JOURNAL READING

PERBEDAAN ANTARA KANKER MULUT DAN KANKER

FARING DAN LARING PADA TINGKAT MOLEKULER

Disusun Oleh :

Ahimsa Yoga Anindita G0007030

Judo Yustanto Kahono G0007091

Kirana Mustikasari G0007095

Jimmy Tanamas G0007199

Pembimbing :

dr. Sudarman, Sp. THT-KL (K)

KEPANITERAAN KLINIK ILMU KESEHATAN THT-KL

FAKULTAS KEDOKTERAN UNS/RSUD DR MOEWARDI

S U R A K A R T A

2012

PERBEDAAN ANTARA KANKER MULUT DAN KANKER FARING DAN

LARING PADA TINGKAT MOLEKULER

Kiyoto Shiga1, Takenori Ogawa2, Katsunori Katagiri1, Fumiaki Yoshida2, Masaru Tateda2, Kazuto Matsuura3 dan Toshimitsu Kobayashi2

ABSTRAK

Untuk menjelaskan perbedaan antara kanker mulut dan kanker faring dan

laring, kami menyelidiki perubahan genetik dan epigenetik pada jenis-jenis tumor

tersebut menggunakan metode biologi molekuler. Metilasi pada bagian promotor dari

gen penekan tumor p16 telah diteliti dengan menggunakan Polymerase Chain

Reaction (PCR) khusus metilasi pada spesimen dari 47 karsinoma sel skuamosa oral,

39 karsinoma sel skuamosa faring dan 35 karsinoma sel skuamosa laring. Spesimen

ini juga ditandai dengan hilangnya alel dari daerah tertentu dari genom, yaitu 3p22,

9p21 dan 17p13 (TP53). Frekuensi metilasi pada bagian promotor dari gen p16 pada

kanker lidah (35,3%) secara signifikan lebih tinggi daripada kanker faring (12,8%)

dan laring (11,4%) (masing-masing p = 0,046 dan p = 0,039). Frekuensi metilasi pada

tumor pasien perempuan (47,1%) lebih tinggi secara bermakna dibandingkan dengan

tumor pada pasien laki-laki (15,4%) (p = 0,0067). Sebaliknya, frekuensi hilangnya

heterozigositas (LOH) di 3p21 pada kanker faring (66,7%) secara signifikan lebih

tinggi daripada kanker mulut (20,0%) (p = 0,0006). Frekuensi LOH pada 17p13 pada

kanker faring (71,0%) dan laring (73,1%) juga secara signifikan lebih tinggi daripada

kanker mulut (36,1%) (masng-masing p = 0,009 dan p = 0,009). Hasil penelitian kami

menunjukkan bahwa ada perbedaan yang nyata dalam frekuensi dari hipermetilasi

gen dan kehilangan alel antara kanker mulut dan kanker faring dan laring. Meskipun

semua tumor didiagnosis sebagai karsinoma sel skuamosa, proses karsinogenesis

mungkin berbeda pada tumor yang terletak di berbagai bagian kepala dan leher.

Hilangnya fungsi gen supresor tumor dengan hilangnya alelik menimbulkan tumor

pada faring dan laring, sedangkan hilangnya fungsi akibat metilasi dari daerah

promoter dari gen-gen, terkait dengan karsinogenesis dalam rongga mulut.

Kata kunci: kanker kepala dan leher, hilangnya heterozigositas, metilasi DNA,

lokasi tumor, jenis kelamin.

PENDAHULUAN

Karsinoma sel skuamosa kepala dan leher (HNSCCs) memiliki manifestasi

klinis yang beragam menurut daerah asalnya, yaitu dari berbagai mukosa bagian

kepala dan leher. Namun, faktor genetik dan epigenetik yang terlibat dalam

karsinogenesis HNSCC di berbagai jaringan belum secara menyeluruh dipelajari dan

dievaluasi. Meskipun ada banyak penelitian pada hipermetilasi daerah promotor gen

penekan tumor, terutama p16 (1-9), perbedaan dalam frekuensi metilasi di antara

tempat kanker di daerah kepala dan leher belum sepenuhnya dijelaskan, sebagian

dikarenakan rendahnya jumlah sampel. Namun, kami sebelumnya telah menunjukkan

perbedaan frekuensi hilangnya alel dari daerah-daerah tertentu pada genom antara

kanker mulut dan kanker faring dan laring (10).

Untuk menjelaskan perbedaan antara kanker mulut dan kanker faring dan

laring, kami menyelidiki perubahan genetik dan epigenetik dalam tumor

menggunakan metode biologi molekuler. Kami menganalisis hipermetilasi daerah

promotor dari gen p16 penekan tumor sebagai perubahan epigenetik. Kami juga

memeriksa hilangnya alels dari daerah tertentu dari genom, yaitu 3p21, 9p21 dan

17p13 (TP53) sebagai perubahan genetik. Membandingkan hasil dari kedua

pendekatan, mengungkapkan temuan baru mengenai perbedaan antara kanker mulut

dan kanker faring dan laring.

MATERIAL DAN METODE

Pasien dan spesimen jaringan

Tumor primer diangkat melalui pembedahan atau diperoleh dari biopsi

sebelum perawatan selama periode antara Mei 1994 dan November 2000, mengikuti

protokol yang disetujui di Pusat Kanker Miyagi. Gambaran klinis pasien dirangkum

dalam Tabel I.

Penelitian ini disetujui oleh Dewan Tinjauan Kelembagaan Universitas

Tohoku dan Pusat Kanker Miyagi. Spesimen bedah diperoleh berdasarkan

persetujuan, dan persetujuan tertulis diperoleh dari semua pasien.

Tabel 1. Gambaran Klinis pada Pasien dan Lokasi Tumor

Rongga Mulut FaringLaring Nilai p

Keseluruhan Lidah DM MB Gusi Keseluruhan Meso Hipo

Usia<45 6 6 0 0 0 0 0 0 2 0,021 (RM vs F)>45 41 28 6 4 3 39 14 25 33

Jenis kelaminWanita 14 9 0 4 1 2 0 1 1 0,0034 (RM vs L)

Laki-laki 33 25 6 0 2 37 14 24 34 0,0018 (RM vs L)Ukuran tumor

T1 8 6 2 0 0 1 0 1 8 TST2 20 14 3 2 1 19 4 15 14T3 13 10 1 2 0 9 6 3 6T4 3 1 0 0 2 9 4 5 6

Keterlibatan Limfonodi N0 vs lainnyaN0 28 20 4 2 2 10 2 8 29 0,0016 (RM vs F)N1 8 6 1 1 0 7 3 4 1 <0,0001 (F vs L)N2 10 7 1 1 1 20 9 11 4N3 1 1 0 0 0 2 0 2 1

Stadium I dan II vs III dan IVI 8 7 1 0 0 1 0 1 7 0,0004 (RM vs F)II 17 12 3 1 1 5 0 5 11 0,0009 (F vs L)III 10 7 1 2 0 9 4 5 6IV 12 8 1 1 2 24 10 14 11

Total 47 34 6 4 3 39 14 25 35

Pasien dengan metastasis limfonodi rekurens tidak dimasukkan dalam klasifikasi tersebut. Meso : mesofaring, Hipo : hipofaring, TS : tidak signifikan, DM : Dasar mulut, MB : mukosa buccal, RM : rongga mulut, F : faring, L : laring.

Persiapan DNA

DNA genomik diekstraksi dari sampel jaringan beku menggunakan proteinase

K digestion dan ekstraksi fenol sesuai dengan metode standar (11,12).

Deteksi hipermetilasi di daerah promotor gen p16

Deteksi hipermetilasi gen dilakukan dengan menggunakan natrium bisulfit

untuk modifikasi DNA diikuti oleh metilasi khusus PCR (MSP). Modifikasi DNA

dilakukan dengan menggunakan CpGenome DNA Modification Kit (Chemicon

International, Temecula, CA, USA). Urutan dari primer yang digunakan adalah

sebagai berikut: p16U forward, 5'-TTATT AGAGGGTGGGGTGGATTGT-3 'dan

reverse, 5'-CAACCCC AAACCACAACCATAA-3'; p16M forward, 5'-TTATTAGA

GGGTGGGCGGATCGC-3 'dan reverse, 5'-GACCCCGAACC GCGACCGTAA-3 '.

Suhu anil (pijar) dari reaksi PCR untuk p16U dan p16M adalah masing-masing 60

dan 69 ˚C. Produk PCR yang dimurnikan dipisahkan dengan elektroforesis pada gel

agarosa 3% yang mengandung 1 mg / ml etidium bromida.

Deteksi hilangnya alel

Penanda polimorfik, D3S1067, IFNA, D3S171 dan TP53, yang dibeli dari

Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) dan masing-masing primer forward dari indikator

tersebut diberi label dengan [γ-32P] ATP dan polinukleotida kinase (Takara Shuzo,

Kyoto, Jepang). PCR dilakukan dengan menggunakan thermal cycler (Perkin-Elmer

Cetus, Boston, MA, USA) selama 36 siklus dalam kondisi yang optimal, yaitu, 1

menit pada 94˚C, 1 menit pada 56˚C dan 1 menit pada 72˚C, kecuali untuk denaturasi

pertama, yang dilakukan pada 94˚C selama 5 menit. Produk PCR yang dimurnikan

dipisahkan dengan elektroforesis pada gel poliakrilamida 6% yang mengandung urea

8,3 M (10).

Analisis statistik

Analisis statistik data dilakukan dengan menggunakan tes χ2.

HASIL

Tabel I menunjukkan fitur klinik patologik dari pasien dan tumor mereka.

Usia pasien dengan kanker mulut secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan

kanker faring dan laring. Adapun dalam hal jenis kelamin, jumlah pasien perempuan

secara signifikan lebih tinggi di antara pasien dengan kanker mulut dibandingkan

dengan kanker faring dan laring. Pasien tahap lanjut (stadium III dan IV) secara

signifikan lebih tinggi pada pasien dengan kanker faring dan laring dibandingkan

dengan kanker mulut. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa metastasis kelenjar getah

bening, secara bermakna lebih sering pada pasien dengan kanker faring dan laring

dibandingkan pada mereka dengan kanker mulut.

Hipermetilasi daerah promotor dari gen p16 penekan tumor dideteksi dengan

menggunakan metode MSP. Kami memeriksa 47 kanker mulut, 39 kanker faring dan

35 kanker laring. Hasil yang mewakili ditunjukkan pada Gambar. 1 dan semua

hasilnya dirangkum dalam Tabel II dan Gambar. 2. Frekuensi metilasi di daerah

promotor dari gen p16 pada kanker mulut dan lidah adalah masing-masing 31,9 dan

35,3%. Sebaliknya, frekuensi dari kanker faring dan laring adalah masing-masing

12,8 dan 11,4%, dan frekuensi kanker mesofaring dan hipofaring adalah masing-

masing 21,4 dan 8,7%. Frekuensi metilasi di kanker mulut secara signifikan lebih

tinggi dari pada kanker hipofaring (p = 0,047). Frekuensi metilasi pada kanker lidah

secara signifikan lebih tinggi daripada di faring, laring dan kanker hipofaring

(masing-masing p = 0,046, 0,033 dan 0,039). Namun, frekuensi metilasi pada tumor

pasien perempuan (47,1%) secara signifikan lebih tinggi dari pada tumor dari pasien

laki-laki (15,4%) (p = 0,0067).

Tabel 2. Hipermetilasi di daerah promoter p16, lokasi tumor dan jenis kelamin

Tidak Termetilasi Termetilasi Termetilasi (%) Nilai-p

Kanker Mulut 32 15 31,9 0,047 (vs HF)Lidah 22 12 35,3 0,046 (vs F)Dasar Mulut 6 0Mukosa Buccal 1 3Gusi 3 0

Kanker Faring 34 5 12,8Mesofaring 11 3 21,4Hipofaring 23 2 8,7 0,033 (vs L)

Kanker Laring 31 4 11,4 0,039 (vs L)Jenis Kelamin

Wanita 9 8 47,1 0,0067Laki-Laki 88 16 15,4

Total 97 24 19,8

Perbedaan yang signifikan dapat dilihat antara kanker mulut dan hipofaring (HF), lidah (L) dan kanker faring (P), L dan HF, serta L dan kanker laring.

Gambar 1. Hipermetilasi di daerah promoter gen p16 yang dideteksi menggunakan metode MSP-bisulfit. Baris 1, kanker lidah (T2N0M0); baris 2, kanker laring (T4N0M0); baris 3, kanker dasar mulut (T2N0M0); baris 4, kanker hipofaring (T2N2aM0); baris 5, kanker hipofaring (T2N2aM0). U, tidak dimetilasi; M, dimetilasi. Pita yang dimetilasi hanya diamati pada kanker lidah (baris 1).

Gambar 2. Hipermetilasi di daerah promoter gen p16 pada HNSCC. Frekuensi hipermetilasi di daerah promoter gen p16 ditampilkan dalam kolom presentase untuk setiap bagian. Kolom sebelah kiri menunjukkan perbedaan antara kanker mulut dan kanker pada faring dan laring. Kolom sebelah kanan menunjukkan perbedaan antara wanita dan laki-laki.

Spesimen dari 47 kanker sel skuamosa mulut, 39 karsinoma sel skuamosa

faring dan 35 karsinoma sel skuamosa laring ditandai dengan adanya hilangnya alel

pada daerah tertentu dari genom, yaitu 3p22, 9p21 dan 17p13 (TP53). Frekuensi

hilangnya heterozigositas (LOH) di 3p21 pada kanker faring (66,7%) secara

signifikan lebih tinggi dari pada kanker mulut dan lidah (20,0 dan 14,8%) (masing-

masing p = 0,0006 dan 0,0003) (Tabel IIIA). Frekuensi LOH di 3p21 pada kanker

mesofaring dan hipofaring (63.6 dan 68,8%) juga secara signifikan lebih tinggi

daripada kanker mulut (masing-masing p = 0,018 dan p = 0,002). Frekuensi LOH di

3p21 pada kanker mesofaring dan hipofaring juga secara signifikan lebih tinggi dari

pada kanker lidah (masing-masing p = 0,009 dan p = 0,001).

Meskipun frekuensi LOH di 9p21 pada kanker faring (58,3%) dan laring

(60,0%) lebih tinggi daripada kanker oral (34,6%), perbedaan yang signifikan tidak

diamati. Frekuensi LOH di 9p21 pada kanker mesofaring (44,4%) dan hipofaring

(66,7%) juga lebih tinggi daripada kanker lidah (33,3%). Namun, perbedaan yang

signifikan yang juga tidak diamati (Tabel IIIB).

Frekuensi LOH di17p13 pada kanker faring (71,0%) dan laring (73,1%) jauh

lebih tinggi daripada kanker mulut (36,1%) (masing-masing p = 0,009 dan p = 0,009).

Frekuensi LOH di 17p13 pada kanker faring dan laring secara signifikan lebih tinggi

daripada kanker lidah (37,0%) (masing-masing p = 0,02 dan p = 0,018). Frekuensi

LOH di 17p13 pada kanker mesofaring (81,8%) secara signifikan lebih tinggi

daripada kanker mulut dan lidah (masing-masing p = 0,02 dan p = 0,03) (Tabel IIIC).

Hasil ini diringkas dalam Gambar. 3.

Tabel 3. LOH pada 3p21, 9p21 dan TP53 dan lokasi tumor

A. LOH pada 3p21 dan lokasi tumor

Lokasi3p21

N LOH (+) LOH (-) Nilai-p

Rongga mulut 35 7 28 P=0,018 (MF), p=0,002 (HF)

Lidah 27 4 23 P=0,009 (MF), p=0,001 (HF)

Dasar mulut 4 1 3

Mukosa buccal 2 1 1

Gusi 2 1 1

Faring 27 18 9 P=0,0006 (RM), p=0,0003 (L)

Mesofaring 11 7 4

Hipofaring 16 11 5

Laring 28 12 16

Total 90 37 53

Perbedaan yang signifikan terlihat antara rongga mulut (RM) dengan mesofaring (MF), RM dengan hipofaring (HF), lidah (L) dengan MF, L dengan HF, RM dengan faring (F), L dengan F. LOH : hilangnya heterozigositas.

B. LOH pada 9p21 dan lokasi tumor

Lokasi3p21

N LOH (+) LOH (-) Nilai-p

Rongga mulut 26 9 17 -

Lidah 27 4 23 -

Dasar mulut 4 2 2 -

Mukosa buccal 3 0 3 -

Gusi 1 1 0 -

Faring 24 14 10 -

Mesofaring 9 4 5 -

Hipofaring 15 10 5 -

Laring 25 15 10 -

Total 75 38 37 -

Tidak tampak adanya perbedaan yang signifikan. LOH : hilangnya heterozigositas.

C. LOH pada TP53 dan lokasi tumor

Lokasi3p21

N LOH (+) LOH (-) Nilai-p

Rongga mulut 36 13 23 P=0,02 (MF), p=0,009 (F)

Lidah 27 10 17 P=0,03 (MF), p=0,02 (F)

Dasar mulut 4 1 3

Mukosa buccal 3 0 3

Gusi 2 2 0

Faring 31 22 9

Mesofaring 11 9 2

Hipofaring 20 13 7

Laring 26 19 7 P=0,009 (RM), p=0,018 (L)

Total 93 54 39

Perbedaan yang signifikan terlihat antara rongga mulut (RM) dengan mesofaring (MF), RM dengan faring (F), lidah (L) dengan MF, L dengan F, RM dengan laring, L dengan laring. LOH : hilangnya heterozigositas.

Gambar 3. Perbedaan frekuensi LOH pada HNSCC. Frekuensi LOH ditampilkan dalam kolom persentase untuk tiap bagian. Perbedaan yang signifikan terlihat pada perbandingan antara frekuensi LOH pada berbagai jenis kanker di daerah kepala dan leher (Tabel 3 dan tinjauan yang relevan). LOH : hilangnya heterozigositas; HNSCC : karsinoma sel skuamosa pada kepala dan leher.

DISKUSI

Kami fokus pada perbedaan HNSCCs di berbagai daerah asalnya yang

berkaitan dengan aspek genetik dan epigenetik dari tumor. Meskipun kami

sebelumnya telah melaporkan perbedaan frekuensi hilangnya alel di beberapa daerah

kanker kepala dan leher (10), dalam penelitian ini hasil kami menunjukkan bahwa

ada perbedaan yang nyata dalam frekuensi hipermetilasi gen antara kanker mulut dan

kanker faring dan laring, serta hilangnya alel.

Ada banyak penelitian tentang status hipermetilasi daerah promotor dari gen

p16 penekan tumor. Frekuensi metilasi ditemukan menjadi sekitar 30% pada

spesimen karsinoma sel skuamosa kepala dan leher yang diperoleh dari pembedahan

tumor (1-9). Meskipun beberapa laporan telah menggambarkan hipermetilasi daerah

promotor dari gen p16 penekan tumor pada kanker mulut dan kanker faring dan

laring, belum ada laporan yang menunjukkan perbedaan frekuensi metilasi di antara

kanker-kanker tersebut. Hal ini mungkin sebagian besar disebabkan oleh rendahnya

jumlah sampel.

Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa hipermetilasi daerah promotor dari

gen p16 penekan tumor berkaitan dengan gender, yaitu, pasien wanita cenderung

memiliki hipermetilasi lebih sering dari gen p16. El-Naggar dkk juga melaporkan

bahwa tidak ada hubungan yang signifikan antara perubahan p16 dan faktor-faktor

klinik-patologik pasien, dengan pengecualian gender (3). Meskipun metode-metode

karakterisasi yang digunakan berbeda dari milik kami dan deteksi hipermetilasi yang

dilakukan dengan menggunakan metode yang berbeda dari milik kami, hasilnya

ternyata sesuai dengan milik kami. Pasien kanker mulut secara signifikan cenderung

lebih banyak perempuan daripada pasien dengan kanker faring dan laring. Kami

berasumsi bahwa kecenderungan ini mengakibatkan perbedaan yang signifikan dari

frekuensi hipermetilasi antara kanker mulut dan kanker faring dan laring. Hal ini

menunjukkan bahwa hipermetilasi daerah promotor dari gen penekan tumor p16

dapat menjadi faktor penting dalam karsinogenesis dari karsinoma sel skuamosa

kepala dan leher pada pasien wanita.

Pada HNSCC, hilangnya alel pada kromosom 9p terjadi paling sering pada

9p21 (1,13-15) dan itu terjadi sebagai peristiwa awal dalam proses karsinogenesis

pada kanker kepala dan leher (13). Daerah 9p21 ini termasuk supresor tumor dan gen

regulator siklus sel, p16 (Ink4a, juga dikenal sebagai CDKN2 atau MTS1) (16-19).

Meskipun penghapusan homozigot, monosomi dan titik mutasi p16 sering terjadi

dalam HNSCC cell line, sesuai bukti dari perubahan yang sama pada spesimen

kanker primer sifatnya kurang umum (1,14,20,21). Namun, HNSCC primer

menunjukkan metilasi yang sering pada daerah promoter dari gen p16 (22,23) dan

pada LOH 9p21. Tampak bahwa kedua jenis perubahan gen adalah mekanisme utama

yang mendasari inaktivasi gen p16 sebagai penekan tumor. Dalam penelitian kami,

LOH di 9p21 diamati pada sekitar setengah dari spesimen, dan itu lebih sering pada

kanker faring dan laring dibandingkan kanker mulut. Sebaliknya, hipermetilasi gen

p16 lebih sering pada kanker mulut dari pada kanker faring dan laring. Hasil ini

menunjukkan bahwa jenis inaktivasi gen p16 berbeda di berbagai tempat dari

karsinoma sel skuamosa kepala dan leher. Juga harus diingat bahwa hilangnya alelik

di 3p dan 17p secara signifikan lebih sering pada kanker faring dan laring

dibandingkan kanker mulut.

Kesimpulannya, meskipun tumor ini didiagnosis sebagai karsinoma sel

skuamosa, proses karsinogenesis mungkin berbeda pada tumor yang terletak di

berbagai bagian kepala dan leher. Hilangnya fungsi gen supresor tumor dengan

hilangnya alelik terutama menyebabkan dan menimbulkan tumor pada faring dan

laring, sedangkan hilangnya fungsi akibat metilasi di daerah promotor dari gen,

berhubungan dengan karsinogenesis dalam rongga mulut, yang dapat menambah

beban hilangnya alelik.

DAFTAR PUSTAKA

1. Reed AL, Califano J, Cairns P, Westra WH, Jones RM, Koch W, Ahrendt S, Eby Y, Sewell D, Nawroz H, Barterk J and Sidransky D: High frequency of p16 (CDKN2/MTS-1/INK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 56: 3630-3633, 1996.

2. Gonzalez MV, Pello MF, Lopez-Larrea C, Suarez C, Menendez MJ and Coto E: Deletion and methylation of the tumor suppressor gene p16/CDKN2 in primary head and neck squamous cell carcinoma. J Clin Pathol 50: 509-512, 1997.

3. El-Naggar AK, Lai S, Clayman G, Lee J-K J, Luna MA, Goepfert H and Batsakis JG: Methylation, a major mechanism of p16/CDKN2 gene inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Am J Pathol 151: 1767-1774, 1997.

4. Sanchez-Cespedes M, Esteller M, Wu L, Nawroz-Danish H, Yoo GH, Koch WM, Jen J, Herman JG and Sidransky D: Gene promoter hypermethylation in tumors and serum of head and neck cancer patients. Cancer Res 60: 892-895, 2000.

5. Hasegawa M, Nelson HH, Peters E, Ringstrom E, Posner M and Kelsey KT: Patterns of gene promoter methylation in squamous cell cancer of the head and neck. Oncogene 21: 4231-4236, 2002.

6. Weber A, Wittekind C and Tannapfel A: Genetic and epigenetic alterations of 9p21 gene products in benign and malignant tumors of the head and neck. Pathol Res Pract 199: 391-397, 2003.

7. Ai L, Stephenson KK, Ling W, Zuo C, Mukunyadzi P, Suen JY, Hanna E and Fan C-Y: The p16 (CDKN2a/INK4a) tumor-suppressor gene in head and neck squamous cell carcinoma: a promoter methylation and protein expression study in 100 cases. Mod Pathol 16: 944-950, 2003.

8. Maruya S, Issa J-PJ, Weber RS, Rosenthal DI, Haviland JC, Lotan R and El-Naggar AK: Differential methylation status of tumor-associated genes in head and neck squamous cell carcinoma: incidence and potential implications. Clin Cancer Res 10: 3825-3830, 2004.

9. Puri SK, Si L, Fan C-Y and Hanna E: Aberrant promoter hypermethylation of multiple genes in head and neck squamous cell carcinoma. Am J Otolaryngol 26: 12-17, 2005.

10. Shiga K, Matsuura K, Tateda M, Saijo S, Ogawa T, Miyagi T and Kobayashi T: Allelic loss correlated with tissue specificity in head and neck squamous cell carcinomas and the clinical features of patients. Tohoku J Exp Med 204: 163-172, 2004.

11. Shiga K, Yamamoto H and Okamoto H: Isolation and characterization of the human homologue of rig and its pseudogenes: The functional gene has features

characteristic of housekeeping genes. Proc Natl Acad Sci USA 87: 3594-3598, 1990.

12. Shiga K, Shiga C, Sasano H, Miyazaki S, Yamamoto T, Yamamoto M, Hayashi N, Nishihira T and Mori S: Expression of c-erbB-2 in human esophageal carcinoma cells: overexpression correlated with gene amplification or with GATA-3 transcription factor expression. Anticancer Res 13: 1293-1302, 1993.

13. Van der Riet P, Nawroz H, Hruban RH, Corio R, Tokino K, Koch W and Sidransky D: Frequent loss of chromosome 9p21-22 early in head and neck cancer progression. Cancer Res 54: 1156-1158, 1994.

14. Zhang SY, Klein-Szanto AJP, Sauter ER, Shafarenko M, Mitsunaga S, Nobori T, Carson DA, Ridge JA and Goodrow TL: Higher frequency of alterations in the p16/CDKN2 gene in squamous cell carcinoma cell lines than in primary tumors of the head and neck: Cancer Res 54: 5050-5053, 1994.

15. Nawroz H, van der Riet P, Hruban RH, Koch W, Ruppert JM and Sidransky D: Allotype of head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 54: 1152-1155, 1994.

16. Serrano M, Hannon GJ and Beach D: A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 366: 704-707, 1993.

17. Serrano M, Lee H-W, Chin L, Cordon-Cardo C, Beach D and Depinho RA: Role of the INK4a locus in tumor suppression and cell mortality. Cell 85: 27-37, 1996.

18. Kamb A, Gruis NA, Weaver-Fejdhaus J, Lin Q, Harshman K, Tavtigian SV, Stockert E, Day III RS, Johnson BE and Skolnick MH: A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science 264: 436-440, 1994.

19. Sherr CJ: Cancer cell cycles. Science 274: 1672-1677, 1996.20. Cairns P, Polascik TJ, Eby Y, Tokino K, Califano J, Merlo A, Mao L, Herath J,

Jenkins R, Westra W, et al: Frequency of homozygous deletion at p16/CDK2 in primary human tumors. Nat Genet 11: 210-212, 1995.

21. Lydiatt WM, Murty VV, Davidson BJ, Xu L, Dyomina K, Sacks PG, Schantz SP and Chaganti RS: Homozygous deletions and loss of expression of the CDKN2 gene occur frequently in head and neck squamous cell carcinoma cell lines but infrequently in primary tumors. Genes Chromosomes Cancer 13: 94-98, 1995.

22. Herman JG, Merlo A, Mao L, Lapidus RG, Issa J-PJ, Davidson NE, Sidransky D and Baylin SB: Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res 55: 4525-4530, 1995.

23. Merlo A, Herman JG, Mao L, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, Baylin SB and Sidransky D: 5' CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumor suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancers. Nat Med 1: 686-692, 1995.