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DETERMINACIÓN DE IMIDACLOPRID EN MIEL UTILIZANDO TÉCNICAS
ELECTROANALÍTICA Y CROMATOGRÁFICA
KARLA ESTEFANÍA RIVERA GUZMÁN
UNIVERSIDAD DE IBAGUÉ
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICAS
ADMINISTRACIÓN AMBIENTAL
IBAGUÉ
2018
DETERMINACIÓN DE IMIDACLOPRID EN MIEL UTILIZANDO TÉCNICAS
ELECTROANALÍTICA Y CROMATOGRÁFICA
KARLA ESTEFANÍA RIVERA GUZMÁN
PASANTÍA DE INVESTIGACIÓN PARA OPTAR AL TÍTULO DE
ADMINISTRADOR AMBIENTAL
Director: Olimpo José García Beltrán
Codirector: Lida Marcela Franco
Codirector: Edgar Orlando Nagles
UNIVERSIDAD DE IBAGUÉ
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICAS
ADMINISTRACIÓN AMBIENTAL
IBAGUÉ
2018
DEDICATORIA
A mis padres quienes con su amor y comprensión fueron mi mayor fortaleza para
lograr con éxito la meta propuesta.
A todas las personas que me motivaron y acompañaron en las circunstancias
vividas durante la realización de mi carrera.
AGRADECIMIENTOS
A mis padres por su apoyo afectivo, moral y material, que fueron fundamentales y
permitieron este importante logro.
A mis profesores Olimpo José García Beltrán, Edgar Orlando Nagles Vidal y Lida
Marcela Franco, por su guía y apoyo durante todo el proceso.
A la Universidad de Ibagué por financiar este trabajo de grado.
“EL AUTOR ES RESPONSABLE DE LAS IDEAS EXPUESTAS EN EL
PRESENTE TRABAJO” (SRT 12 RES. 02 – 2013)
CONTENIDO
pág
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 13
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 15
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA.................................................................................... 15
1.2 PREGUNTA PROBLEMA .................................................................................................. 15
2. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 17
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 18
3.1 OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................ 18
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 18
4. MARCO DE REFERENCIA ...................................................................................................... 19
4.1 MARCO CONCEPTUAL ..................................................................................................... 19
4.2 MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 20
5. METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 21
5.1 RECOLECCIÓN DE LA MIEL ............................................................................................ 21
5.1.1 Extracción de la miel .................................................................................................... 21
5.2 LA DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL PESTICIDA IMIDACLOPRID ...... 21
5.3 IDENTIFICACIÓN DE IMIDACLOPRID POR CROMATOGRAFÍA DE GASES
ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS ................................................................. 22
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................... 23
6.1 EXTRACIÓN DE LOS CONSTITUYENTES ORGÁNICOS PRESENTES EN LA .... 23
MIEL ............................................................................................................................................. 23
6.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS ELECTRODOS DE TRABAJO (SPCE, SPCE/NTC y
SPCE/NTC/LI) ............................................................................................................................ 24
6.2.1 Estudio por microscopía electrónica de barrido (SEM) ........................................... 24
6.2.2 Estudio por Impedancia electroquímica (EIS) .......................................................... 25
6.2.3 Estudio de los electrodos de trabajo .......................................................................... 26
6.3 PARÁMETROS ÓPTIMOS ................................................................................................. 28
6.3.1 pH ................................................................................................................................... 28
6.3.2 Velocidad de barrido .................................................................................................... 29
6.3.3 Curva de calibrado con muestra de prueba .............................................................. 30
6.3.4 Curva de calibrado de muestra real ........................................................................... 33
6.3.5 Estabilidad y vida útil del sensor ................................................................................ 34
6.4 IDENTIFICACIÓN DE IMIDACLOPRID POR CROMATOGRAFÍA DE GASES
ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS ................................................................. 35
7. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 36
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 37
11
LISTA DE TABLAS
pág
Tabla 1. Porcentaje de la composición de la miel .................................................. 21
Tabla 2. Electrodos modificados usados para detectar Imidacloprid. .................... 30
Tabla 3. Resultados de la muestra real ................................................................. 31
LISTA DE FIGURAS
pág
Figura 1. Estructura molecular del Imidacloprid ..................................................... 17
Figura 2. Imágenes SEM de morfología de a) SPCE b) SPCE/ NTC y c)
SPCE/NTC/LI ........................................................................................................ 22
Figura 3. Gráfico de Nyquist sobre SPC (a), NTC/SPCE (b) y SPCE/NTC/LI (c) de
K4Fe (CN)6 10,0 mmol L-1 en KCl 10,0 mmol L-1. .................................................. 23
Figura 4. Figura 3. Voltamperogramas cíclicos con electrodos serigrafiados dopados
con líquido iónico BMIMBF4 (1-Butil-3- metilimidazolio tetra-
tetrafluoroborato). Velocidad de escaneo 0,05 mV s-1. ......................................... 25
Figura 5. Voltamperogramas desde pH 2,3 hasta 6,8 a) corriente de pico versus
potencial b) corriente de pico versus pH. .............................................................. 26
Figura 6. Proceso de adsorción del Imidacloprid por medio de la velocidad de
barrido. .................................................................................................................. 28
12
Figura 7. (a) Voltamperogramas de barrido lineal (b) Curva de variación de
concentración de Imidacloprid desde 6 hasta 18 (mg/L). Condiciones: pH: 6,8 a
0,10 V por 60,0 s. Velocidad de escaneo 100,0 mV s-1. ........................................ 29
Figura 8. Voltamperogramas y curva de calibrado de la muestra 1 de la tabla 3
utilizando SPCE/ NTC. ........................................................................................... 31
Figura 9. a) corriente máxima frente al número de días para el tratamiento con LI y
b) corriente máxima versus número de días de seis electrodos diferentes para IMI
19,0 µmol L-1 en 7,0 pH PBS usando LI-SWNTC/SPC. ......................................... 32
LISTA DE ABREVIATURAS
IMI: Imidacloprid
LI: Líquido iónico
BMIMBF4: 1-Butil-3- metilimidazolio tetra- tetrafluoroborato
°C: Grados centígrados
L: Litros μL: Microlitros
mL: Mililitros
μg: Microgramos kg:
Kilogramos
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación V:
Voltios
UHPLC-MS/MS: Cromatografía líquida de ultra rendimiento - espectrómetro de
masas en tándem
DCM: Diclorometano
CV: Voltamperometría cíclica
QuEChERS: Método de extracción en fase sólida
SPCE: Electrodo sin modificar
NTC: Nanotubos de carbono
13
EIS: Estudio por impedancia electroquímica
μA: Microamperios μmol: Micromoles
SEM: microscopía electrónica de barrido ppm:
Partes por millón
INTRODUCCIÓN
Durante las últimas décadas el uso de pesticidas ha aumentado de forma
significativa, si bien su uso trae beneficios a la agricultura, muchos de ellos terminan
en lugares diferentes a su destino contaminando a su vez el suelo, cuerpos de agua
y alimentos1.
El pesticida Imidacloprid pertenece a la familia de los neonicotinoides, funciona por
medio de la unión y la estimulación de los receptores nicotínicos de acetilcolina en
el sistema nervioso central de los insectos.23-4 Es utilizado a nivel mundial por el
bajo nivel de toxicidad en los mamíferos y alta efectividad contra insectos.5-6
Debido a que es usado en semillas, plantas y suelos6 se cree que es responsable
de la decadencia de polinizadores de cultivos como abejas Apis mellifera L.,7 y
abejorros Bombus terrestres L., ha causado preocupación mundial8, su uso está
controlado por la comisión Europea quien determinó límites de residuos para
acetamiprid, clotianidina, imidacloprid, tiacloprid y thiamethoxam en el rango de
1 SOUZA, P., et al. Pesticides in honey: A review on chromatographic analytical methods. En:
Talanta. Marzo, 2016. vol 149, p. 124-141. 2 BAI., et al. Actions of imidacloprid and a related nitromethylene on cholinergic receptors of an identified insect motor neuron. En: Pestic. Sci. 1991. p. 197-204. 3 ). respuestas neurotóxicas en los tejidos del cerebro de la trucha 4 SONG., et al. Comparative toxicity of four insecticides, including imidacloprid and tebufenozide, to four aquatic arthropods. En: Environ. Toxicol. Chem. 1997. p. 2494-2500. 5 GOULSON, D., Review: an overview of the environmental risks posed by neonicotinoid
insecticides. En: J. Appl. Ecol. 2013. p. 977-987. 6 PHUGARE., et al. Microbial degradation of imidacloprid and toxicological analysis of its
biodegradation metabolites in silkworm (Bombyx mori). En: Chem. Eng. J.2013.p. 27-35. 6
ROUCHAUD., et al. Soil biodegradation and leaf transfer of insecticide imidacloprid applied in seed
dressing in sugar beet crops. En: Bull. Environ. 1994. p.344-350. 7 FAIRBROTHER., et al. Risks of neonicotinoid insecticides to honeybees. En: Environ. Toxicol. Chem. 2014. p. 719-731 8 WHITEHORN., et al. Neonicotinoid pesticide reduces bumble bee colony growth and queen
production. En: Science. 2012. p. 351–352
14
10-200 μg kg- 1 9.
El contacto de las abejas con neonicotinoides ocasiona la contaminación de los
productos y subproductos de las colmenas, en especial la miel, lo que es muy
preocupante debido al alto consumo humano de esta, que a largo plazo pude ser un
riesgo a la salud.
El Codex Alimentario define que la miel es un producto natural, la cual está hecha
con néctar, las secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos
chupadores de las partes vivas de las plantas, que abejas recolectan y transforman
combinándolas con sustancias específicas para luego depositarla en los panales10.
Las abejas se encargan de la polinización de los cultivos agrícolas y de las especies
nativas.
Infortunadamente las prácticas agrícolas que se manejan en la actualidad han
llevado al incremento del uso de pesticidas donde su principal beneficio (eliminación
de plagas) es contraproducente para las abejas y demás polinizador, debido a sus
propiedades.
Por lo anterior el objetivo de esta investigación es determinar la presencia del
pesticida Imidacloprid en miel utilizando técnicas electroanalíticas y
cromatográficas.
9 Base de datos de plaguicidas de la UE
http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/?event=activesubstance.selection , consultado
el: 2014.09.16. 10 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Codex Alimentarius. [en línea]. 2001 [citado el 17 de Marzo
de 2017]. Disponible en Internet: <http://www.fao.org/fao-who-
codexalimentarius/standards/liststandards/es/>
15
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA
Las abejas cumplen una función primordial para los ecosistemas terrestres ya que
son organismos vitales para el desarrollo y sostenimiento de cultivos y plantas
silvestres. En la actualidad, hay evidencia de la decadencia de estos polinizadores
y por lo mismo, también han disminuido las plantas que dependen de ellos11 debido
al uso excesivo de pesticidas.
La disminución de polinizadores como las abejas se vería reflejada en impactos
ecológicos y económicos negativos que podrían perjudicar considerablemente la
diversidad de plantas silvestres, el equilibrio de ecosistemas, agricultura, seguridad
alimentaria y bienestar humano12.
La exposición de las abejas a dosis subletales de pesticidas como el Imidacloprid
deterioran el comportamiento quimiorreceptivo involucrado en la búsqueda de
alimento, el aprendizaje olfatorio, la memoria y entre otras funciones cognitivas de
abejas de la miel13.
1.2 PREGUNTA PROBLEMA
Debido a la creciente preocupación por el destino de los polinizadores domésticos y
silvestres se han creado iniciativas especiales en el Convenio sobre la Diversidad
11 ASHMAN, T., et al. Pollen limitation of plant reproduction: ecological and evolutionary causes and consequences. En: Ecology. 2004. p. 2408-2421. 12 POTTS, S., et al. Global pollinator declines: trends, impacts and drivers. En: Cell press . Junio, 2010, vol 25, p. 345-353. 13 YANG, E-C., et 0061l. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of Imidacloprid in the larval satge. En: PloS One. 2002. p. E49472.
16
Biológica14, diversos programas continentales, nacionales y regionales para abordar
las cuestiones de declinación de polinizadores e investigaciones científicas15.
Por lo tanto, conociendo el problema expuesto nos hacemos el interrogante ¿Se
puede acumular el pesticida Imidacloprid en la miel de las abejas A. melifera por su
constante uso en los cultivos y ser detectado por técnicas analíticas?
14 GHAZOUL, J. Buzziness as usual? Questioning the global pollination crisis. En: Cell press. Julio,
2005, vol 20, p. 367-373. 15 POTTS. Op. cit., p. 345-353.
17
2. JUSTIFICACIÓN
El uso indiscriminado de pesticidas ha hecho que la ecología de insectos tenga un
impacto negativo, esto se evidencia con la disminución de estas poblaciones1617,
una de las más afectadas son las de los polinizadores, en especial A. mellifera. Esto
repercute tanto en la agricultura como en la industria alimenticia. En el caso de la
agricultura disminuyen los polinizadores, por ende afecta la productividad y en la
alimenticia debido a que los alimentos se encuentran contaminados y al ser
ingeridos pueden acumularse en los organismos lo que a largo plazo incide en
diferentes enfermedades.18
El presente trabajo tiene la importancia de identificar y cuantificar la presencia del
pesticida Imidacloprid en miel obtenida de colmenas alimentadas en presencia de
este agroquímico y el desarrollo de un sensor para su detección.
16 ALLEN-WARDELL, G., et al. The Potential Consequences of Pollinator Declines on the
Conservation of Biodiversity and Stability of Food Crop Yields. En: Conservation Biology. 1998. vol. 17 , no. 1, p. 8-17. 18 CELLI, G. Honeybees (Apis mellifera L.) as bioindicators for the presence of pesticide in the
agroecosystem. En: Field test. Ins. Soc. Life. 1996. p. 207 – 212
18
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar la presencia del pesticida Imidacloprid en miel utilizando técnica
electroanalítica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Extraer los constituyentes orgánicos presentes en la miel.
• Estandarizar la presencia del pesticida Imidacloprid mediante un método
electroquímico.
• Identificar la presencia de Imidacloprid mediante técnicas cromatográficas
19
4. MARCO DE REFERENCIA
4.1 MARCO CONCEPTUAL
Imidacloprid: Pertenece a la familia de los neonicotinoides, funciona por medio de la
unión y la estimulación de los receptores nicotínicos de acetilcolina en el sistema
nervioso central19. (Figura 1).
NO2
NH
Cl
Figura 1. Estructura molecular del Imidacloprid.
Plaguicidas: Según la FAO, los plaguicidas son cualquier sustancia o mezcla de
sustancias que están destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga20.
Miel: Es un producto natural, la cual está hecha con néctar, las secreciones de
partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores de las partes vivas
de las plantas, que abejas recolectan y transforman combinándolas con sustancias
específicas para luego depositarla en los panales21.
19 BAI., et al. Op. cit., p. 197-204. 20 FAO Pesticide Disposal Series. Roma. 1996, no. 4. ISSN 0251-1576. 21 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Op. cit., 1.
N N
N
20
Electroanalítica: Técnica química que estudia un analito midiendo el potencial
(voltios) y / o corriente (amperios) en una célula electroquímica que contiene el
analito22.
Cromatografía: Método físico de separación en el cual los componentes a ser
separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria
mientras la otra se mueve en una dirección definida. En un inició era utilizado para
compuestos volátiles que no se descompusieran al calentarse, en la actualidad es
usado en polímeros que al calentarse producen monómeros volátiles23.
4.2 MARCO TEÓRICO
En una revisión para determinar la presencia de plaguicidas en miel por medio de
diferentes métodos para el análisis cromatográficos se encontró que la
contaminación de la miel causada por la contaminación de plaguicidas genera
riesgos para la salud humana24, lo que es preocupante debido a que la miel es un
alimento muy consumido por tener muchas propiedades nutricionales y
antimicrobianas25. También se evidenció que son necesarias técnicas modernas
para determinar los plaguicidas.
En otro estudio se determinó que la pérdida de población de las abejas está
relacionada con la exposición de éstas a plaguicidas 26 , esto se logró con los
métodos de preparación de muestras GPC y d-SPE con Z-Sep donde Z-Sep fue el
mejor método.
22 SKOOG, D. A; WEST, D. M. y HOLLER, F. J. Fundamentals of Analytical Chemistry. En:
Harcourt Brace College Publishers. 1995. 23 BARQUERO, Miriam. En: Principios y aplicaciones de la cromatografía de gases. Costa Rica:
Editorial Universidad de Costa Rica, 2006. p. 56. 24 ZHOU, Qingxiang; DING, Yujie y XIAO, Junping. Sensitive determination of thiamethoxam,
Imidacloprid and acetamiprid in environmental water samples with solid-phase extraction packed
with multiwalled carbon nanotubes prior to high-performance liquid chromatography. EN: Analytical
and Bioanalytical Chemistry. Agosto, 2006. vol. 385, no. 8, p. 1520-1525. 25 ALMASAUDI, Saad B, et al. Antimicrobial effect of different types of honey on Staphylococcus
aureus. En: Saudi Journal of Biological Sciences. Septiembre, 2017. vol. 24, no. 6, p.1255-1261. 26 KEVAN, Peter; GRECO, Carlos F y BELAOUSSOFF, Svenja. Log-Normality of Biodiversity and
Abundance in Diagnosis and Measuring of Ecosystemic Health: Pesticide Stress on Pollinators on
Blueberry Heaths. En: Journal of Applied Ecology. Octubre, 1997. vol. 34, no. 5, p. 1122-1136.
21
Los estudios sobre la presencia de los pesticidas en miel y como afectan a la
población de polinizadores, se han desarrollado en su mayoría en Europa y Brasil,
donde Europa se ha desarrollado normatividad para regular la implementación de
estos y mitigar sus impactos, El método utilizado para determinar la presencia de
116 plaguicidas en miel ha sido el método UHPLC-MS/MS.
Aunque en el continente Europeo se haya desarrollado normatividad, cerca del 98%
de los pesticidas están aprobados para el uso dentro de la Unión Europea.
5. METODOLOGÍA
La caracterización por estudios electroquímicos se realizó en el laboratorio de
química aplicada de la Universidad de Ibagué, mientras que la identificación
cromatográfica se llevó a cabo en la Fiscalía general de la nación de la ciudad de
Ibagué.
5.1 RECOLECCIÓN DE LA MIEL
La miel se recolectó en el Apiario Fry ubicado en el corregimiento Totumo del
municipio de Ibagué-Tolima. Las abejas pertenecen a una investigación de la
profesora Lida Franco.
5.1.1 Extracción de la miel
De la miel recolectada en el área de estudio (tratamiento control sin dosis de
Imidacloprid y tratamiento con pesticida Imidacloprid) se tomaron las muestras de
cada uno de los núcleos de la exclusión A y B, A es el tratamiento control mientras
que B corresponde al tratamiento con pesticida Imidacloprid en el alimento
suministrado a las abejas. La miel fue almacenada en recipientes de plástico
estériles de volumen conocido, los cuales se trasladaron al Laboratorio de Química
Aplicada de la Universidad de Ibagué. A la miel recolectada se le realizó una
redisolución en agua y se extrajo mediante una extracción líquido-líquido con
diclorometano (DCM).
5.2 LA DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL PESTICIDA
IMIDACLOPRID
22
Se desarrolló con la técnica de voltamperometría cíclica (CV) con electrodos
serigrafiados de nanotubos de carbono de pared simple, usando un potenciostato
Dropssens µ400 STAT. Las medidas se desarrollaron con un sistema integrado de
tres electrodos: un electrodo auxiliar de carbono, un electrodo de referencia de plata
y un electrodo de trabajo de carbono. Se estudió el efecto del electrolito y pH para
determinar cuál es el mejor medio, la velocidad de barrido para conocer la
transferencia de carga y conocer el mecanismo de la reacción, la curva de calibrado
para conocer la sensibilidad y el límite de detección del pesticida dentro de la
muestra, el estudio de la impedancia electroquímica se realizó para caracterizar la
superficie del electrodo. Los voltamperogramas se correrán desde 0,0 hasta -1,6 V
con una velocidad de barrido de 0,1 V s-1. Con esta técnica se estandarizó la
identificación del compuesto con un patrón puro y luego se hizo la búsqueda de este
en la solución extraída.
5.3 IDENTIFICACIÓN DE IMIDACLOPRID POR CROMATOGRAFÍA DE
GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
Para determinar el posible contenido de pesticidas se utilizó el método QuEChERS.
Los constituyentes extraidos fueron identificados por medio de un cromatógrafo de
gases de marca Agilent Technologies 7890ª, acoplado a un detector selectivo de
masas y con un inyector automático AT 7863 (2µL) Split 30:1 (250°C). Para la
separación de la muestra se utilizó una columna capilar (DBWAX, DB-5MS). Con
fase estacionaria 0,25 µm, un diámetro de 250 mc y con un rango de masas de 45
– 450.
23
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 EXTRACIÓN DE LOS CONSTITUYENTES ORGÁNICOS PRESENTES EN
LA MIEL
Los constituyentes orgánicos presentes en la miel se componen básicamente de
diferentes azúcares de los cuales predominan la fructosa y la glucosa. También
tiene diferentes sustancias como ácidos orgánicos, en mayor medida el ácido
gluónico, ácidos ácetico, tartárico, láctico, cítrico, succínico, fórmico, maléico, málico
y fumárico, estos en menor concentración27. También enzimas y partículas sólidas
derivadas de la recolección. El sabor y el aroma de la miel dependen de su origen
(vegetal). Su color varía entre incoloro a pardo oscuro. La consistencia de la miel
puede ser total o parcialmente cristalizada, espesa o fluida28.
Los principales constituyentes de la miel se muestran en la tabla 1:
Composición de la miel (%)
Rango de Valor promedio Constituyentes variación
Agua 13,4 – 22,9 17,2
Fructosa 27,3 – 44,3 38,2
Glucosa 22,0 – 40,8 31,3
Sacarosa 1,7 – 3,0 2,4
Maltosa 2,7 – 16,0 7,3
Azúcares superiores 0,1 – 8,5 1,5
27 SUÁREZ-LUQUE, Silvia., et al. Rapid determination of minority organic acids in honey by
highperformance liquid chromatography. Mayo, 2002. vol. 955, no. 2, p. 207-214. 28 SANHUESA, Oscar. Caracterización química multifactorial de miel en relación a la infección por nosema ceranae en abejas, actividad antimicrobiana y origen geográfico del producto. [en línea]. Chile (Santiago). Universidad de Chile, 2016 [citado en 7 de Septiembre de 2018]. Disponible en Internet:
<http://repositorio.uchile.cl/bitstream/handle/2250/141628/Caracterizacion-quimica-multifactorial-demiel-en-relacion-a-la-infeccion-por-Nosema.pdf?sequence=1>.
24
Otros azúcares 0 – 13,2 3,1
Nitrógeno 0,05 – 0,08 0,06
Minerales 0,20 – 0,24 0,22
Ácidos libres 6-8 – 47,2 22
Lactonas 0 – 18,8 7,1
Ácidos totales 8,7 – 59,5 29,1
Tabla 1. Porcentaje de la composición de la miel.
6.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS ELECTRODOS DE TRABAJO (SPCE,
SPCE/NTC y SPCE/NTC/LI)
6.2.1 Estudio por microscopía electrónica de barrido (SEM)
Figura 2. Imágenes SEM de morfología de a) SPCE b) SPCE/ NTC y c) SPCE/NTC/LI
La figura 2 muestra las diferentes características morfológicas de los electrodos de
trabajo SPCE (a), SPCE/NTC (nanotubos de carbono) (b) y SPCE/NTC/LI (líquido
iónico) (c). En la figura 2a SPCE (sin modificación) se muestra una distribución
25
desordenada de grafitos, las grietas entre las partículas de grafito eran bastante
grandes lo que afectaba la conductividad del electrodo29.
En la imagen 2b se observa el SPC modificado con NTC. Se observó una superficie
con los aglomerados de NTC presentando una superficie de área mayor y en la
figura 2c muestra la superficie de SPCE/SWNTC recubierta con el líquido iónico (LI)
butil-metilimidazolio tetrafluorborato (BMIMBF4). Donde se observó una superficie
prácticamente consistente y homogénea que recubrió los nanotubos debido a que
tuvo una buena interacción. Resultados similares se presentaron en un trabajo
donde al utilizar imágenes SEM con x5000 para la detección de dopamina usando
un electrodo de quitosano SPCE/NTC/LI.
6.2.2 Estudio por Impedancia electroquímica (EIS)
Figura 3. Gráfico de Nyquist sobre SPC (a), NTC/SPCE (b) y SPCE/NTC/LI (c) de K4Fe (CN)6 10,0
mmol L-1 en KCl 10,0 mmol L-1.
Se realizó la medición de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) para
estudiar la resistencia al paso de la corriente de los electrodos sin modificar (SPCE)
y modificados (SPCE/NTC y SPCE/NTC/LI), en una solución que tiene un electrolito.
Los resultados se muestran en la figura 3. El electrodo sin modificación (curva
29 REN, Rui; LENG, Cuicui y ZHANG, Shusheng. A chronocoulometric DNA sensor based on
screen-printed electrode doped with ionic liquid and polyaniline nanotubes. En: Biosensors and
Bioelectronics. Mayo, 2010. vol. 25, no. 9, p. 2089-2094.
26
negra) SPCE tuvo una resistencia de 4200 Ω, fue el electrodo que más resistencia
presentó, el electrodo SPCE/NTC (curva roja) mostró menos resistencia bajando a
2500 Ω y el electrodo con nanotubos de carbono y liquido iónico SPCE/NTC/LI
(curva azul) tuvo la menor resistencia con 1800 Ω. Posiblemente, debido a que el
líquido iónico entrelaza los nanotubos y hace que sea más conductor. Las
mediciones de impedancia se llevaron a cabo en el potencial de circuito abierto
usando amplitud de perturbación de 10 mV y un rango de frecuencia entre 10,0 kHz
y 0,10 Hz.
6.2.3 Estudio de los electrodos de trabajo
Para este estudio se utilizó la técnica de voltamperometría cíclica con electrodos
serigrafiados dopados con líquido iónico SPCE/NTC/LI para detectar la señal del
Imidacloprid, se estudió la reducción de IMI 19,0 μmol L-1. Se observa en la figura
4, que en los tres casos se produjo la señal para IMI, (figura 4a) SPCE es sin
modificación, donde se observa un pico catódico a -1,05V con una corriente máxima
catódica de -5,10 μA. Este valor se asemeja a los resultados en trabajos de Majidi
et al30 y Chen et al31 (figura 4b) NTC’s con nanotubos no se observó señal pero al
adicionar LI, la señal de la reducción del imidacloprid presentó valores de -10,97 y -
18,63 μA, por otro lado la señal llegó a potenciales más positivos, de 1,3 y 1,26 V
respectivamente. En la figura 4c) BMIMBF/SPCE con líquido iónico tuvo una mayor
reducción de IMI, mostrando la mayor corriente catódica ya que tuvo un aumento
del 27% y potencial mostró valores menos positivos.
Según Zhao et al31, es posible que la interacción entre el Imidacloprid y el líquido
iónico sea más estable que con otros sustratos como polímeros. Esto requiere
mayor energía para reducir el Imidacloprid.
Por lo anterior, era seguro que la presencia del líquido iónico en la red de nanotubos
de carbono mejoraría la superficie del electrodo, permitiendo así que el Imidacloprid
30 MAJIDI, Mir Reza, et al. Determination of Imidacloprid in Tomato Grown in Greenhouse Based on
Copper(II) Phthalocyanine Modified Carbon Ceramic Electrode by Differential Pulse Voltammetry. En:
Journal of the Chinese Chemical Society. Enero, 2011. vol. 58, p. 207-214. 31 CHEN, Ming, et al. β-Cyclodextrin polymer functionalized reduced-graphene oxide: Application for
electrochemical determination Imidacloprid. En: Electrochimica Acta. Octubre, 2013. vol. 108, p. 1-9. 31
ZHAO, Lijuan, et al. Preparation of hydrophilic surface-imprinted ionic liquid polymer on multi-walled
carbon nanotubes for the sensitive electrochemical determination of imidacloprid. En: RSC Advances.
Enero, 2017. vol. 8, p. 4704-4709.
27
tuviera una reducción más eficaz. El electrodo SPCE/NTC/LI se eligió para realizar
los estudios posteriores.
Figura 4. Voltamperogramas cíclicos con electrodos serigrafiados dopados con líquido iónico
BMIMBF4 (1-Butil-3-metilimidazolio tetra-fluoroborato). a) SPCE (curva negra) y LI/SPCE (curva
28
roja), b) NTC/SPCE (curva negra) y LI-NTC/SPCE (curva roja) y c) LI/SPCE (curva negra) y
LINTC/SPCE (curva roja). Velocidad de barrido 0,05 V s -1.
6.3 PARÁMETROS ÓPTIMOS
6.3.1 pH
Figura 5. Voltamperogramas desde pH 2,3 hasta 6,8 a) corriente de pico versus potencial b)
corriente de pico versus pH.
El efecto del pH sobre la reducción del Imidacloprid se realizó para encontrar las
corrientes catódicas más altas con 19,0 μmol L-1, este estudio también se hizo por
el método de voltamperometría cíclica con electrodos de trabajo SPCE/SWNTC/LI.
El rango de pH estudiado fue desde 2,3 hasta 6,8 la figura 5 muestra los
voltamperogramas.
El estudio de Imidacloprid se empezó con la adición de 50 µl de buffer para
estabilizar el pH, posterior a esto el primer pH utilizado fue de 2,3 seguido por 3,0,
a) b )
29
4,0, 4,9, 5,9 y 6,8 donde como se muestra en la figura 5a, las corrientes máximas
catódicas aumentaron en 4,9, 5,9, 6,8, 5,9 y 6,8 y las posiciones fueron las
siguientes respectivamente: (-5,031µA -1,30V), (-7,24µA 1,27V), (-18,5µA -1,26V).
Con pH mayores, la corriente máxima catódica disminuye notablemente.
En otros estudios donde fueron utilizados diferentes electrodos modificados como
el óxido de grafeno en el electrodo de carbono vítreo32, la ftalocianina de cobre (II)
en electrodo de cerámica de carbono 33 y electrodo de carbono - cerámica
modificado con líquido iónico34; eligieron un pH cercano a 7,0 como ideal. Por lo
anterior, elegimos el pH 6,8 para futuros estudios.
6.3.2 Velocidad de barrido
Este análisis se hizo con el objetivo de observar como es el transporte de masa,
para esto se realizó un estudio variando la velocidad entre 70 y 160 mV s -1 y así
establecer qué proceso controla el transporte de masa en la reacción de reducción
del Imidacloprid 19,0 μmol L-1 utilizando SPCE/SWNTC/LI. En la Figura 6 se muestra
el voltamperograma donde la corriente aumentó al variar la velocidad de barrido
desde 0,07 v/s (-1,15µA -1,18V), 0.09 v/s (-1,75µA -1,22V), 0,1 v/s (2,15µA -1,25V),
0,11v/s (2,87µA -1,23V) y 0,16 v/s (-4,27 µA -1,26V). La ecuación de regresión para
las corrientes máximas fue Ipc = -1,308 + 0,08535ʋ (coeficiente de correlación R2 =
0,990). Esto indica que el proceso es controlado por adsorción, es posible que el
líquido iónico actúe como un agente extractor.
Un estudio donde se utilizó grafeno reducido en un electrodo de carbono vítreo sin
líquido iónico para detectar Imidacloprid34 obtuvo resultados similares, por otro lado
un estudio en el que usando líquido iónico con un electrodo de cerámica de carbono
32 LEI, Wu, et al. Electrochemical determination of imidacloprid using poly (carbazole)/chemically reduced
graphene oxide modified glassy carbon electrode. En: Sensors and Actuators B: Chemical. Julio, 2013. vol. 183,
p. 102-109. 33 MAJIDI, Determination of Imidacloprid in Tomato Grown in Greenhouse Based on Copper(II)
Phthalocyanine Modified Carbon Ceramic Electrode by Differential Pulse Voltammetry, Op. cit., p. 207. 34
MAJIDI, Mir Reza; FADAKAR BAJEH BAJ, Reza y BAMOROWAT, Mehdi. Ionic liquid modified carbon-ceramic
electrode with structure similar to Graphene nanoplatelets: Application to Imidacloprid determination in
some agricultural products. En: Measurement. Noviembre, 2016. vol. 93, p. 29-35. 34 LEI, Electrochemical determination of imidacloprid using poly (carbazole)/chemically reduced graphene
oxide modified glassy carbon electrode, Op. cit., p. 105.
30
mostró que el proceso era controlado por difusión 35 . Por consiguiente las
propiedades del líquido iónico dependen en gran parte del sustrato donde se trabaje.
Figura 6. Proceso de adsorción del Imidacloprid por medio de la velocidad de barrido.
6.3.3 Curva de calibrado con muestra de prueba
Para verificar la sensibilidad del electrodo al detectar el pesticida Imidacloprid se
hicieron pruebas en mieles comerciales con cantidades conocidas del pesticida.
Empezamos con un electrodo SPCE/SWNTC/LI al que se le adicionó 30 μL de
buffer 6,9 al que se le fue adicionando en repetidas ocasiones 10 μL de
Imidacloprid.
La figura 7 muestra los voltamperogramas de barrido lineal y la curva de variación
de concentración de Imidacloprid.
Las condiciones que se tuvieron en cuenta fueron: pH 7,0 a 0,10 V por 60,0 s; la
ecuación de regresión fue Ip = -9,422 + 2,11CIMI (coeficiente de correlación R2 =
35 MAJIDI, Ionic liquid modified carbon-ceramic electrode with structure similar to Graphene nanoplatelets:
Application to Imidacloprid determination in some agricultural products, Op. cit., 33.
60 80 100 120 140 160
0 , 1
, 1 5
2 , 0
2 5 ,
, 0 3
5 , 3
, 0 4
4 5 ,
mV s -1
)
a )
31
0,989 con límites de detección 3σ / b donde σ es el error aleatorio en x e y, y b es la
pendiente fue 0,21 mg L-1 (0,84 μmol L- 1)) para el Imidacloprid.36
A continuación se muestra la tabla 2 con diferentes metodologías para la detección
de Imidacloprid con límites de detección entre 0,020 y 2,93 μmol L- 1.
25
Figura 7. (a) Voltamperogramas de barrido lineal (b) Curva de variación de concentración de
Imidacloprid desde 6 hasta 18 (mg/L). Condiciones: pH: 6,8 a 0,10 V por 60,0 s. Velocidad de
escaneo 100,0 mV s -1.
Electrodo Materiales Límite de
detección
(µmol L-1)
Aplicación
GCE3738 BiF (BiFE) 2,93/ 0,73
µg/cm3
IMI
(insecticida)
CPE39 IMI
36 MOCAK, J., et al. A statistical overview of standard (IUPAC and ACS) and new procedures for determining
the limits of detection and quantification: Application to voltammetric and stripping techniques. En: The
Scientific Journal of IUPAC. Enero, 2009. vol. 69, no. 2, p. 297-328. 37 GUZSVÁNY, Valéria, et al. Monitoring of Photocatalytic Degradation of Selected Neonicotinoid Insecticides
by Cathodic Voltammetry with a Bismuth Film Electrode. En: Electroanalysis. Enero, 2008. vol. 20 no. 3, p. 38 -300. 39 Ibíd., p. 295. 40
CHEN, β-Cyclodextrin polymer functionalized reduced-graphene oxide: Application for electrochemical determination imidacloprid, Op. cit. p. 6.
32
GCE40 β-CDP/rGO 0,02 IMI
CCE40
CuPc
0,28
Formulación
comercial y
muestras
de tomate.
GCE41
(nAgnf/nTiO2nf/GC
E)
0,93 Formulación
comercial
GCE42 PCz/CRGO 0,22 IMI
(insecticida)
CCE4344 AMIM-BF4 0,031 Productos
agrícolas
CPE45 (MIP / GN / GCE) 0,10 Muestras de
arroz
GCE45 (PoPD-
RGO/GCE)
0,40 Muestras de
fruta
GCE46 MIP 0,08 Muestras de
fruta (IMI)
40 MAJIDI, Determination of Imidacloprid in Tomato Grown in Greenhouse Based on Copper(II)
Phthalocyanine Modified Carbon Ceramic Electrode by Differential Pulse Voltammetry, Op. cit., p. 213. 41 KUMARAVEL, A y CHANDRASEKARAN, M. Electrochemical determination of imidacloprid using nanosilver
Nafion®/nanoTiO2 Nafion® composite modified glassy carbon electrode. En: Sensors and Actuators B:
Chemical. Noviembre, 2011. vol. 158, no. 1, p. 319-326. 42 LEI, Electrochemical determination of imidacloprid using poly(carbazole)/chemically reduced graphene
oxide modified glassy carbon electrode, Op. cit., p. 102. 43 MAJIDI, Mir Reza; HOSSEINPOURNAGHI-AZAR, Mohammad y FADAKAR BAJEH BAJ, Reza. Graphene
nanoplatelets like structures formed on ionic liquid modified carbon-ceramic electrode: As a sensing platform
for simultaneous determination of dopamine and acetaminophen. En: Journal of Molecular Liquids. Agosto,
2016. vol. 220, p. 778-787. 45
ZHANG, M, et al. Molecularly imprinted polymer on graphene surface for selective and sensitive electrochemical sensing imidacloprid. En: Sensors and Actuators B: Chemical. Noviembre, 2017. vol. 252, p. 44 -1002. 45 KONG, Lei, et al. Moleculary imprinted sensor based on electropolmerized poly(o-phenylenediamine)
membranes at reduced graphene oxide modified electrode for imidacloprid determination. En: Sensors and
Actuators B: Chemical. Agosto, 2013. vol. 185, p. 424-431. 46 ZHAO, Preparation of hydrophilic surface-imprinted ionic liquid polymer on multi-walled carbon nanotubes
for the sensitive electrochemical determination of imidacloprid, Op. cit., p. 4709.
33
CPE4748 Fosfato de
tricresilo
0,52 Formulación
comercial
SPCE/SWNTC 49
Líquido iónico 0,84 Miel
Tabla 2. Electrodos modificados usados para detectar Imidacloprid.
6.3.4 Curva de calibrado de muestra real
Ya con los parámetros establecidos para el electrodo se utilizó para determinar la
presencia del Imidacloprid en la miel proporcionada para el estudio del presente
trabajo, la miel tenía cantidades conocidas del pesticida (0,025 ppm de IMI).
Los voltamperogramas observan en la figura 8 y los resultados obtenidos se
muestran en la tabla 3, estos resultados mostraron un error relativo menor al 10%
lo que quiere decir que el electrodo es óptimo en altas y bajas concentraciones del
Imidacloprid.
Muestra Adición (mg L-1) Detección (mg L-1) Error relativo (%)
1* 1,21 1,15 -4,95
2 60 65,78 9,63
Tabla 3. Resultados de la muestra real.
*Voltamperogramas y curva de calibrado en la figura 8.
47 PAPP, Zsigmond, et al. Voltammetric determination of imidacloprid insecticide in selected samples using a
carbon paste electrode. En: Microchimica Acta. Julio, 2009. vol. 166, no. 1-2, p. 169-175. 48 El presente trabajo
34
Figura 8. Voltamperogramas y curva de calibrado de la muestra 1 de la tabla 3 utilizando SPCE/
NTC.
6.3.5 Estabilidad y vida útil del sensor
Los estudios realizados mostraron que la corriente pico catódica para IMI cambió en
función del tiempo de deposición de LI en el electrodo SWNTC/SPC. La figura 9a
muestra las corrientes pico catódicas para IMI como una función del tiempo de
depósito de LI. Los resultados mostraron que la corriente era más estable después
de tres días de deposición de LI a 60oC. En días más altos, la corriente de pico
catódica disminuye exponencialmente. Posiblemente, la superficie de SWNTC/SPC
está saturada y forma una superficie que bloquea la transferencia de carga. Dos
días de depósito de LI a 60°C se eligió como óptimo. La Fig. 9b muestra la gráfica
de las corrientes pico catódicas frente al número de días para 19,0 µmol L-1 de IMI
en una solución de pH PBS 7,0 usando seis electrodos LISWNTC/SPC electrodos.
Los resultados mostraron una buena reproducibilidad del 2,6% calculada como la
desviación estándar relativa. La estabilidad del electrodo modificado se estudió con
el mismo electrodo modificado utilizado para reducción de IMI por seis días.
Los resultados mostraron que el mismo electrodo no se puede usar por más de dos
Mediciones sin sufrir una pérdida considerable de actividad.
35
Figura 9. a) Corriente máxima frente al número de días para el tratamiento con LI y b) corriente
máxima versus número de días de seis electrodos diferentes para IMI 19,0 µmol L-1 en 7,0 pH PBS
usando LI-SWNTC/SPC.
6.4 IDENTIFICACIÓN DE IMIDACLOPRID POR CROMATOGRAFÍA DE
GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
De acuerdo al procedimiento de extracción por QuEChERS y posterior identificación
por Cromatográfia Gaseosa Acoplada por Espectrometría de Masa no se pudo
identificar Imidacloprid en los cromatográmas obtenidos, esto pudo deberse a la baja
concentración que posiblemente habría en la miel o por. Además, es posible que al
adicionar el coctel de sales pudo haberse descompuesto el compuesto.
36
7. CONCLUSIONES
Del presente trabajo se puede concluir:
• Se pudo detectar la presencia del pesticida Imidacloprid por medio de
electroanalítica, primero caracterizando el electrodo para que fuera optimo,
para el análisis se utilizó voltamperometría cíclica. Posterior a esto, se
buscaron los parámetros óptimos para estandarizar la presencia del pesticida
en la miel de la exclusión B donde las abejas fueron alimentadas con la
adición del pesticida.
• El límite de detección en diferentes estudios se encontró que estaban entre
0,020 y 2,93 μ mol L-1 con electrodos modificados con mayor rigor, por esto
el límite de detección del electrodo SPCE/SWNTC/LI es aceptable.
• El parámetro óptimo del pH fue de 6,8 debido a que los electrones que se
reducen lo hacen de una manera más fácil.
• Al realizar el estudio de validación con la miel comercial el potencial de
reducción para el Imidacloprid estuvo en valores potenciales más positivos,
esto puede ser debido a un efecto de la matriz en la muestra.
37
• No fue posible obtener resultados por medio de cromatografía líquida debido
a que al pasar por un proceso de redisolución con diclorometano, puede que
se pierda parte de la muestra.
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