KAPILARNA KAPILARNA ELEKTROFOREZAELEKTROFOREZA

Mladen Krsnik, univ.dipl.kem., spec.med.biokem.KC Ljubljana, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo

16. Strokovni sestanek Hematološkega društva laboratorijskih tehnikovKranjska Gora, 13., 14. april 2007

Vsebina predavanjaVsebina predavanja

Predstavitev kapilarne elektroforeze (CE)Predstavitev kapilarne elektroforeze (CE)Uporabnost CE v kliniUporabnost CE v kliniččni kemiji ni kemiji –– prednost prednost avtomatizacija avtomatizacija Primeri doloPrimeri določčevanja preiskave Sevanja preiskave S--MonoklonskiMonoklonskiimunoglobuliniimunoglobulini

*

*EOF; elektro-osmotski tok

‘NOTRANJOST’ KAPILARE

EOF EOF –– ElektroElektro--osmotski tokosmotski tokPod EOF si predstavljamo gibanje ionov v topilu v ozki kapilari,Pod EOF si predstavljamo gibanje ionov v topilu v ozki kapilari, kjer kjer

elektrielektriččna napetost v kapilari povzrona napetost v kapilari povzročča migracijo ionov, molekul.a migracijo ionov, molekul.ČČe so kapilare narejene iz kremena (SiO2) so najvee so kapilare narejene iz kremena (SiO2) so največčkrat na notranjo krat na notranjo stene kapilare vezane stene kapilare vezane silanolnesilanolne skupine. Skupine so negativno nabite. Ko skupine. Skupine so negativno nabite. Ko pride v kapilaro vzorec, se pozitivni delci vepride v kapilaro vzorec, se pozitivni delci vežžejo na negativno steno ejo na negativno steno kapilare in s tem nastane dvojna plast. Kapilaro prikljukapilare in s tem nastane dvojna plast. Kapilaro priključčimo na elektriimo na električčno no napetost in vzorec zanapetost in vzorec začčne potovati proti katodi. Ko se molekula odlepi od ne potovati proti katodi. Ko se molekula odlepi od stene kapilare, pusti za sabo prazen prostor in vanj zaplavajo mstene kapilare, pusti za sabo prazen prostor in vanj zaplavajo manj anj pozitivne molekule, ki se prej niso uspele vezati na steno kapilpozitivne molekule, ki se prej niso uspele vezati na steno kapilare. Temu are. Temu toku retoku reččemo EOF.emo EOF.

Zelo pomembna je pravilna uporaba pufra.Zelo pomembna je pravilna uporaba pufra.pHpH –– zelo mozelo moččno vpliva na EOF, paziti, da se ne spremenijo strukture no vpliva na EOF, paziti, da se ne spremenijo strukture molekulmolekulIonska jakostIonska jakost –– nizka ionska jakost povzronizka ionska jakost povzročči, da se vzorec vei, da se vzorec vežže na e na kapilare, visoka pa, da se vzorec ne more vezati. Posledica tegakapilare, visoka pa, da se vzorec ne more vezati. Posledica tega je je uporaba mouporaba moččnejnejšše el. napetosti, kar pa povzroe el. napetosti, kar pa povzročča segrevanje kapilare a segrevanje kapilare (Joule(Joule--ovoovo segrevanje).segrevanje).

CE v kliniCE v kliniččni kemijini kemiji

Uporaba CE za analizo bioloUporaba CE za analizo biološških vzorcev: kih vzorcev: plazma, serum, plazma, serum, likvorlikvor, eritrociti, urin, solze, , eritrociti, urin, solze, punktatipunktati telesnih votlin,telesnih votlin,……DoloDoloččanje/separacija beljakovin, anje/separacija beljakovin, oligopeptidovoligopeptidov, , zdravil, razlizdravil, različčnih nih metabolitovmetabolitov ((uraturat, , kreatininkreatinin, , seseččnina,nina,……), DNK, RNK,), DNK, RNK,……

ANALIZATOR ZA KAPILARNO ANALIZATOR ZA KAPILARNO ELEKTROFOREZOELEKTROFOREZO

SEBIA SEBIA –– CAPILLARYS 2CAPILLARYS 2

Avtomatiziran analizator za separacijo beljakovin.Avtomatiziran analizator za separacijo beljakovin.Preiskave, ki jih opravljamo na analizatorju:Preiskave, ki jih opravljamo na analizatorju:

SS--Elektroforeza proteinovElektroforeza proteinovSS--MonoklonskiMonoklonski imunoglobuliniimunoglobulini (prej samo IF*)(prej samo IF*)SS--%CDT%CDT

*IF *IF šše vedno zlati standard za doloe vedno zlati standard za določčanje mIg.anje mIg.

Letno Letno šštevilo preiskavtevilo preiskav

LetoS-Elektroforeza

proteinovS-Monoklonskiimunoglobulini

2003 12898 1641

2004 12950 1304

2005 12722 1458

2006 14382 1610**Od tega je bilo v letu 2006 opravljenih približno 90 (~ 5%) preiskav z metodo imunofiksacije.

SS--Elektroforeza proteinovElektroforeza proteinov

SS--Elektroforeza proteinovElektroforeza proteinov

L K M A GL K M A G

INTERPRETACIJA na CEINTERPRETACIJA na CEKjer se krivulja z Kjer se krivulja z antiserumomantiserumom ne pokriva z ne pokriva z osnovno krivuljo, je dokaz, da je v vzorcu prisoten osnovno krivuljo, je dokaz, da je v vzorcu prisoten monoklonskimonoklonski imunoglobulinimunoglobulin tipa G, A ali M in/ali tipa G, A ali M in/ali lahka veriga kapa, lambda.lahka veriga kapa, lambda.

Pri nenavadnih rezultatih ali pri rezultatih, kjer ne Pri nenavadnih rezultatih ali pri rezultatih, kjer ne dobimo nedvoumne interpretacije, vzorec dodatno dobimo nedvoumne interpretacije, vzorec dodatno analiziramo analiziramo šše z metodo e z metodo imunofiksacijeimunofiksacije..

Na zaNa začčetku dela z metodo etku dela z metodo imunotipizacijeimunotipizacije je bilo je bilo taktakššnih vzorcev 25%, trenutno potrdimo le nih vzorcev 25%, trenutno potrdimo le šše e priblipribližžno 5% vzorcev z metodo IF.no 5% vzorcev z metodo IF.

IgGIgG lambdalambda

IgMIgM lambdalambda

IgGIgG kapakapa ++ IgMIgM kapakapa

Proste verige tipa lambdaProste verige tipa lambda

Sled prostih lahkih verig lambdaSled prostih lahkih verig lambda

MOTEMOTEČČE SNOVIE SNOVIV serumu najdemo najveV serumu najdemo največčkrat naslednje interference: krat naslednje interference: hemoliza, hemoliza, lipemilipemiččnostnost in in ikteriikteriččnostnost. . HemoglobinHemoglobin moti moti predvsem v alfa2 obmopredvsem v alfa2 območčju, kjer se veju, kjer se vežže na e na haptoglobinhaptoglobin, ali v , ali v beta obmobeta območčju kot prosti hemoglobin. ju kot prosti hemoglobin. BilirubinBilirubin ne moti do ne moti do koncentracije 300 koncentracije 300 µµmol/L, mol/L, trigliceriditrigliceridi pa se pojavijo med pa se pojavijo med albuminom in alfa1 obmoalbuminom in alfa1 območčjem. Interferenco trigliceridov so jem. Interferenco trigliceridov so rereššili kemiili kemiččno, tako da sedaj trigliceride najdemo pred no, tako da sedaj trigliceride najdemo pred albuminsko frakcijo. Prav tako lahko najdemo albuminsko frakcijo. Prav tako lahko najdemo fibrinogenfibrinogen v v gama obmogama območčju, ju, čče je vzorec odvzet v epruveto, kjer se e je vzorec odvzet v epruveto, kjer se heparinheparin uporablja kot uporablja kot antikoagulantantikoagulant. . CRPCRP ne moti do 300 ne moti do 300 mg/L (anodni del gama obmomg/L (anodni del gama območčja). Ker je kapilara segreta na ja). Ker je kapilara segreta na 35,535,5°° C, ne pride do laC, ne pride do lažžno negativnih rezultatov v primeru no negativnih rezultatov v primeru suma na suma na krioglobulinekrioglobuline (paziti je potrebno na temperaturo (paziti je potrebno na temperaturo pred vbrizgom v kapilaro!).pred vbrizgom v kapilaro!).

ZAKLJUZAKLJUČČEKEKKapilarna elektroforeza je avtomatizirana analizna Kapilarna elektroforeza je avtomatizirana analizna metoda za separacijo beljakovin v serumu. metoda za separacijo beljakovin v serumu. Izvid je Izvid je lahko v elektronski obliki oddan lahko v elektronski obliki oddan žže isti dan e isti dan –– tudi tudi izven KC Ljubljana.izven KC Ljubljana.

Kljub avtomatizaciji metoda Kljub avtomatizaciji metoda imunofiksacijeimunofiksacije šše e zaenkrat vedno ostaja zlati standard pri dolozaenkrat vedno ostaja zlati standard pri določčanju anju monoklonskihmonoklonskih imunoglobulinovimunoglobulinov..

PREVENTIVA: Za doloPREVENTIVA: Za določčanje preiskave Sanje preiskave S--Elektroforeza Elektroforeza proteinov je metoda proteinov je metoda kapilarne elektroforeze avtomatizirana, kapilarne elektroforeze avtomatizirana, hitra in visoko obhitra in visoko obččutljiva. V prihodnosti bi lahko dobila utljiva. V prihodnosti bi lahko dobila stalno mesto ob osnovnih biokemistalno mesto ob osnovnih biokemiččnih preiskavah.nih preiskavah.