Jurnal Kromatografi A, 1217 (2010) 1963-1970Isi tersedia di daftar ScienceDirectJurnal Kromatografi Ajurnal homepage: www.elsevier.com / mencari / kromaPenilaian kuantitatif kerusakan kelembaban untuk mutu biji kakao menggunakandua dimensi kromatografi gas dikombinasikan dengan waktu-of-penerbangan massaspektrometri dan kemometrikaElizabeth M. Humstonsebuah, Joshua D. Knowlesb, Andrew McSheac, Robert E. Synoveca   *, sebuahDepartemen Kimia, Box 351700, University of Washington, Seattle, WA 98195, USAbSekolah Ilmu Komputer, Manchester Biocentre Interdisipliner, The University of Manchester, Manchester M1 7ND, InggriscTheo Chocolate R & D, 3400 Phinney Avenue North, Seattle, WA 98103, USAarticleinfoPasal sejarah:Diterima 24 Oktober 2009Diterima dalam bentuk direvisi 19 Januari 2010Yang diterima 22 Januari 2010Tersedia online 29 Januari 2010Kata kunci:GC × GC-TOFMSKemometrikaCoklatKontrol kualitasCoklatKeamanan panganabstrakPengendalian mutu biji kakao adalah masalah yang signifikan dalam industri coklat.Dalam laporan ini, kami menjelaskanbagaimana kelembaban kerusakan kakao biji mengubah tanda tangan kimia yang mudah menguap dari biji dengan cara yang dapat

dilacak secara kuantitatif dari waktu ke waktu. Tanda tangan kimia dari kacang dipantau melalui samplingruang atas dari uap di atas sampel kacang diberikan. Headspace uap sampel dengan padat-fase mikro-ekstraksi (SPME) dideteksi dan dianalisis dengan komprehensif dua dimensi kromatografi gasdikombinasikan dengan waktu-of-flight spektrometri massa (GC × GC-TOFMS).Kakao kacang dari enam geografisasal (Kosta Rika, Ghana, Pantai Gading, Venezuela, Ekuador, dan Panama) dianalisis. Dua puluh sembilananalit bahwa perubahan dalam tingkat konsentrasi melalui proses kerusakan tergantung waktu embun yangdiukur dengan menggunakan perangkat lunak chemometric. Biomarker analit yang independen dari geografis ori-gin ditemukan. Selanjutnya, algoritma prediksi digunakan untuk menunjukkan bahwa kerusakan kelembabandapat diverifikasi sebelum ada tanda-tanda cetakan dengan menganalisis subset dari 29 analit. Dengan demikian,kuantitatif pendekatan untuk skrining kualitas yang berkaitan dengan identifikasi kerusakan kelembaban di absencetakan terlihat disajikan.© 2010 Elsevier BV All rights reserved.1. PengenalanPengendalian mutu dan keamanan pangan kekhawatiran penting makananprodusen, pemerintah dan konsumen yang terutamamendapat perhatian dengan sejumlah wabah penyakit yang ditularkan melalui makanan ditahun terakhir. Karena pengolahan kakao dalam kacang-manufakturing, termasuk perlakuan panas dan penghapusan kelembaban berlebih,penyakit yang ditularkan melalui makanan dari produk cokelat relatif kurangmungkin, tetapi industri kakao, permen dan coklat masih menghadapisama tantangan untuk memastikan bahwa bahan baku, termasuk kakaokacang-kacangan, berkualitas tinggi dan aman. Biji kakao secara spontanfermentasi biji, dan dengan demikian tunduk pada tingkat tinggi variabilitastergantung pada kondisi pertumbuhan, genetika, pascapanen fermenta-tion dan pengeringan biji kakao sebelum pengiriman atau penanganan.Keragaman ini dapat memiliki dampak besar pada coklat jadiproduk, sehingga sangat penting untuk dapat menentukan apakah kacang prop-Erly fermentasi, berkualitas tinggi, dan kurang cacat. Selain ituuntuk mencoba untuk membedakan biji yang difermentasi dengan benar dan memelihara

bahan baku kualitas tinggi, ada juga keamanan pangan con-* Sesuai penulis. Telp: +1 206 685 2328 dan fax: +1 206 685 8665..E-mail: synovec@chem.washington.edu (RE Synovec).utama adalah Google Earth. Ada potensi untuk berbagai kerusakan kelembaban terkaitproses kimia yang terjadi karena kelembaban tinggi, dll, yang dapatmengakibatkan kolonisasi jamur dan / atau pertumbuhan mikroba selama penyimpan-usia dan transportasi, atau dimasukkannya tidak disengaja dari kimia lainnyaperubahan (atau adulterants) untuk bahan baku itu sendiri. SementaraKehadiran produk degradasi kimia karena kadar air bendungan-usia tidak selalu menunjukkan produk yang tidak aman [1], sering dapatmemperkenalkan menyenangkan off-rasa dalam produk coklat jadi.Dengan demikian, kerusakan kelembaban biji kakao adalah baik keselamatan makanan dankontrol kualitas perhatian untuk industri ini.Saat ini kontrol kualitas metodologi yang digunakan untuk pemantauankakao sangat subjektif dan terbatas dalam kemampuannya untuk mengukur kacangkualitas. Biasanya, sebuah "cut-test" dilakukan pada 50-100 (atau lebih)perwakilan kacang. Kacang dipotong menjadi setengah untuk mengekspos inti untukpemeriksaan sehingga warna, yang merupakan indikator negarafermentasi, dapat diamati. Selain itu, sampel kecilkacang sering dipanggang dan digiling untuk uji rasa. Meskipun cut-hasil tes umumnya direproduksi dengan margin yang signifikankesalahan, hasil tes rasa jauh lebih sulit untuk menyetujuidan berkomunikasi. Mengingat bahwa metode ini adalah negara saat iniof-the-art, metodologi yang lebih handal dan kuantitatif akansangat berguna dalam industri ini. Secara khusus, metode untuk memastikanmunculnya kemungkinan dan kehadiran produk kimia karena0021-9673 / $ - lihat hal depan © 2010 Elsevier BV All rights reserved.DOI: 10.1016/j.chroma.2010.01.069

Halaman 21964EM Humston dkk. / J. Chromatogr. Sebuah 1217 (2010) 1963-1970kerusakan kelembaban bisa sangat berguna karena ini adalah pembusukan umummekanisme. Selain itu, metode yang juga dapat mengidentifikasi con beracuntaminants atau adulterants selama prosedur pengukuran yang samadapat meningkatkan keamanan produk.Telah diketahui bahwa rasa dan kualitas produk yang terkait eratdengan profil volatile coklat [2,3]. Dalam rangka meningkatkanproduk jadi, akan lebih berguna untuk memperoleh pemahaman tentangbagaimana senyawa dalam biji kakao mentah adalah indikasi dari kualitas yang tinggi

coklat bar. Banyak perubahan proses kimia, termasuk cetakan,juga mungkin memiliki profil yang mudah menguap yang mungkin bisa dideteksi.Karena banyak senyawa yang dilakukan berhubungan dengan bau dan rasacoklat adalah senyawa yang mudah menguap, teknik bahwa sampelruang atas di atas sampel kacang kakao secara ideal cocok untuk rutinpemantauan. Headspace padat-fase mikro-ekstraksi (HS-SPME) adalahteknik pengambilan sampel yang mengisolasi com-volatile dan semi-volatilepon dari sampel gas ruang atas dengan mengumpulkan analit keserat dilapisi [4]. Kami baru melaporkan implementasi dariteknik ini untuk biji kakao [5]   sebuah  nd juga telah menunjukkan efektivitas-tive pada coklat bubuk [6]. Metode pengambilan sampel dapat dipasangkan dengankomprehensif dua dimensi kromatografi gas digabungkan kewaktu-of-flight spektrometri massa (GC × GC-TOFMS) untuk pemisahandan deteksi dari jenis sampel kompleks (kuantitatif kimia-kal tanda tangan). Teknik analisis yang kuat memisahkankompleks sampel menjadi dua dimensi dengan menggabungkan dua kolomdengan fasa diam saling melengkapi [7-12]. KombinasiGC × GC dengan deteksi TOFMS telah berhasil memisahkandan mendeteksi berbagai jenis sampel yang kompleks [13-26].Pelaksanaan GC × GC-TOFMS metodologi berperanmengubah jenis sampel kompleks untuk data mentah yang kompleks. Chemometricteknik penting untuk penggalian informasi yang berguna daridata yang kompleks [27]. Salah satu tujuan bersama, dalam hipotesis didorong studiseperti ini, adalah untuk mengidentifikasi fitur (misalnya, analit) yang menawarkan kimia-kal selektivitas untuk percaya diri membedakan jenis sampel. Seperti satupendekatan untuk mengidentifikasi analit yang menarik adalah Rasio Fisher(F-Ratio) algoritma [23]. Algoritma ini menemukan kelas-jenis dibedakanguishing senyawa, dengan adanya variasi biologis, yangmenjadi fokus untuk penyelidikan lebih lanjut. Paralel Faktor analisisis (PARAFAC) adalah algoritma chemometric yang dapat digunakanuntuk secara matematis menyelesaikan analit (s) dari bunga dari latar belakangkebisingan dan interferensi tumpang tindih (senyawa lain) sehingga pro-masi informasi kuantitatif [28-31]. perbandingan lebih lanjut darisampel dapat dibuat dengan menggunakan pengenalan pola dan regresianalisis teknik.Sebelumnya, kami telah diamati perbedaan kuantitatif dramatis dalamprofil yang mudah menguap dari biji kakao tergantung pada kerusakan kelembaban kegiatan-ing dengan kehadiran atau tidak adanya cetakan permukaan [5]. Pada saat

cetakan terlihat, bagaimanapun, suatu inspeksi visual yang sederhana akan membuatnyacukup jelas bahwa kacang telah dikompromikan tanpa perluuntuk sampling analit ruang atas. Untuk kualitas layar rutin-ing, akan lebih berguna untuk mendeteksi perubahan kuantitatif dalamanalit ruang atas yang menunjukkan kerusakan kelembaban sebelum terlihatcetakan. Seperti cetakan baik keselamatan makanan dan kepedulian pengendalian mutu,ini akan menjadi kemampuan penting. Dalam studi ini, kami memiliki mon-itored perubahan yang terjadi di ruang atas analit sebagai kacangmemburuk dari cetakan tidak terlihat dasarnya cetakan permukaan 100%cakupan. Data waktu Kursus ini bertekad untuk biji kakaodari enam asal geografis untuk mengidentifikasi konsisten Kimia-ical perubahan yang berkaitan dengan keamanan pangan dan mutu biji yang mungkinasal independen (yaitu, independen dari berbagai kacang). Spesifiksenyawa yang berhubungan dengan asal-independen perubahan kimiapotensial dapat digunakan sebagai biomarker rutin untuk kelembaban bendungan-usia. Biji kakao dari enam asal sengaja dikenakankelembaban kerusakan dan sampel selama sekitar1 minggu. Pada dasarnya, komposisi kimia permukaan kacangkarena proses kerusakan kelembaban perubahan, dan mudah menguap dansemi volatil komponen memberikan sebuah tanda kimia yang dapatdengan mudah sampel menggunakan HS-SPME.Dengan demikian, HS-SPME digunakan dalambersama dengan GC × GC-TOFMS untuk pengumpulan data. Kelas dis-analit tinguishing terletak dengan F-Rasio analisis dan kemudiandiukur dengan PARAFAC. Hasil ini lebih jauh dibandingkandengan analisis komponen utama (PCA) dan regresi berbagaiteknik (misalnya, Kereta dan hutan acak) untuk setan-maksud menunjukkan bahwa kerusakan kelembaban dapat dideteksi sebelum cetakan terlihatpertumbuhan, maka untuk memberikan kemampuan prediksi secara tepat waktu.2. Eksperimental2.1. Persiapan sampelKakao kacang dari enam asal geografis (Kosta Rika, Ghana,Pantai Gading, Venezuela, Ekuador, dan Panama) diakuisisi olehTheo Chocolate (Seattle, WA, USA). Sampel saham biji mentahdari asal masing-masing disimpan dalam kondisi dingin dan kering diUntuk menjaga kualitas kacang sebelum menilai dampakkerusakan kelembaban, yang didefinisikan sebagai cakupan cetakan 0%. Disaring airditambahkan ke subset dari sampel saham dan kacang adalah

diperbolehkan untuk membentuk apa visual tampaknya jumlah eksternalcakupan (100% cakupan). Ini disediakan untuk referensi, stok kacangsampel pada 0% dan cakupan 100%. Definisi ini adalah kualitatifindikasi dari apa yang dapat diamati oleh mata tanpa mikroskopispembesaran (seperti dalam penilaian lapangan), sehingga tidak mewakilimikroskopis cetakan spora yang mungkin ada. Untuk setiap geografi-kal asal, 18 biji perwakilan diambil dari cakupan 0%saham sampel dan ditempatkan dalam kantong plastik sealable yang 10 mlair disaring ditambahkan. Untuk memastikan bahwa total waktu dengan ditambahkankelembaban adalah konsisten untuk setiap sampel pada saat analisis,penambahan air tercengang, 1 jam untuk setiap asal untuk kompensasi-sate untuk waktu analisis. Biji disimpan pada suhu kamardan sampel, yaitu, tiga biji perwakilan per sampel, adalah ana-lyzed dari saham cakupan 0% dan kemudian dari tas sealable untuktotal 7 titik waktu (0, 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 hari) selama kursusdari proses kelembaban kerusakan. Satu tambahan mereplikasi dari100% sampel saham cakupan (di ~ 1 bulan) juga dikumpulkan untukkacang dari asal masing-masing.2.2. Solid-fase mikro-ekstraksi (SPME)Prosedur SPME dijelaskan sebelumnya digunakan untukpenelitian [5]. Secara singkat, sebuah 65 m PDMS / DVB SPME serat (Supelco, PA, USA)berfungsi untuk preconcentrate analit ruang atas di atas kacang kakaosampel. Serat yang dikondisikan pada 250◦C selama 30 menit sebelumsetiap ekstraksi sampel. Pada waktu tertentu (0, 1, 2, 3, 4, 5, dan 6hari), tiga biji kakao dikeluarkan dari kantong sealable daritertentu asal dan dimeteraikan bersama dalam vial 15 baru SPME ml. Ituasal itu sampel dalam urutan yang sama bahwa air ditambahkan sehinggasetiap sampel kacang dianalisis pada saat total yang sama sejakair ini telah ditambahkan. Untuk persiapan sampel melalui HS-SPME,setiap sampel dipanaskan dalam penangas air sampai 60◦C selama 15 menit, setelahmana serat SPME terkena ruang atas selama 10 menit.Setelah diekstrak, kacang tidak kembali ke tas sebagaiekstraksi mengubah kacang.2.3. GC instrumen parameterParameter instrumen GC juga dipertahankan seperti sebelumnyadijelaskan [5]. Sebuah GC × GC-TOFMS terdiri dari 6890N Agilent

GC (Agilent Technologies, CA, USA) dan modulator termal (4Dupgrade, Leco, St Joseph, MI, USA) dipasangkan dengan Pegasus III TOFMS(Leco, St Joseph, MI, USA) digunakan untuk memisahkan HS-SPMEsampel analit. Serat SPME diperkenalkan ke saluran masuk GC,dipertahankan pada 250◦C dengan aliran Dia konstan 1 ml / menit, untuk

Halaman 3EM Humston dkk. / J. Chromatogr. Sebuah 1217 (2010) 1963-197019655 menit sebagai injeksi. Sebuah GC × pengaturan kolom GC non-kutub (20 mx 250 m id × 0,5 m RTX-5ms (Restek, PA, USA)) untukkutub (2 m × 180 m id × 0,2 m RTX-200ms (Restek, PA, USA))dilaksanakan. Untuk 5 menit pertama, selama injeksi, yang pertamakolom diselenggarakan pada 40◦C dan kolom kedua pada 50◦C. Keduakolom kemudian diikuti program suhu yang menggenjot produksinya padatingkat 8◦C / menit dari 40◦C hingga 140◦C untuk kolom pertama dan 50◦Csampai 150◦C untuk kolom kedua. Tingkat tersebut kemudian meningkat menjadi30◦C / menit sampai suhu akhir 250◦C untuk kolom pertama dan260◦C untuk yang kedua, dimana kolom yang tetap konstan untuk

sebuah min tambahan. Suhu modulator dipertahankan20◦C lebih tinggi dari suhu kolom satu dan dipindahkansetiap limbah 1,5 s. Garis Transfer diselenggarakan pada 280◦C danion TOFMS sumber di 250◦C. Massa saluran 40-250 m / zdikumpulkan dan disimpan dengan kecepatan 100 spektra / s. Tiga biji adalahdigabungkan bersama-sama dan dianalisis pada setiap titik waktu (7 plus tamba-cakupan nasional 100% saham sampel) untuk asal masing-masing (6 total) untuktotal 48 suntikan kromatografi. Berdasarkan penelitian kami sebelumnya[5], ulangan pada setiap titik waktu dan asal kacang tidak dianggapdiperlukan, karena akan dibahas lebih lanjut.2.4. Analisis dataData kromatografi Baku dikumpulkan menggunakan Leco Chro-maTOF perangkat lunak v 3.32 (Leco, St Joseph, MI, USA). Data yangdiekspor ke Matlab untuk Rasio Fisher (F-Ratio) perhitungan. Datadikumpulkan dari waktu 0 hari (yaitu, cakupan 0%) dan dari 100%sampel saham cakupan dari asal masing-masing digunakan sebagai duasampel kelas-jenis F-Rasio analisis [23] untuk menemukansenyawa yang atas atau bawah diatur karena Mois-struktur terburuk proses kerusakan. F-Rasio dihitung baik oleh bobotintensitas kromatografi (tertimbang) dan tanpa penurunan berating (unweighted). Pada lokasi atas diidentifikasi melalui F-Ratioanalisis, identifikasi awal analit ditentukan denganChromaTOF perangkat lunak melalui pencarian spektrum massa darikromatogram terhadap Institut Nasional Standar danTeknologi (NIST) perpustakaan. In-house dikembangkan target-analitFaktor Paralel Analisis (PARAFAC) Graphical User Interface (GUI)digunakan untuk menyelesaikan matematis profil puncak murni dan massaspektrum untuk tujuan kuantitatif [30]. Informasi kuantitatifdiperoleh di perjalanan waktu lengkap untuk semua asal-usul kacang.2.5. Interpretasi dataKomponen Analisis Dasar (PCA) bekerja sebagai Dataalat perbandingan seperti yang telah kita sebelumnya menunjukkan denganData metabolomik [19,22]. analit Setiap dimuat sebagai sampeldengan informasi waktu saja di setiap asal sebagai variabel.PCA kemudian dihitung berdasarkan preprocessing dari mean berpusat

data. Modeling software tambahan digunakan untuk regresi shabu-ods. Untuk hutan Kereta dan acak, paket perangkat lunak statistik Rdipekerjakan [32]. Implementasi standar di WEKA ver-sion 3.5.7 [33] diterapkan untuk semua metode regresi lainnya.Untuk Kereta, perpustakaan rpart [34] digunakan dan, mengikuti standar-dard prosedur, parameter kompleksitas cp = 0,05 dipilih.Untuk hutan acak, perpustakaan hutan acak [35]   w  seperti yang digunakan, danmodel dengan default dari 500 pohon dilatih. 10 kali lipat cross-validasi [36] untuk kedua metode ini diberi kode di-rumah danHasil mean dan deviasi standar dari mengulangiseluruh validasi 10 kali dilaporkan di sini. Untuk metode menjalankandi WEKA, default pengaturan parameter yang digunakan dalam semua kasus, kecualiuntuk Jaringan Dasar Fungsi Radial. Untuk itu model, delapan dasarfungsi dipilih (bukan default dua), satu untuk mewakili-dikirim setiap titik waktu data. WEKA melakukan 10 kali lipat cross-validasisebagai metode standar pengujian. Koefisien determinasi (R2nilai) adalah ukuran fraksi variasi dalam tergantungGambar. 1. Gambar ini menunjukkan kacang pada berbagai tahap kerusakan kelembaban, tampakditunjukkan oleh jamur, dari 0 hari sampai cakupan 100%.variabel yang dijelaskan oleh model [37]. Dalam semua kasus di sini,dihitung sebagai kuadrat dari koefisien korelasi Pearsonantara prediksi model dan sebenarnya diprediksivariabel nilai.3. Hasil dan diskusiKacang dari asal geografis yang diteliti: CostaRika, Ghana, Pantai Gading, Venezuela, Panama, dan Ekuador. Kacangsampel dan dimonitor 7 kali selama kira-kira 1 minggu (0 hari sampai 6 hari dengan interval 1-hari), serta satutambahan pengukuran dari sampel saham dibentuk di ~ 1 bulankerusakan kelembaban (yaitu, cakupan 100%) untuk total 8 titik datadi perjalanan waktu proses kelembaban kerusakan untuk masing-masing asalkelas. Sekali lagi, ekspresi dari kerusakan kelembaban adalah visual-terwujud dengan munculnya cetakan, sementara kurang terlihat kimia lainnyaproses degradasi juga terjadi. Ada beberapa variabel-kemampuan dalam penampilan dan laju pertumbuhan jamur, tetapi semua kacangmencapai apa yang tampak cakupan 100% pada akhir dari 6 -hari periode. Kacang tidak mengkonversi dari tidak adanya cetakan terlihatuntuk cakupan 100% dari 1 hari ke yang berikutnya. Sebaliknya, cetakan muncul ditempat lokal dan secara bertahap tumbuh untuk menutupi seluruh kacang. Gambar. 1

menggambarkan sebuah rekreasi dari proses kerusakan kelembaban melalui cetakanekspresi. Seperti ada variabilitas beberapa, yang paling perwakilankacang tive itu sampel pada setiap titik waktu. Kami memiliki sebelumnyadiamati hanya kecil kacang-ke-kacang variabilitas untuk asal diberikan [5].Kami mengevaluasi reproduktifitas dari ekstraksi dan injeksi5 biji terpisah dari asal yang sama untuk 8 sampel (4 asal diKondisi kelembaban 2 masing-masing) dan mengamati% rata RSD hanya16,2% pada TIC (dapat diterima untuk variasi biologis). Namun, untukmengkompensasi sedikit variabilitas yang mungkin adaantara biji, tiga biji dipilih dan sampel bersama untukanalisis masing-masing. Pada dasarnya, sampel rata-rata sebelum anal-ysis dan informasi di ruang atas rata-rata tiga biji adalahdiberikan pada setiap titik waktu.SPME pengambilan sampel ditambah dengan GC × GC-TOFMS pemisahan dandeteksi efektif dikonversi jenis sampel yang kompleks menjadidata yang kompleks. Perwakilan 2D TIC kromatogram dari mulai-ning dan akhir dari proses kerusakan kelembaban ditunjukkan padaGambar. 2, di mana membungkus dapat diamati. Ini bisa menjadi cor-rected dengan melakukan perubahan dengan periode modulasi, namunmembungkus lebih penuh memanfaatkan kapasitas puncak 2D, dan tidakbermasalah untuk analisis perangkat lunak.Hal ini dimungkinkan untuk mengidentifikasi tampakbeberapa perbedaan kimia tanda tangan antara awaldan akhir dari proses kerusakan kelembaban seperti yang disajikan dalam 2DTIC pemisahan dalam Gambar. 2. Namun, teknik chemometric adalahlebih berguna daripada visualisasi untuk lebih teliti menyelidiki ini com-kompleks data untuk informasi yang bermanfaat. Algoritma F-Ratio dapat digunakanuntuk menemukan analit yang berbeda antara kelas-kelas, dalam hal ini antarayang unmolded sampel dan mereka dengan cakupan 100%, di semuakacang asal kelas. Semua asal dimasukkan untuk setiap sam-ple kelas sehingga setiap perbedaan asal akan dihitung sebagai dalamkelas variasi dan perbedaan diidentifikasi kemungkinan akan ori-independen gin. Algoritma F-Ratio dapat dihitung di kedua

Halaman 41966EM Humston dkk. / J. Chromatogr. Sebuah 1217 (2010) 1963-1970Tabel 1F-Rasio hasil termasuk daftar gabungan dari 20 analit atas ditemukan oleh tertimbang dan unweighted F-Rasio analisis.Para dihitung F-Rasio disediakan dalam kolom

F-Rasio W (tertimbang) dan F-Rasio U (unweighted) dan urutan masing-masing Peringkat W dan Rank U. Identifikasi analit (ditentukan melalui pencocokan spektral massa) adalahterdaftar dengan waktu retensi yang diamati dalam s (TR1 dan TR2) dan mencocokkan nilai spektrum perpustakaan.Peringkat BPeringkat UF-Rasio WRasio F-UTR1TR2AnalitMV171.60E +084.00E +031560.91Asam asetat970221.40E +087.60E +03898.50.58Tetrametil-pyrazine90137.30E +0794.51.45Karbon dioksida9924141.50E +072.40E +03151.50.61

Metil butenol89951.30E +0711250.10Diketahui611.20E +079.30E +0310890.46Nonanoat asam844761.20E +075.20E +03754.50.744-Hidroksi-asam benzenasulfonat928851.00E +075.20E +035431.023-metil-asam butanoic89599.60E +061156.50.052,6,10-trimetil-dodekan9001049.20E +065.60E +03

751.50.83Hexanoic asam913119.00E +064230.152,3-butanadiol932128.70E +064410.052,3-butanadiol, [S-(R *, R *)]940137.20E +06916.51.02Nonanal801145.70E +06820.50.672-Etil-1-HEXANOL9211535.70E +065.70E +038730.76Heptanoic asam876165.60E +0610950.192,3,7-trimetil-oktan

89417115.20E +062.60E +03787.50.74Trimetil-pyrazine920184.40E +0611670.04Heksadekana924193.70E +0612031.50Mercaptoacetic asam750203.50E +061114.50.11Pentadecane91983.80E +031090.50.822-Decenal87993.00E +03562.50.852-Metil-asam butanoic785102.80E +03

10680.57Diketahui122.50E +0310890.672-phenylethyl ester asam asetat887132.50E +0310560.654 - (Prop-2-enoyloxy) oktan877152.20E +038970.76,-Dimetil-benzenemethanol817162.20E +03436.51.10Butanoat asam860172.20E +03988.50.71Oktanoat asam855182.10E +031075.50.542-Etil-2 ,3,3-trimetil-asam butanoic734191.90E +03

1318.50.35Isobutil phthalate806201.80E +036990.894-Metil-asam pentanoat822mode tertimbang dan unweighted. Dalam modus tertimbang, kal-culated F-Ratio adalah skala dengan sinyal analit. Ini adalah keuntungandalam hit kebisingan positif palsu dapat dikurangi, tetapi juga dapatlebih menekankan analit yang memiliki intensitas terbesar. Ituunweighted modus puncak tidak ada scaling analit begitu kecil dengan besarperbedaan tidak berada di bawah terwakili dalam hasil. Sebagai jangka panjangTujuannya adalah untuk memilih analit untuk analisis kuantitatif rutin yangindikator kualitas dan keamanan pangan, mungkin bermanfaat untuk layaruntuk lebih intens, sehingga lebih mudah untuk mendeteksi, analit dengan tertimbangpendekatan. Namun, pada tahap penemuan, masuknya kuranganalit intens juga bermanfaat sebagai bagian dari kimia jari-cetak untuk penentuan perubahan pola, sehingga F-Rasio adalahdihitung dengan kedua pendekatan tertimbang dan tidak tertimbang.Daftar gabungan disusun dari atas analit ditentukan olehsetiap pendekatan, dengan hasil yang diberikan dalam Tabel   1.  Baik tertimbangdan unweighted F-Rasio jajaran terdaftar. Ada tumpang tindih antaradua daftar dengan hampir setengah (sembilan analit) dari analit padadaftar masing-masing juga ditemukan dengan metode lainnya. Analit identifica-tion ditentukan melalui pencocokan dengan standar perpustakaan dengansesuai nilai-nilai yang disediakan untuk menunjukkan kepercayaan pada diidentifi-kation. Analit yang cocok di bawah 700 terdaftar sebagai tidak diketahui;pendekatan masing-masing menemukan satu analit tidak dikenal di 20 besar. Com-daftar dikombinasikan dari 20 analit atas menghasilkan total dari 29 diidentifikasi(Melalui pencocokan spektral massa) analit yang diukuruntuk penyelidikan lebih lanjut. Banyak dari senyawa analitsecara rutin diamati di sampling dari biji kakao [2,3]. SejakTujuan utama dari penelitian ini adalah untuk menentukan apakah satu set analit dapatdigunakan sebagai sidik jari kimia untuk memprediksi kerusakan kelembaban, itutidak diperlukan pada tahap ini untuk lebih ketat mengidentifikasisenyawa tertentu melalui waktu retensi yang sesuai dengan standar. Sebagaiini analit memiliki potensi menjadi asal-independen penanda

kelembaban, retensi verifikasi kerusakan waktu untuk lebih confi-penyok identifikasi dalam hubungannya dengan pencocokan spektral massadapat dibenarkan untuk skrining rutin.Informasi kuantitatif ditentukan untuk masing-masing 29 ana-lytes di perjalanan seluruh waktu dengan memanfaatkan PARAFAC sasaranalgoritma [30]. Hal ini memungkinkan untuk penentuan relatifperubahan selama proses kerusakan kelembaban per analit. Untuk kemudahanvisualisasi, volume sinyal PARAFAC dinormalkanmean untuk masing-masing analit tertentu dan diplot pada panas tunggalpeta, ditunjukkan dalam Gambar. 3. Plot berisi data untuk seluruh waktuTentu saja studi serta 100% cakupan data tambahan poin.Tren tentu saja waktu untuk banyak analit melacak dengantampilan cetakan dan sebagian besar tren tampak asalindependen. Hal ini menunjukkan bahwa perubahan ini disebabkan oleh Mois-mendatang kerusakan daripada acak kacang-ke-kacang atau asal ke asalvariabilitas. Yang 100% tambahan cakupan data titik (~ 1 bulan)berikut sama dengan titik terakhir kalinya (6 hari) dalam perjalanan waktuData memberikan indikasi tambahan konsistensi. Selanjutnya juga tidak-malization bisa dilakukan, jika diperlukan, untuk memperhitungkan ekstraksi daninjeksi variabilitas dengan pengenalan standar internal.Massa sampel (jumlah semua tiga biji) juga dapat dikoreksi untukdengan normalisasi, jika perlu. Namun, massa rata-ratatiga biji untuk semua 48 suntikan dalam penelitian ini adalah cukup sim-ILAR untuk studi bioanalytical (3,97 g dengan RSD 21%.) Jika initidak terjadi, normalisasi harus dilakukan untuk menjelaskanvariabilitas.Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 3, analit beberapa melacak dengan penampilandari cetakan. Beberapa analit meningkat setelah kerusakan kelembaban dan lain-lainmenurun. Tampaknya ada hubungan yang rumit antarabesar set analit dengan tren berkorelasi banyak. Kami memiliki previ-menerus menemukan bahwa PCA dapat digunakan sebagai alat perbandingan datauntuk meringkas hubungan antara analit tertentu dansampel [19,22]. Dalam studi ini, PCA diterapkan di super-vised modus, menggunakan data PARAFAC volume sinyal yang diidentifikasi olehF-Rasio analisis. Data sinyal Volume PARAFAC dimuat untukPCA analisis dengan masing-masing analit sebagai sampel dan perjalanan waktudan informasi asal yang terkandung sebagai variabel. Pendekatan ini

Halaman 5EM Humston dkk. / J. Chromatogr. Sebuah 1217 (2010) 1963-19701967

Gambar. 2. Baku data dari sampel Kosta Rika. Perbedaan dapat diidentifikasi secara visualantara data titik 0 (0 hari) dan titik data 7 (1 bulan, didefinisikan sebagai cakupan 100%).PCA untuk menyediakan informasi yang analit yang paling mirip dengansatu sama lain dalam konteks perjalanan waktu dalam plot skor dandalam pembebanan, yang waktu poin yang mirip satu sama lain dalamkonteks ini 29 analit. Awalnya PCA dilakukan pada setiapasal independen sebagai dapat dilihat pada Gambar. 4   A  F-. Dalam semua kasus,2 pertama PC menangkap sedikitnya 91,1% dari varians dan sebanyak98,6%. Variabel dalam hal ini berhubungan dengan proses perjalanan waktu, sehinggatidak mengherankan bahwa beban membentuk sebuah kontinum dari satu ujungyang lain. Untuk asal-paling, ada transisi yang cukup berbeda dalamtengah kontinum yang kira-kira bertepatan dengan kualitatiftive pengamatan pertumbuhan jamur signifikan. Misalnya, untuk Esampel (Ekuador) titik transisi adalah 3 hari.Selain melihat hasil PCA untuk asal masing-masing tidak terikatdently, PCA juga dilakukan pada semua asal-usul secara bersamaan. Ituhasil PCA pada semua asal dikombinasikan disediakan dalam Gambar. 5. DalamGambar. 5   A  , PC pertama adalah plot terhadap jumlah sampel. Yang sam-prinsip keuangan yang pertama diperintahkan oleh asal dan kemudian selama 8 titik data(Waktu saja, ditambah cakupan 100% dari saham dibentuk.) PC1 topi-Tures 53,9% dari varians dan terutama indikatorperbedaan antara kacang ketika mereka unmolded. Hampirsemua titik waktu berkorelasi pada atau mendekati 100% cakupanmemiliki beban rendah PC1. Gambar. 5   B  menunjukkan plot PC kedua melawanjumlah sampel. PC2 menangkap 41,0% dari varians total dantampaknya berkorelasi dengan variasi yang terjadi setelah sampelmemiliki pertumbuhan jamur terlihat. Dalam hal ini, hampir semua waktu awalpoin memiliki beban sangat rendah pada PC2 sedangkan waktu kemudian poinmemiliki beban yang lebih besar PC2.2 pertama PC bergabung untuk menangkap hampir95% dari varian total dalam data, yang mirip dengan variabel-Ance ditangkap ketika asal masing-masing dihitung secara independen, dandiplot terhadap satu sama lain dalam Gambar. 5   C  . Perbedaan diidentifikasiantara kacang dengan PCA terkait dengan ada atau tidak adanyacetakan dan tidak asal kacang. Crossing dari positif ke neg-konservatif pada PC1 terutama bertepatan dengan ada atau tidak adanyaterlihat dengan PC1 cetakan yang menunjukkan variasi antara awalwaktu poin dan PC2 yang menunjukkan variasi antara lain waktu

poin. Titik waktu dimana cetakan pertama kali terlihat oleh mataditunjukkan dalam Gambar. 5   C  nilai plot dan terjadi dekat dengan (, 0 0)mengkoordinasikan asal usul paling. Ini menunjukkan bahwa dengan menggunakan PCAdengan set analit, adalah mungkin untuk melacak munculnyakelembaban kerusakan.Gambar. 3. Volume sinyal PARAFAC untuk semua 29 analit. Waktu informasi program bisa dilihat. Kolom tersebut akan disusun dari data titik 0 (0 hari) melalui titik data 7 (1bulan, yaitu, 100% cakupan) untuk asal masing-masing. CR: Kosta Rika, G: Ghana, IC: Pantai Gading, V: Venezuela, P: Panama, dan E: Ekuador.Setiap baris mewakili analit (berlabel) diurutan yang sama seperti Tabel 1.

Halaman 61968EM Humston dkk. / J. Chromatogr. Sebuah 1217 (2010) 1963-1970Gambar. 4. PCA pada asal masing-masing secara independen. (A) Kosta Rika, (B) Ghana, (C) Pantai Gading, (D) Venezuela, (E) Panama, dan (F) Ekuador.Hari-hari, 0-6, diberi label seperti itu, dan1-bulan titik waktu diberi label sebagai titik data 7 (didefinisikan sebagai cakupan 100%).Sementara di Gambar. 5   A  -C adalah mungkin untuk menentukan apakah atau tidakkacang ini terlihat dibentuk, urutan yang tepat dari titik waktu adalahtidak selalu discernable dengan PCA baik asal-usul individuatau asal-usul gabungan. Untuk alasan ini, mesin-belajar teknologitehnik yang digunakan untuk menentukan apakah data dapat dimodelkansehingga untuk memprediksi jumlah waktu sejak kerusakan kelembaban, yangdapat memungkinkan untuk mendeteksi kerusakan kelembaban sebelum terlihatpertumbuhan jamur dan bantuan dalam penyaringan untuk kualitas kacang. Untuk quan-tify kemampuan kita untuk mendeteksi kerusakan kelembaban dari pengukurananalit ruang atas yang mudah menguap saja, sebuah analisis regresi adalahdilakukan pada data. Kami mundur pada titik data (jumlahhari setelah kerusakan kelembaban 0-6 dan 100% tambahan menutup-usia point) sebagai fungsi dari 28 dari 29 analit yang tercantum dalam Tabel 1.Tingkat karbon dioksida tidak dimasukkan sebagai variabel prediktordalam analisis regresi karena tidak dianggap sebagai cocokcalon-bidang sistem deteksi karena dapat dipengaruhi olehberbagai kondisi eksternal.Sebuah pilihan sepuluh mesin-belajar metode regresi adalah

diterapkan pada data pelatihan yang lengkap, dan 10 kali lipat cross-validasidigunakan untuk memperkirakan kinerja generalisasi dengan jumlah-mary dari hasil yang ditunjukkan pada Tabel 2. Berdasarkan data tersebut, linierregresi dengan menggunakan set lengkap variabel ditemukan menjadipaling tidak akurat model. Ini hampir pasti karena yang signifikanmulti-kolinearitas pada data, yang mengacaukan teknik ini. Itukolinearitas muncul karena banyak dari tingkat analit tidak inde-independen, tetapi bervariasi bersama-sama karena kimia reaktif-dan / ataumetabolik hubungan. PLS lebih cocok untuk menangani masalah inidan tidak jauh lebih baik, tetapi masih tidak mencapai kinerjadari model lainnya. Hal ini mungkin karena model linier tidak dapat ade-Tabel 2Koefisien determinasi terdaftar untuk pilihan mesin-belajar-regression metode.Model regresiR2dari 10 kali lipat validasi silang.Mean (SD) dari 10 berjalanLinear regresi0.499 (0.12)Parsial regresi kuadrat terkecil0.608 (0.10)Proses Gaussian0.661 (0.11)Secara radial fungsi jaringan0.671 (0.08)1-tetangga terdekat0.737 (0.09)SMO-dukungan vektor regresi0.743 (0.12)Acak subruang0.702 (0.07)Acak hutan0.861 (0.11)M5 regresi pohon0.705 (0.10)Kereta0.702 (0.11)

Halaman 7

EM Humston dkk. / J. Chromatogr. Sebuah 1217 (2010) 1963-19701969Gambar. 5 PCA pada semua asal digabungkan.. (A) PC1 diplot terhadap jumlah sampel dengansampel dalam urutan yang sama seperti Gambar. 3. (B) PC2 diplot terhadap jumlah sampel.Dalam asal masing-masing, titik data tersebut akan disusun dari data titik 0 (0 hari) melaluidata titik 7 (1 bulan, yaitu, 100% cakupan). (C) PC1 diplot terhadap PC2. CR: CostaRica, G: Ghana, IC: Ivory Coast, V: Venezuela, P: Panama, and E: Ecuador.quately capture the non-linear and even non-monotonic changesobserved in the analyte levels over the time course. Adatwo main groups of learning models that do substantially bet-ter at modeling this data. The nearest-neighbor and radial basisfunction methods both use all variables without weighting them,and the predictions are based largely on the most proximal datapoints in this unweighted space. Such methods are not hinderedby non-linearity, a large number of variables, or multi-colinearity.The random forest, random subspaces, CART and M5 regressiontree methods all use rules arranged in tree structures, which alsoenables them to model non-linear data more effectively. Also, ran-dom subspaces and random forests pool a large number of treestogether, allowing them to make use of all the variables withoutover-fitting, while CART and M5 use only a selection of variables.Gambar. 6. Predictions of a random forest regression model. The x-axis displays theactual time points, from 0 days (data point 0) through 1 month, ie, 100% coverage(data point 7).Overall, the high R2values of the best models indicate that theheadspace data contain sufficient information to detect not justthe presence of moisture damage, but also to determine when thecontamination occurred. A plot of the predictions made by a ran-dom forest model, which proved to be the best prediction method,is shown in Fig. 6   .  We can see from this plot that it is particularlygood at accurately differentiating between no contamination andeach of the first 2 or 3 days of contamination. This is the time-framewhere there is no visible mold and visual inspection of cacao beanswill not detect moisture damage. The ability to quantitatively dis-tinguish between these time points indicates a clear potential forthe development of early-warning systems related to food safety

and quality issues.The plot in Fig. 6   a  lso shows that no bean variety has consistentlyhigher or lower predictions than the main trend, suggesting that thevarieties behave largely similarly. This implies that these changesare origin independent and is consistent with what was observedin the PARAFAC signal volumes shown in Fig. 3   a  nd the combinedorigin PCA results shown in Fig. 5   .  We further tested this hypothesisby retraining the random forest model on five of the bean varietiesand testing on the sixth, arguably the one with the largest appar-ent differences, the Venezuela variety. R2value obtained on thistest was still high and averaged around 0.7 (10 runs). The exper-iment was then repeated using the nearest-neighbor classifier (1run because it is deterministic) which gave an R2value of 0.788.These values are less reliable than those quoted in Table 2   ,  becausethey are based on a test set of just 8 data points, but there is no indi-cation from our data that different bean varieties cannot be treatedsama.All the regression methods reported above were trained on allvariabel. However, one might be interested in using only a subsetof the variables. This would be especially the case for the develop-ment of more cost-effective measurement and detection systemsfor in-field applications. The CART and M5 decision tree methodsimplicitly perform a selection of variables during the training pro-cess, and the final models use only these variables. Fig. 7 menunjukkana single CART model trained in the same way as those that werecross-validated and reported in Table 2   .  It uses only six of the avail-able variables to make the predictions and performs at a relativelyhigh level compared to the much larger nearest-neighbor and ran-dom forest models (see Table 2   )  . Additionally, there seem to benumerous options in which subsets of variables can be used to stillarrive at accurate predictions. Models trained on ten different ran-dom selections of k variables were assessed, at a variety of k valuesfor the random forest method. Certain combinations of variables

Halaman 81970EM Humston et al. / J. Chromatogr. A 1217 (2010) 1963–1970

Gambar. 7. CART tree that predicts the number of days since moisture damage. Pada setiapnode, the decision rule displayed (top line) indicates which branch to follow (left orright) based on the value of the variable named. The % of total deviance explainedby the rule is shown as the third value on the second line. The number of observa-tions entering a node and their mean value are the first two values on the secondline, respectively. The leaf nodes indicate the mean value of the observations there,and their number. The model shown splits the data into seven categories based onsix explanatory variables (analytes). It does not manage to separate days 5 and 6,grouping eleven observations together, but makes few other errors. See Table 2   f  orthe cross-validated R2kinerja.Tabel 3R2values (under 10-fold cross-validation) are given for random forest models, basedon selections of k variables, with k ranging from 10 down to 2. Ten independent andentirely random selections at each value of k were done; the table summarizes thedistribution of results obtained.Number of variables, k105432R2Min0.670.640.620.50.03Rata-rata0.850.760.70.70.5Max

0.90.790.850.80.71give better performance than others, but accurate models based ononly three or four variable combinations exist and are not difficultto find, as shown in Table 3   .  We have also run more direct variable-selection techniques, but these do not give a consistent list of toppredictor variables, such that they could be presented as definitive.Rather, it is found that many different subsets of the variables areinformative enough to make accurate (cross-validated) predictions.As seen in Table 3   ,  more than half the random forest models basedon only three variables give R2values of 0.7 or better.The success of the various prediction algorithms with all of thedata combined, or with just a subset of the analytes, shows that itis possible to determine whether moisture damage has occurredbefore there are visible signs of mold. The precise time since dam-age may differ due to many environmental factors (ie, humidity,exposure to elements, etc.), which would be important to furtherinvestigate prior to any implementation as a field device. Bagaimana-ever, there seem to be numerous origin-independent markers thatindicate whether or not the moisture damage has occurred.4. KesimpulanWe have shown that moisture damage to cacao beans alters thevolatile chemical signature in a way that can be tracked over time.These headspace vapor changes can be sampled with HS-SPME anddetected and analyzed with GC × GC–TOFMS. A number of ana-lytes that change in concentration levels via the moisture damageprocess were determined using the F-Ratio algorithm and quanti-fied with the PARAFAC algorithm. It is possible to use predictionalgorithms to determine whether moisture damage has occurredbefore there are visible signs of mold by analyzing subsets of theanalit.Ucapan Terima KasihWe thank the Washington Technology Center (WTC) for theirdukungan keuangan. JDK thanks the University of Manchester forsupporting his visit to the University of Washington as a VisitingScholar.

Referensi[1] R. Dand, The International Cocoa Trade, Woodhead Publishing, 1999.[2] F. Frauendorfer, P. Schieberle, J. Agric. Makanan Chem. 65 (2006) 5521.[3] T. Stark, S. Bareuther, T. Hofmann, J. Agric. Makanan Chem. 54 (2006) 5530.[4] Z. Zhang, J. Pawliszyn, Anal. Chem. 65 (1993) 1843.[5] EM Humston, Y. Zhang, GF Brabeck, A. McShea, RE Synovec, J. Sep. Sci. 32(2009) 2289.[6] S. Ducki, J. Miralles-Garcia, A. Zumbe, A. Torenero, DM Storey, Talanta 74(2008) 1166.[7] J. Beens, M. Adahchour, RJJ Vreuls, K. van Altena, UATh. Brinkman, J. Chro-matogr. A 919 (2001) 127.[8] CA Bruckner, BJ Prazen, RE Synovec, Anal. Chem. 70 (1998) 2796.[9] RM Kinghorn, PJ Marriott, J. High Resolut. Chromatogr. 21 (1998) 620.[10] Z. Liu, JB Phillips, J. Chromatogr. Sci. 29 (1991) 227.[11] JV Seeley, F. Kramp, CJ Hicks, Anal. Chem. 72 (2000) 4346.[12] R. Shellie, L. Mondello, P. Marriott, G. Dugo, J. Chromatogr. A 970 (2002)225.[13] JL Hope, BJ Prazen, EJ Nilsson, ME Lidstrom, RE Synovec, Talanta 65 (2005)380.[14] R. Shellie, P. Marriott, P. Morrison, Anal. Chem. 73 (2001) 1336.[15] AE Sinha, BJ Prazen, CG Fraga, RE Synovec, J. Chromatogr. A 1019 (2003) 79.[16] M. van Deursen, J. Beens, J. Reijenga, P. Lipman, C. Cramers, J. Blomberg, J. HighResolut. Chromatogr. 23 (2000) 507.[17] J. Dalluge, M. van Rijn, J. Beens, RJ Vreuls, UATh. Brinkman, J. Chromatogr. Sebuah965 (2002) 207.[18] J. Dalluge, RJ Vreuls, J. Beens, UATh. Brinkman, J. Sep. Sci. 25 (2002) 201.[19] EM Humston, KM Dombek, JC Hoggard, ET Young, RE Synovec, Anal. Chem.80 (2008) 8002.[20] RE Mohler, KM Dombek, JC Hoggard, KM Pierce, ET Young, RE Synovec,Analyst 132 (2007) 756.[21] RE Mohler, KM Dombek, JC Hoggard, ET Young, RE Synovec, Anal. Chem.78 (2006) 2700.[22] RE Mohler, BP Tu, KM Dombek, JC Hoggard, ET Young, RE Synovec, J.Chromatogr. A 1186 (2008) 401.[23] KM Pierce, JC Hoggard, JL Hope, PM Rainey, AN Hoofnagle, RM Jack, BMWright, RE Synovec, Anal. Chem. 78 (2006) 5068.[24] R. Shellie, W. Welthagen, J. Zrostlikova, J. Spranger, M. Ristow, O. Fiehn, R.Zimmermann, J. Chromatogr. A 1086 (2005) 83.[25] AE Sinha, JL Hope, BJ Prazen, EJ Nilsson, RM Jack, RE Synovec, J. Chro-

matogr. A 1058 (2004) 209.[26] W. Welthagen, R. Shellie, J. Spranger, M. Ristow, R. Zimmermann, O. Fiehn,Metabolomics 1 (2005) 65.[27] KM Pierce, JC Hoggard, RE Mohler, RE Synovec, J. Chromatogr. A 1184 (2008)341.[28] AE Sinha, JL Hope, BJ Prazen, CG Fraga, EJ Nilsson, RE Synovec, J. Chro-matogr. A 1056 (2004) 145.[29] R. Bro, Chemometr. Intell. Lab. Syst. 38 (1997) 149.[30] JC Hoggard, RE Synovec, Anal. Chem. 79 (2007) 1611.[31] AE Sinha, CG Fraga, BJ Prazen, RE Synovec, J. Chromatogr. A 1027 (2004)269.[32] RDC Team, R: A Language and Environment for Statistical Computing, 2008.[33] IH Witten, E. Frank, Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Tech-niques, Morgan Kaufmann, San Francisco, 2005.[34] TM Therneau, B. Atkinson, B. Ripley, R Package Version 3.1-41, 2008.[35] A. Liaw, M. Wiener, R News 2/3 (2002) 18.[36] R. Kohavi, Proc. Int. Joint Conf. Artif. Intell. 14 (1995) 1137.[37] CR Rao, Probability and Mathematical Statistics, Wiley, 1973.