1

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU

Proje Başlığı: Kalsifiye Meme Tümörü Dokusunda Nanobakter Varlığının Araştırılması

Proje Yürütücüsünün İsmi: Prof.Dr.Asuman SUNGUROĞLU Yardımcı Araştırmacıların İsmi: Prof.Dr. Jülide Sedef GÖÇMEN Prof.Dr. Esra ERDEMLİ Uzm.Dr. Hasan Basri ŞENER

Uzm.Dr. İbrahim Gündüz TUNÇ Araş.Gör. Pınar ÖZKAL-BAYDIN

Proje Numarası: 2007 0809052 HPD Başlama Tarihi: 10 Ocak 2008

Bitiş Tarihi: Ocak 2010 Rapor Tarihi: Şubat 2010 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2010 "

2

I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri

Kalsifiye Meme Tümörü Dokusunda Nanobakter Varlığının Araştırılması

Makromoleküler hücredışı matriksler arasında organize inorganik kristal yapılarının oluşumu “biyomineralizasyon” olarak tanımlanmaktadır. Mineralizasyonun moleküler temeli büyük oranda bilinmemektedir. Son yıllarda, mineral oluşumu için biyojeokimyasal döngülerde bakterilerin büyük rol oynadığı gösterilmiştir. Meme dokusunda da kalsiyum birikimiyle oluşan biyomineralize kalsifikasyonlar mamogramla tespit edilmiştir. Tespit edilen mikrokalsifikasyonların bir kısmı maligniteyle ilişkili olabilmektedir. Bütün bu bilgiler göz önüne alındığında meme kanserlerindeki malign kalsifikasyonların temelinin nanobakteriler olduğu düşünülebilir. Çalışmanın amacı, elde edilen meme tümörü dokularında nanobakteri varlığını araştırmaktır. Bu amaçla, 15 hastanın meme tümör dokularının kültürü yapılarak taramalı elektron mikroskobunda (TEM) nanobakteri varlığı araştırılmıştır. Sonuç olarak incelenen dokularda nanobakteri benzeri yapılara rastlanmamıştır.

Researching Presence of Nanobacteria in the Calcified Breast Tumor

The formation of organized inorganic crystalline structures within macromolecular extracellular matrices is referred to as “biomineralization”. The molecular basis of mineralization remains largely unknown. Recently, it has shown that bacteria have major role in biojeochemical cycles for mineral formation. Biomineralizied calcifications that are formed by calcium deposits are also detected by mammogram of breast. Some of the detected microcalcifications may be related with malignancy. Taken together, nanobacteria may be thought as a source of malign calcifications in breast cancers. The aim of the study is researching the presence of nanobacteria in the breast tumor tissue. For this aim, by culturing 15 patients’ breast tumor tissue, presence of nanobacteria is investigated with transmission electron microscopy (TEM). As a result nonobacteria like particles couldn’t be found in analysed tissues.

3

II. Amaç ve Kapsam

Makromoleküler ekstraselüler matriksler arasında inorganik kristal yapılarının oluşumu

“biyomineralizasyon” olarak tanımlanmıştır. Memeli kemik ve dental mineleri

biyomineralizasyona örnek olarak verilebilir. Mineralizasyonun moleküler temeli büyük

oranda bilinmemektedir. Son yıllarda, mineral oluşumu için biyojeokimyasal döngülerde

bakterilerin büyük rol oynadığı gösterilmiştir. Mikroorganizmalar deniz suyunda

termodinamik dengenin dışında “apatit” biriktirebilirler. Ayrıca Ca’u Mg’dan ayırırlar ve

spesifik oligopeptidlerin yardımıyla pH’nın < 8,5 ve [Mg]:[Ca] > 0,1 olduğu ortam

şartlarında karbonat biriktirirler. Bu ortam şartları insan vücudunda da mevcuttur (Kajander

ve Çiftçioğlu, 1998). Bu durum, pek çok önemli kronik hastalıkları (ör. atherosklerozis,

Alzheimer ve bazı kanser tipleri gibi) olan kişilerdeki yumuşak doku kalsifikasyonlarının

infeksiyon ajanlarıyla oluşabileceği düşüncesini akla getirmiştir. Biyolojik “apatit”ler

normal ve patolojik kalsifikasyonların mineral fazında mevcuttur. Hastalardaki kalsiyum

tuzu birikiminin nasıl uyarıldığı henüz netlik kazanmamıştır Bakterilerin patolojik doku

kalsifikasyonlarını tetiklediğine dair pek çok hipotez mevcuttur (Çiftçioğlu ve ark., 2002).

Fizyolojik koşullarda kalsifikasyon yapabilen ve bir enfeksiyon ajanı olan nanobakteriler

(Çiftçioğlu ve ark., 2002) ilk defa Kajander ve Çiftçioğlu tarafından insan ve inek kanında

gösterilmiştir (1998). Sahip olduğu farklı özelliklerden ötürü standart mikrobiyolojik

metodlarla tespit edilmeleri ve gösterilmeleri oldukça güçtür. Çapları 0,2-0,5 µm olduğu

halde yapıları nedeniyle 0,1 µm çaplı filtreden geçebilirler. Yapılarının bozulması,

boyanmaları, fikse edilebilmeleri zordur. Bazı çalışmalarda ısıya karşı dirençli oldukları

görülürken (Kajander ve Çiftçioğlu, 1998) bazı çalışmalarda ısıya hassas oldukları

saptanmıştır (Khullar ve ark., 2004). Replikasyon süreleri yaklaşık 3 gündür. Yüksek doz γ-

radyasyon veya aminoglikozid antibiyotikleri çoğalmalarını önler. Nanobakteriler üreaz

veya alkalin fosfataz üretmezler, fakat pH 7.4’te yüzeylerinde karbonat biriktirirler, bu da

birikim yapan moleküllerin varlığına işaret eder. 16S rRNA gen dizisine göre nanobakteriler

Proteobakterilerin α-2 subgrubunda olup; bu grup Brucella ve Bartonella türlerini de

içermektedir. Sonraki jenerasyon bazı antijenler, konakçıda hücre içi ve dışı lokalizasyon ve

sitopatik etkiler açısından nanobakterilerle benzer özellikleri paylaşan insan ve hayvan

patojenleri grubudur (Kajander ve Çiftçioğlu, 1998).

Nanobakterilerin 4 sebepten ötürü in vivoda taş oluşumu ve kalsifikasyonu tetiklediği

düşünülmektedir: (i) İnsan kanında tespit edilmişlerdir, (ii) Yaşayan organizmalar olarak

kandan üreye transport edilebilirler, (iii) İnsan böbrek taşlarında nanobakteri antijenleri

4

bulunmuştur, (iv) Nanobakterilerin fagositer hücreleri (fibroblast) enfekte ettiği

gösterilmiştir (Kajander ve Çiftçioğlu, 1998).

Çiftçioğlu ve Kajander aynı yıl yaptıkları başka bir çalışmada nanobakterilerin 3T6 ve

fibroblastlar üzerinde sitotoksik etkili olduğunu, hücre içine ise reseptör aracılı endositoz

veya ilişkili bir yolla alındığını göstermişlerdir. Elde ettikleri bulgular nanobakterilerin

kültüre edilen tüm memeli fibroblastlarınca internalize edilebileceği yönündedir. Yapışma

moleküllerince çevrelenirler ve normal olarak fagositik olmayan hücrelerde fagositozu

tetiklerler. Sitotoksisite ise medyum komponentlerinin tüketimi sonucu ortaya

çıkmamaktadır. Muhtemelen lizozomlar içinde nanobakterilerin toksik degredasyon ürünleri

sitotoksisiteye neden olmaktadır. γ-radyasyonlu örnekle normali yer değiştirildiğinde benzer

sitotoksisite yine saptanmıştır; nanobakterilerin sitotoksik etki göstermesi için replike

olmaya ihtiyaçları yoktur. Nanobakteriler yıkandığında da sitotoksisitenin görülüyor olması

sitotoksik komponentleri vücutlarının içinde taşıyor olmaları ve belki de endositotik bir

mekanizmayla hücreye veriyor olabileceklerini göstermektedir. İnternalizasyon sitotoksisite

için gerekli gözükmektedir. İnternalizasyon ve hücre içinde hayatta kalma virulansa

bağlıdır. Ölen hücrelerin fazla sayıda sindirilmiş nanobakteri içerdiği saptanmıştır.

Görüntüleri ise apoptotik hücrelere benzemektedir. Tüm sonuçlar kandan elde edilen bu

organizmaların in vivoda da patojenik olabileceğini göstermektedir (Çiftçioğlu ve Kajander,

1998).

1999 yılında Çiftçioğlu ve ark.nın Helibacter pylori ile peptik ülser arasındaki benzer

ilişkinin böbrek taşları oluşumu ve nanobakteriler arasında olduğunu öneren çalışmaları

yayınlanmıştır. Böbrek taşı oluşumunda nanobakterilerin “nidi” gibi davranabileceği

belirtilmiştir. Ortaya atılan bu teori şu bulgularla desteklenmektedir: (a) Analiz edilen

nanobakterilerin %97.2’si nanobakteri içermektedir. (b) Hemen hemen tüm böbrek taşları

bileşen olarak apatite sahiptir. (c) Nanobakteriler insan vücudunda apatit üreten ve böbrekte

biriktiği bilinen tek organizmadır. (d) İnsan böbrek taşlarından izole edilen nanobakteriler

kültür ortamında da taş üretmişlerdir. (e) İn vitroda memeli hücrelerine sitotoksik olan ve

böbrek dokusunda apoptoza neden olan bir organizma böbrek taşlarının oluşumunda sadece

bir seyirci olamaz. (f) Kontrol kültürleri negatif olduğu için kontaminasyon olmadığı

anlaşılmıştır. (g) Finlandiyalılar’ın yanı sıra Amerikalı hastalardan toplanan böbrek taşı

örneklerinde de nanobakteriler saptanmıştır (Çiftçioğlu ve ark., 1999). Sonraki yıllarda

yapılan çalışmalarda hastaların kist sıvılarında nanobakteri antijenleri varlığı tespit edilmiş

(Hjelle ve ark., 2000), nefrolithiasis ve böbrek kistlerinin oluşumunda da nanobakterilerin

5

yer aldığı öne sürülmüştür (Kajander ve ark., 2001).

Diyabetik böbrek yetmezliği olan bir hastada mitral valf “calciphylaxis”in oluşumundan

(Jelic ve ark., 2004), omurga diski (Eskandary ve ark., 2005), aterosikleroz plakları (Puskas

ve ark., 2005), siyah pigment safra taşları (Wang ve ark., 2006), kalsifiye aort valf stenozu

(Jelic ve ark., 2007, Bratoz-Perez ve ark., 2008), diş plakları (Demir, 2008) oluşumundan,

plasentada erken kalsiyum depolanmasından (Agababov ve ark., 2007) ve infertilitede

testiküler mikrolithiasisin oluşumundan (Zhang ve ark., 2009) da yine nanobakteriler

sorumlu tutulmuştur.

Nanobakterilerin çeşitli kanser tipleriyle ilişkili olabileceğine dair çalışmalar da mevcuttur.

Ovaryum kanseri bunlardan bir tanesidir. Ovaryumda görülen adenokarsinomlar genellikle

mikrokalsifikasyonlarla ilişkilendirilmektedir. Yapılan çalışmada kalsifiye

adenokarsinomlarda nanobakteri antijenleri tespit edilmiştir (Sedivy ve Battistutti, 2003).

Biyomineralizasyon görülmeyen malign ovaryum tümörlerinde ise bu antijenlere

rastlanmamıştır (Hudelist ve ark., 2004). Malign mikrokalsifikasyonlar içeren göğüs kanseri

ile nanobakteriler arasında ilişki olabileceğine dair hipotezler de mevcuttur (Altundağ ve

ark., 2006). Benzer hipotezler mamoplasti sonrası görülen kalsifikasyon ve kapsül

“contracture” için de mevcuttur (Gündeşlioğlu ve ark., 2005). Doku kalsifikasyonuna pek

çok malign hastalıkta rastlanmıştır. Malign hücreler nanobakteriler için reseptörlere

sahiptirler. Nanobakterilerin hücre içine reseptör aracılı endositoz ya da bununla ilişkili

benzer bir yolla alındığı düşünülmektedir. Bu sayede nanobakteriler tümör içine girebilirler

ve kalsifikasyon yapabilirler (Kajander ve Çiftçioğlu, 1998). Meme dokusunda da kalsiyum

birikimiyle oluşan kalsifikasyonlar mamogramla tespit edilmiştir. Bu kalsifikasyonlar büyük

çoğunlukla benign oluşumlar olarak kabul edilir. Fakat tespit edilen mikrokalsifikasyonların

%10’undan daha az bir kısmı maligniteyle ilişkili olabilmekte ve biopsiyle takip

edilmektedir (Frouge ve ark., 1993).

Bütün bu bilgiler göz önüne alındığında meme tümörlerindeki malign kalsifikasyonların

temelinin nanobakteriler olduğu düşünülebilir. Bu çalışmayla, meme dokusu kültürü

yapılarak meme tümörlerinde nanobakteri varlığı araştırılmıştır.

6

III. Materyal ve Yöntem

Çalışma 15 hastadan alınan meme tümörü dokusu ile gerçekleştirilmiştir. Dokudan Nanobakteri Kültürü

- Doku örneği steril bistüri yardımıyla küçük parçalara ayrılıp, ezilmiştir.

- 1 M HCl ile demineralize edilmiştir.

- 1 M NaOH ile nötralize edilmiştir.

- DMEM ile süspanse edilmiştir.

- Süspansiyon 0.2 µm çaplı filtreden geçirilmiştir.

- Filtrat DMEM ,%10 inaktive γFBS içeren besiyerinde kültüre edilmiştir.

- Kültür, ortam şartları 37oC, %5 CO2 ve %95 hava içermek koşuluyla 8 hafta devam etmiştir

(Bratos-Perez ve ark., 2008).

Kontrol kültürleri

- DMEM ve %10 inaktive FBS nanobakteri üretiminin ve görüntülenmesinin denenmesi

amacıyla kültüre edilmiştir.

- DMEM ve %10 inaktive γFBS içeren kültür ortamı tümör dokusu filtratı olmadan, meme tümör

dokusu kültürleri ile eş zamanlı olarak kültüre edilmiştir.

Nanobakteri Eldesi

- Flasktan “scraper” yardımıyla kazıyarak elde edilen kültürler karakterizasyon için 5.000g’de,

45’, +4oC’de santrifüj edilmiştir.

- Pelet nanobakteri varlığını araştırmak amacıyla farklı işlemlere maruz bırakılmıştır:

i-Elektron Mikroskopisi (TEM)

- PBS ile yıkanan pelet %2,5 gluteraldehit + %2 paraformaldehitle 3 sa. fikse edildikten sonra

fosfat tamponla yıkanıp ikinci fiksazyon için %1 Osmiyum tetroksit kullanılmıştır. Uranil

asetatla blok boyama yapıldıktan sonra dereceli etanolle dehidratasyon yapılan örnekler

propilen oksitten geçiri1erek araldit 6005 gömme materyalinde bloklanmıştır (Khullar ve ark.,

2004, Bratos-Perez ve ark., 2008). Bloklar polimerize edildikten sonra 60-90nm kalınlığında

alınan ince kesitler bakır gridlere toplanıp uranil asetat ve kurşun sitratla boyandıktan sonra

LEO 906 E TEM ‘ da incelenerek görüntüleri alınmıştır.

ii- Mikrobiyolojik Araştırmalar

- Nanobakteri kültürlerinde klasik mikropların olmadığını göstermek üzere peletten 200 µl

alınarak Mycoplasma sıvı besiyeri, koyun kanlı agar, Eosin metilen Blue agara aerobik ve

anaerobik inkübasyonla subkültür yapılmıştır.

- Gram ve Giemsa boyamaları yapılmıştır.

7

iii- Spektrofotometrik Araştırmalar

- Peletin spektrofotometre yardımıyla maksimum absorbansı ölçülmüştür.

iv-İmmünohistokimya

- Nanobakterilerin immünohistokimyasal olarak işaretlenmesinde kullanılan 8D10 anti-

nanobakteriyel monoklonal primer antikor Finlandiya’da tek bir firma (Nanobac Oy) tarafından

satılmaktadır. Çalışmamız proje aşamasındayken yapılması planlanan ve parafin bloğa

gömülmek suretiyle hazırlanacak preparatların 8D10 anti-nanobakteriyel monoklonal primer

antikor ile işaretlenmek üzere Nanobac Oy Klinik Laboratuvarı, Kuopio/Finlandiya’ya

gönderilmesi, irtibat kurulan kişinin firmadan ayrılması ve daha sonra firmayla yapılan

yazışmalardan cevap alınamaması nedeniyle gerçekleştirilememiştir. Bu duruma ilave olarak,

son yıllarda yayınlanan araştırmalarda bu antikorun güvenilirliği konusunda da şüphelerin

olduğu belirtilmiştir (Martel ve Young, 2008).

8

IV. Analiz ve Bulgular

Kontrol Kültürleri

Nanobakteri üretiminin ve görüntülenmesinin denenmesi amacıyla kültüre edilmiş olan DMEM ve

%10 inaktive FBS’un 8 haftalık kültürü sonucu elde edilen preparatların TEM’de incelenmesi sonucu

nanobakteri benzeri partiküllere rastlanmıştır (Şekil 1,2,3).

Şekil 1: DMEM ve %10 inaktive FBS’un kültürü sonucu elde edilen nanobakteri benzeri yapılar.

Şekil 2: DMEM ve %10 inaktive FBS’un kültürü sonucu elde edilen nanobakteri benzeri yapılar.

9

Şekil 3: DMEM ve %10 inaktive FBS’un kültürü sonucu elde edilen nanobakteri benzeri yapılar.

DMEM ve %10 inaktive γFBS içeren kültür ortamının tümör dokusu filtratı olmadan, meme tümör

dokusu kültürleri ile eş zamanlı olarak 8 haftalık kültürü sonucunda nanobakteri ya da benzeri hiçbir

üreme saptanmamıştır. Kültür sonucu pelet elde edilememiştir.

Dokudan Nanobakteri Kültürü ve Eldesi

Meme tümörlü 15 hastadan elde edilen tümör dokularının 8 hafta kültürü sonucunda elde edilen pelette

yapılan incelemeler sonucunda:

- TEM: Yağ damlaları dışında herhangi bir görüntü elde edilememiştir. Nanobakteri benzeri

partiküllere rastlanmamıştır.

- Mikrobiyolojik araştırmalar: Peletten 200 µl alınarak koyun kanlı agar, EMB ve mycoplasma

besiyeri ortamlarında yapılan subkültürler sonucunda üreme görülmemiştir. Gram ve Giemsa

boyalarında da herhangi bir özellik saptanmamıştır.

- Spektrofotometrik araştırmalar: Tümör dokularının kültürü sonucu elde edilen peletin

spektrofotometrede ölçümü sonucu maksimum absorbans ortalama 550 nm ölçülmüştür.

Çiftçioğlu ve ark. (2002) nanobakteri saptanan kültürlerde yaptığı bir çalışmada maksimum

absorbans 650 nm ölçülmüştür. Bulgumuz bu değerle uyumlu değildir.

10

V. Sonuç ve Öneriler

Bu çalışmada, 15 meme tümörü dokusu nanobakteri varlığı açısından incelenmiştir. Alınan dokuların

8 haftalık kültürü sonrasında elde edilen pelet TEM’da incelenmiş, absorbansı ölçülmüş ve kültür

ortamında diğer mikroorganizmaların varlığını araştırmak amacıyla mikrobiyolojik analizlere tabii

tutulmuştur. Değerlendirilen tüm bulgular sonucunda 15 meme tümörü dokusunda nanobakteri

benzeri yapılara rastlanmamıştır.

Kimi zaman “nanon”lar kimi zaman “kalsifiye edici nanopartiküller” olarak adlandırılan

nanobakteriler aslında bilim adamlarının yaşam formu kriterlerine uymamaktadır. DNA

replikasyonuna dayalı hücresel yapılara sahip olmak için yaşam formlarının 200 nm den daha büyük

olması gerekmektedir denmektedir. Nanobakterilerse 80 nm civarında boyutlara sahip

olabilmektedirler. Nanobakterilerin canlı organizmalar olduğunu gösteren çalışmaların yanı sıra

nükleik asit ve/veya protein yapısına rastlayamayarak, oluşumları cansız moleküllerin birikimiyle

oluşan mikrokristal apatitler olarak yorumlayan çalışmalar da mevcuttur (Raoult ve ark., 2008;

Martel ve Young, 2008).

Kalsifiye edici nanopartiküllerin canlı olup olmadıkları tam olarak kanıtlanamadığı gibi

mikrokalsifikasyon içeren her tümör dokusunda da varlıkları henüz gösterilmemiştir. Bizim

çalışmamızda da nanopartiküllerin meme tümörü dokularında varlıklarına işaret eden bir bulguya

rastlanmamıştır.

Ancak, cerrahi girişimle alınmış olan bu 15 dokunun esas olarak patolojiye değerlendirilmek üzere

gönderilmiş olması nedeniyle bizim incelememiz için ayrılmış olan parçanın mikrokalsifikasyonlar

içermiyor olabilmesi ihtimali bu çalışmayı sınırlandıran faktör olabilir. Sonucumuzu teyit etmek

üzere, bir sonraki araştırma basamağı olarak, kalsifiye bölgelerin radyolojik-mamografik görüntüsü

alınarak tespit edilmesi ile belirlenen mikrokalsifiye bölgelerden TEM ile çalışılması planlanmıştır.

11

VI. Kaynaklar

ALTUNDAĞ K, ALTUNDAĞ Ö, AKYÜREK S, ATİK MA. (2006). Possible association between nanobacteria and malignant microcalcifications in breast cancer. The Breast Journal, 12(3):287. AGABABOV RM, ABASHINA TN, SUZINA NE, VAINSHTEIN MB, SCHWARTSBURD PM. (2007). Link between the early calcium deposition in placenta and nanobacterial-like infection. J Biosci, 32(6):1163-68. BRATOS-PEREZ MA, SANCHEZ PL, deCRUZ SG, VILLACORTA E, PALACIOS IF, et al. (2008). Association between self-replicating calcifying nanoparticles and aortic stenosis. A possible link to valve calcification. European Heart Journal, 29:371-76. ÇİFTÇİOĞLU N, BJORKLUND M, KUORIKOSKI K, BERGSTROM K. (1999). Nanobacteria: An infectious cause for kidney stone formation. Kidney International, 56:1893-98. ÇİFTÇİOĞLU N, MILLER-HJELLE MA, HJELLE JT, KAJANDER EO. (2002). Inhibition of nanobacteria by antimicrobial drugs as measured by a modified microdilution method. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46(7):2077-86. DEMİR T. (2008). Is there any relation of nanobacteria with peridontal diseases? Medical Hypothesis, 70:36-39. ESKANDRY H, SABA M, YAZDI T. (2005). Nanobacteria and invertebral disc degeneration. Med

Hypotheses, 65(5):997-98. FROUGE C, MEUNIER M, GUINEBRETIERE JM, et al. (1993). Polyhedral microcalcifications at mammography: histological correlation with calciumoxalate. Radiology, 186: 681-84. GÜNDEŞLİOĞLU Ö, ALTUNDAĞ Ö, ALTUNDAĞ K. (2005). Nanobacteria and breast implant capsule contracture and calcification: a hypothesis. Aesth Plast Surg, 29:582. HJELLE JT, HJELLE-MILLER MA, POXTON IR, KAJANDER EO, ÇİFTÇİOĞLU N, JONES ML, CAUGHEY RC, BROWN R, MILLIKIN PD, DARRAS FS. (2000). Endotoxin and nanobacteria in polycystic kidney disease. Kidney Int. 57: 2360-74. HUDELIST G,SINGER CF, KUBISTA E, MANAVI M, MUELLER R, PISCHINGER K, CZERWENKA K..(2004). Presence of nanobacteria in psammoma bodies of ovarian cancer. Evidence for pathogenic role in intrtumoral biomineralization. Histopathology. 45: 633-37. JELIC TM, MALAS AM, GROVES SS, JIN B, MELLEN PF, OSBOME G, et al. (2004). Nanobacteria-caused mitral valve calciphylaxis in a man with diabetic renal failure. Southern Medical

Journal, 97(2):194-98. JELIC TM, CHANG HH, ROQUE R, MALAS AM, WARREN SG, SOMMER AP. (2007). Nanobacteria-associated calcific aortic valve stenosis. The Journal of Heart Valve Disease, 16:101-105. KAJANDER OE, ÇİFTÇİOĞLU N. (1998). Nanobacteria: an alternative mechanism for pathogenic intra-and extracellular calcification and stone formation. Proc Natl Acad Sci USA, 95:8274-79.

12

KAJANDER OE, ÇİFTÇİOĞLU N, MILLER-HJELLE MA, HJELLE JT. (2001). Nanobacteria: controversial pathogens in nephrolithiasis and polycystic kidney disease. Curr Opin Nephrol Hypertens, 10(3):445-52. KHULLAR M, SHARMA SK,SINGH SK, BAJWA P, SHEIKH FA, RELAN V, SHARMA M. (2004). Morphological and immunological characteristics of nanobacteria from renal stones of a North Indian population. Urol. Res. 32(3): 130-35. MARTEL J, YOUNG JD. (2008). Purported nanobacteria in human blood as calcium carbonate nanoparticles. PNAS, 105(14):5549-54. PUSKAS LG, TISZLAVICZ L, RAZGA Zs, TORDAY LL, KRENACS T, PAPP JGy. (2005). Detection of nanobacteria like particles in human atherosclerotic plaques. Acta Biologica Hungarica. 56(3-4):233-45. RAOULT D, DRANCOURT M, AZZA S, NAPPEZ C, GUIEU R, et al. (2008). Nanobacteria are mineralo fetuin complexes. PLOS Pathogens, 4(2):1-8. SEDIVY R, BATTISTUTTI WB. (2003). Nanobacteria promote crystallization of psammoma bodies in ovarian cancer. APMIS, 111:951-4. WANG L, SHEN W, WEN J, AN X, CAO L, WANG B. (2006). An animal model of black pigment gallstones caused by nanobacteria. Digestive Diseases and Sciences, 51(6):1126-32. ZHANG Q, LU G, SHEN X, ZHANG-SONG Z, FANG Q, ZHANG X, LI L, JIN X, SONG B. (2009). Nanobacteria may be linked to testicular microlithiasis in infertility. Journal of Andrology, Published ahead of print.

13

VII. Ekler

a) Mali bilanço ve açıklamaları

Sarf malzeme dışında alım yapılmamıştır. Elimizde 1 adet γFBS ve 2 adet 500 ml lik DMEM

kalmıştır.

Toplam Bütçe 4.200 TL

Harcanan Miktar 4.200 TL

Kalan Miktar Yok