Juliana Terra - Tese de Doutoradobiq.iqm.unicamp.br/arquivos/teses/000449441.pdf · v Aos meus pais, Milton e Vera, e aos meus irmãos (Pedrinho e Juninho), por todo amor, força

i

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

“POTENCIALIDADE DA ALIANÇA DA ESPECTROSCOPIA

DE RAIOS X E QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO DE

VALOR ENERGÉTICO E TEORES DE ALGUNS

MACRONUTRIENTES EM AMOSTRAS DE FARINHAS

PARA CONSUMO HUMANO”

JULIANA TERRA

Orientadora: Profª Drª Maria Izabel Maretti Silveir a Bueno

TESE DE DOUTORADO

Campinas – SP

2009

ii

v

Aos meus pais, Milton e Vera,

e aos meus irmãos (Pedrinho e Juninho),

por todo amor, força e incentivo.

“Todos os fins são também começos, apenas não sabemos disso na hora.”

vii

AGRADECIMENTOS

Inicialmente gostaria de agradecer a Profª Drª Maria Izabel Maretti Silveira

Bueno (BELL), que me fez compreender o significado da palavra orientação. Por

toda a amizade e carinho dedicados, e principalmente por me permitir conhecer o

lado humano e belo que existe por trás da profissional.

Aos meus amigos do GERX (Lidi, Guto, Karen, Vinícius e Bárbara), cujas

conversas e os lanches da tarde animaram até os dias nublados. Em especial ao

meu amigo Alexandre, que mesmo com sua rabugice foi de extrema importância

para a conclusão desta tese.

Ao estagiário, Miguelito, meu obrigado pela ajuda técnica.

Às professoras Regina, Susi, Inês Valéria e Bel Felisbertti (e seus grupos

de pesquisa) pela confiança e palavras de incentivo durante minha mudança de

percurso.

Aos professores Marcelo Alexandre Prado e Celso Aparecido Bertran por

disponibilizar seus equipamentos; e a técnica Cristina Boccado pela paciência e

ensinamentos.

Às minhas amigas (Carmen, Mara, Acacia, Dani, Julia, Lídia, Bianca,

Jana, Cléia, Sônia e Selma) e à minha turma (Vivi, Thaís, Valéria, Tânião, Camila

e Mary), amigas fiéis e confidentes, pela presença em todos os momentos

(alegres ou tristes).

Aos Moura e aos Terra que torceram pela vitória alcançada.

Não poderia deixar de fazer um agradecimento especial aos meus amigos

e educandos da Fundação Bezerra de Menezes pela amizade e carinho

verdadeiros. Ohm!

A toda direção e aos funcionários do Instituto de Química da UNICAMP

pelo apoio acadêmico e técnico

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

ix

CURRÍCULUM VITAE

� Pós-graduação – Mestrado na Área de Química Analíti ca

(Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas-SP, Conclusão: 2005)

� Graduação – Licenciatura em Química


� Graduação – Bacharelado em Química


Durante a sua vida acadêmica, a autora desta tese participou de 17 eventos

científicos, incluindo congressos e encontros nacionais e internacionais. Nestes

eventos foram apresentados 23 trabalhos na forma de painel, sendo publicados

em livros de resumo, e 1 trabalho na forma oral (sendo este relacionado com a

tese aqui apresentada).

Publicou 3 artigos em revistas científicas, todos em parceria com a Prof.

Dra. Adriana V. Rossi, e 1 artigo on-line pela Editora Moderna: “Sobre o

desenvolvimento da Análise Volumétrica e Algumas Aplicações” (Quím. Nova

2005, 28, 166), “Volumetria como ferramenta didática no ensino superior no século

XXI: aspectos conceituais e questões práticas para discussão e reflexão” (Rev.

Bras. Ens. Quim. 2008, 2, 33), “Reflexões sobre o que se ensina e o que se

aprende sobre densidade a partir da escolarização” (QNEsc, 2008, 30, 55-60) e

“Diferentes abordagens para aulas de Química no Ensino Médio”

(http://www.moderna.com.br/moderna/didaticos/em/artigos/2004/0016.htm).

Foi monitora em vários programas e eventos científicos: Programa de

Estágio Docente do IQ-UNICAMP (2003, 2004 e 2006); Simpósio de Profissionais

do Ensino de Química (2002 a 2007); Programa Ciência e Arte nas Férias (2003 e

2004); Encontro Paulista de Pesquisa e Ensino de Química (2004).

Ao longo do trabalho científico, a autora ministrou oficinas e cursos

pedagógicos: Oficina de química para professores de Química da rede pública

estadual de ensino da região de Jundiaí (2003); PROJETO TEIA DO SABER da

UNICAMP nas turmas de Química do núcleo de Ciências Exatas e da Terra (2004

x

e 2006), Cursos no Simpósio de Profissionais do Ensino de Química (2004 a

2006).

Também auxiliou na orientação, com supervisão da profa Maria Izabel M. S.

Bueno, do projeto de iniciação científica “Uso de Quimiometria aliada a

Espectroscopia de Raios-X para quantificação do teor de proteínas e valor

energético em ovos”.

Para seu crescimento pessoal e profissional, a autora exerce, desde 2006,

atividades voluntárias na Fundação Bezerra de Menezes, em Campinas-SP,

sendo Educadora de jovens e crianças das Escolas Preparatórias para Vida (EPV)

que integram a Fundação, e Secretária do Conselho de Educação.

De janeiro a junho de 2009, a autora atuou como pesquisadora da empresa

KosmoSCIENCE Consultoria e Assessoria Técnica em Cosméticos na elaboração

e aperfeiçoamento de métodos para verificação da eficácia de produtos

cosméticos.

Para maiores detalhes, consultar o currículo Lattes.

“Cada responsabilidade que o homem assume para o bem de todos,

voluntariamente, é um passo para o crescimento espiritual” (Paulo Zabeu)

xi

RESUMO

POTENCIALIDADE DA ALIANÇA DA ESPECTROSCOPIA DE RAIO S X E

QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO E TEORES

DE ALGUNS MACRONUTRIENTES EM AMOSTRAS DE FARINHAS P ARA

CONSUMO HUMANO

O valor energético (VE) é uma das informações obrigatórias que devem ser

fornecidas no rótulo dos alimentos pré-embalados. O VE que aparece nos rótulos

corresponde a uma relação dos teores de alguns macronutrientes (proteínas,

gorduras e carboidratos) presentes na amostra. A determinação destes

parâmetros é oficialmente feita a partir de procedimentos analíticos distintos e

todos são laboriosos, lentos e geradores de resíduos. Em geral, envolvem o uso

de reagentes (alguns tóxicos), além de provocarem a destruição da amostra. Esse

trabalho apresenta modelos de calibração e validação para determinar o valor

energético (calorias) e o teor de carboidratos e proteínas em amostras de extratos

e farinhas de vegetais para consumo humano. A modelagem foi obtida através dos

métodos PCA (análise por componentes principais) e PLS (regressão por

quadrados mínimos parciais) para espectros de fluorescência de raios X de

amostras com parâmetros conhecidos, determinados através de métodos

convencionais. Amostras originadas do milho, mandioca, leite, trigo e soja,

adquiridas em supermercados brasileiros, foram avaliadas. O método proposto

não gera resíduos e não necessita de qualquer tipo de solvente ou reagente,

atendendo às exigências da chamada “química verde”. Além disso, a sua

aplicação requer 0,2% do tempo necessário para a aplicação dos métodos

convencionais. Os bons resultados da validação (erros menores que 14%) indicam

que se trata de uma alternativa aos métodos analíticos convencionais, sendo

muito atraente para análises de rotina, obedecendo à legislação vigente (portaria

42, resolução RDC 360, ANVISA), que permite erro máximo de 20%.

xiii

ABSTRACT

POTENTIALITIES OF THE ALLIANCE OF X-RAY SPECTROSCOP Y AND

CHEMOMETRICS TO DETERMINATE ENERGETIC VALUE AND SOM E

MACRONUTRIENTS CONTENS OF INDUSTRIALIZES DRIED FOOD S FOR

HUMAN CONSUMPTION

The energetic value (EV) is a quantitative information required on the labels of pre-

packaged foods. The EV appearing on the label corresponds to the sum of the

energetic contributions from food macronutrients (proteins, carbohydrates and

fats). The determinations of these parameters are based on distinct analytical

procedures, each one being time-consuming, laborious and producing residues. In

general, these methods involve the use of reagents (some toxic) besides

destroying the samples. This work presents multivariate calibration and validation

models to determine the energetic value, protein and carbohydrate contents of

industrialized dried foods for human consumption. The modeling was obtained by

using PCA (principal component analysis) and PLS (partial least squares

regression) for X-ray fluorescence spectra of samples with known parameters,

determined through conventional methods. Samples from corn, casava, milk,

wheat and soy, purchased in Brazilian supermarkets, were investigated. The

proposed method does not generate wastes and does not require any solvent or

reagent, given the demands of the "green chemistry”. Moreover, its application

requires only 0.2% of the time necessary for the application of conventional

methods. The good results of the validation process (errors less than 14%) indicate

that this is an alternative to conventional analytical methods and is very attractive

for routine analysis, according to current legislation (Executive Order 42, DRC

resolution 360, ANVISA), which allows maximum errors of 20%.

.

xv

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURA S............................................................................ xvii

LISTA DE TABELAS.... ................................................................................... xix

LISTA DE FIGURAS.... .................................................................................... xxi

LISTA DE EQUAÇÕES... ................................................................................. xxiii

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO......................................................................... 1

I.1. ROTULAGEM DE ALIMENTOS......................................................... 3

I. 2. ESPECTROMETRIA DE FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X.............. 6

I. 2. 1. BREVE HISTÓRICO............................................................. 6

I. 2. 2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS............................................... 9

I. 3. QUIMIOMETRIA................................................................................ 12

CAPÍTULO II – OBJETIVOS........... ................................................................. 19

II.1. OBJETIVOS....................................................................................... 21

CAPÍTULO III – EXPERIMENTAL........ ........................................................... 23

III.1. REAGENTES.................................................................................... 25

III.2. AMOSTRAS...................................................................................... 26

III.3. EQUIPAMENTOS............................................................................. 30

III.4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL................................................ 31

III.4.1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE....................... 31

III.4.2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X... 36

CAPÍTULO IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................ 39

IV.1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE.................................. 41

IV.2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X.............. 51

IV.2.1. FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X: RELAÇÃO CUSTO

BENEFÍCIO...................................................................................... 76

CAPÍTULO V – CONCLUSÃO.......................................... ............................... 79

V.1. CONCLUSÃO.................................................................................... 81

CAPÍTULO VI – PERSPECTIVAS................................................................... 83

VI.1. PERSPECTIVAS……………………................................................. 85

CAPÍTULO VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................... 87

VII.1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 89

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviatura Descrição em Inglês Descrição em Português

ANVISA --- Agência nacional de

vigilância sanitária

AOAC Association of official

analytical chemists

Associação de químicos

analíticos oficiais

CA Casava Mandioca

CO Corn Milho

EDXRF Energy dispersive X-ray

fluorescence

Fluorescência de raios X por

dispersão de energia

EqM Mathematical equations Equações matemáticas

EV Energetic value Valor energético

FRX X-ray fluorescence Fluorescência de raios X

GERX --- Grupo de espectrometria de

raios X

IUPAC International union of pure

and applied chemistry

União internacional de

química pura e aplicada

LOD Limit of detection Limite de detecção

LOQ Limit of quantitation Limite de quantificação

LV Latent variable Variável latente

mf Final mass Massa final

mi Initial mass Massa inicial

MI Milk Leite

PC Principal component Componente principal

PCA Principal component analysis Análise por componentes

principais

PLS Partial Least Squares Regressão por Quadrados

Mínimos Parciais

xviii

Abreviatura Descrição em Inglês Descrição em Português

PRESS Predicted residual error sum

of squares

Soma dos quadrados dos

erros de previsão

rcal Correlation coefficient of

calibration

Coeficiente de correlação da

calibração

RDC --- Resolução da diretoria

colegiada

RMSEC Root mean square error of

calibration

Raiz quadrada do erro médio

quadrático de calibração

RMSEP Root mean square error of

prediction

Raiz quadrada do erro médio

quadrático de previsão

rval Correlation coefficient of

validation

Coeficiente de correlação da

validação

SDV Standard deviation of

validation

Desvio padrão dos erros de

validação

SÊN Sensitivity Sensibilidade

SO Soy Soja

TC Carbohydrate content Teor de carboidrato

TP Protein content Teor de proteína

Vclorofórmio Volume of chloroform Volume de clorofórmio

VE Energetic value Valor energético

VP Predicted value Valor previsto

Vpipeta Volume of pipet Volume da pipeta

VR Reference value Valor de referência

WH Wheat Trigo

γγγγ Analytical sensitivity Sensibilidade analítica

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Informações sobre as Figuras de Mérito utilizadas em validação

multivariada (Valderrama et al., 2007).............................................................. 17

Tabela 2: Reagentes utilizados na realização dos experimentos.................... 25

Tabela 3: Descrição das amostras de alimento utilizadas para cada grupo.... 27

Tabela 4: Valores apresentados nos rótulos para valor energético (VE) e

teores de proteína (TP) e carboidrato (TC) para as amostras analisadas........ 28

Tabela 5: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do

desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de milho.............. 46


desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de soja................ 47


desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de trigo............... 48


desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de mandioca....... 49


desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de leite................ 50

Tabela 10: Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as

amostras de soja, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e

TP o teor de proteína........................................................................................ 60

Tabela 11: Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os

parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros

relativos entre VR e VP para as amostras de soja........................................... 61

Tabela 12: Informações sobre as amostras iniciais e selecionadas para a

construção dos modelos de calibração e validação para os grupos de milho,

mandioca, leite e trigo....................................................................................... 62


amostras de milho, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e


xx



relativos entre VR e VP para as amostras de milho......................................... 66


amostras de mandioca, onde VE é o valor energético, TC o teor de

carboidrato e TP o teor de proteína.................................................................. 68



relativos entre VR e VP para as amostras de mandioca.................................. 69


amostras de leite, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e




relativos entre VR e VP para as amostras de leite........................................... 72


amostras de trigo, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e




relativos entre VR e VP para as amostras de trigo........................................... 75

Tabela 21: Estimativa do custo e do tempo necessários para a obtenção

dos parâmetros estudados pelos métodos convencionais e proposto e da

quantidade de resíduo líquido gerado pelos métodos...................................... 77

xxi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Diagrama de transições de raios X e suas respectivas

denominações................................................................................................... 10

Figura 2: Fotografia do bloco digestor utilizado............................................... 32

Figura 3: Fotografia do destilador de microKjeldahl utilizado.......................... 33

Figura 4: Fotografia do agitador rotatório manual utilizado............................. 36

Figura 5: Reações envolvidas no método de Kjeldahl..................................... 42

Figura 6: Espectros médios sobrepostos das amostras estudadas e

ampliação da região de espalhamento............................................................. 51

Figura 7: Gráficos de scores para o conjunto de todas as amostras, obtidos

para PC1 x PC2 (A) e para PC2 x PC4 (B)...................................................... 53

Figura 8 : Gráficos de loadings obtidos para PC1, PC2 e PC4 para o

conjunto de todas as amostras......................................................................... 53

Figura 9: Gráfico de scores para o conjunto das amostras na ausência do

grupo da soja, obtidos para PC1 x PC2............................................................ 54

Figura 10: Representação gráfica da relação entre Resíduo de Student e

Leverage para carboidrato, considerando o conjunto total de amostras e 5

variáveis latentes.............................................................................................. 55

Figura 11: Representações gráficas da relação entre Resíduo de Student e

leverage para as amostras de soja obtidas para o teor de carboidrato antes

(A) e depois (B) da exclusão dos outliers......................................................... 58

Figura 12: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios

previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis

analisadas para o conjunto de amostras de soja.............................................. 59



analisadas para o conjunto de amostras de milho............................................ 64



analisadas para o conjunto de amostras de mandioca..................................... 67

xxii



analisadas para o conjunto de amostras de leite.............................................. 70



analisadas para o conjunto de amostras de trigo............................................. 73

xxiii

LISTA DE EQUAÇÕES

EQUAÇÃO 1: Equação de Atwater.................................................................. 04

EQUAÇÃO 2: Decomposição da matriz de dados (X) resultante de

aplicação da análise por componentes principais............................................ 13

EQUAÇÃO 3: Cálculo da leverage máxima admissível de uma amostra

(hcrit). k = número de componentes principais e n = número de espectros do

conjunto de calibração...................................................................................... 38

EQUAÇÃO 4: Cálculo da porcentagem de proteína. CHCl=concentração de

HCl, MN = massa atômica do nitrogênio, VHCl=volume gasto de HCl e mi=

massa inicial da amostra.................................................................................. 43

EQUAÇÃO 5: Cálculo da porcentagem de carboidrato................................... 43

EQUAÇÃO 6: Cálculo da porcentagem de umidade. mi=massa da amostra

inicialmente pesada e mf=massa da amostra seca após o período na

estufa................................................................................................................ 44

EQUAÇÃO 7: Cálculo da porcentagem de cinzas. mi=massa da amostra

inicialmente pesada e mcinzas=massa de cinzas pesada após a carbonização

da matéria orgânica.......................................................................................... 45

EQUAÇÃO 8: Cálculo da porcentagem de gordura. Vclorofórmio=volume de

clorofórmio utilizado para a extração da gordura (20,00 mL), Vpipeta=volume

da pipeta (5,00 mL), mi=massa de amostra inicialmente pesada e mf=massa

de gordura pesada após evaporação do solvente............................................ 45

INTRODUÇÃO

1

II –– IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

INTRODUÇÃO

3

I. 1. ROTULAGEM DE ALIMENTOS

A ciência da nutrição tenta entender como e por que aspectos específicos

da dieta influenciam a saúde. Deficiências, excessos e descontroles na dieta

podem causar impactos negativos à saúde, ocasionando muitas vezes doenças

como o escorbuto, obesidade ou osteoporose, assim como problemas

psicológicos e comportamentais. Os nutrientes nos alimentos são agrupados em

várias categorias. Os macronutrientes são as gorduras, proteínas e carboidratos.

Os micronutrientes englobam os minerais e as vitaminas. Além disso, os alimentos

contêm água e fibras. O conhecimento da composição dos alimentos consumidos

por uma população é fundamental para avaliar o suprimento e o consumo

alimentar de um país, verificar a adequação nutricional da dieta de indivíduos,

estabelecer relações entre dieta e doença, etc. (Kays et al., 1996; Torres et al.,

2000).

A rotulagem nutricional é exigida na maioria dos alimentos pré-embalados e

contém um conjunto de propriedades nutricionais do alimento que deve ser

apresentado ao consumidor (Agarwal et al., 2006; Kays et al., 1996).

Nos diversos países em que existem, as legislações relacionadas à

obrigatoriedade de informações nutricionais em produtos industrializados exigem

como descrição mínima o valor energético (ou caloria ou energia) e a quantidade

de proteína, carboidrato (glicídio), gordura (lipídio) e fibras alimentares (Celeste,

2001). Informações sobre outros componentes podem ser exigidas, dependendo

da classificação e do tipo de alimento (Kays et al., 1996).

A energia metabolizada de um alimento é geralmente expressa como valor

energético (VE). O método oficial para a obtenção de VE envolve calorimetria

direta. Neste procedimento, o conteúdo energético é obtido por meio da

combustão completa do alimento, requerendo, portanto, o uso de uma bomba

calorimétrica, muitas vezes não encontrada em laboratórios de pesquisa e de

indústria (Harris, 2001).

INTRODUÇÃO

4

Como alternativa para a obtenção de VE, Bryant e Atwater estudaram a

disponibilidade de macronutrientes nos alimentos a partir de dados experimentais

sobre a digestão de proteínas, gorduras e carboidratos. O valor de energia

metabolizada obtido por Bryant e Atwater é referido hoje em dia como “fatores

gerais de Atwater” e leva em consideração, portanto, o calor de combustão e a

digestibilidade do alimento. A equação estabelecida por Atwater (Equação 1) está

exposta a seguir, na qual P, G e C correspondem, respectivamente, a proteína,

gordura e carboidrato, estando todas estas variáveis expressas em grama. VE é o

valor energético, em kcal (Buchholz e Schoeller, 2004).

G9P4C4VE ++=

Equação 1 : Equação de Atwater.

Desta forma, na maioria das vezes, o cálculo de VE é realizado a partir

dos valores de proteínas, lipídios (gorduras) e carboidratos da amostra analisada,

conforme Equação 1. A determinação destes macronutrientes é feita a partir de

procedimentos analíticos distintos.

Os carboidratos compreendem a maior parcela da matéria seca de

plantas, sendo os componentes mais abundantes e amplamente distribuídos entre

os alimentos. Além da importância nutricional, os carboidratos são adoçantes

naturais, matéria prima para produtos fermentados e estão associados às

propriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetal (Fennema,

1996; Cecchi, 1999).

O teor de carboidrato pode ser calculado pela diferença entre 100 e a soma

das porcentagens de água, proteína, lipídios, álcool (quando presente) e cinzas

(Anvisa, 2003).

As proteínas são polímeros altamente complexos, formados a partir de um

conjunto de aminoácidos, arranjados em várias sequências específicas. As

propriedades funcionais das proteínas em alimentos variam conforme suas

INTRODUÇÃO

5

estruturas e propriedades físico químicas. Estes compostos apresentam funções

estruturais catalíticas, regulatórias, de defesa, etc (Fennema, 1996; Lehninger,

1990).

O teor de proteína pode ser calculado a partir da quantidade de nitrogênio.

A Association of Official Analytical Chemists (AOAC International, 1996)

recomenda a determinação do nitrogênio pelo método de Kjeldahl. Este método foi

desenvolvido em 1883 por Johan Kjeldahl, e consiste de uma completa digestão

das amostras em ácido sulfúrico concentrado, com catalisadores tais como sais de

cobre, em alta temperatura.

Os lipídios são biomoléculas orgânicas insolúveis em água, que podem

ser extraídas de células e tecidos por solventes orgânicos não polares. Os lipídios

possuem várias funções biológicas importantes; entre elas, são componentes

estruturais de membranas e estão relacionados ao armazenamento e transporte

de combustível metabólico (Lehninger, 1990).

Vários são os métodos encontrados na literatura para determinar a

quantidade de lipídios nas amostras. Entre estes métodos, o Bligh-Dyer (Bligh e

Dyer, 1959) é o mais simples, pois utiliza apenas tubos de ensaio, não

dependendo de nenhum equipamento específico ou sofisticado. Por outro lado,

para sua execução, são necessários solventes orgânicos tóxicos, uma vez que o

procedimento utiliza uma mistura de clorofórmio-metanol-água. A amostra é

misturada com metanol e clorofórmio numa proporção em que formam uma só

fase. Adiciona-se mais clorofórmio e água, promovendo a formação de duas fases

distintas, uma de clorofórmio, contendo lipídios, e a outra de metanol e água,

contendo substâncias não lipídicas. A fase do clorofórmio com a gordura é isolada

e, após a evaporação do solvente, obtém-se a quantidade de gordura por

pesagem.

Todos os procedimentos descritos anteriormente apresentam aspectos

negativos para análises de rotina, pois são laboriosos, lentos e geradores de

INTRODUÇÃO

6

resíduos. Em geral, envolvem o uso de ácidos concentrados ou outros reagentes

orgânicos tóxicos (AOAC International, 1996; Prentice, 2005).

I. 2. ESPECTROMETRIA DE FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X

I.2.1. BREVE HISTÓRICO

Os raios X foram descobertos em 8 de novembro de 1895 pelo físico

alemão Wilhelm Conrad Röntgen durante alguns estudos que fazia sobre a

condutividade dos gases. Por serem desconhecidos, Röntgen chamou tais raios

de X (Birks, 1969; Jenkins, 1999).

Segundo o que contam os historiadores da ciência, Röntgen estava numa

sala totalmente escura. A certa distância da válvula de gases havia uma folha de

papel, usada como tela, tratada com platinocianeto de bário. Röntgen viu a tela

brilhar, emitindo luz, fato que o espantou, uma vez que a válvula estava coberta

por uma cartolina negra e nenhuma luz ou raio catódico poderia ter vindo dela.

Então, ele fez várias investigações; entre elas, colocou diversos objetos entre a

válvula e a tela e viu que todos pareciam transparentes. Mas, ao colocar a sua

mão, ele observou na tela o registro de seus ossos perfeitamente visíveis

(Chassot, 1995).

Meses após seus estudos, Röntgen apresentou à Sociedade Físico –

Médica de Wurzburg, na Alemanha, um relatório descrevendo sua nova

descoberta. Com as perspectivas das várias aplicações que a nova descoberta

teria, Röntgen foi laureado, em 1901, com o primeiro prêmio Nobel de Física

(Bertin, 1970; Chassot, 1995; Jenkins, 1999).

Os estudiosos ligados à medicina viram na nova descoberta a possibilidade

de se ver o interior do corpo humano sem precisar abri-lo e novas investigações

sobre os “misteriosos” raios passaram a ser feitas (Chassot, 1995).

INTRODUÇÃO

7

Em 1911, Barkla mostrou que um elemento, quando estimulado pela

radiação X, emite uma radiação característica. Barkla evidenciou a série de linhas

de emissão, a qual designou de K, L, M, N, etc. (Barkla, 1911).

Estas novas descobertas auxiliaram Henry Moseley nos seus estudos para

obter uma relação entre o nº atômico, o comprimento de onda e as linhas

espectrais de raios X. Tal relação, determinada em 1913, estabelecia a base

qualitativa e quantitativa da análise espectroquímica por raios X (Birks, 1969).

Apesar de toda atenção destinada aos raios X, apenas em 1912, com os

trabalhos de Max von Laue e de Friedrich e Knipping, foi esclarecido que os raios

X eram resultados da colisão entre raios catódicos e os elétrons do cátodo

(Chassot, 1995).

O primeiro equipamento de raios X foi apresentado por Moseley, mas este

era ainda muito primitivo, sendo otimizado aos poucos. Coolidge (1913) introduziu

o filamento quente. Soller (1924) construiu um espectrofotômetro com colimadores

e Geiger e Muller (1928) desenvolveram o tubo detector preenchido com gás.

As aplicações dos raios X em Química Analítica foram iniciadas por

Hadding (1922), com estudos sobre a determinação qualitativa e quantitativa de

metais com número atômicos superiores a 12, a partir dos espectros de

fluorescência obtidos após a excitação por radiação X. Foi Hadding, portanto,

quem realizou a primeira análise envolvendo o espectro de raios X, dando início a

técnica de fluorescência de raios X, o que permitiu Coster e von Hevesy (1923)

descobrirem o elemento háfnio em 1923.

Os métodos analíticos de análise envolvendo a radiação X se

desenvolveram de maneira lenta, mesmo após a já constatação da aplicabilidade

dos mesmos por Hadding, Coster e von Hevesy. Provavelmente, isto tenha

ocorrido devido a maior aceitação por técnicas e métodos já consolidados, como

aqueles chamados de clássicos, como a gravimetria e volumetria (Szabadváry,

1966).

INTRODUÇÃO

8

O primeiro protótipo de um instrumento comercial para fluorescência de

raios X (FRX) foi proposto somente em 1948 (Friedman e Birks, 1948), mas

estudos usando esta técnica continuaram. Em 1929, já se tinha conhecimento do

espalhamento inelástico que os fótons de raios X poderiam sofrer ao interagir com

a matéria (Compton, 1929). Tal fenômeno ficou conhecido como espalhamento

Compton, em homenagem ao seu descobridor, Arthur Holly Compton, cujo

trabalho foi também reconhecido com o recebimento do prêmio Nobel de física.

As décadas de 1950 e 1960 foram marcadas por estudos na busca de

melhorias nos componentes dos equipamentos de FRX e otimização da técnica.

Então, com o passar dos anos, laboratórios de indústrias e centros de pesquisas

se interessaram mais pela técnica, principalmente à medida que suas vantagens,

como rapidez, precisão, exatidão e reprodutibilidade, foram sendo definidas. É

claro que, assim como os demais métodos ditos instrumentais, os avanços da

eletrônica e da computação contribuíram para popularizar os métodos envolvendo

a FRX. No entanto, é provável que o fato destes métodos não serem destrutivos e

não requererem preparo de amostra tenha sido a principal causa para a sua

aceitação (Bertin, 1970; Harris, 2001).

Por volta de 1970, estudiosos começaram a constatar que um novo efeito

de espalhamento (posteriormente chamado de Raman) aparecia em espectros de

raios X de amostras contendo elementos leves, para determinados ângulos entre

a amostra e o feixe. Devido a grande quantidade de espalhamento de raios X

promovida por amostras orgânicas, a técnica de FRX era considerada inadequada

para esta classe de amostras (Mizuno e Ohmura, 1967).

Com o objetivo de minimizar esta deficiência, vários estudos começaram a

ser feitos, principalmente a partir da década de 1990. A união da FRX às

ferramentas quimiométricas mostrou ser muito útil, aumentando assim a

versatilidade da técnica para diferentes tipos de amostras (Alexandre e Bueno,

2006; Bortoleto et al., 2007; Bueno et al., 2005; Goraieb et al., 2007; Molt e

INTRODUÇÃO

9

Schramm, 1999; Pereira e Bueno, 2008; Swerts et al., 1993; Terra et al., 2008a;

Terra et al., 2008b; Vasquez et al., 2002; Verbi et al., 2005, Wang et al., 1990).

I.2.2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

A fluorescência de raios X (FRX) é uma técnica de análise relacionada

com a medida de energia e intensidade características da radiação X emitida por

uma amostra irradiada com radiação eletromagnética (IUPAC, 2008).

O fenômeno fotoelétrico é o principal processo que ocorre junto com os

efeitos de espalhamento dos raios X, sendo estes últimos observados

especialmente quando a matriz é composta por elementos de baixo número

atômico.

O efeito fotoelétrico é verificado quando a fonte de raios X promove a

ejeção de elétrons da camada mais interna do átomo que foi submetido ao

processo de irradiação, o que gera uma situação extremamente instável. Então,

para estabilizar esta situação, elétrons de camadas mais externas se deslocam e

ocupam as vacâncias geradas pela emissão. Neste deslocamento há liberação de

energia que pode ser utilizada na determinação qualitativa de um elemento, uma

vez que ela é característica de cada elemento químico. Paralelamente, a

quantificação do elemento pode ser realizada pela intensidade da radiação

emitida, pois ela é proporcional à concentração da espécie (Jenkins e De Vries,

1970; Skoog et al., 2002).

Conforme as camadas envolvidas neste “deslocamento” dos elétrons, as

emissões de raios X recebem uma nomenclatura específica. A camada a ser

preenchida pelo elétron é que determina a nomenclatura da emissão. Além disso,

se o elétron se desloca para a camada mais próxima, a emissão do fóton de raios

X será denominada de α e as camadas posteriores sucessivamente de β, γ, δ, etc,

conforme esquematizado na Figura 1 (Jenkins, 1999).

INTRODUÇÃO

10

Figura 1 : Diagrama de transições de raios X e suas respectivas denominações.

Entre as vantagens tradicionais é possível destacar que a FRX: (i) é

rápida, (ii) envolve baixo custo operacional, (iii) não promove a destruição da

amostra, e, finalmente, (iv) pode fornecer simultaneamente resultados qualitativos

e quantitativos (Bertin, 1970; Skoog et al., 2002).

Estas diversas vantagens da FRX, associadas ao fato da análise envolver

mínimo (ou nenhum) preparo da amostra, fazem com que esta técnica tenha uma

ampla aplicação não só na área de química, mas também em outras ciências, tais

como medicina (Farquharson e Geraki, 2004), geologia (Schimidt et al., 2002),

biologia (Alexandre e Bueno, 2006; Bode et al., 2008), arqueologia (Calza et al.,

2006; Calza et al., 2007), etc.

Pode-se afirmar que a FRX já está bem consolidada quando aplicada a

determinações inorgânicas em elementos cuja absorção dos raios X apresenta

valores significativos (Z>11). Por outro lado, nos últimos anos vem ganhando

destaque a aplicação de FRX em estudos de amostras orgânicas, nas quais a

radiação X é intensamente dispersada (espalhada) e não apenas absorvida (efeito

fotoelétrico).

INTRODUÇÃO

11

Simultaneamente ao efeito fotoelétrico, na FRX ocorrem os efeitos

Rayleigh, Compton e Raman, relacionados ao espalhamento do feixe incidente. O

processo de espalhamento ocorre quando um fóton de raios X interage com os

elétrons dos elementos químicos, sem que haja absorção ou emissão. Todos os

átomos espalham fótons de raios X, mas a intensidade destes fenômenos

depende do número atômico e da composição da amostra (Jenkins, 1999).

O efeito Rayleigh, também chamado de espalhamento coerente, é

resultado da interação elástica de fótons de raios X com o meio. Neste caso,

portanto, não há perda de energia durante o processo de colisão, o que justifica o

fato do valor do pico máximo de energia observado no espectro de raios X para

esse efeito ser igual a do elemento utilizado na fonte de raios X (Jenkins, 1999;

IUPAC, 2008).

Já o efeito Compton (ou espalhamento incoerente) está associado ao

espalhamento inelástico de fótons de raios X, ou seja, parte da energia do fóton é

dispersada após a colisão, sendo transferida para os elétrons da camada de

valência, que sofrem excitação (Jenkins, 1999; IUPAC, 2008).

Outro espalhamento inelástico que ocorre do feixe de raios X é o Raman.

Neste caso, a perda de energia de fótons é acompanhada pela migração de

elétrons da camada K (Jenkins, 1999). Estudos mais detalhados sobre este

espalhamento (Mizuno e Ohmura, 1967; Suzuki, 1967) permitiram constatar que o

seu comportamento é variável em função do ângulo de incidência, de maneira

que, a 90º, não é observada a banda referente ao espalhamento Raman. Isto

ocorre porque, neste ângulo de incidência, o Raman fica totalmente encoberto

pelos espalhamentos Compton e Rayleigh.

Devido ao fato do espalhamento Raman não ser observado nos espectros

obtidos por fluorescência de raios X por energia dispersiva, muitos estudiosos

ignoram a sua existência ou acreditam que ele não forneça informações

relevantes.

INTRODUÇÃO

12

Hoje, entretanto, já se sabe que, com o auxílio de ferramentas

quimiométricas, a região de espalhamento da FRX pode revelar detalhes

importantes sobre as amostras, uma vez que é dependente de várias

características da amostra como composição, estrutura cristalina e concentrações

relativas de seus componentes.

Em especial, amostras que possuam muitos elementos considerados

leves (Z<11), como é o caso de amostras orgânicas, o espalhamento Raman é

muito intenso. Isto justifica o porquê da técnica de FRX sempre ter sido

considerada inadequada para estes compostos (Alexandre, 2007).

I. 3. QUIMIOMETRIA

Com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais sofisticados, a

possibilidade de aquisição de dados envolvendo a geração de uma quantidade

grande de informações, muitas vezes complexas e variadas, aumenta

proporcionalmente. Na área de química isto não é diferente, o que é comprovado

pela quantidade de variáveis que podem ser medidas em um único equipamento

para uma única amostra. Diante destes dados, a quimiometria foi ganhando

espaço e se estabelecendo, uma vez que ela passou a auxiliar os químicos na

interpretação dos resultados obtidos (Antunes, 2000; Ferreira et al., 1999; Luo,

2006; Swerts et al., 1994).

A quimiometria, segundo a Sociedade Internacional de Quimiometria, é a

área da química que emprega métodos matemáticos e estatísticos para planejar

ou selecionar experimentos de forma otimizada, fornecendo o máximo de

informações químicas com a análise dos dados (ICS, 2008).

A região de espalhamento da FRX é dependente de várias características

da amostra, fornecendo muitas informações sobre ela. Então, para explorar tal

região e obter o máximo de informações sobre amostras orgânicas, o acoplamento

INTRODUÇÃO

13

da FRX e da quimiometria tem mostrado resultados muito promissores,

fortalecendo ainda mais esta união.

Diversos são os métodos estatísticos usados no tratamento dos dados

multivariados. Entre estes estão a análise por componentes principais (PCA – do

inglês, Principal Component Analysis) e a regressão por quadrados mínimos

parciais, o PLS (do inglês, Partial Least Squares).

A PCA consiste na redução da dimensionalidade do conjunto de dados a

partir de combinações lineares das variáveis originais (Beebe et al., 1998). Então,

novas variáveis são geradas e recebem diversos nomes como, por exemplo, fator,

componente principal, autovalores, etc. As componentes principais são ortogonais

entre si, ou seja, as informações contidas em uma são diferentes das contidas na

outra. Além disso, a obtenção destas variáveis ocorre segundo uma ordem

decrescente de quantidade de informação estatística que descrevem, ou seja, a

primeira componente principal é aquela que descreve a maior parte da informação

estatística da amostra (Moita e Moita, 1998).

A análise por componentes principais é um método de agrupamento que,

além de reduzir a dimensionalidade da matriz de dados, permite verificar a

existência de amostras anômalas e as de maior importância, eliminar ruídos

experimentais, classificar as amostras e/ou agrupá-las conforme suas

semelhanças, etc. A sua aplicação implica em decompor a matriz de dados (X) em

duas outras matrizes: a de scores (T) e a de loadings transposta (P’), conforme a

Equação 2, onde E é a matriz de erros ao realizar esta decomposição (Ferreira et

al., 1999; Wold et al., 1987).

E'TPX ++++====

Equação 2 : Decomposição da matriz de dados (X) resultante de aplicação da análise por componentes principais.

INTRODUÇÃO

14

A matriz de scores expressa a relação entre as amostras, apresentando

as suas coordenadas em um novo sistema de eixos. Já a matriz de loadings

expressa a relação entre as variáveis, identificando o quanto cada uma delas

contribuiu na formação das componentes principais (Ferreira et al., 1999; Wold et

al., 1987).

Estabelecer uma relação entre a variável de interesse e as informações

(propriedades) que se tem das amostras significa construir um modelo matemático

cuja equação resultante represente tal relação. Neste modelo, a variável de

interesse é uma grandeza mensurável e o modelo é chamado de calibração

(obtido por métodos quantitativos).

Entre os métodos quantitativos para análise de dados multivariados

destaca-se o PLS. Modelos obtidos por PLS tendem a ser robustos, isto é, seus

parâmetros praticamente não se alteram com a inclusão de novas amostras no

conjunto de calibração. O PLS tem se tornado uma ferramenta extremamente útil

e importante em muitos campos da química, como a físico química, a química

analítica, a química medicinal, ambiental e ainda no controle de inúmeros

processos industriais (Beebe et al., 1998).

A regressão PLS estabelece uma relação quantitativa entre o conjunto das

respostas instrumentais (por exemplo, dados espectrais) e uma ou mais

propriedades físicas ou químicas das amostras de interesse (concentração, índice

de doçura, acidez, viscosidade, etc.), desenvolvendo um modelo matemático que

correlaciona estas informações. Este procedimento engloba duas etapas:

calibração e validação. A etapa de calibração estabelece uma relação entre a

matriz inicial de dados X (sinais instrumentais, variáveis independentes) e as

propriedades conhecidas de amostras de referência (variáveis dependentes)

organizados na matriz Y. A validação permite verificar se o modelo é capaz de

prever as propriedades de novas amostras - valores de incógnitas (Geladi e

Kowalski, 1986).

INTRODUÇÃO

15

Da mesma forma que a PCA, o PLS realiza combinações das variáveis

originais, gerando novas variáveis, geralmente chamadas de variáveis latentes. Na

construção dos modelos de regressão, a escolha do número de variáveis latentes

é uma etapa muito importante. O número ideal de variáveis latentes é aquele que

permite a construção de um modelo com boa capacidade de previsão para

amostras externas, sem super ajustar o modelo nem promover a modelagem de

ruídos (Martens e Naes, 1996).

A validação cruzada é um dos métodos mais utilizados para a

determinação do número de variáveis latentes. Neste procedimento, a calibração é

repetida n vezes, sendo que, em cada uma destas vezes, é feita a previsão das

variáveis para uma i-ésima parte do conjunto de calibração. Ou seja, uma amostra

é retirada do conjunto de n amostras e então é feita a calibração para as n-1

amostras restantes. Na sequência, a amostra não usada na calibração tem sua

variável prevista pelo modelo. O processo é repetido até que todas as amostras

tenham sido excluídas (Martens e Naes, 1996).

Os valores previstos pelo modelo são comparados com os valores de

referência e os erros são calculados. A partir destes, é obtida a soma dos

quadrados dos erros de previsão (PRESS, Predicted Residual Error Sum of

Squares) para cada variável latente. Após a construção do modelo de calibração,

amostras são utilizadas para verificar a capacidade de previsão do modelo

(Martens e Naes, 1996).

Com o objetivo de facilitar a visualização dos resultados, na maioria das

vezes, são realizados pré-processamentos nos dados originais ao realizar o

tratamento quimiométrico. O pré-processamento mais simples e mais utilizado nos

dados de espectrometria consiste em centrar os dados na média. Este

procedimento implica na subtração do elemento de cada coluna pelo valor médio

dos elementos dessa coluna, obtendo-se como resultado uma matriz na qual

todas as colunas têm média zero.

INTRODUÇÃO

16

Em algumas situações, são realizadas transformações nos espectros para

remover matematicamente fontes de variação indesejáveis. Entre estas

transformações destacam-se as técnicas de alisamento que visam aumentar a

razão sinal-ruído, e as correções da linha base, que minimizam as variações

sistemáticas presentes no sistema.

Para verificar a adequação de um procedimento analítico ou de um modelo

proposto, é realizado um processo chamado de validação. A validação permite

constatar se o procedimento ou modelo apresenta um desempenho adequado

para as condições em que será aplicado. A sua realização pode envolver a

determinação de parâmetros que são conhecidos como figuras de mérito (Sena et

al., 2007).

Poppi e colaboradores (Valderrama et al., 2007) propuseram o cálculo de

algumas figuras de mérito. Na Tabela 1 estão expressas as fórmulas para

obtenção de tais parâmetros.

INTRODUÇÃO

17

Tabela 1 : Informações sobre as figuras de mérito utilizadas em validação multivariada

(Valderrama et al., 2007).

Figuras de

Mérito Relação Matemática Definição

SÊN kb

1SÊN=

Fração do sinal responsável pelo acréscimo de uma unidade de concentração à

propriedade de interesse.

γγγγ x

SÊN

δγ = Razão entre a sensibilidade e o ruído

instrumental

RMSEP

v

lv

1i

2^

ii

l

yy

RMSEP∑

=

−=

Grau de concordância entre o valor estimado pelo modelo e o valor tido como

verdadeiro ou de referência

LOD SÊN

13b3LOD xkx δδ ==

Menor valor de sinal líquido (ou concentração) detectável para que as

probabilidades de um falso negativo (α) e um falso positivo (β) sejam iguais a 0,05.

LOQ SÊN

110b10LOQ xkx δδ ==

Valor de concentração analítica (ou sinal) que irá produzir estimativas com um

determinado desvio padrão, usualmente 10%.

tBias SDV

lBiast v

Bias =

bias é a diferença entre a média e o seu valor verdadeiro. Um teste t pode ser

utilizado para se avaliar, quantitativamente, se o bias incluso no modelo é ou não

significativo

bk é o vetor dos coeficientes de regressão estimados pelo PLS δx é uma estimativa do desvio padrão da flutuação do sinal analítico

v

lv

1i

^

ii

l

yy

Bias∑=

−= e

1l

Biasyy

SDVv

2

i

^

i

−

−

−=∑

Iv é o número de amostras do conjunto de validação yi é o valor de referência e ŷi é o valor previsto pelo modelo

OBJETIVOS

19

IIII –– OOBBJJEETTIIVVOOSS

OBJETIVOS

21

II. 1. OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho foi verificar a potencialidade de um novo

procedimento a partir da aliança entre a FRX e a quimiometria para a

quantificação do valor energético e o teor de alguns macronutrientes (proteínas e

carboidratos) contidos em amostras comerciais de farinhas e extratos para

consumo humano, visando minimizar os aspectos negativos dos métodos

convencionais e obter resultados que se enquadrem na legislação vigente no

Brasil, isto é, com erro máximo de 20% (RDC 360, portaria 42, de 23 de dezembro

de 2003 - ANVISA).

EXPERIMENTAL

23

IIIIII –– EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL

EXPERIMENTAL

25

III. 1. REAGENTES

Todos os experimentos foram realizados com reagentes de pureza analítica

(Tabela 2), seguindo-se procedimentos recomendados pela literatura (Baccan et al., 2001;

Jeffery et al., 1992). Para a preparação das soluções, foi utilizada água destilada

(destilador de vidro) como solvente, exceto para o preparo das soluções de fenolftaleína,

verde de bromocresol e vermelho de metila, para o qual foi usado álcool comercial 99,3°,

Chemco. As soluções foram utilizadas com prazo máximo de 7 dias após a data do

preparo.

Tabela 2 : Reagentes utilizados na realização dos experimentos.

Regentes Marca

Ácido bórico Synth

Ácido clorídrico Merck

Ácido sulfúrico Ecibra

Carbonato de sódio Synth

Clorofórmio Synth

Etanol Nuclear

Fenolftaleína Nuclear

Hidróxido de sódio Dinâmica

Peróxido de hidrogênio 30% Ecibra

Sulfato cúprico Ecibra

Sulfato de potássio Ecibra

Sulfato de sódio Vetec

Verde de bromocresol Carlo Erba

Vermelho de metila Berzog

EXPERIMENTAL

26

III. 2. AMOSTRAS

Foram utilizadas neste trabalho 55 amostras comerciais de farinhas e

extratos para consumo humano de marcas variadas. Esta quantidade foi

estipulada em função da disponibilidade de amostras em supermercados da

região de Campinas-SP (Brasil) na ocasião da aquisição das mesmas. As

amostras foram agrupadas conforme a sua origem: milho (COrn), soja (SOy), trigo

(WHeat) e mandioca (CAsava). Também foram incluídas no conjunto amostral,

farinhas lácteas de cereais que, além de cereais, possuem leite em sua

composição. Para efeito de agrupamento, a origem destas amostras foi atribuída

ao leite (MIlk), pois na maior parte destas, mais de um vegetal estava presente.

Para alguns produtos, foi analisada mais de uma marca. As amostras

flocadas foram trituradas com auxílio de almofariz e pistilo antes de serem

utilizadas.

A descrição das amostras, com base nas informações dos fabricantes, pode

ser verificada na Tabela 3. Já na Tabela 4, são apresentados os valores de rótulo

das amostras para os parâmetros analisados. Estes valores foram convertidos

para 100 g de amostra, uma vez que cada produto apresentava os valores para

uma quantidade diferente de amostra.

EXPERIMENTAL

27

Tabela 3 : Descrição das amostras de alimento utilizadas para cada grupo.

Grupo Amostras Descrição do Alimento Aspecto Físico

da Amostra

Milho (CO)

CO1-CO2, Fubá de Milho pó

CO3-CO5, CO7, CO9 Farinha de Milho floco

CO6, CO11 Farinha de Milho grânulo

CO8, CO12 Amido de Milho pó

CO10 Sêmola de Milho grânulo

Soja (SO)

SO1-SO3, SO9-SO10 Extrato de Soja pasta

SO4-SO6 Alimento Instantâneo com

Proteína de Soja pó

SO7 Fibra de Soja pó

SO12 Fibra de Soja grânulo

SO8, SO11 Farinha de Soja pasta

Trigo (WH)

WH1, WH6, WH9 Farinha de Trigo pó

WH2-WH3, WH5 Farinha de Rosca grânulo

WH4 Farelo de Trigo Integral grânulo

WH7 Farinha de Trigo Integral pó

WH8 Gérmen de Trigo Tostado grânulo

WH10-WH12 Fibra de trigo grânulo

Mandioca (CA)

CA1-CA2 Farinha de Mandioca

Temperada grânulo

CA3, CA8, CA11 Farinha de Mandioca Crua grânulo

CA4-CA5, CA12 Farinha de Mandioca

Torrada grânulo

CA6, CA9 Polvilho Doce pó

CA7, CA10 Fécula de Mandioca pó

Leite (MI)

MI2, MI4, MI6 Farinha Láctea pó

MI3 Farinha Láctea grânulo

MI1, MI7 Farinha Láctea de Cereais floco

MI5 Farinha Láctea de Cereais

Integral floco

EXPERIMENTAL

28

Tabela 4 : Valores apresentados nos rótulos para valor energético (VE) e teores de

proteína (TP) e carboidrato (TC) para as amostras analisadas.

Grupo Amostra VE (kcal/100g) TP (g/100g) TC (g/100g)

Milho

CO1 340 8,0 78

CO2 340 8,0 78

CO3 327 7,1 69

CO4 338 7,1 73

CO5 350 7,5 80

CO6 350 7,5 80

CO7 350 7,5 82

CO8 340 0 85

CO9 381 6,7 86

CO10 350 7,5 80

CO11 365 7,5 78

CO12 400 0 90

Soja

SO1 413 40 28

SO2 442 31 42

SO3 490 25 40

SO4 355 36 47

SO5 500 37 38

SO6 469 26 37

SO7 200 37 12

SO8 460 37 31,0

SO9 433 40 21,0

SO10 460 21 31

SO11 500 45 28

SO12 200 37 12

EXPERIMENTAL

29


Trigo

WH1 360 0 76

WH2 370 10,3 77

WH3 370 10,3 77

WH4 340 14,0 72

WH5 373 12,3 80

WH6 360 10,0 76

WH7 360 13,8 73

WH8 340 27,0 37

WH9 344 10,0 76

WH10 180 15,0 20

WH11 150 16,0 22

WH12 150 20 72

Mandioca

CA1 357 3 77

CA2 357 0 77

CA3 356 1,6 88

CA4 380 1,8 92

CA5 358 0 88

CA6 350 0 85

CA7 355 0 90

CA8 360 2 86

CA9 355 0 90

CA10 345 0 85

CA11 338 1,8 83

CA12 380 1,8 93

EXPERIMENTAL

30


Leite

MI1 332 9,8 82

MI2 410 13,0 73

MI3 600 10,0 73

MI4 433 6,7 83

MI5 393 12,7 70

MI6 397 12,7 73

MI7 358 10,4 75

III. 3. EQUIPAMENTOS

� Balança analítica, marca Ohaus, modelo Analytical Plus;

� Bloco digestor MicroKjeldahl para 40 provas, marca Tecnal, modelo TE-40-25;

� Destilador MicroKjeldahl, marca Tecnal, modelo TE-036/1;

� Espectrômetro de fluorescência de raios X por dispersão de energia (EDXRF)

marca Shimadzu, modelo EDX-700, constituído por um tubo de Rh e um detector

semi-condutor de Si(Li);

� Estufa com circulação de ar, marca Nova Ética, modelo 400/3ND, série 0766/00;

� Mufla, marca Fornitec Rebert Shaw Pyrotec.

EXPERIMENTAL

31

III. 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

III. 4. 1 – MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE

Todos os procedimentos descritos a seguir foram realizados em triplicata

para cada uma das amostras.

A – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA - MÉTODO MICROKJELDAHL (AOAC

International, 1996)

O método microKjeldahl envolveu 3 etapas: digestão, destilação e titulação.

• Digestão:

Em 1 tubo de microKjeldahl de 100 mL foram adicionados 200 mg de

amostra pesados em balança analítica, 1,5 g de mistura de catalisador (96%

K2SO4 + 4% CuSO4.5H2O) e 3 mL de H2SO4 concentrado, adicionados com

proveta.

Em seguida, o tubo foi colocado no bloco digestor (Figura 2), que foi

aquecido até 100 ºC, permanecendo nesta temperatura por 30 minutos. A

temperatura foi então elevada de 20 em 20 ºC, permanecendo por 15 minutos em

cada temperatura, para evitar que a amostra levantasse fervura bruscamente e

espirrasse.

Quando a temperatura do bloco atingiu 360 ºC, o tubo foi retirado do bloco

e colocado para esfriar a temperatura ambiente. Se ainda eram observados

resíduos carbonizados, algumas gotas de peróxido de hidrogênio 30% eram

adicionadas ao tubo para auxiliar na digestão dos mesmos; o tubo era novamente

aquecido, elevando a temperatura aos poucos, até atingir 360 ºC.

EXPERIMENTAL

32

Figura 2: Fotografia do bloco digestor utilizado

• Destilação:

O tubo de microKjeldahl contendo a amostra digerida e sem resquícios de

resíduos carbonizados foi colocado em uma das extremidades do destilador de

Kjeldahl. Na saída do destilador, foi colocado um erlemmeyer de 250 mL contendo

10 mL de ácido bórico 20 g L-1, 4 gotas de vermelho de metila 1 g L-1 e 6 gotas de

verde de bromocresol 1 g L-1. A ponta do destilador ficou totalmente mergulhada

na solução ácida.

Em seguida, o destilador foi ligado e aproximadamente 10 mL de NaOH

400 g L-1 foram adicionados ao sistema por uma válvula localizada na parte

superior do destilador (Figura 3). Prosseguiu-se com a destilação até obtenção de

aproximadamente 100 mL de destilado.

EXPERIMENTAL

33

Figura 3 : Fotografia do destilador de microKjeldahl utilizado.

• Titulação:

O destilado obtido na etapa de destilação foi titulado com ácido clorídrico

0,02 mol L-1, previamente padronizado, conforme recomendado na literatura

(Baccan et al., 2001).

Foi calculado então o teor de proteína presente na amostra.

NaOH

EXPERIMENTAL

34

B – QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATO - MÉTODO DA DIFERENÇA

(ANVISA, 2003)

O teor de carboidrato foi calculado pela diferença entre 100 e a soma das

porcentagens de proteína, umidade, cinzas e lipídios determinadas pelos

procedimentos apresentados nos itens III.4.1A, III.4.1B1, III.4.1B2 e III.4.1B3,

respectivamente.

• B1 – QUANTIFICAÇÃO DE UMIDADE (AOAC International, 1996)

Cadinhos de alumínio e suas respectivas tampas foram limpos e secos em

estufa com circulação de ar, por 30 minutos, a 110 ºC. Os cadinhos e tampas

foram colocados em dessecador para esfriar, antes de terem suas massas

medidas.

Em seguida, foram adicionados 2 g de amostras, pesados em balança

analítica. O cadinho com a amostra foi colocado na estufa, sem tampa, por 4 h, a

105 ºC. Decorrido este período, o cadinho foi retirado da estufa, tampado para

evitar a absorção de umidade do meio, e colocado em dessecador. Quando frio,

foi pesado novamente com a tampa.

Na sequência, o cadinho foi levado por mais 30 minutos na estufa a 105 ºC;

sendo pesado novamente depois deste tempo. Este procedimento foi repetido até

a obtenção de massa constante.

Foi feito o cálculo do teor de umidade na amostra, levando em

consideração as três replicatas.

• B2 – QUANTIFICAÇÃO DE CINZAS (AOAC International, 1996)

Cadinhos de porcelana foram previamente limpos e aquecidos a 550 ºC,

por 30 minutos, em mufla. Os cadinhos foram colocados em dessecador para

esfriar, antes de terem suas massas medidas.

EXPERIMENTAL

35

Em seguida, 2 g de amostra, pesados em balança analítica, foram

transferidos para um cadinho, que foi levado novamente a 550 ºC em mufla.

A amostra só foi retirada da mufla após toda parte orgânica ter sido

carbonizada (obtenção de um material esbranquiçado ou cinzento). O cadinho foi

deixado em dessecador para esfriar, sendo pesado logo em seguida, em balança

analítica.

Foi feito o cálculo do teor de cinzas na amostra.

• B3 - QUANTIFICAÇÃO DE GORDURA - BLIGH-DYER (Bligh e Dyer, 1959)

Medidos em balança analítica, 3 g de amostra foram adicionados em um

tubo de ensaio de 70 mL com tampa de rosca. A este tubo foram transferidos, com

auxílio de buretas, 10 mL de clorofórmio, 20 mL de metanol e 8 mL de água

destilada.

O tubo tampado foi então agitado por 30 minutos em um agitador rotatório

manual (Figura 4). Em seguida, foram adicionados com buretas 10 mL de

clorofórmio e 10 mL de solução de sulfato de sódio 15 g L-1. O tubo foi agitado por

mais 2 minutos e deixado em descanso por 40 minutos em geladeira para

separação das fases.

As fases foram separadas, sendo a que continha metanol e água

descartada devidamente e a com clorofórmio, mantida no tubo de ensaio. Foi

adicionado aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro no tubo, que foi

tampado e agitado para remover possíveis traços de água que tivessem

permanecido. O conteúdo do tubo foi filtrado, utilizando funil de vidro e papel de

filtro contendo aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro.

Com o auxílio de pipeta volumétrica, 5 mL do filtrado foram transferidos

para um béquer de 50 mL previamente, limpo, seco e pesado. O béquer foi

colocado em estufa a 105 ºC até evaporação total do solvente. Após resfriado em

EXPERIMENTAL

36

dessecador, o béquer foi novamente pesado e o teor de gordura na amostra foi

calculado.

Figura 4 : Fotografia do agitador rotatório manual utilizado.

C – QUANTIFICAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO (Buchholz e Schoeller, 2004)

O cálculo de VE foi realizado conforme a Equação 1 (p. 4), a partir dos

valores de proteínas, carboidratos e lipídios (gorduras) da amostra analisada,

determinados pelos procedimentos descritos nos itens III.4.1 A, III.4.1 B e

III.4.1 B3, respectivamente.

III. 4. 2 – MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X

• Medidas Analíticas:

Celas de FRX (Chemplex 1300, diâmetro externo de 30,7 mm e volume

interno de 7 cm3) foram montadas com seu fundo sustentado por um filme de

Mylar (Chemplex 100), de espessura de 2,5 µm.

As celas foram preenchidas com a amostra, garantindo completa absorção

do feixe de raios X (modo de espessura infinita). A voltagem aplicada no tubo de

raios X foi igual a 50 kV, com 25% de tempo morto. Os espectros foram obtidos

EXPERIMENTAL

37

sequencialmente, com uma resolução de 0,02 keV, de 0 a 40 keV. O tempo de

irradiação foi de 120 s e para cada amostra foram preparadas 3 celas de FRX,

resultando em 165 espectros.

• Tratamento dos dados:

O tratamento dos dados foi realizado com o programa computacional

Pirouette® 3.11 (Infometrix Co., 2003).

Os dados do espectro inteiro (incluindo a região de espalhamento de raios

X) foram submetidos a tratamento quimiométrico por PCA e PLS, para a

construção dos modelos de calibração e validação. Para todos os casos, o pré-

processamento utilizado foi o de dados centrados na média, o que, de maneira

geral, consiste em subtrair o elemento de cada coluna pelo valor médio dos

elementos dessa coluna, obtendo-se como resultado uma matriz de emissão de

raios X. Os espectros não sofreram qualquer tipo de transformação.

Para a PCA, todos os 165 espectros foram usados para verificar a

possibilidade de separação entre as amostras de cada classe (milho, trigo, soja,

mandioca e leite). O número adequado de componentes principais foi determinado

pela porcentagem de variância acumulada e, uma vez selecionado este número,

foi examinado o gráfico dos scores para verificar a distribuição das amostras.

Foi verificada a possibilidade de construção de modelos de calibração,

utilizando-se todas as amostras num único conjunto. Para este conjunto, foram

primeiramente identificados os outliers, através de duas grandezas

complementares: leverage e resíduo de Student.

A leverage é uma medida da influência de uma amostra no modelo de

regressão. Um valor de leverage pequeno indica que a amostra em questão

influencia pouco na construção do modelo de calibração. Por outro lado, se as

medidas experimentais de uma amostra são diferentes de outras do conjunto de

calibração, ela provavelmente terá alta influência no modelo, que poderá ser

EXPERIMENTAL

38

negativa. Em geral, amostras com leverage maior do que hcrit (Equação 3) devem

ser consideradas suspeitas e analisadas cautelosamente (Ferreira et al., 1999).

nk3

hcrit =

Equação 3 : Cálculo da leverage máxima admissível de uma amostra (hcrit). k =

número de componentes principais e n = número de espectros do conjunto de

calibração.

O resíduo de Student é calculado pela validação cruzada e está relacionado

ao resíduo da variável dependente. Amostras mal modeladas terão resíduos altos.

Supondo-se que os resíduos são normalmente distribuídos, e sabendo-se que

eles são definidos em unidades de desvio padrão do valor médio, os valores com

± 2,5 são considerados altos sob as condições usuais de estatísticas. Ferreira e

colaboradores (1999) descrevem a maioria das fórmulas associadas à leverage e

resíduo de Student para os modelos de calibração, sendo aqui citados como

referência para mais informações sobre este tópico.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

39

IIVV –– RREESSUULLTTAADDOOSS EE DDIISSCCUUSSSSÃÃOO


41

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados e discussão serão apresentados em itens, conforme os

métodos e procedimentos realizados. Para os métodos convencionais (item IV.1),

os valores obtidos para todas as variáveis estudadas estão apresentados nas

Tabelas 5 a 9, no final deste item.

IV. 1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE

A – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA - MÉTODO MICROKJELDAHL

O método microKjeldahl envolveu 3 etapas: digestão, destilação e titulação.

Na etapa de digestão, o nitrogênio da proteína foi transformado em sulfato

de amônio, resultando num produto de cor verde esmeralda, sem resíduos

carbonizados. A digestão completa de cada amostra demorou aproximadamente 4

horas.

A amostra digerida foi acoplada ao destilador de Kjeldahl. O sistema foi

aquecido e hidróxido de sódio concentrado foi adicionado, para proporcionar a

liberação da amônia. Cabe ressaltar que o destilador é um sistema fechado, e,

portanto, impede a perda de amônia por volatilização. A amônia foi liberada em

uma solução de acido bórico de concentração conhecida, formando o borato de

amônio. A etapa de destilação demorou cerca de 10 minutos por amostra.

Finalmente, o borato de amônio foi titulado com uma solução de HCl

padronizada, para a quantificação do nitrogênio presente na amostra.

Todas as reações envolvidas nas etapas do método de Kjeldahl estão

apresentadas na Figura 5:


42

OH2SONaNH2NaOHSO)(NH 2423424 ++→+

324333 BOHNHBOHNH →+

ClNHBOHHClBOHNH 433324 +→+

Figura 5 : Reações envolvidas no método de Kjeldahl

No método de Kjeldahl, é determinado todo o nitrogênio orgânico presente

na amostra, ou seja, o protéico e o não protéico. Porém, na maioria dos alimentos,

o nitrogênio não protéico representa uma pequena parcela do total. A razão entre

o nitrogênio medido e a proteína estimada depende do tipo de amostra. Em geral,

considera-se o fator 6,25 para os alimentos, uma vez que em média 16% das

proteínas correspondem ao nitrogênio ( 25,616

100 = ) (Cecchi, 1999).

As replicatas foram comparadas, utilizando-se o teste Q, para verificar se

diferiram significativamente entre si com 95% de confiança (Miller e Miller, 2000;

Baccan et al., 2001). Foi calculado o valor médio da quantidade de proteína entre

as replicatas não excluídas pelo teste Q, aplicando-se a Equação 4. Foi

considerada a massa atômica do nitrogênio (MN) igual a 14 g mol-1 e a

concentração de ácido clorídrico (CHCl) igual a média dos valores obtidos para as

seis replicatas da titulação de padronização do mesmo.

H2SO4

∆ + catalisador (NH4)2SO4 Amostra (N)


43

mi

25,6..VH.Cproteína% NClHCl Μ

=

Equação 4 : Cálculo da porcentagem de proteína. CHCl=concentração de HCl, MN =

massa atômica do nitrogênio, VHCl=volume gasto de HCl e mi= massa inicial da

amostra.

B – QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATO - MÉTODO DA DIFERENÇA

Nas tabelas de composição de alimentos, o conteúdo de carboidratos tem

sido fornecido como “carboidratos totais” pela diferença, isto é, as porcentagens

de água, proteína, gordura e cinza subtraídas de 100, conforme Equação 5:

)gordura%proteína%cinzas%umidade(%100ocarboidrat% +++−=

Equação 5 : Cálculo da porcentagem de carboidrato.

• B1 – QUANTIFICAÇÃO DE UMIDADE

O método mais utilizado para quantificação da umidade em alimentos é

através da secagem em estufa, no qual a remoção da água é feita por

aquecimento, sendo o ar quente absorvido por uma camada muito fina do alimento

e então transportado para o interior, por condução.

O tempo para se obter massa constante das amostras e, portanto, garantir

que toda a água das mesmas fosse removida, variou entre 5 e 6 horas, conforme

a amostra. O elevado tempo observado se deve à baixa condutividade dos

alimentos analisados, o que torna mais difícil o calor se dissipar para as porções

mais internas da amostra.

As triplicatas de cada amostra tiveram seus valores comparados através do

teste Q para verificar se eles não diferiam significativamente, com 95% de


44

confiança. Então, foram calculados os valores médios entre as replicatas que não

foram rejeitadas pelo teste Q. Para isso, foi utilizada a Equação 6:

mi100).mfmi(

umidade%−=

Equação 6 : Cálculo da porcentagem de umidade. mi=massa da amostra

inicialmente pesada e mf=massa da amostra seca após o período na estufa.

� B2 – QUANTIFICAÇÃO DE CINZAS

As cinzas de um alimento correspondem ao resíduo inorgânico que

permanece após a queima da matéria orgânica, que é transformada

principalmente em CO2, H2O e NO2. Os componentes mais abundantes das cinzas

de um alimento são: K, Na, Ca e Mg (Cecchi, 1999).

A cinza obtida não é necessariamente da mesma composição que a

matéria mineral presente originalmente no alimento, pois podem ocorrer perdas

por volatilização ou alguma interação entre os constituintes da amostra. Os

elementos minerais se apresentam na cinza sob a forma de óxidos, sulfatos,

fosfatos, silicatos e cloretos; dependendo das condições de incineração e da

composição do alimento (Cecchi, 1999).

As cinzas obtidas para as amostras analisadas apresentaram coloração

variada. De maneira geral, as amostras de trigo tenderam para uma cor

acinzentada enquanto as demais ficaram de branco a bege.

O tempo necessário para a obtenção das cinzas variou entre 14 e 16 horas,

conforme a amostra.

Antes de realizar o cálculo do teor de cinzas, foi verificado, através da

aplicação do teste Q, se as replicatas diferiram significativamente entre si com

95% de confiança (Miller e Miller, 2000; Baccan et al., 2001). Então, foi calculado o

valor médio do teor de cinzas (Equação 7) entre as replicatas não excluídas pelo

teste Q.


45

mim.100

cinzas% cinzas=

Equação 7 : Cálculo da porcentagem de cinzas. mi=massa da amostra

inicialmente pesada e mcinzas=massa de cinzas pesada após a carbonização da

matéria orgânica.

B3 - QUANTIFICAÇÃO DE GORDURA - BLIGH-DYER

O método de Bligh-Dyer apresenta algumas vantagens em relação à

extração a quente. É um procedimento simples, que não necessita de

equipamentos especializados ou sofisticados. Este método pode ser aplicado para

amostras com altos teores de umidade, assim como para as amostras ditas secas.

Além disso, é possível destacar a capacidade de, com este procedimento,

promover a extração de todas as classes de lipídios, inclusive os polares.

Por outro lado, o uso de vários solventes e altos volumes são aspectos

negativos, porém estes também estão presentes em extrações feitas a quente.

O tempo necessário para se realizar o procedimento foi de 90 minutos por

amostra.

O cálculo do teor de gordura nas amostras foi feito utilizando a Equação 8 e

apenas com os valores das replicatas não rejeitadas pelo teste Q com 95% de

confiança.

pipeta

oclorofórmi

V.mi

100.mf.Vgordura% =

Equação 8 : Cálculo da porcentagem de gordura. Vclorofórmio=volume de clorofórmio

utilizado para a extração da gordura (20,00 mL), Vpipeta=volume da pipeta (5,00

mL), mi=massa de amostra inicialmente pesada e mf=massa de gordura pesada

após evaporação do solvente.


46

C – QUANTIFICAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO

A equação estabelecida por Atwater (Equação 1, p.4) foi utilizada para o

cálculo do valor energético, levando em consideração os valores médios obtidos

para proteína, gordura e carboidrato.

Tabela 5 : Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão

dos parâmetros avaliados para as amostras de milho.

Amostra Umidade 1

(g/100g)

Cinzas 1

(g/100g)

Proteína 1

(g/100g)

Gordura 1

(g/100g)

Carboidrato 2

(g/100g)

Valor

Energético 2

(kcal/100g)

CO1 11,9±0,1 0,64±0,09 7,5±0,2 3,2±0,7 76,8±0,7 366±1

CO2 12,27±0,02# 0,30±0,06 5±1 1,34±0,02 81±1 356±1

CO3 11,77±0,05 4,54±0,03 6,5±0,1# 2,3±0,1 74,9±0,2 346,2±0,2

CO4 12,32±0,05 0,58±0,03 6,80±0,01 2,35±0,06 77,90±0,08 360,1±0,1

CO5 14±3 0,27±0,01 6,7±0,9 1,2±0,1 78±3 348±3

CO6 12,4±0,1 0,22±0,02 5±2 1,07±0,05 81±2 355±3

CO7 12,32±0,05 0,22±0,06 7,5±0,2 1,07±0,03 78,9±0,2 355,2±0,3

CO8 12,86±0,06 0,069±0,007 0,67±0,05 0,39±0,06 86,0±0,1 350,2±0,1

CO9 9,12±0,03 1,36±0,02 5,5±0,3 1,6±0,3 83,0±0,4 363,3±0,6

CO10 13±1 0,32±0,04 6,7±0,1 0,6±0,6 79±1 350±1

CO11 9,23±0,02# 0,368±0,004# 7,61±0,09 1,0±0,2 81,8±0,2 366,6±0,3

CO12 8±2 3,53±0,02 0,56±0,07 0,10±0,09 88±2 354±2 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%

2=valor calculado a partir dos valores médios

#=parâmetro que teve uma replicata rejeitada pelo teste Q com intervalo de confiança de 95% ou excluída

devido a erros determinados.


47


dos parâmetros avaliados para as amostras de soja.

Amostra Umidade 1

(g/100g)

Cinzas 1

(g/100g)

Proteína 1

(g/100g)

Gordura 1

(g/100g)

Carboidrato 2

(g/100g)

Valor

Energético 2

(kcal/100g)

SO1 5,2±0,4 5,15±0,08 45±2 18±2 27±3 446±4

SO2 6,50±0,08 6,07±0,02# 29,7±0,8 15±5 43±5 423±7

SO3 4,0±0,1 5,69±0,08# 25,2±0,5 22,6±0,2 42,5±0,6 474,6±0,8

SO4 8,9±0,6 8,92±0,09 25,5±0,5 0,00 56,7±0,8 328,8±0,9

SO5 6,30±0,01 6,98±0,04# 25,6±0,4 24,6±0,4 36,6±0,6 469,9±0,8

SO6 6,3±0,4 7,00±0,02 32,3±0,2 24±5 30±5 467±7

SO7 7,3±0,2 5,49±0,03 34,30±0,08 2,2±0,1# 50,8±0,2 359,9±0,2

SO8 5,55±0,04 5,2±0,1 40,4±0,2 23,6±0,4 25,3±0,5 474,9±0,7

SO9 7,16±0,08 4,71±0,01 39,8±0,2 26±1# 22±1 485±1

SO10 7,40±0,03 4,9±0,1 39,2±0,3 24,3±0,4 24,1±0,5 472,1±0,7

SO11 5,8±0,1 5,05±0,01 39,87±0,03# 22,0±0,4 27,3±0,4 466,7±0,6

SO12 9,3±0,1 3,9±0,2 13,9±0,2 4,4±0,4 68,5±0,5 368,9±0,7 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%





48

Tabela 7 : Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão dos

parâmetros avaliados para as amostras de trigo.

Amostra Umidade 1

(g/100g)

Cinzas 1

(g/100g)

Proteína 1

(g/100g)

Gordura 1

(g/100g)

Carboidrato 2

(g/100g)

Valor

Energético 2

(kcal/100g)

WH1 12,5±0,1 0,56±0,03 12,38±0,08 1,57±0,04 73,0±0,1 355,6±0,2

WH2 10,38±0,07 0,77±0,02 9,52±0,07 2,0±0,4 77,3±0,4 365,3±0,6

WH3 9,15±0,07 0,928±0,001# 11±1 2,2±0,2 77±1 371±1

WH4 11,1±0,2 1,70±0,08# 14,4±0,1 2,04±0,09# 70,8±0,3 359,2±0,3

WH5 9,69±0,2 1,3±0,1 13,5±0,1 1,4±0,3 74,1±0,4 363,1±0,5

WH6 12,92±0,09 0,509±0,006 12,9±0,1 1,24±0,07# 72,5±0,2 352,5±0,2

WH7 11,4±0,1 1,53±0,02 12,60±0,08 1,4±0,2 73,0±0,2 355,5±0,3

WH8 9,2±0,2 4,3±0,2 32,3±0,2 10,5±0,1 43,7±0,4 398,3±0,4

WH9 12,5±0,2 0,46±0,02 11,02±0,03 1,6±0,2 74,4±0,3 356,1±0,4

WH10 10,31±0,07 4,39±0,07 16,1±0,2 4,5±0,1 64,7±0,2 363,9±0,3

WH11 24±3 5,0±0,1 16,3±0,2 4,19±0,09 51±3 305 ±3

WH12 11,7±0,1 4,85±0,04 17,8±0,4 4,4±0,1 61,3±0,4 356,2±0,6 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%





49


dos parâmetros avaliados para as amostras de mandioca.

Amostra Umidade 1

(g/100g)

Cinzas 1

(g/100g)

Proteína 1

(g/100g)

Gordura 1

(g/100g)

Carboidrato 2

(g/100g)

Valor

Energético 2

(kcal/100g)

CA1 2,7±0,2# 2,6±0,3 1,7±0,1 5,9±0,1 87,1±0,4 408,7±0,4

CA2 8,04±0,07 2,3±0,1 1,5±0,3 6,0±0,8 82,2±0,9 389±1

CA3 9,74±0,05 0,93±0,02 1,7±0,2 0,6±0,2 87,0±0,3 360,6±0,4

CA4 7,8±0,8 0,98±0,01 1,6±0,1 0,9±0,6 89±1 371±1

CA5 11±3 0,86±0,04 1,1±0,3 0,61±0,08 86±3 355±3

CA6 11,3±0,1 0,05±0,02 0,1±0,1 0,22±0,01 88,4±0,1 355,8±0,2

CA7 12,93±0,04 0,07±0,06 0,36±0,03 0,04±0,02 86,61±0,08 348,23±0,09

CA8 18±2 0,6±0,5 1,1±0,1 0,48±0,01 80±2 328±2

CA9 12,09±0,01# 0,12±0,07 0,4±0,3 0,11±0,01 87,3±0,3 351,7±0,4

CA10 13,07±0,04 0,25±0,01 0,3±0,3 0,02±0,02 86,4±0,3 346,8±0,4

CA11 10,02±0,02 0,9±0,1 1,04±0,06 0,52±0,04 87,5±0,1 358,7±0,1

CA12 6,82±0,03 0,7±0,1 1,3±0,1 0,42±0,07 90,7±0,2 372,1±0,2 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%





50


dos parâmetros avaliados para as amostras de leite.

Amostra Umidade 1

(g/100g)

Cinzas 1

(g/100g)

Proteína 1

(g/100g)

Gordura 1

(g/100g)

Carboidrato 2

(g/100g)

Valor

Energético 2

(kcal/100g)

MI1 4,3±0,1 1,360±0,006 8,78±0,09# 1,7±0,8 83,9±0,8 386±1

MI2 3,71±0,06 2,04±0,02 12,5±0,1 6,2±0,2 75,6±0,2 408,2±0,3

MI3 5,12±0,02 1,552±0,008 11,8±0,2 3,97±0,05 77,6±0,2 393,2±0,3

MI4 3,9±0,1 0,73±0,03 6,1±0,2 1,7±0,1 88,2±0,3 386,7±0,3

MI5 5,82±0,08 2,15±0,09 14,3±0,4 2,5±0,6 75,2±0,7 381±1

MI6 7,9±0,2 2,08±0,07 12,7±0,3 2,7±0,3 74,6±0,5 373,9±0,6

MI7 8,6±0,3 4,7±0,1 13,0±0,2 1,9±0,1# 71,7±0,4 356,1±0,5 1=valores médios das replicatas não excluídas pelo teste Q com intervalo de confiança de 95%




A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) é o órgão brasileiro

que, entre outras funções, é responsável por “promover a proteção da saúde da

população por intermédio do controle sanitário da produção e da comercialização

de produtos e serviços submetidos à vigilância sanitária, inclusive dos ambientes,

dos processos, dos insumos e das tecnologias a eles relacionados” (ANVISA,

2008). É a ANVISA, portanto, que estabelece a legislação relacionada à

elaboração dos rótulos dos alimentos embalados, além de fiscalizar o

cumprimento da mesma.

Conforme a resolução RDC 360, da portaria 42, de 23 de dezembro de

2003 (ANVISA, 2008), aos valores de nutrientes declarados no rótulo há uma

tolerância de 20%.

Como curiosidade, foram comparados os valores obtidos para valor

energético, carboidrato e proteína pelos métodos convencionais e apresentados


51

na Tabela 5 com os valores fornecidos pelos fabricantes. Esta comparação

permitiu verificar que 42 das 55 amostras analisadas (76%) apresentaram pelo

menos uma das informações fora da tolerância da ANVISA, ou seja, com erros

superiores a 20%. Isso deve refletir a pouca fiscalização que se tem feito nos

rótulos dos alimentos comercializados no país. Possivelmente, a fiscalização seja

feita em cima de como o rótulo é apresentado, e não na fidedignidade dos valores.

IV. 2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X

Os espectros de fluorescência de raios X obtidos para as amostras

estudadas estão apresentados na Figura 6.

Figura 6 : Espectros médios sobrepostos das amostras estudadas e ampliação da região de espalhamento.

Observando os espectros sobrepostos, não é possível distinguir ou agrupar

as amostras conforme suas características. Ou seja, usando um método

0 5 10 15 20 25 30 35 400.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

18 19 20 21 22 23 240,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Inte

nsi

da

de

(cp

s/µµ µµA

)

Energia (keV)

Rh kβ (Rayleigh)

Rh kβ (Compton)

Rh kα (Rayleigh)

Inte

nsid

ade

(cps

/µµ µµA

)

Energia (keV)

Rh kα (Compton)LeiteTrigoMilhoSojaMandioca


52

univariado, não é possível verificar se o conjunto amostral apresenta alguma

separação.

Os espectros de raios X obtidos para as diferentes amostras (Figura 6)

foram então tratados com a ferramenta quimiométrica PCA.

O ponto de partida para todas as análises multivariadas é uma matriz de

dados (tabela de dados) chamada de X, com n linhas, denominadas de objetos e p

colunas, que compreendem as medidas ou propriedades relacionadas aos

objetos.

A PCA é uma ferramenta multivariada e, quando aplicada a X, promove a

compressão dos dados originais para um novo sistema de eixos, proporcionando a

representação das variáveis altamente correlacionadas de uma maneira mais

simples, usando apenas um eixo, chamado de componente principal.

Para todos os tratamentos quimiométricos realizados, nenhuma

transformação foi aplicada aos espectros. Paralelamente, o pré-processamento

utilizado consistiu em centrar os dados na média.

Os gráficos da análise de componentes principais (PCA) permitiram

identificar uma separação do conjunto amostral em dois grupos principais:

amostras de soja e as demais amostras. Esta separação foi explicada pelas

componentes principais 1 e 2 (PC1 e PC2) e pode ser vista na Figura 7A (scores).

No gráfico de scores (Figura 7B) entre as PCs 2 e 4 (que explicaram juntas 5,1%

da variância), foi possível verificar uma tendência das amostras de milho se

separarem das demais, assim como as amostras de soja.

O gráfico de loadings (Figura 8) permite identificar quais as variáveis (faixa

espectral) contribuíram para a formação das componentes principais e,

consequentemente, para a separação observada.


53

0 5 10 15 20 25 30 35 40-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4 PC1 (90,4%) PC2 (4,2%) PC4 (0,9%)

Load

ings

Energia (keV)

Figura 7 : Gráficos de scores para o conjunto de todas as amostras, obtidos para PC1 x PC2 (A) e para PC2 x PC4 (B).

Figura 8 : Gráficos de loadings obtidos para PC1, PC2 e PC4 para o conjunto de todas as amostras.

No gráfico de scores (Figura 7A), observa-se que as amostras de soja

apresentam valores positivos na PC2. Os elevados valores na região de energia

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6 Leite TrigoMilho Soja Mandioca

PC

2 (4

,2%

)

PC1 (90,4%)

A

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

Leite Trigo Milho Soja Mandioca

PC

4 (0

,9%

)PC2 (4,2%)

B


54

entre 3,3 e 3,7 keV observados para esta PC na Figura 8 permitem afirmar que o

alto teor de potássio e ou cálcio das amostras de soja foi o principal fator para a

separação das amostras de soja do conjunto amostral.

Paralelamente, as regiões de espalhamento de raios X (faixa ao redor de

19,2 keV) também contribuíram para a separação das amostras de soja. Como

esta região está associada à parte orgânica da amostra, provavelmente ela seja

reflexo de uma característica marcante da soja: o teor de gordura.

Já no caso das demais amostras, o método não apresentou especificidade,

talvez por serem todas as amostras derivadas de vegetais. Para confirmar esta

hipótese, uma nova PCA foi aplicada ao conjunto de amostras, porém, desta vez,

as amostras derivadas da soja foram excluídas (Figura 9).

-3 -2 -1 0 1 2

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3 Leite Trigo Milho Mandioca

PC

2 (1

,6%

)

PC1 (92,2%)

Figura 9 : Gráfico de scores para o conjunto das amostras na ausência do grupo

da soja, obtidos para PC1 x PC2.

Esta nova análise reforçou a tendência do conjunto originado do milho se

separar das demais amostras, porém não houve de fato discriminação das

amostras em função da origem.


55

Como apenas a classificação da soja foi conclusiva por PCA, num primeiro

momento, procurou-se obter os parâmetros de interesse para o conjunto total de

amostras.

Na aplicação do PLS, os valores utilizados como esperados foram aqueles

obtidos através dos métodos convencionais, e não os fornecidos pelos rótulos.

Isso porque, além dos fabricantes não especificarem no rótulo quais os

procedimentos utilizados para a determinação das informações fornecidas, foi

verificado o alto índice de amostras cujos valores diferiram em mais de 20%

daqueles obtidos pelos métodos convencionais apresentados anteriormente.

O modelo de calibração via PLS para o carboidrato (Figura 10) permitiu

constatar que havia outliers no conjunto. Ao excluí-los, outras amostras passaram

a ser outliers. A mesma situação foi observada para as demais variáveis

estudadas e as amostras tidas como outliers não eram necessariamente as

mesmas em uma ou outra variável.

0,00 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

MI1aMI1bMI1cMI2aMI2bMI2c

MI3aMI3bMI3c

MI4aMI4bMI4cMI5aMI5bMI5c

MI6a

MI6bMI6c

MI7aMI7bMI7c

WH1aWH1bWH1c

WH2aWH2bWH2cWH3aWH3bWH3cWH4a

WH4bWH4c

WH5aWH5bWH5cWH6aWH6bWH6c

WH7aWH7bWH7c

WH8a

WH8bWH8c

WH9aWH9bWH9c

WH10aWH10bWH10c

WH11a

WH11b

WH11c

WH12aWH12bWH12c

CO1aCO1bCO1cCO2a

CO2bCO2c

CO3a

CO3bCO3c

CO4aCO4bCO4cCO5a

CO5bCO5c

CO6aCO6bCO6c

CO7aCO7bCO7c

CO8aCO8bCO8c

CO9aCO9bCO9c

CO10aCO10bCO10cCO11a

CO11bCO11c

CO12aCO12bCO12cCA1aCA1b

CA1c

CA2aCA2bCA2c

CA3aCA3bCA3cCA4aCA4b

CA4cCA5aCA5bCA5cCA6aCA6bCA6c

CA7aCA7bCA7cCA8aCA8b

CA8cCA9a

CA9b

CA9cCA10aCA10bCA10c

CA11aCA11b

CA11cCA12a

CA12bCA12c

SO1aSO1bSO1cSO2aSO2bSO2cSO3a

SO3b

SO3c

SO4a

SO4bSO4c

SO5aSO5bSO5c SO6a

SO6bSO6c

SO7aSO7bSO7cSO8aSO8b

SO8c

SO9a

SO9b

SO9c

SO10a

SO10bSO10cSO11a

SO11bSO11cSO12aSO12bSO12c

Res

íduo

de

Stu

dent

Leverage

Figura 10 : Representação gráfica da relação entre Resíduo de Student e

Leverage para carboidrato, considerando o conjunto total de amostras e 5

variáveis latentes.


56

Como não foi possível realizar modelos adequados de calibração para o

conjunto envolvendo todas as amostras, e, como através da PCA foi verificado

que as amostras de soja se separaram das demais, novos modelos foram

propostos para um conjunto de todas as amostras excluindo as derivadas da soja.

Modelos com grande número de amostras tendem a ser mais robustos.

Além disso, se as amostras forem bem diferentes umas das outras, os modelos

serão mais completos, abrangendo uma diversidade de amostras. Porém, mesmo

excluindo as amostras de soja, não foi possível obter modelos de calibração e / ou

validação com valores baixos de erros, mesmo realizando seleção de variáveis.

Sendo assim, diante da impossibilidade de se constatar um agrupamento pela

PCA e dados os altos erros de calibração, para ter os seus parâmetros

quantificados, as amostras foram divididas considerando a sua origem (total de 5

grupos).

Em seguida, foram determinados os outliers de cada grupo, definido o

conjunto de amostra a ser trabalhado e as quantidades de variáveis latentes para

cada variável a ser quantificada (teor de proteína, teor de carboidrato e valor

energético). Cabe ressaltar que nos casos em que todas as replicatas de

determinada amostra foram consideradas outliers, houve uma diminuição no

número de variáveis latentes necessário para a construção do modelo, o que

confirmou que tais amostras eram de fato anômalas.

Para determinar o número de variáveis latentes, foi realizada a validação

cruzada. Uma vez que todas as amostras foram usadas como conjunto de

previsão, foi calculado o PRESS (soma do quadrado dos erros de previsão).

Excluídos os outliers, foram construídos os modelos de calibração e

validação, obtendo os valores de previsão para as amostras externas previamente

selecionadas. Tais amostras foram escolhidas aleatoriamente e correspondiam a

25% das amostras de cada grupo, ou seja, 2 amostras de leite e 3 amostras dos

demais grupos.


57

Estudos preliminares permitiram verificar que os resultados do modelo de

calibração via PLS (utilizando o espectro inteiro) apresentavam erros maiores do

que os esperados. Com o objetivo de amenizar tal situação, foi realizada seleção

de variáveis. Para a escolha destas, foram levadas em consideração as regiões

significativas (altos valores) para os vetores de regressão e de correlação, em

todos os conjuntos estudados. As regiões selecionadas foram entre 1,60-9,60 keV

e 18,00-21,00 keV (região de espalhamento da fonte de irradiação).

A – AMOSTRAS DE SOJA

O conjunto originado da soja envolvia 12 amostras diferentes, num total de

36 espectros. Foram selecionadas para serem amostras externas SO2, SO3 e

SO5, levando em consideração as 3 replicatas de cada uma.

Ao estabelecer a relação entre o Resíduo de Student e a Leverage, foi

verificado que a replicata a da amostra SO4 (SO4a) era um outlier para todas os

parâmetros (Figura 11) e, então, foi retirada do conjunto. Também foi verificado

que as replicatas a e b da amostra SO7 tiveram seus espectros sobrepostos, o

que deve significar que houve algum problema na importação dos dados gerados

pelo EDXRF para o programa quimiométrico utilizado (Pirouette®). Sendo assim, a

replicata SO7b foi retirada do conjunto.

Retiradas estas amostras, não foram mais identificados outliers para

carboidrato e valor energético. No entanto, a amostra SO12 (todas as replicatas)

passou a ser um outlier para proteína, tendo, neste caso, sido excluída do

conjunto de calibração. O conjunto final estabelecido para a construção dos

modelos de calibração para as amostras de soja englobou 9 amostras e 25

espectros para o teor de carboidrato e valor energético, e 8 amostras e 22

espectros para o teor de proteína.


58

Figura 11 : Representações gráficas da relação entre Resíduo de Student e leverage

para as amostras de soja obtidas para o teor de carboidrato antes (A) e depois (B)

da exclusão dos outliers.

Para as amostras de soja, o número de variáveis latentes considerada para

a construção dos modelos de PLS foi igual a 5.

As relações entre os valores previstos (VP) e os valores de referência (VR),

ou seja, os obtidos pelos métodos convencionais, para as variáveis analisadas

para as amostras de soja estão apresentadas na Figura 12. Também são

apresentados os valores dos coeficientes de correlação da calibração (rcal) e da

validação (rval), além das equações matemáticas relacionadas aos modelos de

calibração. Para estas relações foram considerados os valores médios das

replicatas não excluídas.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

SO1aSO1bSO1c

SO4a

SO4bSO4c

SO6aSO6bSO6c

SO7aSO7bSO7c

SO8aSO8bSO8c

SO9a

SO9b

SO9c SO10a

SO10bSO10c

SO11aSO11bSO11c

SO12aSO12bSO12c

A

Res

íduo

de

Stu

dent

Leverage

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5-3

-2

-1

0

1

2

3

SO1aSO1b

SO1c

SO4b

SO4c

SO6a

SO6bSO6c

SO7a

SO7cSO8a

SO8b

SO8c

SO9a

SO9b

SO9c

SO10a

SO10bSO10c

SO11aSO11b

SO11c

SO12aSO12bSO12c

Res

íduo

de

Stu

dent

Leverage

B


59

26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

46

rval

= 0,859

rcal

= 0,983

VP

(g/

100g

)

VR (g/100g)

VP = 3 + 0,93 VR

Proteína

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7020

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

rval

= 0,953

rcal

= 0,993

VP

(g/

100g

)VR (g/100g)

VP = 1 + 0,97 VR

Carboidrato

320 340 360 380 400 420 440 460 480 500320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

rval

= 0,928

rcal

= 0,991

VP

(kc

al/1

00g)

VR (kcal/100g)

VP = 18 + 0,96 VR

Valor Energético

Figura 12 : Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos

(VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o

conjunto de amostras de soja.

É possível verificar na equação matemática que o coeficiente linear do

modelo de calibração para o valor energético da soja é 18. Isto significa que, se o

valor de referência for zero, o modelo fará uma previsão de VE igual a

18 kcal/100g. Como, para a soja, o menor valor de referência de VE é igual a

328,8 kcal/100g (SO4, Tabela 6), este coeficiente corresponderia a um erro

embutido no resultado previsto de aproximadamente 6%. Este é praticamente o


60

erro que poderia ser considerado, uma vez que o coeficiente angular é muito

próximo a 1 (0,96).

Mais detalhes quanto aos erros dos modelos podem ser obtidos pelas

figuras de mérito apresentadas na Tabela 10.

Tabela 10 : Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as amostras

de soja, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de

proteína.

Figuras de Mérito Parâmetros

VE TC TP

SÊN 0,0015a 0,0046b 0,0137b

γγγγ 0,56c 1,72d 5,12d

γ γ γ γ -1 1,77a 0,58b 0,19b

RMSEP 22,46c 1,69d 2,83d

RMSEC 14,45c 1,03d 1,80d

LOD 5,85c 1,92d 0,64d

LOQ 17,74c 5,82d 1,95d

tBias 0,124 0,040 0,025 a(100g/kcal)

b(100g/g)

c(kcal/100g)

d(g/100g)

tTabelado = 2,04 para VE e TC e tTabelado = 2,09 para TP

Os resultados apresentados na Tabela 10 permitiram constatar que os

limites de detecção e quantificação estão abaixo dos menores valores de todos os

parâmetros, mostrando que o método proposto é adequado para a aplicação

proposta.

O teste t, por sua vez, permitiu concluir que o erro sistemático incluso em

cada um dos modelos (ruído) não é significativo e pode ser desprezado, visto que


61

o tBias calculado foi inferior ao tTabelado (com 95% de confiança), para todas as

situações envolvendo amostras de soja (Miller e Miller, 2000).

Embora num primeiro momento o valor de RMSEP para o valor energético

possa parecer alto, cabe ressaltar que ele é similar ao desvio padrão e, portanto,

sua unidade de medida é a mesma do parâmetro em questão. Então, o RMSEP

do valor energético das amostras de soja representa uma faixa de erro entre 4,6 e

6,8%, uma vez que os valores obtidos pelos métodos convencionais para esse

parâmetro variavam entre 328,8 e 485 kcal/100g. Para os teores de carboidrato e

proteína, o RMSEP corresponde a faixas de 2,5-7,7% e 6,3-11,7%,

respectivamente.

Na Tabela 11 estão apresentados os resultados obtidos no modelo de

validação externa para as amostras de soja SO2, SO3 e SO5. Os dados estão

apresentados em função das médias obtidas entre as três replicatas.

Tabela 11 : Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os

parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos

entre VR e VP para as amostras de soja.

Parâmetro Amostra VR VP Er (%)

VE

(kcal/100g)

SO2 423 390 -8

SO3 474,6 412,3 -13,1

SO5 469,9 430,1 -8,5

TP

(g/100g)

SO2 29,7 28,0 -5,7

SO3 25,2 28,3 12,3

SO5 25,6 27,4 7,0

TC

(g/100g)

SO2 43 49 14

SO3 42,5 45,2 6,4

SO5 36,6 41,2 12,6


62

É possível observar na Tabela 11 que os maiores erros obtidos na

validação externa das amostras de soja foram, em módulo, iguais a de 13,1%,

12,3% e 12,6% para valor energético, teor de proteína e teor de carboidrato,

respectivamente. Para todos os casos, estes valores foram inferiores ao máximo

permitido pela ANVISA (20%).

B. Outras amostras

A construção dos modelos de calibração e validação para os demais grupos

de amostras foi feita da mesma maneira como descrito para as amostras de soja,

no item anterior. Então, para facilitar a discussão dos dados, os resultados obtidos

para estes grupos serão apresentados na forma de Tabelas (Tabelas 12 a 20) e

gráficos (Figuras 12 a 16), nos quais devem ser consideradas as seguintes

abreviaturas: valores dos coeficientes de correlação de calibração (rcal) e de

validação (rval).

Tabela 12 : Informações sobre as amostras iniciais e selecionadas para a

construção dos modelos de calibração e validação para os grupos de milho,

mandioca, leite e trigo

Informações Conjunto

Milho Mandioca Leite Trigo

No inicial de amostras 12 12 7 12

Amostras externas

selecionadas

CO1, CO5, CO10

CA1, CA8, CA11 MI5, MI6

WH4, WH6, WH7

Replicatas anômalas

identificadas

CO6a, CO6b, CO6c

CA5a, CA5b, CA5c*

MI3a, MI3b, MI3c

WH11a, WH11b, WH11c

*Amostra CA6 não foi utilizada nos modelos para proteína, pois o valor de referência era zero. As amostras

CA10 e CA12 foram consideradas outliers apenas para proteína.


63

B.1. Amostras de Milho

Os resultados obtidos da construção dos modelos de calibração e validação

para as amostras de milho estão apresentados na Figura 13 e nas Tabelas 13 e

14.


para as variáveis analisadas para as amostras de milho estão apresentadas na

Figura 13. Também são apresentados os valores dos coeficientes de correlação

da calibração (rcal) e da validação (rval), além das equações matemáticas

relacionadas aos modelos de calibração e os respectivos valores de variáveis

latentes (LV).

Os coeficientes lineares das equações matemáticas revelam erros na

construção dos modelos de 10,1%, 6,7% e 3,6% para valor energético, teor de

carboidrato e teor de proteína, respectivamente.

Outras informações sobre os modelos de calibração multivariada construídos

para as amostras de milho podem ser verificadas pelas figuras de mérito

apresentadas na Tabela 13.


64

74 76 78 80 82 84 86 8874

76

78

80

82

84

86

88

rval

= 0,961

rcal

= 0,986

VP

(g/

100g

)

VR (g/100g)

VP = 5 + 0,94 VR

Carboidrato

LV = 4

345 348 351 354 357 360 363 366345

348

351

354

357

360

363

366

rval

= 0,714

rcal

= 0,968

VP

(kc

al/1

00g)

VR (kcal/100g)

VP = 35 + 0,90 VR

Valor Energético

LV = 4

0 1 2 3 4 5 6 7 80

1

2

3

4

5

6

7

8

LV = 5

rcal = 0,998

rval = 0,810

VP

(g/

100g

)VR (g/100g)

Proteína

VP = 0,02 + 0,99VR



conjunto de amostras de milho.


65


de milho, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de

proteína.


VE TC TP

SÊN 0,0089a 0,0207b 0,0166b

γγγγ 3,30c 7,73d 6,20d

γ γ γ γ -1 0,30a 0,13b 0,16b

RMSEP 9,34c 0,89d 0,27d

RMSEC 2,88c 0,13d 0,10d

LOD 0,99c 0,43d 0,18d

LOQ 3,02c 1,29d 0,53d

tBias 0,087 0,154 0,183 a(100g/kcal)

b(100g/g)

c(kcal/100g)

d(g/100g)

tTabelado = 2,04

Os resultados expostos na Tabela 13 permitiram verificar que os valores de

LOQ são inferiores aos valores de referência obtidos pelos métodos convencionais

(Tabela 5), para todos os parâmetros estudados. Porém, para as amostras com

valores de TP < 1 g/100g (CO8 e CO12), os erros dos valores previstos são altos

(> 40%). Possivelmente, este erro poderia ser reduzido se houvesse mais

amostras no modelo com baixa quantidade de proteína.

Em todos os casos, o tBias foi menor do que o tTabelado (2,04), o que significa

que o ruído não foi significativo em nenhum modelo construído, com 95% de

confiança (Miller e Miller, 2000).

Os valores previstos para amostras selecionadas para validação externa

estão apresentados na Tabela 14


66



entre VR e VP para as amostras de milho.


VE

(kcal/100g)

CO1 366 367 0,3

CO5 348 347 -0,3

CO10 350 350 0

TP

(g/100g)

CO1 7,5 7,4 -1,3

CO5 6,7 6,7 0

CO10 6,7 6,9 3,0

TC

(g/100g)

CO1 76,8 77,7 1,2

CO5 78 77 -1

CO10 79 79 0

Para todos os valores previstos pela validação externa das amostras de

milho, os erros foram inferiores a 20%, obedecendo à legislação brasileira vigente.

B.2. Amostras de Mandioca

Os resultados obtidos após a construção dos modelos de calibração e

validação para as amostras de mandioca estão apresentados na Figura 14 e nas

Tabelas 15 e 16. Na construção dos modelos de proteína, foi excluída a amostra

CA6, pois esta não apresentava este macronutriente. Também foram excluídas as

amostras CA10 e CA12, consideradas outliers.


para as variáveis analisadas para as amostras estão apresentadas na Figura 14.


67

345 350 355 360 365 370 375 380 385 390345

350

355

360

365

370

375

380

385

390

rval

= 0,817r

cal= 0,949

VP

(kc

al/1

00g)

VR (kcal/100g)

VP = 39 + 0,89 VR

Valor Energético

LV = 3

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,80,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

rval

= 0,989r

cal= 0,992

VP

(g/

100g

)VR (g/100g)

VP = 0,06 + 0,94 VR

Proteína

LV = 3

82 83 84 85 86 87 88 89 90 9182

83

84

85

86

87

88

89

90

91

rval

= 0,819r

cal= 0,999

VP

(g/

100g

)

VR (g/100g)

VP = 1 + 0,99 VR

Carboidrato

LV = 4



conjunto de amostras de mandioca.

Os valores das figuras de mérito para cada modelo de calibração

multivariada construído para as amostras de mandioca estão exibidos na Tabela

15. Na Tabela 16 estão expostos os valores previstos para as amostras externas.


68


de mandioca, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor

de proteína


VE TC TP

SÊN 0,0049a 0,0426b 0,1490b

γγγγ 1,82c 15,9d 55,4d

γ γ γ γ -1 0,55a 0,06b 0,02b

RMSEP 13,24c 2,84d 0,22d

RMSEC 4,43c 1,17d 0,08d

LOD 1,81c 0,21d 0,06d

LOQ 5,48c 0,63d 0,18d

tBias 0,220 0,219 0,111 a(100g/kcal)

b(100g/g)

c(kcal/100g)

d(g/100g)

tTabelado = 2,04 para VE e TC e tTabelado = 2,14 para TP

Os resultados expostos na Tabela 15 permitiram verificar que os valores de

LOQ são inferiores aos valores de referência obtidos pelos métodos convencionais

para as amostras utilizadas na construção do modelo. Porém, para amostras com

TP < 1 g/100g, os erros envolvidos na validação são altos, requerendo maior

variedade de amostras no modelo de calibração.

Não foram verificados erros sistemáticos significativos nos modelos

envolvendo as amostras de mandioca, uma vez que em todos os casos o valor do

t calculado (tBias) foi inferior ao tabelado (tTabelado).


69



entre VR e VP para as amostras de mandioca.


VE

(kcal/100g)

CA1 408,7 363,9 -11,0

CA8 328 365 11

CA11 358,7 375,4 4,7

TP

(g/100g)

CA1 1,7 1,7 0

CA8 1,1 1,2 9,1

CA11 1,04 0,91 -12,50

TC

(g/100g)

CA1 87,1 88,4 1,5

CA8 80 89 11

CA11 87,5 90,6 3,5

Como a seleção das amostras externas foi feita ao acaso (aleatoriamente),

as amostras selecionadas poderiam apresentar valores de referência fora da faixa

utilizada na validação interna. A amostra CA1, por exemplo, apresentava valor

energético maior do que as amostras da validação interna e a amostra CA8

apresentava teor de carboidrato inferior a todas as amostras de mandioca.

Os maiores erros obtidos na validação externa das amostras de mandioca

foram, em módulo, iguais a 11% para valor energético, 12,50% para teor de

proteína e 11% para teor de carboidrato. Embora, em todos os casos, os erros

tenham sido inferiores aos 20% permitidos pela ANVISA, provavelmente o uso de

outras amostras para validação externa proporcionaria erros menores aos obtidos.


70

6 7 8 9 10 11 12 13

6

7

8

9

10

11

12

13

rval

= 0,994r

cal= 0,997

VP

(g/

100g

)

VR (g/100g)

VP = 0,4 + 0,96 VR

Proteína

LV = 2

360 370 380 390 400 410

360

370

380

390

400

410

rval

= 0,991r

cal= 0,999

VP

(kc

al/1

00g)

VR (kcal/100g)

VP = 1 + 0,99 VR

Valor Energético

LV = 4

72 74 76 78 80 82 84 86 88

72

74

76

78

80

82

84

86

88

rval

= 0,996r

cal= 0,999

VP

(g/

100g

)

VR (g/100g)

VP = 1 + 0,98 VR

Carboidrato

LV = 2

B.3. Amostras de Leite


para as amostras de leite estão apresentados na Figura 15 e nas Tabelas 17 e 18.

Na construção dos modelos, foram excluídas todas as replicatas da amostra MI3,

identificadas como anômalas (Tabela 12).



conjunto de amostras de leite.


71


de leite, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de

proteína.


VE TC TP

SÊN 0,0075a 0,0241b 0,0564b

γγγγ 2,80c 8,97d 21,01d

γγγγ -1 0,36a 0,11b 0,05b

RMSEP 9,48c 1,34d 0,85d

RMSEC 5,46c 0,83d 0,49d

LOD 1,17c 0,37d 0,16d

LOQ 3,57c 1,11d 0,48d

tBias 0,221 0,125 0,018 a(100g/kcal)

b(100g/g)

c(kcal/100g)

d(g/100g)

Os limites de quantificação encontrados para os modelos envolvendo

amostras de leite foram menores do que os valores obtidos pelos métodos

convencionais. Os valores de tBias também foram menores do que os ttabelados,

confirmando mais uma vez que o ruído não é significativo para nenhum dos

modelos.

As faixas de erros envolvendo os valores previstos pela validação interna

para as amostras de leite foram de 2,3 a 2,7% para VE; 1,5 a 1,9% para TC e 5,9

a 13,9% para TP.

Na Tabela 18 estão apresentados os valores obtidos na validação externa

para as amostras previamente selecionadas de maneira aleatória.


72



entre VR e VP para as amostras de leite.


VE

(kcal/100g)

MI5 381 407 7

MI6 373,9 416 11,3

TP

(g/100g)

MI5 14,3 13,8 -3,5

MI6 12,7 14,2 11,8

TC

(g/100g)

MI5 75,2 72,5 -3,6

MI6 74,6 72,0 -3,5

Para todos os parâmetros analisados (valor energético e teores de

carboidrato e proteína), os erros entre os valores previstos pela validação externa

e os de referência, obtidos pelos métodos convencionais, foram inferiores aos

20% aceitáveis pela legislação vigente.

Para a construção dos modelos de validação interna foram utilizadas

apenas 4 amostras de leite (12 espectros), uma vez que as replicatas da amostra

MI3 foram consideradas outliers e as amostras MI5 e MI6 foram usadas na

validação externa. Sendo assim, a inclusão de novas amostras aos modelos

poderá proporcionar resultados mais precisos e exatos.


73

355 360 365 370 375 380 385 390 395 400

355

360

365

370

375

380

385

390

395

400

rval

= 0,976r

cal= 0,997

VP

(kc

al/1

00g)

VR (kcal/100g)

VP = 4+ 0,99 VR

Valor Energético

LV = 4

8 12 16 20 24 28 328

12

16

20

24

28

32

rval

= 0,969r

cal= 0,998V

P (

g/10

0g)

VR (g/100g)

VP = 0,1 + 0,99 VR

Proteína

LV = 4

42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 7842

45

48

51

54

57

60

63

66

69

72

75

78

rval

= 0,971r

cal= 0,993

VP

(g/

100g

)

VR (g/100g)

VP = 1 + 0,98 VR

Carboidrato

LV = 3

B.4 Amostras de Trigo


para as amostras de trigo estão apresentados na Figura 16 e nas Tabelas 19 e 20.



conjunto de amostras de trigo.

Para todos os modelos propostos para as amostras de trigo, o número de

variáveis latentes foi igual a 4 (valor energético e teor de proteína) ou 3 (teor de

carboidrato). Quanto menor o número de variáveis latentes, mais simples é o

modelo estabelecido.


74

Em todos os casos, os coeficientes lineares das equações matemáticas que

correlacionam o valor de referência com o valor previsto na calibração foram

maiores do que 0,9. Já os coeficientes angulares das equações foram

percentualmente baixos em relação aos valores de referência, o que confirma que

os modelos são adequados.

Outras informações sobre os modelos estão apresentados na Tabela 19,

através das figuras de mérito dos mesmos.


de trigo, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de

proteína.


VE TC TP

SÊN 0,0099a 0,0116b 0,0164b

γγγγ 3,70c 4,31d 6,09d

γ γ γ γ -1 0,27a 0,23b 0,16b

RMSEP 6,85c 4,58d 1,79d

RMSEC 2,43c 1,42d 0,55d

LOD 0,89c 0,77d 0,34d

LOQ 2,70c 2,32d 1,64d

tBias 0,130 0,184 0,195 a(100g/kcal)

b(100g/g)

c(kcal/100g)

d(g/100g)

tTabelado = 2,04

Para todos os parâmetros, os limites de quantificação obtidos para os

modelos foram inferiores aos valores determinados pelos métodos convencionais.

Em todos os casos o tBias foi menor do que o tTabelado, o que significa que o

ruído não foi significativo.


75

Para as amostras selecionadas aleatoriamente para serem externas, os

valores previstos estão apresentados na Tabela 20.



entre VR e VP para as amostras de trigo.


VE

(kcal/100g)

WH4 359,2 364,2 1,4

WH6 352,5 366,2 3,9

WH7 355,5 362,7 2,0

TP

(g/100g)

WH4 14,4 13,8 -4,2

WH6 12,9 12,0 -7,0

WH7 12,60 13,30 5,56

TC

(g/100g)

WH4 70,8 70,2 -0,9

WH6 72,5 73,7 1,7

WH7 73,0 71,8 -1,6

O maior erro obtido pela previsão externa das amostras de trigo foi de

|7,0%|, o que permite afirmar que os valores previstos se enquadram dentro do

exigido atualmente pela ANVISA.

Para todas as classes de alimentos, foi possível realizar validação externa

das amostras com baixos erros de previsão, tornando o método proposto (aliança

entre FRX e calibração multivariada) adequado para quantificação de VE, TC e TP

de amostras derivadas de vegetais.

Os erros de previsão obtidos para as amostras externas foram inferiores ao

permitido atualmente (20%) pela ANVISA, o que faz do método proposto uma


76

alternativa aos métodos convencionais para a quantificação do valor energético e

teores de proteína e carboidrato.

A inclusão de novas amostras aos modelos propostos deve favorecer a

previsão de amostras com parâmetros (VE, TC e TP) maiores ou menores aos

utilizados neste trabalho. Criar modelos de calibração com faixas mais amplas dos

parâmetros de interesse expandiria a aplicação da proposta.

IV. 2. 1. FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X – RELAÇÃO CUSTO-

BENEFÍCIO

Após constatar que o desempenho analítico (erro das medidas) permite que

o método proposto seja utilizado para obter valor energético e teores de

carboidrato e proteína, conforme legislação vigente, foi feito um estudo

relacionando custo, tempo para as análises e resíduo líquido gerado.

Este estudo envolveu uma estimativa do custo para realizar os métodos

convencionais e o proposto na quantificação dos parâmetros de interesse deste

trabalho, por replicata (Tabela 21). Esta estimativa foi baseada nos menores

preços de reagentes e equipamentos obtidos em cotações com 3 empresas

especializadas, não sendo computados os gastos com vidraria e cadinhos, por

serem estes instrumentos comumente encontrados em laboratório de pesquisa,

desenvolvimento e controle de qualidade. Também não foi incluído o custo com

água destilada e nitrogênio líquido, que é utilizado no equipamento de EDXRF

para resfriamento do detector.

Para a estimativa do tempo, levou-se em consideração desde o preparo das

amostras e soluções até a obtenção final dos dados. Neste caso, porém, não foi

computado o tempo destinado para cálculos.


77

Tabela 21 : Estimativa do custo e do tempo necessários para a obtenção dos

parâmetros estudados pelos métodos convencionais e proposto e da quantidade de

resíduo líquido gerado pelos métodos.

Parâmetro Custo (R$) Tempo (min) Resíduo Líquido Gerado (mL)

Convencionais Proposto Convencionais Proposto Convencionais Proposto

VE 12.100,00 79.000,00 1580 2 175 0

TP 7.050,00 79.000,00 270 2 115 0

TC 12.100,00 79.000,00 1580 2 175 0

Na Tabela 21 é possível verificar que o custo das análises, em termos de

reagentes e equipamentos, é maior para o método proposto para todos os

parâmetros analisados. Em todos os casos, o custo maior das análises provém

dos equipamentos (principalmente o destilador Kjeldahl para os métodos

convencionais e o EDXRF para o método proposto), sendo o valor referente aos

reagentes torna-se significante apenas para situações envolvendo análise de

muitas amostras. Como a aquisição dos equipamentos se dá apenas uma vez, as

análises subsequentes são mais baratas.

Sendo assim, o que faz com que haja esta diferença nos custos das

análises entre os métodos convencionais e proposto é o EDXRF, cujo custo

aproximado é de US$ 35.000,00 (R$ 79.000,00). A aplicação deste equipamento,

no entanto, é muito vasta - como descrita na introdução deste trabalho - ao

contrário do destilador Kjeldahl, que é usado apenas para quantificar proteínas.

Paralelamente, a quantidade de resíduos gerados pelos métodos

convencionais é maior e seu tratamento envolve um custo a ser levado em

consideração, além de problemas ecológicos.

Quanto ao tempo das análises, é possível verificar pela Tabela 21 que o

método proposto é muito mais rápido, fato de grande interesse para os

laboratórios de rotina de uma maneira geral.


78

Cabe ressaltar que a técnica de fluorescência de raios X permite realizar

quantificações do conteúdo inorgânico das amostras analisadas, informações que

também são exigidas na rotulagem dos alimentos, ampliando as vantagens da

aplicação do método proposto em laboratórios de rotina.

CONCLUSÃO

79

VV –– CCOONNCCLLUUSSÃÃOO

“Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz somente até onde os outros

foram” (Alexandre Graham Bell)

CONCLUSÃO

81

V. 1. CONCLUSÃO

Os resultados permitiram verificar a potencialidade da aplicação da técnica

de Fluorescência de Raios X aliada à Quimiometria para se determinar o valor

energético e os teores de carboidratos e proteínas em amostras de extratos e

farinhas de vegetais para consumo humano.

O tempo reduzido de análise e a não necessidade de uso de solventes

tornam o método proposto uma alternativa a ser considerada em substituição aos

métodos convencionais de análise empregados atualmente, principalmente em

laboratórios industriais e de rotina. Além disso, os erros de previsão externa foram

inferiores ao exigido atualmente (20%) pela Agência Nacional de Vigilância

Sanitária, o que reforça a aplicação da proposta.

Cabe ressaltar, porém, que o método depende da matriz das amostras e,

portanto, houve necessidade de separá-las em função da origem. Outro aspecto a

ser considerado é a baixa sensibilidade do método, uma vez que amostras com

valores nulos ou próximos de zero não podem ser modeladas para o respectivo

parâmetro. Em relação a este último aspecto, um novo modelo construído com um

número maior de amostras com estas características (valores baixos dos

parâmetros) deve amenizar esta deficiência.

PERSPECTIVAS

83

VVII –– PPEERRSSPPEECCTTIIVVAASS

“Não importa o tamanho do circo, mas a graça do palhaço” (José Augusto da Col)

PERSPECTIVAS

85

VI. 1. PERSPECTIVAS

Como perspectivas para a continuação do trabalho, podem ser construídos

novos modelo de calibração envolvendo mais amostras de farinhas de mandioca e

de milho com baixos teores de proteína. Também poderia ser verificada a

possibilidade de calibração e validação de outros parâmetros, como fibra alimentar

e gorduras, relacionados às amostras estudadas.

Além disso, os espectros de FRX podem ser fonte de outras informações

exigidas nos rótulos dos alimentos, como teores de cálcio, ferro, sódio, etc.

Os resultados promissores permitem supor que o método proposto possa

ser estendido para outros tipos de alimentos. Este fato está sendo comprovado

através de outros trabalhos realizados por integrantes do GERX sobre a

orientação da professora Maria Izabel M. S. Bueno, além de um trabalho de pós-

doc em desenvolvimento com apoio financeiro do CNPq.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

87

VVIIII –– RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS


89

VII. 1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Juliana Terra - Tese de Doutoradobiq.iqm.unicamp.br/arquivos/teses/000449441.pdf · v Aos meus pais, Milton e Vera, e aos meus irmãos (Pedrinho e Juninho), por todo amor, força