development and during the antral stage in vitro [73]. AR was also

differentially expressed in mural versus cumulus cells, implying an oocyte-mediated regulation [73].

Studies are ongoing to determine if P4 and/or estrogen have critical roles during folliculogenesis

in primates [86, 94] and other mammalian species, e.g., cow [11, 103, 124]. Dynamic changes were

observed in the protein expression of P4 receptors following in vitro maturation or in response to

supplementation with LH, FSH, or P4 suggesting an important role of P4 during bovine oocyte

maturation [11]. Detailed experiments using encapsulated macaque follicles should better define the

role(s) of each steroid hormone at various stages of follicle development and maturation in primates.

Recent studies also observed the stage-specific production of other local factors, e.g., the

angiogenic factors VEGF-A and ANGPTs [49, 131, 132] and AMH [131, 132, 133] by encapsulated

monkey follicles, plus the correlation of their production with follicle growth and oocyte maturation.

Further studies on these and other local factors will increase our understanding of the regulation and

function of folliculogenesis in primates and optimize conditions for IFM for clinical application.

IFM in humans. Efforts are addressing the promotion of IFM after obtaining human follicles

from both fresh [16, 107, 116] and cryopreserved [58, 91, 116] ovarian cortex or cryopreserved follicles

[16]. To date, only four studies have evaluated the applicability of the alginate matrix and 3D system to

human preantral follicle culture [9, 16, 122, 135]. Three experiments cultured primordial-stage follicles

for seven days, and the follicles [9, 122] and their oocytes [16] doubled in size. Follicle culture from

secondary stage permitted development up to the small antral stage and production of steroid hormones

[135] (Table 1; Figure 2C). These results are promising, but culture systems that support development of

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individual human preantral follicles still need refinement in many aspects, such as definition of the

developmental stage of harvested follicles, the culture media and hormones/local factors necessary for the

maintenance and growth of the follicle in vitro, and the interval of culture needed to produce antral

follicles with meiotically competent oocytes. Due to the large size (>10 mm diameter) of the dominant,

preovulatory follicle in women, it remains unclear if IFM can generate an antral follicle of sufficient

maturation to yield a fertilizable oocyte or subsequent developing embryo. However, live infants have

been derived from oocytes contained within follicles < 6 mm following IVM and ICSI [52],

demonstrating that the diameter of the human follicle capable of producing a competent oocyte is

considerably smaller than the preovulatory follicle.

Tests growing primate primordial and primary follicles are valuable since they are the most

abundant cohorts in the ovary, and are very resistant to damage by cryopreservation and

chemotherapeutics [57]. It was found that primate ovarian tissue can be maintained for up to 24 h at 4°C

without compromising tissue or follicle health. Also, follicle survival and morphology were more optimal

when isolated primordial follicles were cultured in 2% alginate compared with 0.5% alginate; apparently

primordial follicles require a rigid physical environment to survive and grow in vitro [57, 129]. Moreover,

primary follicle culture yielded a MII oocyte in rhesus monkeys [132]. Primordial and primary human

follicles, either fresh or after being cryopreserved, which were isolated and embedded in alginate can

survive and grow for seven days in culture [19, 122], indicating that human preantral follicles can be

successfully cryopreserved without impairing their ability to survive and grow in vitro.

Other groups are focusing on developing primordial follicles to the preantral stage from vitrified

tissue using cortical strips. A high proportion of viable follicles in vitrified ovarian strips were obtained

after culture for seven days, showing an increase in the percentage of secondary and primary follicles, and

a decrease in the number of primordial and transitory follicles [66]; however the proportions of the

different classes of follicles prior to in vitro culture are unknown. This could be an alternative, valuable

three-step approach which first uses culture of ovarian strips to obtain primary from primordial follicles,

followed by culture of isolated primary and secondary follicles, and then aspiration of the cumulus-oocyte

complex for final in vitro oocyte maturation. A culture system based on multiple steps (e.g., further in

vitro maturation of oocytes obtained from follicle culture [82, 116, 117]) may be necessary for full

development of human oocytes capable of normal fertilization and embryogenesis. The culture system is

expected to preserve the endocrine and paracrine functions of the follicles (which may be critical for

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oocyte development), as well as their ability to support the growth and both the nuclear and cytoplasmic

maturation of an oocyte. For the optimization of culture systems, further focus on cumulus-oocyte

development, which may not necessarily require a large follicular structure, is warranted rather than

simply appropriate maintenance of differentiated somatic cells in the follicle wall.

The IFM of cryopreserved human follicles, followed by ARTs, would be an alternative for the

restoration of fertility in cancer patients when tissue transplantation or other techniques cannot be applied,

i.e., young girls for which ovarian tissue cryopreservation is their only option. In addition, IFM provides a

valuable in vitro model to study the processes and regulation of primate folliculogenesis and permits the

mimicking of pathological conditions in vitro for the study of various types of ovarian diseases.

Conclusion

The current data support the applicability of ovarian tissue cryopreservation and possible future

use of the IFM technique for fertility preservation in cancer patients. Ovarian tissue cryopreservation is a

particularly important technique for children and prepubertal adolescents who are not candidates for

oocyte and/or embryo cryopreservation, which are well established techniques [26, 39, 79, 93, 113, 125].

An additional advantage of ovarian tissue cryopreservation is that it avoids certain religious, ethical or

legal issues, such as the fate of cryopreserved embryos in case of divorce, serious diseases or death of one

of the spouses [6].

In view of the growing number of studies on possible alternatives for fertility preservation in

cancer patients, ovarian tissue cryopreservation could be considered by oncologists, for later

transplantation or possible IFM. Thus, the real concern provoked by the possibility that patients may not

be able to have children would be considerably minimized, and the patients would have better

opportunities to be mothers in the future after the cancer treatment. Before cancer treatment (gonadotoxic

or radiation therapy, gonadectomy), patients could be provided with counseling regarding available and

future options for fertility preservation. Fertility preservation may be offered by programs in reproductive

medicine clinics in partnership with oncological care centers designed to support cancer patients [6, 90].

Although IFM offers promise, further advances are needed to understand and develop an in vitro

environment that promotes appropriate follicular growth and differentiation, plus the oocyte competence

necessary for fertilization and subsequent embryonic development. Thus, continued investigations on

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

12

nonprimate, primate and human folliculogenesis are critical for translation to improvement in fertility

treatment for women, including female cancer patients.

Acknowledgments

Acknowledgments to the support received from National Institute of Health (NIH) U54

RR024347, RL1HD058294, PL1EB008542 (The Oncofertility Consortium), NIH-NICHD through

cooperative agreement as part of the Specialized Cooperative Center Program in Reproduction and

Infertility Research U54HD018185, NIH ORWH/NICHD 2K12HD043488 (Building Interdisciplinary

Research Careers in Women's Health), NIH Fogarty International Center TW/HD-00668 (to P. Michael

Conn) and Oregon National Primate Research Center 8P51OD011092.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

13

REFERENCES

1. Abdelhafez FF, Desai N, Abou-Setta AM, Falcone T, Goldfarb J. Slow freezing, vitrification and

ultra-rapid freezing of human embryos: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed

Online. 2010;20(2):209–22. doi: 10.1016/j.rbmo.2009.11.013.

2. Abir R, Fisch B, Raz A, Nitke S, Ben-Rafael Z. Preservation of fertility in women undergoing

chemotherapy: current approach and future prospects. J Assist Reprod Genet. 1998;15(8):469–

77.

3. Abir R, Franks S, Mobberley MA, Moore PA, Margara RA, Winston RML. Mechanical isolation

and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertil. Steril. 1997;68(4):682–

8.

4. Abir R, Nitke S, Ben-Haroush A, Fisch B. In vitro maturation of human primordial ovarian

follicles: clinical significance, progress in mammals, and methods for growth evaluation. Histol

Histopathol. 2006;21(8):887–98.

5. Adhikari D. In vitro activation of dormant follicles for fertility preservation. Adv Exp Med Biol.

2013;761:29 – 42. doi: 10.1007/978-1-4614-8214-7_4.

6. Amato P, Brzyski R, Benward J, Stein A, Steinbock B, Wilder B, Reindollar R, Francis L,

Zoloth L, McCullough L, Gates E, Robertson J, Daar J, Fisseha S, Ralston S, Sauer M, Spillman

M, Rebar R, Tipton S; The Ethics Committee of the American Society for Reproductive

Medicine. Fertility preservation and reproduction in patients facing gonadotoxic therapies. Fertil


7. Amorim CA, Dolmans MM, David A, Jaeger J, Vanacker J, Camboni A, Donnez J, Van

Langendonckt A. Vitrification and xenografting of human ovarian tissue. Fertil Steril.

2012;98(5):1291–8.e1-2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.07.1109.

8. Amorim CA, Jacobs S, Devireddy RV, Van Langendonckt A, Vanacker J, Jaeger J, Luyckx V,

Donnez J, Dolmans MM. Successful vitrification and autografting of baboon (Papio anubis)

ovarian tissue. Hum Reprod. 2013;28(8):2146–56. doi: 10.1093/humrep/det103.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

14

9. Amorim CA, Van Langendonckt A, David A, Dolmans MM, Donnez J. Survival of human pre-

antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in

a calcium alginate matrix. Hum. Reprod. 2009;24(1):92–9. doi: 10.1093/humrep/den343.

10. Andersen CY, Rosendahl M, Byskov AG, Loft A, Ottosen C, Dueholm M, Schmidt KL,

Andersen AN, Ernst E. Two successful pregnancies following autotransplantation of

frozen/thawed ovarian tissue. Hum Reprod. 2008;23(10):2266–72. doi: 10.1093/humrep/den244.

11. Aparicio IM, Garcia-Herreros M, O'Shea LC, Hensey C, Lonergan P, Fair T. Expression,

regulation, and function of progesterone receptors in bovine cumulus oocyte complexes during

in vitro maturation. Biol Reprod. 2011;84(5):910–21. doi: 10.1095/biolreprod.110.087411.

12. Ayensu-Coker L, Bauman D, Lindheim SR, Breech L. Fertility preservation in pediatric,

adolescent and young adult female cancer patients. Pediatr Endocrinol Rev. 2012;10(1):174–87.

13. Bedoschi G, Oktay K. Current approach to fertility preservation by embryo cryopreservation.

Fertil Steril. 2013;99(6):1496–502. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.03.020.

14. Bedoschi GM, de Albuquerque FO, Ferriani RA, Navarro PA. Ovarian stimulation during the

luteal phase for fertility preservation of cancer patients: case reports and review of the literature.

J Assist Reprod Genet. 2010;27(8):491–4. doi: 10.1007/s10815-010-9429-0.

15. Belli M, Vigone G, Merico V, Redi CA, Zuccotti M, Garagna S. Towards a 3D culture of mouse

ovarian follicles. Int J Dev Biol. 2012;56(10-12):931–7. doi: 10.1387/ijdb.120175mz.

16. Bian J, Li T, Ding C, Xin W, Zhu B, Zhou C. Vitreous cryopreservation of human preantral

follicles encapsulated in alginate beads with mini mesh cups. J Reprod Dev. 2013;59(3):288–95.

17. Cakmak H, Katz A, Cedars MI, Rosen MP. Effective method for emergency fertility

preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertil Steril. 2013;100(6):1673–80.

doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.

18. Callejo J, Salvador C, González-Nuñez S, Almeida L, Rodriguez L, Marqués L, Valls A, Lailla

JM. Live birth in a woman without ovaries after autograft of frozen-thawed ovarian tissue

combined with growth factors. J Ovarian Res. 2013;6(1):33. doi: 10.1186/1757-2215-6-33.

19. Camboni A, Van Langendonckt A, Donnez J, Vanacker J, Dolmans MM, Amorim CA. Alginate

beads as a tool to handle, cryopreserve and culture isolated human primordial/primary follicles.

Cryobiology. 2013;67(1):64–9. doi: 10.1016/j.cryobiol.2013.05.002.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

15

20. Cardoso F, Loibl S, Pagani O, Graziottin A, Panizza P, Martincich L, Gentilini O, Peccatori F,

Fourquet A, Delaloge S, Marotti L, Penault-Llorca F, Kotti-Kitromilidou AM, Rodger A,

Harbeck N; European Society of Breast Cancer Specialists. The European Society of Breast

Cancer Specialists recommendations for the management of young women with breast cancer.

Eur J Cancer. 2012;48(18):3355–77. doi: 10.1016/j.ejca.2012.10.004.

21. Chand AL, Harrison CA, Shelling AN. Inhibin and premature ovarian failure. Hum Reprod

Update. 2010;16(1):39 –50. doi: 10.1093/humupd/dmp031.

22. Chaves RN, Duarte AB, Rodrigues GQ, Celestino JJ, Silva GM, Lopes CA, Almeida AP, Donato

MA, Peixoto CA, Moura AA, Lobo CH, Locatelli Y, Mermillod P, Campello CC, Figueiredo JR.

The effects of insulin and follicle-simulating hormone (FSH) during in vitro development of

ovarian goat preantral follicles and the relative mRNA expression for insulin and FSH receptors

and cytochrome P450 aromatase in cultured follicles. Biol Reprod. 2012;87(3):69.

23. Chian RC, Uzelac PS, Nargund G. In vitro maturation of human immature oocytes for fertility

preservation. Fertil Steril. 2013;99(5):1173–81. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.01.141.

24. Chung K, Donnez J, Ginsburg E, Meirow D. Emergency IVF versus ovarian tissue

cryopreservation: decision making in fertility preservation for female cancer patients. Fertil


25. Cobo A, Domingo J, Perez S, Crespo J, Remohi J, Pellicer A. Vitrification: an effective new

approach to oocyte banking and preserving fertility in cancer patients. Clin Transl Oncol

2008;10(5):268–73.

26. Cobo A, Garcia-Velasco JA, Domingo J, Remohí J, Pellicer A. Is vitrification of oocytes useful

for fertility preservation for age-related fertility decline and in cancer patients?. Fertil Steril.

2013;99(6):1485–95. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.02.050.

27. Cobo A, Meseguer M, Remohi J, Pellicer A. Use of cryo-banked oocytes in an ovum donation

programme: a prospective, randomized, controlled, clinical trial. Hum Reprod 2010;25(9):2239–

46. doi: 10.1093/humrep/deq146.

28. Combelles CM, Chateau G. The use of immature oocytes in the fertility preservation of cancer

patients: current promises and challenges. Int J Dev Biol. 2012;56(10-12):919–29. doi:

10.1387/ijdb.120132cc.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

16

29. Cortvrindt R, Hu Y, Smitz J. Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation

factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented

mouse preantral follicle culture. Hum Reprod. 1998;13(5):1292–302.

30. Cortvrindt R, Smitz J. Early preantral mouse follicle in vitro maturation: oocyte growth, meiotic

maturation and granulosa-cell proliferation. Theriogenology. 1998;49(4):845–59.

31. Denschlag D, Reed NS, Rodolakis A. Fertility-sparing approaches in gynecologic cancers: a

review of ESGO task force activities. Curr Oncol Rep. 2012;14(6):535–8. doi: 10.1007/s11912-

012-0261-9.

32. Dittrich R, Lotz L, Keck G, Hoffmann I, Mueller A, Beckmann MW, van der Ven H, Montag M.

Live birth after ovarian tissue autotransplantation following overnight transportation before

cryopreservation. Fertil Steril. 2012;97(2):387–90. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.11.047.

33. Dolmans MM, Luyckx V, Donnez J, Andersen CY, Greve T. Risk of transferring malignant cells

with transplanted frozen-thawed ovarian tissue. Fertil Steril. 2013;99(6):1514–22. doi:

10.1016/j.fertnstert.2013.03.027.

34. Dolmans MM, Marinescu C, Saussoy P, Van Langendonckt A, Amorim C, Donnez J.

Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia

is potentially unsafe. Blood. 2010;116(16):2908–14. doi: 10.1182/blood-2010-01-265751.

35. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, Martinez-Madrid B, Van

Langendonckt A. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue.

Lancet. 2004;364(9443):1405–10.

36. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, Martinez-Madrid B, Van

Langendonckt A. Restoration of ovarian function after orthotopic (intraovarian and periovarian)

transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a woman treated by bone marrow

transplantation for sickle cell anaemia: case report. Hum Reprod. 2006;21(1):183–8.

37. Donnez J, Dolmans MM, Martinez-Madrid B, Demylle D, Van Langendonkt A. The role of

cryopreservation for women prior to treatment of malignancy. Curr Opin Obstet Gynecol.

2005;17(4):333–8.

38. Donnez J, Dolmans MM, Pellicer A, Diaz-Garcia C, Sanchez Serrano M, Schmidt KT, Ernst E,

Luyckx V, Andersen CY. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

17

cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril.

2013;99(6):1503–13. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.03.030.

39. Donnez J, Dolmans MM. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue. Clin Obstet

Gynecol. 2010;53(4):787–96. doi: 10.1097/GRF.0b013e3181f97a55.

40. Donnez J, Dolmans MM. Preservation of fertility in females with haematological malignancy. Br

J Haematol. 2011;154(2):175–84. doi: 10.1111/j.1365-2141.2011.08723.x.

41. Donnez J, Jadoul P, Donnez O, Eyck AV, Squifflet J, Dolmans M. Cryopreservation of ovarian

tissue: an overview. In Chian R, Quinn P., editors. Fertility Cryopreservation. Cambridge

Cambridge University Press; 2010. pp. 189–99.

42. Donnez J, Jadoul P, Pirard C, Hutchings G, Demylle D, Squifflet J, Smitz J, Dolmans MM. Live

birth after transplantation of frozen-thawed ovarian tissue after bilateral oophorectomy for

benign disease. Fertil Steril. 2012;98(3):720–5. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.05.017.

43. Donnez J, Silber S, Andersen CY, Demeestere I, Piver P, Meirow D, Pellicer A, Dolmans MM.

Children born after autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue. a review of 13 live

births. Ann Med. 2011;43(6):437–50. doi: 10.3109/07853890.2010.546807.

44. Donnez J, Squifflet J, Van Erick AS, Demylle D, Jadoul P, Van Langendonckt A, Dolmans MM.

Restoration of ovarian function in orthotopically transplanted cryopreserved ovarian tissue: a

pilote experience. Reprod Biomed Online. 2008; 16(5): 694–704.

45. Duarte AB, Araújo VR, Chaves RN, da Silva GM, Luz VB, Haag KT, Magalhães-Padilha DM,

Almeida AP, Lobo CH, Campello CC, de Figueiredo JR. Insulin-like growth factor II (IGF-II)

and follicle stimulating hormone (FSH) combinations can improve the in vitro development of

grown oocytes enclosed in caprine preantral follicles. Growth Horm IGF Res. 2013;23(1-2):37–

44. doi: 10.1016/j.ghir.2012.12.002.

46. Eppig JJ, O'Brien M J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol

Reprod. 1996; 54(1):197–207.

47. Fahy GM, Lilley TH, Linsdell H, Douglas MS, Meryman HT. Cryoprotectant toxicity and

cryoprotectant toxicity reduction: in search of molecular mechanisms. Cryobiology. 1990;

27(3):247–68.

48. Fahy GM. Vitrification: a new approach to organ cryopreservation. Prog Clin Biol Res.

1986;224:305–35.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

18

49. Fisher TE, Molskness TA, Villeda A, Zelinski MB, Stouffer RL, Xu J. Vascular endothelial

growth factor and angiopoietin production by primate follicles during culture is a function of

growth rate, gonadotrophin exposure and oxygen milieu. Hum Reprod. 2013;28(12):3263–70

doi: 10.1093/humrep/det337.

50. Greve T, Schimidt KT, Kristensen SG, Ernest E, Andersen CY. Evaluation of the ovarian reserve

in women transplanted with frozen and thawed ovarian cortical tissue. Fertil Steril, 2012;

97(6):1394–8.e1. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.02.036.

51. Gutierrez CG, Ralph JH, Telfer EE, Wilmut I, Webb R. Growth and antrum formation of bovine

preantral follicles in long-term culture in vitro. Biol. Reprod. 2000;62(5):1322–8.

52. Guzman L, Ortega-Hrepich C, Albuz FK, Verheyen G, Devroey P, Smitz J, De Vos M.

Developmental capacity of in vitro-matured human oocytes retrieved from polycystic ovary

syndrome ovaries containing no follicles larger than 6 mm. Fertil Steril. 2012;98(2):503–7. e 1-

2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.01.114.

53. Hashimoto S, Suzuki N, Yamanaka M, Hosoi Y, Ishizuka B, Morimoto Y. Effects of vitrification

solutions and equilibration times on the morphology of cynomolgus ovarian tissues. Reprod

Biomed Online. 2010;21(4):501–9. doi: 10.1016/j.rbmo.2010.04.029.

54. Heise M, Koepsel R, Russell AJ, McGee EA. Calcium alginate microencapsulation of ovarian

follicles impacts FSH delivery and follicle morphology. Reprod Biol Endocrinol. 2005;3:47.

55. Herraiz S, Novella-Maestre E, Rodríguez B, Díaz C, Sánchez-Serrano M, Mirabet V, Pellicer A.

Improving ovarian tissue cryopreservation for oncologic patients: slow freezing versus

vitrification, effect of different procedures and devices. Fertil Steril. 2013. pii: S0015-

0282(13)03269-X. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.11.016. [Epub ahead of print]

56. Hirao Y, Itoh T, Shimizu M, Iga K, Aoyagi K, Kobayashi M, Kacchi M, Hoshi H, Takenouchi

N. In vitro growth and development of bovine oocyte granulosa cell complexes on the flat

substratum effects of high polyvinyrrolidone concentration in culture medium. Biol Reprod.

2004;70(1):83–91.

57. Hornick JE, Duncan FE, Shea LD, Woodruff TK. Isolated primate primordial follicles require a

rigid physical environment to survive and grow in vitro. Hum Reprod. 2012;27(6):1801–10. doi:

10.1093/humrep/der468.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22365339




19

58. Hovatta O, Silve R, Abir R, Krausz T, Winston RM. Extracellular matrix improves survival of

both stored and fresh human primordial and primary ovarian follicles in long term culture.

Human Reprod. 1997;12(5):1032–6.

59. Hovatta O, Wright C, Krausz T, Hardy K, Winston RM. Human primordial, primary and

secondary ovarian follicles in long-term culture: effect of partial isolation. Human Reprod.

1999;14(10):2519–24.

60. Imesch P, Scheiner D, Xie M, Fink D, Macas E, Dubey R, Imthurn B. Developmental potential

of human oocytes matured in vitro followed by vitrification and activation. J Ovarian Res. 2013;

18;6(1):30. [Epub ahead of print]

61. Isachenko V, Isachenko E, Keck G, Dittrich R, Montag M, van der Ven H, Mallmann P, Müller

A, Distler W, Beckmann MW, Rahimi G. First live birth in germany after re-transplantation of

cryopreserved ovarian tissue: original device for initiation of ice formation. Clin Lab. 2012;58(9-

10):933–8.

62. Jadoul P, Kim SS; ISFP Practice Committee (Kim S, Donnez J, Barri P, Pellicer A, Patrizio P,

Rosenwaks Z, Nagy P, Falcone T, Andersen C, Hovatta O, Wallace H, Meirow D, Gook D, Kim

SH, Tzeng CR, Suzuki S, Ishizuka B, Dolmans MM). Fertility considerations in young women

with hematological malignancies. J Assist Reprod Genet. 2012;29(6):479–87. doi:

10.1007/s10815-012-9792-0.

63. Jeruss JS, Woodruff TK. Preservation of fertility in patients with cancer. N Engl J Med.

2009;360(9):902–11. doi: 10.1056/NEJMra0801454.

64. Kawamura K, Cheng Y, Suzuki N, Deguchi M, Sato Y, Takae S, Ho C, Kawamura N, Tamura

M, Hashimoto S, Sugishita Y, Morimoto Y, Hosoi Y, Yoshioka N, Ishizuka B, Hsueh AJ. Hippo

signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl

Acad Sci U S A. 2013;110(43):17474–9. doi: 10.1073/pnas.1312830110.

65. Keros V, Xella S, Hultenby K, Pettersson K, Sheikhi M, Volpe A, Hreinsson J, Hovatta O.

Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue. Hum

Reprod. 2009;24(7):1670–83. doi: 10.1093/humrep/dep079.

66. Khosravi F, Reid RL, Moini A, Abolhassani F, Valojerdi MR, Kan FW. In vitro development of

human primordial follicles to preantral stage after vitrification. J Assist Reprod Genet.

2013;30(11):1397–406. doi: 10.1007/s10815-013-0105-z.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

20

67. Kim SS. Assessment of long term endocrine function after transplantation of frozen-thawed

human ovarian tissue to the heterotopic site: 10 year longitudinal follow-up study. J Assist

Reprod Genet. 2012;29(6):489–93. doi: 10.1007/s10815-012-9757-3.

68. Kim SS. General overview of ovarian cryobanking. In. Donnez J, Kim SS., editors. Principles

and Practice of Fertility Preservation. 1st ed. Cambridge University Press; 2011:328–41.

69. Ksiazkiewicz LK. Recent achievements in in vitro culture and preservation of ovarian follicles in

mammals. Reprod Biol. 2006;6(1):3–16.

70. Kuwayama M, Vajta G, Kato O, Leibo SP. Highly efficient vitrification method for

cryopreservation of human oocytes. Reprod Biomed Online. 2005;11(3):300–8.

71. Lee DM, Ting A, Thomas C, Bishop C, Xu F, Zelinski M. Heterotopic transplants of vitrified

ovarian tissue in macaques: assessment of follicular function, embryonic development and a

novel microbubble assay for blood flow. 68th Annual Meeting, American Society of

Reproduction Medicine, San Diego, CA; Fertil Steril. 2012;98:S69,O–232.

72. Lee DM, Yeoman RR, Battaglia DE, Stouffer RL, Zelinski-Wooten MB, Fanton JW, Wolf DP.

Live birth after ovarian tissue transplant. Nature. 2004;428(6979):137–8.

73. Lenie S, Smitz J. Functional AR signaling is evident in an in vitro mouse follicle culture

bioassay that encompasses most stages of folliculogenesis. Biol Reprod. 2009;80(4):685–95. doi:

10.1095/biolreprod.107.067280.

74. Leporrier M, von Theobald P, Roffe JL, Muller G. A new technique to protect ovarian function

before pelvic irradiation. Heterotopic ovarian autotransplantation. Cancer. 1987;60(9):2201–4.

75. Levine J. Fertility preservation in children and adolescents with cancer. Minerva Pediatr.

2011;63(1):49–59.

76. Li F, Turan V, De Sutter P, Oktay K. Sphingosine-1-phosphate prevents chemotherapy-induced

human primordial follicle death. Hum. Reprod. 2014; 29(1):107–13. doi:


77. Liu J, Van der Elst J, Van den Broecke R, Dhont M. Live offspring by in vitro fertilization of

oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation

and in vitro maturation. Biol Reprod. 2001;64(1):171–8.

78. Lunardi FO, Araújo VR, Bernuci MP, Lunardi LO, Gonçalves RFB, Carvalho AA, Figueiredo

JR, Rodrigues APR.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65



21

Restoring fertility after ovarian tissue cryopreservation: a half century of researh. Zygote:

2012;21(4):394–405. doi: 10.1017/S0967199412000573.

79. Luyckx V, Scalercio S, Jadoul P, Amorim CA, Soares M, Donnez J, Dolmans MM. Evaluation

of cryopreserved ovarian tissue from prepubertal patients after long-term xenografting and

exogenous stimulation. Fertil Steril. 2013;100(5):1350–7. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.202.

80. Maltaris T, Dimmler A, Müller A, Hoffmann I, Beckmann MW, Dittrich R. Comparison of two

freezing protocols in an open freezing system for cryopreservation of rat ovarian tissue. J Obstet

Gynaecol Res. 2006.;32(3):273–9.

81. Matos MH, Lima-Verde IB, Luque MC, Maia JE Jr, Silva JR, Celestino JJ, Martins FS, Ba´o

SN, Lucci CM, Figueiredo JR. Essential role of follicle stimulating hormone in the maintenance

of caprine preantral follicle viability in vitro. Zygote. 2007;15(2):173–82.

82. McLaughlin M, Patrizio P, Kayisli U, Luk J, Thomson TC, Anderson RA, Telfer EE, Johnson J.

mTOR kinase inhibition results in oocyte loss characterized by empty follicles in human ovarian

cortical strips cultured in vitro. Fertil Steril. 2011;96(5):1154–9. e 1. doi:

10.1016/j.fertnstert.2011.08.040.

83. Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, Hardan I, Fridman E, Zalel Y, Schiff E, Dor J. Pregnancy

after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after

chemotherapy. N Engl J Med. 2005;353(3):318–21.

84. Milenkovic M, Diaz-Garcia C, Wallin A, Brännström M. Viability and function of the

cryopreserved whole rat ovary: comparison between slow-freezing and vitrification. Fertil Steril.

2012;97(5):1176–82. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.01.123.

85. Murray AA, Gosden RG, Allison V, Spears N. Effect of androgens on the development of

mouse follicles growing in vitro. J Reprod Fertil. 1998;113(1):27–33.

86. Nakamura Y, Tamura H, Takayama H, Kato H. Increased endogenous level of melatonin in

preovulatory human follicles does not directly influence progesterone production. Fertil Steril.

2003;80(4):1012–6.

87. O'Brien MJ, Pendola JK, Eppig JJ. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes

from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol

Reprod.2003; 68(5):1682–6.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

22

88. Oktay K, Buyuk E, Rosenwaks Z, Rucinski J. A technique for transplantation of ovarian cortical

strips to the forearm. Fertil Steril. 2003;80(1):193–8.

89. Ozkaya E, San Roman G, Oktay K. Luteal phase GnRHa trigger in random start fertility

preservation cycles. J Assist Reprod Genet. 2012;29(6):503–5. doi: 10.1007/s10815-012-9752-8.

90. Pfeifer S, Goldberg J, Lobo R, Thomas M, Pisarska M, Widra E, Licht M, Sandlow J, Collins J,

Cedars M, Vernon M, Davis O, Dumesic D, Gracia C, Catherino W, Odem R, Thornton K,

Rebar R, La Barbera A; The Practice Committee of the American Society for Reproductive

Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: a

committee opinion. Fertil Steril. 2013;100(5):1214–23. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.08.012.

91. Picton HM, Gosden RG. In vito growth of human primordial follicles from frozen banked

ovarian tissue. Mol Cell Endocrinol. 2000; 166(1): 27–35.

92. Picton HM, Harris SE, Muruvi W, Chambers EL. The in-vitro growth and maturation of

follicles. Reproduction. 2008;136(6):703–15. doi: 10.1530/REP-08-0290.

93. Prentice JR, Anzar M. Cryopreservation of mammalian oocyte for conservation of animal

genetics. Vet Med Int. 2010;2011. doi: 10.4061/2011/146405.

94. Puttabyatappa M, Brogan RS, Vandevoort CA, Chaffin CL. EGF-like ligands mediate

progesterone's anti-apoptotic action on macaque granulosa cells. Biol Reprod. 2013;88(1):18.

doi: 10.1095/biolreprod.112.103002.

95. Reddy J, Oktay K. Ovarian stimulation and fertility preservation with the use of aromatase

inhibitors in womenwith breast cancer. Fertil Steril. 2012;98(6):1363–9. doi:

10.1016/j.fertnstert.2012.09.022.

96. Revelli A, Marchino G, Dolfin E, Molinari E, Delle Piane L, Salvagno F, Benedetto C. Live

birth after orthotopic grafting of autologous cryopreserved ovarian tissue and spontaneous

conception in Italy. Fertil Steril. 2013;99(1):227–30. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.09.029.

97. Rodrigues JK, Xu J,Yeoman RR, Zelinski MB, Stouffer RL. Testosterone promotes survival and

growth of primate preantral follicles cultured individually in a three-dimensional matrix. Fertil

Steril Supplement, 2012;l98(6):S201–02.

98. Romero S, Smitz J. Exposing cultured mouse ovarian follicles under increased gonadotropin

tonus to aromatizable androgens influences the steroid balance and reduces oocyte meiotic

capacity. Endocrine. 2010;38(2):243–53. doi: 10.1007/s12020-010-9380-y.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65



23

99. Rosendahl M, Schmidt KT, Ernst E, Rasmussen PE, Loft A, Byskov AG, Andersen AN,

Andersen CY. Cryopreservation of ovarian tissue for a decade in Denmark: a view of the

technique. Reprod Biomed Online. 2011;22(2):162–71. doi: 10.1016/j.rbmo.2010.10.015.

100. Sanfilippo S, Canis M, Romero S, Sion B, Déchelotte P, Pouly JL, Janny L, Smitz J, Brugnon F.

Quality and functionality of human ovarian tissue after cryopreservation using an original slow

freezing procedure. J Assist Reprod Genet. 2013;30(1):25–34. doi: 10.1007/s10815-012-9917-5.

101. Saraiva MV, Celestino JJ, Araújo VR, Chaves RN, Almeida AP, Lima-Verde IB, Duarte AB,

Silva GM, Martins FS, Bruno JB, Matos MH, Campello CC, Silva JR, Figueiredo JR.

Expression of follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) in goat ovarian follicles and the

impact of sequential culture medium on in vitro development of caprine preantral follicles.

Zygote. 2011;19(3):205–14. doi: 10.1017/S0967199410000511.

102. Saraiva MV, Rossetto R, Brito IR, Celestino JJ, Silva CM, Faustino LR, Almeida AP, Bruno JB,

Magalhães DM, Matos MH, Campello CC, Figueiredo JR. Dynamic medium produces caprine

embryo from preantral follicles grown in vitro. Reprod Sci. 2010;17(12):1135–43. doi:

10.1177/1933719110379269.

103. Shimizu T, Kaji A, Murayama C, Magata F, Shirasuna K, Wakamiya K, Okuda K, Miyamoto A.

Effects of interleukin-8 on estradiol and progesterone production by bovine granulosa cells from

large follicles and progesterone production by luteinizing granulosa cells in culture. Cytokine.

2012;57(1):175–81. doi: 10.1016/j.cyto.2011.11.007.

104. Silber SJ, DeRosa M, Pineda J, Lenahan K, Grenia D, Gorman K, Gosden RG. A series of

monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus

microvascular) and cryopreservation. Hum Reprod. 2008;23(7):1531–7. doi:


105. Silber SJ. Ovary cryopreservation and transplantation for fertility preservation. Molecular

Human Reproduction. 2012;18(2): 59–67. doi: 10.1093/molehr/gar082.

106. Smitz J, Cortvrindt R. First childbirth from transplanted cryopreserved ovarian tissue brings

hope for cancer survivors. Lancet. 2004;364(9443):1379–80.

107. Smitz J, Dolmans MM, Donnez J, Fortune JE, Hovatta O, Jewgenow K, Picton HM, Plancha C,

Shea LD, Stouffer RL, Telfer EE, Woodruff TK, Zelinski MB. Current achievements and future

research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65



24

implications for fertility preservation. Hum Reprod Update. 2010;16(4):395–414. doi:

10.1093/humupd/dmp056.

108. Smitz JE, Cortvrindt RG. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction.

2002;123(2):185–202.

109. Snyder KA. Oncofertility and the social sciences. In. Oncofertility, fertility preservation for

cancer survivors. Woodruff TK, Snyder KA., editors. New York: Springer. 2008;137–148.

110. Sonmezer M, Oktay K. Fertility preservation in female patients. Hum Reprod Update.

2004;10(3):251–66.

111. Sun J, Li X. Growth and antrum formation of bovine primary follicles in long-term culture in

vitro. Reprod Biol. 2013;13(3):221–8. doi: 10.1016/j.repbio.2013.06.003.

112. Suzuki N, Hashimoto S, Igarashi S, Takae S, Yamanaka M, Yamochi T, Takenoshita M, Hosoi

Y, Morimoto Y, Ishizuka B. Assessment of long-term function of heterotopic transplants of

vitrified ovarian tissue in cynomolgus monkeys. Hum Reprod. 2012;27(8):2420–9. doi:

10.1093/humrep/des178.

113. Syntichaki P, Tavernakis N. Death by necrosis: Uncontrollable catastrophe, or is there order

behind the chaos? EMBO reports. 2002;3(7):604–9.

114. Tambe SS, Nandedkar TD. Steroidogenesis in sheep ovarian antral follicles in culture – time-

course study and supplementation with a precursor. Steroids. 1993;58(8):379–83.

115. Telfer EE, Binnie JP, McCaffery FH, Campbell BK. In vitro development of oocytes from

porcine and bovine primary follicles. Mol Cell Endocrinol. 2000;25;163(1-2):117–23.

116. Telfer EE, McLaughlin M, Dung C, Thong KJ. A two step serum free culture system supports

development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Hum Reprod.

2008;23(5):1151–8. doi: 10.1093/humrep/den070.

117. Telfer EE, Zelinski MB. Ovarian follicle culture: advances and challenges for human and

nonhuman primates. Fertil Steril. 2013;99(6):1523–33. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.03.043.

118. Telfer EE. In vitro development of pig preantral follicles. Reprod Suppl. 2001;58:81–90.

119. Ting AY, Yeoman RR, Campos JR, Lawson MS, Mullen SF, Fahy GM, Zelinski MB.

Morphological and functional preservation of pre-antral follicles after vitrification of macaque

ovarian tissue in a closed system. Hum Reprod. 2013;28(5):1267–79. doi:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

25

120. Ting AY, Yeoman RR, Lawson MS, Zelinski MB. In vitro development of secondary follicles

from cryopreserved rhesus macaque ovarian tissue after slow-rate freeze or vitrification. Hum

Reprod. 2011;26(9):2461–72. doi: 10.1093/humrep/der196.

121. Ting AY, Yeoman RR, Lawson MS, Zelinski MB. Synthetic polymers improve vitrification

outcomes of macaque ovarian tissue as assessed by histological integrity and the in vitro

development of secondary follicles. Cryobiology. 2012;65(1):1–11. doi:

10.1016/j.cryobiol.2012.04.005.

122. Vanacker J, Luyckx V, Amorim C, Dolmans MM, Van Langendonckt A, Donnez J, Camboni A.

Should we isolate human preantral follicles before or after cryopreservation of ovarian tissue?.

Fertil Steril. 2013;99(5):1363–8. e 2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.12.016.

123. Vanacker J, Luyckx V, Dolmans MM, Des Rieux A, Jaeger J, Van Langendonckt A, Donnez J,

Amorim CA. Transplantation of an alginate-matrigel matrix containing isolated ovarian cells:

first step in developing a biodegradable scaffold to transplant isolated preantral follicles and

ovarian cells. Biomaterials. 2012;33(26):6079–85. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.05.015.

124. Vasconcelos RB, Salles LP, Oliveira e Silva I, Gulart LV, Souza DK, Torres FA, Bocca AL,

Rosa e Silva AA. Culture of bovine ovarian follicle wall sections maintained the highly

estrogenic profile under basal and chemically defined conditions. Braz J Med Biol Res.

2013;46(8):700–7. doi: 10.1590/1414-431X20133024.

125. Wang X, Catt S, Pangestu M, Temple-Smith P. Live offspring from vitrified blastocysts derived

from fresh and cryopreserved ovarian tissue grafts of adult mice. Reproduction.

2009;138(3):527–35. doi: 10.1530/REP-09-0148.

126. West ER, Xu M, Woodruff TK, Shea LD. Physical properties of alginate hydrogels and their

effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 2007;28(30):4439–48.

127. West ER, Zelinski MB, Kondapalli LA, Gracia C, Chang J, Coutifaris C, Critser J, Stouffer RL,

Shea LD, Woodruff TK. Preserving female fertility following cancer treatment: current options

and future possibilities. Pediatr Blood Cancer. 2009;53(2):289–95. doi: 10.1002/pbc.21999.

128. Wo JY, Viswanathan AN. Impact of radiotherapy on fertility, pregnancy, and neonatal outcomes

in female cancer patients. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009;73(5):1304–12. doi:

10.1016/j.ijrobp.2008.12.016.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

26

129. Woodruff TK, Shea LD. A new hypothesis regarding ovarian follicle development: ovarian

rigidity as a regulator of selection and health. J Assist Reprod Genet. 2011;28(1):3–6. doi:

10.1007/s10815-010-9478-4.

130. Woodruff TK. The emergence of a new interdiscipline: oncofertility. Cancer Treat Res.

2007;138:3–11.

131. Xu J, Bernuci MP, Lawson MS, Yeoman RR, Fisher TE, Zelinski MB,2 Stouffer RL. Survival,

growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older adult rhesus

monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins and insulin.

Reproduction. 2010;140(5):685–97. doi: 10.1530/REP-10-0284.

132. Xu J, Lawson MS, Yeoman RR, Molskness TA, Ting AY, Stouffer RL, Zelinski MB. Fibrin

promotes development and function of macaque primary follicles during encapsulated three-

dimensional culture. Hum Reprod. 2013;28(8):2187–200. doi: 10.1093/humrep/det093.

133. Xu J, Lawson MS, Yeoman RR, Pau KY, Barrett SL, Zelinski MB, Stouffer RL. Secondary

follicle growth and oocyte maturation during encapsulated three-dimensional culture in rhesus

monkeys: effects of gonadotrophins, oxygen and fetuin. Hum. Reprod. 2011;26(5):1061–72. doi:

10.1093/humrep/der049.

134. Xu J, Xu M, Bernuci MP, Fisher TE, Shea LD, Woodruff TK, Zelinski MB, Stouffer RL.

Primate follicular development and oocyte maturation in vitro. Adv Exp Med Biol.

2013;761:43–67. doi: 10.1007/978-1-4614-8214-7_5.

135. Xu M, Barrett SL, West-Farrell E, Kondapalli LA, Kiesewetter SE, Shea LD, Woodruff TK. In

vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum. Reprod.

2009;24(10):2531–40. doi: 10.1093/humrep/dep228.

136. Xu M, Fazleabas AT, Shikanov A, Jackson E, Barrett SL, Hirshfeld-Cytron J, Kiesewetter SE,

Shea LD, Woodruff TK. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-

phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 2011;84(4):689–97. doi:

10.1095/biolreprod.110.088674.

137. Xu M, Kreeger PK, Shea LD &Woodruff TK. Tissue-engineered follicles produce live, fertile

offspring. Tissue Eng. 2006;12(10):2739–46.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

27

138. Xu M, West-Farrell ER, Stouffer RL, Shea LD, Woodruff TK, Zelinski MB. Encapsulated three-

dimensional culture supports development of nonhuman primate secondary follicles. Biol

Reprod. 2009;81(3):587–94. doi: 10.1095/biolreprod.

139. Yazdanpanah F, Khalili MA, Eftekhar M, Karimi H. The effect of vitrification on maturation

and viability capacities of immature human oocytes. Arch Gynecol Obstet. 2013;288(2):439–44.

doi: 10.1007/s00404-013-2777-0.

140. Zelinski MB, Murphy MK, Lawson MS, Jurisicova A, Pau KY, Toscano NP, Jacob DS, Fanton

JK, Casper RF, Dertinger SD, Tilly JL. In vivo delivery of FTY720 prevents radiation-induced

ovarian failure and infertility in adult female nonhuman primates. Fertil Steril. 2011;95(4):1443–

5;e1-7. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.01.012.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS

WITH CANCER

Jhenifer Kliemchen Rodrigues (BSc, MSc)1,2,3, Jing Xu (PhD)2, Ricardo Mello Marinho (MD, MSc, PhD)3,4, João

Pedro Junqueira Caetano (MD, MSc, PhD)3,4, Mary B Zelinski (PhD)2, Richard L Stouffer (PhD)2, Paula Andrea

Navarro (MD, MSc, PhD)1

1 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo,

Ribeirão Preto/SP, Brazil

2 Division of Reproductive and Developmental Sciences, Oregon National Primate Research Center/ Oregon Health

& Science University, Beaverton/OR, United States of America

3 Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, Pró-Criar Medicina Reprodutiva, Belo Horizonte/MG, Brazil

4 Instituto de Pós-graduação – Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais, Belo Horizonte/MG, Brazil




Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, Zip code: 30140-082

Phone number: (55 – 31) 8325 – 7959/ (55 – 31) 2533 – 3815 / (55 – 31) 3292 – 5299

Fax number: (55 – 31) 3292 – 5299

[email protected] or [email protected]

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Figure 1. Fertility preservation for young girls and women.

Note: Parts of this figure have been re-printed with permission from The Oncofertility Consortium.

Colour Figure

Figure 2. IFM success in producing liveborn mice, nonhuman primate embryos and human antral follicles following 3D alginate culture of encapsulated secondary follicles.

Note: A: Mice at birth following preantral follicle development in vitro in 3D alginate matrix [137]; B: A morula stage embryo obtained from a macaque preantral follicle cultured in vitro in the 3D culture system [133]; C: A small antral follicle obtained from a human preantral follicle matured in a 3D system in vitro culture [135]. Figures are reproduced with permissions from the respective journals.

Table 1. Summary of progress in IFM using tissue from various species.

Animal model Culture type Result References

Mouse 2D Preovulatory follicles, MII Cortvrindt et al., 1998; Cortvrindt and Smitz, 2001

Mouse 2D Preovulatory follicles, MII, Live birth Eppig and O'Brien, 1996; Liu et al., 2001; O’Brien et al., 2003

Mouse 3D Preovulatory follicles Heise et al., 2005

Mouse 3D Preovulatory follicles, MII, Live birth Xu et al., 2006

Bovine (cows) 2D Antral follicles Gutierrez et al., 2000; Sun and Li, 2013

Bovine (cows) 2D Antral follicles, MII, Live birth Hirao et al., 2004

Ovine (sheep) 2D Antral follicles, steroidogenesis Tambe and Nandedkar, 1993

Porcine (pigs) 2D Antral follicles, MII Telfer et al., 2000

Caprine (goats) 2D Antral follicles, MII, Early embryo Saraiva et al., 2010; 2011; Chaves et al., 2012; Duarte et al., 2013

Nonhuman primate 3D Antral follicles Xu et al., 2009; Xu et al., 2010

Nonhuman primate 3D Antral follicles, MII Xu et al., 2011

Nonhuman primate 3D Antral follicles, MII, Early embryo Xu et al., 2011; 2013

Human 2D Antral follicles Abir et al., 1997

Human 3D Antral follicles Amorim et al., 2009; Bian et al., 2013

Human 3D Antral follicles, GV oocytes Xu et al., 2009 Legend: MII = metaphase II oocytes

Table

OXFORD UNIVERSITY PRESS LICENSE TERMS AND CONDITIONS

Feb 05, 2014

This is a License Agreement between Jing Xu ("You") and Oxford University Press ("Oxford University Press") provided by Copyright Clearance Center ("CCC"). The license consists of your order details, the terms and conditions provided by Oxford University Press, and the payment terms and conditions.

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License Number 3322640416281

License date Feb 05, 2014

Licensed content publisher Oxford University Press

Licensed content publication Human Reproduction

Licensed content title Fibrin promotes development and function of macaque primary follicles during encapsulated three-dimensional culture:

Licensed content author J. Xu, M.S. Lawson, R.R. Yeoman, T.A. Molskness, A.Y. Ting, R.L. Stouffer, M.B. Zelinski

Licensed content date 08/01/2013

Type of Use Journal/Magazine

Requestor type Academic/Educational institute

Format Print and electronic

Portion Figure/table

Number of figures/tables 1

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Order reference number

Title of new article IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER

Publication the new article is in


Publisher of new article Springer

Author of new article Jhenifer Kliemchen Rodrigues, Jing Xu, Ricardo Mello Marinho, João Pedro Junqueira Caetano, Mary B Zelinski, Richard L Stouffer, Paula Andrea Navarro

Expected publication date of new article

Mar 2014

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4. No alteration, omission or addition is made to the material without our written consent. Permission must be re-cleared with Oxford University Press if/when you decide to reprint.

5. The following credit line appears wherever the material is used: author, title, journal, year, volume, issue number, pagination, by permission of Oxford University Press or the sponsoring society if the journal is a society journal. Where a journal is being published on behalf of a learned society, the details of that society must be included in the credit line.

6. For the reproduction of a full article from an Oxford University Press journal for whatever purpose, the corresponding author of the material concerned should be informed of the proposed use. Contact details for the corresponding authors of all Oxford University Press journal contact can be found alongside either the abstract or full text of the article concerned, accessible from www.oxfordjournals.org Should there be a problem clearing these rights, please contact [email protected]

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OXFORD UNIVERSITY PRESS LICENSE TERMS AND CONDITIONS Feb 18, 2014

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License date Feb 18, 2014

Licensed content publisher

Oxford University Press

Licensed content publication

Human Reproduction

Licensed content title In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth:

Licensed content author Min Xu, Susan L. Barrett, Erin West-Farrell, Laxmi A. Kondapalli, Sarah E. Kiesewetter, Lonnie D. Shea, Teresa K. Woodruff

Licensed content date 10/01/2009

Type of Use Journal/Magazine

Requestor type Academic/Educational institute Format Print and electronic

Portion Figure/table

Number of figures/tables 1

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Author of this OUP article No

Order reference number None

Title of new article IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER

Publication the new article is in


Publisher of new article Springer

Author of new article Jhenifer Kliemchen Rodrigues, Jing Xu, Ricardo Mello Marinho, João Pedro Junqueira Caetano, Mary B Zelinski, Richard L Stouffer, Paula Andrea Navarro

Expected publication date Mar 2014



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10. Oxford University Press reserves all rights not specifically granted in the combination of (i) the license details provided by you and accepted in the course of this licensing transaction, (ii) these terms and conditions and (iii) CCC’s Billing and Payment terms and conditions.

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MARY ANN LIEBERT, INC. LICENSE TERMS AND CONDITIONS Feb 18, 2014

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Licensed content title Tissue-Engineered Follicles Produce Live, Fertile Offspring

Licensed content author Min Xu, Pamela K. Kreeger, Lonnie D. Shea et al.

Licensed content date Oct 1, 2006 Volume number 12 Issue number 10 Type of Use Journal/Magazine Requestor type academic Format print and electronic Portion charts/graphs/tables Number of charts/graphs/tables 1 Translating... no Distribution quantity 1000 Order reference number

Title of the article

IN VITRO FOLLICLE MATURATION: POTENTIAL FOR FERTILITY PRESERVATION IN PATIENTS WITH CANCER

Publication the article is in Journal of Assisted Reproduction and Genetics

Publisher of the article Springer

Author of the article Jhenifer Kliemchen Rodrigues, Jing Xu, Ricardo Mello Marinho, João Pedro Junqueira Caetano, Mary B Zelinski,



Richard L Stouffer, Paula Andrea Navarro

Expected publication date Mar 2014 Estimated size of the article (pages)

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Mary Ann Liebert, Inc. publishers Terms and Conditions

1. Introduction

The publisher for this copyrighted material is Mary Ann Liebert, Inc. publishers. By clicking "accept" in connection with completing this licensing transaction, you agree that the following terms and conditions apply to this transaction (along with the Billing and Payment terms and conditions established by Copyright Clearance Center, Inc. ("CCC"), at the time that you opened your Rightslink account and that are available at any time at https://myaccount.copyright.com).

2. Limited License

Publisher hereby grants to you a non-exclusive license to use this material. Licenses are for one-time use only with a maximum distribution equal to the number that you identified in the licensing process and any electronic posting is limited to the period committed to at the time of purchase.

3. Geographic Rights: Scope

Licenses may be exercised anywhere in the world.

4. Jurisdiction:

This agreement shall be governed by and construed in accordance with the laws of the state of New York, without giving effect to any principles of conflicts of law. If any provision of this agreement shall be unlawful, void, or for any reason unenforceable, then that provision shall be deemed severable from this agreement and shall not affect the validity and enforceability of any remaining provisions. This is the entire agreement between the parties relating to the subject matter herein and

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shall not be modified except in writing, signed by both parties.

5. Altering/Modifying Material: Not Permitted

You may not alter or modify the material in any manner without the explicit approval of the Publisher.

6. Reservation of Rights

Publisher reserves all rights not specifically granted in the combination of (i) the license details provided by you and accepted in the course of this licensing transaction, (ii) these terms and conditions and (iii) CCC's Billing and Payment terms and conditions.

7. License Contingent on Payment

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8. Copyright Notice: Disclaimer

You must include the following copyright and permission notice in connection with any reproduction of the licensed material:" The publisher for this copyrighted material is Mary Ann Liebert, Inc. publishers."

9. Warranties: None

Publisher makes no representations or warranties with respect to the licensed material and adopts on its own behalf the limitations and disclaimers established by CCC on its behalf in its Billing and Payment terms and conditions for this licensing transaction.

10. Indemnity

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11. No Transfer of License

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12. No Amendment Except in Writing

This license may not be amended except in writing signed by both parties (or, in the case of publisher, by CCC on publisher's behalf).

13. Objection to Contrary Terms

Publisher hereby objects to any terms contained in any purchase order, acknowledgment, check endorsement or other writing prepared by you, which terms are inconsistent with these terms and conditions or CCC's Billing and Payment terms and conditions. These terms and conditions, together with CCC's Billing and Payment terms and conditions (which are incorporated herein), comprise the entire agreement between you and publisher (and CCC) concerning this licensing transaction. In the event of any conflict between your obligations established by these terms and conditions and those established by CCC's Billing and Payment terms and conditions, these terms and conditions shall control.

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February 17, 2014

The Oncofertility Consortium gives permission to Jhenifer Kliemchen Rodrigues and co-workers to use the figures attached, or part of them, to represent the process of fertility preservation for cancer patients. These were previously printed and distributed by the Oncofertility Consortium for use in educational folders and handouts for researchers, medical professionals, and patients.

Sincerely,

Teresa K. Woodruff, Ph.D. Director, Oncofertility Consortium Thomas J. Watkins Professor of Obstetrics and Gynecology Northwestern University



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Documents

Jhenifer Kliemchen Rodrigues - Coordenação de Aperfeicoamento de Pessoal de …capes.gov.br/images/stories/download/pct/premios/226771.pdf · 2016-01-19 · Agradeço a minha tia