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JULIANA SUYAMA HIGA
INFLUÊNCIA DO GENE ycgR NA REGULAÇÃO DE
FATORES DE VIRULÊNCIA EM AMOSTRA DE
Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA ATÍPICA
CAMPINAS
2015
ii
iii
iv
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vi
vii
Resumo
Escherichia coli (E.coli) enteropatogênica (EPEC), é um dos agentes causadores de diarreia
em crianças, principalmente em países em desenvolvimento. EPEC pode ser dividida em
típica (tEPEC) ou atípica (aEPEC) pela presença ou ausência do plasmídeo EAF,
respectivamente e, mais precisamente pela expressão da fímbria Bfp. Uma característica de
EPEC é a capacidade de causar uma lesão histopatológica denominada “attaching and
effacing” (lesão A/E) no epitélio intestinal e os genes responsáveis pela formação da lesão
A/E estão localizados na ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement).
Outra característica de EPEC é a formação de microcolônias que possibilitam a formação
de biofilme. Um dos mecanismos de regulação da formação de biofilme envolve a molécula
sinalizadora Bis-(3´-5´)-monofosfato de guanosina cíclico (c-di-GMP), um mensageiro
secundário universal em bactérias que está envolvido na regulação de uma grande
variedade de processos celulares. Para exercer sua função, c-di-GMP precisa se ligar e
alterar alostericamente a estrutura de uma molécula efetora. Um dos receptores conhecidos
para c-di-GMP é YcgR, uma proteína de domínio PilZ que possui um sítio de ligação para
c-di-GMP e está envolvida diretamente na regulação do movimento flagelar através da
ligação do complexo YcgR-c-di-GMP às proteínas da base do motor flagelar. Existem
poucos dados na literatura sobre as funções de YcgR, todos focados apenas no seu papel na
regulação da motilidade. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência
de YcgR na motilidade, formação de biofilme, adesão e formação de lesão A/E em um
amostra de aEPEC do sorotipo O55:H7. O gene ycgR foi deletado da amostra selvagem
através da técnica de recombinação homóloga proposta por Datsenko e Wanner (2000). A
complementação da amostra mutante foi realizada através da clonagem do gene ycgR no
plasmídeo de expressão pBAD Myc HisA. Os resultados obtidos indicam que a deleção do
gene ycgR reduz a motilidade e aumenta a formação do biofilme inicial na amostra
O55:H7. Além disso, a adesão em células epiteliais e a formação da lesão A/E também
foram reduzidas em comparação à amostra selvagem. Os resultados fenotípicos corroboram
os observados na análise transcricional dos genes eae, ler e espA, que participam da
formação da lesão A/E, e dos genes bscA, fimA e csgD, envolvidos na formação do
biofilme inicial. Com exceção do gene csgD que apresentou um aumento na transcrição na
amostra mutante, todos os outros genes avaliados apresentaram uma menor transcrição em
relação à amostra selvagem. Poucos trabalhos na literatura demonstram o papel do
mensageiro secundário em amostras de E. coli patogênicas, assim, estes resultados são os
primeiros descritos para uma amostra de aEPEC e possibilitam que no futuro novos estudos
possam analisar com mais detalhes a participação de c-di-GMP na regulação de fatores de
virulência não só de aEPEC mas também de outras E.coli patogênicas.
Palavras chave: Escherichia coli, aEPEC, YcgR, Motilidade, Formação de biofilme,
Lesão A/E
viii
.
ix
Abstract
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is a causative agent of diarrhea in children,
especially in developing countries. EPEC can be categorized in 2 subgroups termed typical
(tEPEC) or atypical (aEPEC) by the presence or absence of the EAF plasmid respectively,
and more precisely by the expression of the Bfp fimbriae. One characteristic of EPEC is the
ability to cause a histopathological lesion on epithelial cells called "attaching and effacing"
(A/E lesion). The genes responsible for the production of the A/E lesion are encoded in a
pathogenicity island named “locus of enterocyte effacement” (LEE). Another feature of
EPEC is the formation of microcolonies, which allow biofilm formation. One of the
regulation mechanisms of biofilm formation involves the signaling molecule bis- (3'-5')
cyclic guanosine monophosphate (c-di-GMP), a ubiquitous second messenger in bacteria
that participates in the regulation of a wide variety of cellular processes. To perform its
function, c-di-GMP needs to bind and alter allosterically the structure of an effector
molecule. One of the known receptors for c-di-GMP is YcgR, a Pilz domain protein that
has a c-di-GMP binding site and is involved directly in the regulation of flagellar
movement through the binding of the YcgR-c-di-GMP complex to flagellar motor proteins.
There are few published data on the YcgR functions and they focus mainly on the role of
the YcgR in motility regulation. The aim of this study was to evaluate the influence of
YcgR in motility, biofilm formation, adhesion and A/E lesion formation in an aEPEC strain
serotype O55:H7. ycgR gene deletion was performed by homologous recombination as
proposed by Datsenko and Wanner (2000). Complementation of O55:H7 mutant strain was
achieved by cloning ycgR in pBAD/Myc-HisA plasmid. The results indicate that the
deletion of ycgR gene decreases the motility and increases the formation of initial biofilm
on O55:H7 strain. Moreover, the adhesion on epithelial cells and the A/E lesion formation
were also diminished in comparision to the wild type strain. The phenotypic results are
consistent with the transcriptional analysis of eae, ler and espA genes involved in A/E
lesion formation, and of bcsA, fimA and csgD genes involved in the initial steps of biofilm
formation. With the exception of csgD gene that showed an increased transcription level in
the mutant strain, all other analysed genes showed a decrease in transcription when
compared to the wild type strain. Few studies demonstrate the role of a second messenger
molecule in Escherichia coli pathogenic samples, and therefore, these results are the first
report in this regard for an aEPEC strain. This work should encourage further studies in
order to analyze in more detail the involvement of c-di GMP in the regulation of virulence
factors not only in aEPEC, but also in other pathogenic Escherichia coli pathotypes.
Key words: Escherchia coli, aEPEC, YcgR, Motility, Biofilm formation, A/E Lesion
x
.
xi
SUMÁRIO
I. Introdução ............................................................................................................................... 1
1.Escherichia coli .......................................................................................................... 1
1.2. Escherichia coli diarreiogênicas .......................................................................... 1
1.3. Escherichia coli enteropatogênica ....................................................................... 3
1.3.1 Escherichia coli Enteropatogênica atípica (aEPEC) ........................................ 4
1.4 Lesão A/E e a região LEE ..................................................................................... 5
1.5 Biofilme ................................................................................................................... 8
1.6 c-di-GM ................................................................................................................. 11
1.7. YcgR, domínio PilZ e o controle da maquinaria flagelar .............................. 14
II. OBJETIVO .......................................................................................................................... 18
III. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 19
3.1. Meios de cultura e soluções ................................................................................ 19
3.2 Amostras bacterianas e plasmídeos .................................................................... 19
3.3. Técnicas de manipulação e análise de DNA ..................................................... 20
3.3.1 Obtenção de DNA genômico, purificação e extração de plasmídeos ............ 20
3.3.2 Desenho dos iniciadores para detecção e deleção do gene ycgR ................... 20
xii
3.3.3. Técnica da Reação da Polimerase em cadeia (PCR) – detecção do gene ycgR e
obtenção do cassete de resistência .......................................................................... 21
3.3.4. Indução do estado de competência e transformação da amostra O55:H7 com
plasmídeo pKD46 .................................................................................................... 21
3.3.5 Preparo de células competentes da amostra O55:H7(pKD46) para eletroporação
com os cassetes de resistência ................................................................................. 22
3.3.6 Obtenção do plasmídeo pBAD/Myc-HisA linearizado .................................. 23
3.3.7 Obtenção do inserto ycgR e ligação no plasmídeo pBAD/Myc-HisA ........... 23
3.3.8. Indução do estado de competência e transformação da amostra TOP- 10 com
pBAD Myc HisA + inserto ycgR ............................................................................ 24
3.3.9. Transformação da amostra mutante JH01 com o plasmídeo pBAD Myc His A
ycgR ......................................................................................................................... 24
3.4. Analises transcricionais ...................................................................................... 25
3.4.1. Extração de RNA .......................................................................................... 25
3.4.2. PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) ................................................ 26
3.5 Ensaios Fenotípicos .............................................................................................. 27
3.5.1. Teste de motilidade em ágar semi-sólido ...................................................... 27
3.5.2 Curva de crescimento ..................................................................................... 27
3.5.3. Ensaios de formação de biofilme em superfície abiótica – Técnica de Cristal
Violeta ..................................................................................................................... 27
3.5.4. Ensaios de adesão e de formação de biofilme em células epiteliais in vitro . 28
xiii
IV. RESULTADOS .................................................................................................................. 31
4.1. Obtenção do mutante ycgR ................................................................................ 31
4.2. Obtenção da amostra complementada JH02 .................................................... 34
4.3. Teste de motilidade ............................................................................................. 34
4.4. Curva de crescimento ......................................................................................... 35
4.5. Ensaio de formação de biofilme em superfície abiótica – Técnica de Cristal
Violeta ......................................................................................................................... 36
4.6. Ensaio de formação de biofilme em superfície biótica .................................... 36
4.7. Ensaio de adesão em célula epitelial in vitro .................................................... 40
4.8. Teste de FAS ........................................................................................................ 41
4.9. Análise transcricional por qRT-PCR ................................................................ 42
V. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 46
VI. CONCLUSÕES .................................................................................................................. 53
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 54
ANEXO 1- Certificado de Biossegurança ................................................................................. 69
ANEXO 2 – Certificado de ética no uso animal ........................................................................ 71
xiv
xv
Ao meu sempre porto seguro em pensamento e amor, não importando
quantos anos e dias se passem. Fabinho*, aquele que vive eternamente
dentro do meu coração.
Aos meus benevolentes pais que mesmo às vezes sem entender direito,
sempre apoioaram a filha nessa tal “carreira acadêmica” que ela
escolheu.
Aos meus avós. Aqueles cujos olhos ainda brilham, as vozes ainda
embargam e sorriso ainda impera quando a neta mais velha conta pela
centésima vez com o que trabalha. Contarei mais cem vezes se necessário
Dedico.
*in memorian
xvi
xvii
“Não é preciso que seja uma dor doída....Por
vezes a dor aparece como aquela coceira que
tem o nome de curiosidade”
Rubem Alves, Ostra feliz não faz pérola
xviii
xix
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais por sempre me apoiarem, não importando o quanto isso custasse
a eles (e não estou falando somente do lado financeiro!). E por não terem me
expulsado de casa ainda!!!!
Às minhas tias Sonia e Julia, minhas segundas “mães”, pelo carinho, apoio e por
permitirem que eu “roubasse” a internet quase toda noite, seja pra fuçar o
facebook ou pra virar a noite desperada para terminar relatório, qualificação,
pré-banca.......
Aos meus avós, simplesmente por serem meus avós!! Amor incondicional!
Aos meus tios, tias, primos e prima da família Suyama, que nunca, absolutamente
nunca, falaram “mas você só estuda?” e que sempre me apoiaram.
Às minhas “soul sisters” Maru e Marjory e meu “brinde” Tates, por toda amizade e
carinho. E por me darem um teto toda vez que precisava ir para Campinas
cumprir os créditos das disciplinas (ou só pra passar um tempo mesmo!). Adoro
porque me recuso a dizer que amo!
Ao quarteto que é um quintento e no fim virou um sexteto. Por ser a prova que
Holanda, Campinas, São Paulo e São José das....bom, deixa pra lá, representam
somente uma distância física. Por escutarem meu choro, por me aconselharem e
principalmente por me fazerem rir.
Ao meu super amigo Douradinho, pelas palavras de apoio, pelas noites felizes e
pelos dias seguintes. Por ter sido meu grande companheiro quando tudo parecia
que estava errado. Ao Daniel pelas noites e madrugadas de insônia, risadas e
muita baboseira!
Aos meus amigos de Butantan, do laboratório de Bacteriologia e aos “Parasitas”
pela amizade, diversão, “bons café” e piratinhas no fim da semana. Aos amigos
que já foram embora do Instituto, mas que continuam fazendo parte da minha
vida.
xx
À Thaty “incinere now” pela disponibilidade de me ajudar sempre que precisei,
seja com reagente, óleo de imersão ou microscópio, mas principalmente pela
amizade.
Aos meus amigos de bancada, Hebert, Vanessa, Samuel, Renato, Min, Camila,
Gustavo e Isabella por terem me ajudado durante esses quase 3 anos de
mestrado. Sem vocês eu tenho certeza de que esse trabalho não iria sair nunca!
Ao meu orientador, Dr. Marcelo, por ter acreditado (ou não) que eu tinha
condições de ser sua aluna, pela orientação, pelos ensinamentos, pela amizade
e por sempre ter me dado oportunidade de contestar (porque sou uma pessoa
que pouco contesta!!!)
Aos funcionários do Laboratório de Genética do Instituto Butantan pelo suporte
técnico.
Ao Dr. Henrique Krambeck pelas dicas e fotos de Microscopia Confocal.
À secretária da pós, Lourdes, por sempre ter “quebrado o galho” a mais de
100km de distância da Unicamp quando precisei.
A Capes, pelo suporte financeiro.
Ao Pikachu que “mora” na minha bancada pela simples graça de existir para
me distrair.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para realização
deste trabalho.
Obrigadinha!!!
xxi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. A região LEE ..................................................................................................... 6
FIGURA 2. Etapas de formação do biofilme. ..................................................................... 10
FIGURA 3. Esquema simplicado de síntese e degração do mensageiro secundário. ......... 13
FIGURA 4. Esquema simplificado dos modelos efetores de c-di-GMP que impactam na
transição do estado móvel para séssil em E.coli, através da interação de YcgR/c-di-GMP. 17
FIGURA 5. Representação esquemática da técnica de recombinação homóloga proposta
por Datsenko e Wanner (2000) ............................................................................................. 31
FIGURA 6. Gel de agarose 1% para confirmação da presença do gene ycgR na amostra
selvagem O55:H7. ................................................................................................................ 32
FIGURA 7. Gel de agarose 1% para confirmação a deleção do gene ycgR. ....................... 33
FIGURA 8. Gel de agarose 1% contendo amplificação de fragmentos obtidos para
confirmação da inserção do cassete de resistência na amostra mutante.. ............................. 33
FIGURA 9. Gel de agarose 1% para confirmação da complementação. ............................. 34
FIGURA 10. Teste de motilidade em ágar sem-sólido. ...................................................... 35
FIGURA 11. Curva de crescimento das amostras O55:H7, JH01 e JH02 durante 10 horas.
.............................................................................................................................................. 35
FIGURA 12. Gráfico de forrmação de biofilme em superfície abiótica através de Cristal
Violeta pelos períodos de 3, 6 e 24 horas. ............................................................................ 36
xxii
FIGURA 13. Teste de formação de biofilme em célula epitelial Hep-2 pré-fixada, realizado
com período de 3 horas de incubação, analisado em microscopia confocal. ....................... 37
FIGURA 14. Teste de formação de biofilme em célula epitelial HEp-2 pré-fixada
realizado com período de 6 horas de incubação, analisado em microscopia confocal. ........ 38
FIGURA 15. Teste de formação de biofilme em célula epitelial Hep-2 pré-fixada realizado
com período de 24 horas de incubação, analisado em microscopia confocal ...................... 39
FIGURA 16. Ensaio de adesão em células HEp-2 observadas em microscopia óptica , após
3ou 6 horas de interação, bactéria - célula . .......................................................................... 40
FIGURA 17. Teste de FAS observado em microscopia confocal.. ..................................... 41
FIGURA 18. Análise da transcrição do gene eae nas amostras O55:H7 e JH01. ............... 42
FIGURA 19. Análise da transcrição do gene espA nas amostras O55:H7 e JH01.. ............ 43
FIGURA 20. Análise da transcrição do gene ler nas amostras O55:H7 e JH01. ............... 43
FIGURA 21. Análise da transcrição do gene bcsA nas amostras O55:H7 e JH01. ............. 44
FIGURA 22. Análise da transcrição do gene fimA nas amostras O55:H7 e JH01 ............. 44
FIGURA 23. Análise da transcrição do gene csgD nas amostras O55:H7 e JH01 ........... 45
xxiii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Amostras bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo ..................... 19
TABELA 2. Iniciadores utilizados na detecção do gene ycgR, na deleção através do
sistema de recombinação lambda red, na obtenção do inserto ycgR para complementação da
amostra mutante JH01 e para detecção da complementação .......................................... 25
TABELA 3. Condições para realização dos ensaios de PCR ........................................ 25
TABELA 4. Iniciadores utilizados nos ensaios de qRT-PCR ....................................... 26
xxiv
xxv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA - Adesão agregativa.
A/E - Lesão attaching and effacing.
AIEC - Escherichia coli aderente invasora.
Amp - Ampicilina.
Ampr- Ampicilina resistente
BFP - Bundle forming pilus
bfpA - Bundle forming pilus subunidade A.
BSA - Bovine serum albumin.
Cat – Cloranfenicol acetil transferase.
c-di-GMP – Bis-(3´-5´)- monofosfato de
guanosina cíclico
Ct - Threshold.
CV - Cristal Violeta.
DEC – Escherichia coli diarreiogênica
DA – Adesão difusa
DAEC - Escherichia coli que adere
difusamente
DGC – Diguanilato ciclase
DMEM - Meio mínimo essencial de Eagle
modificado por Dulbeco.
SFB - Soro fetal bovino.
DO - Densidade óptica.
EAEC - Escherichia coli Enteroagregaiva.
eae - E. coli attaching and effacing
EAF – EPEC Adherence factor
EAL – Domínio conservado de aminácidos
presentes nas proteínas com atividade de
fofosdiesterase
E. coli - Escherichia coli
EcoR I - Enzima de restrição da bactéria
Escherichia coli RY 13.
EDTA – Ácido Etilenodiaminoetracético.
EHEC - Escherichia coli Enterohemorrágica.
EIEC - Escherichia coli Enteroinvasora.
EPEC - Escherichia coli Enteropatogênica.
aEPEC - Escherichia coli Enteropatogênica
atípica.
tEPEC - Escherichia coli Enteropatogênica
típica.
EPS - Exopolissacarídeos.
Esc - EPEC secretion
Esp - Escherichia coli secreted Proteins.
espA - Escherichia coli secreted proteins
subunidade A.
ETEC - Escherichia coli Enterotoxigênica.
ExPEC - Escherichia coli patogênica extra-
intestinal.
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
GGDEF – domínio de aminoácidos
conservados presentes nas proteínas com
atividade de diguanilato ciclase
GMP – Guanosina monofosfato
GTP – Trifosfato de guanosina
xxvi
IND – Adesão de padão indeterminado
HD-GYP – Domínio conservado presente em
proteínas com atividade de fosfodiesterase
HEp-2 –Linhagem celular derivada de
adenocarcinoma de laringe
JH01 –
JH02 –Amostra mutante com plasmídeo
pJHS01 (contendo inserto ycgR)
Kb - Kilobases.
LA – adesão localizada
LAL – Adesão localizada -like
LB - Caldo Lúria-Bertani.
LBA - Ágar Lúria-Bertani.
LEE - Ilha de patogenicidade locus of
enterocyte effacement.
Ler - LEE encoded regulator.
LT – Enterotoxina termolábil
MDa - Megadalton
NA - Não aderente.
ORFs - Open reading frames.
pb – Pares de bases.
pBAD Myc-His A- Vetor de expressão
PBS - Tampão fosfato.
PCR - Reação em cadeia da polimerase
pKD3 – Plasmídeo molde para amplificação
do cassete de recombina -
red
pKD46 –Plasmídeo auxiliar que contém os
genes das enzimas de recombinação do
sistema λ-red
PDE - Fosfodiesterase
per - Plasmid encoded regulator.
PilZ – Domínio de ligação a YcgR
pGpG – 5´fosfoguanilil (3´->5´) guanosina
STEC - Escherichia coli produtora da toxina
de Shiga.
SHU - Síndrome hemolítica urêmica
ST- Enterotoxina termoestável
Stx - Toxina de Shiga.
SFB - Soro fetal bovino.
Tir - Translocated intimin receptor.
TTSS – Sistema de secreção do tipo III
TAE - Tris-acetato EDTA.
UV - Ultravioleta.
Xho I - Enzima de restrição da bactéria
Xanthomonas holcicola.
WT – Wild Type (amostra selvagem)
1
I. INTRODUÇÃO
1.Escherichia coli
Escherichia coli (E.coli) é um bacilo gram negativo, facultativo, pertencente à
família Enterobacteriacea, que coloniza o trato gastrointestinal de humanos e outros
animais. Apresentam um alto grau de diversidade genética, ocasionada por mutações,
recombinações e transferência horizontal de genes, inclusive de virulência, tonando-se
patogênicas (OCHMAN; LAWRENC; GROISMAN, 2000). Cepas patogênicas que
colonizam outros nichos são denominadas E.coli extraintestinais (ExPEC) e podem levar a
patologias, como infecções do trato urinário, sepse, meningite e bacteremia. As cepas
patogênicas de E. coli causadoras de infecção intestinal e são chamadas E. coli
diarreiogênicas (DEC) (NATARO; KAPER, 1998).
1.2. Escherichia coli diarreiogênicas
A diarreia continua sendo uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no
mundo, principalmente em países em desenvolvimento, e a segunda principal causa de
morte em crianças com idade inferior a cinco anos (LANATA et al., 2013). Cerca de
760.000 crianças com menos de cinco anos morrem todos os anos em decorrência da
diarreia. Rotavirus e E. coli são os dois agentes etiológicos mais comuns em países em
desenvolvimento (WHO, 2013)
Atualmente, as DEC são divididas em 6 patótipos definidos por seus mecanismos de
virulência específicos, as síndromes clínicas que causam, os sorotipos O:H, os aspectos
epidemiológicos e os tipos de interação com linhagens celulares in vitro: E. coli
enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC),
E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere
difusamente a células epiteliais (DAEC). Alguns desses patótipos incluem microrganismos
bastante diferentes e, por esta razão, as EAEC e EPEC foram subdivididas em típicas ou
2
atípicas e as EHEC passaram a constituir uma subcategoria de E. coli produtora da toxina
de Shiga (STEC) (KAPER et al., 2004).
ETEC são amostras que produzem as enterotoxinas termolábil (LT) e/ou
termoestável (ST) e podem se aderir à mucosa intestinal através de seus vários fatores de
colonização que, juntamente com as enterotoxinas, podem causar um desbalanço
eletrolítico no hospedeiro (LEVINE, 1987), levando a um quadro de diarreia aquosa em
crianças e à chamada “diarreia do viajante” em adultos (KAPER et al., 2004).
EIEC apresentam características semelhantes à Shigella ssp., são capazes de invadir
e se multiplicar em células do epitélio intestinal causando um quadro de colite inflamatória
com diarreia aquosa e, ocasionalmente, disenteria (KAPER et al., 2004). O mecanismo de
patogênese de EIEC é caracterizado pela invasão da mucosa intestinal seguida por
fagocitose e lise do vacúolo endocítico, multiplicação intracelular, movimentação do
citoplasma e passagem para células adjacentes (NATARO; KAPER, 1998).
DAEC se aderem de forma difusa por toda a superfície celular (ELLIOT;
NATARO, 1995), todavia, o mecanismo e a relação das DAEC com quadros de diarreia são
controversos, uma vez que estudos epidemiológicos não as relacionam com a patologia
(GIRÓN et al., 1991; SCALETSKY et al., 2002)
EAEC apresentam como principal característica o padrão de adesão denominado
agregativo (AA) em células epiteliais in vitro, neste padrão as bactérias apresentam-se
aderidas uma às outras numa configurção que lembra “tijolos empilhados” (NATARO et
al., 1987). Ocasiona diarreia em crianças e adultos tanto em países desenvolvidos quanto
nos países em desenvolvimento. Clinicamente caracteriza-se por diarreia aquosa, aguda e
persistente (HARRINGTON et al., 2005)
STEC possuem como característica a produção da toxina de Shiga, que causa danos
às células endoteliais do rim levando, em alguns casos, a uma complicação severa renal
conhecida como síndrome hemolítica urêmica (SHU) (LEVINE, 1987). EHEC é
considerada uma subcategoria de STEC e possui como característica a capacidade de
produzir uma lesão histopatológica denominada “attaching and effacing” (A/E) semelhante
3
às EPEC (NATARO; KAPER, 1998). Surtos associados à EHEC são observados
principalmente em países industrializados, embora também sejam noticiados em países em
desenvolvimento (MELLIES et al., 2007).
EPEC, assim como as EHEC, possuem como característica a formação da lesão A/E
em biópsias intestinas e culturas celulares, porém, se diferenciam por não produzirem a
toxina de shiga (MOON et al., 1983).
1.3. Escherichia coli enteropatogênica
EPEC foi o primeiro patótipo de E.coli descrito (KAPER et al., 2004). A
Organização Mundial de Saúde reconhece que existem 12 sorogrupos clássicos: O26, O55,
O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142 e O158 (WHO, 1987;
HERNANDES et al., 2009). EPEC é semelhante à EHEC em muitos aspectos
epidemiológicos e patogênicos e causa diarreia aquosa em crianças com idade inferior a 2
anos de idade, principalmente em países em desenvolvimento (MILLIES et al., 2007).
A principal característica de EPEC é a formação de uma lesão histopatológica
denominada “attaching and effacing” (Lesão A/E), que pode ser observada tanto em
biópsias de intestino de pacientes ou animais infectados quanto em culturas celulares
(KAPER et al., 2004).
Outra característica de EPEC é o padrão de adesão localizado (LA) das bactérias em
culturas celulares (SCALETSKY et al., 1984). O padrão LA é caracterizado pela adesão
das bactérias em áreas localizadas na superfície celular, formando microcolônias compactas
que podem ser visualizadas em microscopia óptica após 3 horas de incubação (TRABULSI
et al., 2002). EPEC possuem um plasmídeo de aproximadamente 60 MDa denominado
EPEC “adherence factor”(EAF), que contém os genes necessários para biogênese de uma
adesina fimbrial denominada “bundle forming pilus” (BFP), responsável pela adesão
localizada (GÍRON et al., 1991). Além de codificar o operon bfp, que é composto por 14
genes incluindo bfpA, que codfica a maior subunidade da fímbria, o plasmídeo EAF abriga
o operon perABC, que regula a transcrição de bfp, além de ser um ativador transcricional de
LEE (MELLIES et al., 1999, TOBE et al., 1999).
4
As EPEC podem ser classificadas em típicas e atípicas. A divisão de EPEC em dois
grupos distintos ocorreu em 1995, durante o Segundo Simpósio Internacional de EPEC que
ocorreu na cidade de São Paulo, Brasil. A partir deste encontro ficou definido que as
amostras de EPEC capazes de formar a lesão A/E, que não expressam a toxina Stx e
possuem o plasmídeo EAF, seriam classificadas como EPEC típicas (tEPEC), enquanto as
amostras que não apresentam o plasmídeo EAF seriam classificadas como EPEC atípicas
(aEPEC) (KAPER, 1996).
1.3.1 Escherichia coli Enteropatogênica atípica (aEPEC)
Como mencionado anteriormente, o termo EPEC atípica foi criado em 1995 para
denominar amostras de E.coli que diferem das EPEC típicas por não albergarem o
plasmídeo EAF e das EHEC por não produzirem a toxina de Shiga (KAPER, 1996), já que
ambas possuem a região LEE. Em 2002, uma nova definição foi proposta por Trabulsi e
colaboradores, classificando como atípicas as amostras de EPEC que não expressam a
fímbria BFP.
Em geral, as amostras de aEPEC apresentam uma heterogeneidade em relação aos
seus fatores de virulência, que podem ou não ser codificados pela região LEE e ainda
apresentarem outros fatores de virulência de outros patótipos de DEC. Essa
heterogeneidade também pode ser observada nos diversos padrões de adesão às células
epiteliais in vitro. Enquanto tEPEC apresenta caracteristicamente o padrão de adesão LA,
aEPEC apresenta predominantemente o padrão localizado-like (LAL). Diferentemente do
padrão LA, no qual as microcolonias formadas pela adesão das bactérias às células
epiteliais são bastante compactas, no padrão LAL, as microcolonias formadas pelas
bactérias aderidas se apresentam de maneira frouxa. Além disso, enquanto o padrão LA
pode ser observado após três horas de contanto bactéria célula eucariótica, o padrão LAL só
é observado após seis horas de contato (SCALETSKY et al., 1999). A diferença nos
padrões de adesão LA e LAL pode ser justificada pela presença ou ausência da fímbria
BFP, que promove as ligações de uma bactéria à outra levando à formação das
microcolônias, e pela presença ou ausência do regulador per (BUERIS et al., 2015). Além
disso, BFP está envolvida nos passos iniciais da colonização do epitélio intestinal
5
(CLEARY et al., 2004, GIRÓN et al., 1991 ). Além de LAL, as aEPEC podem apresentar
os padrões de adesão agregativo (AA) e difuso (DA). Algumas amostras ainda podem ser
incapazes de se aderir às células epiteliais (NA) ou apresentar um padrão indeterminado
(IND) (ABE et al., 2009,DULGUER et al., 2003, HERNANDES et al., 2009, ROBINS-
BROWNE et al., 2004, TRABULSI, 2002; VIEIRA et al., 2001).
Os sorotipos de aEPEC podem ou não pertencer aos chamados sorogrupos clássicos
de EPEC (DULGUER et al., 2003, GOMES et al., 2004, VEIRA et al.,2001). Os sorotipos
mais frequentemente isolados de aEPEC são O26:H11, O55:H7, O55:H34, O86:H8,
O111:H8, O111:H9, O111:H25, O119:H2, O125ac:H6 e O128:H2 (TRABULSI et al.,
2002).
Diversos autores relacionam aEPEC com quadros de endemia, surtos e diarreia
persistente em crianças em todo mundo (BUERIS et al., 2007, LOZER et al., 2014,
NGUYEN et al., 2006; YATSUYANAGI et al., 2003). Nos últimos anos, estudos
epidemiológicos indicam que aEPEC se tornaram mais prevalentes que tEPEC, tanto países
desenvolvidos quanto em países em desenvolvimento, e que aEPEC é um importante
patógeno endêmico causador de diarreia em crianças (AFSET et al., 2004; ARAUJO et al.,
2007; BUERIS et al., 2007; OCHOA et al., 2008; OCHOA, CONTRERAS, 2011).
1.4 Lesão A/E e a região LEE
A lesão A/E foi observada pela primeira vez por Moon e colaboradores (1983) e é
caracterizada pela destruição das microvilosidades e íntima adesão da bactéria às células do
epitélio intestinal, levando à formação de um pedestal através da polimerização e acúmulo
da actina e outros elementos do citoesqueleto no sítio onde a bactéria se adere.
A observação da lesão A/E era possível somente através de técnicas de microscopia
eletrônica, entretanto, Knutton e colaboradores (1989) desenvolveram o teste de FAS
“fluorescent-actin staining”, que consiste em um marcador fluorescente de isotiocianto
(FITC) conjugado à faloidína, que se liga aos filamentos de actina polimerizada, permitindo
identificar indiretamente a formação da lesão A/E.
6
Os determinantes genéticos para a formação da lesão A/E estão localizados em uma
ilha de patogenicidade de 35kb chamada “Locus of enterocyte effacementt” (LEE), que
contém os genes que codificam a intimina, o sistema de secreção do tipo III (TTSS), as
proteínas secretadas ESP e o receptor translocado da intimina Tir (McDaniel et al., 1995;
McDaniel; Kaper, 1997).
O primeiro gene necessário para formação da lesão A/E descrito foi o gene eae, que
codifica a intimina (Jerse et al., 1990). Poucos anos depois, em 1995, McDaniel e
colaboradores descrevem pela primeira vez a região LEE na amostra de EPEC E2348/69.
Em 1997, McDaniel e Kaper demonstram que a presença da região LEE por si só é capaz
de permitir a formação da lesão A/E por uma amostra de E.coli K12 transformada com
LEE. Em 1998, Elliot e colaboradores publicam pela primeira vez o sequenciamento da
Região LEE da amostra de EPEC E2348/69.
A região LEE possui 41 “open reading frames” (ORFs) organizadas em 5 operons
(LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 e LEE5), que podem ser divididos em 3 domínios funcionais, o
central eae, que codifica a intimina, a região que codifica as proteínas secretadas ESP e a
maior região que codifica o aparato de secreção TTSS (ELLIOT et al., 1998). (Figura 1)
FIGURA 1. A região LEE é composta por possui 41 “open reading frames” (ORFs) organizadas em 5
operons (LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 e LEE5), que podem ser divididos em 3 domínios funcionais, o
central eae, que codifica a intimina, a região que codifica as proteínas secretadas ESP e a maior região
que codifica o aparato de secreção (Adaptado de Dean et al, Current Opinion in Microbiology 2005,
8:28–34 )
7
Os operons LEE1, LEE2 e LEE3 contêm os genes que codificam as proteínas Esc
(“EPEC secretion”) e Sep (“Secretion of EPEC protein”), necessárias para a formação do
aparato de secreção TTSS. Em LEE1 também é encontrado o gene ler, que codifica LER
(“LEE encoded regulator”), uma proteína que age como o principal regulador
transcricional de LEE. LEE4 contém os genes que codificam as proteínas secretadas ESP
(“EPEC secreted proteins”), EspA, EspB, EspD, EspF, e LEE5 contém os genes eae
(“EPEC attaching and effacing”) e tir (“translocated intimin receptor”), que codificam a
adesina intimina e o seu receptor Tir, além de cesT, que codifica a chaperonina CesT das
proteínas Tir e Map (“Mithocondrial-associated protein”) (GARMENDIA et al., 2005).
Em 1996, Rosenshine e colaboradores demonstraram que a ligação de EPEC às
células epiteliais causava a fosforilação da tirosina da proteína Hp90, que acreditava-se ser
o receptor celular da intimina. Entretanto, Kenny e colaboradores em 1997 descobriram que
Hp90 não era uma proteína da célula hospedeira, mas sim produzida pela própria bactéria e
que, após ser translocada pelo TTSS, se insere na membrana da célula hospedeira. Essa
proteína foi denominada Tir. (FRANKEL, PHILLIPS 2008, KENNY et al., 1997, LAI et
al., 2013).
O TTSS é uma estrutura complexa composta por várias subunidades, as proteínas
estruturais que compõe o aparato, as proteínas adicionais translocadoras, e as proteínas
efetoras que acessam o ambiente intracelular da célula hospedeira, subvertendo vários
processos celulares, permitindo a bactéria colonizar, multiplicar e causar doença
(COBURN et al., 2007; WONG et al. 2011).
Para alcançar o citoplasma da célula hospedeira, as proteínas efetoras precisam ser
secretadas por uma estrutura semelhante a uma seringa denominada “translocon”, que se
extende da membrana interna da bactéria até o meio extracelular (GARMENDIA et al.,
2005). A proteína EspA forma um canal filamentoso e EspB e EspD se ligam ao final deste
canal, gerando um poro na membrana da célula hospedeira, por onde as proteínas efetoras
são injetadas no citoplasma da célula eucariótica (HERNANDES et al., 2013).
Após a translocação de Tir, sua interação com a intimina é suficiente para iniciar a
montagem do pedestal (GAMPELLONE; LEONG, 2003). Tir se integra na membrana da
8
célula do hospedeiro onde assume a forma de um grampo. O domínio central, extracelular,
é o receptor para intimina, e as porções N e C terminais de Tir interagem com uma série
proteínas do citoesqueleto que incluem a α-actina, talina e viculina.
A polimeração da actina é atribuída à porção N-terminal de Tir. Na amostra
protótipo de EPEC E2348/69, a fosforilação do resíduo 474 da tirosina de Tir pela tirosina
quinase da célula do hospedeiro forma um sítio de ligação para proteína Nck, que recruta e
ativa a proteína da Síndrome Neural Wiskott-Aldrich (N-Wasp), levando à polimerização
da actina via ativação das proteínas Arp2/3. Uma via alternativa Nck dependente, que pode
ser utilizada por EHEC O157:H7 e por amostras de EPEC, consiste no recrutamento de N-
Wasp por meio da proteína Tccp/EspFu (CAMPELLONE; LEONG, 2003, FRANKEL.;
PHILLIPS, 2007, WONG et al., 2012, WHALE et al 2006).
1.5 Biofilme
Micro-organismos não vivem como culturas puras ou dispersas como células únicas
no ambiente. Ao invés disso, eles frequentemente se juntam em aglomerados (“clusters”)
polimicrobianos, formando o que é conhecido como biofilme (Flemming; Wingender,
2010). Por definição, biofilmes são comunidades bacterianas envoltas por uma matriz
extracelular de exopolissacarídeo (EPS) aderidas à superfícies sólidas ou semi-sólidas
(Donlan; Costerton, 2000). Outra definição mais completa inclui a formação de agregados
celulares em flocos (biofilmes flutuantes) e formações lodosas, que não estão aderidas a
nenhuma interface, mas que apresentam as características de um biofilme (FLEMMING;
WINGERDER, 2010). Em alguns casos, os clusters formados pelos agregados bacterianos
são separados por canais por onde são transportados fluídos pelo biofilme (STEWART;
FRANKLIN, 2008).
Biofilmes podem ser compostos por uma população derivada de uma única espécie
bacteriana ou uma comunidade formada por diversas espécies microbianas que podem se
aderir a diversas superfícies bióticas, como células e tecidos, ou ainda a superfícies
abióticas como poliestireno e vidro (DAVEY; O´TOOLE, 2000) e apresentam diversos
benefícios para a comunidade bacteriana, como resistência a agentes antimicrobianos,
9
proteção contra protozoários e contra o sistema imune do hospedeiro (DAVEY; O´TOOLE,
2000, ITO et al., 2009).
A formação do biofilme não é um processo homogêneo, assim, enquanto as
bactérias se adaptam ao crescimento em comunidade, elas se distinguem em diferentes
fenótipos. Esses processos incluem o transporte e absorção de moléculas orgânicas pela
superfície, transporte de células bacterianas, adesão dos micro-organismos à superfície,
crescimento bacteriano, incluindo a produção de EPS depois da aderência das bactérias e
depressão do biofilme (TRULEAR; CHARACKLIS, 1982).
Classicamente, o processo de formação do biofilme é dividido em cinco etapas,
resultado de vários processos químicos, físicos e biológicos, tais como, pH, osmolaridade,
temperatura, disponibilidade de carbono e ferro e a própria natureza da superfície de adesão
(DONLAN, 2002, O´TOOLE, KAPLAN, KOLTER, 2000)
O primeiro passo na formação do biofilme é a adesão das bactérias planctônicas à
uma superfície e ocorre de forma aleatória, através do movimento browniano e da força
gravitacional, ou de modo dirigido, via quimiotaxia e motilidade (O´TOOLE; KOLTER,
1998) (Etapa 1 da Figura 2). Esta primeira adesão é reversível e é mantida por interações
físico-químicas não específicas, que incluem forças hidrodinâmicas, interações
eletrostáticas, força de Van der Walls e interações hidrofóbicas (KUMAR; ANAND, 1998).
No momento em que as forças de repulsão são maiores que as de atração, as bactérias
podem facilmente se desprender do substrato. A superfície na qual ocorre a adesão
geralmente apresenta um filme condicionante que pode ser composto por muitas partículas
orgânicas ou inorgânicas, constituindo o alicerce para o crescimento do biofilme
(GARRETT et al. 2002).
A segunda fase da adesão consiste na transição do estágio reversível para o
irreversível (Etapa 2 da Figura 2). As bactérias passam a secretar o EPS e adesinas que
interagem com a superfície, contribuindo para a irreversibilidade da adesão (STOODLEY
et al., 2002, HOUDT; MICHIELS, 2005). Nesta fase há o início da formação de
microcolônias e do desenvolvimento da arquitetura do biofilme maduro (Etapas 3 e 4 da
Figura 2), envolvendo a produção de polímeros extracelulares que servem como matriz
10
adesiva e que sequestram nutrientes do ambiente. Os biofilmes maduros apresentam
estrutura semelhante a cogumelos, que são envoltos por EPS e rodeados por poros e canais
de água que funcionam como um sistema de difusão de nutrientes, oxigênio e metabólitos.
A quinta e última fase da formação do biofilme ocorre quando o ambiente não é
mais favorável à sua manutenção e consiste no descolamento do biofilme maduro (Etapa 5
da Figura 2) em forma de agregados celulares ou células planctônicas, ocorrendo de forma
ativa (dispersão), induzida por um processo mecânico (passiva) ou química quando são
adicionadas substâncias que dissolvem o EPS. Após desprendidas, as bactérias livres
podem colonizar novos nichos, reiniciando a formação de novos biofilmes (HALL;
STOODLEY et al., 2004, STOODLEY et al., 2002).
FIGURA 2. Etapas de formação do biofilme.
Fonte: Nature Reviews Microbiology 12, 781–787 (2014)
A heterogeneidade do biofilme pode ser observada no controle da expressão gênica
durante os diferentes estágios de desenvolvimento. Nos estágios iniciais observa-se maior
expressão de genes flagelares, fimbriais (como fímbria tipo I e tipo IV) e adesinas. Esses
genes são importantes nos estágios iniciais do biofilme, pois estão diretamente relacionados
com a capacidade da bactéria conseguir chegar ao local aonde o biofilme irá se fixar além
de contribuir com a aderência das bactérias às superfícies (PRATT; KOLTER, 1999).
11
À medida que o biofilme amadurece, outros genes passam a ser expressos e outros
reprimidos. No biofilme maduro há uma alta expressão de genes relacionados à produção
dos componentes da matriz extracelular, composta por polissacarídeos, proteínas, ácidos
nucleicos e lipídios. Os genes flagelares são reprimidos, uma vez que as células bacterianas
passam a se adaptar à vida séssil.
O estresse ambiental leva ao descolamento (dispersão) do biofilme maduro e, nessa
fase, observa-se novamente a alta expressão de genes flagelares e adesinas, que permitem a
colonização de novos nichos (MACDOUGALD et al., 2011).
A regulação dos genes relacionados à formação de biofilme parece ser exercida por
pelo menos dois sistemas de sinalização, que podem agir individualmente ou em conjunto.
O primeiro é o Quorum sensing, sistema baseado na sinalização célula-célula, densidade
dependente, no qual bactérias respondem à moléculas sinalizadoras denominadas auto-
indutoras, produzidas por indivíduos da mesma espécie, de outras espécies ou ainda de
outros organismos, modulando uma resposta conjunta. O segundo sistema envolove o
mensageiro secundário Bis-(3´-5´)-monofosfato de guanosina cíclico (c-di-GMP), uma
pequena molécula intracelular que responde a diversos estímulos sensoriais e que através de
sua síntese e degradação regula diversos processos celulares (BOYD; O´TOOLE, 2012,
BARRIOS et al., 2005, STANKOWSKA et al., 20012, CAMILLI; BASSLER, 2006).
Recentes estudos descrevem que amostras de EPEC são capazes de formar biofilme
em superfícies bióticas e abióticas, entretanto, ainda se sabe muito pouco sobre os
mecanismos de formação de biofilme por este patótipo (MOREIRA et al., 2006; WEISS-
MUSZKAT et al., 2010; CULLER et al., 2014; NASCIMENTO et al., 2014)
1.6 c-di-GMP
Bis-(3´-5´)-monofosfato de guanosina cíclico (c-di-GMP) é uma pequena molécula
intracelular que responde de maneira integrada a múltiplos estímulos sensoriais. Estudos
recentes demonstram que c-di-GMP é o mensageiro secundário mais utilizado por bactérias
(MILLS et al., 2011). Descrito inicialmente como ativador alostérico da síntese de celulose
em Acetobacter xylinum (atualmente Gluconacetobacter xylinus) por Benziman e
12
colaboradores (Ross et al., 1987), regula uma grande variedade de processos enzimáticos,
transcricionais e pós traducionais que impactam fisiologicamente a formação de biofilme,
sinalização célula-célula, diferenciação, motilidade e virulência bacteriana. A molécula c-
di-GMP também participa da sinalização entre reinos e é reconhecida pelo sistema imune
de mamíferos, sendo um promissor adjuvante vacinal (POVOLOTSKY; HENGEE, 2011,
RÖMLING; GALPERIN; GOMELSKYC, 2013).
C-di-GMP é sintetizada pela diguanilato ciclase (DGC) a partir de duas moléculas
de GTP. Proteínas com atividade DGC possuem um domínio de aminoácidos (Gly- Gly-
Asp-Glu-Phe) conservado denominado GGDEF (RYJENKOV et al., 2005), é hidrolisada
por fosfodiesterases (PDEs) específicas, cuja atividade está associada a domínios EAL
(Glu-Ala-Leu) ou HD- GYP. Após a hidrólise, a molécula é convertida em
5'fosfoguanilil(3'->5')guanosina (pGpG), que é quebrada em duas moléculas de guanosina
monofostato (GMP) (HENGE, 2009; SCHIRMER; JENAL, 2009). (Figura 3).
As diguanilato ciclases são dímeros compostos por duas subunidades que contêm o
domínio GGDEF. O sítio ativo, denominado Sítio A, está localizado na interface entre as
duas subunidades, cada uma ligada a uma molécula de GTP. Além do sítio A, muitas DGCs
possuem um segundo sitio de ligação denominado Sitio I, caracterizado por um motivo
RxxD e que atua como um inibidor alostérico da atividade das DGCs, prevenindo assim o
consumo excessivo de GTP e limitando o acúmulo de c-di-GMP (CHRISTEN et al., 2006,
RJYENKOV et al., 2005, HENGE, 2009).
As PDEs são enzimas monoméricas capazes de linearizar o c-di-GMP num processo
catalítico que requer a presença dos íons Mg2+
e Mn e são inibidas por Ca2+
e Zn2+
(CHRISTEN et al., 2006, HENGE 2009). Em uma única proteína, é possível encontrar os
domínios EAL /HD-GYP e GGDEF juntos ou apenas um desses domínios, sendo comum a
presença de EAL e GGDEF juntamente com outros domínios regulatórios e sensoriais,
como os sistemas de dois componentes REC, PAS, GAF e BLUF entre outros (WEBER et
al., 2006, SCHIRMER; JENAL, 2009). O número de proteínas EAL/GGDEF é bastante
variável entre as espécies bacterianas, E.coli, por exemplo, possui 29 domínios
EAL/GGDEF (RÖMLING; GALPERIN; GOMELSKY, 2013).
13
Para exercer sua função, c-di-GMP precisa se ligar e alterar alostericamente a
estrutura de uma molécula efetora. A variedade de moléculas efetoras permite o controle de
diferentes vias regulatórias através de regulação pós-traducional, quando ligadas à proteínas
que possuem o domínio PilZ, (Figura2) traducional, quando interagem com domínios de
mRNA (“riboswitches”), e transcricional, através da ligação de c-di-GMP com fatores de
transcrição, como FleQ de Pseudomonas aeruginosa (MILLS et al., 2011).
A sinalização do mensageiro secundário permite uma resposta celular quase
imediata à mudanças ambientais, pois a energia dispensada na regulação alostérica e pós-
traducional é menor e mais rápida quando comparada ao processo de síntese ou degradação
de constituintes complexos. Além disso, a associação das GGDEF/ EAL com outros
domínios regulatórios também contribuem para resposta celular. Deste modo, mudanças na
atividade de proteínas complexas como as do aparato flagelar podem ocorrer rapidamente
como resposta a adaptação a diferentes condições ambientais (MILLS et al., 2011).
FIGURA 3. Esquema simplicado de síntese e degração do mensageiro secundário. A molécula de c-di-
GMP é sintetizada a partir de duas moléculas de GTP através a ação de diguanilato ciclase e é hidrolisada
por fosfodiesterases em 5' fosfoguanilil(3'->5')guanosina (pGpG), que é quebrada em duas moléculas de
guanosina monofostato (GMP). Para ser ativo, entrento, c-di-GMP precisa se ligar a uma molécula
efetora, como por exemplo, moléculas que apresentem o domínio PilZ. (Adaptado de Schirmer e Jenal
Nat. Rev. Microbiol, 2009 v.7, p. 725-735)
14
1.7. YcgR, domínio PilZ e o controle da maquinaria flagelar
O gene ycgR foi identificado pela primeira vez em um estudo que analisava o papel
da proteína H-NS na função flagelar em amostra de E.coli (KO; PARK, 2000). H-NS
regula positivamente o regulon flagelar (BERTIN et al., 1994) e interage com FliG para
modular a velocidade rotacional do flagelo (DONATO; KAWULA, 1998). No trabalho de
Ko e Park (2000), mutantes de E.coli com deleção no gene hns apresentaram redução na
expressão do operon flhDC com consequente falha na produção do flagelo. Em mutantes
com superexpressão de flhDC a formação do flagelo era restaurada mas as amostras
continuavam imóveis. A velocidade de “swimming” na amostra com deleção hns foi quase
totalmente restaurada com a inserção de ycgR e parcialmente recuperada pela inserção de
yhjH. A análise dos promotores de ycgR e yhjH indicou que ambos faziam parte do regulon
flagelar, porém sua participação na regulação do motor flagelar era incerta. Os autores
sugeriram que as proteínas do estator não eram capazes de se associar corretamente aos
componentes do rotor no mutante hns, resultando em um motor defectivo.
O primeiro receptor de c-di-GMP, designado domímio PilZ, foi predito por
bioinformática como parte de uma proteína do complexo glicosiltransferase celulose sintase
de G. xylinus por Amikam e Galperin em 2006. Os autores observaram que
aproximadamente 100 aminácidos da região C-terminal da subunidade BcsA
glicosiltransferase formam um domínio proteico, também presente “downstream” em
algumas proteínas EAL ou GGDEF/EAL e, por isso, foi considerado um candidato a
receptor de c-diGMP. Esse domínio foi identificado em diversas espécies bacterianas. O
nome PilZ é decorrente da proteína PilZ, que em Pseudomonas aeruginosa está envolvida
exclusivamente na sínstese de fímbria do tipo IV (ALM et al., 1995). Após a descrição do
domínio PilZ, diversos trabalhos experimentais comprovaram a teoria de Amikam e
Galperin, descrevendo uma grande variedade de receptores contendo esse domínio em
diferentes espécies bacterianas, como a proteína YcgR de E. coli (RYJENKOV et al.,
2006), DgrA de Caulobacter crescentus (CHRISTEN et al., 2007), PlzC e PlzD de Vibrio
cholerae (PRATT et al., 2007).
15
A compreensão de como YcgR participa do controle da maquinaria flagelar se inicia
com trabalho de Ryjenkov e colaboradores (2006), que testaram a hipótese de que YcgR se
ligaria ao c-di-GMP através do domínio PilZ. Através da obtenção de mutantes duplos
yhjH/ycgR, esses autores observaram que houve um aumento no “swimming” e “swarming”
no mutantate, quando comparado a mutantes com deleção apenas em yhjH. Além disso, a
mutação pontual de ycgR não restaurou completamente a motilidade no mutante duplo,
sugerindo que ycgR regula a motilidade de maneira dependente de c-di-GMP.
O flagelo bacteriano é composto por uma estrutura central aconrada à membrana
interna e externa da célula denominada corpo basal, um filamento proteico externo
composto por subunidades repetidas de flagelina, responsável pela antigenicidade
bacteriana, e um gancho localizado externamente à célula, que permite a junção do corpo
basal e do filamento (MACNAB, 1992). O motor flagelar é composto pelas proteínas
estatoras MotA e MotB e o rotor flagelar, que está localizado no lado citoplasmático do
flagelo, é composto por 3 subunidades, FliG, FliM e FliN. O fluxo de prótons que passa
através dos canais iônicos do complexo MotAB, ligando-se aos resíduos Asp de MotB e
alterando conformacionalmente MotA, estimulam a interação eletrostática entre Mot A e
FliG e, consequentemente, o torque que dirige a rotação do flagelo. Proteínas
quimiostáticas respondem a estímulos ambientais, transmitindo sinais para o motor. O
estado fosforilado do regulador de resposta CheY, influencia sua habilidade de interagir
com os componentes do rotor flagelar. Quando CheY-P fosforilado interage com FliM, há
uma alteração da interação entre FliM e a porção C-terminal de FliG, induzindo a
modificação na interface rotor- estator entre FliG e MotA, resultando na mudança de
rotação do flagelo (TERASHIMA et al., 2008).
Os níveis de c-di-GMP controlam a motilidade flagelar através da interação do
complexo YcgR/c-di-GMP com os componentes citoplasmáticos do complexo flagelar.
Diferentes grupos apresentam teorias de como ocorre esse mecanismo. Paul e
colaboradores (2010) propõem um modelo denominado “Backstop brake”, no qual YcgR/c-
di-GMP atua nas proteínas do rotor flagelar, ligando-se a FliM e interrompendo a interação
FliG-FliM, o que reduz a eficiência da geração do torque e induz a rotação anti-horária do
flagelo, ou ligando-se a FliG, promovendo sua reorientação e interrompendo a interação
16
FliG-MotA, reduzindo assim a geração do torque (Figura 4a). Fang e Gomelsky (2010),
sugerem que YcgR/c-di-GMP se liga a FliG e aumenta a rotação anti-horária do flagelo
através da interrupção da interação entre FliG e FliM (Figura 4b). Boehn e colaboradores
(2010), sugerem que YcgR/c-di-GMP interage com a proteína MotA e reduz a função do
motor flagelar (Figura 4c). Este modelo, ao contrário do proposto por Paul e colaboradores
(2010) e Fang e Gomelsky (2010), não envolve a mudança do sentindo de rotação do
flagelo. A interação entre YcgR/c-di-GMP interfere na transferência de energia entre o
rotor e o estator, agindo como um “freio” e reduzindo a rotação do flagelo.
A regulação do flagelo através de YcgR é determinada pela sua ligação ao c-di-
GMP, portanto, tanto a atividade de YcgR quanto a motilidade bacteriana estão sob
controle pós-traducional através da síntese e degradação de c-di-GMP (MILLS et al.,
2011). A enzima regulatória flagelar YhjH, uma PDE, é necessária para manter os níves de
c-di-GMP baixos o suficiente para prevenir que YcgR iniba a motilidade (KO; PARK,
2000). Mudanças ambientais modulam a expressão das DGCs levando ao aumento da
concentração de c-di-GMP e/ou YhjH, facilitando a interação YcgR/c-di-GMP modulando
a motilidade (CHRISTEN et al., 2010).
17
FIGURA 4. Esquema simplificado dos modelos efetores de c-di-GMP que impactam na transição do estado
móvel para séssil em E.coli, através da interação de YcgR/c-di-GMP. (a) interação de YcgR/c-di-GMP com
FliG, interrompendo sua associação com FliM, provocando um aumento da rotação anti-horária do flagelo
(Fang; Gomelsky, 2010) (b) interação de YcgR-c-di-GMP com FliG, interrompendo sua ligação com MotA,
e com FliM, interrompendo sua interação com FliG provocando o “Backstop brake”, que consiste na
redução na eficiência da geração do torque e indução do movimento anti-horário (Paul et al., 2010) (c)
interação de YcgR/c-di-GMP com MotA reduzindo a função do motor flagelar (Boehm et al., 2010).
Adaptado de Boyd e O´Toole. Annu. Rev. Cell.Dev. Biol. 2012, 28:439-62.
18
II. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi analisar o papel do gene ycgR na motilidade e
formação de biofilme em uma amostra de Escherichia coli enteropatogênica atípica.
19
III. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Meios de cultura e soluções
Os meios de cultura e soluções utilizados neste estudo foram preparados de acordo
com a especificação dos fabricantes ou ainda conforme descrito por Sambrook et al.
(1989).
3.2 Amostras bacterianas e plasmídeos
As amostras bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo estão descritas na
tabela 1. A amostra de aEPEC 320, sorotipo 055:H7, pertence à coleção do laboratório de
Bacteriologia do Instituto Butantan. O plasmídeo pKD46 foi utilizado para expressar os
genes do sistema recombinase red e o plasmídeo pkD3 como molde para obtenção do genes
de resistência ao antibiótico cloranfenicol.
TABELA 1. Amostras bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo
Amostra Característica Origem ou referência
BA 320 aEPEC, sorotipo O55:H7 BUERIS et al., 2007
JH01 O55:H7Δ ycgR::cat Este estudo
JH02 JH01 contendo pJHS01 Este estudo
Plasmídeos
pkD46 Plasmídeo auxiliar contendo os genes das enzimas
de recombinação (sistema λ-Red), AMPr
Datsenko e Wanner,
2000
pkD3 Molde para a amplificação do cassete de
recombinação (sistema λ- Red),CATr
Datsenko e Wanner,
2000
pBAD Myc-
His-A Vetor de expressão Invitrogen
pJHS01 plasmídeo pBAD Myc-His contendo ycgR –
Complementação Este estudo
20
3.3. Técnicas de manipulação e análise de DNA
3.3.1 Obtenção de DNA genômico, purificação e extração de plasmídeos
Para a extração dos plasmídeos, necessários para deleção do gene ycgR através da
técnica da recombinação homóloga, amostras albergando o plasmídeo pKD46, sensível a
temperaturas superiores a 30 ºC, foram cultivadas em 3 mL de meio Luria- Bertani, Miller
(LB), (Difco, EUA) com 10 µg/mL de ampicilina a 30 ºC por 18 h. As amostras com
plasmídeo pKD3 foram crescidas à 37 ºC por 18 h em 3 mL de meio LB com 20 µg/mL de
cloranfenicol. Todos os plasmídeos foram extraídos e purificados através do kit
PureYieldTM
Plasmid midiprep System (Promega Co. EUA).
Para obtenção do DNA genômico, a amostra BA320 foi crescida em 3mL de meio
LB 37 °C por 18 h. Após este período, uma alíquota de 1 mL foi transferida para um tubo
de 1,5 mL e centrifugado durante 5 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e
a massa bacteriana foi resuspensa em 500 µL de água ultra pura e então fervida em banho-
maria por 10 min, seguido de um banho de gelo por mais 10 min e mais uma etapa de
centrifugação.
3.3.2 Desenho dos iniciadores para detecção e deleção do gene ycgR
Os iniciadores para detecção do gene ycgR (ycgR_DT) foram confeccionados com
base na sequência da amostra de E.coli K-12 substr.MG 1655 (NCBI Reference Sequence:
NC_000913.2). Este iniciador foi utilizado tanto na detecção do gene ycgR como para
confirmação da deleção do gene após a recombinação homóloga, e foi confeccionado
flanqueando as regiões onde foi inserido o cassete de resistência no cromossomo da
bactéria. Os iniciadores para deleção dos genes ycgR (ycgR_MUT) foram confeccionados
conforme Datsenko e Wanner (2000). Estes iniciadores contém 50 pb de homologia com a
região flaqueadora do gene a ser deletado e 40 pb de homologia com a região referente ao
gene de resistência ao antibiótico cloranfenicol contido no plasmídeo pkD3. Os iniciadores
utilizados na detecção do gene e na deleção através do sistema de recombinação lambda red
estão descritos na tabela 2.
21
3.3.3. Técnica da Reação da Polimerase em cadeia (PCR) – detecção do gene ycgR e
obtenção do cassete de resistência
Para cada PCR foram utilizados 40 pmol de cada um dos iniciadores, 1,0 U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen, EUA), 1,5 mM de MgCl2, 200 mM da mistura de dNTPS
(Invitrogen, EUA) e tampão de reação (200 mM Tris-HCl (pH 8.4), 500 mM KCl ) 10X
concentrado. Foram utilizadas 100 ng do DNA molde para a detecção do gene ycgR, obtido
de acordo com o item 3.2.1. Para a obtenção do cassete de resistência utilizou-se como
DNA molde 50 ng do plasmídeo pKD3 previamente extraído conforme o item 3.2.1. As
condições de reação estão indicadas na tabela 3. Os amplicons obtidos na reação foram
analisados através de eletroforese em gel de agarose 1,5% (Invitrogen, EUA) em tampão
TAE 1x (10 mM Tris-acetato, 2 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)). Após o fim
da corrida eletroforética, os géis foram corados em solução de brometo de etídio (0,5
μg/mL). Os amplicons obtidos correspondentes ao cassete de resistência foram
posteriormente purificados do gel de agarose com o kit GFX PCR DNA and gel Band
Purification Kit (GE Healthcare, EUA), conforme recomendações do fabricante e o DNA
quantificado.
3.3.4. Indução do estado de competência e transformação da amostra O55:H7 com
plasmídeo pKD46
Para a indução do estado de competência, a amostra O55:H7 foi crescida em 40 ml
de meio LB sob agitação de 200 rpm a 37 °C até atingir DO600 de 0,6. Após este período, o
crescimento bacteriano foi resfriado em banho de gelo por cerca de 10 min. Em seguida, o
volume total de cultura foi centrifugado a 6000 rpm por 10 min a 4 °C e o sobrenadante foi
desprezado. O sedimento obtido foi ressuspendido em 20 mL de água ultrapura gelada,
estéril e centrifugado novamente. O mesmo procedimento foi repetido por 4 vezes. Na
última lavagem, o sedimento foi ressuspendido em 1 mL de água ultrapura e uma alíquota
de 50 µL foi transferida para um tubo de 0,6 µL, onde 10 μl do plasmídeo pKD46 extraído
foi adicionado à alíquota de células competentes para então ser eletroporada em cubetas de
eletroporação (0,1 cm – BIORAD) previamente resfriadas. Para eletroporação foi utilizado
o eletroporador GenePulser (BIORAD) a 1,5 kV, 25 μF e 200 Ω. Imediatamente após a
22
eletroporação, o conteúdo da cubeta foi transferido para um tubo com 1 mL de meio SOC
(0,5% de Extrato de Levedura, 2% de Triptona, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM
de MgCl2, 10 mM de MgSO4 e 20 mM de glicose) e em seguida incubado a 30 ºC durante
3 h. Após esse período, os cultivos foram plaqueados em ágar LB contendo 100 μg/ml de
ampicilina (Sigma-Aldrich, MO, EUA) e novamente incubados a 30 °C por 24 h. As
colônias obtidas foram selecionadas e crescidas em 3 mL de meio LB para verificar a
presença do plasmídeo pKD46 após extração com o Kit PureYield™ Plasmid Miniprep
System (Promega Co. EUA). Amostras contendo o plasmídeo foram estocadas em glicerol
80% a -20 ºC e -80 ºC.
3.3.5 Preparo de células competentes da amostra O55:H7(pKD46) para eletroporação
com os cassetes de resistência
A amostra transformante O55:H7 contendo o plasmídeo pKD46 foi crescida a 30 ºC
por 18 h em meio LB acrescido de 100 μL/mL de ampicilina. Uma alíquota de 400 μL
deste pré-inóculo foi transferida para um frasco contendo 40 mL de meio LB acrescido de
100 μL/mL de ampicilina e 1 mM de L- arabionose (Sigma-Aldrich, MO, EUA), mantido
sob agitação de 200 rpm a 30 ºC. Após 1 h de incubação, foi adicionado mais 1 mM de L-
arabionose e a cultura foi mantida nas mesmas condições até atingir DO600 de 0,6. Em
seguida, a amostra foi submetida ao protocolo de competência, conforme descrito no item
3.3.4. A uma alíquota de 100 μL de células competentes foram adicionados 50 ng do
cassete de resistência e as células foram transformadas por eletroporação como descrito no
item 3.3.4. Imediatamente após a eletroporação, o conteúdo da cubeta foi transferido para
um tubo contendo 3 mL de meio SOC e incubado a 37 ºC por 18 h. O cultivo foi plaqueado
em ágar LB contendo 20 μg/ml de cloranfenicol (Sigma-Aldrich, MO, EUA) e incubado
novamente a 37 °C por 24 h. Após esse período, as colônias obtidas foram testadas através
de PCR com os iniciadores ycgR_DT para confirmar a deleção do gene de interesse. As
colônias que apresentaram a deleção do gene ycgR foram estocadas em glicerol 80% a -20
°C e -80 °C. Uma amostra foi escolhida para ser sequenciada no Centro de Estudos de
Genoma Humano (USP-SP) e denominada amostra mutante JH01.
23
3.3.6 Obtenção do plasmídeo pBAD/Myc-HisA linearizado
O plasmídeo pBAD/Myc-HisA (Invitrogen, EUA), foi eletroporado na amostra E.
coli TOP-10 (Invitrogen, EUA). O estado de competência foi obtido de acordo com o item
3.3.4 As colônias transformadas foram selecionadas em placas contendo 100 μg/ml de
ampicilina e estocadas em glicerol 80%. As colônias selecionadas foram crescidas em 3 mL
de meio LB para extração e purificação do plasmídeo através do kit PureYieldTM
Plasmid
midiprep System (Promega Co., EUA). Os plasmídeos obtidos foram digeridos com as
enzimas XhoI e EcoRI (New England Biolab) de acordo com as indicações do fabricante
para linearizá-los.
3.3.7 Obtenção do inserto ycgR e ligação no plasmídeo pBAD/Myc-HisA
O inserto ycgR foi obtido através de PCR com os iniciadores XhoI e EcoI (Tabela
2). A PCR foi executada conforme o item 3.3.3. Como DNA molde foi utilizado o DNA da
amostra selvagem O55:H7 obtido conforme descrito no item 3.2.1. e as condições de reação
estão descritas na tabela 3. Os amplicons obtidos foram analisados através da eletroforese
em gel de agarose 1,5% (Invitrogen, EUA) em tampão TAE 1x (10 mM Tris-acetato, 2 mM
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)). Após o fim da corrida eletroforética, os géis
foram corados em solução de brometo de etídio (0,5 μg/mL) e os amplicons extraídos do
gel de agarose com o kit GFX PCR DNA and gel Band Purification Kit (GE Healthcare,
EUA), conforme recomendações do fabricante. O produto da purificação foi submetido a
uma nova corrida eletroforética em gel de agarose 1,5% para posterior purificação. O
inserto ycgR foi digerido com as enzimas XhoI e EcoRI (New England Biolabs) de acordo
com as especificações do fabricante. A ligação do inserto ycgR com o plasmídeo
pBAD/Myc HisA foi feita com a enzima T4 ligase (Thermo scientific) seguindo as
especificações sugeridas pelo fabricante.
24
3.3.8. Indução do estado de competência e transformação da amostra TOP- 10 com
pBAD Myc HisA + inserto ycgR
Um pré-inóculo da amostra TOP-10 foi crescido a 37 ºC por 18 h em meio LB.
Após este período, 400 μL deste pré-inóculo foi transferido para 40 mL de meio LB e
incubado sob agitação de 200 rpm a 37 ºC até a DO600 de 0,6. O volume total de
crescimento foi centrifugado a 6000 rpm a 4 °C por 10 min. O sobrenadante foi descartado
e o sedimento obtido foi ressuspendido em 20 mL de CaCl2. Este processo foi repetido
mais 4 vezes e o sedimento foi ressuspendidoem 100 µL de CaCl2. Uma alíquota de 50 µL
foi transferida para um tubo de 0,6 µL e acrescido de 10 ng do plasmídeo pBAD/Myc
HisA+inserto ycgR . Em seguida, o tubo foi mantido em banho de gelo por 30 seg, seguido
por uma incubação de 1 min e 30 seg a 42 °C e novo banho de gelo por 2 min. As células
competentes foram transferidas para um tubo contendo 1 mL de meio SOC e incubadas a
37 °C por 3 h. O cultivo foi plaqueado em ágar LB contendo 100 μg/ml de ampicilina por
18 h. Após este período, colônias transformantes foram selecionadas e foram realizadas
reações de PCR. Um amostra foi selecionada e o plasmídeo extraído através do kit
PureYieldTM
Plasmid midiprep System (Promega Co., EUA).
3.3.9. Transformação da amostra mutante JH01 com o plasmídeo pBAD Myc His A
ycgR
Um pré-inóculo da amostra mutante JH01 foi crescido a 37 ºC por 18 h em meio
LB. Após este período, 400 μL foram transferidos para 40 mL de meio LB e incubado sob
agitação de 200 rpm a 37 ºC até atingir DO600 de 0,6. O estado de competência e posterior
transformação foram feitos como no item 3.2.4. Colônias transformantes foram
selecionadas e estocadas em glicerol 80% à -20 °C e -80 °C para posterior confirmação da
complementação por PCR utilizando inciadores internos e externos ao gene ycgR. As
condições de reação estão descritas na tabela 3.
25
TABELA 2. Iniciadores utilizados na detecção do gene ycgR, na deleção através do sistema de
recombinação lambda red, na obtenção do inserto ycgR para complementação da amostra
mutante JH01 e para detecção da complementação
Iniciadores Sequência 5´-3´ Tamanho
(pb) Referência
ycgR_DT F-AACTTGAGCAGGCACTGG
R- ACAGTTTGTCAGTCAGGAG 793
Este
trabalho
ycgR_MUT
F- GGCTCCGCGCTATATCTACAAACTTGAGCAGGCACTGGACGCGA
TGTAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
R- AACTGTGACCGATAAACCAAAGACAGTTTGTCAGTCAGGAGTTT
TTCCGCATGGGAATTAGCCATGGTCC
1094
Este
trabalho
ycgR_Eco_Xho F- GTCGCTCGAGGTGAGTCATTACCATGAGCA
R- GTCGGAATTCTCAGTCGCGCACTTTGTC 756
Este
trabalho
ycgR_INT F-ATTGCCGCTCCACCGTCG
R-CAACTACAGCAGAGTAATA 409
Este
trabalho
TABELA 3 Condições para realização dos ensaios de PCR
Iniciadores Denaturação anelamento polimerização quantidade de ciclos
ycgR_DT 1min 94°C 1min 56°C 1min 72°C 30X
ycgR_MUT 1min 94°C 1 min56°C 1min 72°C 30X
ycgR_Eco_Xho 1min 94°C 1 min 55°C 1min 72°C 30X
ycgR_INT 1min 94°C 1min 56°C 1min 72°C 30X
3.4. Analises transcricionais
3.4.1. Extração de RNA
Pré-inóculos das amostras selvagem O55:H7 e mutante JH01 foram crescidos em 3
mL de meio LB por 18 h. Uma alíquota de 200 µL foi transferida para 20 mL de meio LB
para posterior incubação sob agitação de 200 rpm a 37 °C até atingir a DO600 de 0,5. O
crescimento bacteriano foi centrifugado a 6000 rpm a 4 °C por 10 min. O sobrenadante foi
26
descartado e o sedimento foi ressuspendido em água ultra pura para posterior extração com
o kit RNeasy (Qiagen). O RNA obtido foi quantificado.
3.4.2. PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
Análises transcricionais foram feitas com a utilização do sistema de etapa única
Kapa Sybr Fast One- Step qRT-PCR kit (Kapa biosystemns, EUA). As reações foram
realizadas de acordo com a indicação do fabricante. Para o controle endógeno da
transcrição de foi utilizado o gene rpoA (subunidade A da RNA polimerase). Todas as
análises foram realizadas em triplicata. Os níveis de transcrição foram analisados utilizando
o software LineGene 9600 (Hangzhou Bioer Technology) através da quantificação relativa.
Os iniciadores utilizados estão descritos na tabela 4.
TABELA 4. Iniciadores utilizados nos ensaios de qRT-PCR
Iniciadores Sequência (5´-3´) Referência
ler_RT
F- CGACCAGGTCTGCCCTTCT
R- GCGCGGAACTCATCGAAA
Walters; Sperandio,
2006
eae_RT
F- GCTGGCCCTTGGTTTGATCA
R- GCGGAGATGACTTCAGCACTT
Walters; Sperandio,
2006
espA_RT
F- TCAGAATCGCAGCCTGAAAA
R- CGAAGGATGAGGTGGTTAAGCT
Walters; Sperandio,
2006
csgD_RT R – TGCCCAGGAAACCGCTTG
F - GGTAACTATCGTTATAACAGCA Culler, 2015
fimA_RT F – TGTCCCTCAGTTCTACAGCG
R – TCCTAACTGAACGGTTTGATC
Sharma, Bearson,
Bearson, 2010
bscA_RT F – AGCTCGGCTTCCGTGGC
R – TCATTGTTGAGCCAAAGCCT Culler, 2015
rpoA_RT
F- GCGCTCATCTTCTTCCGAAT
R- CGCGGTCGTGGTTATGTG
Walters; Sperandio,
2006
27
3.5 Ensaios Fenotípicos
3.5.1. Teste de motilidade em ágar semi-sólido
As amostras O55:H7, JH01, e JH02 foram incubadas por 18 h em 3 mL de meio LB
a 37 ºC. Com o auxílio de uma agulha, as amostras foram inoculadas em placa de ágar
semi-sólido 0,3% (1% triptona, 0,25% NaCl e 0,3% ágar bacteriológico) e incubadas por 7
h. Para o ensaio com a amostra mutante complementada, o meio ágar semi-sólido foi
suplementado com 0,02% de L-arabinose (Sigma, EUA).
3.5.2 Curva de crescimento
As amostras O55:H7, JH01 e JH02 foram incubadas por 18 h em 3 mL de meio LB
a 37 ºC. Uma alíquota de 250 μL foi transferida para um volume de 25 mL de meio LB.
Para a amostra mutante complementada, o meio foi suplementado com 0,02% de L-
arabinose. Todos os crescimentos foram incubados a 37 ºC sob agitação de 200 rpm. A
cada 1 hora, uma alíquota de 1 mL foi retirada de cada um dos cultivos para ser mensurada
a densidade óptica (D.O.) a 600nm. Este procedimento foi repetido por 9 horas.
3.5.3. Ensaios de formação de biofilme em superfície abiótica – Técnica de Cristal
Violeta
A análise quantitativa da formação de biofilme em placas de poliestireno foi
realizada seguindo a metodologia descrita por Christensen et al. (1985) e Sheikh et al.
(2001). Os pré-inoculos bacterianos das amostras O55:H7, JH01 e JH02 foram incubadas
por 18 h a 37 °C em meio DMEM. Em seguida os cultivos bacterianos foram inoculados
em meio DMEM na diluição 1:100 em placas de poliestireno de 24 poços (TPP, Suíça) em
volume final de 1 ml. O meio DMEM utilizado no ensaio com a amostra JH02 foi
suplementado com 0,02% de L-arabinose. Após 3, 6 e 24 h de incubação, foram feitas 4
lavagens com tampão fosfato (PBS) (NaCl 136,9 mM, KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM,
Na2HPO4 8,1 mM; pH 7,4) para remoção das bactérias planctônicas. Após a retirada do
excesso do PBS, as bactérias foram fixadas com 1000 μl de etanol a 75% por 10 min. O
28
fixador foi retirado e as bactérias coradas com 1000 μl de solução de cristal violeta a 0,5%,
durante 5 min. Após 4 lavagens com PBS, as placa foram secas e 1000 μl de etanol 95%
adicionado em cada poço, deixando solubilizar o cristal violeta por 2 min à temperatura
ambiente. 150 μl de cada poço foram transferidos uma placa de microtitulação de 96 poços
e a absorbância determinada em comprimento de onda de 595 nanômetros (nm) em leitor
de ELISA Multiskan®EX (Thermo Isher Scientific, EUA).
3.5.4. Ensaios de adesão e de formação de biofilme em células epiteliais in vitro
3.5.4.1. Cultivo e preparo da linhagem celular HEp-2
A linhagem celular HEp-2 foi cultivada em garrafas de 25 ml (TPP, Suiça) em Meio
DMEM suplementado com 0,4% de glicose e contendo L-glutamina (Cultilab, Brasil),
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Gibco) e incubadas em estufa a 37 ºC
contendo 5% de CO2 e 95% de O2, durante três a quatro dias. Após esse período, o meio de
cultivo foi descartado e a monocamada celular foi lavada 4 vezes com 10 ml de PBS estéril.
Após este processo, 2 mL de solução TripLE estéril (Gibco) foi adicionado para o
descolamento da monocamada celular. A solução ficou em contato com a monocamada
celular por 3 min,em estufa de CO2, logo em seguida foram adicionados 5 ml de DMEM-
SFB a 10% na garrafa e a suspensão celular foi então ajustada através de contagem em
câmara de Neubauer (Glastécnica) e diluída em DMEM-SFB a 10% de maneira a obter
uma concentração final de 5 x 104 células/mL. Volumes de 1 mL foram transferidos para
placas de poliestireno de 24 poços com e/ou sem lamínulas de vidro esterilizadas. As placas
foram mantidas a 37 °C em estufa de CO2 por 48 h, até atingirem semi-confluência de
crescimento celular.
3.5.4.2.Teste de adesão em células HEp-2
O teste de adesão foi realizado segundo a metodologia descrita por Cravioto et al.
(1979), utilizando-se monocamada semi-confluente de células dispostas em placas de 24
poços contendo lamínulas de vidro, conforme descrito no item anterior. Após atingirem
semi-confluência, as monocamadas celulares foram lavadas 4 vezes com PBS estéril pH
29
7,4. 1 mL de DMEM acrescido de 1% de D- manose e 0,02% L-arabinose foi adicionado a
cada poço da placa. Para o teste de adesão 40 μl de cultura bacteriana das amostras
amostras O55:H7, JH01 e JH02, previamente cultivadas por 18 h em meio LB, foram
inoculadas à preparação e mantidas por um período de 3 e 6 h à temperatura de 37ºC. Para
o teste de 6 horas, após as 3 primeiras horas de incubação a placa foi lavada por 4 vezes
com PBS 1X e novamente adicionada de 1 ml de DMEM acrescido de 1% de D-manose
(Sigma. EUA) e 0,02% de L-arabinose. Alcançado o tempo final do ensaio, os poços foram
lavados 4 vezes com PBS estéril e as células fixadas com metanol 100% por 30 min. As
lamínulas foram coradas com solução May – Grünwald 0,2% (Merk, Alemanha) por 5 min
seguida por coloração com Giemsa (Merk, Alemanha) por 20 min e lavadas em água
corrente até a retirada do excesso do corante. Após a secagem em temperatura ambiente, as
lamínulas de vidro foram fixadas em lâminas para microscopia com Entellan (Merk,
Alemanha) e observadas em microscópio óptico, em aumento de 1000 vezes.
3.5.4.3 Teste de formação de biofilme em células epiteliais HEp-2
A formação de biofilme em superfície celular fixada foi verificada através de testes
de interação com células HEp-2, realizados segundo metodologia descrita previamente para
adesão de E. coli diarreiogênicas (CORTHESY-THEULAZ et al.,1996; CRAVIOTO et al.,
1979). As células HEp-2 foram cultivadas como descrito no item 3.5.4.2. Após a formação
da monocamada semi-confluente, a placa de 24 poços foi lavada 4 vezes com PBS estéril
com seguida adição de 500 µL de metanol 100% a 4°C, por no mínimo 20 min, para fixar
as células aderidas nas lamínulas. As células pré-fixadas foram então lavadas 4 vezes com
PBS estéril para retirar totalmente o metanol utilizado na fixação. Após as lavagens, em
cada poço foi adicionado meio DMEM, seguido de inoculação de cada uma das amostras
O55:H7, JH01 e JH02 foram na proporção de 1:100, previamente crescidas por 18 h a 37
°C, em meio LB. Estas foram então incubadas por 3, 6 e 24 h, após esse período foram
feitas 4 lavagens com PBS para remoção das bactérias planctônicas e as células e as
bactérias fixadas com p-Formaldeído 4% em PBS 1X, por 18 h a 4 °C. As células foram
novamente lavadas com PBS 1X e, em seguida, permeabilizadas pela adição de Triton X-
100 a 0,1% em PBS 1X, por 4 min. Após novas lavagens, as células foram bloqueadas com
solução de BSA 0,2% em PBS 1X por 30 min. Em seguida, 20 μl de uma solução contendo
30
3 U de Alexa Fluor 488 - Phalloidin (Molecular Probes) em PBS 1 X e iodeto de propídio
(Molecular Probes, EUA) em uma concentração final de 1:1000 foi adicionado. As
lamínulas foram incubadas por 45 minutos sob abrigo da luz e novamente lavadas com PBS
1X, por 4 vezes de 5 min. As lamínulas foram fixadas sobre lâminas de vidro com Mowiol
(Calbiochem, EUA). Após cerca de 24 h a 4 °C, as lâminas foram observadas através de
microscópio confocal de fluorescência, no Laboratório de Parasitologia do Instituto
Butantan, em aumento de 1000X, utilizando microscópio LSM 510 Meta (Zeiss,
Alemanha). FITC filtro BP500-530IR e comprimento de onda 488 nm (excitação) e, IP
filtro 570-719 e comprimento de onda 543 nm (excitação). O software LSM Image
Browser para foi utilizado para capturar e analisar as amostras.
3.5.4.4. Teste de FAS (“Fluorescent actin staining”)
As amostras selvagem, mutante e mutante complementada foram submetidas a
ensaios de polimerização de actina seguindo protocolo descrito por Knutton et al. (1989),
utilizando as células HEp-2. O cultivo das células, bem como os ensaios de adesão em
células epiteliais in vitro, foram realizados como descrito nos itens 3.4.4.1. e 3.4.4.2. Após
as lavagens, as células foram bloqueadas com solução de BSA 0,2% em PBS 1X por 30
min. Em seguida, 20 μl de uma solução contendo 3 U de Alexa Fluor 488 - Phalloidin em
PBS 1 X e iodeto de propídio em uma concentração final de 1:1000 foi adicionado. As
lamínulas foram incubadas por 45 min sob abrigo da luz e novamente lavadas com PBS
1X, por 4 vezes de 5 min. As lamínulas foram fixadas sobre lâminas de vidro com Mowiol.
Após cerca de 24 h a 4 °C, as lâminas foram observadas através de microscópio confocal de
fluorescência, no Laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan, em aumento de
1000X, utilizando microscópio LSM 510 Meta (Zeiss, Alemanha). FITC filtro BP500-
530IR e comprimento de onda 488 nm (excitação) e, IP filtro 570-719 e comprimento de
onda 543 nm (excitação). O software LSM Image Browser para foi utilizado para capturar
e analisar as amostras.
31
IV. RESULTADOS
4.1. Obtenção do mutante ycgR
Para realizar a mutagênese foi escolhida a técnica de recombinação homóloga
proposta por Datsenko e Wanner (2000). Esta técnica consiste na deleção do gene de
interesse através de sua substituição por um cassete de resistência ao antibiótico
cloranfenicol, flanqueada por sítios FRT (Figura 5). Nas Figuras de 6 a 8 estão
demonstradas as etapas realizadas para a obtenção da amostra mutante.
FIGURA 5. Representação esquemática da técnica de recombinação homóloga proposta
por Datsenko e Wanner (2000). (Adaptado de Datesenko e Wanner 2000).
32
Inicialmente, a presença do gene ycgR foi confirmada na amostra selvagem
O55:H7, com a realização de PCR com iniciadores específicos, gerando um fragmento de
793 pares de bases, correspondente ao tamanho do gene ycgR (Figura 4).
FIGURA 6. Gel de agarose 1% para confirmação da presença do gene ycgR na amostra
selvagem O55:H7. Canaleta 1. Peso molecular (1Kb DNA ladder plus), Canaleta 2. Gene
ycgR (793pb)
Em seguida, a amostra O55:H7 contendo o plasmídeo pKD46 foi transformada com
o cassete de resistência e as colônias transformantes obtidas foram selecionadas para
realização de PCR com iniciadores internos especificos para o gene ycgR , gerando um
fragmento de 409 pares de bases, possibilitando a confirmação da deleção (Figura 5).
33
FIGURA 7 Gel de agarose 1% para confirmação a deleção do gene ycgR. Caneleta 1. Peso
molecular (1Kb DNA ladder plus). Caneleta 2. Amostra O55:H7 (409pb) Canaleta 3.
Amostra JH01
Após esta etapa, foi realizada nova reação de amplificação utilizando iniciadores
ycgR_DT, externos ao gene ycgR (Figura 6). Foram observados fragmentos de 793 e 1094
pares de bases correspondentes ao gene ycgR na amostra selvagem e ao cassete de
resistência na amostra mutante, respectivamente.
FIGURA 8. Gel de agarose 1% contendo amplificação de fragmentos obtidos para
confirmação da inserção do cassete de resistência na amostra mutante. Canaleta 1. Peso
molecular (1Kb DNA ladder plus). Canaleta 2. Amostra O55:H7 (793pb). Caneleta 3.
JH01 (1094pb).
34
4.2. Obtenção da amostra complementada JH02
A complementação da amostra mutante JH01 foi realizada através da transformação
da amostra com o plasmídeo pJH01. Colônias transformantes foram selecionadas e
submetidas à PCR utilizando inciadores internos (ycgR_INT) e externos (ycgR_DT) para
confirmar a complementação (Figura 9).
FIGURA 9. Gel de agarose 1% para confirmação da complementação. Foram utilizados
iniciadores internos e externos ao gene ycgR. Caneleta 1. Peso molecular (1Kb DNA
ladder plus). Caneleta 2. Amostra O55:H7. Canaleta 3. Amostra JH01. Observa-se a
ausência de banda quando utilizado o iniciador interno Canaleta 4. Amostra JH02.
4.3. Teste de motilidade
Para verificar se a deleção do gene ycgR afetaria a motilidade da amostra O55:H7,
foi realizado o teste motilidade em ágar semi-sólido (0,3%).
O resultado obtido demonstra que a amostra mutante JH01 tem a motilidade
reduzida em relação à amostra selvagem (Figura 10). A amostra JH02 recupera
parcialmente o padrão de motilidade observado na amostra O55:H7.
35
FIGURA 10. Teste de motilidade em ágar sem-sólido. A. Formação dos halos de
crescimento após 7 horas de incubação. B. representação gráfica dos halos medidos após o
período de crescimento.
4.4. Curva de crescimento
Foi realizada a curva de crescimento das amostras selvagem, mutante e mutante
complementada para a verificação de possíveis alteraçãoes no metabolismo e crescimento
(Figura 11).
FIGURA 11. Curva de crescimento das amostras O55:H7, JH01 e JH02 durante 10 horas.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DO
a 6
00
nm
Horas
O55:H7
JH01
JH02
36
4.5. Ensaio de formação de biofilme em superfície abiótica – Técnica de Cristal
Violeta
Foi avaliada a capacidade de formação de biofilme nos períodos de 3, 6, 24 horas,
considerando a importancia da motilidade para a formação dessas estruturas. Os testes
foram realizados em triplicata e os resultados obtidos indicam que a amostra JH01
apresentou maior formação de biofilme em todos os períodos analisados (Figura 12). A
amostra complementada JH02 recupera parcialmente o padrão obtido com a amostra
selvagem.
FIGURA 12. Gráfico de forrmação de biofilme em superfície abiótica através de Cristal
Violeta pelos períodos de 3, 6 e 24 horas. As barras indicam o desvio padrão obtido.
4.6. Ensaio de formação de biofilme em superfície biótica
Uma vez que biofilmes são comunidades bacterianas que podem se aderir tanto em
superfícies abióticas quanto bióticas, foi analisada a capacidade de formação de biofilme
em células epiteliais HEp-2. Assim como no ensaio de formação de biofilme em superfície
abiótica, foi observado que a amostra JH01 apresenta maior formação de biofilme em todos
os períodos observados (Figuras 13 a 15).
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
3 horas 6 horas 24 horas
D.O
a 5
95
nm
O55:H7
JH01
JH02
37
FIGURA 13. Teste de formação de biofilme em célula epitelial Hep-2 pré-fixada, realizado no período de 3 horas de incubação, analisado em
microscopia confocal. A. amostra O55:H7 eixo X,Y E. Amostra O55:H7 eixo Z. B e C. Amostra JH01 eixo X, Y, F e G. Amostra JH01 eixo Z, D.
Amostra JH02 eixo X,Y, H. Amostra JH02 eixo Z .
38
FIGURA 14. Teste de formação de biofilme em célula epitelial HEp-2 pré-fixada realizado no período de 6 horas de incubação, analisado em microscopia
confocal. A e B Amostra O55:H7 eixo X,Y. F e G. Amostra O55:H7 eixo Z. C e D. Amostra JH01 eixo X, Y. H e I. Amostra JH01 eixo Z, E. Amostra JH02
eixo X,Y. J.. Amostra JH02 eixo Z.
39
FIGURA 15. . Teste de formação de biofilme em célula epitelial HEp-2 pré-fixada realizado no período de 24 horas de incubação, analisado em
microscopia confocal. A. Amostra O55:H7 eixo X,Y. D. amostra O55:H7 eixo Z. B e C. Amostra JH01 X, Y. F e G. Amostra JH01 eixo Z, D.
Amostra JH02 eixo X,Y. H. Amostra JH02 eixo Z.
40
4.7. Ensaio de adesão em célula epitelial in vitro
Uma das principais características de aEPEC é o padrão de adesão localizado-like
(LAL) em células epiteliais in vitro. Para avaliar se o gene ycgR apresenta algum papel na
adesão da amostra O55:H7, foi realizado o ensaio de adesão em células HEp-2. Novamente
foi observado que a amostra JH01 apresenta fenótipo distinto quando comparado à amostra
O55:H7 em ambos os períodos analisados. Após 6 horas de incubação foi possível observar
que não há a formação do padrão de adesão localizado- like, característico desta amostra de
aEPEC. A amostra JH02 retorna parcialmente ao fenótipo observado na amostra O55:H7
(Figura 16).
FIGURA 16. Ensaio de adesão em células HEp-2 observadas em microscopia óptica em
aumento de 100X. Após 3 (A, B, C) ou 6 horas (D, E, F) de interação, as células foram
coradas com May – Grünwald 0,2% e Giemsa 3:1. A e D. Amostra O55:H7. B e E.
Amostra JH01. C e F. Amostra JH02.
41
4.8. Teste de FAS
Foi observado que a amostra JH01 apresenta menor quantidade de actina
polimerizada no sítio de interação bacteriana, indicando uma redução da formação de lesão
A/E quando comparada com a amostra O55:H7. A amostra JH02 recupera parcialmente o
fenótipo que é observado na amostra selvagem (Figura 17).
FIGURA 17. Teste de FAS observado em microscopia confocal. Em vermelho, coradas com iodeto de
propídeo, estão as bactérias. Em verde, corados com Alexa 488, os filamentos de actina. A. Amostra
O55:H7. B. Amostra JH01 C. Amostra JH02, após 3 horas de incubação; D. Amostra O55:H7. E. Amostra
JH01. F. Amostra JH02, após 6 horas de incubação; As setas brancas indicam o local de maior aumento.
42
4.9. Análise transcricional por qRT-PCR
Para analisar se os fenótipos que foram observados estão relacionados com a
transcrição dos genes relacionados à formação da lesão A/E e biofilme, foram realizados
qRT-PCR de diferentes genes que participam de sua regulação.
Foram escolhidos genes eae, ler e espA, que são codificados na região LEE e
osgenes csgD, bscA e fimA que estão relacionados com a formação de biofilme. Em todos
os casos a análise dos níveis transcricionais foi feita comparando a amostra JH01 com a
amostra O55:H7.
A análise transcricional do gene eae, que codifica a intimina, revelou que a
transcrição do gene na amostra JH01 diminui aproximadamente 11 vezes quando
comparado com a amostra selvagem (Figura 18).
FIGURA 18 Análise da transcrição do gene eae nas amostras O55:H7 e JH01. O gene
rpoA foi utilizado para normalizar o Ct.
Do mesmo modo que o gene eae, também foi observada a redução nos níveis
transcricionais do gene espA na amostra JH01 quando comparado a amostra O55:H7, em
aproximadamente 4 vezes (Figura 19).
43
FIGURA 19 Análise da transcrição do gene espA nas amostras O55:H7 e JH01. O gene
rpoA foi utilizado para normalizar o Ct.
O último gene envolvido na regulação da formação da lesão A/E analisado, o gene
ler, principal regulador de LEE, apresentou uma pequena redução da transcrição na amostra
JH01 de aproximadamente 1,4 vezes (Figura 20).
FIGURA 20. Análise da transcrição do gene ler nas amostras O55:H7 e JH01. O gene
rpoA foi utilizado para normalizar o Ct.
44
A transcrição de genes envolvidos na formação de biofilme também foi investigada.
O gene csgD é o regulador do operon csgBA, que codifica os componente estruturais da
fimbria Curli, fimA codifica fímbria do tipo I e o genes bcsA codifica celulose. A análise
da transcrição destes três genes permitiu observar que bscA e fimA apresentaram uma
redução de aproximadamente 2 vezes na amostra JH01 quando comparados com a amostra
selvagem (Figuras 21 e 22), enquanto o gene csgD apresentou um aumento de
aproximadamente 0,6X (Figura 23).
FIGURA 21. Análise da transcrição do gene bcsA nas amostras O55:H7 e JH01. O gene
rpoA foi utilizado para normalizar o Ct.
FIGURA 22. Análise da transcrição do gene fimA nas amostras O55:H7 e JH01 O gene
rpoA foi utilizado para normalizar o Ct.
45
FIGURA 23. Análise da transcrição do gene csgD nas amostras O55:H7 e mutante JH01.
O gene rpoA foi utilizado para normalizar o Ct.
46
V. DISCUSSÃO
Recentes estudos têm demonstrado a importância do mensageiro secundário c-di-
GMP na regulação de diversos processos, principalmente formação de biofilme, motilidade
e virulência. A proteína YcgR pertence à família das proteínas que possuem o domínio
PilZ, que se liga ao c-di-GMP, regulando a rotação do flagelo bacteriano em Escherichia
coli e Salmonella enterica (ZORRAQUINO et al., 2013). Os estudos com YcgR limitam-se
ao seu papel na regulação do movimento flagelar e somente em amostras não patogênicas
de E.coli, não existindo relatos de sua relação com outras possíveis funções ou seu papel
em outras vias regulatórias.
aEPEC é um importante patógeno causador de diarreia em crianças, principalmente
em países em desenvolvimento, e não existe na literatura nenhum trabalho que avalie a
influência de c-di-GMP neste patótipo de DEC.
Para verificar o papel do gene ycgR na regulação da motilidade e sua influência na
adesão de aEPEC, a amostra do sorotipo O55:H7 foi escolhida para deleção do gene ycgR.
O método utilizado para deleção do gene foi o da recombinação homóloga proposto por
Datsenko e Wanner (2000), que consiste basicamente em substituir o gene de interesse por
um cassete de resistência a um antibiótico com o auxilio do sistema λRed, que é composto
pelo plasmídeo pKD46 e por plasmídeos acessórios (neste estudo, o pKD3) que são
utilizados na construção do cassete de recombinação por PCR.
Após a obtenção da amostra JH01 foi necessária a construção do mutante
complementado para garantir que os fenótipos observados foram, de fato, resultado da
deleção do gene ycgR. Para isso, foi utilizado o plasmídeo de expressão pBAD Myc HisA
com o inserto ycgR, que foi transformado na amostra JH01. O resultados obtidos nos testes
fenotípicos realizados demonstram que o mutante complementado JH02 retorna
parcialmente os fenótipos observados na amostra selvagem em todos os ensaios, indicando
que a mutação de ycgR foi responsável pelos fenótipos observados em todos os
experimentos.
47
Foi feita a curva de crescimento das amostras envolvidas no estudo e a análise da
mesma demonstra que não há diferença no padrão da curva das três amostras, indicando
que as alterações no fenótipo da JH01 não são decorrentes de uma alteração no
metabolismo bacteriano (Figura 11).
YcgR é uma proteína de ligação que pertence à família de proteínas PilZ
(RYJENKOV et al., 2006). A primeira proteína PilZ descrita é a de Pseudomonas
aeroginosa e é responsável pela síntese de pili, surgindo daí o nome da família dessas
proteínas (ALM et al., 1996). Por muitos anos os estudos com c-di-GMP foram
direcionados para o entendimento de como o processo de síntese e degradação deste
mensageiro secundário participa de diversos eventos no metabolismo bacteriano, pouco se
sabia dos receptores do c-di-GMP (RÖMLING; GALPERIN; GOMELSKY, 2013). Em
2006, Amikam e Galperin predizem por bioinformática que uma proteína de domínio PilZ
seria a proteína de ligação ao c-di-GMP. Neste mesmo ano, Ryjenkov e colaboradores
relatam que YcgR participaria da regulação do movimento flagelar através de sua ligação
com o c-di-GMP em E.coli e outras enterobactérias. Estudos posteriores corroboraram este
achado e os trabalhos que se seguiram foram em grande parte dedicados em entender como
a interação de YcgR e c-di-GMP altera o movimento flagelar. Estes estudos, entretanto,
foram feitos somente em cepas não patogênicas de E.coli e todos chegam à conclusão de
que a interação do complexo YcgR-c-di-GMP atua na base do flagelo, interferindo na
interação das proteínas do estator ou do rotor flagelar, alterando a rotação do flagelo e que
essa interação é dependente de c-di-GMP de modo que, em altas concentrações, há a
redução da motilidade bacteriana (Boehm et al., 2010; Fang, Gomelsky, 2010; Paul et al.,
2010).
A análise da motilidade demonstrou que a deleção de ycgR levou a redução de
aproximadamente de 2 vezes quando comparado com a amostra selvagem, como pode ser
observado nas Figuras 10A e 10B. Este resultado é diferente dos resultados descritos até
o momento na literatura. Em geral, a regulação do movimento flagelar mediado por ycgR
também envolve a participação da PDE YhjH. Em mutantes com deleção de yhjH a
redução da motilidade é suprimida quando também é deletado ycgR. Mutantes simples em
ycgR não apresentam alteração significativa na motilidade (Boehm et al., 2010; Fang,
48
Gomelsky, 2010; Paul et al., 2010). Os resultados obtidos neste estudo, entretanto,
demonstram que isso não ocorre na amostra O55:H7. É possível, portanto, que em amostra
de aEPEC a regulação da motilidade não seja feita somente por ycgR, e outros elementos
podem estar envolvidos.
C-di-GMP é descrito como uma importante molécula que participa de uma
diversidade de vias regulatórias em bactérias, principalmente na formação de biofilme
(HENGE, 2009). Diversos estudos destacam a importância de c-di-GMP na transição do
estado planctônico para o estado séssil na formação do biofilme, uma vez que níveis
elevados de c-di-GMP inibem a motilidade e promovem a formação do biofilme (HENGE
2009).
Recentes estudos relatam que amostras de aEPEC são capazes de formar biofilme
em superfícies abióticas e bióticas (WEISS-MUSZKAT et al., 2010, CULLER et al.,
2014). Deste modo, foi avaliada a capacidade de formação de biofilme da através da técnica
colorimétrica de cristal violeta em placa de poliestireno para analisar um possível
envolvimento de ycgR na formação de biofilme inicial. Os resultados demonstram que a
amostra mutante apresenta aproximadamente 2 vezes mais formação de biofilme em todos
os períodos analisados quando comparada com a amostra selvagem (Figura 12) e a
amostra complementada recupera parcialmente o fenótipo observado na amostra selvagem.
Este resultado é semelhante ao observado por Sanches-Torres e colaboradores (2011) que,
trabalhando com uma amostra de E.coli K12, descrevem que a deleção de ycgR aumenta a
formação de biofilme inicial após 7 horas de incubação, porém o mesmo não ocorrendo
após 24 horas, resultado semelhante ao observado quando há a deleção de genes que
codificam DGCs, sugerindo que a redução dos níveis de c-di-GMP promove motilidade e
aumenta a formação de biofilme. O trabalho, entretanto, não descreve se a amostra com
deleção em ycgR apresenta alguma alteração na motilidade.
Recentemente, Culler e colaboradores (2014), demonstram que amostras de aEPEC
apresentam formação de biofilme independentemente do padrão de adesão em célula
epitelial, além de formar biofilme em célula epitelial HEp-2 pré-fixada. Assim,
adicionalmente, foi também avaliada a capacidade de formação de biofilme em superfície
49
biótica. Assim como no ensaio de Cristal Violeta, foi observado que a deleção de ycgR leva
a um aumento na formação do biofilme na superfície biótica, sendo possível observar que
na amostra JH01, após 3 horas de incubação, já é possível observar a formação de
aglomerados bacterianos ao redor das células e na lamínula (Figura 13, B e C). Após 6
horas, o biofilme é mais denso, sendo mais fácil observar a formação de aglomerados na
superfície da lamínula onde não há células aderidas (Figura 14, C e D). Esses aglomerados
só são observados na amostra O55:H7 após 24 horas de incubação, ainda assim, são bem
menores quando comparados com os observados na amostra JH01 (Figura 15). Estes
resultados parecem condizentes com os que foram obtidos no ensaio de motilidade, uma
vez que a redução da mesma é um dos eventos iniciais necessários para a formação do
biofilme.
Para analisar quais genes poderiam estar envolvidos neste processo foram realizados
qRT-PCR de genes relacionados com a formação de biofilmes inicial. Foram escolhidos os
genes bcsA, que faz parte da celulose sintase, junto com bcsB, fimA que codifica a maior
parte da pilina na fímbria tipo I e csgD, regulador do operon csgBA, que codifica os
componente estruturais da fimbria Curli.
BcsA é uma proteína de membrana interna com múltiplos domínios transmembrana
e com um domínio citoplasmático 2 glicosiltransferase (WHITNEY, HOWELL, 2013).
Assim como YcgR, possui um domínio PilZ que quando ligado ao c-di-GMP ativa a
produção de celulose (RYJENKOV, 2006). A análise dos níveis transcricionais de bcsA
mostram que há uma redução de 2 vezes na transcrição do gene na amostra JH01 quando
comparado com a amostra O55:H7 (Figura 21). O mesmo resultado foi observado na
análise de fimA, que também apresenta redução de 2 vezes na transcrição de JH01 (Figura
22).
A fímbria Tipo I é uma adesina filamentosa composta de duas unidades, fimH que
codifica uma adesina específica para manose, que fica na ponta da fímbria e fimA, que
codifica a maior parte da fímbria (BELOIN; ROUX; GHIGO, 2008). Fímbrias do tipo I são
especialmente importantes nos estágios iniciais do biofilme. Mutantes que não possuem
fimH não conseguem se aderir em superfície abiótica (PRATT, KOLTER, 1998).
50
Os resultados das análises de qRT-PCR destes dois genes são contraditórios ao
observado nos ensaios fenotípicos de formação de biofilme, nos quais o mutante apresenta
maior formação do mesmo quando comparado com à amostra selvagem.
Fímbrias curli são as principais responsáveis pela adesão à superfícies, agregação
celular e formação de biofilme. A expressão de curli depende de dois operons distintos,
csgABC, que codifica os componentes estruturais de curli e o operon csgDEFG. CsgD é o
regulador global que controla a transcrição de vários genes relacionados com a mudança de
estado planctônico para séssil, além de regular o operon csgABC e os operons de
biossíntese de celulose. CsgD também estimula a transcrição de adrA, que codifica uma
DGC que ativa a produção de celulose em nível pós-transcricional e cuja superexpressão
aumenta a formação do biofilme maduro (GERSTEL; RÖMLING, 2003)
Fímbria curli parece ser importante na interação de outra cepa de aEPEC O55:H7
estudada por Weiss-Muszkat (2010). A deleção dos genes csgFG diminiu a expressão de
curli, reduzindo significativamente a capacidade da cepa de formar o biofilme maduro.
Todavia, a analise do gene csgD parece explicar parcialmente este aumento na
formação do biofilme. Na amostra mutante JH01 observa-se um aumento de
aproximadamente 0,6 vezes na transcrição de csgD, quando comparado com a amostra
O55:H7 (Figura 23). Embora pequeno, este aumento parece ser o suficiente para garantir
que haja maior formação de biofilme pelo mutante, indicando que ycgR pode estar
envolvido na regulação de csgD em nível transcricional. O mesmo não pode ser dito para os
genes fimA e bcsA, cuja regulação pode ser pós – transcricional.
Amostras de aEPEC apresentam como padrão de adesão característico o padrão
LAL, que pode ser observado após 6 horas de contato com a célula e as microcolonias
formadas pelas bactérias aderidas são frouxas. O principal fator para esse tipo de interação
bactéria-bactéria é a ausência da fímbria tipo IV bfp (Scaletsky et al., 1999; Gíron et al.
1991). Foi possível observar que o mutante JH01 apresenta menor adesão quando
comparado com a amostra selvagem. Essa redução foi observada em ambos os períodos de
testes realizados (Figura 16, B e E). Uma das principais características de aEPEC é a
formação da lesão histopatológica A/E. Através do teste de FAS foi possível observar que
51
em ambos os períodos de teste (3 e 6 horas) a formação da lesão A/ E foi reduzida na
amostra JH01 (Figura 17). A lesão A/E pode ser caracterizada pela destruição das
microvilosidades e intima adesão da bactéria às células do epitélio intestinal, levando à
formação de um pedestal através da polarização e acúmulo da actina e outros elementos do
citoesqueleto rearranjados no sítio onde a bactéria se adere (Moon et al.,1983).
Após a verificação da redução da polimerização de actina na amostra JH01, foram
realizados qRT- PCR de 3 genes relacionados à formação da lesão A/E, espA, responsável
pela formação da agulha por onde são translocados os efetores para a lesão A/E, eae, que
codifica a intima, que promove a íntima adesão da bactéria à célula hospedeira, e ler, o
regulador principal de LEE. Em todos os casos, foram observadas reduções nos níveis de
transcrição dos genes. O gene espA apresentou uma redução na transcrição em cerca de 4
vezes (Figura 19), o gene eae redução de aproximadamente 11 vezes (Figura 18) e ler em
cerca de 1,5 vezes na amostra JH01 (Figura 20). Estes resultados sugerem que ycgR
participa da regulação da formação da lesão A/E na amostra O55:H7. Existem poucos
trabalhos descritos na literatura relacionando c-di-GMP com a capacidade de adesão em
amostras E.coli patogênica. Recentemente, Hu e colaboradores (2013) descrevem que a
superexpressão da PDE YhjH e consequente redução dos níveis de c-di-GMP reduz a
aderência e os níveis transcricionais de genes do TTSS na amostra de EHEC EDL933
(O157:H7). Claret e coloboradores (2007) descrevem que a superexpressão de YcgR é
capaz de aumentar a capacidade de adesão da cepa de AIEC (Escherichia coli aderente
invasora) LF82. Nossos resultados sugerem que, em aEPEC, a deleção de ycgR reduz a
adesão da amostra em células epiteliais in vitro, alterando os níveis transcricionais de
genes envolvidos no TTSS, reforçando o papel de YcgR na regulação de aEPEC.
Outra hipótese é que deleção pode ter alterado a transcrição de outros genes
envolvidos na síntese e degradação de c-di-GMP e os resultados observados seriam
consequência indireta da alteração dos níveis do mensageiro secundário. Essa hipótese,
entretanto, precisa ser melhor analisada e trabalhada futuramente.
Os resultados deste trabalho são em grande maioria contraditórios em relação a
todos os dados disponíveis na literatura, sendo o primeiro a focar a proteína YcgR como um
52
regulador de virulência bacteriana. Asim, sua continuidade é de extrema importância para
melhor elucidar o papel da mesma em aEPEC.
53
VI. CONCLUSÕES
O gene ycgR, receptor de c-di-GMP em E.coli, influência na motilidade da amostra
de aEPEC O55:H7. Entretanto, ao contrário do que descrito na literatura, a
motilidade no mutante JH01 é menor do que na amostra O55:H7. Deste modo,
outros genes devem estar envolvidos na regulação da motilidade em aEPEC.
A deleção de ycgR leva à maior formação de biofilme em O55:H7.
O mutante JH01 apresenta menor transcrição dos genes fimA e bscA, relacionados
com a formação do biofilme, mas mostra aumento na transcrição do gene csgD.
YcgR tem papel regulatório na adesão em células HEp-2 em O55:H7. A deleção do
gene levou à redução na adesão nos períodos de 3 e 6 horas.
A redução na lesão A/E observada na amostra mutante pode estar relacionada à
redução na transcrição dos genes eae, espA e ler.
54
REFERÊNCIAS
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ANEXO 1
6 ISSN 1677-7042 1 Nº 80, segunda-feira, 28 de abril de 2008
COMISSÃO TÉCNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA
EXTRATO DE PARECER TÉCNICO Nº 1.341/2008
O Presidente da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança - CTNBio, no uso de suas atribuições e de acordo com o artigo 14, inciso XIX, da Lei 11.105/05 e do Art. 5º, inciso XIX do Decreto 5.591/05, torna público que na 112ª Reunião Ordinária, ocorrida em 17 de abril de 2008, a CTNBio apreciou e emitiu parecer técnico para o seguinte processo: Processo nº: 01200.004893/1997-93 Requerente: Instituto Butantan CNPJ: 61.821.344/0001-56 Endereço Av. Vital Brasil, 1500 São Paulo, SP CEP 05503-900. Telefone: (11) 3726-7222. Fax: (11)3726-1505. Assunto: Solicitação de parecer para pesquisa em regime de contenção com organismo geneticamente modificado da classe II de risco biológico. Extrato Prévio: 1260/2008 Publicado no D.O.U No. 37, 25 de fevereiro de 2008. Decisão: DEFERIDO Resumo: A CTNBio, após apreciação do processo de solicitação de parecer técnico para projeto de pesquisa envolvendo organismos geneticamente modificados, conclui pelo deferimento nos termos deste parecer técnico. O Dr. Paulo Lee Ho, presidente da Comissão Interna de Biossegurança do Instituto Butantan, solicita à CTNBio parecer técnico referente à execução de projeto de pesquisa em regime de contenção nas instalações do Laboratório Bacteriologia, credenciado no Certificado de Qualidade em Biossegurança da instituição (CQB 39/98). O projeto envolve atividades com a bactéria Escherichia coli geneticamente modificada para expressar o promotor do gene LEE1 da Escherichia coli enteropatogênica, este organismo geneticamente modificado foi classificado como sendo da classe de risco II. O projeto a ser executado denomina-se: "Quorum sensing em amostras de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC): Típica e atípica", sob a responsabilidade do Dr. Marcelo Palma Sircili. O responsável pela unidade operativa declara que as instalações contam com salas e equipamentos úteis em nível de biossegurança adequado às atividades propostas. O processo descreve as condições de biossegurança das áreas a serem cadastradas, as medidas de biossegurança propostas para o laboratório e a qualificação da equipe de pesquisadores envolvida no projeto, bem como a declaração formal do responsável assegurando que as condições descritas no processo são apropriadas à realização dos projetos propostos. No âmbito das competências dispostas na Lei 11.105/05 e seu decreto 5.591/05, a Comissão concluiu que o presente pedido atende às normas da CTNBio e à legislação pertinente que visam garantir a biossegurança do meio ambiente, agricultura, saúde humana e animal. A CTNBio esclarece que este extrato não exime a requerente do cumprimento das demais legislações vigentes no país, aplicáveis ao objeto do requerimento. A íntegra deste Parecer Técnico consta do processo arquivado na CTNBio. Informações complementares ou solicitações de maiores informações sobre o processo acima listado deverão ser encaminhadas por escrito à Secretaria Executiva da CTNBio.
WALTER COLLI <!ID1065294-0>
70
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ANEXO 2
