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KARINE LOUIZE VINCENZI
EFEITO IN VITRO DE METABÓLITOS ACUMULADOS NA CITRULINEMIA TIPO I
SOBRE PARÂMETROS DE METABOLISMO ENERGÉTICO EM CÉREBRO DE
RATOS: PAPEL PROTETOR DO RESVERATROL
JOINVILLE
2019
KARINE LOUIZE VINCENZI
EFEITO IN VITRO DE METABÓLITOS ACUMULADOS NA CITRULINEMIA TIPO I
SOBRE PARÂMETROS DE METABOLISMO ENERGÉTICO EM CÉREBRO DE
RATOS: PAPEL PROTETOR DO RESVERATROL
Dissertação de mestrado apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde e Meio Ambiente, na Universidade da Região de Joinville-UNIVILLE. Orientadora: Profª. Drª. Daniela Delwing de Lima. Coorientadora: Profª. Drª. Débora Delwing Dal Magro
JOINVILLE
2019
Catalogação na publicação pela Biblioteca Universitária da Univille
Vincenzi, Karine Louize
V775e Efeito in vitro de metabólitos acumulados na citrulinemia tipo I sobre parâmetros de metabolismo energético em cérebro de ratos: papel protetor do resveratrol/ Karine Louize Vincenzi; orientadora Dra. Daniela Delwing de Lima; coorientadora Dra. Débora Delwing Dal Magro. – Joinville: UNIVILLE, 2019.
85 p.: il. ; 30 cm
Dissertação (Mestrado em Saúde e Meio Ambiente – Universidade da Região de Joinville)
1. Citrulinemia. 2. Metabolismo energético. 3. Resveratrol. I. Lima, Daniela
Delwing de (orient.). II. Magro, Débora Delwing Dal. (Coorient.). III. Título.
CDD 616.6
Elaborada por Rafaela Ghacham Desiderato – CRB-14/1437
Dedico este trabalho primeiramente a
Deus por ter me abençoado com a capacidade
de seguir com meu sonho.
A meu pai, sendo um exemplo pra mim
e me incentivando sempre.
A minha mãe, sua constante
compreensão foi suporte para minha
conquista.
Este trabalho dedico a vocês!
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por me guiar e conceder forças nos meus
períodos mais difíceis e por não deixar minha fé ser abalada nessa jornada. Toda
honra e toda glória sejam dadas a ti Senhor.
A minha mãe, Maria Janete, pelas suas orações e sempre estar de braços
abertos e palavras prontas para me confortar. A meu pai, Volney, por me incentivar a
ser uma profissional diferenciada com seu exemplo e pelos sermões que me
ensinaram a lutar sempre pelos meus objetivos.
Aos meus irmãos, Bianca, Daniel, Rafael e Julia, que sempre depositaram
muita fé em mim, com apoio e compreensão em minhas metas e meu futuro. E toda
minha família por estarem sempre na arquibancada torcendo pelo meu sucesso.
Agradeço a minha orientadora Profª Drª Daniela Delwing de Lima, que além
de minha orientadora esteve sempre disposta a me aconselhar, por acreditar em
meu potencial e ser um profissional inspirador, a você minha eterna gratidão pelos
ensinamentos, paciência e amizade. À minha Coorientadora Profª. Drª Débora
Delwing Dal Magro pelas contribuições na construção do trabalho e parceria em toda
pesquisa.
Aos meus amigos, que me apoiaram e compreenderam minha ausência
durante a elaboração desse trabalho.
Ao meu grupo de pesquisa, me incentivando e sempre apoiando no meu
crescimento. Principalmente Thayná, Larissa e Aline que foram além de tudo,
amigas.
A todos os professores e funcionários do mestrado que de alguma forma
contribuíram para a esta conquista.
Aos meus colegas de sala, turma XVI, pelo constante aprendizado durante o
nosso convívio.
Aos membros da banca, pelas contribuições.
A UNIVILLE, CAPES e a FURB.
A todos que de alguma forma ajudaram a concluir mais essa etapa da minha
vida.
“Não se pode criar experiência. É preciso passar por ela.”
Albert Camus
https://www.pensador.com/autor/albert_camus/
RESUMO
Introdução: A Citrulinemia tipo I é uma doença autossômica recessiva do ciclo da
ureia causada pela deficiência na atividade da enzima argininosuccinato sintetase, a
qual catalisa a formação de argininosuccinato a partir de citrulina e aspartato,
causando um aumento nos níveis de citrulina e amônia. Indivíduos afetados podem
apresentar déficits neurológicos significativos. Objetivo: Investigar os efeitos in vitro
de citrulina, amônia e a influência do antioxidante resveratrol sobre a atividade da
piruvato quinase, citrato sintase, succinato desidrogenase (SDH), complexo II e
citocromo c oxidase no córtex cerebral, cerebelo e hipocampo de ratos Wistar
machos com 60 dias. Metodologia: Para os estudos in vitro, os animais foram
sacrificados por decapitação, sem anestesia, o cérebro foi removido e as estruturas
cerebrais (hipocampo, córtex cerebral e cerebelo) separadas, homogeneizadas em
tampão adequado e armazenadas. A citrulina, amônia e resveratrol foram
adicionados aos ensaios para obtenção das concentrações finais de citrulina (0.1;
2.5 e 5.0 mM), amônia (0.01; 0.1 e 1.0 mM) e resveratrol ( 0.01 mM, 0.1 mM e 0.5
mM) para verificar a atividade sobre os parâmetros de metabolismo energético
avaliados. Os dados foram analisados por ANOVA, seguido pelo teste post-hoc de
Duncan, quando o teste F foi significativo (p
energético causadas pela citrulina e amônia são provavelmente mediadas pela
geração de radicais livres, que por sua vez podem ser eliminados pela ação do
antioxidante resveratrol.
Palavras-chave: Citrulinemia tipo I; citrulina; amônia; metabolismo energético;
resveratrol.
ABSTRAT
Introduction: Citrullinemia Type I is an autosomal recessive disease caused by
deficiency of argininosuccinate synthetase, which catalyzes the formation of
argininosuccinate from citrulline and aspartate, as part of the urea cycle, causing an
increase in citrulline and ammonia levels. Affected individuals may have significant
neurological deficits. Objective: To evaluate the in vitro effects of citrulline, ammonia
and the influence of the antioxidant resveratrol on the activity of pyruvate kinase,
citrate synthase, succinate dehydrogenase (SDH), complex II and cytochrome c
oxidase in the cerebral cortex, cerebellum and hippocampus of 60-day-old male
Wistar rats. Methodology: For in vitro studies, the animals were sacrificed by
decapitation, without anesthesia, the brain was removed and the structures
separated (hippocampus, cerebral cortex and cerebellum), then homogenized in
suitable buffer and stored. Citrulline, ammonia and resveratrol were added to the
assays to obtain final concentrations of citrulline (0.1, 2.5 and 5.0 mM), ammonia
(0.01, 0.1 and 1.0 mM) and resveratrol (0.01 mM, 0.1 mM and 0.5 mM) to verify the
activity on the energy metabolism parameters evaluated. Data were analyzed by
ANOVA, followed by Duncan's post-hoc test, when the F-test was significant
(p
generation of free radicals, which in turn can be eliminated by the action of the
antioxidant resveratrol.
Keywords: Citrulinemia type I; citrulline; ammonia; energy metabolism; resveratrol.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática do ciclo da ureia. ......................................... 27
Figura 2: Hidrólise da ATP: ATP - Adenosina trifosfato; ADP - Adenosina difosfato; Pi
- Fósfato inorgânico. ................................................................................................ 34
Figura 3: Hidrólise da fosfocreatina para geração de ATP. PCr – Fosfocreatina; ADP
– Adenosina Difosfato; ATP – Adenosina trifosfato; Cr – Creatina. .......................... 35
Figura 4: Via Glicolítica. ........................................................................................... 36
Figura 5: Ciclo do Ácido Cítrico. ............................................................................... 37
Figura 6: Representação de transporte de elétrons. ................................................ 39
Figura 7: Reação do Complexo I. ............................................................................. 40
Figura 8: Reação do Complexo II. ............................................................................ 41
Figura 9: Reação do Complexo III. ........................................................................... 41
Figura 10: Cadeia de Transporte de elétrons. .......................................................... 43
Figura 11: Protocolo do experimento in vitro. ........................................................... 47
Figura 12: Fluxograma de preparação do tecido. ..................................................... 48
Figura 13: Fluxograma da atividade da Piruvato Quinase. ....................................... 49
Figura 14: Fluxograma da Atividade da Citrato Sintase. ........................................... 49
Figura 15: Fluxograma da atividade da citocromo c oxidase. ................................... 50
Figura 16: Fluxograma da atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase. ... 51
Figura 17: Fluxograma da Dosagem de Proteínas. .................................................. 51
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Classificação clínica dos Erros Inatos do Metabolismo. .......................... 26
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Acetil-Coa Acetilcoenzima A
ADP Difosfato de Adenosina
ASS Argininosuccinato Sintetase
ASL Argininosuccinato Liase
ATP Trifosfato de Adenosina
ATP PCr Sistema Fosfogênico
ATPase Adenosina-Trifosfatase
CAT Catalase
CAC Ciclo do Ácido Cítrico
CO2 Dióxido de Carbono
CPS-I Carbamil Fosfato Sintetase-I
CTLN1 Citrulinemia Tipo I
CTLN2 Citrulinemia Tipo II
DCU Distúrbios do Ciclo da Ureia
EIM Erros Inatos do Metabolismo
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FAD Flavina-Adenina Dinucleotídeo
GR Glutationa Redutase
GSH-Px Glutationa Peroxidase
GTP Trifosfato de Guanadina
HCO3- Bicarbonato
H2O2 Peróxido de hidrogênio
NAD Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NH4+ Íon amônio
OTC Ornitina Transcarbamilase
O2 Oxigênio
O2o- Radical superóxido
PCr Fosfocreatina
Pi Íon fosfato
Q Ubiquinona
QH2 Ubiquinol
SDH Succinato-Desidrogenase
SOD Superóxido Dismutase
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 22
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 24
2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 24
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................... 24
3 REVISÃO ....................................................................................................... 25
3.1 Erros Inatos do Metabolismo ................................................................... 25
3.2 Ciclo da ureia ............................................................................................ 26
3.3 Citrulinemia ............................................................................................... 27
3.3.1 Citrulinemia Tipo I .................................................................................. 27
3.3.1.1 Descrição Clínica ................................................................................ 28
3.3.1.2 Diagnóstico ......................................................................................... 30
3.3.1.3 Tratamento .......................................................................................... 31
3.4 Antioxidantes ............................................................................................ 31
3.4.1 Resveratrol ............................................................................................. 32
3.5 Metabolismo energético ........................................................................... 33
3.5.1 Sistema ATP-PCr .................................................................................... 34
3.5.2 Glicólise .................................................................................................. 35
3.5.3 Ciclo do Ácido Cítrico (Ciclo de Krebs) ................................................ 37
3.5.4 Cadeia de Transporte de Elétrons ........................................................ 38
3.5.5 Fosforilação Oxidativa ........................................................................... 43
4 INTERDISCIPLINALIDADE ........................................................................... 45
5 METODOLOGIA ............................................................................................ 46
5.1 Animais ...................................................................................................... 46
5.2 Protocolo experimental ............................................................................ 46
5.2.1 Estudos in vitro ...................................................................................... 46
5.2.2 Prevenção com resveratrol ................................................................... 47
5.3 Estudos bioquímicos ................................................................................ 47
5.3.1 Preparação do tecido ............................................................................. 47
5.3.2 Atividade da Piruvato Quinase .............................................................. 48
5.3.3 Atividade da Citrato Sintase .................................................................. 49
5.3.4 Atividade do Citocromo c oxidase ........................................................ 49
5.3.5 Atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase ....................... 50
5.3.6 Dosagem de Proteínas ........................................................................... 51
5.4. Análise estatística .................................................................................... 51
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................... 52
6.1 Artigo ......................................................................................................... 52
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 79
8 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 80
22
1 INTRODUÇÃO
O vasto número de deficiências genéticas existentes resulta em quadros
clínicos extremamente diversos; enquanto alguns EIM são absolutamente
assintomáticos, outros são tão graves que resultam em morte neonatal. A
diversidade envolvida nessas patologias e a ausência, na maioria dos casos, de
sinais e sintomas específicos contribuem para dificultar o diagnóstico dessas
doenças (MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995).
Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são alterações genéticas que se
manifestam pela ausência da síntese de uma proteína, geralmente uma enzima,
ocasionando bloqueio de rotas metabólicas, correspondendo cerca de 10% de todas
as doenças genéticas (ARAÚJO, 2004; BICKEL, 1987).
Distúrbios do Ciclo da Ureia (DCU) são doenças genéticas raras que afetam o
catabolismo proteico através da deficiência de enzimas envolvidas no processo de
excreção da amônia. Os DCU podem se apresentar tardiamente, com manifestações
pleiotrópicas que variam desde o desenvolvimento normal com descompensação
metabólica aguda, até doença psiquiátrica (MIAN; LEE, 2002)
De acordo com os estudos de Raimann et al. (1994) e Summara et al.
(2013), as alterações metabólicas do ciclo da ureia apresentam uma ocorrência
global de 1:30.000 - 46.000 nascidos vivos, inclusa dentre elas a Citrulinemia,
considerada uma patologia rara.
A Citrulinemia Tipo I (CTLN1) é uma alteração genética do ciclo da ureia
causada pela deficiência na atividade da enzima Argininosuccinato Sintetase (ASS),
impedindo a atividade das rotas metabólicas do ciclo da ureia (BICKEL, 1987). É
caracterizada por início neonatal ou intermitente de hiperamonemia, níveis séricos
reduzidos de arginina e elevados de citrulina e glutamina (HÄBERLE et al., 2002).
A forma mais grave da doença ocorre no período neonatal, conhecida como
forma clássica (QUINONEZ; THOENE, 2004; RAIMANN et al., 1994). Nessa
classificação, o recém-nascido torna-se progressivamente mais letárgico, apresenta
dificuldade respiratória e quadros de vômito, desenvolve sinais de aumento da
pressão intracraniana podendo evoluir para convulsões, perda de consciência e
23
morte (CLANCY; CHUNG, 1991; MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995;
QUINONEZ; THOENE, 2004).
A doença também pode se manifestar mais tarde na infância, forma não
clássica, caracterizada com sintomas mais sutis, incluindo dor de cabeça intensa,
escotomas, episódios tipo enxaqueca, ataxia, fala arrastada, letargia e sonolência,
sem intervenção ocorre aumento da pressão intracraniana, e também pode levar a
morte (MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995; QUINONEZ; THOENE, 2004).
As crianças tratadas imediatamente após diagnóstico de CTLN1, que
apresentam a forma clássica, considerada a mais grave, podem sobreviver por um
período indeterminado de tempo, mas geralmente com déficits neurológicos
significativos (QUINONEZ; THOENE, 2004).
Visto que a amônia é um metabólito acumulado da CTLN1, dados da literatura
apontam que a amônia em excesso é uma toxina com efeito potente sobre o sistema
nervoso central, requerendo diagnóstico e terapia emergente (BRENINGSTALL,
1986). Com relação aos danos irreversíveis causados por essa toxina, pode-se citar:
atrofia cortical, aumento ventricular e desmielinização, os quais levam a
comprometimento cognitivo, convulsões e paralisia cerebral (BRAISSANT; MCLIN;
CUDALBU, 2013).
Considerando que a CTLN1 pode causar disfunção neurológica significativa e
encefalopatia hiperamonêmica, este trabalho tem por objetivo investigar os efeitos in
vitro da citrulina e da amônia sobre alguns parâmetros de metabolismo energético,
bem como verificar os efeitos in vitro do resveratrol sobre as alterações causadas
pela citrulina e a amônia nos parâmetros estudados.
24
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar os efeitos in vitro da citrulina e da amônia e a influência do
antioxidante resveratrol sobre parâmetros de metabolismo energético em cérebro de
ratos.
2.2 Objetivos Específicos
1) Verificar os efeitos in vitro de diferentes concentrações de citrulina (0,1, 2,5
e 5,0 mM) e de amônia (0,01, 0,1 e 1,0 mM) sobre a atividade da piruvato quinase,
citrato sintase, complexo II / sucinato desidrogenase e citocromo C oxidase em
hipocampo, córtex cerebral e cerebelo de ratos de 60 dias de idade;
2) Investigar a influência do antioxidante resveratrol (0,01, 0,1 e 0,5 mM)
sobre os efeitos in vitro da citrulina e da amônia sobre os parâmetros de
metabolismo energético analisados em hipocampo, córtex cerebral e cerebelo de
ratos de 60 dias de idade.
25
3 REVISÃO
3.1 Erros Inatos do Metabolismo
Os Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são distúrbios de natureza genética,
geralmente se manifestam devido um defeito enzimático (EL HUSNY; CALDATO,
2006; ZANETTI; ALIBERTI, 2008). Essa ausência enzimática é capaz de acarretar a
interrupção de uma via metabólica, desencadeando alguma falha de síntese,
degradação, armazenamento ou transporte de moléculas no organismo (EL HUSNY;
CALDATO, 2006).
Tratando-se de alterações metabólicas, os EIM possuem duas classificações,
dentre elas: Categoria 1, compreende as doenças que afetam apenas um órgão ou
um sistema anatômico, como o sistema endócrino, sistema imune, coagulação;
Categoria 2, engloba doenças em que a base bioquímica afeta uma via metabólica
comum a um grande número de células ou órgãos, como hiperamonemia em
defeitos do ciclo da ureia ou hipoglicemia em Glicogenose (EL HUSNY; CALDATO,
2006; MARTINS, 1999).
Alterações da Categoria 2, são divididas em três diferentes grupos conforme
suas características fisiopatológicas e fenótipo clínico: Grupo I: Distúrbios de síntese
ou catabolismo de moléculas complexas e incluem as doenças que afetam um
sistema funcional ou anatômico ou mesmo um órgão; Grupo II: Erros inatos do
metabolismo intermediário que levam à intoxicação aguda e recorrente ou crônica e
progressiva; Grupo III: Deficiência na produção ou utilização de energia no fígado,
miocárdio, músculo ou cérebro (EL HUSNY; CALDATO, 2006; ZANETTI; ALIBERTI,
2008). Para um maior entendimento, veja descrição no Quadro 1.
A classificação do presente trabalho se engloba na categoria 2, no Grupo II,
onde as características principais nesse grupo são a existência de intervalos livres
de sintomas, a relação evidente com o aporte alimentar; ou seja, o aumento da taxa
de metabolismo basal e a entrada no organismo de um substrato nocivo, podem
desencadear uma intoxicação aguda e recorrente ou crônica e progressiva (EL
HUSNY; CALDATO, 2006; ZANETTI; ALIBERTI, 2008).
26
Quadro 1: Classificação clínica dos Erros Inatos do Metabolismo.
Classificação Descrição
Categoria 1 Envolve um sistema funcional.
Categoria 2 Afeta vias metabólicas, grande número de células ou órgãos.
Grupo I Defeitos na síntese ou catabolismo.
Grupo II Defeito no metabolismo intermediário.
Grupo III Defeito na produção de energia ou utilização.
Fonte: Adaptado de Martins (1999).
Incorporado no Grupo II encontra-se Distúrbios do Ciclo da Ureia (DCU),
caracterizado como doenças genéticas raras que afetam o catabolismo proteico por
deficiência em uma das enzimas envolvidas no processo de excreção celular
(PEREZ et al., 2010). A patologia dos DCUs é caracterizada principalmente por
hiperamonemia e encefalopatia, com sintomas variando de risco de vida a retardo
mental em sobreviventes (PEREZ et al., 2010).
3.2 Ciclo da ureia
O ciclo da ureia ocorre em cinco etapas enzimáticas, sendo que a enzima
ornitina transcarbamilase (OTC) está localizada na matriz mitocondrial e as enzimas
carbamil fosfato sintetase-I (CPS-I), argininosuccinato sintetase (ASS),
argininosuccinato liase (ASL) e arginase no citosol (MORRIS JR, 2002).
Conforme observado na Figura 1, o ciclo tem início no interior da
mitocôndria, quando o íon amônio (NH4+) presente na mitocôndria hepática se
condensa com o bicarbonato (HCO3-), sob ação da enzima carbamil-fosfato sintetase
(1), formando carbamil-fosfato na matriz, o qual entra no ciclo da ureia, dando início
as quatro etapas que correspondem o ciclo (MORRIS JR, 2002; NELSON; COX,
2011). O produto formado na primeira reação (carbamil-fosfato), sob ação da enzima
ornitina-transcarbamilase (2), condensa-se com ornitina e forma o aminoácido
citrulina, que é transportado para o citosol (NELSON; COX, 2011; VIEIRA, 2014). No
citosol, a citrulina reage com aspartato pela ação da enzima argininosuccinato
sintetase (3) e forma o arginino-succinato, o qual é clivado pela enzima
27
argininosuccinato liase (4) para formar arginina e fumarato. Por fim, a enzima
arginase (5) hidrolisa a arginina, produzindo ureia e ornitina (NELSON; COX, 2011).
Figura 1: Representação esquemática do ciclo da ureia.
Fonte: Adaptado Esper; Noriega; García (2008).
3.3 Citrulinemia
A Citrulinemia é decorrente do acúmulo de citrulina no fluido corporal,
causado por uma deficiência na atividade da enzima argininosuccinato sintetase
(ASS), enzima 3 na figura 1, responsável por catalisar a formação de
argininosuccinato a partir de citrulina e aspartato. Classificada em duas formas de
acordo com a patogênese (GAO et al., 2003): Citrulinemia Tipo I (CTLN1) com
deficiência da enzima ASS (CTLN1 anormalidade no gene ASS em cromossomo
9q34.1) e outra de Citrulinemia Tipo II (CTLN2) caracterizada por mutações de
citrina codificadas por SLC25A13 no cromossoma 7q21.3 (GAO et al., 2003).
3.3.1 Citrulinemia Tipo I
A Citrulinemia Tipo I (CTLN1) foi descrita pela primeira vez por McMurray et
al. (1963), é um raro distúrbio metabólico caracterizado por morbidade neurológica
grave associada à hiperamonemia (PEREZ et al., 2010).
28
A CTLN1 é descrita como um distúrbio hereditário do ciclo da ureia associado
com a deficiência da enzima ASS (KENNAWAY et al., 1975; QUINONEZ; THOENE,
2004). Esta deficiência enzimática resulta em níveis elevados de citrulina no plasma,
e também aumento nos níveis de amônia e glutamina e depleção de arginina
(MAESTRI; CLISSOLD; BRUSILOW, 1995).
As alterações metabólicas do ciclo da ureia ocorrem em 1:30.000 - 46.000
nascidos vivos, dentre elas está a citrulinemia, sendo considerada uma patologia
rara, com incidência estimada de 1:57.000 nascidos vivos (QUINONEZ; THOENE,
2004; RAIMANN et al., 1994; SUMMARA et al., 2013).
A CTNL1 é herdada de maneira autossômica recessiva, é desenvolvida nos
primeiros dias de vida e ocasiona em alta mortalidade infantil (QUINONEZ;
THOENE, 2004; SUGAWARA et al., 2018). A morbidade dos pacientes com DCU
tem sido associada à duração do coma hiperamonêmico e não à deficiência
enzimática específica que causa a hiperamonemia (BRENINGSTALL, 1986).
A amônia é um constituinte normal do nosso organismo, porém em excesso
é uma toxina metabólica com efeito potente sobre a função do sistema nervoso
central (BRENINGSTALL, 1986). A disfunção do sistema nervoso central causada
por este transtorno pode ser intensa, dessa forma, o diagnóstico precoce, bem como
o conhecimento de ciclo metabólico e mecanismos fisiopatológicos são
indispensáveis para estabelecer um tratamento apropriado ao paciente
(BRENINGSTALL, 1986; ESPER; NORIEGA; GARCÍA, 2008).
3.3.1.1 Descrição Clínica
A distinção entre as formas clínicas da CTLN1 é baseada em achados
clínicos, onde uma delas se apresenta como a forma aguda neonatal (conhecida
como a forma "clássica"). A outra classificação dessa patologia é caracterizada na
idade mais avançada, onde os indivíduos apresentam sintomas iniciais mais leves,
podendo agravar posteriormente. Por último, foi encontrado na literatura outra forma
clínica, em que as mulheres têm início dos sintomas durante a gravidez ou após o
parto (QUINONEZ; THOENE, 2004).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/gene/glossary/def-item/autosomal-recessive/
29
Neonatal (Forma “clássica”):
O bebê nasce com características aparentemente normais ao nascimento,
porém após 12 a 48 horas, a criança torna-se progressivamente mais letárgica, se
alimenta mal, pode vomitar, desenvolver sinais de aumento da pressão
intracraniana, apresentar convulsões, dificuldade respiratória e deterioração
progressiva da consciência que pode evoluir para o coma (QUINONEZ; THOENE,
2004; RAIMANN et al., 1994). De acordo com a literatura, as crianças que
apresentaram comprometimento cognitivo tinham um pico de concentração
plasmática de amônia superior a 480 µmol / L ou uma concentração inicial de
amônia plasmática superior a 300 µmol / L (QUINONEZ; THOENE, 2004).
A hiperamonemia e o acúmulo de outros metabólitos tóxicos, como a
glutamina, acarretam em aumento da pressão intracraniana, aumento do tônus
neuromuscular, espasticidade, convulsões, perda de consciência e morte, quando
não ocorre intervenção imediata (BRENINGSTALL, 1986; QUINONEZ; THOENE,
2004). Na citrulinemia clássica tipo I a maior sobrevida de uma criança não tratada é
de 17 dias (QUINONEZ; THOENE, 2004).
As anormalidades metabólicas cerebrais observadas no cenário clínico da
fase neonatal incluem distúrbios no metabolismo energético cerebral, como na via
da glicose, ciclo do ácido cítrico, metabolismo dos aminoácidos e estado redox
mitocondrial (CLANCY; CHUNG, 1991).
Forma não clássica:
A forma não clássica ocorre numa idade mais avançada em comparação a
forma clássica, e apresenta variantes patogênicos específicos da ASS. Os sintomas
nessa forma são mais sutis, incluindo dor de cabeça, escotomas, episódios tipo
enxaqueca, ataxia, fala arrastada, letargia e sonolência, e sem intervenção imediata
ocorre aumento da pressão intracraniana, com aumento do tônus neuromuscular,
espasticidade, convulsões e pode levar a morte (QUINONEZ; THOENE, 2004).
Indivíduos assintomáticos ou com citrulinemia leve também foram detectados
através de programas de triagem neonatal e estudos envolvendo familiares
(HÄBERLE et al., 2002; ISSA; YADAV; TEEBI, 1988; SANDER et al., 2003).
No caso relatado por Issa; Yadav; Teebi (1988), o indivíduo nos primeiros 18
meses de vida apresentou atraso no desenvolvimento psicomotor, onde letargia e os
30
episódios de confusão eram muito frequentes. Depois desenvolveu episódios breves
de coma, irritabilidade extrema e ataques breves de convulsões generalizadas
(ISSA; YADAV; TEEBI, 1988).
De acordo com um relato descrito por Brunetti-Pierri et al. (2012), um
indivíduo com citrulinemia clássica de início neonatal desenvolveu cardiomiopatia
hipertrófica progressiva e cataratas. Apesar do tratamento com dieta com restrição
proteica, suplementação de arginina e benzoato de sódio, ele experimentou
episódios repetidos de hiperamonemia devido a intercorrências da doença ou má
alimentação na dieta (BRUNETTI-PIERRI et al., 2012; QUINONEZ; THOENE, 2004).
De acordo com Quinonez; Thoene (2004), nenhum indivíduo diagnosticado com
CTLN1 clássica foi identificado com achados semelhantes, onde a necessidade de
vigilância permanece controversa até que mais indivíduos diagnosticados tenham
sido estudados.
Por fim, a mulher diagnosticada com CTLN1 também pode ter o início dos
sintomas da doença durante a gestação ou após o parto. De acordo com Potter et al.
(2004), uma mulher que foi identificada com CTLN1 através da triagem neonatal,
permaneceu assintomática por toda a vida, submetida a duas gestações bem-
sucedidas. De forma controversa, conforme relatado por Ito et al. (2004), uma
paciente com CTLN1 desenvolveu insuficiência hepática fulminante durante a
gravidez. A paciente havia experimentado ocasionalmente dor de cabeça, tontura e
distúrbios da consciência, posteriormente apresentou disfunção hepática grave, com
hiperamonemia. Sua condição permaneceu estável por um tempo; no entanto, sua
insuficiência hepática piorou gradualmente, e ela faleceu oito meses depois (ITO et
al., 2004).
3.3.1.2 Diagnóstico
O diagnóstico da CTLN1 nos dados laboratoriais é estabelecido pela análise
quantitativa de aminoácidos no plasma, revelando a ausência de argininossuccinato,
concentração plasmática de citrulina geralmente superior a 1.000 umol / L (normal:
31
A atividade da enzima ASS pode ser medida em fibroblastos, fígado e em
todos os demais tecidos em que a enzima está expressa, sendo que na citrulinemia
esta estará reduzida (QUINONEZ; THOENE, 2004). Mesmo a atividade enzimática
podendo ser detectada em muitos tecidos, é mais alta no fígado (HÄBERLE et al.,
2002). O ensaio da ASS através de método indireto em fibroblastos de pele cultivada
é um método sensível e conveniente opção para confirmar a deficiência dessa
enzima na citrulinemia clássica e, também para casos leves e assintomáticos de
citrulinemia (HÄBERLE et al., 2002).
3.3.1.3 Tratamento
Com relação ao tratamento, a CTLN1 exige uma vigilância a longo prazo com
diligente manejo nutricional e farmacológico, incluindo restrição proteica,
suplementação com L-arginina e de benzoato de sódio e/ou fenilbutirato para
aumentar a excreção de nitrogênio (BATSHAW; MACARTHUR; TUCHMAN, 2001;
HÄBERLE et al., 2012; QUINONEZ; THOENE, 2004).
Quando a hiperamonemia é identificada ou suspeita, deve-se suspender a
ingestão de proteínas por um período máximo de 24 a 48 horas (QUINONEZ;
THOENE, 2004). Esse período de restrição permite que a concentração de amônia
no plasma seja reduzida por meio de terapia de eliminação de nitrogênio e / ou
diálise, evitando um estado catabólico (QUINONEZ; THOENE, 2004).
A única terapia curativa conhecida é o transplante hepático, onde elimina a
necessidade de restrição proteica na dieta, porém não reverte qualquer sequela
neurológica que os indivíduos afetados possam ter no momento do transplante
(QUINONEZ; THOENE, 2004). O transplante hepático, que visa salvar a vida do
paciente, é recorrido quando o distúrbio progride para falência de órgãos e para
curar o defeito metabólico subjacente (KAYLER et al., 2002).
Em um estudo de Bindia; Eiroa (2017) foi relatado um caso de insuficiência
hepática recorrente em um lactente diagnosticado com CTNL1, sem a presença de
comprometimento neurológico grave.
3.4 Antioxidantes
A produção imoderada de radicais livres durante os processos metabólicos no
organismo levou ao desenvolvimento de muitos mecanismos de defesa antioxidante
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/gene/glossary/def-item/affected/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/gene/glossary/def-item/affected/
32
para limitar os níveis intracelulares e impedir a indução de danos. O sistema de
defesa antioxidante tem a função de inibir e/ou reduzir os danos causados pela ação
deletéria dos radicais livres (BARBOSA et al., 2010; BIANCHI; ANTUNES, 1999).
Os antioxidantes são substâncias que neutralizam os radicais livres, evitando,
assim, o dano oxidativo. Dois grupos principais de antioxidantes são reconhecidos:
enzimáticos e não enzimáticos (NDHLALA; MOYO; STADEN, 2010). Os
antioxidantes produzidos pelo corpo agem enzimaticamente, a exemplo da
Superóxido Dismutase (SOD), Glutationa Peroxidase (GSH-Px), Catalase (CAT),
Glutationa redutase (GR); ou, não enzimaticamente, como a glutationa, ubiquinona
(Coenzima Q10) e ácido úrico. Como antioxidantes também ressalta-se compostos
obtidos diretamente da dieta, tais como -tocoferol (Vitamina E), β-caroteno (pro-
vitamina-A), ácido ascórbico (vitamina C), e compostos fenólicos onde se destacam
os flavonoides e poliflavonoides (BARREIROS; DAVID, 2006; VASCONCELOS et
al., 2007).
Os polifenóis são do grupo dos flavonoides e constituem um grupo
heterogêneo, composto de várias classes de substâncias com propriedade
antioxidante. Essas substâncias estão presentes em vários alimentos e bebidas
(FRANKEL; WATERHOUSE; TEISSEDRESPT, 1995). Dentre os polifenóis destaca-
se o resveratrol que é produzido por várias plantas, principalmente uva e seus
derivados (FRÉMONT, 2000).
3.4.1 Resveratrol
O resveratrol (3,4',5-tri-hidroxiestilbeno) encontra-se nas formas cis e trans
isomérica (FRÉMONT, 2000; GAMBINI et al., 2015). Os isômeros cis e trans
coexistem nas plantas e no vinho, porém o cis-resveratrol nunca foi encontrado no
extrato de uva, sendo o trans a forma mais predominante e mais natural (GAMBINI
et al., 2015).
O resveratrol é uma fitoalexina do grupo dos polifenóis produzida
principalmente nos vegetais, em especial, em uva e seus derivados (FRÉMONT,
2000). Essa fitoalexina tem atraído interesse devido sua ação para o tratamento da
hiperlipemia (ARICHI et al., 1980). Esse antioxidante tem sido identificado em 72
33
espécies de plantas distribuídas em 31 gêneros e 12 famílias, muitas incluídas na
dieta humana como amoras, amendoins e uvas (ACQUAVIVA et al., 2002).
Estudos mostram que o resveratrol pode prevenir ou diminuir o avanço
patológico de diversas doenças, como: cardiovasculares (BRADAMANTE;
BARENGHI; VILLA, 2004), neurodegenerativas (ZAMIN et al., 2006), cancerígenas
(ATHAR et al., 2007; JANG et al., 1997), e que possui propriedades anti-
inflamatórias e antioxidantes (FILIP et al., 2003; KIRIMLIOGLU et al., 2007).
O resveratrol demonstrou modular o metabolismo dos lípidos e inibir a
oxidação de lipoproteínas, além de fornecer proteção cardiovascular, e também
possuir propriedades anti-inflamatórias e anticancerígenas (FRÉMONT, 2000). O
papel do resveratrol como fitoalexina é razão suficiente para se interessar por seu
estudo, e os recentes experimentos de transferência de genes já descritos apontam
para uma importante via de aplicações futura (SOLEAS; DIAMANDIS; GOLDBERG,
1997).
3.5 Metabolismo energético
O metabolismo energético é a soma de todas as reações químicas que
ocorrem em nível celular ou no organismo (NELSON; COX, 2011). Ele pode ser
divido em reações catabólicas, reações que produzem energia através da quebra de
biomoléculas, e em anabólicas, reações que utilizam energia e convertem em
biomoléculas maiores (SILVERTHORN, 2003).
Para produção de energia, o metabolismo utiliza três vias metabólicas, são
elas: sistema fosfogênico; glicólise e sistema oxidativo, sendo principal substância
intracelular usada como fonte de energia o trifosfato de adenosina, conhecido como
ATP (GUYTON, 2011; TIRAPEGUI, 2012).
A energia utilizada para a síntese de ATP é proveniente da degradação da
glicose, dos ácidos graxos e dos aminoácidos de fontes alimentares. Essas
substâncias alimentares reagem quimicamente com o oxigênio, sob influências
enzimáticas que controlam a intensidade e a velocidade das reações, liberando
energia (GUYTON, 2011).
A ATP é formada a partir de uma molécula de adenina e de ribose,
denominada adenosina, unida a três fosfatos. O difosfato de adenosina (ADP) é
34
formado quando a ATP liga-se à água, catabolizada pela enzima adenosina
trifosfatase (ATPase), clivando a ligação fosfato para liberar o fosfato inorgânico (Pi)
+ energia, como mostra a Figura 2 (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).
Figura 2: Hidrólise da ATP: ATP - Adenosina trifosfato; ADP - Adenosina difosfato; Pi - Fósfato inorgânico.
Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).
Essa reação gera uma quantidade significativa de energia, o que faz a ATP
ser um composto de fosfato de alta energia, porém as células contém uma
quantidade limita de ATP e, portanto, terão que ressintetizá-la continuamente,
conforme sua necessidade de utilização (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013;
POWERS; HOWLEY, 2005).
3.5.1 Sistema ATP-PCr
Essa fonte de energia é encontrada no estoque intramuscular na forma de
ATP e fosfocreatina (PCr), que juntos são denominados como sistema fosfogênico
(Sistema ATP-PCr). Tem como característica principal a energia imediatamente
disponível para o músculo, graças a ação altamente energética da PCr (MAUGHAN;
GLEESON; GREENHAFF, 2000; TIRAPEGUI, 2012).
O sistema ATP-PCr é o primeiro a ser ativado para reposição de ATP,
entretanto os estoques celulares de PCr são limitados, suprindo as células com
energia somente nos primeiros segundos de uma atividade física, onde não há
formação de ácido lático (TIRAPEGUI, 2012).
A utilização de energia das ligações fosfato na ATP e na PCr são
responsáveis em proporcionar fontes anaeróbicas de energia. A Figura 3 ilustra
esquematicamente o sistema ATP-PCr, onde a PCr doa, via hidrólise catalisada pela
enzima creatina-quinase, um grupo fosfato para a ADP, transformando-o em ATP e
35
se tornando uma molécula de creatina (GUYTON, 2011; MCARDLE; KATCH;
KATCH, 2013).
Figura 3: Hidrólise da fosfocreatina para geração de ATP. PCr – Fosfocreatina; ADP – Adenosina Difosfato; ATP – Adenosina trifosfato; Cr – Creatina.
Fonte: Adaptado de Mcardle; Katch; Katch, (2013).
Dados mostram que as células armazenam 4 a 6 vezes mais PCr do que
ATP, que a reação não necessita de oxigênio e alcança uma produção máxima de
energia em cerca de 10 segundos (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).
3.5.2 Glicólise
A via catabólica central é ligada a uma série de reações que converte a
molécula de glicose (C6H12O6), sob ações enzimáticas, em piruvato, e esse conjunto
de processos é denominado Glicólise, via independente de oxigênio, que por esse
fato garante a síntese rápida de ATP (SILVERTHORN, 2003; TIRAPEGUI, 2012). A
Glicólise ocorre no meio aquoso da célula, fora da mitocôndria (MCARDLE; KATCH;
KATCH, 2013).
Essa via representa a segunda fonte energética predominante a ser
utilizada após o inicio de uma atividade física (TIRAPEGUI, 2012). Como
mencionado anteriormente, o ponto final da glicólise é o piruvato, que representa um
metabólito de cruzamento que pode ser reduzido para formar lactato ou oxidado a
CO2 e H2O, dependendo do nível de energia e condições da célula (CABRERA;
SAIDEL; KALHAN, SATISH, 1999).
Essa via metabólica é divida em duas fases, conforme Figura 4, fase de
preparação (investimento energético) e fase de pagamento (geração de energia). Na
primeira fase é gasto duas moléculas de ATP onde a glicose é convertida através de
cinco passos enzimáticos, em duas moléculas de glicerol-3-fosfato. Na fase seguinte
são geradas quatro moléculas de ATP e duas nicotinamida adenina dinucleotídeo
(NADH), através de cinco passos enzimáticos (TIRAPEGUI, 2012).
36
Figura 4: Via Glicolítica.
Fonte: Adaptado de Tirapegui, (2012).
De acordo com a Figura 4, a via Glicolítica é regulada por reações
enzimáticas, que são responsáveis em regular o fluxo de substratos, são elas:
hexoquinase (1) , fosfofrutoquinase-1 (2) e piruvato quinase (3) (TIRAPEGUI, 2012).
A enzima hexoquinase é responsável pela ativação da glicose para reações
subsequentes, formando glicose-6-fosfato, uma reação irreversível em meio
intracelular. A enzima fosfofrutoquinase-1 forma frutose-1,6-bifosfato por catalisar a
transferência de um grupo fosforil do ATP para a frutose-6-fosfato. A última etapa
reguladora da glicólise é catalisada pela enzima piruvato quinase que transfere o
grupo fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP, com a formação de ATP e de piruvato
(MAUGHAN; GLEESON; GREENHAFF, 2000; NELSON; COX, 2011).
A via Glicolítica, como dito anteriormente, é considerada uma via
independente de oxigênio (O2), visto como uma reação anaeróbica, liberando cerca
de 5% apenas de energia existente dentro da molécula de glicose (MCARDLE;
KATCH; KATCH, 2013).
37
3.5.3 Ciclo do Ácido Cítrico (Ciclo de Krebs)
Proposto por Hans Adolf Krebs em 1937 (AKRAM, 2014), o Ciclo do Ácido
Cítrico (CAC) é a principal via metabólica e a via final para oxidação de carboidratos,
gorduras e aminoácidos. O ciclo consiste em oito reações enzimáticas, conforme
visto na Figura 5, resultando na formação de dióxido de carbono (CO2), trifosfato de
guanosina (GTP) e equivalentes redutores na forma de nicotinamida adenina
dinucleotídeo (NADH) e flavina adenina dinucleotídeo (FADH2) (BOWTELL et al.,
2007). A extração de energia da via Glicolítica para o ciclo de Krebs ocorre quando o
piruvato é transformado irreversivelmente em acetilcoenzima A (acetil-CoA), onde
esse composto é responsável pelo inicio do segundo estágio do fracionamento de
glicose (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).
Figura 5: Ciclo do Ácido Cítrico.
Fonte: Adaptado de Tirapegui, (2012).
O inicio das reações do CAC (ver Figura 5) é através da condensação do
acetil-CoA e oxaloacetato para formação de citrato, através da enzima citrato-sintase
(1). Em seguida a enzima aconitase (2) catalisa a isomerização do citrato em
isocitrato. A terceira etapa do ciclo é catalisada pela enzima isocitrato-desidrogenase
(3), a qual é responsável pela descarboxilação oxidativa do citrato para formar -
cetoglutarato e NADH. Em seguida é realizado outra descarboxilação oxidativa,
38
onde o composto -cetoglutarato é convertida em succinil-CoA e CO2 pela ação do
complexo -cetoglutarato-desidrogenase (4), sendo formado outro NADH. A quinta
etapa do ciclo é a clivagem de succinil-CoA em succinato, realizada pela enzima
succinil-CoA-sintetase (5) ou succinato-tiocinase (5). Após a formação do succinato,
ocorre sua oxidação à fumarato sob ação da flavoproteína succinato-desidrogenase
(6), formando também flavina-adenina dinucleotído reduzida (FADH2). Na penúltima
etapa do ciclo, a fumarase (7) catalisa a hidratação reversível do fumarato à malato.
Finalizando o CAC, a L-malato-desidrogenase (8), ligada ao NAD, catalisa a
oxidação de malato à oxalacetato, formando também NADH (AKRAM, 2014;
NELSON; COX, 2011).
Durante cada volta completa do ciclo formam-se três moléculas de NADH e
uma de FADH2 (MAUGHAN; GLEESON; GREENHAFF, 2000; POWERS; HOWLEY,
2005). O CAC é também responsável pela formação de um composto rico em
energia, a trifosfato de guanosina (GTP) (POWERS; HOWLEY, 2005).
A GTP é um composto que tem a permissão de transferir um fosfato para o
ADP e por consequência formar ATP. A formação direta dessa energia é
denominada fosforilação do substrato, porém é responsável pela menor parte de
formação de energia, uma vez que a parte principal de produção de energia é
decorrente da formação de NADH e FADH2 (POWERS; HOWLEY, 2005).
Como observado anteriormente na descrição do CAC, o oxigênio molecular
não participa ativamente desse processo, sendo o principal objetivo do CAC gerar
carreadores de elétrons como o NADH e FADH2, que posteriormente serão oxidados
para transferir elétrons para a cadeia de transporte de elétrons para formação de
ATP (MAUGHAN; GLEESON; GREENHAFF, 2000; POWERS; HOWLEY, 2005).
3.5.4 Cadeia de Transporte de Elétrons
Na Via Glicolítica, a presença de O2 determina o destino do produto final :
ácido pirúvico ou piruvato. Com o oxigênio, esse ácido é convertido em Acetil-CoA.
O Acetil-CoA entra no CAC, onde passa por uma série complexa de reações
químicas que permite a oxidação desse composto, sendo degradado em dióxido de
carbono (CO2) e hidrogênio (H+). Após, no final da cadeia, o H+ proveniente da
oxidação do NADH e FADH2 combina-se com o O2 para formar H2O e, dessa forma
39
impede a oxidação. Os elétrons que foram separados do H passam por uma série de
reações denominada cadeia de transporte de elétrons (WILMORE; COSTILL, 2001).
Na mitocôndria, com a presença de oxigênio, ocorre a produção de ATP,
denominada Fosforilação Oxidativa, que ocorre atrelada à cadeia de transporte de
elétrons, através da geração de um gradiente de prótons e de pH (ver representação
na Figura 6). A produção de ATP ocorre graças a um mecanismo que usa energia
disponível dos transportadores de hidrogênio reduzidos, como NADH e FADH2. Os
elétrons removidos dos átomos de hidrogênio são transportados pela cadeia de
transporte de elétrons, e durante essa processo é gerado energia suficiente para
refosforilar ADP em ATP (POWERS; HOWLEY, 2005).
Figura 6: Representação de transporte de elétrons.
Fonte: Adaptado de Wilmore; Costill, (2001).
Como mostra na Figura 6, a produção final de energia proveniente de uma
molécula de glicose, incluindo glicólise, CAC e cadeia respiratória é de 30 ou 32
moléculas de ATP. A quantidade de ATP produzida depende do tipo do sistema de
lançadeira que transfere equivalente redutores na mitocôndria, sendo de 32
moléculas de ATP, quando é utilizada a lançadeira malato-aspartato, é de 30
moléculas de ATP, ao utilizar a lançadeira glicerol fosfato (POWERS; HOWLEY,
2005).
40
Os carregadores de elétrons são oxidados e transferem elétrons para
complexos supramoleculares inseridos na membrana mitocondrial interna. Esse
processo compreende quatro complexos proteicos, todos responsáveis de catalisar
a transferência de elétrons, são eles: complexos proteicos (I, II, III, IV), que
trabalham uns com os outros através da ubiquinona (Q) e da proteína citocromo c
(MILLAR et al., 2011; NELSON; COX, 2011).
Complexo I
O Complexo I é também conhecido como NADH ubiquinona oxidorredutase,
tem a função de transferir quatro prótons da matriz para o espaço intermembrana e
também de transferir energia química para a Q (NELSON; COX, 2011). É
considerada a maior proteína do complexo, representa um local de entrada para
elétrons na cadeia de transporte de elétrons (KLODMANN et al., 2010).
Figura 7: Reação do Complexo I.
Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).
A Figura 7 resume a expressão do Complexo I, ilustra NADH sendo oxidado
para formar Ubiquinol (QH2), através da utilização da energia da transferência de
elétrons, onde a reação que ele catalisa é vetorial: movendo prótons da matriz
(tornando negativamente carregada com a saída de prótons) ao espaço
intermembrana (tornando positivamente carregado) (NELSON; COX, 2011).
Complexo II
A succinato-desidrogenase (SDH) é a única enzima do CAC ligada à
membrana. A SDH é uma das enzimas que compõem o CAC, responsável pela
oxidação do succinato à fumarato (HEAZLEWOOD; HOWELL; MILLAR, 2003;
NELSON; COX, 2011).
41
A ação da SDH resulta na formação de FADH2 no Complexo II, os dois
elétrons do FADH2 são transferidos diretamente para a Q, formando nesse processo,
o QH2, de acordo com a Figura 8 (EUBEL; JÄNSCH; BRAUN, 2003; NELSON;
COX, 2011).
Figura 8: Reação do Complexo II.
Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).
O Complexo II é formado por subunidades A e B, que contém três centros
2Fe-2S (2 ferros - 2 enxofres), FAD ligado e um sítio de ligação para o substrato, o
succinato. Também pelas subunidades C e D, contendo um grupo heme, heme b, e
um sítio de ligação para ubiquinona. O grupo heme b do Complexo II serve para
reduzir a frequência com que os elétrons migram para fora do sistema, reduzindo
assim a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), como o H2O2, e o O2o-
(NELSON; COX, 2011).
Complexo III
O Complexo III é também chamado de ubiquinona ou citocromo c
oxidorredutase e é responsável pela transferência de elétrons do ubiquinol (QH2)
para o citocromo c, com o transporte vetorial de prótons da matriz para o espaço
intermembrana (NELSON; COX, 2011). No total esse complexo transporta quatro
elétrons provenientes de duas moléculas de QH2 (SWEETLOVE et al., 2010).
Com base na estrutura e funcionalidade do Complexo III foi proposto para a
passagem de elétrons e prótons o ciclo Q, onde a equação resultante para as
reações redox é representada pela Figura 9 abaixo (NELSON; COX, 2011).
Figura 9: Reação do Complexo III.
Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).
42
O ciclo Q é responsável por acomodar a troca entre carregador de dois
elétrons ubiquinona e os carregadores de um elétron, citocromo c1 e c, onde o efeito
resultante de transferência é que QH2 é oxidado a Q, e duas moléculas de citocromo
c são reduzidas (NELSON; COX, 2011).
O citocromo c é uma proteína solúvel do espaço intermembrana. Sua principal
função é transferir os elétrons do Complexo III para o complexo IV, ou seja, não faz
parte de nenhum complexo da cadeia respiratória em particular (NELSON; COX,
2011; SWEETLOVE et al., 2010).
Complexo IV
O Complexo IV é designado também por citocromo-oxidase ou citocromo c
oxidase, representa a etapa final da cadeia respiratória. É uma enzima grande (13
subunidades) da membrana mitocondrial interna, traduzida por dois citocromos com
grupos heme (citocromos a e a3), e dois centros contendo cobre (CuA e CuB)
(NELSON; COX, 2011).
O Complexo IV inicia com o citocromo c, onde duas moléculas desse
citocromo reduzido doam um elétron para o centro CuA. O oxigênio liga-se ao heme
a3 e é reduzido a seu derivado peróxido. A chegada de mais dois elétrons a partir do
citocromo c converte em duas moléculas de água com o consumo de quatro prótons
da matriz (NELSON; COX, 2011).
Simplificando, a função do complexo IV é transferir os elétrons do citocromo
c para o oxigênio molecular, reduzindo-o à água, criando um gradiente eletroquímico
que é utilizado para sintetizar o ATP (MILLAR et al., 2004; PEIFFER; INGLE;
FERGUSON-MILLER, 1990).
O resumo do fluxo de elétrons e prótons através dos quatro complexos se
inicia com os elétrons chegando a Q através dos Complexos I e II, em seguida a Q
reduzida (QH2) transfere elétrons para o Complexo III que transfere ao citocromo c.
O Complexo IV reduz o O2 em H2O através da transferência de elétrons do
citocromo c. O fluxo de elétrons através dos Complexos I, III e IV é acompanhada
pela cadeia de prótons da matriz ao espaço intermembrana (NELSON; COX, 2011).
43
Figura 10: Cadeia de Transporte de elétrons.
Fonte: Adaptado de Nelson; Cox, (2011).
Na Figura 10, pode-se observar a representação esquemática da cadeia
transportadora de elétrons, onde mostra os Complexos I, III e IV, responsáveis por
bombear os H+ para o espaço intermembrana; o Complexo II (proteína de
membrana) e Q (Coenzima Q ou Ubiquinona), responsável por transportar elétrons
dos Complexos I e II ao Complexo III; Cit c (Citocromo c), responsável por
transportar os elétrons do Complexo III ao Complexo IV e, por último, a enzima ATP
sintetase, responsável por fosforilar o ADP em ATP (POWERS; HOWLEY, 2005).
3.5.5 Fosforilação Oxidativa
O sistema oxidativo, conhecido também como fosforilação oxidativa, é a via
metabólica mais duradoura e eficiente, podendo utilizar diferentes substratos
energéticos como, glicose, ácidos graxos e aminoácidos. Única via dependente de
oxigênio, por esse fato se torna um processo relativamente lento e o último a ser
requisitado para geração de energia (TIRAPEGUI, 2012).
Esse sistema de produção de energia celular é muito mais eficiente que o
sistema independente de oxigênio. A energia liberada na glicólise é rápida e não
requer oxigênio, porém relativamente pouco ATP é ressintetizado por esse
mecanismo. Consequentemente, as reações dependentes de oxigênio proporcionam
maior produção de energia apesar do ciclo para essa produção ser mais lento
(WILMORE; COSTILL, 2001).
44
Quando falamos de sistema oxidativo, logo pensamos em oxidação celular,
onde as reações de oxidação significam remoção de elétron e redução quando
aceitam elétrons. A formação de ATP ocorre durante as reações de oxidação e
redução (MCARDLE; KATCH; KATCH, 2013).
A fosforilação oxidativa sintetiza ATP pela transferência de elétrons de NADH
e FADH2, bombardeando os prótons através da membrana mitocondrial interna para
dentro do espaço intermembrana, tornando possível o mecanismo de acoplamento
que une ADP e um Pi para sintetizar ATP, e assim liberando energia (MCARDLE;
KATCH; KATCH, 2013).
45
4 INTERDISCIPLINALIDADE
Ao estudar a Citrulinemia, verifica-se a relação dessa doença com a saúde e
o meio ambiente, e o quanto esse pode ser afetado, seja direta ou indiretamente. O
presente estudo de Erro Inato do Metabolismo, abordando a patologia Citrulinemia,
relata uma doença genética hereditária (BICKEL, 1987; QUINONEZ; THOENE,
2004), que pode acometer membros de uma mesma família. Essa patologia pode
causar alterações cerebrais (CLANCY; CHUNG, 1991; MAESTRI; CLISSOLD;
BRUSILOW, 1995; QUINONEZ; THOENE, 2004) que acabam interferindo na relação
do indivíduo com membros da sociedade e com o ambiente de trabalho,
minimizando suas possibilidades de renda. Apresenta também risco de morte ao
nascer (BRENINGSTALL, 1986; CLANCY; CHUNG, 1991; QUINONEZ; THOENE,
2004), afetando a estrutura emocional da família.
Para trabalhar no tratamento dessa patologia, a presente pesquisa envolve o
estudo com o resveratrol, nesse sentido atrelada à diminuição do consumo de
fármacos usados até o momento para o tratamento da Citrulinemia, onde também
agridem o meio ambiente e causam efeitos indesejados aos pacientes. Esse
tratamento farmacológico usado atualmente, por consequência, tem gerado um
aumento de lixo industrial e tempo hospitalar, acarretando em uma crescente na
produção de lixo hospitalar. Além disso, o resveratrol poderá minimizar efeitos
indesejados da doença (ARICHI et al., 1980; FILIP et al., 2003; JANG et al., 1997;
KIRIMLIOGLU et al., 2007; ZAMIN et al., 2006) e melhorar a qualidade de vida do
indivíduo.
Com relação à economia, está relacionado ao aumento no consumo de fontes
de resveratrol (ACQUAVIVA et al., 2002), encontrada atualmente grande produção
de sua fonte no país, desencadeando uma melhora na economia do mesmo. Dessa
forma, o custo do tratamento da Citrulinemia seria mais acessível; além de poder
contribuir para uma diminuição no uso de serviços de saúde.
46
5 METODOLOGIA
5.1 Animais
Foram utilizados ratos machos Wistar de 60 dias de idade provenientes da
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Antes do processo de
experimentação, os animais foram acomodados e aclimatados por sete dias, para
adaptação em um novo ambiente. Foram mantidos em salas com ciclo de 12h
claro/escuro à temperatura mantida entre 20-22°C com livre acesso à comida
(ração) e água. Os animais foram mantidos em número máximo de quatro por gaiola
contendo maravalha. A frequência de troca de caixas foi a cada 2 dias. Os cuidados
com os animais seguiram o disposto na Lei nº11.794, de 8 de outubro de 2008, e
nas demais normas aplicáveis à utilização de animais em ensino e/ou pesquisa,
especialmente as Resoluções Normativas do Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal – CONCEA (BRASIL, 2008; MINISTÉRIO DA CIÊNCIA,
TECNOLOGIA).
As condições de ambiente, iluminação, acomodação e nutrição seguiram as
recomendações exigidas pelo “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,
1996”. A ração fornecida aos animais continha: proteína, 20%; carboidrato, 70%;
lipídeo, 10%; - (Nuvital Nutrientes, Curitiba-PR-Brazil).
5.2 Protocolo experimental
5.2.1 Estudos in vitro
Para estudos in vitro, estruturas cerebrais (córtex cerebral, cerebelo e
hipocampo) foram pré-incubadas por 1 hora a 37°C na presença de citrulina ou
amônia nas concentrações finais de 0.1, 2.5 e 5.0mM e 0.01, 0.1 e 1.0mM,
respectivamente, de acordo com o protocolo experimental de Prestes et al. (2006),
observe esquema na Figura 11. Experimentos de controle foram realizados com
solução salina. Neste estudo, as concentrações de L-citrulina foram utilizadas em
comparação com os valores observados em pacientes citrulinêmicos (ACHKAR et
al., 2013).
47
5.2.2 Prevenção com resveratrol
Para os experimentos in vitro, os ratos foram divididos em grupos: grupo 1
(controle-salina), grupo 2 (citrulina), grupo 3 (amônia), grupo 4 (controle-resveratrol
0.01 mM), grupo 5 (controle- resveratrol 0.1 mM), grupo 6 (controle- resveratrol 0.5
mM), grupo 7 (citrulina + resveratrol 0.01 mM), grupo 8 (citrulina + resveratrol 0.1
mM) e grupo 9 (citrulina + resveratrol 0.5 mM), grupo 10 (amônia + resveratrol 0.01
mM), grupo 11 (amônia + resveratrol 0,1 mM) e grupo 12 (amônia + resveratrol 0.5
mM), conforme ilustra da Figura 11. Após a adição dos compostos descritos acima,
os tubos de ensaio foram incubados por 1 hora a temperatura de 37C. Os
experimentos in vitro foram realizados com a utilização de hipocampo, córtex
cerebral e cerebelo de ratos.
As concentrações de resveratrol seguiram o protocolo descrito por Dos
Santos et al. (2006).
Figura 11: Protocolo do experimento in vitro.
Fonte: Dos Santos et al., (2006) e Prestes et al., (2006).
5.3 Estudos bioquímicos
5.3.1 Preparação do tecido
Os animais foram sacrificados por decaptação, o cérebro foi removido e o
córtex cerebral, o cerebelo e o hipocampo foram dissecados e mantidos em uma
placa de vidro gelada. As estruturas cerebrais foram homogeneizadas com tampão
adequado, de acordo com a técnica empregada. Homogeneizados foram preparados
48
usando um homogeneizador Potter-Elvehejem (Remi motores, Mumbai, Índia)
passando 5 pulsos, seguido de centrifugação a 3.000 x g por 15min a 4C antes de
descartar núcleos e restos celulares. O pellet foi descartado e o sobrenadante foi
guardado em alíquotas e armazenado a −80C para análise dos parâmetros do
metabolismo energético, conforme mostra o fluxograma na Figura 12.
Figura 12: Fluxograma de preparação do tecido.
Fonte: Elaborada pelo autor.
5.3.2 Atividade da Piruvato Quinase
A atividade da piruvato quinase foi determinada pelo método descrito por
Leong et al. (1981), conforme ilustra na Figura 13. O meio de incubação consistiu
em 0.1m de tampão Tris-HCl, pH 7.5, MgCl2 10.0 mM, NADH 0.16 mM, KCl 75 mM,
ADP 5.0 mM, 7,0 unidades de L-lactato desidrogenase, Triton X-100 a 0.1% (v / v) e
10 μL do sobrenadante, isento de mitocôndria, num volume final de 0.5 mL. A reação
foi iniciada após 30 min de pré-incubação pela adição de fosfoenolpiruvato 1.0 mM
(PEP). Os ensaios foram realizados à temperatura de 25ºC. Os resultados foram
expressos em μmol de piruvato formado por por minuto por miligrama de proteína.
49
Figura 13: Fluxograma da atividade da Piruvato Quinase.
Fonte: Leong et al., (1981).
5.3.3 Atividade da Citrato Sintase
A atividade da citrato sintase foi determinada pelo método descrito por Srere
(1969). De acordo com a metodologia ilustrada na Figura 14, adicionou-se 800 L
de tampão, 100 L de DTNB 1 mM, 40 L de acetil-CoA 2.5 mM, 10 L de triton 10%
e 10 L de amostra homogeneizada. Após aguardou-se dois minutos à temperatura
ambiente, adicionou-se 50 L de oxaloacetato 4 mM, homogeneizou-se e lêu-se em
espectrofotômetro durante três minutos no comprimento de onda de 412 nm.
Figura 14: Fluxograma da Atividade da Citrato Sintase.
Fonte: Srere (1969).
5.3.4 Atividade do Citocromo c oxidase
A atividade da citocromo c oxidase foi determinada pelo método descrito por
Rustin et al. (1994). De acordo com a ilustração da Figura 15, a atividade enzimática
50
foi medida observando a diminuição da absorvância devido à oxidação do citocromo
c previamente reduzido a 550 nm com 580 nm como comprimento de onda de
referência ( = 19,1 mM-1x cm-1). O tampão de reação continha 10.0 mM de fosfato
de potássio, pH 7.0, n-dodecil-β-D-maltosido 0.6 mM, 2-4 g de proteína
homogeneizada e a reação foi iniciada pela adição de 0.7 g de citocromo c
reduzido. A atividade da citocromo c oxidase foi medida a 25°C durante 10 min.
Figura 15: Fluxograma da atividade da citocromo c oxidase.
Fonte: Rustin et al. (1994).
5.3.5 Atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase
A atividade do Complexo II e da Succinato Desidrogenase (SDH) foram
determinadas pelo método descrito por Fischer et al. (1985), conforme Figura 16. As
dosagens foram realizadas em homogeneizados de cerebelo, córtex cerebral e
hipocampo, seguindo a diminuição da absorvância devido à redução de 2.6-
dicloroindofenol (DCIP) a 600 nm com 700 nm como comprimento de onda de
referência (= 19,1 mM-1 cm-1) na presença de metasulfato de fenazina (PMS). A
mistura da reação foi constituída por fosfato de potássio 40. 0 mM, pH 7.4, succinato
16.0 mM e DCIP 8 μM, foi pré-incubada com 40-80 g de proteína homogeneizada a
30°C durante 20 min. Posteriormente, para a atividade do complexo II, foi adicionado
azida sódica .,0 mM, rotenona a 7 μM e a reação foi iniciada pela adição de DCIP 40
μM e monitorizada durante 5 min. A atividade de SDH foi determinada no mesmo
meio de incubação por adição de PMS 1.0 mM e monitorizada durante 5 min.
51
Figura 16: Fluxograma da atividade do Complexo II e Succinato Desidrogenase.
.
Fonte: Fischer et al. (1985).
5.3.6 Dosagem de Proteínas
A determinação das proteínas foi realizada pelo método de Lowry et al. (1951)
conforme ilustração da Figura 17, utilizando-se albumina sérica bovina como
padrão.
Figura 17: Fluxograma da Dosagem de Proteínas.
Fonte: Lowry et al. (1951).
5.4. Análise estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada por análise de variância
(ANOVA), uma via utilizando o programa IBM Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS) for Windows version 20.0 in a PC compatible computer (IBM Corp.
Armonk, NY, USA).Foram considerados significativos valores de p
52
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES
6.1 Artigo:
RESVERATROL EFFECTS ON CEREBRUM ENERGY METABOLISM
ALTERATIONS CAUSED BY METABOLITS ACUMULATTED IN TYPE I
CITRULLINEMIA IN RATS
Karine Louize Vincenzi1, Larissa Delmônego1, Aline Lima1; Thayná Patachini Maia2,
Luana Carla Pscheidt3, Débora Delwing-Dal Magro4, Daniela Delwing-de Lima1,2*
1 Programa de Pós-Graduação em Saúde e Meio Ambiente, Universidade da Região
de Joinville– UNIVILLE, Rua Paulo Malschitzki,10- Zona Industrial Norte, CEP
89201-972, Joinville, SC, Brazil.
2Departamento de Medicina, Universidade da Região de Joinville– UNIVILLE, Rua
Paulo Malschitzki, 10- Zona Industrial Norte, CEP 89201-972, Joinville, SC, Brazil.
3Departamento de Farmácia, Universidade da Região de Joinville– UNIVILLE, Rua
Paulo Malschitzki, 10- Zona Industrial Norte, CEP 89201-972, Joinville, SC, Brazil.
4Departamento de Ciências Naturais, Centro de Ciências Exatas e Naturais,
Universidade Regional de Blumenau, Rua Antônio daVeiga,140,CEP 89012-900,
Blumenau, SC, Brazil.
*Address for correspondence: Dr. Daniela Delwing de Lima, Departamento de
Medicina, Universidade da Região de Joinville, Rua Paulo Malschitzki, 10 - Zona
Industrial Norte, CEP 89201-972, Joinville, SC, Brazil, Phone 55 47 3461 9112,
E-mail addresses [email protected]; [email protected].
mailto:[email protected]
53
ABSTRACT
We investigated the in vitro effects of citrulline (0.1, 2.5 and 5.0 mM), ammonia (0.01,
0.1 and 1.0 mM) and the influence of resveratrol (0.01 mM, 0.1 mM and 0.5 mM) on
pyruvate kinase, citrate synthase, succinate dehydrogenase (SDH), complex II and
cytochrome c oxidase in the cerebral cortex, cerebellum and hippocampus of 60 day-
old male Wistar rats. Results showed that 2.5 and 5.0 mM citrulline decreased
pyruvate kinase activity in the cerebral cortex and, at a concentration of 5.0 mM,
increased pyruvate kinase in the hippocampus. Additionally, 5.0 mM citrulline
increased citrate synthase in the cerebellum of rats. Citrulline (5.0 mM) reduced
complex II and cytochrome c oxidase in the cerebral cortex and hippocampus, but
did not alter SDH activity in any of the structures studied. With regard to ammonia, at
0.1 and 1.0 mM, ammonia decreased complex II activity in the cerebral cortex and
1.0 mM ammonia decreased this activity in the cerebellum and hippocampus.
Ammonia (1.0 mM) also decreased cytochrome c oxidase in the cerebral cortex and
cerebellum of rats, but did not alter pyruvate kinase, citrate synthase or SDH activity
in the cerebrum of rats. Resveratrol was able to prevent most of the alterations,
caused by these metabolites, in the biomarkers of energy metabolism measured in
the cerebrum of rats. Data suggest that these alterations in energy metabolism,
caused by citrulline and ammonia, are probably mediated by the generation of free
radicals, which can in turn be scavenged by resveratrol.
Keywords: Citrullinemia Type I; Citrulline; Ammonia; Energy metabolism;
Resveratrol.
54
1 INTRODUCTION
Citrullinemia Type I (CTLN1) is a rare hereditary urea cycle disorder,
characterized by deficiency in the activity of the enzyme, argininosuccinate
synthetase (ASS), which is responsible for catalyzing the formation of
argininosuccinate from citrulline and aspartate.1 This enzymatic deficiency results in
elevated plasma citrulline levels, as well as increased levels of ammonia and
glutamine and arginine depletion.2 Metabolic alterations of the urea cycle occur in 1:
30,000 live births and, among these, citrulinemia is considered a rare pathology with
an estimated incidence of 1: 57,000 live births.3,4 The most severe form of the
disease occurs in the neonatal period, with rapidly progressive encephalopathy and
death.5 The disease may also manifest later in childhood, with episodic
hyperammonemic encephalopathy and developmental delay.2,6 The accumulation of
ammonia in the blood and cerebrospinal fluid (CSF) can result in lethargy, vomiting,
irritability, decreased muscle tone, respiratory distress, cerebral edema,
hepatomegaly and seizures. If left untreated, CTLN1 may progress to coma, and
neurological abnormalities, and intellectual disability may also occur.7
According to Clancy and Chung,8 CTLN1 can lead to metabolic abnormalities in
the brain, including disturbances of cerebral energy metabolism, mitochondrial redox
state and amino acid metabolism. Furthermore, Prestres et al.9 reported that citrulline
and ammonia alter antioxidant capacity in the cerebral cortex of young rats, which
may reflect an involvement of oxidative stress in the neuropathology of citrullinemia.
However, the relationship between citrulline and the accumulation of ammonia in the
disease, and alterations in energy metabolism, are not well established. On the other
hand, studies have described reductions in brain ATP in adult animals exposed to
lethal doses of ammonium salts;10 furthermore, intoxication with high doses of
ammonia decreases concentrations of energy phosphates in the brain tissue of
mice11 and progressively decreases the activity of complex IV in the mitochondrial
respiratory chain.12
Resveratrol (3,5,4´ trihydroxystilbene) is a phytoalexin from the group of
polyphenols, and is produced mainly in plants, especially grapes and their
derivatives.13
Many studies have shown that resveratrol promotes mitochondrial
biogenesis, making cells more efficient in terms of energy production, and also
providing neuroprotective effects.14 Energy management may be affected by
55
mitochondrial imbalances caused by pathophysiological processes, such as oxidative
stress and/or inflammation. In this context, resveratrol, as a polyphenol, may exert
exogenous antioxidant/anti-inflammatory effects, modulating energy expenditure via
its action on AMP-activated protein kinase, therefore acting as an epigenetic
regulator or via regulation of the production of anti-inflammatory cytokines.15
Considering the rarity of urea cycle disturbances and the lack of scientific
studies of the pathogenesis of CTLN1, this study aimed to investigate the in vitro
effects of citrulline and ammonia and the influence of the antioxidant, resveratrol on
some parameters of energy metabolism in the cerebrum of 60-days-old Wistar rats.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1 Animals and Reagents
Adult male Wistar rats (60-days-old) obtained from the Federal University of
Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, Santa Catarina, Brazil, were used in the
experiments. Before the experiments, animals were accommodated and acclimatized
for 7 days, to adapt to their new environment. The animals were maintained on a 12
h light/12 h dark cycle at constant temperature (22 ± 1 °C), with free access to water
and commercial protein chow. The conditions of room lighting, accommodation and
nutrition followed the recommendations of the Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals, 2011.16 Animal care followed the provisions of Law no. 11794
(October 8, 2008) and other regulations applicable to the use of animals in teaching
and/or research, especially the Normative Resolutions of the National Council for the
Control of Animal Experimentation – CONCEA.8
All chemicals were purchased from Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA.
The experimental protocol was approved by the Ethics Committee for Animal
Research of the University of Joinville Region, Joinville, Brazil, under the protocol
number 010/2016 – PRPPG/CEP.
2.2 Experimental Protocols
2.2.1 In vitro Studies
56
For in vitro studies, cerebral structures (cerebral cortex, cerebellum and
hippocampus) were pre-incubated for 1 h at 37°C in the presence of citrulline or
ammonia at final concentrations of 0.1, 2.5 and 5.0 mM and 0.01, 0.1 and 1.0 mM,
respectively, according to the experimental protocol of Prestes et al.9 Control
experiments were performed with saline. In this study, concentrations of L-citrulline
were physiologically comparable to values observed in citrullinemic patients.17
2.2.2 Resveratrol Treatment
The assays were divided into 12 groups: Group 1 (control-saline), group 2
(citrulline), L-citrulline added at the concentrations of 0.1, 2.5 and 5.0 mM; group 3
(ammonia), ammonia added at concentrations of 0.01, 0.1 and 1.0 mM; group 4
(control-0.01 mM resveratrol); group 5 (control-0.1 mM resveratrol); group 6 (control-
0.5 mM resveratrol); group 7 (citrulline + 0.01 mM resveratrol), in which L-citrulline
was added at concentrations of 0.1, 2.5 or 5.0 mM with 0.01 mM resveratrol; group 8
(citrulline + 0.1 mM resveratrol), in which L-citrulline was added at the concentrations
of 0.1, 2.5 or 5.0 mM with 0.1 mM resveratrol; group 9 (citrulline + 0.5 mM
resveratrol), in which L-citrulline was added at the concentrations of 0.1, 2.5 or 5.0
mM with 0.5 mM resveratrol; group 10 (ammonia + resveratrol 0.01 mM), in which
ammonia was added at concentrations of 0.01, 0.1 or 1.0 mM with 0.01 mM
resveratrol; group 11 (ammonia + resveratrol 0.1 mM), in which ammonia was added
at concentrations of 0.01, 0.1 or 1.0 mM with 0.1 mM resveratrol; and group 12
(ammonia + 0.5 mM resveratrol), in which ammonia was added at concentrations of
0.01, 0.1 or 1.0 mM with 0.5 mM resveratrol.
Following the addition of the compounds, as described above, test tubes were
incubated for 1 hour at 37°C. In vitro experiments were performed using the
hippocampus, cerebral cortex and cerebellum of rats. Concentrations of resveratrol
followed the protocol described by Dos Santos et al.18, Fig. 1.
2.3 Biochemical studies
2.3.1 Tissue preparation
After decapitation of rats, the cerebrum was removed, and the cerebral cortex,
cerebellum and hippocampus were dissected and kept on an ice-cooled glass plates.
57
The cerebral structures were homogenized with appropriate buffer, according to the
technique employed. Homogenates were prepared using a Potter-Elvehejem
homogenizer (Remi motors, Mumbai, India) by passing 5 pulses, followed by
centrifugation at 800 x g for 10min at 4C, before discarding nuclei and cell debris.
The pellet was discarded and the supernatant was stored in aliquots at −80C for
assaying parameters of energy metabolism.
2.3.2 Pyruvate kinase activity
Pyruvate kinase activity was assayed, essentially as described by Leong et al.19
The incubation medium consisted of 0.1 M Tris–HCl buffer, pH 7.5, 10.0 mM MgCl2,
0.16 mM NADH, 75 mM KCl, 5.0 mM ADP, 7.0 units of L-lactate dehydrogenase,
0.1% (v/v) Triton X-100, and 10 µL of mitochondria-free supernatant in a final volume
of 0.5 mL. After a pre-incubation 30 min of 37°C, the reaction was started by the
addition of 1.0 mM phosphoenolpyruvate (PEP). Results are expressed as
micromoles of pyruvate per minute per milligram of protein.
2.3.3 Citrate synthase activity
The activity of citrate synthase was determined by the method described by
Srere.20 Accordingly, 800 µL buffer (1M Tris-HCL, pH 8), 100 µL 1mM DTNB, 40 µL
2.5 mM acetyl-COA, 10 µL 10% Triton and 10 µL of homogenized sample were
added. After 2 minutes at room temperature, 50µL of oxaloacetate (4 mM) were
added and changes in absorbance were observed during 3 minutes at a wavelength
of 412 nm. Results are expressed as nanomoles of citrate per minute per milligram of
protein.
2.3.4 Respiratory chain enzyme activities
SDH and complex II activities: The activities of succinate: phenazine
oxyreductase (soluble SDH) and complex II (succinate: DCIP oxyredutase) were
determined, according to methodology described by Fischer et al.,21 in homogenates
of cerebrum structures by measuring the decrease in absorbance due to the
reduction of 2,6-dichloroindophenol (DCIP) at 600 nm, with 700 nm as the reference
wavelength (=19.1 mM-1 cm-1), in the presence of phenazine methasulphate (PMS).
The reaction solution containing 40.0 mM potassium phosphate, pH 7.4, 16.0 mM
58
succinate and 8 M DCIP was preincubated with 40-80 g homogenated protein at
30C for 20 min. Subsequently, 4.0 mM sodium azide, 7 M rotenone and 40 M
DCIP were added. The reaction was initiated by the addition of 1.0 mM PMS and was
accompanied for 5 min. Results for complex II and SDH activity are expressed as
nanomoles of DCIP reduction per minute per milligram of protein.
Cytochrome c oxidase activity: The activity of cytochrome c oxidase was
determined according to Rustin et al.22 Enzymatic activity was measured by following
the decrease in absorbance due to oxidation of previously reduced cytochrome c at
550 nm, with 580 nm as the reference wavelength ( = 19.1 mM-1x cm-1). The
reaction buffer contained 10.0 mM potassium phosphate, pH 7.0, 0.6 mM n-dodecyl-
β-D-maltoside, and 2-4 g homogenate protein. The reaction was initiated by the
addition of 0.7 g reduced cytochrome c and monitored for 10 min. Results are
expressed as nanomoles of cytochrome c oxidized per minute per milligram of
protein.
2.3.5 Protein determination
Protein concentrations were determined by the method of Lowry et al.,23 using
bovine serum albumin as standard.
2.4 Statistical analysis
Statistical analyses were performed using the IBM Statistical Package for Social
Sciences (SPSS) for Windows, version 20.0, using a PC compatible computer (IBM
Corp. Armonk, NY, USA). The Kolmogorov-Smirnov normality test was performed,
demonstrating a parametric distribution. Subsequently, data were analyzed by
ANOVA, followed by the Duncan multiple range test, when the F-test was significant.
Values of p
59
at concentrations of 2.5 and 5.0 mM, significantly decreases pyruvate kinase activity
in the cerebral cortex [F(3,20)=5.757; p0.05] or hippocampus [F(3,20)=0.594; p>0.05] of rats, as
compared to the control groups. With regard to the respiratory chain, Fig. 1(D) and
Fig. 1 (E) show that citrulline (5.0 mM) reduced the activities of complex II and
cytochrome c oxidase in the cerebral cortex [F(3,20)=20.395; p0.05],
hippocampus [F(3,20)=1.528; p>0.05 and F(3,20)=0.178; p>0.05]; or cerebellum
[F(3,20)=0.595; p>0.05 and F(3,20)=0.157; p>0.05] of rats, respectively. With regard
to the respiratory chain, Fig. 2 (D) shows that 1.0 mM ammonia decreased complex II
in the cerebellum [F(3,20)=8.327; p
60
cerebral cortex [F(3,20)=23.616; p
61
Fig. 4 (A) and Fig. 4 (B) show that 0.01 mM resveratrol did not prevent the reduction
in complex II activity, while at concentrations of 0.1 and 0.5 mM, resveratrol partially
prevented the reduction in complex II activity caused by 1.0 mM ammonia in the
hippocampus [F(7,40)=13.222; p
62
structures analyzed. Pyruvate kinase (PK) is a thiol-enzyme that is fundamental for
the glycolytic pathway and energy production in the brain.27 This enzyme produces
pyruvate, which is irreversibly converted into acetyl-CoA, in turn initiating the
tricarboxylic-acid cycle (TCA).28 In the cerebral cortex, the reduction of this enzyme’s
activity impairs the glycolytic pathway and energy production, contributing to brain
damage. In the hippocampus, the increase in pyruvate kinase activity, caused by
citrulline, may be associated with activation of anaerobic pathways, with the aim of
contributing to cellular homeostasis.
The tricarboxylic-acid cycle (TCA) and the electron transport chain are
fundamental routes for the aerobic generation of cellular energy. According to Beal,29
the susceptibility to the impairment of energy metabolism may increase in tissues
with high-energy demands, such as the brain, which contains a large number of
mitochondria. This study statistically demonstrated that citrulline, at the concentration
of 5.0mM, increased citrate synthase activity in the cerebellum, but did not alter this
enzyme’s activity in the cerebral cortex and hippocampus of rats. However,
ammonia, at all concentrations used, did not alter this parameter in the rat cerebrum.
Citrate synthase, the first enzyme of the TCA, is inhibited by high concentrations of
ATP, acetyl CoA and NADH, when the cell energy supply is high.30 Therefore, the
increase in the activity of citrate synthase in the cerebellum may be associated with
an increase in ADP/ATP ratio, stimulating pathways of fuel oxidation, such as the
TCA cycle, in order to supply more NADH and FADH2 to the electron transport chain
to increase ATP levels.31
The enzyme, succinate dehydrogenase (SDH), is the only membrane-bound
TCA enzyme, and is located on the inner mitochondrial membrane, with the function
of transferring electrons directly into the electron transport chain, aiding the
production of energy.31,32 In this study, results showed that, in vitro, citrulline and
ammonia, at any of the concentrations used, altered the activity of this enzyme in the
rat cerebrum.
With regard to the respiratory chain, citrulline at a concentration of 5.0 mM
(the highest concentration used) reduced the activity of complex II and cytochrome c
oxidase in the cerebral cortex and hippocampus, but did not alter this enzyme’s
activity in the cerebellum. Ammonia, at a concentration of 1.0 mM, decreased the
activity of complex II in the cerebellum and in the hippocampus and, at
63
concentrations of 0.1 and 1.0 mM, decreased complex II activity in the cerebral
cortex. With regard to cytochrome c oxidase, ammonia (1.0 mM) decreased this
enzyme’s activity in the cerebral cortex and cerebellum, but did not alter this activity