Kamil Jurowski - WordPress.com€¦ · nowoczesne techniki chiralooptyczn e do badania struktury i równowagi konformacyjnej cząsteczek chiralnych o znaczeniu biologicznym. ... jedną

Kamil Jurowski

Kamila Kochan

Anna Jurowska

Grzegorz Zając

Kornel Roztocki

https://scientiaeetdidactics.wordpress.com/

mgr Kamil Jurowski [email protected]

Absolwent Wydziału Chemii Uniwersytet Jagiellońskiego w Krakowie (2012) – praca pod tytułem „Zastosowanie metody LA ICP MS do obrazowania cynk w strukturach mózgu szczura jak narzędzie do badania patofizjologii depresji”. Obecnie doktorant na macierzystej jednostce. Jego zainteresowania naukowe dotyczą zastosowania technik spektrometrii mas w badaniach bioanalitycznych (metalomika, proteomika, lipidomika). W swoim dorobku posiada cztery publikacje związane z zastosowaniem spektrometrii mas w badaniach biomedycznych. Jest autorem wielu wystąpień konferencyjnych zarówno krajowych jak również międzynarodowych. Oprócz zainteresowań naukowych aktywnie zajmuje się dydaktyką akademicką. Od początku studiów doktoranckich jest stypendystą Konsorcjum „KNOW” (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie. Członek Polskiego Towarzystwa Chemicznego oraz Polskiego Towarzystwa Spektrometrii Mas.

mgr Kamila Kochan [email protected]

Absolwentka Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie (2012). Pracę magisterską pod tytułem „Obrazowanie pojedynczych komórek za pomocą spektroskopii FT-IR” zrealizowała w Zespole Obrazowania Ramanowskiego. Obecnie doktorantka na Wydziale Chemii UJ. W ramach pracy doktorskiej zajmuję się aplikacją komplementarnych technik obrazowania metodami spektroskopii oscylacyjnej (FT-IR, Raman) do badania modeli uszkodzenia wątroby. Skupia się stosowaniu technik spektroskopii oscylacyjnej zarówno ex vivo jak również do badań żywych komórek. W swoim dorobku posiada 11 publikacji w czasopismach z listy filadelfijskiej dotyczących aplikacji technik obrazowania metodami spektroskopii oscylacyjnej do badań biomedycznych. Jest autorką licznych wystąpień konferencyjnych, a także stypendystką Konsorcjum „KNOW” (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie oraz kierownikiem i wykonawcą kilku grantów badawczych.

mgr Anna Jurowska [email protected]

Absolwentka Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie – praca magisterska pt. „Synteza i charakterystyka fizykochemiczna nowych kompleksów Mo(IV) z ligandami N, i N,N-donorowymi”. Obecnie doktorantka II roku Chemii na macierzystej jednostce. Badania związane z tematem rozprawy doktorskiej realizuje w Zespole Chemii Koordynacyjnej. W swojej pracy naukowej zajmuje się syntezą i charakterystyką fizyko-chemiczną kompleksów metali d- elektronowych z dendrymerycznymi ligandami opartymi na strukturze triazyny. Od początku studiów doktoranckich jest stypendystką Konsorcjum „KNOW” (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie. Jest autorką czterech publikacji z listy filadelfijskiej i kilkunastu wystąpień na konferencjach krajowych oraz międzynarodowych.

mgr Grzegorz Zając [email protected]

Tytuł magistra uzyskał w 2014 roku na Wydziale Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego; temat pracy: "Struktura, spektroskopia i stereochemia astaksantyny". W swoich badaniach, realizowanych na studiach doktoranckich, wykorzystuje nowoczesne techniki chiralooptyczne do badania struktury i równowagi konformacyjnej cząsteczek chiralnych o znaczeniu biologicznym. Jego zainteresowania naukowe dotyczą przede wszystkim badań układów chiralnych z wykorzystaniem ramanowskiej aktywności optycznej ROA (ang. Raman Optical Activity), oraz jej zaawansowanych rozwinięć: RROA (ang. Resonance Raman Optical Activity) i SEROA (ang. Surface-enhanced Raman Optical Activity), jak również innych metod chiralooptycznych (ECD, VCD). Jest autorem dwóch publikacji w czasopismach z listy filadelfijskiej i licznych wystąpień na krajowych i międzynarodowych konferencjach naukowych.

mgr Kornel Roztocki [email protected]

Absolwent Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, studia magisterskiej ukończył z wyróżnieniem w 2014; tytuł pracy: „Synteza układów M-MOF z udziałem metaloligandów hydrazonowych”. Doktorat realizuje na macierzystej uczelni zajmując się głównie zagadnieniami związanymi z chemią koordynacyjną, a w szczególności chemią supramolekularną oraz związkami typu MOF (sieci metalo-organiczne).

K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja

widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3

11




12




13

‡

W polskiej literaturze fachowej brak jest monografii,

która przedstawiałaby w jednej pozycji różnorodne

podejścia do interpretacji widm spektroskopowych

i spektrometrycznych. Informacje na temat interpretacji

widm opisane w niniejszej monografii są bardzo ważne

z dydaktycznego punktu widzenia, bowiem stanowią

zestawienie najważniejszych informacji w przypadku

interpretacji widm w jednej monografii. Dla Autorów

niniejszej monografii jest dużym zaskoczeniem, iż do tej

pory nie było w polskiej literaturze żadnej pozycji

poświęconej tym podstawowym, niezwykle ważnym

zagadnieniom.

We współczesnym Świecie dominuje komputeryzacja,

cyfryzacja i coraz większa ilość monografii występuje

w postaci elektronicznej (e-booki). W tego typu

rozwiązaniach można dopatrywać się zarówno wad jak




14

i zalet, niemniej jest to obecnie jedyny możliwy środek

przekazu do najszerszego grona odbiorców. Taki właśnie

cel przyświecał Autorom niniejszej monografii, którzy

zdecydowali się wydać tę pozycję tylko w postaci

elektronicznej.

Autorzy dokonali możliwie największych starań, aby

uniknąć ewentualnych błędów i zastosować poprawną

nomenklaturę fachową. Niemniej Autorzy zdają sobie

sprawę z ewentualnych niedoskonałości pracy i proszą

o zgłaszanie swoich wątpliwości bezpośrednio na adresy

mailowe przedstawione w notach biograficznych niniejszej

monografii. Wszystkie zaprezentowane widma stanowią

wyniki badań Autorów lub zostały zapożyczone

z bezpłatnych i ogólnodostępnych baz danych, które mogą

być wykorzystywane w monografiach na potrzeby

dydaktyczne.

Mamy nadzieję, iż praca ta będzie stanowić cenne

źródło wiedzy w nowoczesnym wydaniu, które umożliwi

zapoznanie wielu czytelników z obliczeniami spektrosko-

powymi i spektrometrycznymi, patrząc przez pryzmat

młodych naukowców, którzy też byli studentami

i zdają sobie sprawę jak trudno jest znaleźć źródło wiedzy

związane z tego typu tematyką.

Kraków, 2015

Autorzy

K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja



15

1

Spektrometria mas

1.1. Wstęp

Widmo mas (z ang. mass spectrum) to graficzne

przedstawienie zależności intensywności sygnału od

stosunku m/z dla jonów. Innymi słowy, widmo mas

w określonych warunkach eksperymentalnych stanowi

zapis (wykres lub tabelę) natężenia sygnałów

analitycznych (natężenie prądu wytwarzanego przez jony

w miarę ich docierania do detektora) dla danych wartości

m/z. Intensywność sygnału (piku) na widmie wskazuje

zatem na względną liczbę jonów – im wyższy jest pik, tym

większa jest populacja jonu, od którego ten pik pochodzi.

Z uwagi na to, że na widmie mas można zaobserwować

zazwyczaj sygnały charakteryzujące się smukłym i ostrym

kształtem, sygnały te nazywa się pikami, a nie pasmami

tak jak ma to miejsce w różnych metodach spektrosko-

powych. Poniżej przedstawiono przykładowe widmo mas

dla o-ksylenu – rysunek 1.1 oraz tabela 1.1.

K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i spektrometrycznych

okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3

16

Rys. 1.1. Widmo mas o-ksylenu w postaci wykresu.




17

Tabela 1.1. Widmo mas o-ksylenu w postaci tabeli.

m/z Intensywność względna [%]

26 1,29

27 9,61

38 2,77

39 18,12

40 2,19

41 3,09

50 7,09

51 16,7

52 7,41

53 5,03

61 1,42

62 3,16

63 7,67

64 1,81

65 9,80

66 1,29

74 2,26

75 1,74

76 1,55

77 18,43

78 8,83

79 7,22

89 2,83

91 99,99

92 8,32

102 1,35

103 5,8

104 2,77

105 21,92

106 55,77

107 5,09




18

Należy zauważyć, że najczęstszym sposobem

przedstawiania widma mas jest prezentacja graficzna,

a nie tabelaryczna. Niemniej w zależności od celu badań,

obie formy prezentacji wyników są ważne. Powszechnie

więc widmo mas kojarzy się z wykresem słupkowym,

gdzie na osi x odłożona jest wartość (m/z), a na osi y

odłożona jest intensywność względna (%).

Na widmie mas najbardziej intensywny pik nazywany

jest pikiem podstawowym. Wysokość piku

podstawowego przyjmuje się za 100%, a wysokość

pozostałych pików odnosi się do tej wartości. Z kolei jony

powstałe w wyniku fragmentacji związku są rozdzielane

w zależności od ich stosunku masy do ładunku (m/z).

Warto zwrócić uwagę na to, że większa liczba jonów jest

naładowana pojedynczo, stąd skalę widma traktuje się

często jako skalę wyrażoną w jednostkach masy. Nie tak

rzadko możliwe są jony naładowane podwójnie, które

pojawiają się na skali m/z przy wartościach

odpowiadających połowie ich masy. Na widmie mas mogą

również występować takie jony, które powstały na skutek

usunięcia z cząsteczki jednego elektronu – takie jony

nazywają się jonami cząsteczkowymi (molekularnymi,

M) i zazwyczaj występują na widmie mas przy największej

wartości m/z. Wyjątkiem są grupy sygnałów

charakteryzujących się wartościami m/z równymi: M+1,

M+2, M+3, … itd. Sygnały tego typu noszą nazwę pików

izotopowych. Źródłem takich pików jest to, że liczne

pierwiastki obecne w związkach występują w przyrodzie




19

w postaci wielu izotopów (wiele pierwiastków nie jest

monoizotopowych).

Liczba pików o znacznej intensywności w widmie mas

oraz ich rozmieszczenie jest charakterystyczną cechą

danej cząsteczki analitu. Masa i względne stężenie jonu

molekularnego wskazują na wielkość i ogólną trwałość

cząsteczki. Widmo mas zawierające kilka pików

o znacznej intensywności wskazuje, że cząsteczka ulega

tylko niewielkiej liczbie rozpadów, co świadczy o trwałości

produktów lub o obecności małej liczby nietrwałych

wiązań.

1.2. Interpretacja widm mas

1.2.1. Identyfikacja piku jonu molekularnego

Z uwagi na to, że wzór cząsteczkowy jest zazwyczaj

jedną z najważniejszych informacji otrzymywaną z widma

mas, stąd należy mieć pewność, że w grupie pików

o masach: M, M+1, M+2 itd. pik jonu molekularnego został

prawidłowo zidentyfikowany.

Wiadomo, że jon cząsteczkowy musi być jonem

posiadającym nieparzystą liczbę elektronów, z uwagi na

fakt, iż powstaje z cząsteczki na skutek utraty jednego

elektronu.




20

1.2.1.1. Stopień nienasycenia (wskaźnik deficytu atomów wodoru)

Jedną z metod umożliwiających określenie, czy dany

jon ma nieparzystą liczbę elektronów jest tzw. stopień

nienasycenia (S), który określa sumę wiązań

wielokrotnych oraz układów pierścieniowych. W niektórych

źródła literaturowych stopień nienasycenia określa się

czasami jako tzw. wskaźnik deficytu atomów wodoru. Dla

prostych cząsteczek organicznych, w których obecne są

tylko atomy węgla, wodoru, tlenu, siarki, azotu oraz

chlorowców można zapisać uproszczony wzór na stopień

nienasycenia (S):

𝑆 =2𝑛𝐶−𝑛𝐻+𝑛𝑁−𝑛𝑋+2

2 (1.1)

gdzie:

𝑛𝐶 – atomy węgla

𝑛𝐻 – atomy wodoru

𝑛𝑁 – atomy azotu

𝑛𝑋 – atomy chlorowców

Podsumowując:

Jeśli w cząsteczce są obecne atomy wodoru, to ich

liczbę odejmuje się od podwójnej liczby atomów

węgla;




21

Jeśli w cząsteczce są obecne atomy azotu, to ich

liczbę dodaje się do podwójnej liczby atomów

węgla;

Jeśli w cząsteczce są obecne atomy chlorowców,

to ich liczbę odejmuje się od podwójnej liczby

atomów węgla;

Niech jako przykład posłuży cząsteczka kwasu

cynamonowego:

W cząsteczce tej obecnych jest:

𝑛𝐶 = 9

𝑛𝐻 = 8

𝑛𝑁 – 0

𝑛𝑋 – 0

Wówczas stopień nienasycenia wynosi 6, ponieważ:

𝑆 =2𝑛𝐶 − 𝑛𝐻 + 𝑛𝑁 − 𝑛𝑋 + 2

2=

2 ∙ 9 − 8 + 0 − 0 + 2

2= 6

Analizując wzór półstrukturalny można stwierdzić,




22

że w cząsteczce kwasu cynamonowego znajduje się

5 wiązań typu π (czerwone strzałki) oraz jeden pierścień

aromatyczny (różowe tło) w sumie 6, co jest w zgodzie

z wcześniejszymi obliczeniami:

Z punktu widzenia spektrometrii mas, ważne jest, by

pamiętać, że stopień nienasycenia dla jonów

o nieparzystej liczbie elektronów musi być liczbą

całkowitą. Z kolei dla jonów o parzystej liczbie elektronów,

stopień nienasycenia będzie liczbą niecałkowitą.

1.2.1.2. Reguła azotowca

Jeśli cząsteczka związku organicznego lub jon posiada

nieparzystą liczbę atomów azotu, to liczba określająca jej

masę cząsteczkową jest nieparzysta. Jeśli z kolei

cząsteczka lub jon zawiera parzystą liczbę atomów azotu

lub nie zawiera ich wcale, to masa cząsteczkowa jest

wyrażona liczbą parzystą. Reguła ta znajduje




23

zastosowanie do wszystkich związków zawierających

atomy: C, H, O, N, S, P, B, Si oraz atomy fluorowców. Na

podstawie przedstawionych wcześniej informacji można

dojść do następujących wniosków:

Jony o nieparzystej liczbie elektronów (tzw. jony

nieparzystoelektronowe), odpowiadające cząsteczce

niezawierającej atomów azotu lub zawierających ich

parzystą liczbę będą miały masę wyrażoną liczbą

parzystą;

Jony o parzystej liczbie elektronów (tzw. jony

parzystoelektronowe), odpowiadające cząsteczce

zawierającej nieparzystą liczbę atomów azotu będą

miały masę wyrażoną liczbą nieparzystą.

Warto zwrócić uwagę na to, że jony nieparzysto-

elektronowe powstają głównie w EI, z kolei jony

parzystoelektronowe powstają głównie w ESI, APCI oraz

MALDI.

1.2.1.3. Analiza pików jonów fragmentacyjnych w pobliżu piku badanego

jonu

Rozpoznawanie piku jonu molekularnego można

również dokonać poprzez analizę pików jonów

fragmentacyjnych w pobliżu badanego jonu. Utrata

fragmentów o masach z zakresu: 3 – 15 oraz z zakresu:




24

20 – 26 jest bardzo mało prawdopodobna, stąd jeśli

obserwuje się piki odpowiadające fragmentom o tak

zmienionej masie, to można przypuszczać, że

rozpatrywany jon jest raczej jonem fragmentacyjnym, a nie

cząsteczkowym.

1.2.1.4. Zmiana warunków pomiaru

Zmiana warunków pomiarowych daje również

możliwości na dostarczenie dowodów potwierdzających

właściwe rozpoznanie jonu cząsteczkowego. W takim

przypadku pomocne może okazać się maksymalne

wzmocnienie, co ułatwi obserwację bardzo słabego piku

jonu molekularnego.

Drugim sposobem może być zmniejszenie energii

strumienia elektronów, co powoduje zmniejszenie

intensywności jonów fragmentacyjnych w porównaniu

z intensywnością jonu cząsteczkowego. Należy zauważyć,

że dotyczy to również jonów fragmentacyjnych

pochodzących od kontaminacji.

Innym podejściem może być również zastosowanie

innego typu jonizacji niż EI, np. jonizacja chemiczna,

jonizacja polem w większym stopniu sprzyjają tworzeniu

grupy pików jonu molekularnego, stąd jeśli są dostępne to

również powinny być zastosowane.




25

1.2.2. Intensywność piku jonu molekularnego

Intensywność piku molekularnego w widmie mas jest

tym większa, im mniejsza jest energia potrzebna do

jonizacji cząsteczki i im trwalszy jest jon cząsteczkowy.

Strukturze cząsteczki odpowiadają charakterystyczne

wartości energii jonizacji, a to określa wielkość energii

potrzebnej do wytworzenia jonu cząsteczkowego.

Należy zwrócić uwagę, że jeśli cząsteczka zawiera

wiązanie łatwo ulegające rozszczepieniu, to pik jonu

molekularnego będzie charakteryzował się bardzo małą

intensywnością. Zazwyczaj intensywność jonu

molekularnego wzrasta ze wzrostem nienasycenia i ze

wzrostem liczby pierścieni, przy czym jest mniejsza dla

łańcuchów rozgałęzionych. Wzrost intensywności piku

jonu cząsteczkowego może być z kolei powodem

obecności heteroatomów, mających na zewnętrznych

powłokach łatwo ulegające dysocjacji elektrony.

W tabeli 1.2. przedstawiono ogólne wskazówki

pomocne podczas przewidywania intensywności piku jonu

molekularnego dla widm różnego rodzaju klasy związków

organicznych.

……………………………………………………………………………………………….……

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………..




26

Tabela 1.2. Ogólne wskazówki pomocne podczas przewidywania

intensywności piku jonu molekularnego. in

tensyw

ność p

iku

jonu

mo

lekula

rnego

mała lub pik nie występuje

średnia duża

kla

sa z

wią

zków

alkohole

alifatyczne

aminy

alifatyczne

nitryle

związki o rozga-

łęzionych

łańcuchach

związki nitrowe

aromatyczne bromo-

i jodopochodne

sprzężone alkeny

pochodne benzylowe

oraz benzoilowe

ketony i aldehydy

o prostych łańcu-

chach, estry, kwasy

karboksylowe, amidy

etery

halogenki alkilowe

węglowodory

aromatyczne

aromatyczne

nitryle i aminy oraz

fluoro- i chloro-

pochodne

nasycone związki

cykliczne

1.2.3. Wzory cząsteczkowe

Jedną z najbardziej użytecznych informacji,

pozyskiwanych z widma mas, jest wzór cząsteczkowy

danego związku. Jeśli istnieje możliwość identyfikacji jonu

molekularnego, to istnieją dwa sposoby ustalania wzoru

cząsteczkowego w zależności od rozdzielczości

stosowanego spektrometru mas. Najlepszą metodą jest

zastosowanie aparatu odznaczającego się dużą




27

zdolnością rozdzielczą, co umożliwia dokładny pomiar

masy jonu molekularnego. Z uwagi na to, że masy

atomowe nie wyrażają się liczbami całkowitymi, masa

każdego zestawu atomów będzie wyrażona

charakterystyczną liczbą niecałkowitą. Dokładny pomiar

masy pozwala zatem odróżnić dwa sygnały. Warto

zwrócić uwagę, iż istnieją różnorodne tabele, które

ułatwiają powiązanie dokładnych mas ze wzorami

cząsteczkowymi. Dokładne wyznaczanie masy

cząsteczkowej jest szczególnie ważne podczas, gdy

zachodzi potrzeba potwierdzenia poprawności identyfikacji

konkretnego jonu cząsteczkowego, natomiast jest mało

przydatne w przypadku prób ustalania wzoru nieznanego

analitu.

Inną metodą może być pomiar intensywności pików

izotopowych, szczególnie jeśli wykorzystuje się widma

mas wykonane przez spektrometry mas o małej

rozdzielczości. W tym przypadku należy stosować

abundancje trwałych izotopów. Dane dla poszczególnych

izotopów są przedstawiane w dwojaki sposób – jako

odsetek wszystkich występujących izotopów, albo jako

odsetek izotopu występującego w największej ilości.

Każda więc kombinacja atomów będzie dawała grupę

pików izotopowych o możliwych do przewidzenia

intensywnościach. Niech jako przykład posłuży metan,

w którym stosunek intensywności pików 12CH4:13CH4

wynosi 100:1,08. Intensywność piku M+1 będzie równa

1,08% intensywności piku molekularnego. Warto




28

nadmienić, że bardzo mały wkład w intensywności tego

piku będzie też wnosiła cząsteczka 12C1H32H.

Należy zauważyć, że jednym z warunków, jaki musi być

spełniony, aby możliwe było zastosowanie intensywności

pików izotopowych do określenia wzoru cząsteczkowego,

jest względnie duża intensywność piku molekularnego.

W innym przypadku piki izotopowe mogą być zbyt słabe,

aby można było zmierzyć ich intensywność z wymaganą

dokładnością. Innym problemem może być nakładanie się

piku sprotonowanego jonu molekularnego, słabych jonów

tła lub pików kontaminacji próbki. Warto zwrócić uwagę,

iż metoda ta daje poprawne wyniki tylko dla cząsteczek

o masie nie większej niż 250 – 300.

1.2.4. Fragmentacja

Pik jonu molekularnego dostarcza podstawowych

informacji na temat tożsamości cząsteczki. Dalsze

informacje można uzyskać z układu pików

fragmentacyjnych, które pochodzą od jonów powstałych

na drodze rozpadu jonu molekularnego. Ponieważ nie

wszystkie jony mają takie samo znaczenie, poniżej

zestawiono najważniejsze zasady i metody postepowania

podczas interpretacji widm:

Najważniejszy na widmie mas jest pik jonu

molekularnego;




29

Spośród jonów o podobnej masie lub powstających

w porównywalnych ilościach, jony o nieparzystej

liczbie elektronów mają na ogół większe znaczenie

niż jony o parzystej liczbie elektronów – jony

o nieparzystej liczbie elektronów tworzą się zwykle

w reakcjach przegrupowania, które mogą być

charakterystyczne dla poszczególnych klas

związków;

można się spodziewać, że jony o dużych masach

będą dostarczały ważniejszych informacji niż te,

o małych masach powstających w wyniku prostych,

łatwych do wyjaśnienia fragmentacji;

Źródłem cennych informacji o rodzajach procesów

rozpadu mogą być jony metastabilne;

Istnieją dwa ważne czynniki decydujące

o intensywności pików jonów fragmentacyjnych

w widmie mas: 1) różnice między energiami wiązań

rozrywających się i tworzących w trakcie

powstawania jonu; 2) trwałość danego jonu.

Widmo mas stanowi swojego rodzaju „molekularny

odcisk palca”, ponieważ każda cząsteczka posiada

własny, charakterystyczny szablon fragmentacji, a z kolei

prawdopodobieństwo, że dwie cząsteczki będą posiadały

identyczny szablon fragmentacyjny, jest bardzo małe.

Obecnie bardzo rzadko dochodzi do samodzielnej




30

interpretacji złożonych widm mas, ponieważ możliwa jest

komputerowa identyfikacja nieznanego związku poprzez

analizę porównawczą badanego szablonu fragmenta-

cyjnego z widmem mas z darmowych bibliotek widm mas,

oferowanych przez różnorodne firmy specjalizujące się

w budowie instrumentów analitycznych.

Jeśli jednak zachodzi potrzeba samodzielnej analizy

widma mas, to możliwe jest wyciąganie wniosków,

dotyczących struktury badanej cząsteczki na podstawie

sposobu jej fragmentacji.

Wiadomo jest, że fragmentacja zachodzi wówczas, gdy

wzbudzony, mający znaczną energię kationorodnik,

rozpada się samorzutnie na mniejsze fragmenty

- wiązania chemiczne pękają i powstają w najprostszym

przypadku dwa fragmenty. Jeden z tych dwóch

fragmentów ma ładunek dodatni, jest karbokationem,

natomiast drugi jest obojętnym elektrycznie rodnikiem.

Co więcej, ładunek dodatni pozostaje na tym fragmencie,

na którym jest trwalszy, czyli lepiej stabilizowany

- w czasie fragmentacji powstają karbokationy bardziej

trwałe.

Poniżej przedstawiono zarys informacji na temat

charakterystycznych właściwości fragmentacyjnych

niektórych wybranych grup funkcyjnych:

alkohole – ta klasa związków organicznych posiada

dwie charakterystyczne ścieżki fragmentacji: rozpad

alfa oraz dehydratację; w przypadku pierwszej z nich




31

rozerwaniu ulega wiązanie C—C najbliższe grupy

hydroksylowej, dając obojętny rodnik oraz fragment

naładowany elektrycznie i zawierający atom tlenu,

co można schematycznie przedstawić jako:

W drugim przypadku (dehydratacja), eliminowana jest

cząsteczka wody, dając alkenowy kationorodnik o 18 u

lżejszy od masy jonu molekularnego, co można

schematycznie przedstawić jako:

aminy – ulegają charakterystycznemu rozpadowi α,

podobnie jak alkohole; wiązanie C—C najbliższe do

atomu azotu ulega rozerwaniu, dając obojętny rodnik

alkilowy oraz kation z atomem azotu, co można

schematycznie przedstawić jako: ……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………




32

aldehydy i ketony – jeśli na trzecim atomie węgla od

grupy karbonylowej znajduje się atom wodoru (γ atom

węgla), to ulegają charakterystycznemu rozczepieniu

cząsteczki – tzw. rozszczepieniu McLaffertyego.

W takim przypadku atom wodoru zostaje przeniesiony

do atomu tlenu z grupy karbonylowej, następnie pęka

wiązanie C—C, co z kolei prowadzi do powstania

obojętnej cząsteczki alkenu, a ładunek dodatni

pozostaje na fragmencie, zawierającym atom tlenu,


Oprócz tej przemiany aldehydy i ketony mogą ulegać

również fragmentacji poprzez rozpad α, polegający na

rozerwaniu wiązania między grupą karbonylową

a najbliższym atomem węgla, w wyniku czego powstaje

obojętny rodnik oraz kation zawierający atom tlenu,





33

1.2.5. Reguły przydatne podczas interpretacji widm mas

Podczas interpretacji widma mas, warto posługiwać się

pewną strategią, której etapy przedstawiono poniżej.

Należy jednakże zauważyć, że każde widmo mas stanowi

indywidualny problem i nie można sztywno trzymać się

jakiegokolwiek schematu postępowania. Dlatego też

poniżej przedstawiono jedynie ogólne zasady, które mogą

być przydatne podczas interpretacji widm mas:

Etap I. Należy najpierw zidentyfikować jon

molekularny (M+);

Etap II. Poddać związek analizie elementarnej oraz

obliczyć na jej podstawie stopień nienasycenia

związku (S);

Etap III. Na podstawie ogólnej analizy widma mas

należy wyciągnąć wszystkie możliwe wnioski

na temat struktury związku - zidentyfikować

serie pików i jony charakterystyczne;

Etap IV. Na podstawie obecności jonów o dużych

masach należy ustalić prawdopodobną

strukturę fragmentów obojętnych;




34

Etap V. Należy zidentyfikować piki jonów

o nieparzystej liczbie elektronów i rozważyć

możliwe przegrupowania;

Etap VI. Na podstawie danych uzyskanych z widma

mas oraz innych przesłanek należy

zaproponować prawdopodobną strukturę

związku, posiłkując się w razie potrzeby

bazami danych lub tablicami spektrometry-

cznymi.

1.2.6. Przegląd widm mas wybranych klas związków

organicznych

Z uwagi na fakt, iż monografia ta nie jest dedykowana

wyłącznie spektrometrii mas, stąd poniżej zestawiono

jedynie zarys podstawowych informacji na temat widm

mas wybranych klas związków organicznych.

1.2.6.1. Węglowodory

1.2.6.1.1. Alkany

Ponieważ do zjonizowania węglowodorów nasyconych

jest wymagana relatywnie duża wartość energii, stąd

powstałe jony ulegają najczęściej przypadkowym

przegrupowaniom. Zazwyczaj jon molekularny daje się

zaobserwować, ale jego intensywność może być

niewielka. Zwykle widma mas alkanów zawierają serię




35

pików, których położenie różni się o czternaście jednostek

masy, co odpowiada jonom różniącym się liczbą grup

metylenowych (-CH2- lub =CH2). Warto zwrócić również

uwagę na to, że jon M-CH3 zazwyczaj nie jest obecny na

widmie mas.

Dla węglowodorów o prostych łańcuchach

intensywność pików innych jonów stopniowo się zwiększa,

osiągając maksimum przy m/z 43 (C3H7+) lub m/z 57

(C4H9+) – piki te powstają od jonów znacznie

rozgałęzionych, powstających w wyniku przegrupowań

cząsteczkowych. Przykład widma mas dla alkanów

nierozgałęzionych na przykładzie undekanu przedsta-

wiono na rysunku 1.2.

W przypadku alkanów rozgałęzionych można

zaobserwować piki odpowiadające preferowanym

rozszczepieniom przy III° lub IV° atomach węgla.

Przykładem tego może być pik m/z 113 na widmie mas dla

2,6-dimetylooktanu, które zostało przedstawione na

rysunku 1.3. Pik m/z 113 odpowiada drugorzędowemu

karbokationowi, który powstaje poprzez oderwanie grupy

etylenowej.

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………….

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………..



36

Rys. 1.2. Widmo mas nierozgałęzionego węglowodoru nasyconego na przykładzie undekanu.



37

Rys. 1.3. Widmo mas rozgałęzionego węglowodoru nasyconego na przykładzie 2,6-dimetylooktanu.




38

1.2.6.1.2. Alkeny

Zazwyczaj na widmach mas alkenów, pik jonu

molekularnego jest wyraźny. Ponadto, bardziej intensywna

w porównaniu do alkanów jest seria pików odpowiadająca

masie CnH+

n-1. Seria ta jest widoczna np. w widmie mas

heks-1-enu, które zostało przedstawione na rysunku 1.4.

Zazwyczaj określenie położenia wiązania podwójnego nie

jest możliwe z uwagi na łatwo zachodzące

przegrupowania.

1.2.6.1.3. Areny

Z uwagi na stabilizujący wpływ pierścienia

aromatycznego, w widmach mas arenów występuje

zazwyczaj bardzo intensywny pik jonu molekularnego.

Zazwyczaj można również zanotować piki jonów

podwójnie zjonizowanych, które występują w widmie mas

przy wartościach odpowiadających połowie ich masy

rzeczywistej. W widmach pochodnych benzenu obecny

jest pik m/z 91, który pochodzi od jonu tropyliowego

(C7H7+), który po utracie obojętnej cząsteczki etynu

przekształca się w jon o wartości m/z 65 (C5H5+). Przykład

widma mas pochodnej benzenu na przykładzie toluenu

przedstawiono na rysunku 1.5.

Warto zwrócić uwagę, że w przypadku związków

aromatycznych podstawionych grupami alkilowymi

posiadającymi co najmniej trzy atomy węgla, atom wodoru

z pozycji γ może ulegać przeniesieniu – w analogii do




39

przegrupowania McLafferty’ego. Efektem tego jest pik m/z

92. Przykład widma mas dla tego typu związków

aromatycznych na przykładzie butylobenzenu przedsta-

wiono na rysunku 1.6.

Rys. 1.4. Widmo mas alkenu na przykładzie heks-1-enu.

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………..

K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Interpretacja widm spektroskopowych i

spektrometrycznych okiem młodych naukowców, Scientiae et Didactics, 2015, ISBN 978-83-941637-2-3

40

Rys. 1.5. Widmo mas pochodnej benzenu na przykładzie toluenu.



41

Rys. 1.6. Widmo mas związku aromatycznego podstawionego grupami alkilowymi, posiadającymi co

najmniej trzy atomy węgla na przykładzie butylobenzenu.




42

1.2.6.2. Alkohole, fenole i etery

Zazwyczaj pik jonu molekularnego na widmach mas

alkoholi jest bardzo słaby lub wręcz niezauważalny.

W przypadku tej klasy związków charakterystycznymi

jonami są stabilizowane przez rezonans karbokationu,

powstałe na drodze rozpadu α. Preferowanym kierunkiem

tego rozpadu jest ten, w którym oderwaniu ulegają jak

największe grupy alkilowe.

W przypadku alkoholi I° charakterystycznym pikiem jest

M – 18, co wynika z utraty cząsteczki wody przez jon

molekularny. Warto zwrócić uwagę na to, że pik ten może

również pochodzić od jonu powstałego na drodze

termicznego rozkładu alkoholu w komorze jonizacyjnej.

Jako przykład może posłużyć widmo mas propan-1-olu

przedstawione na rysunku 1.7. Na widmie tym można

zauważyć pik m/z 42 z uwagi na utratę cząsteczki wody,

pik m/z 59 z uwagi na utratę atomu wodoru oraz jon

m/z 31, który pochodzi od jonu CH2=O+H.

W przypadku fenoli na widmie mas występuje

intensywny pik jonu molekularnego. Do charakter-

rystycznych pików fenoli można zaliczyć takie, które

pochodzą od jonów M-28 (co wynika z utraty CO

i powstania jonu nieparzystoelektronowego) oraz M-29 (co

wynika z utraty CHO). Na rysunku 1.8 przedstawiono

widmo mas dla fenolu (hydroksybenzenu). Charakte-

rystycznymi pikami na tym widmie są: m/z 65 (pochodzący

z utraty CHO) oraz m/z 66 (pochodzący z utraty CO),

a ponadto pik jonu molekularnego m/z 94.




43

W przypadku eterów pik jonu molekularnego jest

bardzo mało intensywny lub niezauważalny. W przypadku

tej klasy związków obserwuje się bardzo często piki

pochodzące z dwóch charakterystycznych procesów

fragmentacyjnych. Pierwszy z nich to rozpad wiązania

węgiel-tlen, co skutkuje pojawieniem się piku

o największej intensywności. Drugi proces polega na

rozerwaniu wiązania między atomami węgla α oraz β

(czyli rozszczepienie α). Przykładem może być widmo

mas eteru dietylowego, na którym obserwuje się

intensywne piki: m/z 59, m/z 45 oraz m/z 31- rysunek 1.9.

Rys. 1.7. Widmo mas alkoholu I° na przykładzie propan-1-olu.



44

Rys. 1.8. Widmo mas fenolu (hydroksybenzenu).



45

Rys. 1.9. Widmo mas eteru dietylowego.




46

1.2.6.3. Aldehydy i ketony

W przypadku aldehydów i ketonów pik dla jonu

molekularnego jest zazwyczaj zauważalny. Na widmie

mas dla tych klas związków istnieją charakterystyczne piki

pochodzące od karbokationów, jakie powstają w wyniku

rozpadu α względem grupy karbonylowej, co prowadzi do

powstania dwóch możliwych jonów acyliowych, które

w konsekwencji tracą cząsteczkę tlenku węgla(II).

W przypadku aldehydów oraz ketonów aromatycznych

pikiem podstawowym jest zazwyczaj pik jonu C6H5-C≡O+,

co daje pik m/z 105. Warto zauważyć, że rozpad α ma

mniejsze znaczenie niż w przypadku ketonów, chociaż

intensywny pik przy m/z 29, odpowiadający CHO, jest

czasami obecny na widmie mas.

Dla aldehydów i ketonów charakterystyczne jest

również przegrupowanie McLafferty’ego, pod warunkiem

jednak, że grupa alkilowa związana z grupą karboksylową

ma łańcuch zbudowany z co najmniej trzech atomów

węgla. Na drodze tej przemiany powstają jony

o nieparzystej liczbie elektronów, co jest pomocne

podczas analizy widma. Pik tego typu odpowiadający

jonowi nieparzystoelektronowemu o m/z 43 może być

zaobserwowany np. na widmie 4-metylopentan-2-onu –

rysunek 1.10.



47

Rys. 1.10. Widmo mas 4-metylopentan-2-onu.




48

1.2.6.4. Kwasy karboksylowe

W przypadku widm mas kwasów monokarboksylowych

pik jonu molekularnego zazwyczaj jest obecny. Rozpad

α daje dwa piki jonów o masach: M-17 (OH) oraz M-45

(COOH), np. widmo mas dla C3H5COOH – rysunek 1.11.

1.2.6.5. Estry kwasów karboksylowych

W przypadku estrów kwasów karboksylowych

o ogólnym wzorze R1COOR2 pik pochodzący od jonu

molekularnego jest zazwyczaj widoczny, jeśli grupa

alkilowa R1 zawiera mniej niż cztery atomy węgla. Piki

charakterystyczne pochodzą od jonów powstałych na

skutek przegrupowania McLafferty’ego. Przegrupowanie

to może zachodzić z udziałem grup alkilowych takich jak

– acylowa oraz alkoksylowa, ale pod warunkiem, że grupy

te są zbudowane przynajmniej z trzech (w przypadku

pierwszej grupy) lub dwóch (w przypadku drugiej grupy)

atomów węgla.

Warto zauważyć, że charakterystyczny jon dla estrów

alkoholi, charakteryzujących się długimi łańcuchami,

powstaje na skutek przegrupowania dwóch atomów

wodoru – jest to tzw. przegrupowanie typu

„McLafferty’ego + 1”. Przykładowo w widmie mas

butanianu etylu przedstawionym na rysunku 1.12., obecne

są dwa charakterystyczne piki pochodzące od

nieparzystoelektronowych jonów o m/z 88 oraz m/z 60,

które powstały na skutek dwóch następujących po sobie




49

przegrupowań McLafferty’ego. Co więcej, odczepienie

grupy alkoksylowej powoduje intensywny pik o m/z 71

(M-OCH2CH3). Często w spektrometrii mas mówi się

o tzw. „diagnostycznym wskaźniku”, jakim jest pik

o m/z 71.

Rys. 1.11. Widmo mas dla kwasu masłowego.

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………...



50

Rys. 1.12. Widmo mas dla butanianu etylu.




51

1.2.6.6. Aminy

W przypadku amin alifatycznych pik jonu

molekularnego posiada małą intensywność, z kolei

w przypadku amin aromatycznych intensywność ta jest

wysoka. Charakterystyczne reakcje rozpadu są

analogiczne jak w przypadku alkoholi i eterów.

W przypadku amin I° podstawionych w pozycji α jest

preferowane odczepienie największej grupy alkilowej

– analogiczna sytuacja jest w przypadku amin II° oraz III°.

Niech jako przykład posłuży widmo mas dla dietyloaminy

przedstawione na rysunku 1.13.

1.2.6.7. Amidy

Jeśli chodzi o zachowanie amidów, to rozpad ich

przebiega podobnie jak ma to miejsce w przypadku

odpowiednich kwasów karboksylowych i estrów

metylowych. Dla wszystkich amidów charakterystyczne

jest tworzenie jonów o masie M+1 w reakcji między jonami

i cząsteczkami. Co więcej, w widmach amidów

I° występuje zwykle intensywny pik przy m/z 44. Co

więcej, podobnie jak w innych klasach związków

organicznych, obserwuje się przegrupowania

McLafferty’ego. Na rysunku 1.14 przedstawiono

przykładowe widmo mas dla acetamidu.



52

Rys. 1.13. Widmo mas dla dietyloaminy.



53

Rys. 1.14. Widmo mas dla acetamidu.




54

2

Spektroskopia

ramanowska

2.1. Wstęp

Widma ramanowskie dostarczają informacji

o kompozycji badanej próbki na poziome molekularnym.

Oznacza to, że pozwalają one na identyfikację wszystkich

składników próbki. Spektroskopia ramanowska może być

stosowana zarówno do oznaczeń jakościowych, jak

i ilościowych. W przypadku analizy ilościowej konieczne

jest jednak wykonanie odpowiedniej kalibracji. Co więcej,

możliwe jest określenie np. konformacji molekuł, długości

łańcucha, czy stopnia nienasycenia kwasów tłuszczowych.

W poniższym rozdziale przedstawione zostanie




55

podejście do interpretacji widm ramanowskich na

przykładzie odpowiednio dobranych związków

chemicznych z grupy lipidów, białek i węglowodanów,

a także na przykładzie widm pochodzących z bardziej

skomplikowanych układów biologicznych. Przy analizie

widm ramanowskich wyodrębnić można zazwyczaj dwa

interesujące zakresy: tzw. fingerprint (0 – 1800 cm-1) oraz

wysoki zakres (2800 – 3200 cm-1). Ze względu na brak

pasm w obszarze pomiędzy tymi dwoma zakresami (1800

– 2800 cm-1) region ten zazwyczaj nie jest przedstawiany

na widmach materiałów biologicznych.

2.2. Interpretacja widm ramanowskich - lipidy

Lipidy stanowią grupę związków doskonale nadających

się do badania techniką spektroskopii ramanowskiej, ze

względu na duży przekrój czynny molekuł na

rozpraszanie. Sygnały lipidowe charakteryzują się

zazwyczaj dobrą intensywnością. W przypadku mieszanin

lipidów, oprócz identyfikacji ich obecności w próbce,

możliwe jest również oznaczenie np. stopnia nienasycenia

komponentów lipidowych, czy rozgałęzienia łańcucha

lipidowego. Na rysunku 2.1 przedstawiono widmo

ramanowskie kwasu palmitynowego wraz z przypisanymi

najważniejszymi pasmami. W obszarze odcisku palca

wyraźnie widoczne jest kilka pasm. W zakresie pomiędzy

1000 a ok. 1200 cm-1 obserwujemy pasma związane

z drganiami rozciągającymi szkieletu C – C. Następnie,




56

widoczne są pasma związane z drganiami skręcającymi

grupy CH2 (δ(CH2), z ang. twisting) oraz drganiami

deformacyjnymi grup CH3 i CH2 (δ(CH3) i δ(CH2)).

W wysokim zakresie z kolei widoczne są pasma

związane z drganiami rozciągającymi wiązań C – H,

odpowiednio dla grup CH2 oraz CH3, przy czym pasma,

odpowiadające drganiom rozciągającym asymetrycznym,

pojawiają się przy niższej wartości liczby falowej niż

pasma odpowiadające drganiom rozciągającym

symetrycznym. W tabeli 2.1 zestawiono obserwowane

pasma dla widma ramanowskiego kwasu palmitynowego

wraz z ich odpowiednim przypisaniem.

Tabela 2.1. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla

widma kwasu palmitynowego (rys.2.1).

Położenie pasma [cm-1] Przypisanie

1068 ν (C – C)

1134 ν (C – C)

1300 τ (CH2)

1427 β (CH2)

1442 α (CH2 /CH3)

1467 β (CH2 /CH3)

2848 νs (=CH2)

2882 νas (=CH2)

2925 νs (=CH3)

2967 νas (=CH3)



57

Rys. 2.1. Widmo ramanowskie kwasu palmitynowego wraz z przypisaniem najważniejszych pasm.




58

Kwas palmitynowy stanowi przykład lipidu nasyconego.

W przypadku obecności wiązań wielokrotnych na widmie

ramanowskim pojawiają się dodatkowe pasma, związane

z ich drganiami. Przykład takiego widma przedstawiono na

rysunku 2.2. Przykładem wymienionych pasm,

pochodzących od drgań wiązań wielokrotnych, mogą być

m.in. pasma położone przy 1266, 1657 i 3012 cm-1. Ich

obecność pozwala na jednoznaczną identyfikację

nienasyconych lipidów. W tabeli 2.2 zestawiono

obserwowane pasma dla widma ramanowskiego kwasu

oleinowego wraz z ich odpowiednim przypisaniem.


widma kwasu oleinowego (rys.2.2). Pasma pochodzące od wiązań

wielokrotnych zaznaczono kolorem czerwonym.


1084 ν (C – C)

1266 δ(CH2)

1305 τ (CH2)

1444 α (CH2 /CH3)

1657 ν(C=C)

2852 νs (=CH2)

2892 νas (=CH2)

3012 ν(=CH)



59

Rys. 2.2. Widmo ramanowskie kwasu oleinowego wraz z przypisaniem najważniejszych pasm.




60

Fakt występowania pasm pochodzących wyłącznie od

drgań wiązań wielokrotnych pozwala nie tylko

zidentyfikować obecność takich związków w badanej

próbce, ale również zbadać ich stopień nienasycenia.

Stopień nienasycenia rozumiany może być jako stosunek

ilości wiązań wielokrotnych do ilości wiązań pojedynczych.

Intensywność każdego pasma, odpowiadającego danemu

drganiu danego wiązania, rozpatrywanego jako oscylator,

uzależniona jest od ilości tych wiązań. A zatem

intensywność pasm związanych z wiązaniami

wielokrotnymi będzie proporcjonalna do ich ilości.

Analogiczna sytuacja ma miejsce dla wiązań

pojedynczych. Zatem stosunek intensywności pasm

odpowiadający wiązaniom wielokrotnym do intensywności

pasm odpowiadających wiązaniom pojedynczym będzie

ściśle powiązany ze stopniem nienasycenia.

W spektroskopii ramanowskiej najczęściej wykorzystuje

się tzw. intensywność integralną pasma, tj. wartość całki

odpowiadającej polu powierzchni pod pasmem.

W spektroskopii ramanowskiej możemy wyodrębnić trzy

kryteria wyznaczania stopnia nienasycenia, przy czym pod

pojęciem kryterium rozumiany jest zestaw pasm

wykorzystywanych do oceny stopnia nienasycenia.

Pierwszym z nich są pasma położone przy ok. 1266

i 1305 cm-1, pochodzące odpowiednio od wiązań

nienasyconych i nasyconych. Kryterium to jest stosowane

powszechnie. Znaczącą trudnością z nim związaną jest

jednak słabe rozdzielenie wymienionych pasm. Powoduje

to konieczność arbitralnego i często niejednoznacznego




61

określenia granic całkowania.

Drugim, najpowszechniej wykorzystywanym kryterium,

jest stosunek intensywności pasm położonych przy 1657

i 1444 cm-1. W tym przypadku pasma są zdecydowanie

rozdzielone, a ich granice wyraźnie określone.

W przypadku skomplikowanych mieszanin, zawierających

również składniki białkowe, należy jednak mieć na uwadze

fakt, iż pasmo położone przy 1657 cm-1 może częściowo

pokrywać się z pasmem amidowym I.

Trzecim możliwym do wykorzystania kryterium jest

stosunek pasm położonych przy 3012 i 2852 cm-1.

Kryterium to jest jednak wykorzystywane stosunkowo

rzadko ze względu na jego słabą czułość. Pasmo

położone przy 3012 cm-1 (pochodzące od lipidów

nienasyconych) jest znacząco mniejsze od pasma

położonego przy 2852 cm-1. Tym samym, aby stosunek

intensywności wymienionych pasm uległ niewielkiej

zmianie konieczna jest istotna zmiana zawartości lipidów

nienasyconych.

Na rysunku 2.3 przedstawiono zestaw widm kwasów

tłuszczowych o wzrastającym stopniu nienasycenia. …………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………




62

Rys. 2.3. Zestaw widm ramanowskich kwasów tłuszczowych

o różnym stopniu nienasycenia.

***

Innym interesującym przykładem zastosowania

spektroskopii ramanowskiej do analizy lipidów jest ocena

obecności izomerów geometrycznych trans w badanej

próbce. Wykorzystywane jest do tego pasmo pochodzące

od drgań rozciągających wiązanie C=C. W przypadku

obecności izomeru cis pasmo to położone jest przy około

1656 cm-1, natomiast w przypadku konformeru trans ulega




63

przesunięciu do około 1675 cm-1. Na rysunku 2.4

przedstawiono tą zależność na przykładzie kwasu

oleinowego oraz jego izomeru geometrycznego – kwasu

elaidynowego.

Rys. 2.4. Widma ramanowskie kwasu oleinowego (wiązanie

podwójne w konformacji cis) oraz jego izomeru geometrycznego –

kwasu elaidynowego (wiązanie podwójne w konformacji trans)

z zaznaczonym charakterystycznym położeniem pasma od drgania

rozciągającego C=C dla obu konformerów.

***

Kolejnym interesującym zagadnieniem, możliwym do

obserwacji i oceny za pomocą spektroskopii ramanowskiej




64

jest długość (oraz rozgałęzienie) łańcuchów lipidowych.

Jak można było zaobserwować na zaprezentowanych

dotychczasowo widmach oraz w tabelach, ugrupowania

CH2 i CH3 są źródłem różnych pasm (choć często

położonych blisko siebie). Zarówno długość, jak

i rozgałęzienie łańcucha kwasów tłuszczowych (i innych

lipidów) przekładają się bezpośrednio na ilość ugrupowań

CH2 i CH3 w molekule. Poprzez ocenę stosunku

intensywności odpowiadających im pasm możliwe jest –

podobnie jak w przypadku stopnia nienasycenia –

określenie długości/rozgałęzienia łańcucha lipidowego.

Na rysunku 2.5 przedstawiono przykład dwóch

nasyconych kwasów tłuszczowych o różnej długości

łańcucha.

Rys. 2.5. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego i stearynowego.




65

Na rysunku 2.5 zaznaczono dwa obszary, w których

występują wyraźne różnice. Pierwszym z nich jest zakres

pomiędzy 1400 a 1500 cm-1. W przypadku obu kwasów

występują trzy pasma . W przypadku kwasu stearynowego

(wyższy stosunek ilości grup CH2 do grup CH3) pasmo od

drgań β grupy CH2 ulega jednak przesunięciu w kierunku

niższej wartości liczby falowej. Zmianie ulegają również

stosunki intensywności poszczególnych pasm (rysunek

2.6). .

Rys. 2.6. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego i stearynowego

w zakresach głównych różnic: 1400 – 1500 cm-1

(po lewej) oraz 2800

– 3050 cm-1

(po prawej).




66

Różnicę długości łańcucha (rozumianą jako różnicę

stosunku ilości grup CH2 do ilości grup CH3) można

wyraźniej zaobserwować w wysokim zakresie (2800 –

3050 cm-1), gdzie pasma od drgań ugrupowań CH2 i CH3

są lepiej rozdzielone. W przypadku obu kwasów

najintensywniejszym jest pasmo odpowiadające drganiu

rozciągającemu asymetrycznemu grupy CH2 (νas (=CH2),

ok. 2882 cm-1). Wyraźnie widoczne (choć mniej

intensywne) jest również pasmo pochodzące od drgań

rozciągających symetrycznych tej grupy (νs (=CH2), ok.

2848 cm-1). Różnicę w długości łańcucha możemy jednak

zaobserwować na podstawie pasm odpowiadających

drganiom ugrupowań CH3. Chociaż liczba tych grup w obu

cząsteczkach jest taka sama, to jednak stosunek ilości

grup CH3 do grup CH2 jest wyższy w kwasie

palmitynowym. W widmie kwasu palmitynowego wyraźnie

widoczne są zarówno drgania asymetryczne jak

i symetryczne grup CH3, podczas gdy w widmie kwasu

stearynowego intensywność pasma pochodzącego od

drgania symetrycznego CH3 jest już zbyt mała.

***

Do grupy lipidów, oprócz kwasu tłuszczowych,

zaliczamy szereg innych związków chemicznych, m.in.

trójglicerydy, cholesterol i jego estry oraz fosfolipidy.

Różnice w budowie chemicznej z oczywistych względów

znajdują swoje odzwierciedlenie w widmach

ramanowskich.




67

Trójglicerydy są to estry glicerolu oraz trzech kwasów

tłuszczowych. Z tego względu w ich widmie pojawiać się

będą nie tylko pasma od kwasów tłuszczowych

(nasyconych i/lub nienasyconych – w zależności od

trójglicerydu), ale również pasma m.in. od wiązania

estrowego. Na rysunku 2.7 przedstawiono widma

trójglicerydu nasyconego (tripalmitynian glicerolu) oraz

kwasu tłuszczowego, budującego dany trójgliceryd (kwas

palmitynowy) wraz z przypisaniem charakterystycznych

pasm.

Jak widać, widmo trójglicerydu różni się nieco od widma

budującego go kwasu tłuszczowego. Podstawową różnicą

jest obecność pasma pochodzącego od drgania

rozciągającego wiązanie estrowe (ν(C=O)), polożonego

przy ok. 1745 cm-1 (zaznaczonego na rysunku 2.7 kolorem

czerwonym). Pasmo to będzie obecne w widmach

ramanowskich wszystkich trójglicerydów, a także estrów.

Poza obecnością wymienionego pasma, na widmie

trójglicerydu zauważyć można szereg innych różnic.

Wysoki zakres charakteryzuje się wiekszą intesywnością

w stosunku do zakresu odcisku palca (600 – 1800 cm-1) w

porówananiu do widma kwasu tłuszczowego. Wynika to z

faktu, iż w wysokim zakresie obecne są pasma związane

z drganiami ugrupowań CH2 i CH3. Cząsteczka

trójglicerydu posiada w swojej strukturze aż trzy

cząsteczki kwasu tłuszczowego (stąd około trzykrotnie

większą liczbę ugrupowań CH2). Pasma powiązane

z ugrupowaniami CH2 (≈2850 cm-1 oraz 2885 cm-1) będą




68

zatem znacznie bardziej intensywne w widmie

trójglicerydu.

Rys. 2.7. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego (niebieskie)

oraz tripalmitynianu glicerolu (czarne) wraz z położeniem pasm.




69

Z drugiej strony jednak czasteczka trójglicerydu

posiada nieznacznie większą ilość ugrupowań CH3 niż

cząsteczka kwasu tłuszczowego. Wyraźna zmiana

stosunku ilości ugrupowań CH2 do ilości ugrupowań CH3

w przypadku trójglicerydu w porównaniu do kwasu

tłuszczowego powoduje, że dla trójglicerydu pasma

pochodzace od drgań ugrupowań CH3 są niewidoczne.

Pomimo opisanych różnic pomiędzy widmami kwasu

tłuszczowego oraz odpowiadającego mu trójglicerydu daje

się pomiędzy nimi zauważyć również pewne

podobieństwo. Obecność tych samymch pasm lipidowych

(z wyjątkiem pasma pochodzącego od drgania

rozciągającego C=O), ich zbliżone położenie oraz profil

spektralny widma pozwalają wnioskować, że w obrębie

obu tych związków występują podobne ugrupowania.

Opisane różnice miedzy widmem kwasu tłuszczowego

i pochodzącego od niego trójglicerydu są zdecydowanie

mniejsze niż różnice pomiędzy widmami ramanowskimi

dwóch trójglicerydów o różnym stopniu nienasycenia.

Widma takie przedstawiono na rysunku 2.8.

Podobnie jak w przypadku kwasów tłuszczowych,

również dla trójglicerydów możliwe jest określenie stopnia

nienasycenia. Jak widać na rysunku 2.8, obecność wiązań

wielokrotnych w łańcuchu kwasu tłuszczowego

trójglicerydu jest źródłem pasm pochodzących od drgań

rozciągających oraz deformacyjnych tego wiązania. Są to

pasma położone (analogicznie jak w widmie ramanowskim

kwasu tłuszczowego) przy ok. 1270, 1659 oraz 3008 cm-1




70

(zaznaczone na rysunku 2.8 kolorem niebieskim). W tabeli

2.3 zestawionio pasma obserowane na widmach

ramanowskich tripalmitynianu oraz trioleinianu glicerolu

wraz z ich przypisaniem.


widma trójglicerydów przedstawionych na rysunku 2.8.


875 ν (C – C)

1066 ν (C – C)

1084 ν (C – C)

1270 δ(CH2)

1302(6) τ (CH2)

1445 (7) α (CH2 /CH3)

1470 β (CH2 /CH3)

1659 ν(C=C)

1745(9) ν(C=O)

2850(3) νs (=CH2)

2884 νas (=CH2)

2905 νas (=CH2)

2932 νs (=CH3)

3008 ν(=CH)




71

Rys. 2.8. Widma dwóch trójglicerydów o różnym stopniu

nienasycenia: tripalmitynianu oraz trioleinianu glicerolu wraz

z położeniem pasm.




72

***

Kolejną interesującą grupą lipidów są cholesterole (tj.

cholesterol oraz jego estry). Związki te mają w swojej

strukturze pierścień, którego drgania są źródłem szeregu

specyficznych pasm. Na rysunku 2.9 przedstawiono

ramanowskie widmo cholesterolu oraz jego dwóch estrów

– palmitynianu oraz oleinianu.

Widmo ramanowskie cholesterolu jest bogate w pasma.

Niektóre z nich – jak np. pasmo położone przy 1442 cm-1

– nie są specyficzne wyłącznie dla cholesterolu, a raczej

dla całej grupy lipidów. Widoczne jest również pasmo

pochodzące od drgań wiązań podwójnych w pierścieniu

(około 1672 cm-1). Nie oznacza to jednak, że są to

wiązania w konformacji trans. Energia drgań wiązań

wielokrotnych w pierścieniu będzie jednak nieco inna niż

w przypadku wolnych kwasów tłuszczowych. Profil

spektralny widma – szczególnie w wysokim zakresie – jest

dla cholesterolu na tyle charakterystyczny, że pozwala go

jednoznacznie odróżnić od pozostałych lipidów.

Przykładem pasma pochodzącego od pierścienia

cholesterolu jest pasmo położone przy około 700 cm-1,

związane z drganiami deformacyjnymi pierścienia

cholesterolu.

Estry cholesterolu zbudowane są z pierścienia

cholesterolu oraz odpowiedniej reszty kwasu

tłuszczowego przyłączonej za pomocą wiązania

estrowego. Z tego względu w ich widmie ramanowskim –




73

podobnie jak w przypadku każdego estru – obserwować

będziemy pasmo położone przy około 1740 cm-1 (drganie

rozciągające wiązanie C=O). Widoczne będą również

pasma markerowe dla reszty kwasu tłuszczowego.

A zatem, np. w przypadku gdy jest to kwas tłuszczowy

nienasycony, obserwować będziemy pasma pochodzące

od drgań wiązań wielokrotnych w łańcuchu (tj. m.in.

pasma przy około 1659 i 3009 cm-1). Ponieważ w obrębie

takiej molekuły występuje w dalszym ciągu pierścień

cholesterolowy na widmie występować będą również

pasma charakterystyczne dla niego – tj. przy ok. 700 cm-1

(drgania deformacyjne pierścienia) oraz 1668 cm-1

(drgania wiązań podwójnych w pierścieniu). Warto zwrócić

tutaj uwagę na przykład oleinianu cholesterolu, dla którego

w zakresie 1620 – 1700 cm-1 pojawiają się

w rzeczywistości dwa pasma (niezbyt wyraźnie

rozdzielone) – jedno, od drgania wiązania podwójnego

w łańcuchu kwasu tłuszczowego (ok. 1659 cm-1) oraz

drugie od drgań wiązań podwójnych pierścienia (ok.

1668 cm-1). …………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………




74

Rys. 2.9. Widma ramanowskie cholesterolu oraz jego dwóch estrów

– nasyconego (palmitynian) i nienasyconego (oleinian).




75

Podsumowanie:

Obecność lipidów w próbce na podstawie widma

ramanowskiego można zidentyfikować z łatwością m.in.

na podstawie pasm położonych przy 1300 i 1444 cm-1.

Obecność wiązania wielokrotnego w lipidach

potwierdzają pasma pochodzące od ich drgań położone

przy ~1266, 1656 oraz 3010 cm-1.

Stopień nienasycenia można wyznaczyć z widma

ramanowskiego korzystając ze stosunków intensywności

(integralnej) pasm pochodzących od wiązań wielokrotnych

i pojedynczych, korzystając z następujących kryteriów:

I1266/I1305

I1656/I1444

I3010/I2885

Obecność estrów (kwasów tłuszczowych, cholesterolu,

itd.) można potwierdzić na podstawie występowania

pasma od drgania rozciągającego wiązanie estrowe,

położonego przy ok. 1740 cm-1.

Obecność cholesterolu można potwierdzić na

podstawie jego profilu spektralnego (wysoki zakres, tj.

2800 – 3050 cm-1) oraz obecności pasm pochodzących od

drgań pierścienia cholesterolu (np. ok. 701 cm-1).

O obecności estrów cholesterolu świadczy natomiast

współwystępowanie pasma pochodzące od estrów (~1740

cm-1) oraz pasm pochodzących od pierścienia

cholesterolu (np. ~701 cm-1).




76

2.3. Interpretacja widm ramanowskich - białka

Kolejną grupą związków, których analizę można

przeprowadzić metodą spektroskopii ramanowskiej są

białka. W przypadku białek najbardziej charakterystyczne

pasma związane są z grupą CONH. W tabeli 2.4

zestawiono położenia pasm amidowych oraz ich

pochodzenie.

Dla identyfikacji konformacji białek szczególne

znaczenie ma położenie pasm amidowych I, II oraz III.

Położenia tych pasm zmieniają się znacznie, w zależności

od tego, czy dane białko występuje w formie α lub β.

Typowo, dla struktury α pasmo amidowe I położone jest

w zakresie pomiędzy 1655 a 1662 cm-1. Dla struktury β

natomiast pasmo amidowe I przesunięte jest w kierunku

wyższych wartości liczb falowych, tj. 1672 – 1674 cm-1.

Odwrotną zależność możemy zaobserwować dla pasma

amidowego III, występującego zazwyczaj w przedziale

1264 – 1274 cm-1 dla struktury α oraz w przedziale 1227 –

1242 cm-1 dla białek w konformacji β-kartki.

Z powyższych informacji wynika jasno, iż spektroskopia

ramanowska pozwala na identyfikację struktury

II-rzędowej białek. W niniejszym rozdziale przedstawione

zostaną przykłady widm białek o budowie wyłącznie

α-helisy, β-kartki oraz złożonych, zaliczanych do grup α/β

i α + β (posiadających fragmenty formujące zarówno

strukturę wyłącznie α-helisy jak i β-kartki, ulokowane

w sposób uporządkowany lub nieuporządkowany).




77

Tabela 2.4. Zestawienie zakresów występowania charakterystycznych

pasm amidowych oraz ich pochodzenia.

Pasmo Położenie

pasma (zakres) [cm-1]

Pochodzenie

Amidowe A ~ 3500 Drganie rozciągające N-H

Amidowe B ~ 3100 Drganie rozciągające N-H

Amidowe I 1600 – 1690 Drganie rozciągające C=O

Amidowe II 1480 – 1580 Drganie rozciągające C-N oraz drganie zginające N-H*

Amidowe III 1230 – 1300

Amidowe IV 625 – 770 Drganie zginające O-C-N

Amidowe V 640 – 800 Drganie zginające** N-H

Amidowe VI 540 – 600 Drganie zginające** C=O

Amidowe VII ~ 200 Drgania szkieletowe

* drgania sprzężone

** poza płaszczyznę (z ang. out – of – plane)

Na rysunku 2.10 przedstawiono widmo albuminy –

białka należącego do grupy α. Jest to klasyczny przykład

białek o konformacji α (zerowa zawartość struktury β).



78

Rys. 2.10. Widma ramanowskie albuminy (reprezentującej białka grupy α) z zaznaczonymi położeniami

pasm oraz pochodzeniem (dla wybranych).




79

Jak widać na widmie ramanowskim, zarówno położenie

pasma amidowego I (1657 cm-1), jak i pasma amidowego

III (1273 cm-1) potwierdzają strukturę albuminy jako

α- helisę. W przypadku analizy widm ramanowskich białek

należy również liczyć się z obecnością pasm

pochodzących od aminokwasów budujących owe białka.

Przykładem tego mogą być pasma położone przy

1009 cm-1 oraz przy 1321 i 1341 cm-1, pochodzące

odpowiednio od fenyloalaniny i tryptofanu. W tabeli 2.5

zestawiono przypisanie pasm widocznych na widmie

albuminy.

Tabela 2.5. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla

widma albuminy (α-helisa) przedstawionego na rysunku 2.10.

Położenie pasma [cm-1]

Przypisanie

1009 Fenyloalanina

1273 Amidowe III (ν(C-N) + δ(N-H))

1321 Tryptofan (δ(Ca – H)

1341 Tryptofan (δ(Ca – H)

1454 δ(C-H)

1657 Amidowe I (ν(C=O)

3060 ν(N-H)

Na rysunku 2.11 przedstawiono przykład białka –

elastyny – o strukturze β-kartki.


spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

Documents

Kamil Jurowski - WordPress.com€¦ · nowoczesne techniki chiralooptyczn e do badania struktury i równowagi konformacyjnej cząsteczek chiralnych o znaczeniu biologicznym. ... jedną