Univerzitet u NišuPrirodno–matematički fakultet

Odsek za hemiju (smer analitička hemija)

Seminarski radKarakterizacija enzimske aktivnosti

Kandidat Profesor Jovana Pavlović Dr Snežana Mitić

1. Enzimi

Enzimi (fermenti) su proteinski molekuli, katalizatori biološkog porekla. Njihova sinteza se vrši u živim ćelijama, a katalitičko delovanje mogu da ostvaruju kako u intracelularnim prostorima, tako i izvan ćelija pri pogodnim uslovima. Enzimi mogu biti prosti enzimi koji hidrolizom daju smešu slobodnih amino kiselina, i složeni enzimi koji se sastoje iz enzimskog, proteinskog (apoenzim) i neproteinskog dela (kofaktora). Kofaktor i enzimski deo su povezani preko nekovalentnih veza (vodonične veze, hidrofobne interakcije), a nekad i kovalentnim vezama. Kofaktor može biti neki metalni jon ili kompleksni organski molekul tzv. koenzim. Metalni joni mogu u enzimima imati dvojaku ulogu: mogu da služe kao „most“ preko koga se gradi koordinativni kompleks enzim-supstrat (ES) ili da sami predstavljaju katalitičku grupu (Koraćević et al., 2000). Naziv enzim potiče od grčke reči en zyme, što znači „u kvascu“, pošto su prvi biokatalizatori izdvojeni iz kvaščevih gljivica. Termin fermenti potiče od latinske reči fermentatio (vrenje) da bi se označile supstance koje izazivaju vrenje (anaerobno razlaganje) šećera. Oba naziva imaju isto značenje (Anonymus, 2010).

1.1. Osobine enzimaEnzimi su proteinski katalizatori koji povećavaju brzinu hemijske reakcije, a da se ne

troše tokom reakcije koju katalizuju.

1. Aktivna mesta Enzimski molekuli sadrže specijalni džep koji se naziva aktivno mesto. Aktivno

mesto grade aminokiselinski bočni lanci koji stvaraju trodimenzionalnu površinu enzima komplementarnu supstratu. Aktivno mesto enzima vezuje supstrat, formirajući pri tom kompleks enzim–supstrat.

2. Katalitička efikasnost Većina reakcija katalizovanih enzimom su visoko efikasne, a odvijaju se i od 10 3–108

puta brže nego nekatalizovane reakcije. Obično, svaki molekul enzima je sposoban da transformiše 100–1 000 molekula supstrata u produkt u jednoj sekundi. Broj molekula supstrata koji se konvertuje u produkat u sekundi jednim molekulom enzima naziva se broj izmena (na eng. turnover number).

3. Specifičnost Enzim su visoko specifični katalizatori, interaguju sa jednim ili manjim brojem

supstrata i katalizuju samo jednu vrstu hemijskih reakcija.

4. Kofaktori Neki enzimi vezuju neproteinske kofaktore koji su neophodni za njihovu enzimsku

(katalitičku) aktivnost. Najčešći kofaktori su metalni joni kao što su Zn2+ ili Fe2+, i organski molekuli koji se nazivaju koenzimi. Najčešći koenzimi su derivati vitamina. Na primer, koenzim NAD+ sadrži niacin, FAD sadrži riboflavin, a koenzim A pantotensku kiselinu. Enzim sa kofaktorom naziva se holoenzim. Apoenzim se odnosi na proteinski deo

holoenzima. U odsustvu odgovarajućeg kofaktora apoenzim ne pokazuje biološku aktivnost. Prostetična grupa je čvsto vezani koenzim koji ne disosuje sa enzima (na primer, biotin vezan za karboksilaze).

5. RegulacijaEnzimska aktivnost može se regulisati, tj. enzim može biti inhibiran ili aktiviran, tako

da brzina formiranja produkta odgovara potrebama ćelije.

6. Lokacija unutar ćelijeVećina enzima nalazi se u specifičnim organelama unutar ćelije. Ovakvo

pregrađivanje enzima omogućava izolovanje reakcionog supstrata ili produkta reakcije od kompetitivnih reakcija. Sama lokacija enzima obezbeđuje favorizovanu sredinu za odigravanje reakcije, kao i organizaciju hiljade enzima koji su prisutni u ćeliji u svrsishodne reakcione puteve.

1.2. Kako enzimi funkcionišu?Mehanizam enzimske aktivnosti može se posmatrati na dva različita načina. Prvi

razmatra katalizu u uslovima energetskih promena koje se dešavaju tokom reakcije, što znači da enzimi obezbeđuju alternativni, energetski favorizovani reakcioni put koji se razlikuje od reakcionog puta nekatalizovane reakcije. Drugi opisuje način na koji aktivna mesta hemijski olakšavaju katalizu.

A. Energetske promene tokom reakcije Sve hemijske reakcije imaju energetsku barijeru koja razdvaja reaktante i produkte.

Ta energetska barijera koja se naziva slobodna energija aktivacije, predstavlja energetsku razliku između reaktanata i visokoenergetskog intermedijera (TS‡) koji nastaje tokom formiranja produkata.

1. Slobodna energija aktivacijeSlobodna energija aktivacije predtavlja razliku slobodne energije između reaktanta i

TS‡, gde se intermedijer formira tokom konverzije reaktanta u produkte. Zbog visoke energije

aktivacije, brzine nekatalizovanih hemijskih reakcija su često male.

2. Brzina reakcije Molekuli koji reaguju moraju imati dovoljno energije da bi prešli energetsku barijeru

prelaznog stanja. U odsustvu enzima, samo mali deo od ukupnog broja molekula imaju dovoljno energije da dostignu prelazno stanje između reaktanta i produkata. Brzina reakcije je određena brojem takvih energetskih molekula. Uopšteno, što je niža slobodna energija aktivacije, više molekula će imati dovoljno energije da prođe kroz prelazno stanje, a samim tim reakcija je brža.

3. Alternativin reakcioni putEnzim omogućava reakciji da se brzo odvija pod uslovima koji preovladavaju u ćeliji,

tako što obezbeđuje alternativni reakcioni put sa nižom slobodnom energijom aktivacije.

Enzim ne menja slobodne energije reaktanata i produkata, pa samim tim ne menja ni ravnotežu reakcije.

B. Hemija aktivnog mesta Aktivno mesto nije pasivno „spremište“ za vezivanje supstrata, već kompleksna

molekulska „mašina“ koja koristi veliki broj različitih hemijskih mehanizama za olakšavanje konverzije supstrata u produkt. Veliki broj faktora je odgovoran za katalitičku efikasnost enzima, uključujući sledeće:

1. Stabilizacija prelaznog stanja Aktivno mesto se često ponaša kao fleksibilan molekulski umetak koji vezuje supstrat

u geometrijsku strukturu koja odgovara aktiviranom prelaznom stanju molekula. Stabilizacijom supstrata u prelaznom stanju, enzim znatno povećava koncentraciju reaktivnog intermedijera koji se može konvertovati u produkt, a samim tim ubrzava reakciju.

2. Drugi mehanizmiAktivno mesto obezbeđuje katalitičke grupe koje poboljšavaju mogućnost formranja

prealznog stanja. Kod nekih enzima ove grupe učestvuju u acido–baznoj katalizi, gde ostaci amino kiselina otpuštaju ili primaju protone. Kod drugih enzima, kataliza uključuje formiranje kovalentnog kompleksa enzim–supstrat.

2. Kinetika monosupstratnih enzimskih reakcija

Već smo rekli da su enzimi proteini sa katalitičkim osobinama. Kao katalizator enzim snižava energiju aktivacije reakcije (Ea), samim tim povećava brzinu reakcije bez uticaja na položaj ravnoteže. Iako su po ovim osobinama slični neorganskim katalizatorima, enzimi imaju određena svojstva po kojima se razlikuju od katalizatora iz nežive prirode:

1. mnogo su efikasniji od neorganskih katalizatora,2. pokazuju manje ili više izraženu specifičnost prema supstratu i prema vrsti hemijske

reakcije koju katalizuju,3. pošto su proteinske prirode, enzimi su podložni procesima denaturacije pod uticajem

soli teških metala, visoke temperature, jakih baza i kiselina. Iz ovih razloga enzimi deluju pri uslovima blagih temperatura i pH vrednosti, dok su za odvijanje nekatalizovanih hemijskih reakcija, ili za delovanje neorganskih katalizatora potrebne visoke temperature, povećan atmosferski pritisak, ili ekstremno jake baze ili kiseline,

4. mada se direktno ne troše u hemijskim reakcijama koje katalizuju, enzimi u ćelijama imaju ograničeno vreme trajanja, pa se vrše procesi razgradnje i ponovne sinteze njihovih molekula,

5. razlika između neorganskih katalizatora i enzima je direktno povezana sa njihovom strukturom. Nasuprot neorganskim katalizatorima, svaki tip enzimskog molekula, bez obzira na reakciju koju katalizuje, bez obzira na detalje svoje strukture, sadrži negde unutar svoje tercijarne konfiguracije karakteristični klaster amino kiselina koje formiraju aktivni centar. Molekuli reaktanti, nazvani supstratima, vezuju se za aktivni centar enzima, koji je obično mala šupljina (džep) na inače velikom proteinskom molekulu. Struktura supstrata je komplementara strukturi aktivnog centra, koji nije samo mesto vezivanja supstrata. Mnogi amino kiselinski bočni nizovi koji leže u

aktivnom centru učestvuju u katalitičkom procesu. U poređenju sa neorganskim katalizatorima, koji su vrlo nespecifični, enzimi se odlikuju visokim stepenom specifičnosti. Od 20 različitih amino kiselina koje čine proteine, samo nekoliko njih učestvuje u aktivnim centrima mnogih proteina koji su proučavani,

6. aktivnost enzima podleže kontrolnim mehanizmima, tj. regulaciji pod uticajem različitih faktora: alosterijskih efektora, koncentracije supstrata, kofaktora, aktivatora, inhibitora, kovalentne modifikacije itd. (Murzin & Salami, 2005).

Koncentracija enzima predstavlja broj molekula enzima u jedinici zapremine, ili na jedinicu mase. Koncetracija enzima u ćelijama i tkivima zavisi od njihove biosinteze i razgradnje.

Enzimska jedinica (1 e .u.=1 μ mol

min ) je najčešće upotrebljavana standardna jedinica enzimske aktivnosti. Definiše se kao količina enzima koja uzrokuje nestanak 1µmola supstrata ili nastanak 1µmola proizvoda u minuti.

Specifična aktivnost se definiše kao broj enzimskih jedinica po jedinici mase. Ova masa bi mogla da odgovara masi čistog ezima, količini proteina u određenom izolatu ili ukupnoj masi tkiva odakle je enzim izolovan.

Molekularna aktivnost ili broj izmena (turnover number) označava broj µmola supstrata koji se pod uticajem enzimskih molekula transformiše u produkt reakcije u jedinici vremena pri optimalnim uslovima. Visoki broj izmena govori o velikoj aktivnosti enzima. Enzimska aktivnost je adekvatna brzini katalizovane reakcije.

Na osnovu Linus Pauling-ovih razmatranja, Joseph Kraut ističe sledeće: „Enzim se može smatrati fleksibilnim molekularnim modelom, evolutivno dizajniranim tako da bude precizno komplementaran reaktantima u aktiviranoj geometriji njihovog prelaznog stanja, koja se razlikuje od geometrije osnovnog stanja. Zato enzim čvrsto vezuje prelazno stanje, jako povećavajući njegovu koncetraciju i proporcionalno ubrzavajući samu reakciju”. Stoga se ovaj opis enzimske katalize sada posmatra kao stabilizacija prelaznog stanja. Enzim povećava brzinu reakcije uglavnom tako što se specifično vezuje za kompleks prelaznog stanja S‡ i samim tim stabilizuje njegovu strukturu. Kako je brzina hemijske reakcije

proporcionalna koncetraciji kompleksa prelaznog stanja S‡, snižavanje aktivacione energije efektivno vodi povećanju brzine reakcije (Marangoni, 2003).

Slika 1. Promene unutrašnje energije sistema koji podleže hemijskoj reakciji konverzije supstrata S u produkt P. Ea odgovara energiji aktivacije za enzimski katalizovanu (Ea,e) i nekatalizovanu (Ea,u) reakciju.

Termodinamički ciklus koji spaja vezivanje supstrata sa prelaznim stanjem vezivanja prikazan je sledećim jednačinama:

Gornji reakcioni put predstavlja nekatalizovanu reakciju, dok je donji enzimski katalizovana reakcija. Za ovu šemu mogu da se napišu četiri konstante ravnoteže:

K s=[ E ] [ S ][ ES ] K t=

[ E ] [ S‡ ][ ES‡ ]

K e‡=

[ E S‡ ][ ES ]

Ku‡=

[ E ] [S‡ ][ E ] [ S ]

Odnos konstanti ravnoteže za prelaz supstrata iz osnovnog u prelazno stanje u prisustvu i odsustvu enzima je povezan sa odnosom disocijacionih konstanti za ES i ES‡ komplekse:

K e‡

Ku‡ =

[ E S‡ ] / [ ES ][ E ] [S‡ ] / [ E ] [ S ]

=[ E ] [ S ] / [ ES ]

[ E ] [ S‡ ] / [ E S ‡ ]=

K s

K t

Teorija apsolutnih brzina pretpostavlja da je konstanta brzine reakcije (k r) direktno

proporcionalna ravnotežnoj konstanti formiranja kompleksa u prelaznom stanju (K ‡ ¿, od reaktanata koji se nalaze u osnovnom stanju:

k r=kv K ‡

Relativne promene u reakcionim brzinama koje su posledice enzimske katalize date su odnosom konstanti brzina reakcija konverzije supstrata u produkt, u prisustvu (k e) i

odsustvu (k u) enzima:

ke

ku

=ke ve K e

‡

ku vu Ku‡ =

ke ve K s

ku vu K t

Veličine ubrzanja enzimskih reakcija ke

ku, mogu biti izuzetno velike u opsegu 1010–

1014. Pretpostavimo sada da se odnos k e ve

ku vu ne razlikuje znatno od jedinice, prethodna

jednačina se može napisati u sledećem obliku:

ke

ku

≈K s

K t

Odnos K s

K t mora takođe biti u opsegu 1010–1014. Ovaj važan rezultat sugeriše da

supstrat u prelaznom stanju mora obavezno da se veže mnogo jače za enzim, nego supstrat u osnovnom stanju. Takođe, ovaj izraz predstavlja sažeti okvir za razumevanje enzimskog delovanja. Može se postaviti pitanje koliko je enzim efikasan. Ako se k e poistoveti sa k cat dobija se izraz:

kcat

K s

=ku

ke ve

ku vu

1K t

Odnos k cat/ K s (M-1s-1) predstavlja konstantu brzine drugog reda za reakciju slobodnog enzima sa supstratom. Veličina ove konstante brzine ne može biti veća od difuzionih koeficijenata reaktanata. Prema tome savršeno razvijen enzim imaće povećanu snagu vezivanja u prelaznom stanju (vrednost za Kt smanjena), dok se ne dostigne difuzioni limit za termodinamički favorizovanu reakciju (Marangoni, 2003).

3. Karakterizacija enzimske aktivnosti

3.1. Kriva progresije i određivanje reakcionih brzina

U cilju određivanja reakcione brzine neophodno je stvoriti krivu progresije. Za konverziju supstrata S u produkt P, opšti oblik krive progesije (slika 2) je eksponencijalno opadajući prvog reda sa koncentracijom supstrata:

[ S−Smin ]=[S0−Smin ] e−kt

ili eksponencijalno rastući prvog reda sa koncentracijom produkta:

[ P−P0 ]=[ Pmax−P0 ](1−e−kt)

gde [ S0 ], [ Smin ] i [ S ] odgovaraju početnoj koncentraciji supstrata (t=0), minimalnoj

koncentraciji supstrata ( t⟶∞ ¿ i koncentraciji supstarta u vremenu t, dok [ P0 ],[ Pmax ] i [ P ] odgovaraju početnoj koncentraciji produkta (t=0), maksimalnoj koncentraciji produkta (t⟶∞ ¿ i koncentraciji produkta u vremenu t.

Brzina reakcije (reakciona brzina) (v), odgovara trenutnom nagibu bilo koje krive progresije:

v=−d [S ]

dt=

d [P]dt

=k [S0 ] e−kt

Slika 2. Promena koncentracije supstrata (S) i proizvoda (P) u funkciji od vremena, od početnih vrednosti (S0 i P0) do konačnih vrednosti (Pmax i Smin)

Kao što se da videti sa slike 2 reakciona brzina opada sa vremenom. Razlog tome mogu biti:

1. nestabilnost enzima tokom proticanja reakcije

2. stepen zasićenja enzima supstratom opada sa smanjenjem količine supstrata3. reverzibilne reakcije postaju predominantne sa akumuliranjem produkta4. produkt reakcije inhibira enzim5. bilo koja kombinacija prethodno navedenih faktora dovodi do pada brzine

Progresivne krive enzimski–katalizovanih reakcija ne odgovaraju standardnim modelima krivih homogenih hemijskih reakcija i samim tim zahtevaju drugačiji pristup. Enzimolozi koriste inicijalne brzine kao meru reakcionih brzina. Tokom ranih faza enzimski–katalizovanih reakcija, konverzija supstrata u proizvod je mala i zato se može smatrati konstantnom i efektivno jednakom inicijalnoj koncentraciji supstrata [S t]≈[ S0], a sa druge

strane koncentracija nastalog proizvoda u tom početnom periodu je vrlo mala, [P t]≈ 0, tako da se povratna reakcija može smatrati zanemarljivom. Što je još važnije, može se smatrati da enzim ostaje stabilan tokom ranih faza reakcije. Da bi se dobile inicijalne brzine, tangenta progresivne krive se povlači što je moguće bliže njenom početku. Progresivne krive su obično linearne ispod 20 % konverzije supstrata u produkt (slika 2). U literaturi se spominje da se deo konverzije supstrata u produkt može opisati linearnom funkcijom do 10% od početka reakcije. Ali isto tako se navodi da se taj inicijalni period, u kome enzimski–katalizovana reakcija pokazuje linearnu kinetiku, može produžiti promenom uslova sredine u kojoj se ta reakcija dešava. Drugim rečima, progresivne krive će varirati u zavisnosti od pH sredine, temperature, jonske sile, polarnosti, tipa supstrata, koncentracije enzima i koenzima i mnogih drugih faktora (Marangoni, 2003).

Slika 2. Određivanje inicijalne brzine enzimski–katalizovanih reakcija iz nagiba na t=0, u slučaju smanjeja koncentracije supstrata ili porasta koncentracije produkta.

Vrlo često istraživači se koriste merenjem jedne tačke da bi odredili reakcione brzine. Merenje jedne tačke može da ne bude validno za sve proučavane reakcione uslove i tretmane. Dakle, veoma je važno u kom delu reakcije se vrši proučavanje. Za pravilnu enzimsku kinetičku analizu bitno je dobiti reakcione brzine isključivo iz inicijalne oblasti progresivne krive. Korišćenje pogrešnog vremena za dobijanje brzine neće dati linearnu zavisnost između brzine i enzimske

koncentracije, što je osnova za enzimsko kinetičku analizu. Da bi reakcija bila kinetički kontrolisana enzimom, reakciona brzina mora biti direktno proporcionalna enzimskoj koncentraciji (slika 3).

Slika 3. Zavisnost reakcione inicijalne brzine od koncentracijie enzima u reakcionoj smeši

Ponekad oblik krive progresije nije kakav se očekuje, tj. eksponencijalno opadajući ili rastući prvog reda. U tom slučaju najbolje je odrediti uzrok takvog abnormalnog ponašanja i modifikovati uslove izvođenja analize u cilju eliminisanja abnormalnosti. Kontinualne i diskontinualne metode oje se koriste za praćenje odvijanja enzimskih reakcija nisu uvek pouzdane. Ovo je slučaj posebno kod reakcija koje se odvijaju u dva stadijuma, kod kojih dolazi do nagomilavanja intermedijera tokom konverzije supstrata u produkat. U tom slučaju nestajanje supstrata je znatno pouzdaniji indicator aktivnosti nego gomilanje produkta. Za diskontinualne metode potrebne su najmanje tri tačke, jedna na početku reakcije t0, druga u određenom vremenu t1 i treća u određenom vremenu t2 koje bi trebalo da bude t2=2t1. Ovo nam omogućava proveru linearnosti krive progresije (Marangoni, 2003).

3.2. Uitcaj koncentracije supstrata na brzinu reakcije

Iz jednačine za reakcionu brzinu bi se moglo zaključiti da je brzina reakcije pseudo–prvog reda i da linearno zavisi od početne koncentracije supstrata. Međutim, još ranija istraživanja pokazuju da inicijalna brzina zavisi od koncentracije supstrata na način koji to pokazuje slika 4. Slika 4. A pokazuje vremenski tok enzimski–katalizovane reakcije pri različitim početnim koncentracijama supstrata. Brzine za svaku koncentraciju supstrata se mere kao nagib prave koja je dobijena kao zavisnost [ P ] od vremena. Slika 4. B pokazuje grafik zavisnosti inicijalne brzine (prethodno dobijene na osnovu grafika 4. A) od koncnetracije supstrata (Copeland, 2000).

Sa grafika B možemo identifikovati tri različita regiona: zavisnost pri niskim koncentracijama supstrata je linearna i prvog je reda, dok pri velikim koncentracijama supstrata zavisnost tj. brzina pokazuje kinetiku nultog reda, tj. ne menja se sa promenom koncentracije supstrata. U srednjem delu krive, brzina pokazuje zakrivljenu zavisnost od koncentracije supstrata.

Slika 4. (A) Krive progresije za niz enzimski–katalizovanih reakcija sa različitim početnim koncentracijama supstrata [ S ]. (B) Grafik reakcionih brzina, merenih kao nagib linearnih

pravi sa grafika A, u funkciji od [ S ].

Objašnjenje ovakvog ponašanja dao je Brown 1902. U to vreme je i objašnjena kinetika enzimskih reakcija primenom šeme reakcije:

Brown je predvideo da će brzina reakcije biti proporcionalna koncentraciji nastalog

kompleksa ES, v=k2 [ ES ]. Ako bi se koncentracija enzima održavala konstantnom, a

koncentracija supstrata varirala, u početnom delu reakcije brzina bi bila direktno proporcionalna koncentraciji supstrata i pokazivala bi zavisnost prvog reda od koncentracije supstrata. Pri veoma visokim vrednostima koncentracije supstrata, sav enzim bi već bio u formi kompleksa ES, i brzina reakcije bi u tom delu zavisila, ne od koncetracije supstrata, već od brzine transformacije kompleksa ES u EP, tj. nastanka slobodnog enzima i dobijanja krajnjeg produkta. Dodavanje supstrata pri ovim uslovima i u ovom delu reakcije neće dovesti do promene brzine reakcije (Copeland, 2000).

3.3. Modeli katalize: ravnotežni i stacionarni model

Enzimska reakcija se posmatra kao dvostepeni proces: vezivanje supstrata S enzimom E i formiranje kompleksa enzim–supstrat, koje je praćeno ireverzibilnim raspadom ovog kompleksa na slobodan enzim i produkt P.

Teoriju o enzimskoj kinetici razradili su Henri i Michaelis i Menten, definišući odnos između brzine reakcije, koncentracije supstrata, maksimalne brzine i Km vrednosti. Kasnije su ovu metodu dopunili Brigss i Haldane hipotezom o stacionarnom stanju („steady-state“).

Model brze ravnoteže

Brown je dao jednu kvalitativnu sliku enzimske kinetike koja je morala da dobije matematički oblik. To je najpre uradio Henri, mada se kroz literaturu njegov rad i doprinos pripisuju Michaelisu i Mentenu, koji su samo nastavili njegov rad. U modelu ravnoteže Henri-ja, Michaelis-a i Menten-a, pretpostavlja sledeće: brza ravnoteža se uspostavlja između reaktanata (E+S) i kompleksa ES, i sam nastanak kompleksa ES je znatno brži u odnosu na sporiju konverziju ES na slobodni enzim i proizvod(e). Ovaj model pretpostavlja, koristeći

već navedenu reakcionu šemu Brown–a, da je k 2<< k−1 . Slobodni enzim (E f) se vezuje za supstrat i formira kompleks (ES). Uzimajući da je supstrat u velikom višku, pravi se pretpostavka da je koncentracija slobodnog supstrata [S ]f približna ukupnoj koncentraciji

supstrata ([S ]f [ S ]). Samim tim, pretpostavlja se da je reakcija vezivanja supstrata u ravnoteži.

Ravnotežna konstanta disocijacije za ES kompleks (K s) je mera afiniteta enzima prema

supstratu i odgovara koncentraciji supstrata na 12

V max (Marangoni, 2003).

K s=[ E ] f [ S ]

[ ES ]

Kako je koncentracija slobodnog enzima [ E ] f data razlikom ukupne koncentracije

enzima[ E ] i koncentracije binarnog kompleksa [ ES ],

[ E ] f =[ E ]−[ ES ]

izraz za konstantu disocijacije može se napisati:

K s=( [ E ]−[ ES ] ) [ S ]

[ ES ]

Preuređenjem ovog izraza dobijamo izraz za koncentraciju kompleksa:

[ ES ]= [ E ] [ S ]K s+[ S ]

Nakon nastajanja kompleksa, raznim hemijskim koracima dolazi do njegove transformacije, nastaje produkt reakcije i regeneriše se slobodni enzim. U najprostijem slučaju jedan hemijski korak, definisan konstantom brzine prvog reda k 2 rezultuje formiranjem produkta. Ipak, verovatnije je da će doći do niza brzih hemijskih koraka koji će voditi nastajanju kompleksa [ ES ]. Zbog jednostavnosti, svi ovi hemijski procesi opisuju se

jednom konstantom prvog reda k cat. Odatle sledi:

E+S K s

⇔

ES k cat→

E+P

a brzina formiranja produkta data je jednačinom prvog reda:

v=k cat [ ES ]

Kombinacijom jednačina za koncentraciju kompleksa i brzinu formiranja produkta dobijamo sledeći izraz:

v=kcat [ E ] [ S ]

K s+ [ S ]

Ova jednačina opisuje reakcionu brzinu kao hiperboličnu funkciju od [ S ], sa

maksimalnom vrednošću k cat [ E ]u na određenoj vrednosti [ S ]. Tu reakcionu brzinu

označavamo kao maksimalnu reakcionu brzinu V max.

V max=k cat [ E ]

v=V max [ S ]K s+[ S ]

=V max

1+K s

[ S ]

Ovo su konačne jednačine izvedene nezavisno od strane Henri-ja i Michaelis-a i Menten-a u cilju opisivanja enzimskih kinetičkih podataka (Marangoni, 2003).

Pretpostavke Henri i Michaelis-Menten-ovog modela su:1. korak vezivanja supstrata i formiranje ES kompleksa je brz u odnosu na brzinu

razlaganja. Ovo vodi aproksimaciji da je reakcija vezivanja supstrata u ravnoteži.2. koncentracija supstrata ostaje konstantna tokom celog vremena odigravanja reakcije

[S ]≈[Su] .Ovo je delom zahvaljujući činjenici da se koriste inicijalne brzine tako da je [S ]≫¿ [ E ].

3. konverzija produkta natrag u supstrat je zanemarljiva, jer je veoma malo produkta imalo vremena da se akumulira tokom odigravanja reakcije.

Dugo je poznato da se brzina enzimski-katalizovane reakcije povećava sa povećanjem koncentracije supstrata, ali tako da svaki dodati inkrement supstrata rezultuje manjim povećanjem reakcione brzine. Preciznije, veza između inicijalne brzine reakcije i koncentracije supstrata [S ] ima izgled hiperbole, što se može eksperimentalno pokazati (slika 4). Važna osobina ovog hiperboličkog odnosa je da kako [S ] teži beskonačnosti brzina teži gornjoj graničnoj vrednosti (asimptotski joj se približava), koja zavisi od broja enzimskih molekula i može se povećati jedino dodatkom enzima (Marangoni, 2003).

Model stacionarnog stanja

Originalne postavke Henri-ja i Michaelis-a i Menten-a zavise od brzog postizanja stanja ravnoteže enzimskih reakcija. Ovaj prilaz je prilično koristan kod brzih kinetičkih merenja, kao što su rekacije sa samo jednom izmenom (single–turnover). Međutim najveći broj ekperimentalnih merenja enzimskih reakcija, dešava se kada je kompleks enzim–supstrat prisutan u konstantnoj koncentraciji, tj. koncentraciji u stacionarnom stanju. Briggs i Halden (1925) su zaključili da je ravnotežno–vezujući pristup Henri–a i Michael–Menten–a mogao da se opiše opštijim pristupom tj. modelom stacionarnog stanja, koji ne zahteva k 2≪k−1

(Marangoni, 2003). Stacionarno stanje se odnosi na period enzimske reakcije tokom kojeg brzina

formiranja ES kompleksa tačno odgovara brzini raspada na slobodni enzim i proizvod. Ova kinetička faza se može postići kad je koncentracija molekula supstrata u velikom višku u odnosu na koncentraciju slobodnog enzima [ E]f . Da bi se postiglo stacionarno stanje, moraju

se zadovoljiti određeni uslovi koji omogućavaju da se naprave pretpostavke koje dosta uprošćavaju matematički oblik kinetike enzima. Pretpostavke su sledeće:

1. tokom inicijalne faze reakcione progresione krive ne gradi se ni jedan drugi intermedijer u značajnoj količini osim ES kompleksa. Svi enzimski molekuli biće u obliku ili slobodnog enzima ili ES kompleksa. Stoga je ukupna koncentracija enzima jednaka:

[ E ]= [ E ] f + [ ES ]

2. kao i u ravnotežnom modelu (model brze ravnoteže), pretpostavlja se da enzim deluje katalitički i da je samim tim prisutan u veoma maloj koncentraciji u odnosu na supstrat [S ]≫ [ E ]. Sledi da koncentracija nagrađenog kompleksa ES ne smanjuje zanačajno koncentraciju slobodnog supstrata, i može se pretpostaviti da je [S ]≈[S ]f , gde je [S ] ukupna koncentracija supstrata, a[S ]f koncentracija slobodnog supstrata (Copeland, 2000).

Tokom inicijalne faze reakcione krive, veoma malo proizvoda nastaje u poređenju sa ukupnom koncentracijom supstrata, tj. [P ]≈ 0 i samim tim je iskorišćena (utrošena) [S ] vrlo mala. U početnom delu reakcione krive brzo formiranjeESkompleksa biće praćeno kinetičkom fazom u kojoj će brzina formiranja novog ES biti uravnotežena brzinom razgradnje na E i P. Drugim rečima, tokom ove faze koncentracija ES je konstantna (Copeland, 2000). Ovo je i glavna pretpostavka u aproksimaciji stacionarnog stanja, koja se može prikazati na sledeći način:

d [ ES ]dt

=0

Ubrzo, pošto se enzim i supstrat pomešaju, sledi brza pre–stacionarna faza građenja kompleksa ES, posle koje sledi dugačak period u kom se koncentracija ES ne menja (stacionarna faza), i nakon toga faza posle stacionarnog stanja koja se karakteriše naglim padom početne koncentracije supstrata. Ranije smo rekli da se brzina enzimske reakcije (progresiona krova pseudo prvog reda) opisuje izrazom:

v=k2 [ ES ]

Sada [ ES] zavisi od brzine formiranja kompleksa koja se odigrava sa konstantom k 1 i

brzine disocijacije kompleksa koja se odigrava sa konstantama k−1i k 2. Jednačine za brzinu ova dva procesa su:

d [ ES ]dt

=k1 [ E ] [ S ]

−d [ ES ]dt

=(k−1+k2) [ ES ]

Dakle, diferencijalna jednačina koja opisuje promene u koncentaciji ES kompleksa u vremenu t=0 glasi:

d [ ES ]dt

=k1 [ E ]f [ S ]f −k−1 [ ES ]−k2 [ ES ]=0

Brzine u stanju ravnoteže moraju da budu jednake:

k 1 [ E ] f [ S ]f =(k−1+k2) [ ES ]

[ ES ]= [ E ]f [ S ]fk−1+k2

k1

=[ E ] f [ S ]f

Km

Km=[ E ] [ S ]

[ ES ]=

k−1+k2

k1

Konstanta Km biće jednaka konstanti disocijacije kompleksa K s samo u slučaju kada

je k−1≫k2, pa prema tome Km=k−1/k−1. Michaelis–ova konstantaKm odgovara koncentraciji

supstrata na 12

V max.

Kako je stepen nestajanja supstrata tokom stacionarne faze neznatan, može se [ S ] f zameniti ukupnom koncentracijom supstrata [ S ], koja se inače mnogo lakše eksperimentalno

meri. Pomoću jednačine [ E ]= [ E ] f + [ ES ], možemo [ E ] f pisati kao [ E ]−[ES ] . Odavde sledi,

nakon svih zamena i sređivanja:

[ ES ]=[ E ] [ S ][ S ]+Km

Kombinacijom ove jednačine sa izrazom za brzinu dobijamo:

v=k2 [ E ] [ S ][ S ]+ Km

ili

v=k cat [ E ] [ S ][ S ]+K m

Kako koncentracija supstrata teži beskonačnosti, brzina dostiže maksimalnu vrednost koja je definisana kao V max. Pod ovim uslovima Km ima veoma mali doprinos u gornjoj jednačini. Sledi:

limS → ∞

[ S ][ S ]+ Km

≅[ S ][ S ]

=1

i dolazimo do jednačine V max=k cat [ E ]. Kombinacijom jednačina dolazimo do konačnog

izraza za brzinu reakcije:

v=V max [ S ]K m+ [ S ]

=V max

1+K m

[ S ]Ovo je centralni izraz za stacionarno stanje enzimske kinetike. Iako se razlikuje od

izraza koji su dali Henri i Michaelis i Menten, obično se koristi i naziva Henri-Michaelis-Menten ili češće samo Michaelis-Menten-ova jednačina. Ovaj izraz predstavlja hiperboličku zavisnost υ od [S ] (slika 5) (Marangoni, 2003).

Slika 5. Grafički prikaz Michaelis–Menten –ove jednačine

3.4. Grafik brzine u funkciji od [ S ] i značaj konstanti Km i k cat

Kriva koja se dobija crtanjem grafika zavisnosti brzine od koncentracije supstrata ima hiperboličnu zavisnost (slika 6).

Slika 6. Grafik inicijalne brzine u funkciji od koncentracije supstrata za enzimski–katalizovanu reakciju.

Pri niskim koncentracijama supstrata brzina reakcije proporcionalna je koncentraciji supstrata. U ovoj oblasti reakcija je prvog reda u odnosu na koncentraciju supstrata. Pri velikim koncentracijama supstrata zavisnost tj. brzina pokazuje kinetiku nultog reda, tj. ne menja se sa promenom koncentracije supstrata. Ako pogledamo prethodno opisane jednačine za reakcionu brzinu videćemo da ako znamo koncentraciju enzima koja je eksperimentalno korišćena, možemo direktno odrediti vrednost konstante k cat. Vrednost ove konstante ponekad se odnosi i na molekularnu aktivnost (turnover number) enzima, pošto ona definiše broj katalitičkih izmena koje se dese u jedinici vremena. U laboratoriji se broj izmena može odrediti kao k cat, merenjem reakcione brzine u uslovima kada je [S ]≫Km, a v→ V max. Međutim brzina enzimskih izmena je sasvim drugačiji u fiziološkim uslovima in vivo, nego u

laboratoriji. Zato za slučaj kada je [ S ]≪ Km jednačina za brzinu dobija sledeći oblik:

v=kcat

Km

[ E ] [ S ]f

kcat

Km

=kcat k 1

k−1+kcat

Prema tome u laboratorijskim uslovima kada je [S ]≫Km, formiranje kompleksa ES je

brzo i to nije korak koji limitira brzinu. Međutim in vivo, [ S ]≪ Km brzina reakcije može biti

limitirana difuzionom brzinom sudara slobodnog enzima sa supstratom, koja je definisana konstantom k 1. Vrednost ove konstante obično se kreće u opsegu 108–109 (M−1 s−1¿. Značaj

konstante k cat je u tome da ona definiše maksimalnu brzinu na kojoj je moguće odigravanje enzimske reakcije, pri konstantnoj koncentraciji enzima i beskonačnoj koncentraciji supstrata.

Katalitička efikasnost enzima se najbolje definiše odnosom kinetičkih konstanti k cat/ Km (M−1 s−1¿. Ovaj odnos ima jedinicu konstante brzine reakcije drugog reda, i

generalno se koristi za upoređenje efikasnosti različitih enzima. Vrednost odnosa k cat / Km se koristi za poređenje iskorišćavanja različitih supstrata od strane određenog enzima. Međutim kada se porede različiti supstrati za određeni enzim, najveće razlike se javljaju u vrednosti k cat

a ne Km. Razlog otme je što specifičnost prema supstratu obično rezultuje zbog razlika u

prelaznom stanju, a ne vezujućih interakcija u osnovnom stanju. Prema tome odnos k cat/ Km sakuplja u sebi efekat različitih supstrata na obe kinetičke konstante i omogućava manji limita za konstantu produktivnog vezivanja supstrata (vezivanje supstrata koje vodi formiranju ES‡ kompleksa). Odnos k cat / Km se takođe koristi za poređenje efikasnosti sa kojom enzim katalizuje određenu reakciju u direktnom i reversnom pravcu. Enzimske reakcije su u principu reverzibilne, mada je za mnoge enzime reversni pravac termodinamički nepovoljan. Prisustvo enzima u rastvoru ne menja konstantu ravnoteže između koncentracije slobodnog supstrata i slobodnog proizvoda. Kako je konstanata ravnoteže konstantna za specifične uslove u rastvoru, ona će ograničavati vrednosti odnosa k cat / Km koje mogu biti postignute u oba pravca.

Vrednost odnosa k cat / Km ograničavaju neki fizički faktori. Najveći uticaj na vrednost

ovog odnosa određen je vrednošću konstante k 1 (brzinom formiranja kompleksaES). Ovaj korak kontrolisan je isključivo brzinom difuzije supstrata do aktivnih mesta enzima. Brzina difuzije je povezana sa viskoznošću rastvarača. Ovo ograničava vrednost konstante k 1 na

108–109 (M−1 s−1¿. Odnos k cat/ Km za većinu enzima nalazi se u ovom opsegu. Sve ovo ukazuje na činjenicu da katalitička aktivnost većine enzima zavisi od brzine difuzije supstrata ka aktivnim mestima. Međutim, specijalno prostorno uređenje enzima može dovesti do uklanjanja ovih ograničenja maksimalne brzine do kojih dolazi usled difuzije. Na primer, proizvod jedne enzimske reakcije može se usmetiri do aktivnog mesta drugog enzima, gde će doči do dalje konverzije. Pri većim koncentracijama supstrata brzina reakcije ostaje praktično konstantna i veoma neosetljiva na promene koncentracije supstrata. U ovoj oblasto enzimaska

reakcija je nultog reda u odnosu na koncentraciju supstrata. U slučaju kada je [ S ]≫ Km,

reakcija za brzinu postaje:

v=k cat [Eu ]=V max

Vrednost kostante Kmznatno varira od jednog enzima do drugog, ali i za određeni

enzim u zavisnosti od supstrata na koji deluje. Generalno kreće u oblasti od 10 -1–10-7 M. Km se definiše kao koncentracija supstrata pri kojoj enzimska reakcija dostiže polovinu svoje maksimalne brzine. Drugim rečima, Km predstavlja koncentraciju supstrata pri kojoj je polovina aktivnih mesta enzima popunjena (zasićena) molekulima supstrata u stacionarnom stanju ravnoteže. Vrednost konstanteKm zavisi od vrste supstrata i uslova sredine kao što su

pH, temperatura, jonska jačina i polarnost. Konstante Km i K s odgovaraju koncentraciji supstrata na polovini maksimalne brzine. Ako sada u jednačini

v=V max [ S ]K m+ [ S ]

vrednost [ S ] izrazimo kao [ S ]=12

Km dobićemo izraz:

Km=k−1

k1

=K s

Važno je reći da je Km=K s samo kada se razgradnja kompleksa ES odigrava znatno

sporije nego vezivanje supstrata za enzim (k−1≫k2 ¿. Pri ovim uslovimaKm predstavlja jačinu kompleksa ES ili meru afiniteta vezivanja supstrata za enzim (Marangoni, 2003).

3.5. Određivanje kinetičkih konstanti Km i V max

Određivanje enzimskih katalitičkih parametara iz progresione krive

Brzina enzimski katalizovane reakcije može se odrediti kao smanjenja koncentracije supstrata ili povećanja koncentracije produkta u funkciji od vremena. U uslovima smanjenja koncentracije supstrata Michaelis–Menten–ov izraz za brzinu dobija oblik:

−d [ S ]dt

=V max [ S ]

K s+ [ S ]Sređivanjem izraza i integracijom za granične uslove [ S ]=[ S0 ] u vremenu t=0 i

[ S ]=[ St ] u vremenu t dobijamo:

−Km∫S 0

St d [ S ][ S ]

−∫S 0

St

d [ S ]=V max ∫t=0

t

dt

Km ln[S0 ][S t ]

+[ S0−S t ]=V max t

Kako izraz ne predstavlja eksplicitnu funkciju, da bi mogao da se koristi za određivanje kinetičkih podataka potrebno ga je prevesti u implicitan oblik, deljenjem obe strane sa t i Km.

1t

ln[S0 ][ S t ]

=[ S0−S t ]

K mt+

V max

Km

Slika 7. Linearna kriva korišćena za određivanje kinetičkih parametara linearizacijom progresione krive

Lineweaver-Burk-ova kriva za enzimsku kinetiku

Pored postojanja velikog broja kompjuterskih programa za dobijanje linearnih krivi, tradicionalne metode kao što je Michaelis-Menteno-ova i Lineweaver-Burk-ova metoda su još uvek vrlo značajne za crtanje linearnih grafika na osnovu enzmskih kinetičkih podataka. Ovi grafici su veoma značajni za dobijanje mehanizama multisupstratnih enzima i za određivanje načina interakcije između enzima i inhibitora. Prvi i najdirektniji način grafičkog prikazivanja podataka je kriva zavisnosti brzine od koncentracije supstrata [S ] - Michaelis-Menten-ova kriva. Prava provučena kroz tačke, dobijene prema Michaelis-Menten-ovoj jednačini za stacionarno stanje je dobijena metodom najmanjeg kvadratnog odstupanja. Najčešće korišćena metoda za linearizaciju podataka enzimske kinetike je metoda Lineweaver-a i Burk-a. Polazi se od pretpostavke postojanja stacionarnog stanja (Copeland, 2000).

v=V max

1+Km

[ S ]Transformacijom u recipročni oblik dobija se izraz:

1v=

Km

V max [ S ]+ 1

V max

Ova jednačina predstavlja jednačinu prave y=ax+b, gde je y=1v

; nagib a=Km

V max, a

odsečak b= 1V max

, što se može videti na slici 8.

Slika 8. Lineweaver-Burk-ova dvostruko-recipročna kriva

Kinetičke konstante Km i V max mogu se odrediti iz vrednosti nagiba i odsečka linearne Lineweaver-Burk- ove zavisnosti. Kako x osa odgovara recipročnoj koncentraciji supstrata, vrednost x=0, tj. 1/ [S]=0, odgovara vrednosti [S ]=∞; ekstrapolisana vrednost odsečka na y−osi odgovara recipročnoj vrednosti V max.

Vrednost Km može biti određena iz Lineweaver-Burk- ove krive na dva načina. Već je navedeno da je

nagib krive a=Km

V max. Ako bi se

nagib krive, koja pokazuje najbolju linearnost, podelio vrednošću odsečka na y−osi (dakle sa

b= 1V max

) dobila bi se vrednost za Km. Alternativno, mogla bi da se ekstrapoliše prava do

tačke u kojoj seče x−osu. Dobijeni odsečak na x−osi jednak je −1Km

, odatle bi mogla da se

odredi vrednost Km iz apsolutne recipročne vrednosti x-odsečka dobijene krive. Pogodniji

način za određivanje Km i V max je linearizacijom netransformisanih podataka dobijenih iz Michaelis-Menten-ove jednačine (Copeland, 2000).

Ostale linearne transformacije enzimskih kinetičkih podataka

Eadie–Hofstee kriva

Prednost ove krive u odnosu na Lineweaver-Burk-ovu je ta što za nju nije potrebna produžena ekstrapolacija da bi se našla vrednost Km (Copeland, 2000). Polazeći od Michaelis–Mentenove jednačine dolazimo do sledećeg izraza:

v=V max−Km( v[ S ] )

Slika 9. Eadie–Hofstee kriva

Hanes–Woolf–ova kriva Množenjem obe strane Lineweaver-Burk-ove jednačine sa [ S ] dobija se izraz za Hanes–

Woolf–ovu krivu (Copeland, 2000):

[ S ]v

= [ S ]( 1V max )+

K m

V max

Slika 10. Hanes–Woolf–ova kriva

Eisenthal– Cornish-Bowden–ove direktne krive

Kod ove metode grafik zavisnosti brzine u funkciji od −[ S ] za parove

podataka v i [ S ]. Za svaki par se nakon toga povlači prava linija kroz tačku koja se dobija za par podataka. Ekstrapolacijom ovih pravih dobija se tačka preseka. Kada se povuče horizontalna linija od

tačke preseka do y ose dobija se V max. Vertikalna linija povučena od tačke preseka na x osu

daje nam Km (Copeland, 2000).

Slika 11. Eisenthal–Cornish- Bowden–ove direktne krive

4. Hemijski mehanizam enzimske katalize

Suštinska uloga enzima u skoro svim fiziološkim procesima potiče od dve glavne osobine enzimske katalize: (1) enzimi znatno ubrzavaju hemijske reakcije, (2) enzimi reaguju sa specifičnim molekulom (supstrat) i daju specifičan proizvod reakcije. U daljem tekstu razjasnićemo, specifičnost prema supstratu i ubrzanje reakcije, koji su rezultat precizne trodimenzionalne strukture mesta za vezivanje supstrata unutar enzimskog molekula, koje se naziva aktivno mesto. Enzimi su proteini, tako da hemijske reaktivne grupe koje reaguju sa supstratom nastaju uglavnom od neutralnih amino kiselina. Vrsta i uređenje ovih amino kiselina unutar aktivnog mesta enzima, određuje topologiju aktivnog mesta u odnosu na stereohemiju, hidrofobnost i elektrostatički karakter. Zajedno ove osobine određuju koji će se molekul vezati za aktivno mesto. Struktura aktivnog mesta, takva kakva jeste, razvija se tokom vezivanja molekula supstrata na takav način da dolazi do deformacije i narušavanja reda, što dovodi do konverzije supstrata u njegovu strukturu koju ima u prelaznom stanju. Prelazno stanje je znatno stabilizovano prilikom vezivanja za enzim. Kako postizanje strukture u prelaznom stanju predstavlja glavnu energetsku barijeru napretku hemijske reakcije, videćemo da stabilizacija prelaznog stanja enzimima rezultuje značajnim ubrzanjem reakcije (Copeland, 2000).

4.1. Komlementarnost supstrat–aktivno mesto

Prilikom vezivanja proteina i liganda u binarni kompleks, kompleks mora rezultovati ukupnom stabilizacijom sistema u odnosu na slobodan protein i ligand; u suprotnom vezivanje neće biti termodinamički favorizovano. Već znamo da su glavne sile zaslužne za stabilizaciju interakcija enzim–ligand vodonično vezivanje, hidrofobne sile, van der Walls–ove interakcije, elektrostatičke interakcije itd. Sve one doprinose ukupnoj energiji vezivanja kompleksa i moraju više nego da kompenzuju gubitak rotacione i translacione entropije koja prati formiranje binarnog kompleksa. Jasno je da je formiranje binarnog kompleksa enzim–supstrat prvi korak u katalitičkom procesu koji koriste enzimi. Formiranje inicijalnog kompleksa (enzim–supstrat ES ili Michaelis–ov kompleks) praćeno je raznim koracima koji vode do formiranja stabilnog enzim–prelazno stanje kompleksa E S‡, kompleksa enzim–produkt EP, i konačno do disocijacije kada dolazi do regeneracije slobodnog enzima i oslobađanja molekula produkta. Formiranje inicijalnog kompleksa ES definisano je konstantom disocijacije K s, koja predstavlja odnos konstanti brzine asocijacije (k as) i

disocijacije (k dis) kompleksa. Kao što je prethodno objašnjeno, radi jednostavnosti, brzine hemijskih koraka koje prate formiranje kompleksa ES, često se opisuju jednom kinetičkom konstantom k cat. Kao što ćemo kasnije videti ova konstanata je često ograničena brzinom

postizanja prelaznog stanja E S‡. Da bi smo razumeli povećanje brzine i specifičnost enzimskih reakcija, moramo razmotriti strukturu reaktivnih centara ovih molekula (aktivno mesto), i odnos aktivnog mesta prema stukturi molekula supstrata u njegovom osnovnom i prelaznom stanju, tokom formiranja binarnih kompleksa ES i E S‡. Iako je aktivno mesto svakog enzima jedinstveno, ipak se mogu naći neke sličnosti:

1. aktivno mesto enzima je malo u odnosu na ukupnu zapreminu enzima2. aktivno mesto je trodimenzionalno, amino kiseline i kofaktori u aktivnom mestu se

drže u tačno određenom uređenju u odnosu jedni na druge, i u odnosu na strukturu molekula supstrata. Trodimenzionalana struktura aktivnog mesta formira se kao rezultat tercijarne strukture proteina.

3. u većini slučajeva, početna interakcija između enzima i molekula supstrata je nekovalentna, koristi se vodoničnim vezama, elektrostatičkim, hidrofobnim interakcijama i drugim, da bi došlo do vezivanja.

4. aktivno mesto enzima obično se nalazi u tesnacima i udubljenjima proteina. Ovakav način organizacije aktivnog mesta utiče na izbacivanje glavnog dela rastvarača (voda), koji bi redukovao katalitičku aktivnost enzima. Drugim rečina, molekuli supstrata su desolvatisani tokom vezivanja i zaštićeni od rastvarača aktivnim mestima enzima.

5. specifičnost iskorišćavanja supstrata zavisi od dobro definisanog uređenja atoma u aktivnom mestu enzima, koje je na neki način komplement strukture molekula supstrata (Copeland, 2000).

Krajem devetnaestog i početkom dvadesetog veka izučavanjem stabilnosti enzima, inhibicije enzima i kinetike u stacionarnom stanju, došlo se do eksperimentalnih podataka o postojanju binarnog ES kompleksa. Daljim istraživanjem dobilo se još eksperimentalnih podataka i došlo se do opšteg principa da je specifičnost prema supstratu posledica selektivnog vezivanja molekula supstrata za aktivna mesta enzima. Selekcija tačno određenog

supstrata označava strukturnu komplementarnost između molekula supstrata i aktivnog mesta enzima. U kasnom devetnaestom veku ovi koncepti su formulisani kao “model kjuča i brave” (Copeland, 2000).

Po ovom modelu aktivno mesto enzima i molekul supstrata se posmatraju kao statične strukture koje su stereohemijski komplementarne. Ubacivanje supstrata u aktivno mesto statičnog enzima analogno je umetanju kjluča u bravu, ili delića slagalice u ostatak slagalice. Najbolje uklapanje dešava se sa supstratom koji je najbolji komplemnt strukture aktivnog mesta. Na taj način molekuli se čvršće vezuju. Komplementarnost aktivno mesto–supstrat rezultuje ne samo iz stereohemijskog uklapanja supstrata u aktivno mesto. Ove dve strukture moraju biti i elektrostatički komplementarne, omogućavajući na taj način da su suprotna naelektrisanja izbalansirana, i samim tim izbegavajući odbojne sile.

Enzimska kataliza je stereo–, regio– i enantio– selektivna. Prema tome prepoznavanje supstrata mora biti rezultat najmanje tri kontaktne tačke vezivanja između enzima i molekula supstrata. Koncept ključ i brava, kao i vezivanje preko tri tačke pomažu u objašnjavanju selektivnosti prema supstratu u enzimskoj katalizi. Međutim iz svega ovoga nije se mogao odrediti oblik molekula supstrata prema kojem aktivna mesta pokazuju strukturnu komplementarnost. Tokom godina istraživanja nađeno je da su se aktivna mesta enzima razvila u najbolji komplement strukture supstrata u prelaznom stanju, a ne u osnovnom. Na primer, dobro je poznato da su molekuli inhibitora takvi da oponašaju strukturu prelaznog stanja reakcije, i samim tim se čvršće vezuju za enzim nego supstrat ili molekul produkta (Copeland, 2000).

4.2. Povećanje brzine kroz stabilizaciju prelaznog stanja

Inicijalni sudar (obično kroz koliziju molekula u rastvoru) između enzima i supstrata vodi do reverzibilnog formiranja Michaelis–ovog kompleksa ES. Pod uobičajnim laboratorijskim uslovima ova ravnoteža potpomaže formiranje kompleksa, sa ΔG vezivanja oko -3 do -12 kcal/mol. Formiranje ES kompleksa vodi formiranju vezane vrste prelaznog stanja E S‡. Kao i kod nekatalizovane reakcije formiranje ove vrste predstavlja glavnu energetsku barijeru za formiranje produkta. Kada se ta energetska barijera jednom savlada, reakcija će se najverovatnije odvijati ka stvaranju produkta. U slučaju enzimski–katalizovanih reakcija, ovaj proces ukljčuje formiranje vezanog EP kompleksa i konačno disocijaciju istog u cilju oslobađanja slobodnog enzima i slobodnog produkta. Kako se enzimi pojavljuju na obe strane termodinamičke jednačine (i na strani produkata i reaktanata), ona je nepromenjena u odnosu na termodinamiku cele reakcije. Odavde sledi da će slobodna energija reakcije zavisiti samo od relativnih koncentracija S i P:

ΔG=−RTln( [ P ][ S ] )

Odavde vidimo da ΔG zavisi samo od početnog i krajnjeg stanja reakcije, a ne i od različitih intermedijernih stanja (ES, EP i E S‡) koja se formiraju tokom reakcije. Iz svega rečenog, možemo zaključiti da enzimi ne mogu da menjaju ravnotežu između produkata i

reaktanata. Enzimi kao i svi katalizatori, ubrzavaju postizanje ravnoteže u hemijskom sistemu i na taj način povećavaju brzinu hemijsku reakciju. Odgovor na pitanje kako enzimi povećavaju brzinu hemijske reakcije leži u objašnjenju aktivacione enrgije reakcije. Ključ enzimskog povećanja brzine, jeste sniženje energetske barijere stabilizacijom prelaznog stanja. Brzina potrošnje supstrata v, povezana je sa energijom aktivacije na sledeći način:

v=−d [ S ]

dt=( kB T

h ) [ S ] exp(−Ea

RT )Radi jednostavnosti fiksiraćemo reakcionu temperaturu na 25℃, a koncentraciju S na

jediničnu vrednost. Znamo da je na ovoj temperaturi RT=0,59 i kB T

h=6,2× 1012 s−1.

Pretpostavimo da je aktivaciona energija hemijske reakcije 10 kcal/mol. Brzina reakcije nakon izračunavanja biće:

v=2,7 ×105 jed ∙ s−1

Ako bi se aktivaciona energija redukovala na 5 kcal/mol brzina bi bila :

v=1,3 ×109 jed ∙ s−1

Odavde vidimo da snižavanjem energije za 5 kcal/mol postižemo povećanje reakcione brzine oko 5000 puta. Uopšteno, linearno smanjenje aktivacione energije rezultuje eksponencijalnim porastom reakcione brzine.

Ako sada pogledamo enzimski–katalizovanu reakciju, slobodnu energiju koja je povezana sa različitim stanjima odredićemo kombinacijom kinetičkih i ravnotežnih merenja. Ako sada slobodnu energiju slobodnih E i S na početku normalizujemo na 0, promenu slobodne energije koja nastaje kao posledica formiranja E S‡ izračunaćemo iz sledeće jednačine:

Ea=ΔGES‡=−RTln( kcat

K s)+RTln( k BT

h )Promena slobodne energije tokom formiranja kompleksa ES, u favorizovanom slučaju

može se odrediti merenjem K s ravnotežnim metodama ili kinetičkim merenjima:

ΔGES=−RTln ( 1K s

)Alternativno, iz merenja u stacionarnom stanju može se izračunati samo promena

slobodne energije koja je povezana sa k cat:

ΔG k cat=−RTln ( kcat )+RTln ( kB T

h )

Iz ovih jednačina vidimo da je ukupna aktivaciona energijaEa sastavljena od dva

člana ΔGES i ΔG k cat. Član ΔG k cat

predstavlja količinu energije koja se mora utoršiti da bi se

dostiglo prelazno stanje (u koracima stvaranja i kidanja veza), dok je član ΔG k cat ukupna

energija koja se dobija kao rezultat stvaranja enzim–supstrat kompleksa i njegove energije vezivanja.

Aktivaciona energija i za katalizovani i nekatalizovanu reakciju može se odrediti iz zavisnosti reakcione brzine od temperature prema Arenijusovoj jednačini:

k cat=Aexp(−Ea

RT )U odsustvu enzima, reakcija se odvija od supstrata do produkta prelaskom preko

znatno velike energetske barijere koja je potrebna da bi se dostiglo prelazno stanje S‡. U prisustvu enzima, sa druge strane, reakcija se odvija kroz stvaranje kompleksa ES. Kompleks ES predstavlja intermedijer tokom reakcionog puta. Energija vezivanja povezana sa formiranjem kompleksaES, delom se može koristiti za formiranje prelaznog stanja. Kada jednom dođe do vezivanja, molekulske sile u vezanom molekulu imaju simultani uticaj na destabilizaciju konfiguracije osnovnog stanja vezanog molekula supstrata i energetsku favorizaciju prelaznog stanja. Kompleks E S‡ nastaje na nižoj energiji negoS‡. Reakcija se zatim nastavlja kroz formiranje drugog intermedijernog stanja, enzim–produkt kompleksa EP, pre nego što dođe do oslobađanja produkta i slobodnog enzima (Copeland, 2000).

4.3. Hemijski mehanizmi za stabilizaciju prelaznog stanja

Stabilizacija prelaznog stanja posledica je strukture i reaktivnosti aktivnog mesta enzima. Enzimi se koriste brojnim hemijskim mehanizmima da bi postigli stabilizaciju prelaznog stanja i svi oni se mogu grupisati u pet glavnih kategorija:

1. međusobno približavanje (blizina) reaktanata2. kovalentna kataliza3. opšta kiselinsko–bazna kataliza4. konformaciona distorzija 5. preuređenje aktivnog mesta za komplementarnost sa prelaznim stanjem

4.3.1. Međusobno približavanje reaktanata

Najočigledniji faktor za povećanje brzine prostim vezivanjem supstrata za aktivno mesto enzima je to što ovo vezivanje, molekul supstrata i reaktivne grupe aktivnog mesta dovodi na najbliže moguće rastojanje. Razmotrimo sada bimolekulsku reakciju, koja uključuje dva supstrata A i B koji formiraju kovalentnu vrstu A−B. Da bi dva molekula u rastvoru mogla da reaguju oni moraju: (1) da se sudare i to kolizijom koja je limitiran difuzijom, pri tačno određenoj međusobonj orijentaciji za datu reakciju, (2) da podležu solvatacionim promenama koje omogućavaju molekulsko orbitalne interakcije, (3) prevaziđu

van der Waals–ove odbojne sile, i (4) da elektronske orbitale podležu promenama da bi se postigla konfiguracija prelaznog stanja.

U rastvoru, brzina reakcije određena je brzinom sudara između dva supstrata. Brzina kolizionog sudara u rastvoru može se povećati povećanjem temperature ili povećanjem koncentracije rekatanata. Kod enzimski–katalizovanih reakcija, vezivanje dva supstrata za aktivno mesto je preduslov za odigravanje reakcije. Kada je supstrat zarobljen unutar aktivnog mesta enzima, efektivna koncentracija je znatno povećana u odnosu na njegovu koncentraciju u rastvoru.

Drugi aspekt efekta blizine je taj da je struktura aktivnog mesta takva da vezuje supstrat u specifičnoj orjentaciji koja je optimalna za reakciju. Kod većine bimolekulskih reakcija, dva supstrata moraju da postignu specifično međusobono uređenje da bi došli do prelaznog stanja. Pored ovoga postoji i značajna entropijska prednost povezana sa blizinom reaktanata. Sa efektom blizine povezano je i orbitalno usmeravanja. Hipoteza o usmeravanju orbitala kaže da uređivanje reaktivnih grupa (jedna pored druge) oko supstrata i amino kiselinskih ostataka u aktivnom mestu nije dovoljno za katalizu. Pored ovog pozicioniranja, enzimi moraju tačno da usmere molekulske orbitale supstrata u odgovarajući položaj. Prema hipotezi usmeravanja orbitala, grupe u aktivnom mestu su se razvile na način koji optimizira usmeravanje orbitala na supstratu (Copeland, 2000).

4.3.2. Kovalentna kataliza

Postoji veliki broj primera enzimski–katalizovanih reakcija koje se odvijaju kroz formiranje kovalentnih intermedijera između enzima i molekula supstrata. Eksperimentalni podaci postojanja ovakvih intermedijera mogu se dobiti iz kinetičkih merenja, izolacijom i identifikacijom stabilnih kovalentnih adukata i skorije proučavanjem kristalne strukture intermedijernih vrsta rentgentskom kristalografijom. Pokazano je da nekoliko familija enzima formira kovalentne intermedijere, uključujući serin proteaze (acil–serin intermedijeri), cistein proteaze (acil–cistein proteaze), protein kinaze i fosfataze (fosfatno–aminokiselinski intermedijeri), i enzimi koji kao kofaktor koriste piridoksal–fosfat (piridoksal–aminokiselinske Šifove baze). Za ovakve enzime forniranje kovalentnih intermedijera je neophodan korak u katalizi. Na ovaj način se ceo sistem vodi preko rekacione koordinate ka prelaznom stanju, što olakšava prelaženje energetske barijere. Svrha stvaranja kovalentnog intermedijera je odigravanje zahtevnijih reakcija u dva koraka–formiranje i raspadanje kovalentnog intermedijera. Korak koji ograničava brzinu u ovakvoj reakciji je često formiranje ili raspadanje intermedijera. Kovalentana kataliza kod enzima olakšana je uglavnom elektrofilnom i nukleofilnom katalizom, a u nekim specijalizovanim slučajevima i redoks katalizom.

Nukleofilna kataliza. Nukleofilna reakcija uključuje doniranje elektrona sa nukleofila enzima na supstrat, koji vodi delimičnom formiranju kovalentne veze između ovih grupa u prelaznom stanju reakcije:

Nuc :⊝+⇋ Nucδ+¿⋯⋯ ¿δ +¿ ¿¿

Reakciona brzina kod nukleofilne katakize zavisi i od snage napadujućeg nukleofila i od osetljivosti elektrofilne grupe suspstrata. Sposobnost doniranja elektrona (nukleofinost) zavisi od mnogo faktora a najvažniji je baznost grupe. Konstanta brzine reakcije kod nukleofilne katalize u korelaciji je sa p Ka nukleofila. Nukleofili kod enzimske katalize su često aminokiselinski bočni lanci unutar aktivnog mesta. Najbaznije amino kiseline su najbolji nukleofili. Međutim, enzimi moraju funkcionisatu unutar uskog opsega fiziološkog pH (pH oko 7,4), što ograničava korelaciju između p Ka i nukleofilnosti. Na primer,

gvanidino grupa arginina bila bi dobar nukleofil ( p Ka=¿ 12,5). Ako sada uzmemo u obzir Henderson–Hasselbalch–ovu jednačinu, videćemo da se na fiziološkom pH ova grupa skoro celokupno nalazi u protonovanom obliku (konjugovana kiselina). Prema tome, bočni lanci arginina ne funkcionišu kao nukleofili. Amino kiseline koje se ponašaju kao nukleofili su serin, treonin, cistein, aspartat, glutamat, lizin, histidin i tirozin.

Elektrofilna kataliza. Kod elektrofilne katalize kovalentni intermedijer se formira između katjonskog elektrofilnog dela enzima i dela molekula supstrata bogatog elektronima. Iz tog razloga, za elektrofilnu katalizu su potrebni organski kofaktori sa manjkom elektrona ili metalni joni. Amino kiselinski bočni lanci ne obezbeđuju efektivne elektrofile. Postoji veliki broj primera enzimskih reakcija koje uključuju metalne jone u aktivnom mestu tokom elektrofilne katalize. Metalni jon ima brojne uloge u ovim reakcijama: on štiti negativnu šaržu na grupama supstrata, koje bi u suprotnom odbile napad elektronskog para sa nukleofila; može da povećava reaktivnost grupa privlačenjem elektorna; može da služi kao most između susptrata i nukleofilne grupe; može da menja p Ka i reaktivnost obližnjih nukleofila. Metalni joni često služe i kao centri za vezivanje molekula supstrata. Na primer, kod većine citohroma, supstrat se može koordinisati preko gvožđa na jedno od šest koordiacionih mesta u koordinacionoj sferi hem–a. Metalni jon vezan za supstrat takođe utiče na konformaciju supstrata i poboljšava katalizu. Kod ATP–zavisne protein kinaze (enzim koji prenosi γ–fosfatnu grupu sa ATP–a na protein supstrat), susptratni enzim nije ATP nego koordinacioni kompleks ATP – Mg2+¿¿. Jon magnezijuma vezuje se za terminalnu fosfatnu grupu, pozicionira je i znatno olakšava nukleofilni napad na γ–fosfatnu grupu. Najčešći mehanizam elektrofilne katalize kod enzimskih reakcija je kombinacija supstrata i katalitičke grupe, u cilju formiranja elektrofila koji sadrži katjonski atom azota. Dobar primer ovoga je grupa elektrofilnih reakcija koja zahteva piridoksal–fosfat kao kofaktor. On je neophodan kofaktor za većinu enzimskih reakcija koje se odvijaju na alfa, beta i gama ugljenikovim atomima α–amino kiselina. Sve ove elektrofilne reakcije se odigravaju kroz tri osnovna koraka: formiranje katjonskog imina (Šifova baza koja znatno snižava energiju aktivacije), hemijske promene kroz formiranje karbanjonskog intermedijera i hidroliza proizvoda imina (Copeland, 2000).

4.3.3. Opšta kiselinsko–bazna kataliza

Skoro svaka enzimska reakcija uključuje transfer protona koji zahteva učešće neke kisele i/ili bazne grupe. Kada imamo katalizu sa malim molekulima i kod nekih primera enzima, protoni (sa hidronijum jona) i hidroksi joni direktno učestvuju kao kiselinske i bazne grupe i tada govorimo o specifičnoj kiseloj katalizi ili specifičnoj baznoj katalizi. Češće

međutim, organski supstrati, kofaktori i aminokiselinski bočni lanci sa enzima ispunjavaju ovu ulogu, ponašajući se pri tom kao Bronsted–Lowry–jeve kiseline i baze i tada govorimo o opštoj kiseloj ili opštoj baznoj katalizi.

Kod neenzimskih reakcija opšta kiselo/bazna kataliza se razlikuje od specifične samo na osnovu uticaja koncentracije kiseline ili baze na brzinu reakcije. Kod opšte kiselo/bazna katalize brzina reakcije zavisi od koncentracije ovih vrsta.

4.4.4. Konformaciona distorzija

Dva eksperimentalna razmatranja dovela su do hipoteze da konformaciono prilagođavanje enzima, supstrata ili oba predstavlja važan aspekt enzimske katalize. Prvo, kvantitativna istraživanja enzimskih reakcija dovela su do zaključka da se uočeno povećanje brzine ne može potpuno pripisati kovalentnoj ili kiselo/baznoj katalizi. Kako je poznato da su mnogi proteini, uključujući i enzime konformacionon dinamični, razvijena je hipoteza da se konformaciono prilagođavanje koristi za izmeštanje supstrata, enzima ili oba da bi se ceo sistem doveo do strukture u prelaznom stanju. Na primer aktivno mesto enzima podleže nizu konformacionih prilagođavanja koja vode od izmeštanja supstrata ka strukturi u prelaznom stanju i samim tim olakšavaju katalitičku reakciju. Drugo razmatranje koje je uključilo konformacionu distorziju kao jedan vid katalitičkog mehanizma je ispoljavanje specifičnosti supstrata u k kat a ne u Km. Uočeno je da se specifičnost prema supstratu ispoljava na visokim koncentracijama supstrata (a ne kada se oni nalaze u maloj koncentraciju i u osnovonm stanju), samim tim specifičnost je u velikoj meri određena razlikom u vrednostima k kat. Svi ovi argumenti i eksperimentalni podaci koji su vodili tome da je za reverzibilnu enzimsku reakciju, distorzija ES kompleksa neophodna komponenta katalize, nisu se slagali sa prethodnim modelima po kojima su supstrat u osnovnom stanju i aktivno mesto konformaciono rigidni (ključ i brava model). Iz svega ovoga bilo je potrebno uzeti u obzir konformacionu fleksibilnost i optimizaciju komplementarnosti aktivno mesto–prelazno stanje. Tri glavna modela su razvijena da bi zadovoljili ove zahteve: Košlandov model indukovanog prilagođavanja, neproduktivno vezujući model i model indukovanog napona.

Po Košlandovom modelu, u odsustvu supstrata aktivno mesto se nalazi u konformaciji koja ne podržava katalizu. Kada se odgovarajući (“dobar”) supstrat veže za aktivno mesto, sila vezivanja između enzima i supstrata se koristi za prevođenje enzima u termodinamički manje favorizovanu ali katalitički aktivnu konformaciju. Po ovom modelu loši supstrati nemaju potrebne strukturne karakteristike da bi indukovali konformacione promene potrebne za katalizu.

Kod modela neproduktivnog vezivanja, smatra se da je aktivno mesto enzima kruto, a dobrim supstratom smatra se onaj supstrat koji ima nekoliko strukturnih karakteristika, od kojih je svaka od njih komplementarna određenom podmestu unutar strukture aktivnog centra. Usled prisustva višestrukih komplementarnih interakcija između podmesta i supstrata, postojaće samo jedna aktivna konformacija i orijentacija supstrata u aktivnom centru enzima; druge strukture i orijentacije vode od vezivanja neaktivne supstratne vrste koja će biti neproduktivna u odnosu na katalizu.

Kod modela indukovanog napona sile vezivanja između enzima i supstrata se direktno koriste za indukovanje napona u molekulu supstrat, koji ga premešta ka strukturi u prelaznom stanju i olakšava reakciju. Kod ovog modela smatra se da je aktivni centar enzima fleksibilan. Najstabilnija konformacija aktivnog centra je ona koja ne odgovara potpuno konformaciji supstrata u osnovnom stanju, nego je komplementarna prelaznom stanju. Da bi se supstrat u osnovnom stanju vezao, enzim mora podleći konformacionoj promeni koja je energetski nepovoljna. Odavde sledi da je ES kompleks pokretačka sila za vraćanje molekula u njegovu originalnu konformaciju niže energije, a ovo je praćeno izmeštanjem molekula supstrata radi dovođenja u strukturu prelaznog stanja koja je komplementarna konformaciji aktivnog centra najniže energije. Pored sternih efekta, elektrostatički efekti takođe mogu indukovati napon (Copeland, 2000).

4.4.5. Preuređenje aktivnog mesta za komplementarnost sa prelaznim stanjem

Alternativni mehanizam katalize koji se koristi konformacionim promenama je onaj kod koga je aktivno mesto enzima konformaciono kruto, ali se preuređuje da bi bilo optimalno prilagođeno supstratu u njegovoj konformaciji u prelaznom stanju. Ovaj mehanizam je donekle sličan modelu ključa i brave, ali je komplementarnost u prelaznom stanju supstrata a ne u osnovnom. Po mehanizmu koji je predložen od strane Cannon–a i Benkovic–a aktivno mesto enzima se preuređuje u konformaciju koja je komplementarna prelaznom stanju supstrata. Ovo preuređeno aktivno mesti strateški lokalizuje reaktivne grupe u niskoj dielektričnoj sredini koja znatno smanjuje destabilizaciju prelaznog stanja povezanu sa reakcijama u rastvoru. Prema tome, po ovom mehanizmu, enzimi primarno ubrzavaju reakcione brzine ne stabilizacijom prelaznog stanja jakim vezujućim interakcijama, već izbegavanjem enrgetskih nepovoljnosti koje prate formiranje prelaznog stanja u glavnini rastvora (Copeland, 2000).

5. Inhibicija

Aktivnost mnogih enzima a samim tim i brzina enzimski katalizovane reakcije može se smanjiti (inhibirati) vezivanjem specifičnih malih molekula i jona za aktivno mesto. Enzimsku aktivnost inhibira više stotina prirodnih jedinjenja i više hiljada veštački sintetisanih hemijskih jedinjenja. Enzimska inhibicija može biti reverzibilna i ireverzibilna, pa samim tim inhibitore delimo na ireverzibilne i reverzibilne.

Ireverzibilni inhibitori se vezuju za enzim kovalentnim i jako čvrstim nekovalentnim vezama. Često se nazivaju i enzimski otrovi, i potpuno redukuju kataličku aktivnost enzima. Enzim koji je inaktiviran ireverzibilnim inhibitorom ne može se reaktivirati dijalizom ili nekom sličnom blagom fizičkom metodom (Leskovac, 2004).

Mnogo važnija klasa inhibitora su reverzibilni inhibitori. Oni obično formiraju nekovalentne komplekse sa raznim vrstama enzima i na taj način smanjuju količinu enzima dostupmu za učešće u katalitičkoj reakciji. Reverzibilni inhibitori mogu se ukloniti dijalizom i na taj način se može povratiti katalitička aktivnost enzima u potpunosti. Svi reverzibilni inhibitori formiraju dinamičke komplekse sa enzimom, koji imaju drugačije katalitičke

osobine od slobodnog enzima. Reverzibilni inhibitori se dele, na osnovu njihovog uticaja na kinetičko ponašanje i na kinetičke parametre enzimske reakcije, na tri glavne grupe: kompetitivne, nekompetitivne i bezkompetitivne. Važno je reći da kompetitivne inhibicije dolazi u enzimskim reakcijama sa jednim ili više supstrata ili produkata, dok se nekompetitivna i bezkompetitivna inhibicija odigravaju isključivo u reakcijama sa dva ili više supstrata ili produkta (Leskovac, 2004).

Postoji i specijalna klasa inhibitora, koji se tako čvrsto vezuju za enzim tako da ostaju trajno vezani za inhibitor (brzina disocijacije je vrlo mala). Ovi inhibitori čine posebnu grupu čvrsto vezujućih inhibitora (Leskovac, 2004).

5.1. Reverziblna inhibicija

Većina osnovne upotrebe reverzibilnih inhibitora zasniva se na njihovoj sposobnosti da se specifično i sa razumno visokim afinitetom vezuju za enzim. Relativni potencijal reverzibilnih inhibitora se meri njihovim kapacitetom vezivanja za enzim, i obično se kvantifikuje merenjem konstante disocijacije za enzim–inhibitor kompleks:

[ E ]+ [ I ] Kd

⇔

[ EI ]

Kd=[ E ] [ I ][ EI ]

U određenom slučaju interakcije enzim–inhibitor, konstanata disocijacije se često odnosi na konstantu inhibitora sa oznakom K i. Vrednost konstante K i za reverzibilni inhibitor može se odrediti na veliki broj načina.

Da bi se razumele molekulske osnove revirzibilne inhibicije, korisno je obratiti pažnju na ravnotežu između enzima, njegovog supstrata i inhibitora koja se može uspostaviti u rastvoru. Na slici 15 prikazana je uopštena šema mogućih interakcija između ovih molekula.

Slika 15. Ravnotežna šema za molekulsku aktivnost (turnover) enzima u prisustvu i odsustvu inhibitora

Na ovoj šemi K s je ravnotežna konstanta disocijacijeES kompleksa na slobodan

enzim i slobodan supstrat, K i je konstanta disocijacije EI kompleksa, dok je k P konstanata

brzine formiranja produkta iz ES i ESI kompleksa. Koeficijent α označava uticaj inhibitora na afinitet enzima prema supstratu, i isto tako uticaj supstrata na afinitet enzima prema inhibitoru. Koeficijent β označava modifikaciju brzine formiranja produkta enzimom, koja nastaje kao rezultat uticaja inhibitora. Inhibitor koji potpuno blokira aktivnost enzima ima vrednost konstante β jednaku nuli. Inhibitor koji samo delimično blokira formiranje produkta ima vrednost konstante β između nule i jedinice. Enzimski aktivatatori sa druge strane imaju vrednost ove konstante veće od jedinice. Pitanje koje se često postavlja je: zašto je konstanta α ista i za modifikaciju K s i K i? Odgovor je da ova konstanata mora bit jednaka za obe na termodinamičkom nivou. Da bismo ovo pokazali razmotrićemo sledeće parove reakcija:

E+S K s

⇔

ES ∆ G=RTln ( K s )

ES+ I α K i

⇔

ESI ∆ G=RTln ( α K i )Ukupna reakcija za ovaj par reakcija je:

E+S+ I ⇌ESI ∆ G=RTln ( α K i K s )

Razmotrimo sada sledeće parove reakcija:

E+ I ⇌EI ∆ G=RTln ( K i )

EI+S α K s

⇔

EIS ∆ G=RTln ( αK s )Ukupna reakcija ovde je:

E+S+ I ⇌ESI ∆ G=RTln ( α K s K i )

Vidimo da oba para reakcija daju istu ukupnu reakciju. Kako već znamo da je ∆ G nezavisna od puta kojim se reakcija odvija, već samo od početnog i krajnjeg stanja, sledi da ukupne reakcije za ova dva para reakcija imaju iste vrednosti ∆ G.

Vrednosti konstanti α i β obezbeđuju nam informacije o stepenu modifikacije koje jedan ligand (supstrat ili inhibitor) ima na vezivanje drugog liganda, i definišu načine interakcije inhibitora sa enzimom.

Kompetitivna (konkurentna) inhibicija

Kompetitivna inhibicija odnosi se na slučaj kada se inhibtor vezuje isključivo za slobodan enzim. Prema tome, ako pogledamo šemu na slici 15, kompetitivna inhibicija se karakteriše vrednostima konstanti α=∞ i β=0. Kod ovog tipa inhibicije dva liganda (inhibitor i supstrat) se takmiče za isti enzim, a slobodan enzim vezuje ili molekul inhibitora ili molekul supstrata ali nikada oba istovremeno. Najčešće kompetitivni inhibitori funkcionišu tako što se vezuju za aktivno mesto slobodnog enzima, samim tim se direktno takmiče sa supstratom za zajedničko mesto na slobodnom enzimu. U ovom slučaju inhibitori

obično imaju neke zajedničke strukturne karakteristike sa supstratom ili prelaznim stanjem, koje omogućavaju inhibitoru da interaguje sličnim favorizovanim interakcijama sa grupama u aktivnom mestu. Ovo, naravno, nije jedini način na koji kompetitivni inhibitor može da blokira vezivanje supstrata za slobodan enzim. Takođe je moguće (mada manje verovatno) da se inhibitor veže za neko drugo mesto koje se nalazi distalno u odnosu na mesto vezivanja supstrata, i na taj način indukuje neke konformacione promene enzima koje vode modifikaciji supstrata. Na ovaj način vezivanje supstrata nije više moguće.

Kada je koncentracija inhibitora takva da je manje od 100% molekula enzima vezano za inhibitor, posmatraće se rezidualna aktivnost koja je povezana sa slobodnim enzimom. Molekuli slobodnog enzima imaće istu molekulsku aktivnost (turnover brzinu) kao i u odsustvu inhibitora i pokazivaće istu maksimalnu brzinu. Kompetitivnost između supstrata i inhibitora za slobodan enzim, imaće uticaj na povećanje koncentracije supstrata koja je potrebna za dostizanje polovine maksimalne brzine. Prema tome, prisustvo kompetitivnog inhibitora u uzorku enzima ima kinetički uticaj na povećanje prividne konstante Km datog

susptrata (prividno smanjenje afiniteta enzima prema supstratu), bez uticaja na vrednost V max. Ako pođemo od Michaelis–Menten–ovog modela brze ravnoteže (brzina formiranja

produkta, a samim tim i brzina razlaganja kompleksa ES je najsporiji stadijum reakcije i određuje brzinu enzimski katalizovane reakcije) ravnotežna konstanta disocijacije za ES kompleks K s predstavlja meru afiniteta enzima prema supstratu i odgovara koncentraciji

supstrata na 12

V max. Kako se i Km definiše kao koncentracija supstrata pri kojoj enzimska

reakcija dostiže polovinu svoje maksimalne brzine, možemo reći da je Km=K s, ali samo kada se razgradnja kompleksa ES odigrava znatno sporije nego vezivanje supstrata za enzim (k−1≫k2 ¿. Pri ovim uslovimaKm predstavlja jačinu kompleksa ES ili meru afiniteta vezivanja

supstrata za enzim. Polazeći od svih ovih pretpostavki dobijamo sledeći izraz za brzinu:

v=k kat [ ES ]

K s=[ E ] [ S ][ ES ]

K i=[ E ] [ I ][ EI ]

[ Eu ]=[ E ]+ [ ES ]+ [ EI ]=[ E ]+ [ E ] [ S ]K s

+[ E ] [ I ]

K i

v=V max [ S ]K s

¿+[ S ]=

V max [ S ]α K s+[ S ]

K s¿ odgovara prividnoj konstanti disocijacije kompleksa enzim–supstrat u prisustvu

inhibitora. U slučaju kompetitivnog inhibitora K s¿=α K s, gde je

α=1+[ I ]K i

Slika 12. Grafički prikaz uticaja reverzibilnog kompetitivnog inhibitora na reakcionu brzinu enzimski katalizovane reakcije

Nekompetitivna inhibicija

Kod ovog tipa inhibicije inhibitor pokazuje afinitet vezivanja i prema slobodnom enzimu i prema binarnom kompleksu enzim–supstrat. Bezkompetitivni inhibitori se ne takmiče sa supstratom za vezivanje za slobodan enzim. Oni se vezuju za enzim na različitom mestu od aktivnog, tako da mogu omogućiti i istovremeno vezivanje supstrata, ali na ovaj način nastajeESI kompleks koji je neproduktivan. Zbog toga se ova inhibicija ne može prevazići povećanjem koncentracije supstrata. Prividan kinetički efekat nekompetitivnih inhibitora je da smanjuju vrednost V max bez uticaja na prividnu konstantu Km supstrata. Kod nekompetitivnih inhibitora konstanta imaju sledeće vrednosti: α=β=0 i δ=1 (zato što je ovo specijalan slučaj linearne mešovite inhibicije).

v=V max

¿ (S )K s+(S )

=( V max/α ) [ S ]

K s+[ S ]

Slika 13. Grafički prikaz uticaja reverzibilnog nekompetitivnog inhibitora na reakcionu brzinu enzimski katalizovane reakcije

Bezkompetitivna (akompetitivna) inhibicija

Akompetitivni inhibitori se isključivo vezuju za kompleks ES. Kinetički efekat ovih inhibitora je prividno smanjenje V max i stvarno smanjenje Km (smanjenjeK s, tj. povećanje afiniteta enzima prema supstratu). Prividno povećanje afiniteta enzima prema supstratu posledica je neproduktivnog vezivanja supstrata, što rezultuje smanjenjem koncentracije slobodnog enzima. Potpuno akompetitivni inhibitori se karakterišu vrednostima konstanti α ≪1 i β=0. Potpuno akompetitivni inhibitori nemaju afinitet prema slobodnom enzimu tako da je vrednost K i beskonačna. Međutim oni imaju merljiv afinitet prema ES kompleksu tako

da je vrednost α K i određena. Brzina enzimske reakcije je prema tome:

v=k kat [ ES ]

K s=[ E ] [ S ][ ES ]

K i=[ ES ] [ I ][ ESI ]

[ Eu ]=[ E ]+ [ ES ]+ [ ESI ]=[ E ]+ [ E ] [ S ]K s

+[ E ] [ S ] [ I ]

K s K i

v=V max

¿ (S )K s

¿+(S )=

( V max/α ) [ S ]( K s/α )+[ S ]

Slika 14. Grafički prikaz uticaja reverzibilnog bezkompetitivnog inhibitora na reakcionu brzinu enzimski katalizovane reakcije

6. Regulacija katalitičke aktivnosti enzima

U ćelijskom metabolizmu određena grupa enzima zajedno učestvuje u nekom metaboličkom putu, u cilju izvođenja tog metaboličkog procesa i dobijanja određenog produkta metabolizma. Kod ovih enzimskih sistema produkt reakcije katalizovane jednim enzimom postaje supstrat za drugi enzim. Aktivnost ovih enzima reguliše se koncentracijom njihovih supstrata ili kontrolom sinteze i razgradnje samog enzima i većina njih prati kinetički obrazac Michaelis–Mentena. Međutim u svakom metaboličkom putu postoji jedan ili više enzima koji imaju znatno veći uticaj na određenu sekvencu. Ovi enzimi, koji se nazivaju regulatorni enzimi pokazuju povećanu ili smanjenu katalitičku aktivnost kao odgovor na određene signale, znatno su osetljiviji na promene u koncentraciji metabolita i ne pokoravaju se Michaelis–Menten–ovoj kinetici. Regulatorni enzimi se obično nalaze na kontrolnim tačkama metaboličkog puta, tj. na početku, na kraju ili na mestu grananja metaboličkog puta. Regulatorni enzimi ispoljavaju dva regulatorna fenomena: kooperativnost i alosteriju. Aktivnost regulatornih enzima se ne može menjati prostom promenom koncentracije supstrata: aktivnost alosteričnih enzima reguliše se nekovalentnim vezivanjem regulatornih jedinjenja koja se nazivaju alosterični modifikatori ili alosterični efektori; aktivnost drugih enzima reguliše se reverzibilnom kovalentnom modifikacijom (Horton et al., 2005).

Kooperativnost

Većina enzima su oligomeri koji se sastoje od različitih podjedinica (subjedinica). Često su te subjedinice identične i svaka od njih nosi ekvivalentno katalitičko mesto. Ako su mesta identična i nezavisna jedno od drugog, prisustvo supstrata na jednom od njih neće imati uticaj na vezivanje supstrata i katalitičke osobine drugih mesta. Kod kooperativnih enzima, s druge strane postoje katalitička mesta niskog i visokog afiniteta za vezivanje supstrata, tako da kod ovih enzima dolazi do kooperativnog vezivanja supstrata. Vezivanje molekula supstrata indukuje strukturne i/ili elektronske promene koje rezultuju u izmenjenom afinitetu za vezivanje supstrata preostalih slobodnih mesta. Enzimski afinitet za vezivanje supstrata može se povećati (pozitivni kooperativni efekat) ili smanjiti (negativin kooperativni efekat). Primer ovog kooperativnog efekta je vezivanje kiseonika za hemoglobin. Vezivanje liganda utiče na afinitet svih ostalih nepopunjenih vezujućih mesta, a O2 se može smatrati i za ligand i za aktivirajući homotropni modifikator. Postoji po jedno vezujuće mesto za kiseonik

na svakoj subjedinici, tako da se alosterični efekat, koji dovodi do povećanja kooperativnosti ispoljava konformacionim promenama od jedne subjedinice do druge kroz interakciju subjedinica–subjedinica (Lehninger et al., 2004).

Alosterija

Alosterični protein je onaj kod koga pored aktivnog (funkcionalnog) mesta postoje i različita regulatorna (alosterična) mesta za vezivanje liganda. Vezivanje liganada na takvom mestu dovodi do konformacionih promena samog enzima, što utiče na afinitet aktivnog mesta prema supstratu. Alosterični enzimi poseduju “druge oblike”, ili konformacije koje se mogu indukovati vezivanjem alosteričnih liganda, koji se nazivaju modifikatori ili efektori. Konformacione promene indukovane vezivanjem efektora, prevode enzim u manje ili više aktivni oblik. Modifikatori alosteričnoh enzima mogu biti i inhibitori i aktivatori. Efektor koji inhibira aktivnost enzima naziva se negativni efektor, i obrnuto. Kada supstrat deluje i kao efektor onda govorimo o homotropnom efektu, i obrnuto kada se efektor razlikuje od supstrata govorimo o heterotropnom efektu. Kooperativno vezivanje liganda za multimerne proteine, kao što je hemoglobin je oblik alosteričnog vezivanja i pozitivnog homotropnog efekta (Horton et al., 2005).

Alosterični supstrat koji je ujedno i efektor, obično pokazuje pozitivni homotropni efekat. U takvim slučajevima, prisustvo molekula supstrata na jednom mestu enzima, poboljšava katalitičke osobine drugog vezujućeg mesta, tj. vezujuća mesta ispoljavaju kooperativnost.

Inhibicija povratnom spregom („feedback“ inhibicija) je odličan primer negativnog heterotropnog efekta. Kod ovog specifičnog tipa inhibicije alosterični enzim poseduje alosterično mesto koje vezuje proizvode enzimski katalizovane reakcije, tako da dolazi do inhibicije početnog enzima. Primer ovakovog enzima je aspartat transkarabamoilaza, koji katalizuje prvi korak u sintezi pirimidinskih baza, reakciju kondenzacije aspartata i karbamoil–fosfata u karbamoilaspartat i ortofosfat. Uloga ovog regulatornog enzima je da na kraju metaboličkog puta nastane tačno određena količina citidin–trifosfata (CTP), i to tako što se sam enzim inhibira CTP–om. Na ovaj način vezivanje CTP–a za regulatornu subjedinicu (alosterično mesto) aspartat transkarbamoilaze, smanjuje aktivnost (inhibira) aktivnog mesta na katalitičkoj subjedinici, tj. smanjuje afinitet prema supstratu (Berg et al., 2006).

Već smo rekli da se alosterično regulisani enzimi ne pokoravaju Michaelis– Menten–ovoj hiperboličnoj zavisnosti, nego da pokazuju sigmoidalnu zavisnost. Objašnjenje ovakvog ponašanja je sledeće: u odsustvu supstrata enzim skoro celokupno postoji u T stanju. Vezivanje supstrata za enzim pomera enzim ka R stanju. Prelaz od T do R stanja vezivanjem supstrata na jednom mestu povećaće enzimsku aktivnost preostalih mesta i dovešće do porasta aktivnosti enzima. Ova osobina naziva se, kao što je već rečeno kooperativnost. Sam alosteri;ni efekat opisuje se sa dva modela: Košlandovim (sekvencijalni) modelom i Monodovim (simetričnim ili koncertovanim) modelom. (Berg et al., 2006).

Kovalentna modifikacija

Kovalentno vezivanje drugih molekula za enzim može modifikovati aktivnost enzima. U ovom slučaju, donor molekul obezbeđuje funkcionalnu grupu koja modifikuje osobine enzima. Većina ovih modifikacija je reverzibilna. Najzastupljeniji, ali ne i jedini vidovi kovalentne modifikacije su fosforilacija i defosforilacija. Na primer histoni, proteini koji učestvuju u pakovanju DNK molekula u hromozome i u regulaciji gena, kovalentno se modifikuju acetilovanjem i deacetilovanjem. Enzimi koji katalizuju reakcije fosforilacije su protein kinaze. Protein kinaze prenose γ–terminalnu fosforil grupu na specifične ostatke serina, treonina i tirozina. Na ovaj način aktivnost enzima se efikasno kontroliše iz strukturnih, termodinamičkih, kinetičkih i regulatornih razloga (Berg et al., 2006).

7. Literatura

Anonymus, 2010 (accessed on). en.wikipedia.org/wiki/Enzyme.Berg, J. M.; Tymoczko, J. L.; Stryer, L., Biochemistry, 6th ed., W. H. Freeman

Company, 2006.Copeland, R. A., Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and

Data Analysis, 2nd ed., John Wiley & Sons, INC., New York, USA, 2000.Horton, R.; Moran, L. A.; Scrimgeour, G.; Perry, M.; Rawn, D., Principles of

Biochemistry, 4th ed., Prentice Hall, 2005.Koraćević, D., et al., Biohemija, II izdanje, Savremena Administracija, Beograd, 2000.Lehninger, A.; Cox, M.; Nelson, D. A., Lehninger’s Principles of Biochemistry, W. H. Freeman, 2004.Leskovac, V., Comprehensive Enzyme Kinetics, Kluwer Academic/Plenum

Publishers, New York, USA, 2004.Marangoni, A. G., Enzyme Kinetics: A Modern Approach, John Wiley & Sons, Inc.,

Hoboken, New Jersey, 2004.Murzin, D.; Salami, T., Catalytic Kinetics, Elsevier Science & Technology Books,

Amsterdam, Netherlands, 2005.