TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KALP FONKSİYON BOZUKLUĞUNDA ROL

OYNAYAN HÜCRE İÇİ SERBEST Zn2+ DERİŞİMİ VE

KONTROLSÜZ SARKOPLAZMİK RETİKULUM Ca2+

SIZINTISI ARASINDAKİ İLİŞKİNİN

ELEKTROFİZYOLOJİK VE BİYOKİMYASAL

TEKNİKLERLE İNCELENMESİ

Erkan TUNCAY

BİYOFİZİK ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Belma TURAN

2014-ANKARA

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KALP FONKSİYON BOZUKLUĞUNDA ROL

OYNAYAN HÜCRE İÇİ SERBEST Zn2+ DERİŞİMİ VE

KONTROLSÜZ SARKOPLAZMİK RETİKULUM Ca2+

SIZINTISI ARASINDAKİ İLİŞKİNİN

ELEKTROFİZYOLOJİK VE BİYOKİMYASAL

TEKNİKLERLE İNCELENMESİ

Erkan TUNCAY

BİYOFİZİK ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Belma TURAN

Bu tez TÜBİTAK tarafından SBAG-111S042 ve SBAG-107S427 proje numaraları ile desteklenmiştir.

2014-ANKARA

ii

Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Biyofizik Doktora Programı

çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından

Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir.

Tez Savunma Tarihi: 05.02.2014

Prof. Dr. Cüneyt GÖKSOY Gülhane Askeri Tıp Fakültesi Jüri Başkanı Prof. Dr. Belma TURAN Prof. Dr. Nuhan Puralı Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Danışman TİK Üyesi Prof. Dr. Mehmet UĞUR Prof. Dr. K. Can AKÇALI Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi TİK Üyesi Üye

iii

İÇİNDEKİLER

Kabul Ve Onay Sayfası ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vi Şekiller viii Çizelgeler xv 1. GİRİŞ 1

1.1. Kalpte Hücre İçi Elektriksel Aktivite 1 1.2. Kalpte Uyarılma-Kasılma Çiftleniminde Rol Oynayan Mekanizmalar 5 1.2.1. Pacemaker Potansiyeli ve Sol Ventikülde Aksiyon Potansiyelinin Oluşması5 1.2.2. Kardiyomiyositlerde Hücre İçi Ca2+ İyon Artışı ile İlgili Mekanizmalar 8 1.2.3. Kardiyomiyositlerde Kayan Filamanlar Modeli 9 1.2.4. Kardiyomiyositlerde Gevşeme Süreci ve Rol Alan Mekanizmalar 10 1.3. Patolojik Kalp ve Ca2+ Homeostazı Arasındaki İlişki 11 1.3. 1. Ca2+ ve Kardiyak Fonksiyon Bozukluğu 11 1.3.2. Kalp Fonksiyon Bozukluğu ile Hücre İçi Na+ ve H+ İyonları İlişkisi 14 1.3.3. Kalp Fonksiyon Bozukluğu ile Hücre İçi Zn2+ İyonu ile İlişkisi 15 1.4. Kardiyomiyositlerde Hücre İçi Zn2+ Homeostazı ve Etkili Mekanizmalar 17 1.5. Kardiyomiyositlerde Oksidatif Stres/Nitrosatif Stres ve Hücre İçi Zn2+ Homeostazı Arasındaki İlişkisi 19 1.6. Çalışmanın Amacı 21

2. GEREÇ ve YÖNTEMLER 22 2.1. Deneylerde Kullanılan Sıçanlar ve Deneysel Diyabet Modeli 22 2.2. Tüm Kalp Dokusundan Kardiyomiyosit İzolasyonu 23 2.3 L-tipi Ca2+ Kanal Akımı Ölçümü 24 2.4 Bazal Hücre İçi Serbest Ca2+ ve Zn2+ Değişimi Ölçümleri 25 2.5 Elektriksel Uyarı Altındaki Kardiyomiyositlerde Hücre İçi Serbest Ca2+ ve Zn2+ Değerlerinin Geçici Değişimlerinin (Transient) Ölçülmesi 26 2.6. Dinlenimdeki Kardiyomiyositlerde Lokal Zn2+ Salınması (Zn2+ spark) ile Lokal Ca2+ Salınmasının (Ca2+ spark) Ölçülmesi 27 2.7. Western Blot Ölçümleri 29 2.8. Protein Thiol (SH) Oksidasyonu Ölçümü 30 2.9. Plazma Örneklerinde Oksidatif Stres/Antioksidant Seviyelerinin Belirlenmesi

30 2.10. İstatistiksel Analizler 31 2.11. Kullanılan Kimyasallar 31

3. BULGULAR 32

iv

3.1. Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişimi ve Homeostazı İle İlgili Çalışmalar 32 3.1.1. Deney Hayvanları ile İlgili Genel Parametreler 32 3.1.2. Farklı Zn2+ Bileşiklerine Maruz Kalan Kardiyomiyositlerde L-tipi Ca2+- Kanal Akımları 32 3.1.3. İzole Kardiyomiyositlerde Serbest Zn2+ Varlığının Gösterilmesi 35 3.1.4. İzole Kardiyomiyositlerde Bazal Serbest Zn2+ Miktarının Ölçülmesi 36 3.1.5. İzole Kardiyomiyositlerde Zn2+ Transientlerinin Gösterilmesi 38 3.1.6. Hücre Dışı ve Hücre İçi Serbest Zn2+ Miktarındaki Artışın Global Zn2+

Değişimlerine Etkisi 39 3.1.8. Hücre Dışı ve Hücre İçi Serbest Zn2+ Miktarındaki Artışın Lokal Zn2+

Değişimlerine Etkisi 41 3.1.9. Hücre İçi Lokal ve Global Zn2+ Değişimi ve Dış Ortam Ca2+ Miktarı Arasındaki İlişki 43 3.1.10. Hücre İçi Zn2+ Homostazında Hücre İçi Ca2+ Depolarının Rolü 45 3.2. Hücre içi Serbest Zn2+ Değişimi ile Oksidatif/Nitrosatif Stres Arasındaki İlişki

49 3.2.1. Oksidatif Stres Artışı ile Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişimindeki Artış Arasındaki İlişki 49 3.2.2. Nitrosadatif Stres Artışı ile Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişimindeki Artış Arasındaki İlişki 51 3.2.3. Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişiminin Artışı ve Ryanodin Reseptörü Kompleksi Arasındaki İlişki 53 3.3. Hücre İçi Serbest Zn2+ Değişimi ile Hiperglisemi Arasındaki İlişkisi 56 3.3.1. Hiperglisemi ve Sistemik/Hedef Organ Oksidatif Stres Artışı Arasındaki İlişki 56 3.3.2. Hiperglisemi İndüklü Artan Oksidatif Stres Bazal Hücre İçi Serbest Zn2+ Artışına Neden Olur 60 3.3.2. Hiperglisemi İndüklü Artan Oksidatif Stres Hücre İçi Zn2+ Homeostazının Değişmesine Neden Olur 63

4.TARTIŞMA 65 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 75 ÖZET 77 SUMMARY 78 KAYNAKLAR 79 ÖZGEÇMİŞ 85

v

ÖNSÖZ

Bu tez çalışmasının danışmanlığını üstlenen ve çalışmaların gerçekleşmesi için

gerekli tüm olanakları sağlayan değerli hocam Prof. Dr. Belma TURAN’a teşekkür

ederim.

Çalışma süresince desteklerini esirgemeyen Prof. Dr. Mehmet UĞUR, Doç. Dr.

Burak H. Kandilci ve değerli çalışma arkadaşlarım Figen Çiçek, Vedia Deletioğlu,

Ayşegül Toy, Seda Uysal, Şerife ve Doç. Dr. Kemal Sayar çiftine teşekkür ederim.

Tez projemde datalarından yararlandığım, Esma Nur Okatan ve Ali Aytaç Seymen’e

ayrıca teşekkürlerimi sunarım.

Lisansüstü çalışmalarım sırasında emekleri ve mesaileri ile her zaman yanımda olan

Biyofizik Anabilim Dalı çalışanlarına ve öğrencilerine ayrıca teşekkür ederim.

Bu tez çalışması TÜBİTAK SBAG-111S042 ve SBAG-107S427 proje numaraları ile

ve 2214/A - Yurt Dışı Doktora Sırası Araştırma Burs Programı tarafından

desteklenmiştir. TÜBİTAK’a desteklerinden dolayı teşekkür ederim.

Her zaman, destekleri ve varlıklarıyla bana güç veren Aileme sonsuz şükranlarımı sunarım.

vi

SİMGELER ve KISALTMALAR

[Ca2+]i Hücre İçi Serbest Ca2+ Konsatrasyonu

[Zn2+]i Hücre İçi Serbest Zn2+ Konsatrasyonu

AP Aksiyon Potansiyeli ATP Adenozin trifosfat

AVN Atriyoventriküler Nod CaMKII Kalsiyum kalmodülin kinaz II

cAMP Siklik Adenozin Mono Fosfat (Bir hücre içi ikincil mesajcı) cGMP Siklik Guanizin Mono Fosfat

CICR Ca2+–uyarımlı Ca2+–salımı CSQ Calsequestrin

DT50 Yarı gevşeme süresi eNOS Endotelyal Nitrit Oksit

FCCP carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy), mitokondrial protonofor FKBP FK506 bağlayıcı protein

GLU Glükoz GTP Guanin trifosfat

ICaT T-tipi Ca2+ kanalı If Funny Currents

INS İnsülin LTCC L-tipi Ca2+ Kanalları

mRNA Mesajcı RNA MT Metallotionin

NCX Na+/Ca2+ Exchanger (Na+/Ca2+ Değiştokuşcusu) NO Nitrik Oksit

PKA Protein Kinaz A pCaMKII Fosforile kalsiyum kalmodülin kinaz II

pPKA Fosforile Protein Kinaz A pRyR2 Fosforile Riyanodin Reseptörü

PLB Fosfolamban PKG Protein Kinaz-G

RT Rotenone, mitokondrial complex1 inhibitörü

vii

RyR2 Kardiak Riyanodin Reseptörü

SAN Sinoartiyal Nod SERCA Sarco/Endoplazmik Retikulum Calcium Pump ATPase (SR

Ca2+ Pompası) SNP Sodyum Nitroprusside

SR Sarkoplazmik Retikulum TP Kasılmanın maksimuma ulaşma süresi

TPEN Tetrakis-(2-Pyridylmethyl)ethylenediamine ZnPT Çinko-1-hydroxypyridine-2-thione

viii

ŞEKİLLER

Şekil 1.1.Ventrikül aksiyon potansiyelinin evreleri ve onlara karşılık gelen iyonik akımlar (Mukherjee ve Spinale, 1999).

Şekil 1.2.Üstte kalbin farklı bölgelerinde gözlenen aksiyon potansiyeli desenleri, altta ise, vücut yüzeyinden kaydedilen bileşik aksiyon potansiyeli, EKG görülmektedir. (Jeanne Nerbonne ve Kass, 2005).

Şekil 1.3.Sinoatriyal nod hücrelerinde (SAN) hücrelerinde ve ventrikül hücrelerinde AP ve bu sürece katılan iyonların iletkenliklerinin karşılaştırılması.

Şekil 1.4.AP’nin Sinoatriyal nodda (SAN)’da oluşması ve Atriyoventriküler nod (AVN), atriyum ve ventrikülere yayılması.

Şekil 1.5.Ventrikül hücrelerinde Ca2+ düzenlenmesi. Alt grafik aksiyon potansiyeli, Ca2+ transienti ve kasılmanın zamansal değişimlerini göstermektedir. NCX, Na+/Ca2+ değiştokuşcusu; ATP, ATPaz; PLB, fosfolamban; SR, sarkoplazmik retikulum (Bers, 2002).

Şekil 1.6.Sarkomer organizasyonu ve kardiyak kasılma olayının şematik diyagramı. Solda kalp kasılması sırasında sarkomerlerin aldığı pozisyon sağda ise bu olayı gerçekleştiren aktin ve miyozinlerin biribiri üzerinden kayma şekli gösterilmiştir (Seidman ve Seidman, 2001).

Şekil 1.7.Kardiyak hücrelerde SR üzerinde bulunan RyR2’ nin şematik gösterimi. RyR2’ler calmodulin (CaM), FK506-bağlayıcı protein FKBP12.6 (calstabin2), protein kinaz A (PKA) CaM-bağımlı kinaz II (CaMKII), fosfotaz 1 ve 2A, fosfodiesterazlar, junctin, triadin ve calsequestrin (CSQ) gibi çeşitli regüle edici proteinlerden oluşan 565 kDa ağırlığında makromoleküler bir yapıdır. RyR2’nin kanal davranışı, birçok protein (CaM, FKBP12.6, PKA) ve ligand (Ca2+, ATP, Mg2+) tarafından belirlenir (Chakraborti ve ark., 2003).

Şekil 1.8.Na+ ve pH regülasyonunda rol alan yolakları gösteren şematik diyagram. (Allen ve Xiao, 2003).

Şekil 1.9.Memeli hücrelerinde Zn2+ taşıyıcılarının ve metalationin (MT)’lerin hücresel yerleşimini gösteren şekil. Zn2+’u sitozole taşıyanlar (ZiP) mavi renk ile sitozolden uzaklaştıranlar (ZnT) siyah renk ile gösterilmiştir.

ix

Metal-responsive-element binding transcription factor, MTF1 olarak kısaltılmıştır (Fukada ve ark., 2011).

Şekil 2.1.Kardiyak hücrelerden Ca2+ spark kayıt ve analiz için oluşturulan grafikler. Fluo-3 (AM) ile yüklenmiş bir kardiyomiyositin konfokal mikroskobu ile alınan flüoresan ve gerçek görüntüsü en üstte görülmektedir. Hücre üzerinde boyuna tanımlanan doğrunun zaman içinde değişim deseni ortadaki grafiği oluşturmaktadır. 4–5 piksel genişliğinde zamansal (mavi eğri) ve uzaysal ortalama eğrisi ile (kırmızı eğri) spark parametreleri hesaplanmıştır.

Şekil 3.1.İki farklı Zn2+ bileşiği olan ZnCl2 (10 ve 100 µM) ve bir Zn2+ iyonoforu olan ZnPT (1 ve 10 µM)’nın ICaL maksimum akımlarına olan etkisi. Maksimum Ca2+ akımları, her seferinde hücrelerin 0 mV’a kenetlenmesi ile ölçülmüştür. Hücrelerden yaklaşık 2 dakika boyunca bazal kayıtlar alındıktan sonra sırasıyla 10 µM ZnCl2, yıkama, 100 µM ZnCl2 ve yıkama (A) 1µM ZnPT, yıkama, 10 µM ZnPT ve yıkama (B) 1µM ZnPT, 1µM ZnPT + 50 µM TPEN ve yıkama (C) protokolleri uygulanarak bazala göre maksimum ICaL‘deki değişime ait örnek gösterim.

Şekil 3.2. L-tipi Ca2+ -kanal akımı. Solda, 10 ve 100 µM ZnCl2 uygulanmış, sağda 1 ve 10 µM ZnPT uygulanmış kontrol gruplarına ait zar potansiyeline göre ölçülen akım yoğunluklarının ortalamasından elde edilen akım-voltaj grafiği ve ortada akımın kayıt protokolü. Değerler ortalamaSEM ile temsil edilmiştir.

Şekil 3.3.Gruplar için ICa akımlarının kinetik analizleri. Gruplardan elde edilen ortalama değerler ve Boltzman denklemlerinin uygulanması ile çizdirilmiş aktivasyon (I/Imax=[1+exp (V1/2–Vm)/k]-1) ve inaktivasyon (I/Imax=[1+exp(Vm–V1/2)/k]-1) eğrileri. V1/2, aktivasyon veya inaktivasyon’un %50 değerine ulaştığı potansiyel ve k eğim parametresidir. 10 µM ZnCl2’nın (A) ve 1 µM ZnPT (B) aktivasyon ve inaktivasyon eğrilerine olan etkisi. Değerler ortalamaSEM olarak verilmiştir.

Şekil 3.4.FluoZin-3 (AM) ile yüklenmiş kardiyomiyositlerde konfokal mikroskopta hücre içi Zn2+ değişimine bağlı olarak floresans değişiminin gözlenmesi.

Şekil 3.5.Sıçan kalbinden izole edilen kardiyomiyositlerde hücre içi serbest Zn2+’ nun belirlenmesi. FluoZin-3 (AM) boyası ile 30 dakika boyunca inkübe edilen hücreler bir küvet içine alındıktan sonra sırasıyla bazal, 10µM 1-hydroxypyridine-2-thione (ZnPT) ile maksimum ve 50µM Tetrakis-(2-Pyridylmethyl)ethylenediamine(TPEN) ile minimum yanıtlar alınarak

x

serbest çinko miktarı [Zn2+]i = KdX(F-Fmin)/(Fmax-F) eşitliği ile belirlenmiştir. Floresans miktarı keyfi birim olarak belirlenmiştir.

Şekil 3.6.TPEN’nin FluoZin-3 (AM) ve Fluo-3 (AM) boyalı hücrelerde floresans miktarlarına olan etkisi. (A) TPEN FluoZin-3 boyalı hücrelerde bazal floresans değerini anlamlı derecede azaltırken, Fluo-3 boyalı hücrelerde bazal floresans miktarına etki etmemiştir. (B) Bar grafiklerde FluoZin-3 ve Fluo-3 boyalı kardiyomiyositlerde TPEN’in bazal floresans miktarına olan etkisi bazala göre % değişim olarak gösterilmiştir. Deneylerde kullanılan toplam hücre sayısı, n= 5-7 *P<0,05; başlangıç değerine göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.7.Kardiyomiyositlerde hücre içi Zn2+ transientlerinin gösterilmesi. Kardiyomiyositler 0,2 Hz frekans ve 25-30 V genlikli elektriksel uyarı altındayken gözlenen çinko ve kalsiyum trazientlerine ait örnekler (A). TPEN’nin hücre içi Zn2+ ve Ca2+ miktarlarına ve transientlerine olan etkisi. 50 µM TPEN uygulaması sorası hücre içi Zn2+ miktarı anlamlı derecede azalırken kalsiyum miktarında bir değişim gözlenmemiştir. TPEN Zn2+ transientlerini azaltırken Ca2+ transientlerine etki etmemiştir (B). TPEN’nin hücre içi Zn2+ ve Ca2+ miktarlarına ve transientlerine olan etkisi bar grafik olarak gösterilmiştir (C ve D). Tüm değerler, TPEN verilmeden önceki başlangıç durumuna göre (BAZAL) % değişim olarak verilmiştir. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 10-12 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.8.Hücre içi ve dışı Zn2+ artışının Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkisi. Kardiyomiyositler 0,2 Hz frekans ve 25-30 V genlikli elektriksel uyarı altındayken hücre içi (A, sol) ve dışı (B, sol) Zn2+ artışına bağlı olarak gözlenen Zn2+ ve Ca2+ trazientlerinin değişimine ait örnekler. Kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra, hücreler sırasıyla 1µM ZnPT ve 50µM TPEN içeren kreps solüsyonu ile perfüze edilmişlerdir. ZnPT uygulaması Zn2+ transientlerini arttırırken Ca2+ transientlerini anlamlı derecede azaltmıştır. Daha sonra hücrelerin TPEN ile perfüze edilmesi Zn2+ transientlerini tamamen ortadan kaldırırken Ca2+ tranznetlerini anlamlı derecede azaltmıştır (A, sol). Kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra, hücreler sırasıyla 10,100 µM ZnCl2 ve 50µM TPEN içeren kreps solüsyonu ile perfüze edilmişlerdir. ZnCl2, Zn2+ ve Ca2+ transientlerini anlamlı derecede azaltırken, hücrelerin daha sonra TPEN ile perfüze edilmesi Zn2+ ve Ca2+ transientlerinde bir değişime neden olmamıştır (B,sol). Tüm değerler, başlangıç durumuna göre (BAZAL) % değişim olarak verilmiştir. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 15-20 hücre kullanılmıştır.*P<0,05; bazala göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

xi

Şekil 3.9.İzole kardiyomiyositlerde Zn2+ ve Ca2+ spark parametrelerinin karşılaştırılması. FluoZin-3 (AM) veya Fluo-3 (AM) boyası ile inkübe edilen kardiyomiyositlerden kaydedilen Zn2+ ve Ca2+ sparkına ait örnek şekiller ve ölçülen parametrelere ait ortalama değerler (TP: sparkın tepeye çıkış süresi, FDHM: sparkın maksimumdan yarıya inme süresi). *P<0,05; Zn2+ sparkına göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.10.Hücre içi ve dışı Zn2+ değişiminin Zn2+ ve Ca2+ spark parametrelerine olan etkisi. FluoZin-3 (AM) veya Fluo-3 (AM) boyası ile inkübe edilen kardiyomiyositlerden kaydedilen Zn2+ ve Ca2+ spark frekans ve genlikleri. Hücreler sırasıyla 50µm TPEN, 1µM ZnPT, 1µM ZnPT+50µM TPEN ve 100µM ZnCl2’ya maruz bırakılmışlardır. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 17-20 hücre kullanılmıştır. *p<0,05; kontrole göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.11.Hücre dışı Ca2+’nun Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile inkübe edilen kardiyomiyositler elektrik alan uyarısı ile uyarılarak Zn2+ ve Ca2+ transientlerine bakılmıştır. Dış ortamdaki Ca2+

uzaklaştırıldığında (0mM) Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin ortadan kaybolduğu gözlenmiştir. Dış ortamdaki Ca2+ tekrar normal seviyeye getirildiğinde (1,8mM) ise Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin eski haline geldiği gözlenmiştir. Deney protokolüne ait örnek şekil ve bar grafik sırasıyla şekilde üst ve alt tarafta yer almıştır. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 10-12 hücre kullanılmıştır.

Şekil 3.12.Hücre dışı Ca2+’nun Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile inkübe edilen kardiyomiyositler elektrik alan uyarısı ile uyarılarak Zn2+ ve Ca2+ transientlerine bakılmıştır. Dış ortamdaki Ca2+

uzaklaştırıldığında Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin ortadan kaybolduğu ve yerine 1µM ZnPT eklendiğinde Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin tekrar oluşumuna katkı sağlamadığı gözlenmiştir. Dış ortamdaki Ca2+ tekrar 1,8mM’a getirildiğinde transientlerin tekrar oluştuğu gözlenmiştir. 50µM TPEN eklenmesi ise Zn2+ transientlerini tamamen ortadan kaldırırken, Ca2+ transientlerine etki etmemiştir. Deney protokolüne ait örnek şekil ve bar grafik sırasıyla şekilde üst ve alt tarafta yer almıştır. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 9-12 hücre kullanılmıştır.

Şekil. 3.13.Hücre içi Zn2+ homostazında hücre içi Ca2+ depolarının rolü. FluoZin-3 ve fluo-3 boyaları ile inkübe edilen kardiyomiyositler elektriksel uyarı altında Zn2+ ve Ca2+ transientleri alınırken sırasıyla RyR2 kanal blokörü ryanodine (1-µM), mitokondrial komplex1 inhibitörü rotenone (RT;1 µM) ve bir mitokondrial protonofor olan carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) (FCCP; 1-µM) ile perfüze edilerek bu ajanların Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkileri. Deneylerde toplam 3-4 hayvan

xii

kalbinden izole edilen 15-20 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

Şekil. 3.14.Zn2+ depolarının belirlenmesi: düşük Na+ ve hücre dışı asidifikasyonun etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin sırasıyla düşük Na+ (10mM) içeren KREPS solüsyonu varlığında, 1µM ZnPT ve 50µM TPEN ile perfüze edildiklerinde elektrik alan uyarı altındayken verdikleri Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller ve bar grafik (A ve C). FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin sırasıyla düşük Na+ içeren KREPS solüsyonu varlığında, 10µM ZnCl2 ve 50µM TPEN ile perfüze edildiklerinde dinlenim durumunda verdikleri Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller ve bar grafik (B ve C). Kardiyomiyositlerin düşük Na+ içeren KREPS solüsyonu ile perfüze edildiklerindeki oluşturdukları transientlerin büyüklüklerinin karşılaştırılması (D). FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin elektrik alan uyarısı altındayken hücre dışı asidik pH’ta (pH=6,0) oluşturdukları Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller ve bar grafik (E ve F). Deneylerde kullanılan toplam hücre sayısı, n=7-12 ve *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

Şekil 3.15.Hücre içi serbest Zn2+ miktarına oksidasyonun etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin sırasıyla 100µM H2O2 ve 500µM DTT veya 50µM TPEN ile perfüze edildiklerinde elektrik alan uyarı altındayken verdikleri Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller (A). Uygulamalara ait değerler bar grafik olarak verilmiştir (B). Deneylerde toplam 4-5 hayvan kalbinden izole edilen 15-20 hücre kullanılmıştır ve *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

Şekil. 3.16.Hücre içi serbest Zn2+ miktarına oksidasyonun etkisi. FluoZin-3 ile yüklenmiş kardiyomiyositlerde H2O2 ve DTT’nin bazal floresans miktarındaki meydana getirdiği değişimlere ait örnek konfokal resimleri. Hücrelerden iki dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra bir grup hücreye 100µM H2O2 ve ardından 500µM DTT uygulanmıştır (A). Uygulamalara ait değerler bar grafik olarak verilmiştir (B). Deneylerde toplam 3 hayvan kalbinden izole edilen 5-7 hücre kullanılmıştır ve *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

Şekil 3.17.Hücre içi serbest Zn2+ miktarına nitrosadatif stresin rolü. FluoZin-3 ile yüklenmiş kardiyomiyositlerde nitrit oksit donörü NaNO2’nin ve gunalylyl siklaz inhibitörü olan ODQ’nun FluoZin-3 floresansında meydan getirdiği değişimlere ait örnek şekiller. Hücrelerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra bir grup hücreye 100µM NaNO2 ve ardından 50µM TPEN uygulanmıştır. Diğer grup hücreler ise 30 dakika boyuca 30µM gunalylyl siklaz inhibitörü olan ODQ ile inkübe edildikten sonra 100µM NaNO2 ve 50µM TPEN uygulanarak bazal floresanstaki

xiii

değişimin cGMP yolağı üzerindeki rolüne bakılmıştır (A). Uygulamalara ait değerler bar grafik olarak verilmiştir (B). Deneylerde kullanılan toplam hücre sayısı, n=5-9 Tüm değerler, başlangıç durumuna göre % değişim olarak verilmiştir. *P<0,05; bazala göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.18.Sıçan kardiyomiyositlerinde ZnPT inkübasyonlarının protein miktarlarına olan etkisi. Kontrol (KON) ve 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonuna ait grupların FKBP12.6 (A), CaMKII (B), PKA (C), RyR (D) protein miktarları için ortalama±SEM değerlerin bar grafik gösterimleri. Gruplara ait tüm western blot örnek resimleri bar grafik üstlerinde verilmiştir.

Şekil 3.19.Sıçan kardiyomiyositlerinde ZnPT inkübasyonunun fosforile protein miktarlarına olan etkisi. Kontrol (KON) ve 1 ve 10 µM ZnPT inkübasyonuna ait grupların pCaMKII (A), pPKA (B) ve pRyR (C) protein miktarları için ortalama±SEM değerlerin bar grafik gösterimleri. Gruplara ait tüm western blot örnek resimleri bar grafik üstlerinde verilmiştir. *P<0,05 vs KON grubuna göre, †P<0,05 vs +ZnPT1 grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.20.Sıçan kardiyomiyositlerinde ZnPT inkübasyonunun pCaMKII/CaMKII ve pPKA/PKA ve pRyR/RyR oranlarına olan etkisi. Kontrol (KON) ve 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonuna ait grupların pCaMKII/CaMKII (A), pPKA/PKA (B) ve pRyR/RyR (C) oranları ortalama±SEM değerlerin bar grafik gösterimleri. Gruplara ait tüm western blot örnek resimleri bar grafik üstlerinde verilmiştir. *P<0,05 vs KON grubuna göre, †P<0,05 vs +ZnPT1 grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.21.Hayvanların vücut ağırlıkları ve kan şekeri parametreleri. Kontrol, diyabet ve 5-hafta boyunca N-acetylcysteine cysteine (NAC) ile beslenmiş diyabetli hayvanların 1. ve 5. haftada kaydedilen vücut ağırlıkları ve kan şekeri parametreleri sırasıyla her grubun birinci ve ikinci kolonunda verilmiştir. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.22.Plazmadan ölçülen MDA seviyesi ve glütatyon miktarları. 5 hafta boyunca diyabet kalmış grupta kontrol grubu ile karşılaştırıldığında MDA seviyesi artarken GSH/GSSG oranı azalmıştır. N-acetylcysteine cysteine (NAC) ile 5 hafta boyunca beslenmiş olan diyabetli grup bu değerleri kontrol seviyesine getirmiştir. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.23.Serbest ve toplam protein thiol (SH)’larının belirlenmesi. 5 hafta boyunca diyabet kalmış grupta kontrol grubu ile karşılaştırıldığında protein serbest

xiv

SH miktarı azalmıştır. Aynı süre boyunca diyabet kalmış grupta N-Acetylcysteine (NAC) tedavisinin uygulanması bu değerleri kontrol seviyesine getirmiştir. Toplam SH miktarında ise gruplar arasında bir fark gözlenmemiştir. *p<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.24.Kontrol ve diyabet grubu sıçan kalplerinden izole edilen kardiyomiyositlerde hücre içi serbest Zn2+ belirlenmesi. 3 ay boyunca diyabet kalan grubun sitozolik Zn2+ miktarı kontrol grubu ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı derecede artmıştır. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.25.Hipergliseminin hücre içi serbest Zn2+ miktarına olan etkisi. Kontrol grubu kardiyomiyositlerin 4 saat boyunca 50mM glükoz (+GLU) ile inkübasyonu 3 ay boyunca diyabet olarak bekletilen sıçanlardan elde edilen kardiyomiyositlerdeki gibi kontrole göre anlamlı derecede artmıştır. Diyabet grubu hücrelerin 100nM insulin (+INS) ile inkübe edilmesi ise bazal Zn2+ miktarını kontrol seviyesine gerilemiştir. Deneylerde toplam 3 hayvan kalbinden izole edilen 10-15 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; KON6 grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.26.Kontrol ve diyabet grubu sıçan kalbinden izole edilen kardiyomiyositlerde FluoZin-3 (AM) boyası kullanılarak hücre içi serbest Zn2+ miktarlarının karşılaştırılması. Kontrol ve diyabet grubundan izole edilen kardiyomiyositler 1 saat boyunca 1mM NAC ile inkübe edilmişlerdir. Her seferinde eşit miktarda küvet içerisine yerleştirilen hücrelerden hücre içi serbest Zn2+ miktarlarına bakılmıştır. Değerler kontrol grubuna göre yüzde değişim cinsinden verilmiştir. Deneylerde toplam her grup için 3-5 hayvan kalbinden izole edilen 25-30 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; KON6 grubuna göre istatistiksel farkı göstermektedir.

Şekil. 3.27.Diyabetli sıçanların N-acetyl cysteine (NAC) ile beslenmesinin veya diyabetli kardiyomiyositlerin NAC ile inkübasyonunun hücre içi global Ca2+ veya Zn2+ değişimlerine olan etkisi. FluoZin-3 (alt) veya Fluo-3 (üst) ile yüklenen izole kardiyomiyositlerden elektrik alan uyarısı ile kaydedilen örnek Zn2+ ve Ca2+ transientleri (A). Kontrol (KON), diyabet (DM), NAC ile beslenmiş diyabetli grup (DM+NAC) ve 1 saat boyunca 1mM NAC ile inkübe edilen diyabetli gruptan kaydedilen Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin maksimum genlikleri (B). Her gruptan kaydedilen Zn2+ transientlerinin tepeye çıkış süreleri (TP) ve maksimumdan %50’ye iniş süreleri (DT50). Her gruptan kaydedilen Ca2+ transientlerinin tepeye çıkış süreleri (TP) ve maksimumdan %50’ye iniş süreleri (DT50). Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 21-34 hücre kullanılmıştır *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

xv

ÇİZELGELER

Çizelge 3.1. Kardiyomiyositlerden kaydedilen ICaL akımlarının yoğunluğu ve kinetik parametrelerinin değerleri.

1

1. GİRİŞ

1.1. Kalpte Hücre İçi Elektriksel Aktivite

En genel tanımla, iki atriyum ve iki ventrikülden oluşan dört gözlü bir yapıya sahip

olan kalbin memelilerdeki görevi taze kanı tüm dolaşım sistemine pompalamadır.

Pompa özelliğini sağlayan kasılabilme, kardiyomiyositlerin ortak özelliği olmasına

karşın, bu miyositler kalbin tümünde aynı özellikleri taşımazlar. Genel olarak

kardiyomiyositler atriyal, ventriküler ve uyarı-iletimde rol alan hücreler şeklinde üç

gruba ayrılırlar. Ancak buralar da kendi içlerinde farklı bölgelerde farklı özellikler

göstermektedirler (Guyton, 2007).

Kardiyomiyositler kalpteki tüm hücrelerin 1/3’ünü, miyokardın toplam hacminin

%75’ini oluştururlar. Kalp kası, biribirine interkale diskler adı verilen özelleşmiş

yapılarla bağlı çok sayıda miyokard hücrelerinden oluşur. Ventriküler miyositlerin

hacimlerine bakıldığında, hacmin yaklaşık yarısı miyofibrillerle, 1/3 ile 1/4 kadarı da

mitokondrilerle doludur. Kollajen bağ dokusu ile sarılan bir grup miyosit

miyofibrilleri meydana getirir ve miyofibriller de birbirlerine kollajen aracılığı ile

tutunurlar (Guyton, 2007).

Bir insan kalbinin normal fonksiyonunu yapabilmesi için, 80 yıldan daha fazla olmak

üzere günde 24 saat, dakikada ortalama 70 kez ritmik olarak atması gerekir. Yaklaşık

3 milyar civarında kasılan hücrelerle bir konsorsiyum şeklinde tüm kalbin

kasılmasını hatasız bir şekilde gerçekleşir. Kalpte uyarı bir noktadan başlayarak

iletim sistemi aracılığı ile tüm kalbe yayılır. Uyarının iletimi gedik-kavşak (gap-

junction) denilen hücreler arası bağlantılar yoluyla gerçekleşir. Elektriksel aktivitenin

bir kaç saniye bile olsa kaybolması, baygınlığa, uzun süre kaybolması ise, ölümle

sonuçlanabilecek olumsuz vakalara sebep olabilir (Klabunde, 2011; Schafer, 2012).

İyon kanalları, Na+ K+ Cl- ve Ca2+ gibi spesifik iyonların hızlı bir şekilde membran

boyunca ilerlemesini sağlayan membranın içi ile dışı arasında uzanan integral

2

proteinlerdir (Klabunde, 2011). Bu kanallar saniyede 108 iyonun membran içi ile dışı

arasında transferini sağlarlar. İyon kanallarının açılması ve kapanması voltaj-bağımlı,

ligand-bağımlı ve/veya reseptör-ilişkili olabilir. Bir kanalın herhangi bir şekilde

aktive olması, kanalın konformasyonunda değişime neden olacak ve kanalın

açılmasını veya kapanmasını sağlayacaktır. Kalpte dominant olarak Na+, K+ ve Ca2+

gibi voltaja duyarlı iyon kanalları mevcuttur. Membran potansiyelinin değişimine

bağlı olarak bu kanallar açılacak veya kapanacaktır. Diğer başka bir tür kanal ise

ligand-kapılı kanallardır. Bu kanallar hücre dışında nörotransmitterler veya hücre

içinde Ca2+ veya bazı nükleotidler ile aktive olan kanallardır. Reseptör-ilişkili veya

mekanik kapılı kanallar ise, gerginlik veya basınç gibi mekanik bir etkiye bağlı

olarak konformasyonunu değiştiren kanallardır (Nerbonne ve Kass, 2005; Goldman

ve Schafer, 2012).

Birçok iyon kanalının koordineli olarak aktivasyonu kalpte aksiyon potansiyelinin

(AP) oluşumuna katkı sağlar. Kalp ventrikül AP’nin toplam 5 fazı bulunmaktadır.

Dinlenim durumunda transmembran potansiyeli -90 mV civarındadır. Atriyum veya

ventrikül hücrelerinde dışarıdan bir uyarıya bağlı olarak hücrenin depolarize olması

sonucu, Na+-kanalları kapalı durumdan açık duruma geçer ve gradiyent

doğrultusunda Na+ iyonlarının hücre içine akmasıyla (INa) AP’nin hızlı bir şekilde

yükselen faz-0 aşaması oluşur. Bu aşamada depolarizasyon sonucu AP’nin

maksimum değeri +40 mV’a kadar ulaşabilir ve depolarizasyonun sonlarına doğru

Na+-kanalları inaktive olmaya başlarlar. Bununla birlikte K+-kanallarının açılmasına

bağlı olarak dışa doğru geçici akımlar oluşur (Ito). Bu aşamada hem Na+-kanallarının

inaktivasyonu nedeniyle hem de Ito akımları nedeniyle AP ani bir şekilde düşmeye

başlar. Bu an AP’nin faz-1 aşaması olarak adlandırılır (Klabunde, 2011).

Potansiyeldeki bu hızlı düşüş L-tipi Ca2+ kanallarının (LTCC; ICaL) akitvasyonuna

bağlı olarak Ca2+ iyonlarının hücre içine girmesi ile durur ve AP’nin faz-2 bölümünü

oluşturur. Bu plato fazına ICaL’nin dışında, yavaş aktive olan gecikmiş doğrultucu

K+-kanalları akımı (IKr ve IKs; IK) ve Na+/Ca2+ değiş tokuşçusu (NCX) akımı gibi

birçok akım katkıda bulunur. Bu fazın sonuna doğru Ca2+ kanalları inaktive olmaya

başlar ve dışa doğru K+-kanal akımları kuvvetlenir. Bu aşamadan sonra hızlı

repolarizasyonun oluştuğu faz-3 bölümüne geçilir. Bu fazda içeri doğrultucu K+-

3

kanalları, IK1 aktive olarak AP’ni dinlenim membran potansiyeline getirir. Son faz

olan faz-4 ise, kalbin diyastol durumunu temsil eder ve birçok hücrede -90 mV

civarında bulunan kısımdır (Şekil 1.1). Sinoatrial ve atrioventriküler nodlarda

bulunan özelleşmiş hücrelerde dinlenim membran potansiyeli -60 mV civarındadır.

Bununla birlikte, burada bulunan bazı kanallar nedeniyle oluşan akımlar (If akımları

gibi) spontan depolarizasyonu oluşturur (Mukherjee ve Spinale, 1999; Nerbonne ve

Kass, 2005; Goldman ve Schafer, 2012).

Şekil 1.1. Ventrikül aksiyon potansiyelinin evreleri ve onlara karşılık gelen iyonik akımlar (Mukherjee ve Spinale, 1999).

AP’ye katkıda bulunan pompalar da bulunmaktadır: Küçük bir akım oluşturmakla

birlikte Na+/K+ pompasının asıl işlevi akım üretmekten çok AP’yi oluşturacak iyonik

gradiyentleri korumaktır (Wahler, 1997). Bununla birlikte, (NCX) normal modunda

çalışarak, dışarı attığı her 1 Ca2+ için içeri 3 Na+ taşırken, plato evresinin

başlangıcında ters yönde çalışarak önemli bir akım oluşturmaktadır. Bu yüzden,

NCX’in AP’nin şekline de etkisi olduğu gösterilmiştir (Janvier ve Boyett, 1996) .

4

Kardiyak AP’nin şekli ve süresi kalbin her bölgesinde farklılık gösterir (Şekil 1.2).

Bir atriyal AP’nin süresi 100-200 ms arasında iken, ventriküler AP’nin süresi 250-

300 ms olabilmektedir. Bu süre farklılıkları sahip oldukları farklı tip iyon

kanallarından, zaman ve/veya voltaj-bağımlı özelliklerinin farklılarından ileri

gelmektedir. Aynı zamanda ventrikülün her tabakasında da farklı şekil ve sürelerde

AP görülmektedir. Kalbin epikardiyum bölgesinde, faz-1 endokardiyuma göre daha

hızlı olmaktadır. Epikardiyumda faz-2 aşaması gecikmiş doğrultucu akımların daha

az aktivasyonu nedeniyle endokardiyum ile karşılaştırıldığında daha kısa

sürmektedir. Miyokardiyum ise en uzun AP’nin görüldüğü bölgedir (Schafer, 2012).

Atriyum ve ventrikül yanında purkinje liflerinde de faz-0 aşaması çok hızlı

görülmektedir. Bunun en önemli nedeni, sahip oldukları voltaj-duyarlı Na+-

kanallarının aktivasyonudur. Sinoartiyal nodda (SAN) ve atriyoventriküler nodda

(AVN) ise, faz-0 aşaması oldukça uzundur. Bu da gösteriyor ki, voltaj-duyarlı Na+-

kanalları depolarizasyonda önemli bir role sahip değildir. Buna rağmen yapılan

çalışmalarda SAN ve AVN hücrelerinde de bu kanallara rastlanmıştır (Munk ve ark.,

1996; Fozzard ve ark., 2002). Atriyum, ventrikül ve purkinje liflerinde faz-0 ve faz-1

aşaması sırasıyla INa ve Ito ile devam eder. Faz-1 aşamasında bu hızlı repolarizasyon

ventrikül ve purkinje liflerinde atriyuma göre daha dominanttır. Atriyoventriküler

hücrelerinde faz-2 aşamasında rol alan ICaL, SAN ve AVN hücrelerinde

depolarizasyonda rol oynamaktadır. Aynı zamanda diğer bir tip Ca2+ kanalı olan

voltaj-duyarlı transient Ca2+ kanalları da (T-tipi Ca2+ kanalları, ICaT)

depolarizasyonda rol oynamaktadır. Ventriküler ve atriyal miyokardiyumda plato

fazında K+’un hücre dışına doğru sürücü kuvvetinden dolayı, Ca2+ kanallarının

inaktivasyonuyla birlikte hızlı bir repolarizasyon süreci başlar. Bu faz-3 aşamasında

rol alan çeşitli K+ kanalları mevcuttur (IKr, IKs, IK1). SAN ve AVN’da ise daha yavaş

aktive olan K+ kanalları bulunmaktadır (IKr, IKs gibi). Bu farklı kanal kompozisyonu

nedeniyle kalbin her bölgesinde farklı şekil ve sürelerde AP görülmektedir

(Nerbonne ve Kass, 2005).

5

Şekil 1.2. Üstte kalbin farklı bölgelerinde gözlenen aksiyon potansiyeli desenleri, altta ise, vücut yüzeyinden kaydedilen bileşik aksiyon potansiyeli, EKG görülmektedir. (Jeanne ve Kass, 2005).

1.2. Kalpte Uyarılma-Kasılma Çiftleniminde Rol Oynayan Mekanizmalar

Kalbin pompalama işlevini yerine getirmesi, sarkolemmanın elektriksel olarak

uyarılmasıyla başlayıp hücrenin kasılmasıyla son bulan olaylar zinciri (uyarılma-

kasılma çiftlenimi) ile gerçekleşmektedir. Uyarılma-kasılma çiftlenimi, AP

sarkolemmayı depolarize ettiği zaman başlamış olur (Katz, 2006).

1.2.1. Pacemaker Potansiyeli ve Sol Ventikülde Aksiyon Potansiyelinin

Oluşması

Kalp kasında uyarıların başladığı ve diğer bölgelere iletildiği özel bir sistem vardır.

Bu sisteme kalbin uyarı ve ileti sistemi denir. Kalp kası hücrelerinin özelleşmesi ile

SAN, AVN, his demetleri ve purkinje lifleri oluşmuştur. Kalpte bulunan primer kalp

6

atımını sağlayan hücreler SAN’da yer almaktadır. SAN’lar dakikada 70-80 kez,

AVN’ler dakikada 40-60 kez, his demetleri ve purkinje lifleri ise daha düşük

dakikada 15-40 kez kendiliğinden impuls oluşturabilme özelliğine sabittir. Kalbin

normal çalışmasında uyarının çıktığı yer SAN’lardır. Burada bulunan hücrelerin sabit

bir membran potansiyeli yoktur. Kalpte bulunan atriyal ve ventriküler hücrelerinin

aksine AP’nin depolarizasyon fazında hızlı INa yerine daha yavaş ICaL’ları rol

oynamaktadır. Burada hızlı INa yer almaz (Nerbonne ve Kass, 2005).

Şekil 1.3. Sinoatriyal nod hücrelerinde (SAN) hücrelerinde ve ventrikül hücrelerinde AP ve bu sürece katılan iyonların iletkenliklerinin karşılaştırılması.

SAD’da gözlenen AP toplamda 3-fazdan oluşmaktadır. Faz-4 aşaması AP’yi

tetikleyen spontan depolarizasyonun olduğu kısımdır. Repolarizasyon fazının

sonunda AP yaklaşık olarak -60 mV’a gelir. Bu değerde yavaş içeri doğrultucu Na+-

kanalları (If) açılır. Bu kanallardan oluşan akımlara ‘funny currents’ denir. Bu

kanalların açılması ile membran yavaşça depolarize olmaya başlar. Daha sonra

membran potansiyeli -50 mV’a geldiğinde diğer içeri doğrultucu bir kanal olan T-tipi

Ca2+ kanalları açılır. Ca2+ iyonları elektrokimyasal gradyent doğrultusunda hücre

içine doğru girmeye başlar (ICaT). Bu kanalların açılmasına takiben diğer bir Ca2+

kanalı olan LTCC açılarak daha fazla Ca2+ iyonun (ICaL) hücre içine girmesine neden

olur ve faz-0 aşaması oluşur. Faz-3 aşaması repolarizasyon dönemini temsil eder. Bu

dönemde K+-kanallarının açılmasına bağlı olarak zarın K+’una iletkenliğini artar ve

K+ iyonları hücre dışına akmaya başlar (IK). Bu aşamada LTCC inaktive olur ve Ca2+

7

iletkenliği azalır. Şekil 1.3’de ventrikül hücrelerinde ve SAN hücrelerdeki AP ve

iletkenlikler karşılaştırılmıştır. (Nerbonne, ve Kass, 2005).

SAN’tan çıkan uyarı ilk olarak atriyum kasını uyarır sonra AVN’a geçer. Atriyumda

iletim hızı yaklaşık 0,5 m/s’dir. Uyarı AVN’a geçerken biraz yavaşlar ve iletim hızı

0,05 m/s’ye düşer. Böylelikle ventrikülün depolarizasyonu ve ardından

kasılmasından önce, atriyumun depolarizasyon ve kasılma periyodunun

tamamlanması için yeterli süreyi sağlar. İleti bundan sonra his demetlerine ve his

demetlerinin sağ ve sol dallarına geçerek sağ ve sol ventrikül kasındaki purkinje

sistemine ulaşır. Burada iletim hızı AVN’a göre oldukça hızlıdır. His demetlerinde

ve purkinje liflerinde iletim hızı sırasıyla 2 ve 4 m/s’dir. Uyarının atriyum kasında

yayılması sonucunda atriyum sistolü, ventrikülde yayılması sonucu ventrikül sistolü

meydana gelir. Atriyum sistolünden sonra, atriyum içindeki kan ventrikülere,

ventrikül sistolünden sonra ise kan aort ve pulmaner arterlere pompalanır (Klabunde,

2011).

Şekil 1.4. AP’nin Sinoatriyal nodda (SAN)’da oluşması ve Atriyoventriküler nod (AVN), atriyum ve ventrikülere yayılması.

8

1.2.2. Kardiyomiyositlerde Hücre İçi Ca2+ İyon Artışı ile İlgili Mekanizmalar

Uyarılma-kasılma çiftleniminde depolarizasyona bağlı olarak voltaj bağımlı LTCC

açılması ile az miktar Ca2+ iyonu hücre içine doğru girmeye başlar (ICaL). Bu Ca2+

girişi sarkoplazmik retikulum (SR) üzerinde bulunan kardiyak riyanodin

reseptörlerinin (RyR2) aktivasyonunu sağlar. Bu aktivasyon ile birlikte RyR2’den

daha fazla miktarda Ca2+ salınması gerçekleşir (Santana ve ark., 2002; Chakraborti

ve ark., 2007). Genellikle, SR’dan Ca2+ salınımının temel mekanizması kabul edilen

bu olaya “Ca2+–uyarımlı Ca2+–salımı” (CICR) denir (Fabiato ve ark., 1983; Niggli ve

Lederer, 1990, Bers, 2002; Bracken ve ark., 2003). Bunu takiben, 50 ms’den daha

kısa bir süreç içerinde sitozolik Ca2+ miktarı 10-100 kat kadar artar. Bu salınan Ca2+

hücre içinde miyofilamanlar boyunca yayılır ve Ca2+’un troponinC’ye bağlanması ile

kasılma işlemi başlar (Şekil 1.5).

Şekil 1.5. Ventrikül hücrelerinde Ca2+ düzenlenmesi. Alt grafik aksiyon potansiyeli, Ca2+

transienti ve kasılmanın zamansal değişimlerini göstermektedir. NCX, Na+/Ca2+ değiştokuşcusu; ATP, ATPaz; PLB, fosfolamban; SR, sarkoplazmik retikulum (Bers, 2002).

9

1.2.3. Kardiyomiyositlerde Kayan Filamanlar Modeli

Kasılma fonksiyonunun gerçekleşmesinde en önemli adım hücre içi serbest Ca2+

konsantrasyonunun artmasıyla başlar. Daha önce anlatıldığı gibi, kasılmanın

başlaması, membranın depolarizasyonunu takiben LTCC aracılığıyla hücre içine

Ca2+ girişi ile birlikte SR yüzeyindeki RyR2’den çok daha büyük bir Ca2+ salımına

yol açar. Kasılmada rol alan diğer elemanlar ise kontraktil proteinler adı verilen aktin

ve miyozinlerdir. Bu proteinler hem kasılma da hem de gevşemede rol alırlar (Katz,

2006).

Şekil 1.6. Sarkomer organizasyonu ve kardiyak kasılma olayının şematik diyagramı. Solda kalp kasılması sırasında sarkomerlerin aldığı pozisyon sağda ise bu olayı gerçekleştiren aktin ve miyozinlerin biribiri üzerinden kayma şekli gösterilmiştir (Seidman ve Seidman, 2001).

Kasılma-gevşeme süreçlerinde rol alan iki temel kontraktil protein aktin ve miyozin

flamanlarıdır. Diyastolik durumda miyozin başları ile aktinler birbirleri ile temas

halinde değildirler. Bunun nedeni aktin üzerinde bulunan tropomyozinin miyozin

başlarının bağlanacağı bölgeyi kapatmasından dolayıdır. Tropomiyozin üzerinde 3

protein daha bulunmaktadır. Bunlar troponin I, troponin C ve troponin T’dir.

Miyozin başlarının aktindeki bölgeye bağlanması için, Ca2+’ un troponin-C’ ye

bağlanarak troponin-I’nın inhibisyonunun ortadan kalkması gereklidir. Sitozolik Ca2+

seviyesi düşük olduğunda, tropomiyozin kompleksi miyozin başları aktin ile

etkileşemez (Katz, 2006). Sitozolde Ca2+ miktarı arttığı zaman, Ca2+ troponin-C ile

etkileşir. Aktive olan troponin-C inhibitör molekül troponin-I’ya kuvvetli bağlanır.

Bu durum ince flament üzerinde troponin-M (tropomiyozin)’ nin repozisyonuna

10

neden olur, aktin-miyozin etkileşiminde troponin-M ile yapılan etkileşme ortadan

kalkar. Böylece çapraz köprü çevrimi başlar (Şekil 1.6).

Kasın kasılmasında kontraktil proteinler dışında ve Ca2+ dışında, ATP’ de çok

önemli rol oynamaktadır. Çeşitli fosforilasyonlar sonunda SR’ dan salınan Ca2+ ,

miyozinde bulunan ATPaz’ı aktif hale geçirerek ATP’ nin hidrolizine neden olur.

Açığa çıkan ATP enerjisi miyofibrillerin etkileşmesini ve biribiri üzerinden

kaymasını sağlayarak kasılmayı oluşturur (Bers, 2002).

1.2.4. Kardiyomiyositlerde Gevşeme Süreci ve Rol Alan Mekanizmalar

RyR2’lerden salınan Ca2+ troponin C’ye bağlandıktan kısa bir süre sonra buradan

ayrılır ve gevşeme başlar. Ca2+, fosfolambanın (PLB) regüle ettiği Ca2+-ATPaz

(SERCA2a) pompası tarafından SR içerisine tekrar geri alınır. Aynı zamanda trans-

serkolemmal Ca2+ uzaklaştırma işlemi, plazma membranı üzerinde bulunan düz

modda çalışan NCX ve Ca2+ pompası tarafından gerçekleşir ve hücre içi serbest Ca2+

miktarı dinlenim seviyesine düşer (Wahler, 1997; Bers, 2002; Bracken ve ark., 2003;

Chakraborti ve ark., 2007).

NCX’in Ca2+ taşıma yönü, Na+ gradiyenti, Ca2+ gradiyenti ve membran potansiyeli

tarafından belirlenir. Kardiyak AP süresince Na+ iyonu Na+ kanalları aracılığıyla

girer ve subsarkolemmal bölgede birikmeye başlar. Na+’un bu bölgede

birikmesinden dolayı NCX ters modda çalışmaya başlar ve Na+’u hücre dışına

atarken Ca2+’un hücre içine girmesine sebep olur (Chakraborti ve ark., 2007).

11

1.3. Patolojik Kalp ve Ca2+ Homeostazı Arasındaki İlişki

1.3. 1. Ca2+ ve Kardiyak Fonksiyon Bozukluğu

Karakteristik olarak, kalp hastalıklarında en sık görülen durum, yeterli kan

pompalamada meydana gelen bozukluklardır. Kan pompalama fonksiyonu kalbin

kasılma fonksiyonları ile ilişkilidir (Santonastası ve Wehrens, 2007). Kalpte Ca2+’ a

bağlı sinyal mekanizmalarının varlığı ve önemi çok önceki yıllarda bulunmuştur.

Sitozolik Ca2+ konsantrasyonundaki değişimler, kas kasılmasında, hücre

bölünmesinde, apoptozizde, nörotransmiter salınımı gibi olaylarda önemli rol

oynamaktadır (Bers ve ark., 2003). Hücre içi Ca2+’un kalpteki en önemli rolü kas

kasılması içindir. AP’nin başlamasını takiben SR’da depolanmış olan Ca2+, SR’dan

salınarak kasılma fonksiyonunu başlatır. Ca2+ salınımında meydana gelen herhangi

bir bozukluk kasılma fonksiyonunu direkt olarak etkileyecektir. Aynı şekilde kasılma

sonrası Ca2+‘un hücre içinden uzaklaştırılmasında meydana gelen bir sorun, kas

gevşemesinde bir başka soruna da neden olacaktır. Yeterli gevşeyememe ise, kalbin

bir sonraki atımında yeteri kadar kanın ventriküllere dolamamasına ve böylece daha

az miktarda kanın pompalanmasına neden olacaktır (Bers ve ark., 2003; Chakraborti

ve ark., 2003; Santonastası ve Wehrens, 2007).

Kasılma ve gevşemede rol alan birçok mekanizma bulunmaktadır. AP’nin

başlamasıyla birlikte hücre içine Ca2+, LTCC aracılığı ile girerek CICR olayını

başlatır. Bu nedenle kalp rahatsızlıklarında bu kanalların önemli bir rolü olabileceği

düşünülmüştür (Marin-Garcia, 2010). Çeşitli hastalık modelleri kullanılarak yapılan

çalışmalarda ICaL’da bir değişimin olmadığı gözlenmiştir (Yaras ve ark., 2005;

Marin-Garcia, 2010). Aynı zamanda yapılan bazı çalışmalarda kalp rahatsızlığı ile

birlikte LTCC ekspresyonunda artışın olduğu gözlense bile çoğu çalışmada ise bir

değişimin olmadığı bulunmuştur (Bodi ve ark., 2005; Wang ve ark., 2005).

CICR olayının ikinci aşamasını SR membranı üzerinde bulunan ve kardiyak

izoformu olan RyR2’ler oluşturur. Şekil 1.7’de gösterildiği gibi, RyR2’ler

kalmodülin (CaM), FK506-bağlayıcı protein FKBP12.6 (calstabin2), protein kinaz A

12

(PKA) CaM-bağımlı kinaz II (CaMKII), fosfotaz 1 ve 2A, fosfodiesterazlar, junctin,

triadin ve calsequestrin (CSQ) gibi çeşitli regüle edici proteinlerden oluşan 565 kDa

ağırlığında makromoleküler bir yapıdır. RyR2’nin kanal davranışı, birçok protein

(CaM, FKBP12.6, PKA) ve ligand (Ca2+, ATP, Mg2+) tarafından belirlenir

(Santonastası ve Wehrens, 2007). RyR2 üzerinde bulunan FKBP12.6 küçük bir

protein olup RyR2’nin kapı fonksiyonunda önemli bir role sahiptir. Yapılan

çalışmalarda, bu protein miktarındaki azalma RyR2’lerin konformasyonunda bir

değişime ve Ca2+ sızıntısına neden olduğu gösterilmiştir (Yaras ve ark., 2005;

Santonastası ve Wehrens, 2007). Çeşitli kalp hastalıkları modellerinde RyR2

fonksiyon bozukluğundan bahsedilir. Ventriküler aritmi görülen ve ani kalp ölümü

gerçekleşen hastalarda irsi RyR2 gen mutasyonlarına rastlanmıştır (Santonastası ve

Wehrens, 2007). Bu gen mutasyonlarının dışında, klinik ve deneysel çalışmalarda

kalp rahatsızlığı modellerinde, PKA ve CaMKII’nin aktivitelerinde artışın olduğu ve

bu hiperaktif PKA ve CaMKII’nin RyR2’leri hiperfosforile ederek fonksiyonunda

değişimlere neden olduğu gösterilmiştir (Yaras ve ark., 2005; Santonastası ve

Wehrens, 2007; Tuncay ve ark., 2013). RyR2’lerin fosforilasyonu ile birlikte,

diyastolik Ca2+ sızıntısı, Ca2+ spark frekansında artış, sistolik Ca2+ transientlerinde

azalma görülmüştür (Kim ve ark., 2001; Choi ve ark., 2002; Bidasee ve ark., 2003;

Yaras ve ark.,2005; Ozdemir ve ark.,2005; Bai ve ark., 2012). Bu istenmeyen SR

kaynaklı diyastolik Ca2+ sızıntısı, aritmilere ve anormal kalp kasılmalarına neden

olmaktadır.

Kardiyomiyositlerde SR içinde en fazla miktarda bulunan Ca2+ bağlayıcı protein

calsequestrin, CSQ’dur. CSQ ile RyR2 arasında fiziksel bir bağ bulunmaktadır. Bu

bağ RyR2’lerden salınan Ca2+ miktarını kontrol eder. SR içerisinde CSQ tek Ca2+

bağlayıcı protein değildir. Aynı zamanda sarcalumenin, calumenin gibi proteinlerde

Ca2+ bağlarlar. Kalp hastalıklarında, bu Ca2+ bağlayıcı protein miktarlarında azalma

olduğu gözlenmiştir. Bu azalmanın diyastolik Ca2+ seviyesinde artışa neden

olabileceği düşünülmektedir (Kranias ve Bers, 2007). Ca2+’un geri alınımından

sorumlu olan SERCA, PLB tarafından kontrol edilmektedir. SERCA’nın fonksiyonu

PLB tarafından inhibe edilmektedir. PLB’nın inhibitor etkisi PKA ve CaMKII

tarafından fosforile edildiğinde ortadan kalkmaktadır. Kardiyomiyopati oluşturulan

13

hayvan modellerinde SERCA’nın protein seviyesinde azalmanın olduğu veya

değişmediğini gösteren çalışmalar mevcuttur (Tuncay ve ark., 2013; Chakraborti ve

ark., 2007). Aynı zamanda yine kardiyomiyopati oluşturulan hayvan modellerinde,

PLB fosforilasyonun arttığını veya azaldığını gösteren çalışmalar da bulunmaktadır

(Tuncay ve ark., 2013; Chakraborti ve ark., 2007).

Şekil 1.7. Kardiyak hücrelerde SR üzerinde bulunan RyR2’ nin şematik gösterimi. RyR2’ler calmodulin (CaM), FK506-bağlayıcı protein FKBP12.6 (calstabin2), protein kinaz A (PKA) CaM-bağımlı kinaz II (CaMKII), fosfotaz 1 ve 2A, fosfodiesterazlar, junctin, triadin ve calsequestrin (CSQ) gibi çeşitli regüle edici proteinlerden oluşan 565 kDa ağırlığında makromoleküler bir yapıdır. RyR2’nin kanal davranışı, birçok protein (CaM, FKBP12.6, PKA) ve ligand (Ca2+, ATP, Mg2+) tarafından belirlenir (Chakraborti ve ark., 2003).

Kardiyomiyositlerde Na+/Ca2+ değiştokuşcusu (NCX), Ca2+’u hücre dışına atan temel

plazma membran proteinidir. Çalışma yönü ve hızı tamamen hücre içi ve dışında

Na+, Ca2+ iyonları ve membran potansiyeli ile belirlenir. Bu değiştokuşçunun

kardiyomiyositlerdeki asıl görevi, Ca2+’u hücre dışına atmaktır. Aynı zamanda bu

proteinin fosforilasyonu çalışmasını önemli derecede etkileyecektir. Bununla birlikte

Ca2+ ATPaz’da Ca2+’un atılmasında ikinci önemli role sahiptir. Özellikle kalp

hastalıklarında NCX miyokardiyal kasılma fonksiyonlarında önemli bir role sahip

olmaktadır. Kalp hastalıklarında NCX aktivitesinde azalma olduğu gösterilmiştir

(Tokimoto ve ark., 2002). Hipoksi oluşturulan hücrelerde, NCX’in ters modda

çalışmasının artması ve buna bağlı olarak Ca2+ girişindeki artış hücre hasarlarına

14

neden olduğu gösterilmiştir (Rahamimoff, 1990). Kalp yetmezliği bulunan hastalarda

veya hayvan modellerinde yapılan çalışmalarda, kalpte NCX’in ekspresyon

seviyesinin arttığı, SERCA’nın azaldığı, buna ters olarak, hipertriodi olan hastalarda

ise, NCX’in ekspresyon veya protein seviyesinin azaldığı, SERCA2a’nın ise arttığı

gösterilmiştir (Tuncay ve ark., 2013; Tokimoto ve ark., 2002).

1.3.2. Kalp Fonksiyon Bozukluğu ile Hücre İçi Na+ ve H+ İyonları İlişkisi

Diyabet ve iskemi çalışmalarında, Ca2+ homeostazında meydana gelen değişimlerde

Na+/H+ değiştokuşçularının (NHE) ve NCX’in önemli bir role sahip olduğu

gösterilmiştir (Anzawa ve ark., 2012). Özellikle iskemide ve diyabette, hücre içi Na+

artışı, görülen önemli bulgulardan biridir. Hücre içi Na+ artışı NHE’nin çalışmasına

bağlı olarak arttığı ve bu artışın NCX’in ters modda çalışmasını arttırarak sitozolik

Ca2+ birikimine neden olduğu gösterilmiştir (Allen ve Xiao, 2003; Chakraborti ve

ark., 2007; Anzawa ve ark., 2012). İskemide oksidatif fosforilasyona bağlı olarak

anaerobik glikoliz hızlanacaktır. Bununla birlikte, laktat ve proton glikoliz ürünleri

oluşarak çok kısa bir süre içerisinde asidoziz meydana gelecektir. Hücre içi asidoziz,

NHE, Na+-HCO3- kontrasporterlarını uyararak H+’nın dışarı atılımını ve Na+’un içeri

alımını arttıracaktır. Buna bağlı olarak ise, hücre içi Na+ miktarı artacaktır (Şekil

1.8). Bu durum NCX’in çalışmasını önemli derecede etkileyecektir. Çünkü NCX’in

çalışma yönü ve hızı tamamen hücre içi ve dışında Na+, Ca2+ iyonları ve membran

potansiyeli ile belirlenir (Allen ve Xiao, 2003).

Hücre içinde artan Na+, NCX’in ters modda çalışmaya zorlayacaktır ve bu durumda

Ca2+’u hücre içine atacaktır. Hücre içinde artan Ca2+ ise daha önce anlatıldığı gibi,

birçok mekanizmayı aktive ederek hücre hasarlarına neden olacaktır.

15

Şekil 1.8. Na+ ve pH regülasyonunda rol alan yolakları gösteren şematik diyagram. (Allen ve Xiao, 2003).

1.3.3. Kalp Fonksiyon Bozukluğu ile Hücre İçi Zn2+ İyonu ile İlişkisi

Zn2+ genel bir tanım ile fizyolojik öneme sahip bir hücre içi iyon olup farklı

hücrelerde farklı ve çeşitli hücre içi mekanizmalarda ve temel hücre fonksiyonunda

önemli rol oynadığı uzun yıllardan beri bilinmektedir. Zn2+, biyolojik sistemlerde,

yapısal/regülatör metallo-proteinlere bağlı veya histokimyasal olarak reaktif olmak

üzere iki farklı durumda bulunur. Fizyolojik koşullarda, hücre içi serbest Zn2+

derişimi ([Zn2+]i) sıkı kontrol altında regüle edilmekte buna karşın dinamik olarak da

düzensiz bir şekilde hücre içinde değişebildiği hipotezlenmektedir.

Özellikle son yıllarda insan genomlarında yapılan biyoinformatik çalışmalarında

Zn2+ ’nun sitozolde bulunan tüm proteinlerin %10’ununa bağlı olarak bulunduğu

gösterilmiştir (Vallee ve Falchuk, 1993). Transkripsiyon faktörleri ve enzimler gibi

birçok proteinin yapısında bulunan Zn2+ yapısal ve fonksiyonel kofaktör olarak görev

almaktadır. Hücre içinde [Zn2+]i 1-nM’dan daha düşük değerlerde (Turan ve ark.,

1997; Ayaz ve Turan, 2006) bulunmasına karşın, bu iyonunun çok büyük oranı

proteinlere bağlı kofaktör olarak görev yapmaktadır. Kalp kasındaki toplam

çinkonun %70’lik kısmı hücre içinde kompartmanlaşmış durumdadır. Kısaca, 30%

çekirdekte ve %50 si ise sitozolde ve organellerde, geri kalan kısmı ise sitozoldeki

proteinlere bağlı olarak bulunmaktadır (Vallee ve Falchuk, 1993). Son zamanlarda

yapılan çalışmalarda Zn2+ ‘nun tıpkı Ca2+ gibi depoları olduğu, bu depolara girişi-

16

çıkışının mevcut olduğu (ZIP’ler ve ZnT’ler ile) hipotezlenmiş ve gösterilmiştir

(Fukada ve Kambe, 2011; Hershfinkel ve ark., 2001, 2009; Nitzan ve ark., 2002;

Stork ve ark., 2010).

Hücre içi çeşitli proteinlerden Zn2+ salınarak, çeşitli sinyal yolaklarını, mitokondrial

metabolizmayı ve hücrenin redoks durumunu etkileyebilir. Çeşitli

konsantrasyonlarda Zn2+ antioksidant kapasiteyi arttırmakta veya toksik reaktif

oksijen türlerinin salınmasına neden olabilmektedir (Little ve ark., 2010; Tuncay ve

ark., 2010). Zn2+ finger proteinleri Zn2+’ya çok büyük bir afinite ile bağlanırlar. Bu

nedenle hücre içi Zn2+ miktarı çok düşük değerlerde kalır. Toplam Zn2+

konsantrasyonu, bu yüksek afiniteli proteinlerden dolayı, çok etkilenmeyecektir

(Little ve ark., 2010). Yani toplam hücresel Zn2+ konsantrasyonundan çok, serbest

hücre içi Zn2+ konsantrasyonu fizyolojik açıdan önemli olacaktır.

Kalp yetmezliği olan hastalarda yapılan çalışmalarda, serum Zn2+ seviyesinin düşük

olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, diyabetik sıçanlarda yapılan çalışmalarda,

serum Zn2+ seviyesinin arttığını, azaldığını veya değişmediğini, hücre içi Zn2+

seviyesinin ise arttığını gösteren bulgular bulunmaktadır (Ayaz ve Turan, 2006;

Little ve ark., 2010). Bu sonuçlar da gösteriyor ki, Zn2+ transport mekanizmasında

meydana gelen değişimler hücre içi ile dışı arasındaki Zn2+ seviyesindeki değişimlere

yol açabilmektedir (Little ve ark., 2010).

Zn2+’nun insulin kristalinin bir parçası olduğu 1934 yılından beri bilinmektedir. Bu

nedenle, Zn2+ ve diyabet arasındaki ilişki her zaman önemli bir konu olmuştur

(Jansen ve ark., 2009). Diyabetik kardiyomiyopati hem tip 1 hem de tip 2 diyabetli

hastalarda görülen sol ventrikül yetmezliği geliştiğinde klinik tedavi gerektiren

önemli ve kompleks bir metabolik hastalıktır. Bu süreçlerin moleküler ve hücresel

mekanizmaları tam olarak bilinmemesine karşın, hücre içi Ca2+ ve Zn2+

mekanizmasının ve bu mekanizmada rol alan oyuncuların bozulmuş olduğu en

önemli bulgular arasındadır (Ayaz ve ark., 2004; Ayaz ve Turan, 2006). Günümüzde

artan oksidatif stresin diyabetik kardiyomiyopatinin gelişmesinde önemli rol

oynadığı bilinmektedir. Oksidant stresin proteinlerin tiyol bağlanma bölgelerinden

17

Zn2+’ nin serbestleşmesini tetiklediği ve oksidant stres ile Zn2+ salan önemli bir

hücresel molekülün PKC olduğu ve diyabette PKC’nin aktive olduğu (Korichneva ve

ark. 2002) gösterilmiştir.

Ayrıca, önceki çalışmalarda diyabetli sıçan kalbi fonksiyon bozukluğunda hücre içi

serbest Ca2+ konsantrasyonun ([Ca2+]i)’ deki artışa paralel olarak hücre içi serbest

Zn2+ konsantrasyonu ([Zn2+]i)’ nun da arttığı ve bunun kardiyomiyositlerde değişmiş

olan MT seviyesi yanında artmış olan oksidant strese ve azalmış olan antioksidan

savunma mekanizmasına bağlı olduğu gösterilmiştir (Ayaz ve Turan, 2006).

Kardiyomiyositlerde [Zn2+]i artışının, kalp kasılmasında önemli rol oynayan L-tipi

Ca2+ kanal akımlarını bloke ettiği gösterilmiştir (Alvarez-Collazo ve ark., 2012).

Aynı zamanda, yine kasılma fonksiyon bozukluğunun belirtilerinden en önemlisi

olan Ca2+ transientlerininde azaldığı gösterilmiştir. Yine yapılan bir başka çalışmada,

kardiyoplejik solüsyona Zn2+ eklenmesi, kalbin sistolik fonksiyonlarını azaltırken,

tam tersine iskemi-reperfüzyon hasarı sonucu azalan sistolik ve diyastolik

fonksiyonları arttığı gösterilmiştir (Yi ve ark., 2013).

1.4. Kardiyomiyositlerde Hücre İçi Zn2+ Homeostazı ve Etkili Mekanizmalar

Fizyolojik koşullardaki [Zn2+]i ile [Ca2+]i karşılaştırıldığında [Zn2+]i‘in 100 kat daha

az ve HT29, beta ve HEK hücrelerinde olduğu gibi kardiyomiyositlerde de 1-nM

veya daha düşük değerlerdedir (Alvarez-Collazo ve ark., 2012; Bellomo ve ark.,

2012). Ancak kardiyomiyositlerde [Zn2+]i diyabette %70, aldostronizmde % 200’den

daha fazla miktarda artış göstermiştir (Ayaz ve Turan, 2006; Kamalov, 2010).

Memeli hücrelerinde [Zn2+]i homeostazı, hücre içine alınımı, atılımı, depolanması

gibi süreçleride içeren olayları, farkı proteinler ile koordineli bir şekilde regüle

edilmektedir.

18

Şekil 1.9. Memeli hücrelerinde Zn2+ taşıyıcılarının ve metalationin (MT)’lerin hücresel yerleşimini gösteren şekil. Zn2+’u sitozole taşıyanlar (ZiP) mavi renk ile sitozolden uzaklaştıranlar (ZnT) siyah renk ile gösterilmiştir. Metal-responsive-element binding transcription factor, MTF1 olarak kısaltılmıştır (Fukada ve ark., 2011).

Zn2+’nun hücre dışından içeri girişinin hangi yolaklar ile olabileceğine yönelik ilk

çalışmalar, LTCC aracılığı ile olabileceği yönünde olmuştur (Atar ve ark., 1995).

Kalp hücreleri kullanılarak yapılan çalışmalarda, Zn2+’nun LTCC’a afinitesinin

Ca2+’dan çok fazla olduğu ve bu kanalların Zn2+’yu geçirdiği görülmüştür.

Nöronlarda ise, hem LTCC hem de N-tipi Ca2+ kanallarından Zn2+ geçebileceği

görülmüştür (Atar ve ark., 1995; Kerchner ve ark., 2000; Alvarez-Collazo ve ark.,

2012). Bu çalışmalardan sonra, Zn2+’ nun kendine ait bir kanalının olabileceği

düşüncesiyle bazı çalışmalar başlamıştır ve günümüze kadar Zn2+’u sitozole taşıyan

(ZiP) 14 farklı ve sitozolden uzaklaştıran (ZnT) 10 farklı Zn2+ taşıyıcısı

tanımlanmıştır (Lichten ve Cousins, 2009). Bunlardan bazıları plazma membranında

yer alırken (ZiP1-6,8,10,14 ve ZnT1), bazıları insulin granüllerinde (ZnT5 ve ZnT8),

golgide (ZnT5,6,7 ve ZiP13), endozomda (ZnT4), lizozomda (ZnT2), sinaptik

veziküllerde (ZnT3) yer almaktadır (Lichten ve Cousins, 2009; Fukada ve ark.,2011).

En son olarak ise, önemli bir Zn2+ deposu olarak düşünülen endoplazmik

retikulumda (ER) ZnT1 ve ZiP7’lerin bulunduğu gösterilmiştir (Taylor ve ark.,

2012).

19

Metallotioninler (MT) bilinen en büyük Zn2+ deposudur. Ancak son yıllarda yapılan

çalışmalar ER ve mitokondrininde bir Zn2+ deposu olabileceği yönündedir (Sensi ve

ark., 2003; Stork ve ark; 2009; Taylor ve ark., 2012). Zn2+’nun bu depolardan

salınıması, oksidatif stres, enzimler veya Ca2+ aracılığı ile olabileceği yönündedir

(Alvarez-Collazo ve ark., 2012; Taylor ve ark., 2012).

Serbest Zn2+ çeşitli iyon kanallarını, membran reseptörlerini ve taşıyıcıları modüle

edebilmektedir. Zn2+’nun G-çiftlenimli (coupled) reseptörlere bağlanarak aktive

edebildiği veya ligandıyla olan etkileşimini arttığı yapılan çalışmalar arasındadır

(Shariri ve ark., 2010). Zn2+ LTCC akımlarını bloke etmekte ve NCX’in

modülasyonunu sağlamaktadır (Alvarez-Collazo ve ark., 2012; Yi ve ark., 2012).

Diğer yandan, her ne kadar Zn2+ fosfotaz aktivitesi için gerekli olsa da, serbest Zn2+

konsantrasyonundaki artış fosfodiesterazları inhibe etmektedir. Bunlardan en

önemlisi, pikomolar miktarda Zn2+ reseptör protein tirozin fosfotaz aktivitesini

inhibe etmektedir (Alvarez-Collazo ve ark., 2012).

1.5. Kardiyomiyositlerde Oksidatif Stres/Nitrosatif Stres ve Hücre İçi Zn2+

Homeostazı Arasındaki İlişkisi

Zn2+ redoks denge mekanizmasında önemli bir hassasiyete sahiptir. Zn2+ kendisi

redoks inert bir iyon olmasına rağmen hücre içinde redoks durumun değişiminden

çok çabuk etkilenebilmektedir. Hücrede bir şekilde oksidatif stresin artması Zn2+’nun

bağlı olduğu proteinlerden ayrılmasına veya depolardan salınmasına neden

olabilmektedir. Artan oksidatif stres glisemi kontrolünün düştüğü kronik diyabet

hastalarında görülen bir bulgudur. Kardiyomiyositlerde, oksidanların 30-kat [Zn2+]i

artışına neden olurken, sadece 2-kat [Ca2+]i artışına neden olduğu gösterilmiştir

(Turan ve ark., 1997). Herhangi bir hastalık durumunda özellikle diyabette, oksidatif

stresin artması beklenen bir durumdur. MT’ler burada önemli bir rol oynamaktadır.

Diyabette MT seviyesinin azaldığı ve [Zn2+]i arttığı gösterilmiştir (Turan ve ark.,

1997; Ayaz ve Turan, 2006). MT’ler metal bağlayıcılığı yanında, oksiradikal tutucu

özelliğinden dolayı, hidroksil radikallerini nötralize ederler. Bu nedenle, reaktif

oksijen türlerinin birikimine karşı MT’ler koruyucu protein olarak görev yaparlar

20

(Foster ve Samman, 2010). Zn2+ kendisi aynı zamanda, mitokondriyi inhibe ederek

ve NADPH oksidazı aktive ederek reaktif oksijen türlerinin oluşmasına katkıda

bulunmaktadır (Alvarez-Collazo ve ark., 2012)

Nitrik oksit (NO) birçok dokuda çeşitli fizyolojik ve patolojik yanıtlara neden olan

önemli biyolojik bir mesajcıdır. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda NO’nun

fonksiyonu hakkında net bir bilgi elde edilememiştir. Vasküler sistemde çok iyi bir

gevşetici ajan olduğu bilinmektedir. Kalpte ise çelişkili birçok veri bulunmaktadır.

Kasılmayı arttırdığını, azalttığını veya değiştirmediğini gösteren çalışmalar

bulunmaktadır (Derici ve ark.,2012). NO’nun birçok patolojik durumda arttığı da

gösterilmiştir (Calo ve ark.,1996; Ayaz ve Turan, 2006).

Birçok çalışmada in vitro glükoz artışının endotelyal nitrit oksit (eNOS) gen ve

protein ekspresyonunu upregüle ettiği ve buna bağlı olarak NO üretimini hem

hayvanlarda hem de insanlarda arttırdığı gösterilmiştir (Pandolfi ve Pietro, 2010).

Aynı zamanda artan NO’nun hücre içi iyon hemoztazında da değişikliklere neden

olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Høydal ve ark., 2007; Xi ve ark., 2010).

NO direkt olarak MT’lerin sistein rezidüleri ile etkileşir ve proteindeki

konformasyonel değişimlerden dolayı MT’e bağlı bulunan Zn2+’yu serbestleştirir. Bu

ise [Zn2+]i artışa neden olur (Foster ve Samman, 2010). Xi ve ark. 2009 yılında

yaptıkları çalışmada, gama-opioid reseptörlerini aktive ederek NO üretimine neden

olan morfinin, [Zn2+]i arttırdığını göstermişlerdir. Aynı zamanda [Zn2+]i artışının,

siklik guanizin monofosfat (cGMP) protein kinaz-G (PKG) yolağı ile oluştuğunu

göstermişlerdir.

21

1.6. Çalışmanın Amacı

Bu tez çalışmasının kapsamı 3 ana bölümde toplanmıştır. Birinci bölümde, sol

ventrikülden (3 aylık sıçan veya tavşandan) taze olarak izole edilen

kardiyomiyositlerde nanomolar seviyelerinde ölçülen ve özellikle oksidatif stres

altında hücre içi bazal serbest Ca2+ miktarına ([Ca2+]i) göre çok daha fazla oranlarda

arttığı gösterilen hücre içi bazal serbest Zn2+ miktarının ([Zn2+]i) kalpte hem

fizyolojik ve hem de fizyopatolojik koşullarda uyarılma-kasılma çiftleniminde rolü

olabileceğini düşündürmektedir (Turan B ve ark., 1997; Ayaz ve Turan, 2006). Buna

karşın, [Zn2+]i ‘nun çok fonksiyonlu bir iyon olarak yeni bir sinyal molekülü gibi

davranabildiği de ileri sürülmektedir.

Böylece, çalışmamızın birinci bölümünde [Zn2+]i ‘nun kardiyomiyositlerde fizyolojik

koşullarda uyarılma-kasılma çiftlenimini nasıl modüle ettiği ve fizyolojik koşullarda

bozulan bu çiftlenime hangi yollarla katkılarda bulunduğunun açıklığa

kavuşturulması hedeflenmiştir.

Çalışmamızın ikinci bölümünde, akut ve kronik oksidatif stres altındaki

kardiyomiyositlerde [Zn2+]i homeostazı ve buna etkili faktörlerin araştırılması

hedeflenmiştir. Bu amaçla, normal yetişkin erkek sıçanlardan izole edilen

kardiyomiyositler oksidanlara maruz bırakılarak hem oksidatif hem de nitrosatif stres

altındaki hücrelerde [Zn2+]i homeostazının incelenmesi hedeflenmiştir. Ayrıca, hem

kronik oksidatif hem de nitrosatif stres etkisini çalışmak için diyabetli sıçanların

kardiyomiyositlerinde [Zn2+]i homeostazının incelenmesi de hedeflenmiştir.

Çalışmamızın son bölümünde, diyabetteki sıçanlara bir antioksidan ajan olan N-asetil

sistein (NAC) verilecek bu hayvanlar 4-hafta boyunca beslenerek daha sonra bu

sıçanlardan elde edilen kardiyomiyositlerde [Zn2+]i homeostazı incelenerek, oksidatif

stres, [Ca2+]i, [Zn2+]i ve bu homeostaza katkıda bulunan diğer faktörlerin detaylı

olarak incelenmesi hedeflenmiştir.

22

2. GEREÇ ve YÖNTEMLER

2.1. Deneylerde Kullanılan Sıçanlar ve Deneysel Diyabet Modeli

Çalışmada kullanılan deney protokolleri için Ankara Üniversitesi Deney Hayvanları

Etik Komitesinden onay raporu alınmıştır. Tüm kullanılan sıçanlar Ankara

Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Ünitesinden temin edilmiştir.

Çalışmanın ilk bölümündeki çalışmalar için, ağırlıkları 200-250 g arasında değişen,

yaklaşık 3 aylık Wistar türü erkek sıçanlar kullanılmıştır. Hayvanlar, deney süresi

boyunca her kafeste 3 tane olacak şekilde, su ve yem kısıtlaması olmaksızın standart

deney hayvanı saklama koşullarında anabilim dalımızda bulunan deney hayvanları

misafir odasında tutulmuşlardır. Tüm hayvanların vücut ağırlıkları ve açlık kan

şekeri düzeyleri ölçülmüştür.

Çalışmamızın diğer bölümlerinde kullanılan sıçanların toplam yaşları 24-25 haftalık

olup bu sıçanlar 12-13 haftalık iken anabilim dalımız deney hayvanı misafir odasına

alınarak burada 12-13 hafta süresince standart sıçan yemi ve su ile her bir kafeste 3

adet olmak üzere muhafaza edilmişlerdir. Bu sıçanların bir grubu kontrol grubu

sıçanlar olmak üzere ayrılırken bir diğer grubu diyabetli grup olmak için

ayrılmışlardır. Diyabetli hayvan oluşturmak için, hayvanların bir grubuna hayvanlara

tek doz streptozotocin (STZ; 50 mg/kg) intraperitoneal (i.p.) olarak enjekte

edilmiştir. STZ enjeksiyonundan 1 hafta sonra hayvanların açlık kan şeker düzeyleri

ölçülerek kan şeker düzeyleri 300 mg/dl ve üzerinde olan hayvanlar diyabetik olarak

kabul edilmiştir (DM grubu). STZ enjeksiyonundan itibaren 4-hafta boyunca diyabet

olarak kalan sıçanlar DM-grubu, 12-hafta boyunca diyabet kalan grup ise DM6-

grubu olarak sınıflandırılmıştır. Kontrol grubu (KON-grubu) hayvanlarına STZ

taşıyıcısı olan sitrat (0,1 mol/l, pH=4,5 sitrat tamponu) enjeksiyonu yapılmış ve 1

hafta sonra tekrar açlık kan şekeri düzeyleri ölçülmüş ve bu hayvanlar KON grubu

olarak 12 hafta boyunca standart koşullarda kafeslerde tutulmuşlardır. Aynı şekilde 3

aylık kontrol grubu KON, 6 aylık kontrol grubu ise KON6 olarak adlandırılmıştır.

23

Çalışmamızın son bölümü için, STZ enjeksiyonu yapıldıktan bir hafta sonra diyabet

olduğu anlaşılan sıçanların bir grubu N-asetil sisteyin (NAC; 150 mg/kg/gün ) ile 4-5

hafta boyunca her gün beslenmişlerdir (DM+NAC grubu). Deney süresi sonunda

tekrar kan şekerleri ve ağırlıkları ölçüldükten sonra tüm sıçanlar deneyler için

kullanılmıştır. Bu grubun kontrolü olarak 16-17 haftalık STZ-taşıyıcısı enjekte edilen

ve standart koşullarda beslenen sıçanlar kullanılmıştır.

2.2. Tüm Kalp Dokusundan Kardiyomiyosit İzolasyonu

Kalp dokusundan tek kalp hücrelerinin (kardiyomiyosit) izolasyonu enzimatik

yöntemle yapılmıştır (Özdemir ve ark., 2005). Deney süresi sonrası, hayvanlar sodyum

pento barbital kullanılarak (30 mg/kg vücut ağırlığı) hafif anestezi altına alınmış ve

göğüs açılarak kalpleri hızlı bir şekilde çıkarıldıktan sonra Langendorff sistemine aorttan

bağlanmıştır. Langendorff sisteminde kullanılan perfüzyon çözeltisinin içeriği (mM olarak):

145 NaCl; 5 KCl; 1,2 MgSO4; 1,4 Na2HPO4; 0,4 NaH2PO4; 5 HEPES; 10 glikoz olup

bu çözeltinin pH’sının 7,2 dengesinin sağlanması için % 5 CO2 -% 95 O2 ile 10 dakika

önceden gazlanmıştır. Kalpler önce bu Ca2+ içermeyen çözelti ile 5 dakika perfüze

edilerek tüm kan ve diğer sıvılardan temizlenmişlerdir. Bu işlemi takiben, kalpler 30–35

dakika süre ile içerisinde kollajenaz bulunan aynı çözelti (worthington collagenase tip-2)

(1–1,2 mg/mL) ile perfüze edilerek kalbin kollejen dokusunun parçalanmsı sağlanmıştır.

Daha sonra, sistemden ayrılan ve atriyumları ve diğer dokuları tamamen çıkarılan kalpler

küçük bir kabın içine alınmış (Ca2+ içermeyen perfüzyon çözeltisi ile) ve makasla ince

ince dilimlenmiştir. Daha sonra, ince bir filtreden geçirilerek hücreler bir tüpün içerisine

alınmış ve birkaç yıkama işleminden geçirilmiştir. Çözeltide Ca2+ aşamalı olarak arttırılmış

ve son olarak ortamda 1-mM Ca2+ olan çözelti içinde hücreler 37°C'de 1-saat kadar

inkübatörde tutulmuşlardır.

Birinci grup çalışmamızda, normal 3-aylık erkek sıçan kalbi sol ventrikülden izole edilen

kardiyomiyositler L-tipi Ca2+-kanal akımı, bazal ve geçici Ca2+ ve Zn2+ değişimi

(transient) ölçümü, Ca2+ spark ölçümü için kullanılmıştır.

24

İkinci grup çalışmamızda, KON-grubu ve DM-grubu sıçanların kalplerinden elde

edilen kardiyomiyositlerin bir grubu standart koşullarda, KON-grubunun bir bölümü,

yüksek glükozda (50-mM) 4-saat süre ile diğer bir bölümü ise, 1-µM ZnPT ile 20-

dakika boyunca, DM-grubu kardiyomiyositlerin bir bölümü bir antioksidant olan 1-

mM N-acetyl cysteine (+NAC) ile 1-saat; diğer bir bölümü ise, 100-nM insülin ile 4-

saat 37°C'de inkübe edilmişler ve sonra ölçümlerde kullanılmışlardır.

Üçüncü grup çalışmamızda ise, 5-hafta boyunca NAC ile beslenmiş sıçanlardan elde

edilen kardiyomiyositler, hücre içi Zn2+ ve Ca2+ ölçümleri için kullanılmıştır.

2.3 L-tipi Ca2+ Kanal Akımı Ölçümü

Bu çalışmanın ilk bölümünde L-tipi Ca2+-kanal akımları (ICaL) ölçülmüştür. Bu

akımlar tüm hücre voltaj-kenetleme konfigürasyonunda 1,5-2,0 M’luk elektrotlar

kullanılarak yapılmıştır. Ölçümler için kullanılan pipet çözeltisi (mM): 110 Cs-

aspartat; 20 CsCl; 1,0 MgC12; 5,0 fosfokreatin-Na2; 5 ATP-Na2; 10 EGTA ve 5

HEPES (pH= 7,4). Akım kayıtları için, hücreler –80 mV düzeyinde kenetlenerek

eğimli bir voltaj uygulaması ile zar potansiyeli –45 mV’a kenetlenmiş, bu seviyede

bir süre beklenerek, voltaj-kapılı Na+-kanalı akımları bloke edilmiştir. Sonra

hücrelerden –50 mV’tan başlamak üzere 10-mV’luk artışlarla +60 mV’a 300 ms

süreli depolarize edici pulslar uygulanarak 12-farklı voltaj seviyesinde akım

kayıtları alınmış ve bilgisayara online kaydedilerek Clampfit 8.0 programı ile

analiz edilmişlerdir. Tepe değerleri ölçülüp 200-ms’nin sonundaki kuyruk

akımlarından çıkarılmıştır. Her potansiyel değeri için elde edilen akım değeri

ölçüm yapılan hücrenin ölçülen sığasına bölünerek değerlendirilmiş ve tüm akım

değerleri akım yoğunluğunun voltaja göre değişimi olarak verilmiştir.

Akımların aktivasyon değerleri her bir potansiyel değerinde kaydedilen akımın

maksimum akıma oranlanması ile elde edilmiş ve Boltzmann denklemine

uydurulmuştur (Xu ve Rozanski, 1997; Rozanski ve Xu, 2002). Yarı aktivasyon

potansiyelinin, V1/2 değeri, Vm zar potansiyeli ve k-sigmoidal eğrinin eğim

parametresi olmak üzere denklem aşağıdaki gibi yazılabilir.

25

(I/Imax= [1+exp(V1/2–Vm)/k]-1)

Kanalların inaktivasyon kinetiğini incelemek için –80 mV’a kenetlenen zar, 50-ms

boyunca –60 mV’ta tutulduktan sonra, –70 ile +60 mV’lar arasında 10 mV’luk

adımlarla prepuls uygulanmış ve her adımı takiben tekrar –80 mV seviyesinde 3-

ms bekleyip, +70 mV’luk ve 500-ms süreli ikinci bir puls uygulanmıştır.

Arkasından ortalama değerler hesaplanarak aşağıda verilen Boltzmann denklemine

uydurulmuştur.

(I/Imax= [1+exp(Vm–V1/2)/k]-1)

2.4 Bazal Hücre İçi Serbest Ca2+ ve Zn2+ Değişimi Ölçümleri

Hücre içi serbest Ca2+ ve Zn2+ miktarlarının belirlenmesi için hücreler, 3-µM

FluoZin-3 (AM) veya 4-µM Fura-2 (AM) ile 30-40 dakika boyunca inkübe

edildikten sonra de-esterifikasyon için 4-5 defa yıkanarak hücre içi serbest Ca2+ ve

Zn2+ derişimi ([Ca2+]i ve [Zn2+]i) ölçümleri için hazır hale getirilmiştir. [Zn2+]i ‘nın

belirlenmesi için iki farklı yöntem kullanılmıştır. Birinci yöntem olarak, Zn2+ ‘ya

afinitesi yüksek (Kd=15 nM) bir boya olan ve 490 nM dalga boyunda uyarılıp, 520

nm dalga boyunda emisyon veren FluoZin-3 (AM) boyası ile boyanmış bir miktar

hücre (yaklaşık 3000 hücre) bir küvet içerisine alınarak flüoresans spektrofotometri

(Jasco FP-6500, Japan) yardımıyla bazal [Zn2+]i ölçümü gerçekleştirilmiştir. Kontrol,

diyabetik ve 1-mM NAC ile 1-saat boyunca 37°C'de inkübe edilen diyabetik hücreler

(DM+NAC grubu) her seferinde eşit miktar olmak şartıyla küvet içerisine

yerleştirilmiştir. Küvetin alt kısmında bulunan küçük bir magnet yardımıyla düşük

hızda döndürülen hücrelerden 4-dakika boyunca bazal kayıt aldıktan sonra sırasıyla

10-µM ZnPT verilerek maksimum sinyal, en son olarak ise 50-µM Tetrakis-(2-

Pyridylmethyl)Ethylenediamine (TPEN) verilerek minimum sinyal elde edilmiştir.

FluoZin-3’ün bilinen Kd değerinden yararlanılarak bazal [Zn2+]i değeri

[Zn2+]i=KdX(F-Fmin)/(Fmax-F) eşitliğinden yararlanılarak hesaplanmıştır. İkinci bir

yöntem olarak ise, hücreler Ca2+’a afinitesi yaklaşık 100-nM, Zn2+’ ya afinitesi ise

26

yaklaşık 1-nM olan Fura-2 (AM) boyası ile boyanmıştır. Fura-2 ratiometrik bir

boyadır ve 340 nm ile 380 nm dalga boylarında uyarılarak 520 nm dalga boyunda

emisyon yaymaktadır. Bu yöntem için PTI Ratiomaster mikrospektrofotometri

(Photon Technology International) cihazı kullanılarak tek hücreden kayıt alınmıştır.

Hücrelerde 4-dakika boyunca bazal flüoresans kayıdı alındıktan sonra, 50-µM TPEN

verilerek, hücre içindeki tüm Zn2+’nun boya tarafından tutulması sağlanmıştır. Her

hücre için, TPEN verildikten sonra elde edilen floresans miktarı bazal [Ca2+]i olarak,

bazala göre yüzde düşüş miktarları bazal [Zn2+]i miktarı olarak hesaplanmıştır. Bazal

[Zn2+]i ve [Ca2+]i miktarlarındaki değişim; kontrol grubu, 50-mM glükoz ile 4-saat

boyunca 37°C' de inkübe edilen kontrol grubu hücrelerinde, diyabetik ve 1-mM NAC

ile 1-saat veya 100-nM insulin ile 4-saat boyunca 37°C'de inkübe edilen diyabetik

grubu hücreleri için hesaplanmıştır. Aynı zamanda hücreler yüksek oksidatif stres

altında iken FluoZin-3 (AM) boyalı hücrelerden konfokal mikroskobu yardımıyla

bazal [Zn2+]i miktarlarındaki değişim izlenmiştir.

2.5 Elektriksel Uyarı Altındaki Kardiyomiyositlerde Hücre İçi Serbest Ca2+ ve

Zn2+ Değerlerinin Geçici Değişimlerinin (Transient) Ölçülmesi

İzole edilen kardiyomiyositler Fura-2 (AM; 4-M) veya Fluo-3 (AM; 4-M) ile oda

sıcaklığında 45-50 dakika inkübe edildikten sonra, Fura-2 için, 340 nm ve 380 nm’de

uyarılarak, Fluo-3 için 490 nm’de uyarılarak 520 nm’ ye merkezlenmiş flüoresan

oranların ölçülmesi ile geçici veya bazal Ca2+ değişimleri hesaplanmıştır

(Grynkiewicz ve ark., 1985). Aynı zamanda hücreler FluoZin-3 (3-M) ile oda

sıcaklığında 30-40 dakika inkübe edildikten sonra, 490 nm’de uyarılarak 520 nm’ye

merkezlenmiş flüoresan değişimlerinin ölçülmesiyle geçici veya bazal Zn2+

değişimleri hesaplanmıştır. Hücre içi serbest Ca2+ ve Zn2+ ölçüm ([Zn2+]i ve [Ca2+]i)

deneylerinde kullanılan banyo çözeltisinin içeriği şu şekildedir (mM): 117 NaCl; 5,4

KCl; 1,2 MgSO4; 1,7 CaCl2; 1,2 KH2PO4; 10 HEPES ve 10 glikoz (pH=7,4). İki

ucuna elektrot yerleştirilmiş küvet içine alınan hücrelerden uyarılabilir olanı

seçilerek bir pencere içine alınmıştır. Önce 20- s’lik bazal [Zn2+]i ve [Ca2+]i sinyali

kaydedilmiş, sonra hücreler 25–30 V’luk pulslar ile 0,2 Hz frekansında uyarılarak

200-s süreyle geçici [Zn2+]i ve [Ca2+]i değişimleri (Ca2+ ve Zn2+ transientleri)

27

kaydedilmiştir. Arkasından aynı pencere banyonun hücre bulunmayan bir bölgesine

odaklanarak belli bir süre kayıt alınıp hücre içi sinyalden çıkarılmıştır. Böylece,

banyo ortamının floresansından kaynaklanabilecek gürültünün ortadan kaldırılması

hedeflenmiştir. Gözlenen Ca2+ ve Zn2+ değişimine ait sinyallerin ölçümü PTI (Photon

Technology Internetional) RatioMaster marka mikrospektroflorimetre ile yapılarak

Felix (PTI) programı ile bilgisayara kaydedilip değerlendirilmiştir. Transientlerin

kinetik analizi Micosoft Excell programı ile hazırlanan bir analiz algoritması ile

gama dağılım fonksiyonuna uydurularak gerçekleştirilmiştir. Her hücre 200-s

süresince kaydedilen transientlerin parametrelerinin ortalamasından elde edilen değer

ile temsil edilmiştir. Fura-2 veya Fluo-3 ve FluoZin-3 ile ölçülen [Ca2+]i ve [Zn2+]i

sinyallerinin bazal değerden çıkarılarak ölçülen maksimum değeri (F340/380 veya

F/F0), tepeye çıkış süresi (TP) ve maksimum değerin % 50’sine iniş süresi (DT50)

ölçülerek karşılaştırılmıştır.

Kontrol, diyabet ve 5-hafta boyunca NAC ile beslenmiş sıçan kalplerinden izole

edilen kardiyomiyositler Ca2+ ve Zn2+ transient ölçümleri için kullanılmışlardır. Aynı

zamanda [Zn2+]i artışının Ca2+ transientlerine olan etkisine bakılmıştır.

2.6. Dinlenimdeki Kardiyomiyositlerde Lokal Zn2+ Salınması (Zn2+ spark) ile

Lokal Ca2+ Salınmasının (Ca2+ spark) Ölçülmesi

Enzimatik yolla izole edilen kardiyomiyositler, içeriği (mM) 117 NaCl; 5,4 KCl; 1,7

MgCl2;1 NaH2PO4; 1,8 CaCl2; 10 glikoz ve 10 HEPES (pH 7,4) olan tampon

çözeltisine aktarılmıştır. Kardiyomiyositler burada 4-M Fluo-3 (AM) ile karanlık

ortamda 25-dakika inkübe edildikten sonra 3-kez tampon çözeltisi ile yıkanmıştır.

Deney kabına aktarılan kardiyomiyositlerin cam tabana oturması beklenildikten

sonra Leica TCS SP5 lazer taramalı konfokal mikroskop (Leica, Almanya) yardımı

ile doğrusal tarama modunda oluşturulan görüntüler kaydedilmiştir. Taranan doğru

(512 piksel) myositlerin uzun eksenine gelecek şekilde ayarlanmıştır. Her görüntü,

400 Hz hızında, 63X yağ imersiyon (NA=1,3) objektif yardımıyla oda sıcaklığında

(20–22°C) kaydedilmiştir. Konfokal pinhol 1–1,5 airy birime ayarlanmıştır.

28

Kaydedilen spark ölçüm resimleri ImageJ grafik programı altında çalışan ücretsiz bir

yazılım olan SparkMaster eklentisi ile değerlendirilmiştir (http://rsb.info.nih.gov/ij).

Sparkların maksimum floresans değerleri ve floresansın tepeye çıkış süreleri, bazal

seviyeye dönüş sürelerinin yarısı gibi zaman parametreleri ImageJ programıyla

otomatik olarak belirlenmiştir.

Şekil 2.1 de, canlı bir kardiyomiyosit ve bu kardiyomiyositten tespit edilen bölge ve

kaydedilen örnek sparklar görülmektedir. Kontrol grubu deney hayvanlarından elde

edilen kardiyomiyositler Ca2+ spark ölçümleri için kullanılmıştır. Kontrol

hücrelerinden 2-dakika boyunca spark kaydı alındıktan sonra banyo ortamına son

konsantrasyon 1-M olacak şekilde ZnPT eklenerek, hücre içi Zn2+ artışının Ca2+

sparklarına olan etkisi araştırılmıştır.

Şekil 2.1. Kardiyak hücrelerden Ca2+ spark kayıt ve analiz için oluşturulan grafikler. Fluo-3 (AM) ile yüklenmiş bir kardiyomiyositin konfokal mikroskobu ile alınan flüoresan ve gerçek görüntüsü en üstte görülmektedir. Hücre üzerinde boyuna tanımlanan doğrunun zaman içinde değişim deseni ortadaki grafiği oluşturmaktadır. 4–5 piksel genişliğinde zamansal (mavi eğri) ve uzaysal ortalama eğrisi ile (kırmızı eğri) spark parametreleri hesaplanmıştır.

Zam

an

µm

29

2.7. Western Blot Ölçümleri

Deney gruplarından tek hücre izolasyonunu takiben kardiyomiyositler içeriği (mM) 20

Tris-HCl, 150 NaCl, 2 KCl, 2 EDTA, 0,5 dithiothreitol, 100 proteaz inhibitörü koktaili, 0,4

PMSF ve %2 NP-40 liziz buffer (pH: 8,0) olan çözelti içerisinde homojenizasyon işlemi

yapılmıştır. Hücreler hazırlanmış homojenizasyon buffer içerisinde 5 dakika kadar buz

içerisinde bekletildikten sonra 1 dakika boyunca vorteksleme işlemi yapılmıştır. Daha

sonra tüp içerisindeki hücreler 4C de 10.000xrpm’de 10 dakika boyunca sanrifuj

edilmiştir. Supernatant, sitozolik kısım olarak saklanırken, pellet homojenizasyon tamponu

içinde çözülerek SR vezikülü olarak saklanmıştır. Protein miktarı Bradfort yöntemi

(Bradford, 1976) ile tayin edilerek elektroforez deneyleri için kullanılana kadar -80 oC de

dondurulmuştur.

Homojenatlar, %5 lik SDS-PAGE jel içerisine her kuyuda eşit miktarda protein

olacak şekilde yüklenerek 150 V’ da 3-9 saat yürütülmüştür. Daha sonra Proteinler

40 mA akım altında 2 saatlik transferin sonunda nitroselluloz membrana aktarılmıştır

(Laemmli, 1970). Spesifik olmayan (non-specific) bağlanmaları önlemek amacıyla,

membran PBS/süt içerisinde oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat boyunca bekletildikten

sonra TTBS tamponu (%20 Tween, 10 mM Tris ve pH=7,6), 100 mM NaCl ve %3

bovine serum albumin) ile yıkanmıştır. Membranlar, TTBS ve %3’lük BSA

solüsyonu içerisine konan her bir proteine özgü primer antikorlar ile 4C’de 1 gece

inkübasyona bırakılmıştır. Bu işlemlerden sonra yıkama aşamasına geçilmiştir.

Membranlar 1X15 ve 2X5 dakikalık yıkamamın ardından primer antikorlarda seçilen

türe göre anti rabbit, anti mouse veya anti goat IgG-peroxidase (1/10.000) ile 1 saat

yeniden inkübe edilerek, 1x15 ve 2x5 dakikalık yıkama gerçekleştirilmiştir. Yıkama

işlemlerinin ardından, membranlar üzerine luminol eklenerek karanlık ortamda

görüntü luminasans filme aktarılmıştır. Bilgisayara aktarılan film görüntüsü

üzerinden luminasans miktarı uygun bir program yardımıyla belirlenmiştir.

Deneylerde kontrol grubu sıçan kalplerinden izole edilen kardiyomiyositler

kullanılmıştır. Kontrol grubu ve 20 dakika boyunca 1 ve 10mM ZnPT ile inkübe

edilen kontrol grubu kardiyomiyositlerde, PKA ve fosforile formu pPKAThr198, Ca2+ -

30

kalmodülin kinaz (CaMKII) ve fosforile formu pCaMKIIThr286, ryanodine (RyR) ve

fosforile formu (pRyR), FKBP12.6 ve GAPDH protein miktarlarına bakılmıştır.

2.8. Protein Thiol (SH) Oksidasyonu Ölçümü

İzole kardiyomiyositler önce içeriği (mM): 123 NaCl, 5,4 KCl, 1,7 MgCl2, 1,8 CaCl2,

10 HEPES ve 10 glikoz (pH=7,4) olan HEPES tamponu ile yıkandıktan sonra % 2

sodyum dodecylsulfate içeren 0,2 M Tris/HCl (pH=8,1) tamponu ile parçalanmaları

sağlanmıştır. Ölçüm Ellman ayıracı kullanılarak belirlendi. Toplam protein thiol (SH

grubu) ölçümü için, 0,05 mL parçalanmış hücre solüsyonundan alınarak 0,8 mL saf

su ve 0,1 mL 2 mM 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) ile karıştırarak 20 dakika

boyunca renk oluşumu için beklendi. Beklemeden dolayı oluşan süpernatantların 412

nm dalga boyunda absorbansları okunmuştur. Serbest (acid soluble) SH gruplarının

miktarını belirlemek amacıyla 0,7 mL parçalanmış hücre solüsyonu ile 0,35 mL %

20’lik trichloroacetic acid (TCA) ile karıştırılarak 13.000xg’ de 10-dakika santrifuj

edilmiştir. Santrifuj sonrası çöken kısım % 20’lik TCA ile yeniden yıkanmıştır. Daha

sonra supernatant NaOH ile pH=8’e ayarlanarak 412 nm de absorbansları

okunmuştur. Örnek ve ayıraç körleri yardımıyla elde edilen düzeltmeden sonra SH

grup konsantrasyonları “extinction” katsayısı olarak 1,31 mM-1 mm-1 değeri

kullanılarak hesaplanmıştır.

2.9. Plazma Örneklerinde Oksidatif Stres/Antioksidant Seviyelerinin

Belirlenmesi

Oksidatif hasar sonucu meydana gelen lipid degredasyonu lipid peroksidasyonu ile

belirlenir. Bundan dolayı oksidatif stres ölçümlerinde önemli bir marker olmuştur.

Satüre olmamış poli (polyunsaturated) lipidler, reaktif oksijen türleri tarafından

gerçekleştirilen oksidatif saldırıya karşı en açık olanlardır. Lipidlerde meydana

gelen oksidasyon sonucu son ürün olarak oluşan malondialdehyde (MDA)

miktarının belirlenmesiyle, hücrede veya dokuda oksidatif stres hakkında bilgi elde

edilebilir. Plazma lipid peroksidasyonu, thiobarbituric asit reaktif madde (TBARS)

ölçüm kiti (Cayman Chemical Company) kullanılarak MDA miktarının ölçülmesi

31

ile tayin edilir. Plazma glutatyon miktarı ise, indirgenmiş glutatyon (GSH) ve

okside glutatyon (GSSG) seviyelerinin glutatyon ölçüm kiti (Cayman Chemical

Company) kullanılarak tayin edilir. Bu kit, 2-(N-morpholino) ethanesulfonic asit

tamponu, GSSG standart, enzim karışımı ve 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoate)

içermektedir. GSH ve GSSG seviyeleri, indirgenmiş glutatyon standardı

kullanılarak mol/L cinsinden hesaplanmıştır. GSH ve GSSG belirleme limitleri

sırasıyla, 0,1-mol/L ve 0,001-mol/L, GSH ve GSSG için inta-assay varyasyon

katsayıları ise sırasıyla % 0,96 ve % 6,45’tir.

Önceden dondurulmuş kalp kası homojenatları sıvı nitrojen kullanılarak pulverize

edilmiş ve daha sonra homojenize edilmiştir. Protein miktarları Bredford metodu

(Bio-Rad) kullanılarak hesaplanmış ve protein standardı için ise bovin serum

albumin (BSA) kullanılmıştır. Protein oksidasyonları kalp homojenatlarından

ölçülmüştür (Turan ve ark.,1996; Tuncay ve ark., 2007) .

2.10. İstatistiksel Analizler

Tüm deney sonuçları ortalama±SEM (standart error of mean) olarak verilmiştir.

Ortalamalar arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlılık seviyeleri ise ANOVA

veya student t-testi kullanılarak belirlenmiştir. ANOVA testi sonrasında farklı olan

grupları belirlemek amacıyla TUKEY post-hoc testi kullanılmıştır. İstatiksel

anlamlılık test değeri olarak 0,05 değeri seçilmiştir.

2.11. Kullanılan Kimyasallar

NaCl, KCl, MgSO4, CaCl2, KH2PO4, HEPES, glikoz, CsCl, MgC12, MgATP, EGTA,

Na2GTP, CdCl2, Na2HPO4, NaH2PO4 ve BIM Sigma (SIGMA-ALDRICH Chemie

GmbH, Taufkirchen, Germany)’dan satın alınmıştır. Kolejenaz tip-2 worthington

firmasından (Worthington Biochemical Corporation, ABD), Fura-2 (AM) (Molecular

Probes, ABD), Fluo-3 (AM) ve FluoZin-3 (AM) (Invitrogen, ABD)’den satın alınmıştır.

32

3. BULGULAR

3.1. Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişimi ve Homeostazı İle İlgili Çalışmalar

3.1.1. Deney Hayvanları ile İlgili Genel Parametreler

Çalışmamızın birinci bölümünde kullanılan deney hayvanları Wistar türü erkek

sıçanlar olup, bunların vücut ağırlıkları 200-250 g arasında ve yaşları ise 16-17

haftalık olarak seçilmiştir. Bu hayvanların kan şekerleri 90-110 mg/dL arasında ve

kalp ağırlıkları ise ortalama (±SEM) olarak 1,34 ± 0,67 g ölçülmüştür.

3.1.2. Farklı Zn2+ Bileşiklerine Maruz Kalan Kardiyomiyositlerde L-tipi Ca2+-

Kanal Akımları

Yetişkin sıçanlardan taze olarak izole edilen kardiomyositler akut olarak çeşitli Zn2+

bileşiklerine (ZnCl2 veya zinc-pyrithione, ZnPT) maruz bırakılarak voltaj kenetleme

tekniği ile L-tipi Ca2+ kanal akımları (ICaL) ölçülmüştür. L-tipi Ca2+ kanalları hücre

içi Ca2+ homeostazında önemli rolü olması nedeniyle, hücre içi Zn2+ homeostazında

da rolü olacağı hipotezlenerek, 2 farklı Zn2+ bileşiği olan ZnCl2 (10-100 µM) ve bir

Zn2+ iyonoforu olan ZnPT (1-10 µM) ayrı ayrı olmak üzere uygulandığında 1-2

dakika içinde ICaL genliğini önemli derecede inhibe ettikleri, buna karşın ZnCl2 etkisi

yıkanabilir iken ZnPT etkisinin ortamdan uzaklaştırılmasına karşın geriye

döndürülemediği gözlenmiştir (Şekil 3.1 A ve B). Bir Zn2+ tutucusu olan tetrakis-(2-

pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) uygulanması da örneğin 1 µM ZnPT etkisini

değiştirememiştir (Şekil 3.1 C). Bu akımların akım-voltaj (I-V) karakteristikleri

incelendiğinde, ZnCl2 uygulaması bu kanallardan ölçülen akımların sadece

genliklerini etkileyip kanalların diğer voltaj- ve zaman-bağımlı özelliklerini

etkilemediği (Şekil 3.2 A), buna karşın ZnPT uygulamasının bu kanalların I-V

eğrilerini -10 mV sola kaydırarak kanalların voltaj-bağımlı iletkenliklerini daha

negatif potansiyel değerlerine kaydırdığı gözlenmiştir (Şekil 3.2 B).

33

Şekil 3.1. İki farklı Zn2+ bileşiği olan ZnCl2 (10 ve 100 µM) ve bir Zn2+ iyonoforu olan ZnPT (1 ve 10 µM)’nın ICaL maksimum akımlarına olan etkisi. Maksimum Ca2+ akımları, her seferinde hücrelerin 0 mV’a kenetlenmesi ile ölçülmüştür. Hücrelerden yaklaşık 2 dakika boyunca bazal kayıtlar alındıktan sonra sırasıyla 10 µM ZnCl2, yıkama, 100 µM ZnCl2 ve yıkama (A) 1µM ZnPT, yıkama, 10 µM ZnPT ve yıkama (B) 1µM ZnPT, 1µM ZnPT + 50 µM TPEN ve yıkama (C) protokolleri uygulanarak bazala göre maksimum ICaL‘deki değişime ait örnek gösterim.

Zaman (dak.)2 4 6 8 10 12

-2000

-1500

-1000

-500

0

1M ZnPT

Yıkama10M ZnPT

Yıkama

Akı

m (p

A)

Zaman (dak.)2 4 6 8 10 12

-2000

-1500

-1000

-500

0

Yıkama

1M ZnPT

1M ZnPT+50M TPEN

Akı

m (p

A)

Zaman (dak.)2 4 6 8 10 12

-2000

-1500

-1000

-500

0

Yıkama10M ZnCl2 Yıkama

100M ZnCl2

Akı

m (p

A)

A B

C

Şekil 3.2. L-tipi Ca2+ -kanal akımı. Solda, 10 ve 100 µM ZnCl2 uygulanmış, sağda 1 ve 10 µM ZnPT uygulanmış kontrol gruplarına ait zar potansiyeline göre ölçülen akım yoğunluklarının ortalamasından elde edilen akım-voltaj grafiği ve ortada akımın kayıt protokolü. Değerler ortalamaSEM ile temsil edilmiştir.

-80 mV

+60 mV

-60 -50 -40 -30 -20 -10 10 20 30 40 50 60 70

-11-10

-9-8-7-6-5-4-3-2-1

1

pA/pF

mV

34

1 µM ZnPT uygulaması ayrıca bu kanalların aktivasyon/inaktivasyon

karakteristiklerini de etkileyerek, V1/2 aktivasyon potansiyelinde yaklaşık -5 mV’luk

sola kaymaya neden olmuştur (Şekil 3.3 B). Buna karşın 10 µM ZnCl2 uygulaması

böyle bir etkiye neden olmamıştır (Şekil 3.3. A). Kanallara ait kinetik parametreler

ve ölçülen maksimum değerler Tablo 3.1’de verilmiştir.

Şekil 3.3. Gruplar için ICa akımlarının kinetik analizleri. Gruplardan elde edilen ortalama değerler ve Boltzman denklemlerinin uygulanması ile çizdirilmiş aktivasyon (I/Imax=[1+exp (V1/2–Vm)/k]-1) ve inaktivasyon (I/Imax=[1+exp(Vm–V1/2)/k]-1) eğrileri. V1/2, aktivasyon veya inaktivasyon’un %50 değerine ulaştığı potansiyel ve k eğim parametresidir. 10 µM ZnCl2’nın (A) ve 1 µM ZnPT (B) aktivasyon ve inaktivasyon eğrilerine olan etkisi. Değerler ortalamaSEM olarak verilmiştir.

-80 mV

20 mV 0 mV

A

B

-75 -50 -25 0 250

25

50

75

100

0

25

50

75

100

KON+ZnPT1

Akt

ivas

yon

(%)

İnaktivasyon (%)

-75 -50 -25 0 250

25

50

75

100

0

25

50

75

100

KON+ZnCl210

Akt

ivas

yon

(%)

İnaktivasyon (%)

35

Çizelge 3.1. Kardiyomiyositlerden kaydedilen ICaL akımlarının yoğunluğu ve kinetik parametrelerinin değerleri.

Imax (pA/pF ) Inaktivasyon Aktivasyon

0 mV -10 mV V1/2 (mV) k V1/2 (mV) k

KON

-9.8 0.5 -9.4 0.8 -29.80.3 -6.80.2 -21.90.4 3.80.4

ZnCl2

(10 μM)

-8.0 0.6* -7.8 1.0* -29.70.5 -7.00.1 -23.10.1 3.80.2

ZnCl2

(100 μM) -6.9 0.8* -6.7 1.8* - - - -

ZnPT1

(1 μM) -8.2 0.3* -8.2 0.4* -25.40.3* -6.00.2 -24.70.1* 3.80.6

ZnPT10

(10 μM) -6.7 0.5*† -7.4 0.6* - - - -

Gruplara ait ventrikül hücrelerinden kaydedilen ortalama akım yoğunlukları, deneysel verilere Boltzmann denklemlerinin uygulanmasıyla elde edilen V1/2 (yarı-aktivasyon veya inaktivasyon potansiyeli) ve k (eğim) parametreleri. Değerler, ortalamaSEM olarak verilmişlerdir. Deneylerde toplam 3-4 hayvan ve 10-12 hücre kullanılmıştır. *p<0,05 vs KON ve †P<0.05 vs ZnPT1 grubu.

3.1.3. İzole Kardiyomiyositlerde Serbest Zn2+ Varlığının Gösterilmesi

FluoZin-3 (AM) boyasının hücre içi Zn2+ artışına bağlı olarak floresans değişimine

neden olup olmadığını test etmek için, yetişkin sıçanlardan taze olarak izole edilen

kardiomyositler 3µM FluoZin-3 ile 30 dakika boyunca inkübe edilmişlerdir.

Deesterifikasyon işleminin ardından, hücreler polylyzin ile kaplamış lameller üzerine

konularak yapışması beklenmiştir. Konfokal mikroskop kullanılarak yapılan deneyde

hücrelerden 2 dakika boyunca bazal floresans kaydı alındıktan sonra akut olarak

1µM ZnPT eklenerek floresnans miktarındaki artış izlenmiştir. Floresanans miktarı

sabitlendikten sonra ortama 50µM TPEN verilerek tüm çinkonun tutulması

36

sağlanmıştır. Şekil 3.4’te FluoZin-3 ile inkübe edilmiş kardiyomiyositlerin ZnPT ve

TPEN uygulamasında sonraki konfokal mikroskop görüntüleri gösterilmiştir.

Şekil 3.4. FluoZin-3 (AM) ile yüklenmiş kardiyomiyositlerde konfokal mikroskopta hücre içi Zn2+ değişimine bağlı olarak floresans değişiminin gözlenmesi.

3.1.4. İzole Kardiyomiyositlerde Bazal Serbest Zn2+ Miktarının Ölçülmesi

Hücre içi serbest Zn2+ miktarının belirlenmesi için iki farklı metod uygulanmıştır.

Sıçan kalbinden izole edilen kardiyomiyositler, 3µM FluoZin-3 (AM) veya 4µM

Fura-2 (AM) (Zn2+ için Kd sırasıyla 15nM ve ~1nM) boyası ile 30 dakika boyunca

inkübe edilmişlerdir. Hücreler 3 kez yıkanarak deesterifikasyon işleminin

yapılmasının ardından deney için hazır hale getirilmiştir. FluoZin-3 boyası ile

boyanan hücreler her seferinde aynı miktar olmak şartıyla (~ 4.000 hücre/küvet)

içerisinde metal karıştırıcısı olan bir küvet içerisine alınmışlardır. FluoZin-3 490 nm

dalga boyunda uyarılan ve 520 nm dalga boyunda emisyon yayan Zn2+’ya afinitesi

yüksek olan bir boyadır. Spektrofotometri cihazı içerisine alınan küvet içerisindeki

hücrelerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra sırasıyla maksimum ve

minimum floresans değerlerini elde etmek için sırasıyla 10 µM ZnPT ve 50 µM

TPEN eklenmiştir. Elde edilen maksimum (Fmax), minimum (Fmin), bazal (F), ve Kd

değerleri ile hücre içi Zn2+ miktarları [Zn2+]i = KdX(F-Fmin)/(Fmax-F) formülünde

yerine konularak hesaplanmıştır (Şekil 3.5).

37

Şekil 3.5. Sıçan kalbinden izole edilen kardiyomiyositlerde hücre içi serbest Zn2+’ nun belirlenmesi. FluoZin-3 (AM) boyası ile 30 dakika boyunca inkübe edilen hücreler bir küvet içine alındıktan sonra sırasıyla bazal, 10µM 1-hydroxypyridine-2-thione (ZnPT) ile maksimum ve 50µM Tetrakis-(2-Pyridylmethyl)ethylenediamine(TPEN) ile minimum yanıtlar alınarak serbest çinko miktarı [Zn2+]i = KdX(F-Fmin)/(Fmax-F) eşitliği ile belirlenmiştir. Floresans miktarı keyfi birim olarak belirlenmiştir.

Bir diğer metod olarak hücre içi Zn2+ miktarındaki değişimi göstermek için, Zn2+’ya

afinitesi oldukça yüksek ratiometrik bir boya olan Fura-2 (AM) kullanılmıştır. İzole

kardiyomiyositlerden iki dakika boyunca bazal bir sinyal alındıktan sonra, 50µM

TPEN ilave edilerek bazal sinyaldeki düşme miktarı izlenmiştir. Her grup için bazala

göre % floresans miktarındaki azalma hesaplanarak karşılaştırma yapılmıştır.

TPEN’nin Zn2+ için ayrılma sabiti 1015.6 M-1 ve Ca2+ için ise 104.4 M-1 olarak

bilinmektedir (Arslan ve ark, 1985). Aynı zamanda TPEN’nin bu konsantrasyonda

Ca2+ tutmadığını göstermek için çinkoya karşı afinitesi daha düşük bir Ca2+ boyası

olan Fluo-3 (AM) ile deneyler yapılmıştır. Kardiyomiyositlerden iki dakika boyunca

bazal kayıt alındıktan sonra 50µM TPEN ilave edildiğinde bazal floresans değerinde

bir değişim olmadığı gözlenmiştir. Aynı deney protokolü FluoZin-3 boyalı

hücrelerde tekrarlandığında ise bazal floresans değerinde anlamlı derecede bir düşüş

meydan gelmiştir (Şekil 3.6).

ZnPT TPEN

38

Şekil 3.6. TPEN’nin FluoZin-3 (AM) ve Fluo-3 (AM) boyalı hücrelerde floresans miktarlarına olan etkisi. (A) TPEN FluoZin-3 boyalı hücrelerde bazal floresans değerini anlamlı derecede azaltırken, Fluo-3 boyalı hücrelerde bazal floresans miktarına etki etmemiştir. (B) Bar grafiklerde FluoZin-3 ve Fluo-3 boyalı kardiyomiyositlerde TPEN’in bazal floresans miktarına olan etkisi bazala göre % değişim olarak gösterilmiştir. Deneylerde kullanılan toplam hücre sayısı, n= 5-7 *P<0,05; başlangıç değerine göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

3.1.5. İzole Kardiyomiyositlerde Zn2+ Transientlerinin Gösterilmesi

Hücre içi Ca2+ hemostazının yanısıra hücre içi Zn2+ hemostazının da önemli bir yer

tuttuğu daha önce yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Bu çalışmada, FluoZin-3 veya

Fluo-3 AM ile boyalı izole sıçan kardiyomiyositlerinde elektriksel uyarı altında ayrı

ayrı sırasıyla Zn2+ ve Ca2+ değişimlerine bakılmıştır. Tek hücrede yapılan ölçümlerde,

hücreler 0,2 Hz frekansta 25-30 V genlikli elektrik alan uyarısı ile uyarılmışlardır.

Elde edilen sonuçlarda elektriksel uyarı altında Ca2+ transientleri gibi Zn2+

transientlerininde oluştuğu görülmüştür. Bir banyo içerisinde 2 dakika boyunca

KREBS çözeltisi ile perfüze edilen ve elektrik alan uyarısı ile uyarılan Zn2+ ve Ca2+

duyarlı flüoresan boyalarla boyalı hücrelerden bazal kayıtlar alındıktan sonra

solüsyon değiştirilerek 4 dakika boyunca TPEN ile perfüze edilmişlerdir. TPEN

uygulaması Ca2+ transientlerinde ve bazal flüoresanta bir değişime neden olmazken

Zn2+ transientleri ve bazal flüoresan anlamlı derecede azaltmıştır (Şekil 3.7).

TPEN YIKAMA

2 dak.

A B

BAZAL

+TPEN

YIKAMA

BAZAL

+TPEN

YIKAMA

0

25

50

75

100

125

*

0

25

50

75

100

125

Fluo

Zin -

3( %

)

Fluo-3(%

)

39

Şekil 3.7. Kardiyomiyositlerde hücre içi Zn2+ transientlerinin gösterilmesi. Kardiyomiyositler 0,2 Hz frekans ve 25-30 V genlikli elektriksel uyarı altındayken gözlenen çinko ve kalsiyum trazientlerine ait örnekler (A). TPEN’nin hücre içi Zn2+ ve Ca2+ miktarlarına ve transientlerine olan etkisi. 50 µM TPEN uygulaması sorası hücre içi Zn2+ miktarı anlamlı derecede azalırken kalsiyum miktarında bir değişim gözlenmemiştir. TPEN Zn2+ transientlerini azaltırken Ca2+ transientlerine etki etmemiştir (B). TPEN’nin hücre içi Zn2+ ve Ca2+ miktarlarına ve transientlerine olan etkisi bar grafik olarak gösterilmiştir (C ve D). Tüm değerler, TPEN verilmeden önceki başlangıç durumuna göre (BAZAL) % değişim olarak verilmiştir. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 10-12 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

3.1.6. Hücre Dışı ve Hücre İçi Serbest Zn2+ Miktarındaki Artışın Global Zn2+

Değişimlerine Etkisi

FluoZin-3 (AM) veya Fluo-3 (AM) boyası ile inkübe edilen izole kardiyomiyositler

deestrefikasyon işlemlerinden sonra poly-L-lizin ile kaplı cam lamel üzerine alınarak

birkaç dakika boyunca beklenmiş ve cam üzerine yapışması sağlanmıştır. Daha sonra

BAZAL+TPEN

BAZAL+TPEN

0

25

50

75

100

*

0

25

50

75

100

Fluo

Zin-

3(%

Değ

işim

)

Fluo-3(%

Değişim

)

BAZAL+TPEN

BAZAL+TPEN

0

25

50

75

100

125

*

0

25

50

75

100

125

Zn+2

Tra

nzie

nt(%

Değ

işim

)

Ca

+2 Tranzient(%

Değişim

)

C D

A B

40

kardiyomiyositler normal KREBS çözeltisi ile perfüze edilerek, 2 dakika boyunca

0,2 Hz’lik elektriksel uyarı altında ayrı ayrı Zn2+ ve Ca2+ transient kayıtları alınmıştır.

Şekil 3.8. Hücre içi ve dışı Zn2+ artışının Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkisi. Kardiyomiyositler 0,2 Hz frekans ve 25-30 V genlikli elektriksel uyarı altındayken hücre içi (A, sol) ve dışı (B, sol) Zn2+ artışına bağlı olarak gözlenen Zn2+ ve Ca2+ trazientlerinin değişimine ait örnekler. Kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra, hücreler sırasıyla 1µM ZnPT ve 50µM TPEN içeren kreps solüsyonu ile perfüze edilmişlerdir. ZnPT uygulaması Zn2+ transientlerini arttırırken Ca2+ transientlerini anlamlı derecede azaltmıştır. Daha sonra hücrelerin TPEN ile perfüze edilmesi Zn2+ transientlerini tamamen ortadan kaldırırken Ca2+ tranznetlerini anlamlı derecede azaltmıştır (A, sol). Kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra, hücreler sırasıyla 10,100 µM ZnCl2 ve 50µM TPEN içeren kreps solüsyonu ile perfüze edilmişlerdir. ZnCl2, Zn2+ ve Ca2+ transientlerini anlamlı derecede azaltırken, hücrelerin daha sonra TPEN ile perfüze edilmesi Zn2+ ve Ca2+ transientlerinde bir değişime neden olmamıştır (B,sol). Tüm değerler, başlangıç durumuna göre (BAZAL) % değişim olarak verilmiştir. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 15-20 hücre kullanılmıştır.*P<0,05; bazala göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Hücreler normal KREBS çözeltisi ile perfüze edilerek 2 dakika boyunca bazal kayıt

alındıktan sonra perfüzyon değiştirilerek 1µM ZnPT ile hücreler 5 dakika boyunca

perfüze edilmiştir. ZnPT’nın bazal flüoresan miktarını (~%200) ve Zn2+

BAZAL+Z

nPT+TPEN

BAZAL+Z

nPT+TPEN

0

50

100

150

200

250

0

50

100

150

200

250

*

**

*Zn+2

Tra

nzie

nt(%

değ

işim

)

Ca

+2 Tranzient(%

değişim)

Zn2+

(10) - + - - - + - - Zn

2+ (100) - - + + - - + +

TPEN (50) - - - + - - - +

A

B

41

transientlerini (~%160) anlamlı derece arttırdığı gözlenmiştir. Bu artışın Zn2+

kaynaklı olup olmadığını anlamak için perfüzyon tekrar değiştirilerek hücreler 50µM

TPEN ile perfüze edilmiştir. TPEN bazal flüoresan değerini daha önceki deneylerde

olduğu bazal seviyenin altına indirmiş ve aynı zamanda transientleri tamamen

ortadan kaldırmıştır (Şekil 3.8).

Aynı şekilde hücrelerden bazal kayıt alındıktan sonra perfüzyon değiştirilerek

sırasıyla 10 ve 100µM ZnCl2 ile beşer dakika perfüze edilmişlerdir. Elde edilen

sonuçlarda hücre dışı Zn2+ artışının, hem Zn2+ hem de Ca2+ boyası ile boyalı

hücrelerde bazal floresans miktarında değişmemiştir. 10µM ZnCl2 Zn2+ ve Ca2+

transientlerini yaklaşık % 25 azaltırken, 100µM ZnCl2 Zn2+ transientlerinde artı bir

% 35’lik azalışa neden olurken Ca2+ transientlerine bir etkisi olmamıştır. Deney

sonunda hem Zn2+ hem de Ca2+ boyalı hücrelere 50µM TPEN eklenmiştir. TPEN

Zn2+ ve Ca2+ transientlerinde artı bir değişime neden olmamıştır (Şekil 3.8).

3.1.8. Hücre Dışı ve Hücre İçi Serbest Zn2+ Miktarındaki Artışın Lokal Zn2+

Değişimlerine Etkisi

Kontrol grubu sıçan kalplerinden izole edilen kardiyomiyositlerden FluoZin-3 (AM)

veya Fluo-3 (AM) boyası ile inkübe edilerek konfokal mikroskopta spark

parametrelerine bakılmıştır. Kaydedilen Zn2+ ve Ca2+ sparklarına ait örnek şekiller

Şekil 3.9’da sunulmuştur. Zn2+ sparkı oluşma frekansı, Ca2+ spark frekansı ile

karşılaştırıldığında yaklaşık 5 kat daha azdır.

42

Şekil 3.9. İzole kardiyomiyositlerde Zn2+ ve Ca2+ spark parametrelerinin karşılaştırılması. FluoZin-3 (AM) veya Fluo-3 (AM) boyası ile inkübe edilen kardiyomiyositlerden kaydedilen Zn2+ ve Ca2+ sparkına ait örnek şekiller ve ölçülen parametrelere ait ortalama değerler (TP: sparkın tepeye çıkış süresi, FDHM: sparkın maksimumdan yarıya inme süresi). *P<0,05; Zn2+ sparkına göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.10. Hücre içi ve dışı Zn2+ değişiminin Zn2+ ve Ca2+ spark parametrelerine olan etkisi. FluoZin-3 (AM) veya Fluo-3 (AM) boyası ile inkübe edilen kardiyomiyositlerden kaydedilen Zn2+ ve Ca2+ spark frekans ve genlikleri. Hücreler sırasıyla 50µm TPEN, 1µM ZnPT, 1µM ZnPT+50µM TPEN ve 100µM ZnCl2’ya maruz bırakılmışlardır. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 17-20 hücre kullanılmıştır. *p<0,05; kontrole göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

İzole kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra ortama

50µM TPEN eklenmiştir. TPEN Ca2+ sparklarının genlik ve frekansına bir etki

göstermezken Zn2+ sparklarının frekansının %50 genliğini ise %20 oranında

azaltmıştır. Aynı şekilde kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal kayıt

alındıktan sonra ortama 1µM ZnPT uygulaması Ca2+ spark frekans ve genliğine etki

etmezken Zn2+ spark frekansını değiştirmeden genliği anlamlı derecede arttırmıştır.

ZnPT ardından 50µM TPEN eklenmesi ise Zn2+ spark frekansını ve genliğini

düşürürken Ca2+ spark parametrelerinde bir değişime neden olmamıştır. Hücre dışı

0.0

0.5

1.0

*

0.0

0.5

1.0

Fluo

Zin-

3(D

F/F

0) Fluo-3

( DF/F

0 )

†

*

*0.0

0.8

1.6

2.4

Fre

kans

(100

m

-1s-1

)

0.0

0.8

1.6

2.4 Frekans

(100m

-1s-1)

KONTPENZnPT+ TPEN

ZnCl2

*

43

çinkonun ZnCl2 (100-µM) ile arttırılması ise hem Ca2+ hem de Zn2+ parametrelerinde

bir değişime neden olmamıştır.

3.1.9. Hücre İçi Lokal ve Global Zn2+ Değişimi ve Dış Ortam Ca2+ Miktarı

Arasındaki İlişki

Kalsiyum iyonu (Ca2+) kalp kasının kasılmasında önemli bir role sahiptir. Ancak

hücre içindeki Ca2+ kadar hücre dışında bulunan Ca2+’da kasılmanın başlayabilmesi

için gereklidir. Kalp kasında kasılma aksiyon potansiyeli (AP) oluşumuyla birlikte L-

tipi Ca2+-kanallarının açılması ve hücre içine Ca2+ girmesiyle başlamış olur. Bu hücre

içine giren Ca2+ ryanodine reseptörlerinden daha fazla Ca2+ çıkışına sebep olur

(Ca2+-induced Ca2+–release) ve kasılma bundan sonra Ca2+‘nun troponinC’ye

bağlanmasıyla başlar. Bu çalışmanın bu bölümünde hücre dışı Ca2+’nun Zn2+ ve Ca2+

transientlerine olan etkisini araştırılmıştır. Hücreler hücre dışı Ca2+ içeriği 1,8 mM

olan KREBS solüsyonu ile 2 dakika boyunca perfüze olurken, perfüzyon içeriği 0

mM Ca2+ olan KREBS solüsyonu ile değiştirilmiştir. Perfüzyondan sonra hem Zn2+

ve hem de Ca2+ transientlerinin tamamen ortadan kalktığı görülmüştür. Perfüzyon

tekrar içeriği 1,8mM Ca2+ olan KREBS solüsyonu ile değiştirildiğinde Zn2+ ve Ca2+

transientlerinin tekrar oluşmaya başladığı ve başlangıç değerine geldiği görülmüştür

(Şekil 3.11).

Zn2+ transientlerinin dış ortamdaki Ca2+’a olan bağlılığını göstermek için yapılan bir

diğer deney protokolünde ise, hücreler 1,8mM Ca2+ içeren KREBS çözeltisinde iken

0mM Ca2+’ luk KREPS çözeltisi ile perfüze edilmeye başlanmıştır. Zn2+ ve Ca2+

transientleri tamamen ortadan kalktıktan sonra hücreler 1µM ZnPT içeren KREBS

çözeltisi ile perfüze edilmiştir. 1µM ZnPT, Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin oluşumuna

bir katkıda bulunmazken sadece bazal FluoZin-3 floresans miktarında artışa neden

olmuştur. Hücrelerin tekrar 1,8 mM Ca2+ içeren KREBS solüsyonu ile perfüze

edilmesi Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin tekrar oluşmasını sağlamıştır. Ardından

eklenen 50µM TPEN ise Zn2+ transientlerini tamamen ortadan kaldırırken Ca2+

transientlerinde bir değişime neden olmamıştır. Bu sonuçlar, hücre dışı Ca2+’un hem

44

Ca2+ hem de Zn2+ transientlerinin oluşmasında önemli bir role sahip olduğunu

göstermektedir (Şekil 3.12).

Şekil 3.11. Hücre dışı Ca2+’nun Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile inkübe edilen kardiyomiyositler elektrik alan uyarısı ile uyarılarak Zn2+ ve Ca2+ transientlerine bakılmıştır. Dış ortamdaki Ca2+ uzaklaştırıldığında (0mM) Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin ortadan kaybolduğu gözlenmiştir. Dış ortamdaki Ca2+ tekrar normal seviyeye getirildiğinde (1,8mM) ise Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin eski haline geldiği gözlenmiştir. Deney protokolüne ait örnek şekil ve bar grafik sırasıyla şekilde üst ve alt tarafta yer almıştır. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 10-12 hücre kullanılmıştır.

Ca2+

(mM) 1.8 0 1.8 1.8 0 1.8 0

25

50

75

100

125

0

25

50

75

100

125

Fluo

Zin-

3 ( D

F %

) Fluo-3 (D F %)

45

Şekil 3.12. Hücre dışı Ca2+’nun Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile inkübe edilen kardiyomiyositler elektrik alan uyarısı ile uyarılarak Zn2+ ve Ca2+ transientlerine bakılmıştır. Dış ortamdaki Ca2+ uzaklaştırıldığında Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin ortadan kaybolduğu ve yerine 1µM ZnPT eklendiğinde Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin tekrar oluşumuna katkı sağlamadığı gözlenmiştir. Dış ortamdaki Ca2+ tekrar 1,8mM’a getirildiğinde transientlerin tekrar oluştuğu gözlenmiştir. 50µM TPEN eklenmesi ise Zn2+ transientlerini tamamen ortadan kaldırırken, Ca2+ transientlerine etki etmemiştir. Deney protokolüne ait örnek şekil ve bar grafik sırasıyla şekilde üst ve alt tarafta yer almıştır. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 9-12 hücre kullanılmıştır.

3.1.10. Hücre İçi Zn2+ Homostazında Hücre İçi Ca2+ Depolarının Rolü

Kardiyomiyositlerde sarkoplazmik retikulum (SR) en önemli Ca2+ deposu olarak

bilinmektedir. SR üzerinde bulunan ryanodine reseptörleri (RyR2) ise Ca2+’ u

SR’dan sitozole taşıyan bir kanal olarak görev yapmaktadır. Aynı zamanda Ca2+ için

bilinen diğer bir depo ise mitokondridir.

0

50

100

0

50

100

Zn+2

Tra

nzie

nt(%

değ

işim

)

Ca

+2 Tranzient(%

değişim)

1,8 mM Ca2+ + - - + + + - - + +

0 mM Ca2+ - + + - - - + + - -

1 µM ZnPT - - + - - - - + - -

50 µM TPEN - - - - + - - - - +

46

Şekil. 3.13. Hücre içi Zn2+ homostazında hücre içi Ca2+ depolarının rolü. FluoZin-3 ve fluo-3 boyaları ile inkübe edilen kardiyomiyositler elektriksel uyarı altında Zn2+ ve Ca2+ transientleri alınırken sırasıyla RyR2 kanal blokörü ryanodine (1-µM), mitokondrial komplex1 inhibitörü rotenone (RT;1 µM) ve bir mitokondrial protonofor olan carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) (FCCP; 1 µM) ile perfüze edilerek bu ajanların Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkileri. Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 15-20 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

Çalışmamızın bu bölümünde, Zn2+ transientlerinin oluşumunda SR ve mitokondrinin

rolü araştırılmıştır. FluoZin-3 ve Fluo-3 AM boyaları ile inkübe edilen hücrelerden

elektriksel uyarı altında Zn2+ ve Ca2+ transientleri alınırken sırasıyla RyR2 kanal

blokörü ryanodine (1µM), mitokondrial kompleks1 inhibitörü rotenone (RT;1µM)

ve bir mitokondrial protonofor olan carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) (FCCP;

1µM) ile perfüze edilerek bu ajanların Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan etkileri

incelenmiştir. Ryanodine Zn2+ ve Ca2+ transientlerini tamamen ortadan kaldırırken,

RT ve FCCP Zn2+ transientlerinde yaklaşık %50 azalmaya neden olmuş, Ca2+

47

transientlerinde ise anlamlı bir değişime neden olmamıştır (Şekil 3.13). Bu ajanların

hiçbirisi bazal Zn2+ ve Ca2+’ a etki etmemiştir.

Çalışmanın diğer bir bölümünde, hücre içi Ca2+ miktarındaki artışının, Zn2+

transientlerine ve hücre içi Zn2+ miktarına olan etkisi incelendi. Hücre içi Ca2+

miktarı hücre dışı Na+ miktarının 117-mM’dan 10-mM’a düşürülmesi ile elde

edilmiştir. Bu sayede ters modda çalışacak olan Na+/Ca2+ değiş-tokuşçusu ile hücre

içine Ca2+ depolanması sağlanmıştır. Elektriksel uyarı altındaki FluoZin-3 ve Fluo-3

ile inkübe edilmiş kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal Zn2+ ve Ca2+

transientleri alındıktan sonra, perfüzyon düşük Na+ ile değiştirilmiştir (10mM Na+).

Düşük Na+ ile perfüzyon sonrası bazal Ca2+ ve Zn2+ floresans miktarları artarken,

bazal Ca2+ ve Zn2+ transientlerinde dalgalanmaların meydana geldiği görülmüştür.

1µM ZnPT ile perfüzyon ise bazal Zn2+ miktarını arttırırken, transientleri ortadan

kaldırmıştır. Bazal Ca2+ miktarında veya transientlerde ise bir değişime neden

olmamıştır. Deney sonunda 50µM TPEN eklenmesi bazal Zn2+ floresansını

düşürürken, bazal Ca2+ floresans miktarında bir değişime neden olmamıştır.

Aynı şekilde 10µM ZnCl2 uygulaması düşük Na+ perfüzyonu sonrası artmış olan

bazal Zn2+ ve Ca2+ floresans miktarında veya transientlerde bir değişime neden

olmazken, 50µM TPEN ile perfüzyon bazal Zn2+ floresans miktarını azaltırken

transientler tamamen ortadan kalkmıştır. 50µM TPEN bazal Ca2+ floresans

miktarında veya transientlerde bir değişime neden olmamıştır (Şekil 3.14A-D).

48

Şekil. 3.14. Zn2+ depolarının belirlenmesi: düşük Na+ ve hücre dışı asidifikasyonun etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin sırasıyla düşük Na+ (10mM) içeren KREPS solüsyonu varlığında, 1µM ZnPT ve 50µM TPEN ile perfüze edildiklerinde elektrik alan uyarı altındayken verdikleri Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller ve bar grafik (A ve C). FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin sırasıyla düşük Na+ içeren KREPS solüsyonu varlığında, 10µM ZnCl2 ve 50µM TPEN ile perfüze edildiklerinde dinlenim durumunda verdikleri Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller ve bar grafik (B ve C). Kardiyomiyositlerin düşük Na+ içeren KREPS solüsyonu ile perfüze edildiklerindeki oluşturdukları transientlerin büyüklüklerinin karşılaştırılması (D). FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin elektrik alan uyarısı altındayken hücre dışı asidik pH’ta (pH=6,0) oluşturdukları Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller ve bar grafik (E ve F). Deneylerde kullanılan toplam hücre sayısı, n=7-12 ve *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

E F

A B

C D

49

Bilindiği gibi hücre içinde Zn2+’nun büyük bir kısmı proteinlere bağlı olarak

bulunmaktadır. Bu deney protokolünde, pH’ı değiştirerek protein tiollerindeki (SH)

kimyasal modifikasyona bağlı olarak Zn2+’nun salınmasını sağlanmıştır. Hücre dışı

pH’nın 7,4’ten 6,0’a indirerek hücre içi pH’nın düşürülmesi hedeflenmiştir. Hücre içi

pH’nın düşürülmesi ile bazal Zn2+ floresans miktarında anlamlı derecede bir artış

meydana gelirken, Ca2+ floresans miktarında bir değişim gözlenmemiştir. pH’nın

düşürülmesi Zn2+ ve Ca2+ transientlerini anlamlı derecede azaltmıştır. 50µM TPEN

ile perfüzyon sonrası artan bazal Zn2+ floresansı azalırken, Ca2+ floresans miktarında

bir değişim gözlenmemiştir. 50µM TPEN’nin hem Zn2+ ve hem de Ca2+

transientlerine etki etmemiştir (Şekil 3.14 E ve F).

3.2. Hücre içi Serbest Zn2+ Değişimi ile Oksidatif/Nitrosatif Stres Arasındaki

İlişki

3.2.1. Oksidatif Stres Artışı ile Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişimindeki Artış

Arasındaki İlişki

Zn2+ redoks denge mekanizmasında önemli bir hassasiyete sahiptir. Zn2+ kendisi

redoks inert bir iyon olmasına rağmen hücre içinde redoks durumun değişiminden

çok çabuk etkilenebilir. Hücrede bir şekilde oksidatif stresin artması Zn2+’u bağlı

olduğu proteinlerden ayrılmasına veya depolardan salınmasına neden olabilmektedir.

Artan oksidatif stres glisemi kontrolünün düştüğü kronik diyabet hastalarında

görülen bir bulgudur. Burada yaptığımız çalışmada artan oksidatif stresin hücre içi

serbest Zn2+ miktarına olan etkisi araştırılmıştır.

Deney protokolümüzün ilk aşamasında sıçan kalplerinden izole edilen

kardiyomiyositler Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına bakmak için sırasıyla FluoZin-3 (AM)

veya Fluo-3 (AM) ile inkübe edilmişlerdir. Hücreler polylzin kaplı küvet içerisine

yerleştirilerek elektrik alan uyarısı altında 2 dakika boyunca bazal kayıtlar alındıktan

sonra perfüzyon içerisinde 100µM H2O2 içeren KREPS solüsyonu ile değiştirilmiştir.

H2O2 bazal FluoZin-3 ve Fluo-3 floresans miktarlarını yaklaşık %40 oranında

arttırmıştır. Zn2+ ve Ca2+ transientleri sırasıyla %20 ve %10 oranında artmıştır.

50

Deney sonunda hücrelerin 500µM DTT veya 50µM TPEN ile perfüzyonu, FluoZin-3

floresans miktarını bazal seviyeye indirirken, Fluo-3 floresansını sadece 500µM DTT

uygulaması bazal seviyeye indirmiştir (Şekil 3.15).

Deneyin ikinci aşamasında ise, konfokal mikroskobu kullanılarak dinlenim

durumundaki hücrelerden bazal Zn2+ kayıtları alınmıştır. Bunun için, FluoZin-3

(AM) ile boyalı izole kardiyomiyositlerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan

sonra, bu hücrelere 100µM H2O2 eklenerek 10 dakika boyunca bazal floresans

miktarındaki değişim izlenmiştir. Deney sonunda bazal floresans miktarının H2O2

verilmeden önceki değeriyle karşılaştırıldığında %25 oranında arttığı gözlenmiştir.

Bu artışın ardından bir indirgeyici ajan olan DTT (500µM) eklenerek floresans

miktarındaki değişime bakılmıştır. Floresans miktarı DTT ile birlikte bazal seviyenin

altına inmiştir. Tüm deneyler 37oC’de gerçekleşmiştir (Şekil 3.16).

Şekil 3.15. Hücre içi serbest Zn2+ miktarına oksidasyonun etkisi. FluoZin-3 ve Fluo-3 boyaları ile yüklü hücrelerin sırasıyla 100µM H2O2 ve 500µM DTT veya 50µM TPEN ile perfüze edildiklerinde elektrik alan uyarı altındayken verdikleri Zn2+ ve Ca2+ yanıtlarına ait kaydedilen örnek şekiller (A). Uygulamalara ait değerler bar grafik olarak verilmiştir (B). Deneylerde toplam 4-5 hayvan kalbinden izole edilen 15-20 hücre kullanılmıştır ve *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

A

B

51

Şekil. 3.16. Hücre içi serbest Zn2+ miktarına oksidasyonun etkisi. FluoZin-3 ile yüklenmiş kardiyomiyositlerde H2O2 ve DTT’nin bazal floresans miktarındaki meydana getirdiği değişimlere ait örnek konfokal resimleri. Hücrelerden iki dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra bir grup hücreye 100µM H2O2 ve ardından 500µM DTT uygulanmıştır (A). Uygulamalara ait değerler bar grafik olarak verilmiştir (B). Deneylerde toplam 3 hayvan kalbinden izole edilen 5-7 hücre kullanılmıştır ve *P<0,05; başlangıç durumuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

3.2.2. Nitrosadatif Stres Artışı ile Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişimindeki Artış

Arasındaki İlişki

Birçok çalışmada in vitro glükoz artışının endotelyal nitrit oksit (eNOS) gen ve

protein ekspresyonunu upregüle ettiği ve buna bağlı olarak nitrit oksit üretimini hem

hayvanlarda hem de insanlarda arttırdığı gösterilmiştir (Pandolfi ve Di-Pietro, 2010).

Aynı zamanda artan nitrit oksidin hücre içi iyon hemoztazında da değişikliklere

neden olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Høyda ve ark., 2007; Xi ve ark.,

2010). Yaptığımız bu çalışmada endojen olarak nitrit oksidin arttırılmasının hücre içi

çinko miktarında bir değişime neden olup olmadığı araştırılmıştır. FluoZin-3 (AM)

ile boyalı kardiyomiyositlerden 37oC’de 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan

sonra bir nitrit oksit donörü olan NaNO2 (100µM) verilmiştir. 10 dakika boyunca

NaNO2 varlığında alınan kayıtlarda bazal floresans değerinin başlangıç durumuyla

kıyaslandığında %20 oranında arttığı bulunmuştur. Bu floresans değişiminin hücre

içi Zn2+ artışından kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak için ise deney sonunda

hücrelere 50µM TPEN verilmiştir. TPEN’nin ardından FluoZin-3 floresansı hızlı bir

şekilde düşerek bazalın altına inmiştir. Diğer bir deney grubunda ise, bazal çinkodaki

artışın cGMP aracılı olup olmadığını anlamak için, hücreler 30 dakika boyunca bir

+H2O

2 +DTT

2O2+H +D

TT0

50

100

150*

Fluo

Zin-

3 (D

F/F 0

%)

A B

52

guanilaz siklaz inhibitörü olan 30µM ODQ ile inkübe edilmişlerdir. İnkübe edilen

hücrelerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra tekrar 100µM NaNO2

uygulanmıştır. 100µM NaNO2 uygulaması bazal floresans değerinde herhangi bir

değişime neden olmamıştır. Ardından verilen TPEN ise bazal Zn2+‘nu daha önceki

deneylerde olduğu gibi bazal seviyenin altına indirmiştir (Şekil 3.17).

Şekil 3.17. Hücre içi serbest Zn2+ miktarına nitrosadatif stresin rolü. FluoZin-3 ile yüklenmiş kardiyomiyositlerde nitrit oksit donörü NaNO2’nin ve gunalylyl siklaz inhibitörü olan ODQ’nun FluoZin-3 floresansında meydan getirdiği değişimlere ait örnek şekiller. Hücrelerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra bir grup hücreye 100µM NaNO2 ve ardından 50µM TPEN uygulanmıştır. Diğer grup hücreler ise 30 dakika boyuca 30µM gunalylyl siklaz inhibitörü olan ODQ ile inkübe edildikten sonra 100µM NaNO2 ve 50µM TPEN uygulanarak bazal floresanstaki değişimin cGMP yolağı üzerindeki rolüne bakılmıştır (A). Uygulamalara ait değerler bar grafik olarak verilmiştir (B). Deneylerde kullanılan toplam hücre sayısı, n=5-9 Tüm değerler, başlangıç durumuna göre % değişim olarak verilmiştir. *P<0,05; bazala göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

2

+NaN

O+T

PEN+ODQ 2

+NaN

O+T

PEN0

50

100

150*

Fluo

Zin-

3 (D

F/F 0

%)

B

+NaNO2 +TPEN ODQ +NaNo2 +TPEN +ODQ A

53

3.2.3. Hücre İçi Serbest Zn2+ Derişiminin Artışı ve Ryanodin Reseptörü

Kompleksi Arasındaki İlişki

Kardiyomiyositlerde hücre içi Ca2+ regülasyonunda SR önemli bir role sahiptir.

Kasılma mekanizmasında yeterli [Ca2+]i yükselişi, SR'ı gelişmiş kalp hücrelerinde

SR'dan salınan Ca2+ ile meydana gelmektedir. Kalp kasında Ca2+’ un SR’dan

salınması SR membranı üzerinde bulunan ve Ca2+ ile aktive olan ryanodine

reseptörleri (RyR2) sayesinde gerçekleşir. Çeşitli tipte ve sayıda düzenleyici

proteinler RyR2’ye bağlanarak daha büyük bir makromoleküler yapı

oluşturmaktadırlar. Bu proteinlere, kalmodulin (CaM), FKBP12.6, PKA örnek olarak

verilebilir. Herhangi bir nedenle kinazların aktivasyonu sonucu RyR2’lerinin

fosforile olması veya regüle edici proteinlerin miktarının azalması, reseptörün

konformasyonun değişmesine ve Ca2+’ un depolardan sızmasına neden olur. Bu ise

hücre içi iyon hemostazında değişimlere yol açabilir. Çalışmanın bu bölümünde

hücre içi serbest Zn2+ ([Zn2+]i) artışının RyR2 ve fosforile formu (pRyR2), CaMKII

ve fosforile formu (pCaMKII), PKA ve fosforile formu (pPKA) ile FKBP12.6

protein miktarlarına olan etkisi incelenmiştir.

Sıçan kalbinden izole edilen kardiyomiyositler 20 dakika boyunca 37 oC’de 1 ve

10µM ZnPT ile inkübe edilmişlerdir. ZnPT ile inkübe edilen ve kontrol grubu

kardiyomiyositlerinde, yukarıda belirtilen proteinlerin miktarlarına bakılmıştır. Elde

edilen sonuçlardan sırasıyla 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonu, kontrol grubuna göre

karşılaştırıldığında RyR2, CaMKII, PKA ve FKBP12.6 protein miktarlarında bir

değişime neden olmamıştır (Şekil 3.18). Ancak 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonu

RyR2, CaMKII ve PKA fosforile formlarının protein miktarlarında kontrol grubu ile

karşılaştırıldığında sırasıyla %60 ve %97, % 94 ve %206 oranında artışa neden

olmuştur. (Şekil 3.18). RyR’nin başlangıçta fosforile durumu bulunmamaktadır.

Ancak 1µM ZnPT inkübasyonu ile birlikte fosforile olmaya başlamıştır. 20 dakika

10µM ZnPT inkübasyonu ise, 1µM ZnPT uygulaması ile karşılaştırıldığında %50

oranında RyR fosforilasyonunu arttırmıştır (Şekil 3.19).

54

Şekil 3.18. Sıçan kardiyomiyositlerinde ZnPT inkübasyonlarının protein miktarlarına olan etkisi. Kontrol (KON) ve 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonuna ait grupların FKBP12.6 (A), CaMKII (B), PKA (C), RyR (D) protein miktarları için ortalama±SEM değerlerin bar grafik gösterimleri. Gruplara ait tüm western blot örnek resimleri bar grafik üstlerinde verilmiştir.

55

Şekil 3.19. Sıçan kardiyomiyositlerinde ZnPT inkübasyonunun fosforile protein miktarlarına olan etkisi. Kontrol (KON) ve 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonuna ait grupların pCaMKII (A), pPKA (B) ve pRyR (C) protein miktarları için ortalama±SEM değerlerin bar grafik gösterimleri. Gruplara ait tüm western blot örnek resimleri bar grafik üstlerinde verilmiştir. *P<0,05 vs KON grubuna göre, †P<0,05 vs +ZnPT1 grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Aynı zamanda her bir protein miktarı kendi fosforile protein miktarları ile

oranlandığında pCaMKII/CaMKII ve pPKA/PKA oranlarının kontrol grubu ile

karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı derecede arttığı görülmüştür (Şekil

3.20).

Şekil 3.20. Sıçan kardiyomiyositlerinde ZnPT inkübasyonunun pCaMKII/CaMKII ve pPKA/PKA ve pRyR/RyR oranlarına olan etkisi. Kontrol (KON) ve 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonuna ait grupların pCaMKII/CaMKII (A), pPKA/PKA (B) ve pRyR/RyR (C) oranları ortalama±SEM değerlerin bar grafik gösterimleri. Gruplara ait tüm western blot örnek resimleri bar grafik üstlerinde verilmiştir. *P<0,05 vs KON grubuna göre, †P<0,05 vs +ZnPT1 grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

A B C

*† *†

A B C

KON

+ZnPT1

+ZnPT10

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

**

pPK

A/P

KA

KON

+ZnPT1

+ZnPT10

0.0

1.0

2.0

3.0

*

*

pCaM

KII/

CaM

KII

KON

+ZnPT1

+ZnPT100.0

0.5

1.0

1.5

*

*†

pRYR

/RyR

56

3.3. Hücre İçi Serbest Zn2+ Değişimi ile Hiperglisemi Arasındaki İlişkisi

3.3.1. Hiperglisemi ve Sistemik/Hedef Organ Oksidatif Stres Artışı Arasındaki

İlişki

Çalışmanın son bölümünde, başlangıçta ağırlıkları (200-250g) ve kan şekeri

düzeyleri (90-100 mg/dL) aynı olan 3 aylık sıçanlar kullanılmıştır. Sıçanların bir

kısmı alınarak STZ enjeksiyonu ile diyabet yapılmıştır. STZ enjeksiyonu ile diyabet

yapılan sıçanlar ve kontrol olarak bekletilen sıçanların ağırlıkları ile kan şekerleri

tekrar ölçülerek Şekil 3.21’de her bir grubun ilk kolonuna yazılmıştır. Başlangıçta

tüm deney gruplarının ağırlıkları ve kan şekeri düzeyleri birbirlerine yakın düzeyde

iken, birinci haftadan itibaren diyabetli grupların kan şekeri düzeylerinin kontrol

grubuna göre 3–4 kat yüksek kaldığı (STZ enjeksiyonunu takiben ilk haftadaki değer

seviyesinde) gözlenmiştir. Deney sürecinin sonunda diyabetik gruplarda ağırlıkların

kontrol gruplarına göre anlamlı derecede düşük olduğu, kan şekerlerindeki

yükselmenin de yine istatistiksel olarak anlamlı derece de yüksek olduğu

görülmektedir.

Şekil. 3.21. Hayvanların vücut ağırlıkları ve kan şekeri parametreleri. Kontrol, diyabet ve 5-hafta boyunca N-acetylcysteine cysteine (NAC) ile beslenmiş diyabetli hayvanların 1. ve 5. haftada kaydedilen vücut ağırlıkları ve kan şekeri parametreleri sırasıyla her grubun birinci ve ikinci kolonunda verilmiştir. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

57

Kontrol grubunda bulunan hayvanların ağırlıklarda deney süresi boyunca düzenli bir

artış olduğu, kan şekeri değerlerinin ise, değişmediği gözlenmiştir. Diyabet grubunda

ise vücut ağırlıklarında istatistiksel olarak anlamlı derecede azalma olduğu ve kan

şekeri düzeyinin kontrollere göre 4 kat artış olduğu gözlenmiştir. N-acetyl cysteine

(NAC) ile 5 hafta boyunca beslenmiş olan diyabetli grupta ise kan şekeri düzeyinde

başlangıç durumuna göre bir değişim gözlenmediği, vücut ağırlıklarında ise diyabetli

grubundan farklı olarak artış meydana geldiği gözlenmiştir (Şekil 3.21).

Serbest radikaller birçok hastalığın patogenezinde yer alan yüksek oranda oksijen

içeren moleküllerdir. Serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma sistemi

arasında kritik bir denge vardır. Bu çalışmada 3 aylık kontrol diyabet ve 5 hafta

boyunca NAC ile beslenmiş sıçanlardan alınan plazma örneklerinde oksidatif stres

göstergeleri olan malondialdehide (MDA) indirgenmiş glütatyon (GSH) ve okside

glütatyon (GSSG) miktarlarına bakılmıştır. Hiperglisemiye bağlı oksidatif stres

oluşumunu belirlemek için, sıçan plazmalarında lipid peroksidasyon seviyesine

bakılmıştır. Lipid peroksidasyonu, oksidatif hasar sonucu meydana gelen lipid

degredasyonudur. Bundan dolayı oksidatif stres ölçümlerinde önemli bir marker

olmuştur. Polyunsaturated lipidler, reaktif oksijen türleri tarafından gerçekleştirilen

oksidatif saldırıya karşı en açık olanlardır. Lipidlerde meydana gelen oksidasyon

sonucu son ürün olarak oluşan MDA miktarının belirlenmesiyle, hücrede veya

dokuda oksidatif stres hakkında bilgiye sahip olunabilir. Aynı şekilde, hipergilisemi

indüklü oksidatif stres oluşumunu göstermek için kalp dokusundan alınan örneklerle

MDA seviyesine bakılmıştır (Şekil 3.22). STZ enjeksiyonu ile oluşturulan diyabet

modelinde MDA seviyesi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında yaklaşık 3 kat

artarken (324±31 ve 917±36 μmol/mg protein, sırasıyla kontrol ve diyabet grubu), 5

hafta boyunca NAC ile beslenmiş diyabetli hayvanlarda (DM+NAC) MDA seviyesi

kontrol seviyesine gerilediği gözlenmiştir (298±47 μmol/mg protein).

58

Şekil 3.22. Plazmadan ölçülen MDA seviyesi ve glütatyon miktarları. 5 hafta boyunca diyabet kalmış grupta kontrol grubu ile karşılaştırıldığında MDA seviyesi artarken GSH/GSSG oranı azalmıştır. N-acetylcysteine cysteine (NAC) ile 5 hafta boyunca beslenmiş olan diyabetli grup bu değerleri kontrol seviyesine getirmiştir. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Hücre veya dokuda oksidatif stres durumu hakkında bilgi edinebilmek için bir diğer

yöntem ise, indirgenmiş ve okside glütatyon (sırasıyla, GSH ve GSSG) miktarlarına

bakmaktır. GSH birçok canlı hücrede bulunan, protein sülfidrillerinin oksidasyon

durumlarının korunmasında ve hidroperoksidlerin yıkımı gibi birçok biyolojik

süreçte rol oynayan bir tripeptidtir. Aynı zamanda hayvan dokularında bulunan

önemli ve anahtar role sahip bir antioksidandır. Toplam glutatyonun %90-95 kadarı

indirgenmiş durumda bulunmaktadır. Glütatyonun oksidasyonu ile glütatyon disülfit

oluşur (GSSG). Redoks durumunu göstermek için glutatyon kiti kullanılarak

GSH/GSSG oranına bakılmıştır. Elde edilen sonuçlarda bu oranın diyabetli grupta

(27±3), kontrol grubu (41±4) ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede düştüğü

görülmüştür. 5 hafta boyunca NAC ile beslenen diyabetli grupta ise GSH/GSSG

oranı kontrol seviyesine gelmiştir (48±9). Bu sonuçlar da gösteriyor ki, kalpte redoks

durumu hiperglisemi ile değişim göstermiştir (Şekil 3.22).

59

Şekil 3.23. Serbest ve toplam protein thiol (SH)’larının belirlenmesi. 5 hafta boyunca diyabet kalmış grupta kontrol grubu ile karşılaştırıldığında protein serbest SH miktarı azalmıştır. Aynı süre boyunca diyabet kalmış grupta N-Acetylcysteine (NAC) tedavisinin uygulanması bu değerleri kontrol seviyesine getirmiştir. Toplam SH miktarında ise gruplar arasında bir fark gözlenmemiştir. *p<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Hücre içinde redoks durumunda meydan gelen değişimin göstergelerinden biri de

protein tiol (SH) gruplarındaki oksidasyondur. Thioller, güçlü indirgeyici

kapasitelerinden ve serbest radikaller ile kolayca etkileşebilme özelliklerinden

dolayı, proteinleri, hücre lipidlerini ve oksidatif hasara karşı nükleik asitleri koruyan

oldukça önemli antioksidantlardır. Kalp dokusundan alınan örneklerle yapılan

deneylerde serbest tiyol miktarının diyabetli grupta (1,3±0,3 mol/mg) kontrol

grubuna göre (2,8±0,2 mol/mg) anlamlı derecede azaldığı gözlenmiştir. Bununla

birlikte, 5 hafta boyunca NAC tedavisi uygulanan diyabetli grupta serbest thiol

miktarının arttığı gözlenmiştir (2,7±0,3 mol/mg). Aynı zamanda toplam thiol

miktarlarında hem diyabetli grupta hem de NAC tedavisi uygulanmış diyabetli

grupta, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bir değişim olmadığı gözlenmiştir (Şekil

3.23).

Bu sonuçlar, STZ enjeksiyonu ile oluşturulan diyabet modelinde, oksidatif stres

göstergelerinden lipid peroksidasyonunda, okside glutatyon miktarında ve tiyol

oksidasyonunda önemli miktarda artışın olduğu ve antioksidan tedavisinin bu olayı

kontrol edebildiğini göstermiştir.

KON DM

DM+NAC

KON DM

DM+NAC

0

2

4

6

8

0

2

4

6

8

*

Serb

est S

H(

mol

/mg)

ToplamSH

( mol/m

g)

60

3.3.2. Hiperglisemi İndüklü Artan Oksidatif Stres Bazal Hücre İçi Serbest Zn2+

Artışına Neden Olur

Buraya kadar yapılan çalışmalarda, oksidasyonun hücre içi serbest Zn2+ artışında

önemli bir yere sahip olduğu görülmüştür. Bu nedenle oksidatif stresin artmış olduğu

bilinen diyabetli gruplarda serbest Zn2+ ölçümleri yapılmıştır. Bu ölçümlerde

ratiometrik bir boya olan Fura-2 (AM) kullanılmıştır. Bu deney grubunda

hayvanların bir kısmı kontrol olarak bırakılırken, bir kısmı 3 aylık iken STZ ile

diyabet oluşturulmuştur. Diyabet grubu hayvanların bir kısmı 1 ay süresince bir

antioksidant olan N-cetayl cysteine (DM+NAC; 150 mg/kg/gün) ile beslenmiştir.

Diyabet oluşturulduktan 1 ay sonra hayvanlar serbest Zn2+ ölçümleri için hazır hale

getirilmişlerdir. Serbest [Zn2+]i ve [Ca2+]i ölçümleri oluşturulan kontrol, diyabet, 1 ay

boyunca NAC ile beslenmiş diyabetli gruptan izole edilen kardiyomiyositlerde

ölçülmüştür. Buna ek olarak diyabetli gruptan izole edilen kardiyomiyositler 1 saat

boyunca bir antioksidant olan NAC (+NAC; 1mM) ile inkübe edilerek serbest [Zn2+]i

ve [Ca2+]i miktarlarına bakılmıştır. Serbest Zn2+ ölçümleri, bazal floresans kaydı

alındıktan sonra hücrelerin 30µM TPEN ile perfüze edilmesinden sonra bazal

floresans miktarındaki % azalmaya bakılarak hesaplanmıştır. Serbest Ca2+ miktarı ise

TPEN perfüzyonundan sonra elde edilen floresans değeri olarak verilmiştir. Bu

deneysel metod kullanılarak elde dilen sonuçlardan, diyabetli sıçanlardan izole edilen

kardiyomiyositlerde serbest [Zn2+]i seviyesi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında

%190 oranında arttığı görülmüştür. Diyabetli kardiyomiyositlerin 1 saat boyunca

NAC ile inkübasyonu veya diyabetli sıçanların 1 ay boyunca NAC ile beslenmesi

serbest [Zn2+]i miktarını kontrol seviyelerine çekmiştir. Aynı şekilde [Ca2+]i miktarını

%30 oranında arttırırken in vivo veya in vitro NAC uygulaması serbest Ca2+

miktarını azaltmıştır (Şekil 3.24).

Elde edilen sonuçlardan hipergliseminin serbest [Zn2+]i derişiminde artışa neden

olduğu gözlenmiştir. Aynı şekilde, hiperglisemi modelinin taklit etmek için 6 aylık

kontrol grubu kardiyomiyositler 50 mM glikoz (+GLU) ile 4 saat boyunca inkübe

edilerek serbest [Zn2+]i derişimine bakılmıştır. Bir diğer grupta ise, 6 aylık diyabet

grubu kardiyomiyositlerin bir kısmı 100nM insulin (+INS) ile 4 saat boyunca inkübe

61

edilerek [Zn2+]i’ya bakılmıştır. Elde edilen sonuçlarda bazal Zn2+ derişiminin

diyabetli grupta ve yüksek glikoz ile inkübe edilen grupta kontrol grubuna göre

yaklaşık 2kat artarken, insulin ile inkübe edilen grupta bazal Zn2+ derişiminin kontrol

seviyesine gerilediği gözlenmiştir (Şekil 3.24).

Şekil 3.24. Kontrol ve diyabet grubu sıçan kalplerinden izole edilen kardiyomiyositlerde hücre içi serbest Zn2+ belirlenmesi. 3 ay boyunca diyabet kalan grubun sitozolik Zn2+ miktarı kontrol grubu ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı derecede artmıştır. *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

Şekil 3.25. Hipergliseminin hücre içi serbest Zn2+ miktarına olan etkisi. Kontrol grubu kardiyomiyositlerin 4 saat boyunca 50mM glükoz (+GLU) ile inkübasyonu 3 ay boyunca diyabet olarak bekletilen sıçanlardan elde edilen kardiyomiyositlerdeki gibi kontrole göre anlamlı derecede artmıştır. Diyabet grubu hücrelerin 100nM insulin (+INS) ile inkübe edilmesi ise bazal Zn2+ miktarını kontrol seviyesine gerilemiştir. Deneylerde toplam 3 hayvan kalbinden izole edilen 10-15 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; KON6 grubuna göre istatistiksel olarak farkı belirtmektedir.

1 dak.

KON DM

DM+NAC

+NAC

KON DM

DM+NAC

+NAC

0

50

100

150

200

250

*

*

0

50

100

150

200

250

[Zn2+

] i(%

değ

işim

)

[Ca

2+]i(%

değişim)

KON6

+GLU

DM6

+INS

0

50

100

150

200

250

* *

[Zn2+

] i(%

değ

işim

)

KON

DM

DM+NAC

62

Bir başka metod olarak serbest [Zn2+]i derişimini ölçmek için Zn2+’ya karşı afinitesi

yüksek ve Ca2+’a afinitesi daha düşük bir boya olan FluoZin-3 (AM) kullanılmıştır.

Bu deney grubunda hayvanların bir kısmı kontrol olarak bırakılırken bir kısmı 3

aylık iken STZ ile diyabet oluşturulmuştur. Diyabet oluşturulduktan 3 ay sonra

hayvanlar serbest Zn2+ ölçümleri için hazır hale getirilmişlerdir. Kontrol ve diyabet

grubu hücrelerin bir kısmı 1 saat boyunca bir antioksidant olan NAC (+NAC; 1mM)

ile inkübe edilmiş ve serbest [Zn2+]i derişimine bakılmıştır. Bazal Zn2+ ölçümleri

daha önce anlatıldığı şekilde yapılmıştır. Kısaca, izole edilen hücreler FluoZin-3

(AM) ile 30 dakika inkübe edilmişlerdir. Hücreler boya ile yüklendikten sonra deney

grubundaki hücreler ayrı ayrı ve her seferinde eşit miktarda olmak üzere küvet

içerisine konulmuştur. Hücrelerden 2 dakika boyunca bazal kayıt alındıktan sonra bir

Zn2+ iyonoforu olan 10µM ZnPT ve ardından bir Zn2+ bağlayıcısı olan 50µM TPEN

eklenerek spektrofotometri cihazı kullanılarak maksimum ve minimum floresans

miktarları tespit edilmiştir. FluoZin-3’ün Zn2+ için Kd (Kd=15 nM) değerinden de

yararlanarak bazal Zn2+ derişimi ölçülmüştür. Elde edilen sonuçlarda bazal Zn2+

derişiminin diyabetli grupta yaklaşık %230 artarken, 1 saat boyunca 1mM NAC ile

inkübasyonun bazal Zn2+’nunu kontrol değerine çekmiştir. Kontrol grubu

hücrelerinin NAC ile inkübasyonu bazal Zn2+ derişiminde bir değişime neden

olmamıştır (Şekil 3.26).

Şekil 3.26. Kontrol ve diyabet grubu sıçan kalbinden izole edilen kardiyomiyositlerde FluoZin-3 (AM) boyası kullanılarak hücre içi serbest Zn2+ miktarlarının karşılaştırılması. Kontrol ve diyabet grubundan izole edilen kardiyomiyositler 1 saat boyunca 1mM NAC ile inkübe edilmişlerdir. Her seferinde eşit miktarda küvet içerisine yerleştirilen hücrelerden hücre içi serbest Zn2+ miktarlarına bakılmıştır. Değerler kontrol grubuna göre yüzde değişim cinsinden verilmiştir. Deneylerde toplam her grup için 3-5 hayvan kalbinden izole edilen 25-30 hücre kullanılmıştır. *P<0,05; KON6 grubuna göre istatistiksel farkı göstermektedir.

KON6

+NAC

DM6

+NAC

0

50

100

150

200

250 *

[Zn2+

] i( %

değ

işim

)

63

3.3.2. Hiperglisemi İndüklü Artan Oksidatif Stres Hücre İçi Zn2+

Homeostazının Değişmesine Neden Olur

Diyabetin ve diyabetli hayvanların bir antioksidan olan NAC ile beslenmesinin

(DM+NAC) veya 1 saat boyunca 4mM NAC ile inkübasyonun (+NAC) serbest Zn2+

ve Ca2+ değişimine olan etkisini daha ayrıntılı incelemek için, FluoZin-3 ve Fura-2

ile boyalı hücrelerden elektriksel uyarı sonucu oluşan Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin

genlik ve zaman parametrelerine bakılmıştır. Elde edilen sonuçlarda, diyabetli

grubun, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında Zn2+ ve Ca2+ transientleri azalırken

NAC ile beslenmiş diyabetli hayvanlardan izole edilen kardiyomiyositlerde veya

NAC ile 1 saat boyunca inkübe edilen diyabetli kardiyomiyositlerde Zn2+ (KON:

0,25±0,03; DM: 0,17±0,01; DM+NAC: 0,24±0,04; +NAC: 0,20±0,01) ve Ca2+

transientleri (KON: 0,35±0,02; DM: 0,19±0,03; DM+NAC: 0,35±0,04; +NAC:

0,28±0,04) kontrol grubuna yaklaşmıştır (Şekil 3.27 A ve B). Zn2+ transientlerinin

maksimuma ulaşma sürelerinde (TP) veya maksimumdan %50’ye iniş sürelerinde

(DT50) hiçbir grup arasında bir fark bulunmazken, Ca2+ transientlerinin TP ve DT50

süreleri diyabetli grupta anlamlı derece uzarken, NAC ile beslenmiş veya inkübe

edilmiş diyabetli grupta, kontrol veya diyabetli grup ile karşılaştırıldığında anlamlı

bir fark gözlenmemiştir (Şekil 3.27 C ve D).

64

Şekil. 3.27. Diyabetli sıçanların N-acetyl cysteine (NAC) ile beslenmesinin veya diyabetli kardiyomiyositlerin NAC ile inkübasyonunun hücre içi global Ca2+ veya Zn2+ değişimlerine olan etkisi. FluoZin-3 (alt) veya Fluo-3 (üst) ile yüklenen izole kardiyomiyositlerden elektrik alan uyarısı ile kaydedilen örnek Zn2+ ve Ca2+ transientleri (A). Kontrol (KON), diyabet (DM), NAC ile beslenmiş diyabetli grup (DM+NAC) ve 1 saat boyunca 1mM NAC ile inkübe edilen diyabetli gruptan kaydedilen Zn2+ ve Ca2+ transientlerinin maksimum genlikleri (B). Her gruptan kaydedilen Zn2+ transientlerinin tepeye çıkış süreleri (TP) ve maksimumdan %50’ye iniş süreleri (DT50). Her gruptan kaydedilen Ca2+ transientlerinin tepeye çıkış süreleri (TP) ve maksimumdan %50’ye iniş süreleri (DT50). Deneylerde toplam 3-4 hayvan kalbinden izole edilen 21-34 hücre kullanılmıştır *P<0,05; kontrol grubuna göre istatistiksel farkı belirtmektedir.

D C

B A

KON DM

DM+NAC

+NAC

KON DM

DM+NAC

+NAC

0.0

0.2

0.4

0.0

0.2

0.4

*

*

*F/Fo

(Zn2+

tran

zien

ti)

F/Fo(C

a2+ tranzienti)

65

4.TARTIŞMA

Zn2+ genel bir tanım ile fizyolojik öneme sahip bir hücre içi iyon olup, farklı

hücrelerde farklı ve çeşitli hücre içi mekanizmalarda ve temel hücre fonksiyonunda

önemli rol oynadığı uzun yıllardan beri bilinmektedir. Zn2+, biyolojik sistemlerde,

yapısal/regülatör metallo-proteinlere bağlı veya histokimyasal olarak reaktif olmak

üzere iki farklı durumda bulunur. Fizyolojik koşullarda, [Zn2+]i sıkı kontrol altında

regüle edilmekte buna karşın dinamik olarak da düzensiz bir şekilde hücre içinde

değişebildiği hipotezlenmektedir.

Bu çalışmada son dönemlerde geliştirilen, geniş dinamik aralığa sahip,

oksidasyondan etkilenmeyen ve Zn2+’ya afinitesi oldukça yüksek bir floresans boya

olan FluoZin-3 (AM) kullanılmıştır (Kd=15nM). Bu floresans boya 2mM’a kadar

olan Mg2+ konsantrasyonuna hiçbir yanıt vermemiştir. Aynı zamanda, FluoZin-3’ün

Ca2+’a olan hassasiyeti, Ca2+ konsantrasyonunun 1-5µM’dan fazla olduğu

durumlarda gerçekleşmektedir. 100µM’dan daha az Ca2+ konsantrasyonun FluoZin-3

floresansına katkısı sadece %5 oranında kalmaktadır (Martin ve ark., 2006). Hücre

içi ortamda Ca2+ konsantrasyonu 100µM’dan daha az olduğu düşünüldüğünde, hücre

içi Zn2+ Homeostazının incelenmesi için FluoZin-3 kullanılabilecek en iyi

boyalardan biridir.

Aynı şekilde, FluoZin-3’ün Zn2+’ya olan hassasiyetini test etmek için, FluoZin-3

(AM) ile yüklenmiş hücreler 1µM ZnPT (Zn2+ iyonoforu) ile perfüze edilmişlerdir.

Daha önceki yapılan çalışmada olduğu gibi, perfüzyon sonrası bazal floresansı

yaklaşık %250 arttığı, ardından 50µM TPEN (Zn2+ tutucusu) ile perfüzyonun ise,

floresans miktarını başlangıç değerinden yaklaşık %30 oranında azaldığı

gözlenmiştir (Martin ve ark., 2006). Fluo-3 (AM) ile yüklü hücrelerde ise, hem 1µM

ZnPT uygulaması hem de 50µM TPEN uygulaması bazal floresansta bir değişime

neden olmamıştır.

66

Çalışmamızın birinci bölümünde, [Zn2+]i’nun kardiyomiyositlerde fizyolojik

koşullarda uyarılma-kasılma çiftlenimini nasıl modüle ettiği ve fizyolojik koşullarda

bozulan bu çiftlenime hangi yollarla katkılarda bulunduğunun açıklığa

kavuşturulması hedeflenmiştir. Yapılan deneylerde, FluoZin-3 (AM) ile yüklenmiş

kardiyomiyositler, elektrik alan uyarı ile uyarıldıklarında Ca2+ transient kinetiklerine

benzer Zn2+ transientlerini oluşturdukları gözlenmiştir. Buna ek olarak, hiçbir uyarı

altında olmayan kardiyomiyositlerde ise, yine Ca2+ spark kinetiklerine benzer Zn2+

sparklarının oluştuğu gözlenmiştir. Bu değişimlerin Zn2+ kaynaklı olup olmadıklarını

anlamak için FluoZin-3 veya Fluo-3 (AM) ile yüklenmiş kardiyomiyositler 50µM

TPEN ile perfüze edilmişlerdir. TPEN ile perfüzyon sonrası, Zn2+ transientleri

%50’dan fazla oranda azalırken, Ca2+ transientlerinde bir değişim gözlenmemiştir.

Aynı şekilde Zn2+ sparklarında da, TPEN sonrası frekansı ve genliği azalırken, Ca2+

sparklarında bir değişim gözlenmemiştir. Elde edilen bu sonuçlar, daha önce yapılan

literatür verileri ile de uyum içerisindedir. Hem Ca2+ hem de Zn2+’ya afinitesi olan

Fura-2 (AM) veya FluoZin-3 (AM) ile yüklü kardiyomiyositlerde yapılan

deneylerde, hücreler elektriksel uyarı altındayken [Zn2+]i’da dalgalanmaların veya

transientlerin oluştuğu gözlenmiştir (Atar ve ark., 1995; Turan ve ark., 1997; Palmer

ve ark., 2006).

Bir başka deney protokolünde, floresansta meydana gelen değişimlerin [Zn2+]i

değişimi ile ilişkili olup olmadığını test etmek için, hücrelerden Zn2+ transient

kayıtları alınırken 1µM ZnPT uygulanmıştır. Uygulama sonucunda Zn2+

transientlerinin genliklerinin arttığı gözlenmiştir. Ardından bu değişimin gerçekten

Zn2+ kaynaklı olup olmadığını anlamak için, kayıt alınmaya devam ederken TPEN

uygulanmıştır. TPEN uygulaması sonrası, Zn2+ transientlerinin tamamen ortadan

kalktığı gözlenmiştir. Aynı zamanda Fluo-3 (AM) ile yüklenmiş hücrelerde de aynı

deneyler tekrarlanmış ve 1µM ZnPT’nın Ca2+ transientlerini azalttığı, ardından

uygulanan TPEN’de bu azalışı devam ettirdiği gözlenmiştir. Bu sonuçlar

doğrultusunda, [Zn2+]i artışı ile Zn2+ transientleri arasında bir ilişkinin olduğu

gözlenmiştir. Aynı deneyler, bu sefer hücre dışı Zn2+ konsantrasyonunu dereceli

olarak arttırılarak yapılmıştır. Elde edilen sonuçlarda, hem Zn2+ hem de Ca2+

transientlerinin azaldığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar da gösteriyor ki, kısa süreli hücre

67

içi Zn2+ değişimleri, hücre dışından Zn2+ girişiyle ilişkili değildir. Bunun en önemli

nedeni hem hücre içi hem de hücre dışı Zn2+’nun LTCC kanallarını bloke

edebilmesinden kaynaklanabilir. Bu düşünce ile yapılan deneylerde hem hücre dışı

(10 ve 100µM ZnCl2) hem de hücre içi Zn2+ artışının (1 ve 10µM ZnPT) LTCC

akımlarını istatistiksel olarak anlamlı oranda azalttığı gözlenmiştir. Aynı zamanda

ZnPT uygulamasının LTCC’larının kinetiklerinde de değişime neden olduğu

gözlenmiştir.

Zn2+ ve Ca2+ kinetiklerindeki bu benzerlik bize Ca2+’un [Zn2+]i hemoztazında rolü

olabileceği düşüncesini getirmiştir. Nöronlarda, KCl veya gulütamat uyarılarına bağlı

olarak Ca2+’un hücre içine girişini takiben, hücresel Zn2+ salınımının gerçekleştiği

görülmüştür (Sensi ve ark., 2002; Dineley ve ark., 2008). Mast hücrelerinde ise,

hücre dışı uyarıya bağlı olarak [Zn2+]i artışının Ca2+ bağımlı olduğu gösterilmiştir

(Yamasaki ve ark., 2007). Yaptığımız çalışmada da benzer olarak hücre dışı Ca2+’un

kaldırılması hem Ca2+ transientlerini hem de Zn2+ transientlerini ortadan kaldırmıştır.

Bu sonuçlar da gösteriyor ki, uyarı sonrası hücre içine Ca2+ girişi veya CICR olayı

sonrası [Ca2+]i miktarı artmakta, bu ise depolardan Zn2+’un salınmasını

tetikleyebilmektedir. SR büyük oranda CSQ gibi metal bağlayıcı proteinler

içermektedir. Bu proteinler, 200 mol Zn2+/mol, 50 mol Ca2+/mol bağlayabilmektedir.

Bu bilgiler doğrultusunda ve SR’ın bir Zn2+ deposu olabileceği düşüncesiyle,

RyR’leri ryanodine maddesi kullanılarak bloke ettiğimizde, Zn2+ ve Ca2+

transientlerinin tamamen ortadan kalktığı görülmüştür. Buna ek olarak, [Ca2+]i’u

arttırmak için, kardiyomiyositleri düşük Na+ (10mM) ile perfüze edilmiştir. Bu

sayede Na2+/Ca2+ değiştokuşçusunun ters modda çalışarak içeri Ca2+ girişini

sağlaması planlanmıştır. Sonuç olarak, hem [Ca2+]i ve [Zn2+]i hem de Ca2+ ve Zn2+

salınımlarında artış olmuştur. Elde edilen sonuçlarda, Zn2+ salınımının Ca2+ bağımlı

olduğu görülmüştür.

Zn2+ metalla-proteinlerde bulunan sistein, histidin ve glutamat rezidülerine

bağlanarak buffer edilmektedir. Aynı zamanda Zn2+, bu proteinlerden oksidatif stres

aracılığı ile salınabilmektedir. ROS türlerinin, iNOS’ın (inducible nitric oksit sentaz)

NO üretimini tetikleyerek Zn2+’nun, Zn2+-metallationin kompleksinden salınımını

68

gerçekleştirdiğini gösteren çalışmalar mevcuttur (Croix ve ark., 2002; Spahl ve ark.,

2003; Khatai ve ark., 2004). Aynı zamanda asidik pH Zn2+-tiyol stabilizasyonunu

bozarak, Zn2+’nun salınmasına neden olabilmektedir (Sensi ve ark., 2003; Maret,

2009). Aynı bu çalışmalarda gösterildiği gibi, yapmış olduğumuz deneylerde, asidik

pH’nın, [Zn2+]i miktarını arttırırken, [Ca2+]i miktarında bir değişime neden

olmamıştır. Bununla birlikte, Zn2+ ve Ca2+ transientleri önemli derecede azalmıştır.

Serbest/bağlı Zn2+ oranı iskemide olduğu gibi asidozizin oluştuğu durumlarda dahil

olmak üzere birçok çevresel faktöre bağlıdır (Maret, 2009). Hem Ca2+ salınımındaki

azalma nedeniyle hem de asidik pH, hızlı bir şekilde tiyollerden Zn2+ salmasına

neden olmasıyla var olan Ca2+’a bağlı Zn2+ salınımını azaltmış olabileceğinden, Zn2+

transientleri azalmış olabilir.

Yapılan çalışmalarda mitokondrinin de Zn2+ deposu olabileceği yönündedir (Sensi ve

ark., 2002; Dineley ve ark., 2008). Bu nedenle projenin bu bölümünde mitokondrial

aktiviteyi inhibe edici ajanlar kullanılarak Ca2+ ve Zn2+ salınımlarındaki değişim

incelenmiştir. RT ve FCCP Ca2+ transientleri üzerinde etkisi gözlenmezken, Zn2+

transientinin genliklerini azaltmıştır. Bu azalmadaki en önemli neden, Zn2+

transientlerinin oluşumunda mitokondriden salınan Zn2+’nunda rolü olabileceğidir.

Nöronlarda yapılan çalışmalarda, Ca2+ bağımlı Zn2+ salınımının mitokondri aracılığı

ile olduğu gösterilmiştir (Sensi ve ark., 2002; Dineley ve ark., 2008). Nöronlarda,

uyarı soncu [Zn2+]i artışı, mitokondri fonksiyonunun bir protonofor olan FCCP ile

inhibe edilmesiyle bloke edilmiştir. Yine aynı çalışmada, glutamat aracılı Ca2+

bağımlı Zn2+ mobilizasyonunun ROS’un aktive olmasına bağlı olarak gerçekleştiği

gösterilmiştir (Dineley ve ark., 2008). Kardiyomiyositlerde mitokondri, hücresel

hacmin yaklaşık %40’lık bir bölümünü oluşturur ve hücre içi temel ROS üretim

merkezidir. Elektron transfer zincirindeki %1-2’lik elektronun sızıntısı ile moleküler

oksijen, süperoksit anyonuna ve sonra H2O2’ye dönüşür (Chance ve ark., 1979;

Detkova ve ark., 2008). Birçok kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde,

mitokondri kaynaklı ROS üretiminin rolü olduğu görülmüştür (Ayaz ve Turan, 2006;

Teshima, 2013).

69

Çalışmamızın ikinci bölümünde, oksidatif stres altındaki kardiyomiyositlerde [Zn2+]i

homeostazı ve buna etkili faktörlerin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, normal

sıçanlardan izole edilen kardiyomiyositler oksidanlara maruz bırakılarak hem

oksidatif hem de nitrosatif stres altındaki hücrelerde [Zn2+]i homeostazının

incelenmesi hedeflenmiştir. Ayrıca, hem kronik oksidatif hem de nitrosatif stres

etkisini çalışmak için diyabetli sıçanların kardiyomiyositlerinde [Zn2+]i

homeostazının incelenmesi de hedeflenmiştir.

Çalışmamızın bu bölümünde ilk olarak, oksidatif stres-Zn2+ ilişkisini incelemek için,

sıçan kalplerinden elde edilen kardiyomiyositler akut olarak bir oksidant olan 100µM

H2O2’e maruz bırakılmışlardır. Elde edilen sonuçlarda, [Zn2+]i ve [Ca2+]i seviyesi

önemli oranda artmıştır. Bununla birlikte, Ca2+ transientlerinde bir değişim

gözlenmezken, Zn2+ transientlerinde yükselen [Zn2+]i ile birlikte artış gözlenmiştir.

Bu artışın oksidant kaynaklı olup olmadığını anlamak için ise hücreler bir oksidant

tutucusu olan 500µM DTT ile perfüze edilmiştir. DTT sonrası, [Ca2+]i, [Zn2+]i ve

Zn2+ transientleri bazal seviyeye dönmüşlerdir. Aynı şekilde, [Zn2+]i ve Zn2+

transientlerindeki artışın Zn2+ kaynaklı olup olmadığı anlamak için ise, hücreler

TPEN ile perfüze edilmişlerdir. [Ca2+]i’da bir değişim gözlenmezken, Zn2+

transientleri azalmış ve [Zn2+]i bazal seviyeye gerilemiştir. Daha önce yapılan

çalışmalarda, farklı oksidant ajanlarla muamele edilen hücrelerde de benzer şekilde

[Ca2+]i veya [Zn2+]i seviyesinde artışın olduğu gözlenmiştir (Aizenman ve ark., 2000;

Du ve ark., 2002; Dineley ve ark.,2008). [Zn2+]i’daki oksidatif strese bağlı artışın

kaynağı, daha öncede belirtildiği gibi, NO aracılı olarak Zn2+’nun metalla-

proteinlerden salınmasıyla olabileceğidir (Croix ve ark., 2002; Spahl ve ark., 2003;

Khatai ve ark., 2004; Dineley ve ark., 2008).

NO, kardiyomiyositlerde mitokondri tarafından üretilir. Mitokondrideki NO üretimi,

artan [Ca2+]i konsantrasyonunun sonucu olarak mitokondriye Ca2+ pompaları

tarafından Ca2+’un taşınması ile tetiklendiği gösterilmiştir (Spahl ve ark., 2003).

Yapılan çalışmalarda NO’nun, cGMP – PKG yolağını kullanarak [Zn2+]i artışına

neden olduğu bulunmuştur (Jang ve ark., 2007). Bunu test etmek için, FluoZin-3

(AM) ile yüklenmiş kardiyomiyositler bir NO donörü olan 100µM NaNO2 ile

70

perfüze edilmiştir. Perfüzyon sonrası, [Zn2+]i miktarında artışın olduğu gözlenmiştir.

Bununla birlikte, guanilaz siklaz inhibitörü ile inkübe edilen kardiyomiyositlerde

NO’ya bağlı [Zn2+]i’da bir değişim gözlenmemiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda,

NO’nun [Zn2+]i artışında önemli bir rol oynadığı ve daha önceki çalışmalarda

belirtildiği gibi bu artışı cGMP yolağını kullanarak yapabileceği gösterilmiştir (Jang

ve ark., 2007).

Kalp kasında Ca2+’ un SR’dan salınması SR membranı üzerinde bulunan ve Ca2+ ile

aktive olan ryanodine reseptörleri (RyR2) sayesinde gerçekleşir. Çeşitli tipte ve

sayıda düzenleyici proteinler RyR2’ye bağlanarak daha büyük bir makromoleküler

yapı oluşturmaktadırlar. Bu proteinlere, kalmodulin (CaM), FKBP12.6, PKA örnek

olarak verilebilir. Herhangi bir nedenle kinazların aktivasyonu sonucu RyR2’lerinin

fosforile olması veya regüle edici proteinlerin miktarının azalması, reseptörün

konformasyonun değişmesine ve Ca2+’ un depolardan sızmasına neden olur. [Zn2+]i

artışının RyR2’ler üzerindeki etkisini incelemek için, kardiyomiyositler 20 dakika

boyunca 1 ve 10µM ZnPT ile inkübe edilmişlerdir. Elde edilen sonuçlarda RyR,

CaMKII ve PKA’nın fosforile formlarında konsantrasyona bağlı bir artışın olduğu

gösterilmiştir. Bununla birlikte, ZnPT inkübasyonu bu proteinlerin miktarlarında bir

değişime neden olmamıştır. RyR’leri regüle edici bir protein olan FKBP12.6’nın

toplam miktarı da 1 ve 10µM ZnPT inkübasyonundan etkilenmemiştir. Birçok

çalışmada, oksidatif strese bağlı olarak RyR’lerin ve RyR’leri regüle eden enzimlerin

fosforile olduğu gösterilmiştir (Lengyel ve ark., 2000; Tuncay et al.,2013). Bu

fosforilasyonlar sonucunda RyR’lerin konformasyon değişimine bağlı olarak Ca2+

sızıntısı meydana gelmekte ve bu nedenden dolayı SR Ca2+ miktarında azalma

olmaktadır (Choi ve ark, 2002; Zhu ve ark, 2005). SR Ca2+ miktarındaki azalma ise,

kasılma fonksiyonları direkt olarak etkilemektedir. Zn2+’da kendisi oksidatif stresi

arttırarak RyR’lerin ve RyR’leri regüle eden enzimlerin fosforilasyonuna katkıda

bulunmuş olabilir.

Çalışmamızın son bölümünde, diyabetteki sıçanlara bir antioksidan ajan olan N-asetil

sisteyin (NAC) ile 4-hafta boyunca beslenen sıçanlardan elde edilen

kardiyomiyositlerde [Zn2+]i homeostazı incelenerek, oksidatif stres, [Ca2+]i, [Zn2+]i

71

ve bu homeostaza katkıda bulunan diğer faktörlerin detaylı olarak incelenmesi

yapılmıştır.

Deney hayvanlarının genel özellikleri ve fiziksel durumlarına bakıldığında;

başlangıçta üç gruptaki sıçanların yakın ağırlıkta ve kan şekeri değerlerine oldukları

görülmektedir. Fakat deney süresince diyabetli grupların kilo alımında bir duraklama

olduğu hatta zayıfladıkları görülmüştür. Bu da, kan şekerinin artışına paralel olarak

diyabette beklenen bir sonuçtur ve literatürdeki bulgularla uyumludur ( McNeill ve

ark., 1991; Ayaz ve ark., 2004; Tuncay ve ark., 2007; Yaras ve ark., 2007; Tuncay ve

ark., 2013). Gavaj yoluyla dört hafta boyunca mideye doğrudan NAC verilmesi,

vücut ağırlıklarını pozitif yönde etkilerken kan şekerleri değerinde değişime neden

olmamıştır.

Serbest radikaller birçok hastalığın patogenezinde yer alan yüksek oranda oksijen

içeren moleküllerdir. Bu çalışmada oksidatif stres göstergeleri olan malondialdehide

(MDA) indirgenmiş glütatyon (GSH), okside glütatyon (GSSG) ve protein tiyol (SH)

gruplarındaki oksidasyon miktarlarına bakılmıştır. Lipidlerde meydana gelen

oksidasyon sonucu son ürün olarak MDA oluşmaktadır. Yapmış olduğumuz

deneylerde, MDA seviyesi diyabetlilerde 3 kat artarken, NAC ile beslenen grupta

MDA seviyesi kontrol seviyesine gerilemiştir.

Glütatyonun oksidasyonu ile glütatyon disülfit oluşmaktadır (GSSG). Kalpteki

redoks durumunu göstermek için glutatyon kiti kullanılarak GSH/GSSG oranına

bakılmıştır. Elde edilen sonuçlarda bu oranın diyabetli grupta anlamlı derecede

düştüğü, NAC ile beslenmenin ise, bu parametreleri kontrol değerine çektiği

görülmüştür.

Tiyoller, güçlü indirgeyici kapasitelerinden ve serbest radikaller ile kolayca

etkileşebilme özelliklerinden dolayı, proteinleri, hücre lipidlerini ve oksidatif hasara

karşı nükleik asitleri koruyan oldukça önemli antioksidantlardır. Yine, kalp

dokusundan alınan örneklerle yapılan deneylerde serbest tiyol miktarının diyabetli

grupta kontrol grubuna göre anlamlı derecede azaldığı gözlenmiştir. Bununla birlikte,

72

5-hafta boyunca NAC tedavisi uygulanan diyabetli grupta serbest thiol miktarının

arttığı gözlenmiştir.

Bu sonuçlar, STZ enjeksiyonu ile oluşturulan diyabet modelinde, oksidatif stres

göstergelerinden lipid peroksidasyonunda, okside glutatyon miktarında ve tiyol

oksidasyonunda önemli miktarda artışın olduğu ve antioksidan tedavisinin bu olayı

kontrol edebildiğini göstermiştir ve literatürdeki verilerle de uyumludur (Cao ve ark.,

2012; Wang ve ark., 2011; Tuncay ve ark., 2007;Ayaz ve Turan, 2006).

Oksidatif stresin hücre içi [Zn2+]i artışında önemli bir yere sahip olduğu yaptığımız

çalışmalarla görülmüştür. Bu nedenle oksidatif stresin artmış olduğunu gösterdiğimiz

diyabetli gruplarda serbest Zn2+ ve Ca2+ ölçümleri yapılmıştır. Bu ölçümler Fura-2

(AM) kullanılarak yapılmıştır. Fura-2, Zn2+’ya olan hassasiyeti Ca2+’a göre oldukça

fazla (Kd=1.3nM, 330 nM; sırasıyla Zn2+ ve Ca2+) olan ratiometrik bir boyadır

(Turan ve ark., 1997). Boyanın bu özelliğinden yararlanarak bazal Zn2+ ve Ca2+

miktarları ölçülmüştür. Elde edilen sonuçlarda diyabette, [Zn2+]i miktarı kontrol

grubuna göre kıyaslandığında %90, [Ca2+]i miktarı ise %30 oranında arttığı

bulunmuştur. Kronik veya akut antioksidan uygulaması ise, hem [Zn2+]i’u hem de

[Ca2+]i’u kontrol değerlerine çekmiştir. Kardiyomiyositlerde aynı ve farklı hastalık

modelleri kullanılarak yapılan [Zn2+]i ölçümlerinde, [Zn2+]i’nun sırasıyla %80 ve

%200 oranında artmış olduğu görülmüştür (Ayaz ve Turan, 2006; Kamalov, 2010).

Bu sonuçlar doğrultusunda, oksidatif stresin ortadan kalkması diyastolik iyon

seviyelerini düzenleyerek kontrol seviyelerine çekmiştir.

Çalışmamızın diğer bölümünde, diyabet modelini taklit etmek için, 6 aylık

hayvanlardan izole edilen kardiyomiyositler 4 saat boyunca yüksek glikoz altında

inkübe edilmiştir. Aynı zamanda doğumunun 3. ayından itibaren 3 ay boyunca

diyabet kalmış hayvanlardan izole edilen kardiyomiyositler, 4 saat boyunca insulin

ile inkübe edilmiştir. Kontrol, diyabet ve glikoz veya insulin ile inkübe edilen

gruplarda [Zn2+]i ölçümleri yine Fura-2 (AM) kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen

sonuçlarda, diyabetli grupta [Zn2+]i %110 artmış olarak bulunmuştur. Bununla

birlikte, glikoz ile inkübasyon [Zn2+]i miktarını yaklaşık %75 oranında artarken,

73

insulin ile inkübasyon, [Zn2+]i seviyesini kontrol değerlerine çekmiştir. Bu alınan

verilere benzer olarak, Zn2+’ya hassas FRET sensörleri ile yapılan [Zn2+]i

ölçümlerinde, beta hücrelerin yüksek glikoz ile inkübe edilmesi [Zn2+]i miktarını

yaklaşık %100 arttırdığı gösterilmiştir (Bellomo ve ark., 2011).

Yine 6 aylık hayvanlar kullanılarak [Zn2+]i ölçümleri, bu sefer FluoZin-3 (AM)

kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen sonuçlarda diyabetin [Zn2+]i seviyesini kontrol

grubu ile karşılaştırıldığında % 130 oranında arttığı bulunmuştur. Aynı zamanda

kontrol ve diyabet grubu hücrelerin, NAC ile 1 saat boyunca inkübe edilmeleri,

[Zn2+]i seviyesini diyabetlilerde kontrol değerlerine çekerken, kontrol grubunda bir

değişikliğe neden olmamıştır. Bu deneyler sonucunda [Zn2+]i ölçümlerini iki farklı

boya kullanarak test etme olanağı bulmuş olduk.

Çalışmamızın son aşamasında, hipergliseminin, Zn2+ ve Ca2+ transientlerine olan

etkisi incelenmiştir. Diyabetli grupta, Ca2+ ve Zn2+ transientleri anlamlı derecede

azalırken kronik NAC uygulaması bu parametreleri kontrol değerlerine çekerken,

akut uygulama bunu kısmen başarabilmiştir.

Tüm bu sonuçlar beraber değerlendirildiğinde, oksidatif stresin artışına bağlı olarak,

Ca2+ ve Zn2+ transientlerinin anlamlı derecede azaldığı, diyastolik [Zn2+]i ve [Ca2+]i

seviyelerinin de artmış olduğu bulunmuştur. Bu değişimler oksidatif/nitrozatif stres

sonucunda sızıntılı hale gelen RyR2’nin bir sonucu olabilir. Hiperglisemide olduğu

gibi artan ROS miktarı, kardiyomiyositlerde dahil olmak üzere birçok hücrede,

biyokimyasal ve elektrofizyolojik değişimlere neden olmaktadır (Yaras ve ark.,

2005; Tuncay ve ark., 2013). Kardiyomiyositlerde artan oksidatif stres sonucu RyR2

fonksiyonlarında bozulmalar meydana gelmektedir. RyR2’nin redoks

modifikasyonuna en önemli katkı, oksidanlar aracılığı ile olmaktadır. Kalpte birçok

hastalık modelinde direkt veya dolaylı yollarla oksidanlar SR Ca2+ sızıntısına neden

olmaktadır (Anzai ve ark., 1998; Aracena ve ark., 2005; Deng ve ark., 2005;

Terenteyev ve ark., 2008). Hipotezimizi destekleyen bir diğer önemli bulgu ise,

reaktif ROS/RNS’nin hücre içi depolardan Zn2+ salarak [Zn2+]i seviyesini

arttırmasıdır (Turan ve ark., 1997; Dineley ve ark.,2008).

74

Bugüne kadar yapılan çalışmalarda Zn2+ salınımını Ca2+ bağlı olduğu gösterilmiştir.

(Dineley ve ark.,2008). [Zn2+]i artışı, Ca2+ iyonlarının, iyon bağlama kapasitesi, pH

ve redoks tarafından belirlenen metallo-proteinlerden Zn2+ salınmasına katkıda

bulunması nedeniyle olabilmektedir (Valle ve Falchuk, 1993; Turan ve ark., 1997;

Ayaz ve Turan; 2006; Tuncay ve ark., 2011). Daha öncede gösterildiği gibi, Zn2+

birçok proteinin fosforilasyonunda önemli rol oynamaktadır. Yapılan bir başka

çalışmada, iskelet kaslarındaki RyR1’in SR’a bağlanmasını Zn2+’nun modüle ettiği

gösterilmiştir (Lengyel ve ark., 2000; Xia ve ark., 2000). Bizim de yaptığımız

çalışmada Zn2+’nun RyR fosforilasyonunu önemli oranda arttırdığı bulunmuştu. Bu

nedenle, artan [Zn2+]i ve büyük ihtimalle artan [Ca2+]i ile hiperglisemi sonucu

antioksidan defans sisteminin bozulması ve buna bağlı olarak oksidatif stresteki artış,

ECC’de meydana gelen hasarda büyük rol oynayabilir.

Sonuç olarak çalışmamızın ortaya koyduğu bulgular, elektrik alan uyarısı altında

veya uyarı olmadan, Zn2+’nunda Ca2+ gibi dinamiklere sahip olduğu, hücre içi Zn2+

artışının Ca2+ tarafından kontrol edilebildiği ve ECC modüle edebildiği

gösterilmiştir. Bununla birlikte, bugüne kadar en çok araştırılan ve merak edilen

konular arasında olan Zn2+’nun hücre içinde nerede depolandığı olmuştur. Bu

çalışmada, MT ve mitokondri dışında SR’ında bir Zn2+ deposu olabileceği düşüncesi

ön plana çıkmıştır. Son olarak ise, hiperglisemi sonucu artan oksidatif stresin, Ca2+

ve Zn2+ hemoztazında bozulmalara bağlı olarak kardiyak kas fonksiyonlarını

azalttığı, bunun ise antioksidan tedavisi ile normale döndüğü gösterilmiştir.

Birçok enzim için kofaktör olan ve antioksidan defans mekanizması için önemli

olduğu düşünülen Zn2+’nun, ne kadar miktarda ve süre ile artışının yararlı veya

zararlı olabileceğinin araştırılması gereken konular arasındaki önemini hala

korumaktadır.

75

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu çalışmada, [Zn2+]i’nun kardiyomiyositlerde fizyolojik koşullarda uyarılma-

kasılma çiftlenimini nasıl modüle ettiği ve fizyolojik koşullarda bozulan bu

çiftlenime hangi yollarla katkılarda bulunduğu, akut ve kronik oksidatif stres

altındaki kardiyomiyositlerde [Zn2+]i homeostazı ve buna etkili faktörler, hem kronik

oksidatif hem de nitrosatif stres etkisini çalışmak için sistolik ve diyastolik

miyokardiyal fonksiyonların yavaşladığı ve oksidatif stresin oluştuğu karakterize

edilen STZ enjeksiyonu ile hiperglisemi oluşturulan sıçanların kardiyomiyositlerinde

[Zn2+]i ve [Ca2+]i homeostazının ve bu mekanizmalarda antioksidanların rolü

incelenmiştir.

Çalışmamızda, FluoZin-3 Zn2+ indikatörü kullanılarak, daha önceden bilinen Ca2+

spark ve transientlerin kinetiklerine benzer, Zn2+ spark ve Zn2+ transientleri

görüntülenmiştir.

Zn2+ transient ve sparklarının dinamiklerinin, hücre dışı Zn2+ girişinden bağımsız

hücre içi Zn2+ artışına bağlı olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda, LTCC kanallarının

hücre içi ve dışı Zn2+ artışına bağlı olarak bloke olduğu gösterilmiştir.

Ca2+ uyarılı bir Zn2+ salınımın gerçekleştiği görülmüştür. Sarkoplazmik retikulumun

Ca2+ salınımı inhibe edildiğinde veya hücre dışı sodyumun azaltılması sonucu hücre

içinde Ca2+ birikmesine bağlı olarak sırasıyla Zn2+ salınımlarının ortadan kalktığı

veya arttığı gözlenmiştir.

Zn2+ salınımında özellikle redoks durumun regülasyonunda görev alan

mitokondrininde rol aldığı gösterilmiştir. Mitokondrinin [Ca2+]i artışına bağlı olarak

ROS ve NO üretimine arttırdığı bilinmektedir. Çalışmamızda akut olarak ROS ve

NO artışının [Zn2+]i ve [Ca2+]i miktarını arttırdığı gösterilmiştir. ROS ve NO’lar

Metallo-proteinler (MT gibi) redoks durumunu değiştirerek Zn2+’nun buradan

salınmasını sağlayabilecekleri gösterilmiştir. Bu nedenle mitokondrinin

76

blokasyonuna bağlı olarak Zn2+ transientleri azalmış olabileceği hipotezlenmiştir.

Bununla birlikte, metallo-proteinler pH’a karşı duyarlıdır. Asidoziz sonucu

[Zn2+]i’nun artmış olduğu gösterilmiştir.

Sistolik ve diyastolik miyokardiyal fonksiyonların yavaşladığı ve oksidatif/nitrozatif

stresin oluştuğu karakterize edilen STZ enjeksiyonu ile hiperglisemi oluşturulan

sıçanlardan elde edilen kardiyomiyositlerde [Zn2+]i ve [Ca2+]i miktarında artışın

meydana geldiği, transientlerin ise deprese olduğu görülmüştür. Antioksidan tedavisi

ile hem Zn2+ hem de Ca2+ homeostazının düzeldiği gösterilmiştir.

Hücre içinde konsantrasyonu artan Zn2+ kalbin ECC’de önemli rol oynayan

RyR2’lerin fosforilasyonunda artışa neden olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda

RyR2’leri regüle eden PKA ve CaMKII protein seviyelerinde de Zn2+ artışına bağlı

olarak fosforilasyonların arttığı gözlenmiştir.

Yapılan çalışmalarda, Zn2+’nun aynı zamanda mitokondri oksidan üretimini azaltarak

antioksidan defans mekanizmasını yardımcı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle,

birçok enzim için kofaktör olan ve antioksidan defans mekanizması için önemli

olduğu düşünülen Zn2+’nun, ne kadar miktarda ve süre ile artışının yararlı veya

zararlı olabileceğinin araştırılması önemli olacaktır. Aynı zamanda SR ve mitokondri

ile son zamanlarda kadiyomiyositlerde önemli fonksiyonlarda yer aldığı bulunan

endoplazmik retikulumda da Zn2+ konsantrasyonlarının yeni geliştirilen FRET

sensörleri ayrı ayrı ölçülmesi, Zn2+’un nereden salındığı ve oksidatif/nitrozatif stres

durumunda nasıl değiştikleri hakkında daha detaylı bilgiler sunabilecektir.

77

ÖZET

Kalp Fonksiyon Bozukluğunda Rol Oynayan Hücre İçi Zn2+ Derişimi ve Kontrolsüz Sarkoplazmik Retikulum Ca2+ Sızıntısı Arasındaki İlişkinin Elektrofizyolojik ve Biyokimyasal Tekniklerle İncelenmesi

Çinko (Zn2+), biyolojik sistemlerde, bağlı veya histokimyasal olarak reaktif olarak bulunmaktadır. Aynı zamanda, bir sinyal molekülü olarak fonksiyon gören Zn2+, enzimlerde dahil olmak üzere birçok proteinin yapı taşını oluşturur. Zn2+’ nin, kardiyak fonksiyonları boyunca hücre içi dağılımı ve salınımları hakkında çok az bilgi bulunmaktadır. Bu çalışmanın amacı, kalp fonksiyon bozukluklarında sarkoplazmik retikulum ile hücre içi serbest Zn2+ arasındaki ilişkiyi incelemektir.

Son zamanlarda, Zn2+’ya duyarlı ve seçici floroforların geliştirilmesi ve özellikle bu floroforların Ca2+ gibi diğer metallere hassasiyetinin çok az olması, canlı hücrelerde hücre içi Zn2+’yu izlemeyi mümkün hale getirmiştir. Bu çalışmada izole sıçan kardiyomiyositleri kullanılarak, Zn2+ homeostazındaki hızlı değişimleri Zn2+ duyarlı floresans boya olan FluoZin-3 ve karşılaştırma amacıyla, Ca2+’a duyarlı Fluo-3 floresans boyası kullanılarak incelendi. Daha önceden bilinen Ca2+ spark ve transientlerin kinetiklerine benzer, Zn2+ spark ve Zn2+ transientleri görüntülendi. Sarkoplazmik retikulumun Ca2+ salınımı inhibe edildiğinde veya hücre dışı sodyumun azaltılması sonucu hücre içinde Ca2+ birikmesine bağlı olarak sırasıyla Zn2+ salınımlarının ortadan kalktığı veya arttığı gözlenmiştir. Mitokondri inhibisyonu, Ca2+ transientlerini etkilemeden, Zn2+ transientlerini azaltmıştır. Akut veya kronik oksidatif stres sonucu artan Zn2+ salınımını anlamak için sırasıyla, Ca2+ bağımlı Zn2+ salınımını arttıran oksidatif ajan olan H2O2 ile kardiyomiyositler inkübe edilmiş veya sistolik ve diyastolik miyokardiyal fonksiyonların yavaşladığı ve oksidatif stresin oluştuğu karakterize edilen STZ enjeksiyonu ile hiperglisemi oluşturulan sıçanlar kullanılmıştır. Hücre içi Ca2+, Zn2+ konsantrasyonlarında artışın meydana geldiği, transientlerin ise deprese olduğu görülmüştür. Antioksidan tedavisi ile hem Zn2+ hem de Ca2+ homeostazının düzeldiği bulunmuştur.

Bu çalışmada, kardiyak siklüs boyunca, Zn2+’nun salındığı, bu salınımın çoğunlukla serbest Ca2+ artışına bağlı olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda, reaktif oksijen türlerinin metallathioninlerin ve diğer redoks aktif proteinlerin, iyonik değişimler hariç metal bağlama özelliklerini değiştirmesi yoluyla Zn2+’nun salınımını tetiklediği gösterilmiştir. Antioksidan tedavisi ile bu oksidatif sürecin değiştiği, Ca2+ ve Zn2+

hemeostazının düzenlendiği görülmüştür.

Anahtar Sözcükler: Çinko iyonu, hiperglisemi, kalsiyum iyonu, kardiyomiyositler, oksidatif stres

78

SUMMARY

Investigation of relationship between intracellular free Zn2+ concentration and uncontrolled Ca2+ leakage from Sarcoplasmic Reticulum in Cardiac Dysfunction by Using Electrophysiological and Biochemical Techniques

Zinc (Zn2+) exists in biological systems as bound and histochemically reactive free Zn2+. It is an structural constituent of many proteins, including enzymes from cellular signalling pathways, in which it functions as a signalling molecule. Very little is known about precise mechanisms controlling the intracellular distrubution of Zn2+

and its variations during cardiac function. The purpose of this study is to determine the relationship between sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and intracellular free Zn2+ on heart dysfunction.

Live-cell detection of intracellular Zn2+ has become feasible through are recent development of Zn2+-sensitive and-selective fluophores able to distinguish Zn2+ from Ca2+. Here we, in freshly isolated rat cardiomyocytes, we investigated the rapid changes in Zn2+ hemostasis using the Zn2+-specific fluorescent dye, FluoZin-3, in comparison to Ca2+-dependent Fluo-3 fluorescence. Zn2+ sparks and Zn2+ tranzients, respectively, were visualized in a similar manner to known rapid Ca2+ chnages. Zn2+ transients required Ca2+ entry. Inhibition the sarcoplasmic reticulum Ca2+ release or increasing the Ca2+ loading a low-Na+ solution suppressed or increased Zn2+

movements, respectively. Mitochondrial inhibitors reduced Zn2+ transients without effecting Ca2+ transients. To understand acute or chronic oxidative stress induced Zn2+ release, repectively, we used oxidatizing agent H2O2 for incubating cardiomyocytes which is facilitated Ca2+-dependent Zn2+ release in cardiomyocytes and hyperglycemic rats induced by STZ injection and cause diabetic cardiomyopathy which is characterized by declined systolic, diastolic myocardial performance and oxidative stress in cardiac cells. Both, intracellular free Ca2+ and Zn2+ concantrations increased and transients are depressed while treatment with an antioxidant improved heart function by ameliorating the Ca2+ and Zn2+ hemostasis.

It is proposed that Zn2+ release during the cardiac cycle results mostly from intracellular free Ca2+ increase, triggering production of reactive oxygen species that induce changes in metal binding properties of metallothioneins and redox active proteins, aside from ionic exchange on these proteins. Treatment with antioxidants changing the oxidation status and as a result Ca2+ and Zn2+ hemostasis.

Key Words: Calcium ion, cardiomyocytes, hyperglycemia, oxidative stress, zinc ion,

79

KAYNAKLAR

ALLEN DG, XİAO XH. (2003). Role of the cardiac Na+/H+ exchanger during ischemia and reperfusion. Cardiovasc Res. 57(4):934-41.

ALVAREZ-COLLAZO J, DÍAZ-GARCÍA CM, LÓPEZ-MEDİNA AI, VASSORT G, ALVAREZ JL. (2012). Zinc modulation of basal and β-adrenergically stimulated L-type Ca2+ current in rat ventricular cardiomyocytes: consequences in cardiac diseases. Pflugers Arch. 464(5):459-70.

ANZAI K, OGAWA K, KUNIYASU A, OZAWA T, YAMAMOTO H, NAKAYAMA H. (1998) Effects of hydroxyl radical and sulfhydryl reagents on the open probability of the purified cardiac ryanodine receptor channel incorporated into planar lipid bilayers. Biochem Biophys Res Commun. 249(3): 938-942.

ANZAWA R, SEKİ S, NAGOSHİ T, TANİGUCHİ I, FEUVRAY D, YOSHİMURA M. (2012). The role of Na+/H+ exchanger in Ca2+ overload and ischemic myocardial damage in hearts from type 2 diabetic db/db mice. Cardiovasc Diabetol. 11:33.

ARACENA P, TANG W, HAMILTON SL, HIDALGO C. (2005). Effects of s-glutathionylation and s-nitrosylation on calmodulin binding to triads and fkbp12 binding to type 1 calcium release channels. Antioxid Redox Signal. 7(7-8): 870-881.

ATAR D, BACKX PH, APPEL MM, GAO WD, MARBAN E. (1995). Excitation-transcrition coupling mediated by zinc influx through voltage-dependent calcium channels. J Biol Chem. 270(6): 2473-77.

AYAZ M, TURAN B. (2006). Selenim prevents diabetes-induce alterations in [Zn2+] and metallothionein level of rat heart via restoration of cell redox cycle. Am J Physiol. 290(3): H1071-80.

BAI SZ, SUN J, WU H, ZHANG N, LI HX, ET AL. (2012) Decrease in calcium-sensing receptor in the progress of diabetic cardiomyopathy. Diabetes Res Clin Pract 95: 378–385.

BELLOMO EA, MEUR G, RUTTER GA. (2011) Glucose regulates free cytosolic Zn²+concentration, Slc39 (ZiP), and metallothionein gene expression in primary pancreatic islet β-cells. J Biol Chem.286(29):25778-89.

BERS DM, EİSNER DA, VALDİVİA HH. (2003). Sarcoplasmic reticulum Ca2+ and heart failure: roles of diastolic leak and Ca2+ transport. Circ Res. 93(6):487-90.

BERS, D.M. (2002). Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415: 198-204. BIDASEE KR, NALLANI K, HENRY B, DINCER UD, BESCH HR JR (2003) Chronic

diabetes alters function and expression of ryanodine receptor calcium-release channels in rat hearts. Mol Cell Biochem 249: 113–123.

BODI I, MIKALA G, KOCH SE, AKHTER SA, SCHWARTZ A . (2005). The L-type calcium channel in the heart: the beat goes on. J Clin Invest 115:3306–3317

BRACKEN, N.K., SINGH, J., WINLOW, W., HOWARTH, F.C. (2003). Mechanisms underlying contractile dysfunction in streptozotocin-induced type 1 and type 2 diabetic cardiomyopathy. In: Artherosclerosis,hypertension and diabetes,Ed.: G.N. Pierce, M. Nagano, P. Zahradka, N.S. Dhalla. Boston:Kluver Academic Publishers

CALÓ L, D'ANGELO A, CANTARO S, BORDIN MC, FAVARO S, ANTONELLO A, BORSATTI A. (1996). Increased urinary NO2-/NO3- and cyclic guanosine monophosphate levels in patients with Bartter's syndrome: relationship to vascular reactivity. Am J Kidney Dis. 27(6):784-9.

CAO J, VECOLI C, NEGLİA D, TAVAZZİ B, LAZZARİNO G, NOVELLİ M, MASİELLO P, WANG YT, PURİ N, PAOLOCCİ N, L'ABBATE A, ABRAHAM NG. (2012). Cobalt-Protoporphyrin Improves Heart Function by Blunting Oxidative

80

Stress and Restoring NO Synthase Equilibrium in an Animal Model of Experimental Diabetes. Front Physiol. 3:160.

CHAKRABORTİ S, DAS S, KAR P, GHOSH B, SAMANTA K, KOLLEY S, GHOSH S, ROY S, CHAKRABORTİ T. (2007). Calcium signaling phenomena in heart diseases: a perspective. Mol Cell Biochem. 298(1-2):1-40.

CHANCE B, SIES H, BOVERIS A. (1979). Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev. 59(3):527-605.

CHOI, K.M., ZHONG, Y., HOIT, B.D., GRUPP, I.L., HAHN, H., DILLY, K.W., GUATIMOSIM, S., LEDERER, W.J., MATLIB, M.A. (2002). Defective intracellular Ca2+ signaling contributes to cardiomyopathy in type 1 diabetic rats. Am. J. Physiol. 283: H1398-H1408.

DENG J, WANG G, HUANG Q, YAN Y, LI K, TAN W, JIN C, WANG Y, LIU J. (2008). Oxidative stress-induced leaky sarcoplasmic reticulum underlying acute heart failure in severe burn trauma. Free Radic Biol Med. 44(3): 375-385.

DERİCİ K, SAMSAR U, DEMİREL-YİLMAZ E. (2012). Nitric oxide effects depend on different mechanisms in different regions of the rat heart. Heart Vessels. 27(1):89-97.

DINELEY KE, DEVINNEY MJ 2ND, ZEAK JA, RINTOUL GL, REYNOLDS IJ.(2008). Glutamate mobilizes [Zn2+] through Ca2+ -dependent reactive oxygen species accumulation. J Neurochem. 106(5):2184-93.

DINGER B, HE L, CHEN J, LIU X, GONZALEZ C, OBESO A, SANDERS K, HOİDAL J, STENSAAS, L, FİDONE S. (2007). The role of NADPH oxidase in carotid body arterial chemoreceptors. Respir Physiol Neurobiol. 157(1):45-54.

FABIATO A (1983) Calcium induced release of calcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum. Am J Physiol 245:C1– C14

FOSTER M, SAMMAN S. (2010). Zinc and redox signaling: perturbations associated with cardiovascular disease and diabetes mellitus. Antioxid Redox Signal. 13(10):1549-73.

FOZZARD HA. (2002) Cardiac sodium and calcium channels: a history of excitatory currents. Cardiovasc Res 55: 1–8.

FUKADA T, KAMBE T. (2011). Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3(7):662-74.

GOLDMAN, L ve SCHAFER A.I. (2012). Goldman’s Cecil Medicine. New York: Elsevier GRYNKIEWICZ, G., POENIE, M., TSIEN, R. (1985). A new generation of Ca2+ indicators

with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260: 3440-3450 GUYTON, A. C. (1996). Tıbbi Fizyoloji. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi. HERSHFINKEL M, KANDLER K, KNOCH ME, DAGAN-RABIN M, ARAS MA,

ABRAMOVITCH-DAHAN C, SEKLER I, AIZENMAN E. (2009). Intracellular zinc inhibits KCC2 transporter activity. Nat Neurosci. 12(6):725-7.

HERSHFINKEL M, MORAN A, GROSSMAN N, SEKLER I. (2001). A zinc-sensing receptor triggers the release of intracellular Ca2+ and regulates ion transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 98(20):11749-54.

HØYDAL MA, WİSLØFF U, KEMİ OJ, BRİTTON SL, KOCH LG, SMİTH GL, ELLİNGSEN Ø.N. (2007) itric oxide synthase type-1 modulates cardiomyocyte contractility and calcium handling: association with low intrinsic aerobic capacity. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil. 14(2):319-25.

J. MARÍN-GARCÍA (2010). Heart Failure, Contemporary Cardiology. Springer Science and Business Media.

JANG Y, WANG H, XI J, MUELLER RA, NORFLEET EA, XU Z. (2007). NO mobilizes intracellular Zn2+ via cGMP/PKG signaling pathway and prevents mitochondrial oxidant damage in cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 75(2):426-33.

JANSEN J, KARGES W, RINK L. (2009). Zinc and diabetes--clinical links and molecular mechanisms. J Nutr Biochem. 20(6):399-417.

81

JANVIER, N.C., BOYETT, M.R. 1(996). The role of Na-Ca exchange current in the cardiac action potential. Cardiovasc. Res. 32: 69-84.

KAMALOV G, AHOKAS RA, ZHAO W, ZHAO T, SHAHBAZ AU, JOHNSON PL, BHATTACHARYA SK, SUN Y, GERLİNG IC, WEBER KT. (2010). Uncoupling the coupled calcium and zinc dyshomeostasis in cardiac myocytes and mitochondria seen in aldosteronism. J Cardiovasc Pharmacol. 55(3):248-54.

KATZ, A.M. (1992). Physiology of the Heart. Philadelphia: Raven Press. KERCHNER GA, CANZONIERO LM, YU SP, LING C, CHOI DW. (2000). Zn2+ current

is mediated by voltage-gated Ca2+ channels and enhanced by extracellular acidity in mouse cortical neurones. J Physiol. 528 Pt 1:39-52.

KHATAI L, GOESSLER W, LORENCOVA H, ZANGGER K. (2004). Modulation of nitric oxide-mediated metal release from metallothionein by the redox state of glutathione in vitro. Eur J Biochem. 271(12):2408-16.

KIM HW, CH YS, LEE HR, PARK SY, KIM YH (2001) Diabetic alterations in cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase and phospholamban protein expression. Life Sci 70: 367–379.

KLABUNDE R.E. (2011). Cardiovascular Physşology Concepts. Baltimore Lippincott Williams & Wilkins

KORICHNEVA I, HOYOS B, CHUA R, LEVI E, HAMMERLING U. (2002). Zinc release from protein kinase C as the common event during activation by lipid second messenger or reactive oxygen. J Biol Chem. 277(46):44327-31.

KRANIAS EG, BERS DM. (2007). Calcium and cardiomyopathies. Subcell Biochem. 45:523–537

LENGYEL I, FİEUW-MAKAROFF S, HALL AL, SIM AT, ROSTAS JA, DUNKLEY PR. (2000). Modulation of the phosphorylation and activity of calcium/calmodulin-dependent protein kinase ii by zinc. J Neurochem. 75(2): 594-605.

LICHTEN LA, COUSINS RJ. (2009). Mammalian zinc transporters: nutritional and physiologic regulation. Annu Rev Nutr. 29:153-76

LITTLE PJ, BHATTACHARYA R, MOREYRA AE, KORICHNEVA IL. (2010). Zinc and cardiovascular disease. Nutrition. 26(11-12):1050-7.

MARET W. (2009). Molecular aspects of human cellular zinc homeostasis: redox control of zinc potentials and zinc signals. Biometals. 22(1):149-57.

MARKS AR. (2003). Calcium and the heart: a question of life and death. J Clin Invest.111(5):597-600.

MARTIN JL, STORK CJ, LI YV. (2006). Determining zinc with commonly used calcium and zinc fluorescent indicators, a question on calcium signals. Cell Calcium. 40(4):393-402.

MCNEILL, JH., DELGATTY, HL., BATTELL, ML. (1991). Insulinlike effects of sodium selenate in streptozocin-induced diabetic rats. Diabetes. 40(12): 1675-8.

MUKHERJEE, R., SPINALE, F.G. (1999). Alterations in ionic currents and relation to contractile dysfunction with severe cardiac hypertrophy and failure. Heart. Fail. Rev. 4: 319–327.

MUNK AA, ADJEMIAN RA, ZHAO J, OGBAGHERRIEL A, AND SHRIER A. (1996). Electro-physiological properties of morphologically distinct cells isolated from the rabbit atrio-ventricular node. J Physiol 493: 801–818

NERBONNE JM, KASS RS. (2005) Molecular physiology of cardiac repolarization. Physiol Rev. 85(4):1205-53.

NIGGLI, E. & LEDERER, W. J. (1990). Voltage-independent calcium release in heart muscle. Science 25:565–568.

NITZAN YB, SEKLER I, HERSHFİNKEL M, MORAN A, SILVERMAN WF. (2002). Postnatal regulation of ZnT-1 expression in the mouse brain. Brain Res Dev Brain Res. 137(2):149-57.

82

OZDEMİR S, UGUR M, GÜRDAL H, TURAN B. (2005). Treatment with AT(1) receptor blocker restores diabetes-induced alterations in intracellular Ca(2+) transients and contractile function of rat myocardium. Arch Biochem Biophys. 435(1):166-74.

OZDEMİR S. (2004). Anjiyotensin II reseptörünün deneysel diyabetik sıçan kalbi elektriksel aktivitesindeki rolü: Doktora tezi, Ankara Üniv. Sağlık Bilimleri Enstitüsü.

PALMER BM, VOGT S, CHEN Z, LACHAPELLE RR, LEWINTER MM. (2006). Intracellular distributions of essential elements in cardiomyocytes. J Struct Biol. 155(1):12-21.

PANDOLFİ A, Dİ PİETRO N. (2010). High glucose, nitric oxide, and adenosine: a vicious circle in chronic hyperglycaemia? Cardiovasc Res. 86(1):9-11.

RAHAMIMOFF H (1990) Na+/Ca2+ exchanger: the elusive protein. Curr Top Cell Regul 31:241–271

ROZANSKI, G.J., XU, Z. (2002). Sulfhydryl modulation of K+ channels in rat ventricular myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 34: 1623-1632.

SANTANA LF, CHASE EG, VOTAW VS, NELSON MT, GREVEN R. (2002) Functional coupling of calcineurin and protein kinase A in Mouse ventricular myocytes J Physiol. 544(Pt 1):57-69.

SANTONASTASI M, WEHRENS XH. (2007). Ryanodine receptors as pharmacological targets for heart disease. Acta Pharmacol Sin. 28(7):937-44.

SEIDMAN JG, SEIDMAN C. (2001) The genetic basis for cardiomyopathy: from mutation identification to mechanistic paradigms. Cell. 104: 557-67

SENSI SL, TON-THAT D, SULLIVAN PG, JONAS EA, GEE KR, KACZMAREK LK, WEISS JH. (2003). Modulation of mitochondrial function by endogenous Zn2+ pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(10):6157-62.

SENSI SL, TON-THAT D, WEISS JH. (2002). Mitochondrial sequestration and Ca(2+)-dependent release of cytosolic Zn(2+) loads in cortical neurons. Neurobiol Dis. 10(2):100-8.

SHARIR H, ZİNGER A, NEVO A, SEKLER I, HERSHFINKEL M. (2010). Zinc released from injured cells is acting via the Zn2+-sensing receptor, ZnR, to trigger signaling leading to epithelial repair. J Biol Chem. 285(34):26097-106.

SPAHL DU, BERENDJI-GRÜN D, SUSCHEK CV, KOLB-BACHOFEN V, KRÖNCKE KD. (2003). Regulation of zinc homeostasis by inducible NO synthase-derived NO: nuclear metallothionein translocation and intranuclear Zn2+ release. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(24):13952-7.

ST CROIX CM, WASSERLOOS KJ, DINELEY KE, REYNOLDS IJ, LEVITAN ES, PITT BR. (2002). Nitric oxide-induced changes in intracellular zinc homeostasis are mediated by metallothionein/thionein. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.282(2):L185-92.

STORK CJ, LI YV. (2010). Zinc release from thapsigargin/IP3-sensitive stores in cultured cortical neurons. J Mol Signal. 5:5.

STORK CJ, Lİ YV. (2009). Rising zinc: a significant cause of ischemic neuronal death in the CA1 region of rat hippocampus. J Cereb Blood Flow Metab. 29(8):1399-408.

TAKIMOTO E, YAO A, TOKO H, TAKANO H, SHIMOYAMA M, SONODA M, WAKIMOTO K, TAKAHASHI T, AKAZAWA H, MIZUKAMI M, NAGAI T, NAGAI R, KOMURO I (2002) Sodium calcium exchanger plays a key role in alteration of cardiac function in response to pressure overload. FASEB J 16:373– 378

TAYLOR KM, HISCOX S, NICHOLSON RI, HOGSTRAND C, KILLE P. (2012). Protein kinase CK2 triggers cytosolic zinc signaling pathways by phosphorylation of zinc channel ZIP7. Sci Signal. 5(210):ra11.

TERENTYEV D, GYORKE I, BELEVYCH AE, TERENTYEVA R, SRİDHAR A, NİSHİJİMA Y, DE BLANCO EC, KHANNA S, SEN CK, CARDOUNEL AJ, CARNES CA, GYORKE S. (2008). Redox modification of ryanodine receptors

83

contributes to sarcoplasmic reticulum ca2+ leak in chronic heart failure. Circ Res. 103(12): 1466-1472.

TESHIMA Y, TAKAHASHIN, NISHIO S, SAITO S, KONDO H, FUKUI A, AOKI K, YUFU K, NAKAGAWA M, SAIKAWA T. (2013). Production of Reactive Oxygen Species in the Diabetic Heart. Circ J. [Epub ahead of print]

TUNCAY E, BILGİNOGLU A, SOZMEN NN, ZEYDANLI EN, UGUR M, VASSORT G, TURAN B. (2011). Intracellular free zinc during cardiac excitation-contraction cycle: calcium and redox dependencies. Cardiovasc Res. 89(3):634-42.

TUNCAY E, OKATAN EN, VASSORT G, TURAN B. (2013). ß-blocker timolol prevents arrhythmogenic Ca² release and normalizes Ca²+ and Zn²+ dyshomeostasis in hyperglycemic rat heart. PLoS One.8(7):e71014.

TUNCAY E, SEYMEN AA, TANRIVERDİ E, YARAS N, TANDOGAN B, ULUSU NN,TURAN B. (2007) Gender related differential effects of omega-3e treatment on diabetes-induced left ventricular dysfunction. Mol Cell Biochem.; 304(1-2):255-263.

TURAN B, DÉSİLETS M, AÇAN LN, HOTOMAROGLU O, VANNİER C, VASSORT G. (1996). Oxidative effects of selenite on rat ventricular contractility and Ca movements. Cardiovasc Res. 32(2):351-61.

TURAN B, FLISS H, DESİLETS M. (1997). Oxidant-Induced Alteration of Inracellular Free- Zn2+ Concentration in Rabbit Ventricular Myocytes. Am. J. Physiology, 272, (Heart Circ.Physiol. 41), H2095-H2106.

VALLEE BL, FALCHUK KH. (1993). The biochemical basis of zinc physiology. Physiol Rev. 73(1):79-118.

WAHLER, G.M. (1997). Cardiac action potentials. In: Cell Physiology, Ed.: N. Sperelakis. New York, Academic Press, p.: 780-790

WANG G, LI W, LU X, ZHAO X. (2011). Riboflavin alleviates cardiac failure in Type I diabetic cardiomyopathy. Heart Int.;6(2):e21.

WANG S, ZIMAN B, BODI I ET AL (2009) Dilated cardiomyopathy with increased SR Ca2+ loading preceded by a hypercontractile state and diastolic failure in the alpha(1C)TG mouse. PLoS One 4:e4133

XIA RH, CHENG XY, WANG H, CHEN KY, WEİ QQ, ZHANG XH, ZHU PH. (2000). Biphasic modulation of ryanodine binding to sarcoplasmic reticulum vesicles of skeletal muscle by zn2+ ions. Biochem J. 345 Pt 2. 279-286.

XI J, TIAN W, ZHANG L, JIN Y, XU Z. (2010) Morphine prevents the mitochondrial permeability transition pore opening through NO/cGMP/PKG/Zn2+/GSK-3beta signal pathway in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298(2):H601-7.

XU, Z., ROZANSKI, G.J. (1997). Proton Inhibition of transient outward potassium current in rat ventricular myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 481–490.

YAMASAKI S, SAKATA-SOGAWA K, HASEGAWA A, SUZUKI T, KABU K, SATO E, KUROSAKI T, YAMASHITA S, TOKUNAGA M, NISHIDA K, HIRANO T. (2007). Zinc is a novel intracellular second messenger. J Cell Biol.177(4):637-45.

YARAS N, UGUR M, OZDEMİR S, GURDAL H, PURALI N, LACAMPAGNE A, VASSORT G, TURAN B. (2005). Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart. Diabetes. 54(11):3082-8.

YI T, VICK JS, VECCHIO MJ, BEGIN KJ, BELL SP, DELAY RJ, PALMER BM. (2013). Identifying cellular mechanisms of zinc-induced relaxation in isolated cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305(5):H706-15.

YI T, CHEEMA Y, TREMBLE SM, BELL SP, CHEN Z, SUBRAMANİAN M, LEWİNTER MM, VANBUREN P, PALMER BM. (2012). Zinc-induced cardiomyocyte relaxation in a rat model of hyperglycemia is independent of myosin isoform. Cardiovasc Diabetol. 11:135.

YI T, VICK JS, VECCHİO MJ, BEGIN KJ, BELL SP, DELAY RJ, PALMER BM. (2013). Identifying cellular mechanisms of zinc-induced relaxation in isolated cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305(5):H706-15.

84

ZHU X, BERNECKER OY, MANOHAR NS, HAJJAR RJ, HELLMAN J, ICHINOSE F, VALDIVIA HH. (2005) Increased leakage of sarcoplasmic reticulum Ca2+ contributes to abnormal myocyte Ca2+ handling and shortening in sepsis. Crit Care Med. 33(3):598-604.

85

ÖZGEÇMİŞ

I- KİŞİSEL BİLGİLER

Adı: Erkan

Soyadı: Tuncay

Doğum yeri ve tarihi: Üsküdar – 17.07.1983

Uyruğu: T.C.

Medeni durumu: Bekar

İletişim adresi ve telefonu: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi

Biyofizik A.B.D. – 0312 3103010/337

II – EĞİTİMİ

Pendik Orhan Sinan Hamzaoğlu İlköğretim Okulu (1989-1997)

Pendik Lisesi, İstanbul 1997-2001

Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Fizik Bölümü Lisans (2001-2005)

Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyofizik A.B.D. Yüksek lisans

(2005-2008)

Yabancı dili: İngilizce

III- MESLEKİ DENEYİMİ

Araştırma Görevlisi: Aksaray Üniversitesi Sağlık Yüksek Okulu Hemşirelik

Bölümü (2007-2009).

Araştırma Görevlisi: Aksaray Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Fizik

Bölümü Nükleer Fizik ABD (2009-2013).

Fizikçi: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik ABD

(2013- )

86

IV - ÜYE OLDUGU BİLİMSEL KURULUŞLAR

American Biophysical Society

V- Bilimsel İlgi Alanları

Yayınlar

Gender related differential effects of Omega-3E treatment on diabetes-induced left ventricular dysfunction. Tuncay E, Seymen AA, Tanriverdi E, Yaras N, Tandogan B, Ulusu NN, Turan B. Mol Cell Biochem. 2007 May 26

Sex related effects on diabete-induced alterations in calcium release in the rat heart. Yaras N, Tuncay E, Purali N, Sahinoglu B, Vassort G, Turan B.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007 Sep 21

Antioxidants but not Doxycycline Treatments Restore Depressed Beta-Adrenergic Responses of the Heart in Diabetic Rats. Bilginoglu A, Seymen A, Tuncay E, Zeydanli E, Aydemir-Koksoy A, Turan B. Cardiovasc Toxicol. 2009 Mar 18

Effects of beta-adrenergic receptor blockers on cardiac function: a comparative study in male versus female rats. Tuncay E, Seymen AA, Sam P, Gurdal H, Turan B. Can J Physiol Pharmacol. 2009 Apr;87(4):310-7.

Intracellular free zinc during cardiac excitation-contraction cycle: calcium and redox dependencies. Tuncay E, Bilginoglu A, Sozmen NN, Zeydanli EN, Ugur M, Vassort G, Turan B. Cardiovasc Res. 2011 Feb 15;89(3):634-42. Epub 2010 Nov 9.

Age-related regulation of excitation-contraction coupling in rat heart. Kandilci HB, Tuncay E, Zeydanli EN, Sozmen NN, Turan B. J Physiol Biochem. 2011 Sep;67(3):317-30. Epub 2011 Feb 2.

Profound cardioprotection with timolol in a female rat model of aging-related altered left ventricular function. Sozmen NN, Tuncay E, Bilginoglu A, Turan B. Can J Physiol Pharmacol. 2011 Apr;89(4):277-88. doi: 10.1139/Y11-018. Epub 2011 Apr 28.

Cardioprotective effect of propranolol on diabetes-induced altered intracellular Ca2+ signaling in rat. Tuncay E, Zeydanli EN, Turan B. J Bioenerg Biomembr. 2011 Dec;43(6):747-56. Epub 2011 Nov 30.

Resveratrol and diabetic cardiac function: focus on recent in vitro and in vivo studies. Turan B, Tuncay E, Vassort G. J Bioenerg Biomembr. 2012 Apr;44(2):281-96.

Tuncay E, Okatan EN, Vassort G, Turan B.ß-blocker timolol prevents arrhythmogenic Ca²+ release and normalizes Ca²+ and Zn²+ dyshomeostasis in hyperglycemic rat heart. PLoS One. 2013 Jul 29;8(7):e71014.

87

Ozcinar E, Okatan EN, Tuncay E, Eryilmaz S, Turan B.Improvement of Functional Recovery of Donor Heart Following Cold Static Storage with Doxycycline Cardioplegia. Cardiovasc Toxicol. 2013 Oct 9. [Epub ahead of print]

Okatan EN, Tuncay E, Turan B.Cardioprotective effect of selenium via modulation of cardiac ryanodine receptor calcium release channels in diabetic rat cardiomyocytes through thioredoxin system. J Nutr Biochem. 2013 Dec;24(12):2110-8.

Tuncay E, Okatan EN, Toy A, Turan B. (2014) Enhancement of cellular antioxidant-defence preserves diastolic dyfunction via regulation of both diastolic Zn2+ and Ca2+ and prevention of RyR2-leak in hyperglycemic cardiomyocytes. [Epub ahead of print].

VI – BİLİMSEL ETKİNLİKLERİ

Katılmış olduğu kongreler

Biyofizik Kongresi (Ankara, Türkiye, 2004) Selenium in Health and Disease (Ankara, Türkiye, 2006) ISHR World Congress (Bologna, İtalya, 2007) 52. Uluslararası Biyofizik Kongresi (Kalifornia, ABD, 2008) ISHR -Avrupa Toplantısı (Atina, Yunanistan, 2008) NATO Workshop- Translational Knowledge For Heart Health (Istanbul,

Türkiye, 2008) Ankara Biyokimya Günleri (Türkiye, Ankara,2009) Molecular Medicine (Istanbul, Türkiye, 2009) 37. IUPS Kongresi (Kyoto, Japonya, 2009) IDF 20. Dünya Diyabet Kongresi (Montreal, Kanada, 2009) 1. Moleküler Dinamik Çalıştayı (İstanbul, Türkiye, 2009) Frontiers in Cardiovascular Biology 2010 (Berlin, Almanya, 2010) Moleküler Dinamik Çalıştayı (İstanbul, Türkiye, 2010) Experimental Biology (Washington,ABD, 2011) International Society of Zinc Biology 2012 (Melbourne, Australya, 2012) Molecular Dynamics Çalıştayı 2012 (Sidney, Australya, 2012) Advanced Summer School on Nutrition and Disease: Biochemical and

Molecular Insights (Hermanus, Güney Afrika, 2012) Membrane Bound Protein & Ligand Docking Workshop (İstanbul, Türkiye,

2012) 24. Ulusal Biyofizik Kongresi (İstanbul, Türkiye, 2012) 57. Uluslararası Biyofizik Kongresi (Philadelphia, ABD, 2013)

Posterler

Gender related differential effects of Omega-3E treatment on diabetes-induced left ventricular dysfunction. Italy ISHR Congress.

88

Sex Related effects on diabetes-induced alterations in calcium release in the rat heart. Italy ISHR Congress.

Beneficial effect of sodium selenate on vascular dysfunction in diabetic rats. Italy ISHR Congress.

Beneficial Effects Of Chronic Treatment With Beta-Adrenergic Blockers On Diabetic Cardiomyopathy. Biophysics Congress in California, 2008.

Differential Effects Of Timolol And Propranolol On Heart Function During Maturation. Biophysics Congress in California, 2008.

Chronic Treatments With Beta-Adrenergic Blockers Have Differential Effects On Electrical And Mechanical Activities Of Heart. Istanbul,2008.

Beneficial Effects Of Long-Term Treatment With Beta-Adrenergic Blocker On Depressed Heart Function Of Female Rats. Atina,2008.

Beneficial Effects Of Non-Selective Beta Blockers On Mechanical And Electrical Activities Of Diabetic Rat Heart. Atina,2008.

Antioxidants But Doxycycline Restore Depressed -Adrenergic Responses Of The Heart In Diabetic Rats. Atina,2008.

Chronic Treatments with Beta-Adrenergic Blockers Have Differential Effects on Electrical and Mechanical Activities of Heart. Istanbul, 2008

Beneficial Effects With Beta-Adrenergic Receptor Blockers On Altered Intracellular Ca2+ In Diabetic Rat Heart. IUPS Kyoto, 2009.

Beneficial Effects with Beta-Adrenergic Receptor Blockers on Diabetes-Induced Intracellular Ca2+ Related Mechanisms in the Heart. 20th Diabetes Congress Montreal, 2009.

Beneficial effects of beta-blocker treatment on altered basal cardiac function and responses to beta-adrenoceptor stimulation in female rats during maturation. Germany, 2010

Phosphorylation of ryanodine receptors plays important role in rat heart function during maturation. Germany, 2010

Timolol treatment of diabetic rats improved basal cardiac function and responses to β3- but not β1- and β2-receptors stimulations. Experimental Biology, ABD,Washington,2011

Timolol Treatment of Diabetic Rats Improved Basal Cardiac Function and Responses to β3- but not β1- and β2-receptors Stimulations, NACD, Ankara,2011

Uzun Süreli Timolol Uygulamasının Kalbin Bazal Mekanik Aktivitesine Ve Beta Adrenerjik Reseptör Yanıtlarına Etkilerinin Diyabetli Sıçanlarda İncelenmesi, 23rd National Biophysics Congress, Edirne,2011

Hücre İçi Serbest Zn2+’nun Kardiyomiyositlerde Uyarılma-Kasılma Çiftlenimindeki Rolü, 23rd National Biophysics Congress, Edirne,2011

Doxycycline regulates intracellular zinc in diabetic rat heart via regulation of cellular redox cycle, Melbourne,2012

A Comparative Study on Beneficial Effects of Antioxidants on Diabetes-induced Cardiac Contractile Dysfunction, Hermanus,2012

Enhancement of antioxidant defence preserves RyR2 function of hyperglycemic cardiomyocytes via regulation of both intracellular Zn2+ and Ca2+ homeostasis, Philadelphia, ABD, 2013