Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique

Universit Mentouri Constantine Facult des Sciences de la Nature et de la Vie

Dpartement de Biochimie - Microbiologie

N dordre N de srie

Thse de Doctorat Prsente pour lobtention du diplme de Doctorat en sciences

Option : Biochimie

Par : KEBIECHE Mohamed

Thme

Soutenu le :22/11/2009

Devant le jury : Prsident : Mme BENLATRECHE C. Prof. Universit Mentouri-Constantine

Rapporteur : Mme MERAIHI Z. Prof. Universit Mentouri-Constantine

Examinateurs : Mr SOULIMANI R. Prof. Universit de P. Verlaine- Metz, France

Mr MADANI K. Prof. Universit MIRA, Bejaia

Mr LAGHOUCHI S. Prof. Universit de Jijel

Activit biochimique des extraits flavonodiques de la

plante Ranunculus repens L : effet sur le diabte

exprimental et lhpatotoxicit induite par

lEpirubicine

Liste des abrviations ALAT Alanine amino transfrase ASAT Aspartate amino transfrase A Absorbance CCl4 Ttrachlorure de carbone CAT Catalase DTNB 5-5-dithiobis2-nitrobenzoque DNID Diabte non insulinodpendant DID Diabte insulinodpendant DPPH 2, 2-diphnylpicrylhydrasyl EB Extrait butanolique EPI Epirubicine ED Eau distille Fl O Flavonod radical FADH Flavine Adnosine Dinuclotide, forme rduite GPx Glutathion peroxydase GR Glutathion rductase GSH Glutathion GSSG Glutathion oxyd GLP-1 Glucagon like peptide-1 HNE 4-hydroxynonenal HO Hme oxygnase H2O2 Peroxyde dhydrogne (eau oxygne) IP Intrapritonal L Litre MDA Malondialdhyde Mole Mole/L NADH Nicotinamide Adnine Dinuclotide NADPH Nicotinamide Adnine Dinuclotide Phosphate NBT Nitro blue Tetrazolium NO Nitric oxide NOS NOsynthase OH Le radical hydroxyl O2 Anion superoxyde ONOO Peroxynitrite PCG Pourcentage de la chute de la glycmie QR Querctine RRL Ranunculus repens L ROS Reactive oxygen species ROO Radical peroxyl RPE Rsonance para-lectrique SOD Superoxyde dismutase SIDA Syndrome dimmunodficience acquise

TBARS Thiobarbituric acid reactive substances TBA Thiobarbituric acid TCA Acide trichloroactique TEP Ttratoxypropane TNB Thionitrobenzoque UI Unit internationale U Microunit

Sommaire Page

Introduction gnrale.............................................1

Partie 1 : Effet des extraits de flavonodes de Ranunculus repens L (RRL) et

de la querctine sur le diabte Introduction.. ...3

1. Le diabte.....5

1.1. Dfinitions et gnralits....... ..5

1.2. Le pancras et linsulinoscrtion..6

1.3. La pancratotoxicit lalloxane.....11

1.4. De lhyperglycmie chronique aux complications organiques....11

1.5. Le diabte et le stress oxydatif.........12

1.6. Les antidiabtiques : de lefficacit la toxicit..12

1.7. Plantes antidiabtiques.13

2. Les flavonodes-gnralits.....15

2.1. Dfinitions et historique ....15

2.2. Les composs phnoliques...15

2.2.1 Biosynthse des composs phnoliques.....17

2.2.2. Structure et classification...19

2.3. Pharmacologie des flavonodes...20

2.3.1. Biodisponibilit..20

2.3.2. Absorption intestinale et mtabolisme...20

2.4. Proprits pharmacologiques des flavonodes.....21

2.4.1. Proprits anti-inflammatoire et immunologique..21

2.4.2. Proprits antivirales et antibiotiques....22

2.4.3. Proprits antinoplasiques....23

2.4.4. Proprits antioxydantes des flavonodes..23

2.4.5. Proprits pro-oxydantes des flavonodes24

2.5. Distribution de flavonodes25

2.6. La plante Ranunculus repens L......26

2.5.1. Systmatique de la plante..26

2.5.2. Biologie de Ranunculus repens L.26

2.5.3. Ethnopharmacologie de Ranunculus repens L.27

3. Matriel et mthodes danalyse.....28

3.1 Prparation des extraits phnoliques....28

3.1.1. Extraction des flavonodes ..... ..28

3.1.2. Dosage des polyphnols.....29

3.1.3. Dosage des flavanoides......29

3.1.4. Evaluation du pouvoir oxydant des flavonodes....31

3.2. Exprimentation animale..32

3.2.1. Animaux et conditions dhbergement .. 32

3.2.2. La recherche de toxicit des flavanoids de RRL .... 32

3.2.3. Test de tolrance au glucose..... 32

3.2.4. Evaluation de leffet des flavanoids sur le stockage de glycogne hpatique et

linsulinoscrtion...33

3.2.5. Evaluation de lactivit antidiabtique des composs phnoliques...37

3.2.6. Effet prventif des extraits de flavonodes de RRL et de la querctine sur le

diabte induit par lalloxane..38

3.2.7. Recherche des mcanismes de prvention des extraits butanolique de RRL et de

la querctine...39

3.2.8. Evaluation statistique.....42

3.3. Rsultats et interprtation.. ..43

3.3.1. Extraction et dosages des composs phnoliques..43

3.3.2. Evaluation du pouvoir antiradicalaire. ......44

3.3.3. Effet des flavonodes sur la tolrance au glucose......45

3.3.4. Evaluation du stockage de glycogne hpatique et la glycosylation de glucose

in vitro.................................................................................................................................46

3.3.5. Effet antidiabtique des flavonodes en aigu et en subchronique chez les rats

diabtiques......51

3.3. 6. Effet prventif des flavonodes contre le diabte induit lalloxane...54

3.4. Discussion ..59

3.4.1. Les flavonodes de Ranunculus repens L..59

3.4.2. Etude de lactivit des flavonodes et leur mcanisme daction....61

3.4.3. Activit antidiabtique des flavonodes.....63

3.4.4. Effet protecteur des flavonodes et mcanismes daction contre le diabte induit par

lalloxane...........64

3.4.5. Effet de lalloxane et les flavonodes du RRL sur les cellules du pancras : mcanisme

daction.......66

Conclusion.......68

Rfrences bibliographiques..... 69

Partie 2 : Effet des extraits de flavonodes de RRL et de la querctine sur

lhpatotoxicit induite par lEpirubicine

Introduction.81 Le stress oxydant....83

1. Dfinitions........83

2. Les espces ractives de loxygne et leur origine..84 2.1. Les radicaux libres oxygns ..84

2.2.3. Rle pathologique des espces actives de loxygne.. ...94

2.2.4. Les systmes scavenger des radicaux libres..99

Les systmes endognes enzymatiques.......99

Les systmes endognes non enzymatiques.....103

2.2. Les systmes exognes antioxydants...104

3. Etude exprimentale de leffet hpatoprotecteur des

flavonodes....111

3.1. Matriel et mthodes.................................................................................112 3.1.1. Induction de lhpatotoxicit par lEpirubicine.112

3.1.2. Le srum et le test de la fonction hpatique ....112

3.1.3. Prparation des fractions de cytosol et de la matrice mitochondriale...112

La prparation de cytosol des hpatocytes....112

La prparation de la matrice mitochondriale.....113

3.1.4. Evaluation biochimique du statut oxydatif dans le cytosol et les

mitochondries....113

3.2. Rsultats et interprtation ....115

3.2.1. Effet de lpirubicine sur la fonction hpatique et laction hpatoprotecteur des

flavonodes....115

3.2.2. Evaluation in vivo de la peroxydation lipidique dans le cytosol et la mitochondrie.115

3.2.3. Evaluation des systmes antioxydants dans le cytosol hpatique....117

3.2.4. Evaluation de lactivit enzymatique CAT et SOD dans les mitochondries.......117

3.3. Discussion.......118 Conclusion.121 Conclusion gnrale......122

Rfrences bibliographiques.124 Annexes

Introduction gnrale

Le diabte est une maladie mtabolique caractrise par un dsordre au niveau de la

rgulation du mtabolisme des glucides entranant une hyperglycmie. A l'origine, le terme

"diabte" dsignait diverses maladies caractrises par une limination importante durines,

une dshydratation et une soif intense [Calop et al., 2008]. Cette pathologie se distinguait par

la saveur sucre des urines et fut nomme diabte sucr [Rodier, 2001 ; Sharma, 2008]. Elle

est rpandue dans le monde o on dnombre 5 7% de la population mondiale [Weaber,

2007 ; Sharma et al., 2008 ; Singh P. and Kakkar P., 2009 ; Zhou et al., 2009].

Selon lOMS [Guermaz, 2008], lAlgrie en compte 5 millions tout diabte confondu. Le

diabte sucr est un groupe de maladies mtaboliques caractrises par une hyperglycmie

chronique rsultante dun dfaut de la scrtion de linsuline et/ou de laction de cette

hormone [Rodier, 2001 ; Sharma et al., 2008]. Le diabte type 1, insulinodpendant (DID), est

actuellement matris surtout aprs la synthse de linsuline recombinante [Johnson, 1983].

Pour le diabte type 2 (DNID), le champ de recherche est encore ouvert.

Au niveau des socits industrielles, les recherches et les tentatives en pharmacothrapie

ont permis dtablir linsulinothrapie pour lutter contre le diabte juvnile et le contrle du

rgime alimentaire associ la prise de molcules antidiabtiques (sulphonylurs, biguanide,

methformine, ) pour le traitement et la lutte contre le DNID [Marles, 1994 ; Dey lucey et

al., 2002].

Dans certaines socits traditionnelles non industrialises (Chine, certains pays africains et

latino-amricains), la prise en charge mdicamenteuse de pathologies dites chroniques (tel

le diabte) est en grande partie assure par lutilisation de plantes mdicinales et alimentaires

[Sharma et al, 2008 ; Guermaz, 2008 ; Singh, 2009 ; Zhou et al., 2009 ]. En effet, la vie

humaine sur trre est troitement lie lexploitation des plantes. Ces dernires ont la capacit

de produire des substances naturelles trs diversifies. A ct des mtabolites primaires, elles

accumulent frquemment des mtabolites dits secondaires qui reprsentent une source

importante de molcules utilisable par lhomme en particulier dans le domaine

pharmacologique [Marouf et Jol, 2007].

De nos jours, plus de 3000 flavonodes sont identifis et se trouvent localiser

particulirement dans les pigments floraux ou dans les feuilles [Marfak, 2003]. Les

flavonodes sont reconnus essentiellement pour leur action antioxydante [Bruneton, 1999],

modulatrice de lactivit de certaines enzymes, vasculoprotectrice [Vitor et al., 2004]

[Ghedira, 2005], anti-inflammatoire [Chen et al.,2008] et antidiabtique [Marfak, 2003].

Lexistence dune pharmacope traditionnelle antidiabtique destine au traitement de la

pathologie diabtique svit et son existence est confirme par les praticiens et les mdecins

qui la pratiquent [Sharma et al, 2008 ; Singh, 2009].

Il parat difficile voire impossible de rpertorier la totalit des plantes actives et efficaces

sur ce genre de pathologie. Aussi, dans notre travail, nous nous sommes limits ltude de

la plante Ranunculus repens L trs utilise de faon traditionnelle (ses jeunes pousses de

feuilles en dcoction et en infusion) dans le traitement du diabte sucr dans la rgion de

Jijel (ville de lEst algrien). Ses effets avrs sur le diabte, nous ont donc pousss

dmontrer exprimentalement, le ou les principes actifs et den comprendre les mcanismes

daction. Par ailleurs, selon la documentation consulte [Coles, 1977 ; Lovett-Doust et al.,

1990 ; Khan et al., 2006], cette plante na pas t tudie tant sur le plan phytochimique que

pharmacologique.

Notre stratgie exprimentale comporte donc les axes suivants :

Un fractionnement des flavonodes par entranement avec diffrents solvants

organiques

Un modle de rat diabtique est conu pour tester lefficacit des extraits de la plante

et tudier galement leurs mcanismes daction in vitro et in vivo. Pour cette tude la

querctine est utilise comme tmoin positif, connue pour ses proprits

antiradicalaires [Boots, 2008 ; Coskun, 2005] et antioxydantes [Boots, 2008 ; Erlund ,

2004].

Une tude parallle est entreprise pour valuer la toxicit hpatique mdicamenteuse cause par lEpirubicine (antibiotique anticancreux). Les activits antihpatotoxiques,

hpatoprotectrices et antioxydantes des extraits de flavonodes sont compares

leffet de la querctine.

Le travail est divis en 2 sections : une section comportant les deux premiers points et une

autre pour la dernire tude.

Introduction

Le diabte est une maladie mtabolique grave menaant, dune manire croissante, la sant

publique dans le monde. Elle touche environ 4% de la population mondiale et on s'attend

une augmentation de 5,4% en 2025 [Al-Achi, 2005]. Les patients atteints de diabte ont le

stress oxydatif lev et une altration des systmes de dfense anti-oxydant, qui semblent

contribuer l'initiation et la progression des complications du diabte induit [Kim et al.,

2006]. Les systmes de dfenses antioxydants existant dans lorganisme sont susceptibles de

moduler le niveau du stress oxydatif intracellulaire. En effet, la superoxyde dismutase, la

catalase, la glutathion peroxydase (enzymes antioxydantes), peuvent catalyser la dismutation

des radicaux libres ou leur neutralisation [Rudge et al., 2007]. Le diabte entrane de graves

dsquilibres mtaboliques, des changements dans de nombreux tissus en particulier le

pancras [McCord et al., 1971] o Ihara et al., 1999, ont not une augmentation des

marqueurs du stress oxydatif dans les lots pancratiques de rats diabtiques. Le

malondialdehyde reflte le degr de peroxydation lipidique, laugmentation de sa production

joue un rle important dans le contrle de la progression du diabte [Ilhan et al., 2001].

Malgr lutilisation des hypoglycmiants comme drogues antidiabtiques, le diabte et ses

complications constituent une grande problmatique dans la prise en charge thrapeutique des

diabtiques et la russite du traitement serait dun intrt grandiose, malgr lavance de

nouvelles molcules thrapeutiques. Les mdicaments modernes, y compris l'insuline et les

hypoglycmiants oraux (les biguanides, les sulfonylures), leur administration rgulire

engendre deffets indsirables [Nissen and Wolski, 2007]. Rcemment, les diabtologues sont

arrivs lvidence dun complment thrapeutique constitu par les extraits de plantes est

ncessaire pour optimiser le traitement du diabte [Bagchi et al., 1997 ; Kim et al., 2002 ; Jin

et al., 2008 ].

Les plantes sont reconnues comme une merveilleuse source de mdicaments. Actuellement

1200 espces de plantes sont utilises comme mdicaments dans la thrapeutique

traditionnelle du diabte [Marles and Farnsworth, 1995]. Cependant pour la plupart d'entre

elles les preuves scientifiques ne sont pas encore lucides.

Les antioxydants jouent un rle majeur dans la protection contre les dommages oxydatifs

molculaire [Evans, 2007]. En plus du stress oxydatif, laction de linsuline est galement

perturbe chez les diabtiques, ce qui entrane une augmentation de la production hpatique

de glucose. Ainsi, l'effet des composs phytochimiques sur les tissus tel que le foie, qui rgule

le mtabolisme du glucose, est un domaine intressant explorer. En effet, les flavonodes

sont longuement reconnus pour avoir un effet anti-inflammatoire, antioxydant, antiallergique,

antithrombotique, antiviral et anticancrinogne [Carroll et al., 1998]. Cependant peu

dinformations sont disponibles sur leur potentiel rguler et contrler le glucose sanguin

chez lhomme.

Lobjectif de la prsente tude est la validation de leffet antidiabtique de la plante

Ranunculus repens L (poudre de feuilles sches), reconnue par la tradimdecine dans le

traitement du diabte ainsi que le potentiel antioxydant en utilisant des outils biochimiques.

Dans ce contexte, une tude sera entreprise pour comprendre les mcanismes molculaires

daction des fractions riches en flavonodes de la plante. Un autre objectif fix galement par

cette investigation est ltude de la variation du status redox des cellules pancratiques sous

leffet du diabte.

Le test de tolrance au glucose en utilisant les diffrents extraits de flavonodes, glycogne

hpatique, la scrtion d'insuline, test de glycosylation in vitro, activit des enzymes

antioxydantes, glutathion et peroxydation lipidique ont t analyss chez le diabte induit par

lalloxane afin d'valuer leffet des flavonodes sur certains paramtres molculaires et

biochimiques des cellules pancratiques.

1. Le diabte

1.1. Dfinitions et gnralits

Le diabte est une maladie frquente, connue depuis fort longtemps, trs rpandue en ce dbut

de XXIme sicle. Cest une pathologie chronique, caractrise par une hyperglycmie.

Lorsque la glycmie dans le sang, mesure jeun, devient suprieure 1,26 g par litre, la

personne est considre comme diabtique. Cette maladie est incurable, mais peut nanmoins

tre traite efficacement [Buysschaert et al., 1998 ; Raccah, 2004].

Le diabte est un dsordre du mtabolisme lipidique, glucidique et protique attribu la

production diminue de l'insuline ou une rsistance anormale cette hormone qui entrane

une hausse du taux de glucose.

On peut distinguer plusieurs types de diabte :

Le diabte insulinodpendant (DID) : Concerne le plus souvent les enfants, mais il

peut survenir tout ge. Les cellules qui scrtent l'insuline sont dtruites jusqu' 90% de leur

quantit normale (causes auto-immunes ou idiopathiques. Il est li un dficit en insuline [

Raccah, 2004 ; Calop et al., 2008 ].

Diabte non insulinodpendant (DNID) : Ce type de diabte dbute gnralement

aprs l'ge de 40 ans et reprsente 90% de l'ensemble des cas mondiaux [Buysschaert et al.,

1998 ; Raccah, 2004]. Il rsulte de l'incapacit de l'organisme ragir correctement l'action

de l'insuline. Linsuline est soit basse ou soit leve (insulinorsistance prdominante ou

insulinopnie prdominante) [Calop et al., 2008 ; Raccah, 2004].

En l'absence de traitement, le diabte se reconnat par une lvation chronique de la glycmie.

Celle-ci s'accompagne parfois par les symptmes suivants : polydipsie, polyurie, asthnie,

polyphagie, amaigrissement ou obsit, et des troubles de la conscience aboutissant un coma

mortel [Sharma et al., 1993 ; Buysschaert et al., 1998 ; Raccah, 2004 : Calop et al., 2008 ].

Le diabte aboutit des complications comme les maladies cardio-vasculaires et rnales. Ces

complications peuvent tre retardes, diminues ou empches en maintenant une glycmie

prs de la normale (0.7 - 0.8 g/l) [Raccah, 2004].

Les maladies coronariennes sont prsentes chez 8 20 % des diabtiques au-del de 45 ans et

cette frquence augmente avec l'ge [Raccah, 2004]. Le diabte est la cause principale de

nouveau cas de ccit chez des adultes diabtiques entre 30 et 75 ans. Les diabtiques au-del

de 65 ans sont deux fois plus souvent hospitaliss pour des problmes lis au fonctionnement

des reins que les personnes non atteintes [Sharma et al., 1993 ; Buysschaert et al., 1998 ;

Raccah, 2004].

Les diabtiques de type 2, prcisment, sans aucun pass coronaire ont un risque dinfarctus

myocardique aussi lev que celui des tmoins non diabtiques [Sharma et al., 1993 ;

Buysschaert et al., 1998].

1. 2. Le pancras et linsulino-scrtion

Bien que les apports de glucose soient trs variables dans le temps, la glycmie reste toujours

comprise entre 0.7 et 0.8 g/l [Raccah, 2004]. Cette rgulation est assure par les scrtions

endocrines du pancras qui pntrent dans le flot sanguin par la veine msentrique

[Buysschaert et al., 1998].

Le pancras est une glande double, la fois exocrine et endocrine, situe dans une anse du

duodnum. La glande endocrine est reprsente par de petits lots cellulaires dissmins dans

le parenchyme exocrine, les lots de Langerhans, dont le diamtre varie de 100 300 mm et

dont le total ne reprsente gure que 1% environ de la glande, soit un poids total de 1 2 g ).

(figure 1).

Figure 1 : Les systmes endocriniens du pancras [Nelson et Cox, 2004 ]

Les scrtions de linsuline rejoingnent la circulation sanguine via le foie. Le pancras scrte

plusieures hormones (Nelson et Cox, 2004) :

1/ L'insuline : hormone peptidique synthtise dans les glandulaires des lots de

langerhans ou cellules Bta. Lincapacit de ces cellules produire suffisamment linsuline,

entrane un diabte. Cette fragilit intervienne dans les mcanismes qui conduisent la

destruction de la cellule bta, sous leffet dagents diabtognes, comme lAlloxane [Malaisse

et al., 1982 ; Oberley, 1988]. Laction de linsuline est reprsente sur la figure

suivante (figure2):

Figure 2 : Mcanisme biochimique de laction de linsuline [Oberley, 1988].

Au niveau des cellules cibles, cette hormone facilite la pntration du glucose dans les

cellules en augmentant la permabilit de leur membrane via des rcepteurs au glucose

exemple GLUT 4 [Malaisse et al., 1982 ; Oberley, 1988 ]. Au niveau du foie, elle stimule la

glycognogense.

La capacit, plus ou moins grande, de linsuline favoriser lutilisation du glucose par les

tissus priphriques dfinit le degr de sensibilit linsuline dune personne. Chez les

humains obses et/ou diabtiques, cette action de linsuline est fortement rduite et cette

perturbation est due un dfaut au niveau du transport du glucose [Buysschaert et al., 1999 ;

Raccah, 2004 ; Weaber, 2007 ]. Les mcanismes par lesquels linsuline stimule ce processus

dans les cellules musculaires et adipeuses soient indiqus dans la figure 3.

Comme nous lavons mentionn ci-dessus, linsuline stimule l'enrichissement de la

membrane plasmique en transporteurs GLUT 4, o des vsicules contenant les transporteurs

fusionnent avec la membrane [Wang et al., 1997]. Une autre hormone d'origine intestinale, le

GLP-1, est galement capable d'augmenter le nombre de rcepteurs GLUT4 et GLUT1 sur les

adipocytes in vitro [Wang et al., 1997].

Figure 3 : Stimulation de lenrichissement de la membrane plasmique en GLUT4

par linsuline [Kahn, 1992].

Linsulino-rsistance est une rponse biologique in vivo l'insuline explique par une scrtion rduite ou par son action dfectueuse. Elle est caractristique du diabte non

insulino-dpendant et concerne la majorit des tissus cibles comme le foie qui va augmenter

sa production en glucose, les muscles squelettiques et le tissu adipeux. Les mcanismes

responsables peuvent se situer diffrents niveaux du mtabolisme insulinique, y compris au

niveau du rcepteur l'insuline des cellules cibles [Buysschaert et al., 1999 ; Raccah, 2004 ]

(figure 4).

Figure 4 : Les mcanismes de l'insulino-rsistance [Kahn, 1992 ]

(1) signalisation dficiente, (2) translocation affaiblie, (3) fusion choue,(4) fusion partielle et exposition au milieu extracellulaire inadquate, or (5) rduction de lactivation des transporteurs de glucose.

2/ Le glucagon : hormone peptidique synthtise par les cellules , qui est une hormone

hyperglycmiante. C'est un facteur antagoniste de l'insuline. Cette hormone agit en stimulant

la glycognolyse hpatique.

3/ La somatostatine : hormone peptidique synthtise par les cellules dont le rle est

hyperglycmiant.

Chez les mammifres, l'organisme contrle l'quilibre entre la consommation cellulaire du

glucose et sa production endogne hpatique et les apports exognes. Les facteurs hormonaux

comme l'insuline et le glucagon, des neurotransmetteurs et autres molcules participent la

rgulation du mtabolisme glucidique afin de maintenir l'homostasie (figure 5). Certains des

signaux hormonaux favorisant la production d'insuline ont t tudis dans le but de corriger

le DNID tel que le glucagon intestinal (GLP-1) [Nauck, 1998].

Les rgulations des scrtions endocrines pancratiques font donc intervenir de nombreuses

molcules d'origines diverses: des hormones, mais aussi des neurotransmetteurs et des

produits de la digestion.

Figure 5 : Rgulation des scrtions endocrines pancratiques [Nauck, 1998].

1.3. La pancratotoxicit lalloxane

LAlloxane est un compos organique bas sur un squelette de lhtrocyclique de la

pyrimidine (figure 6). Ce compos a une haute affinit pour leau existant sous forme

monohydrate. Les donnes caractrisant l'Alloxane dans les conditions standards sont les

suivantes :

Figure 6. Structure chimique de l'Alloxane.

LAlloxane est un agent oxydant fort excentre une activit cytotoxique sur les cellules par le

produit de sa rduction, lacide diallurique [Grankvist et al., 1981]. Il tablit un cycle

doxydorduction avec formation de radicaux superoxydes, associ linternalisation de

fortes doses de calcium dans le cytosol provoquant anisi la destruction rapide des cellules

[Ammon et al., 1983 ; Lenzen et al., 1996 ]. Cet effet dltre est inhrent la vulnrabilit de

ces cellules au stress oxydatif en raison dune part, de leur pauvret en cu++/zn++ super oxyde

dismutase, en catalase et en glutathion peroxydase, dautre part au faible contenu en

glutathion rduit [Grankvist et al., 1981]. cette fragilit intervient dans les mcanismes qui

conduisent la destruction des cellules sous leffet dagents diabtognes comme

lAlloxane [Grankvist et al., 1981; Ammon et al., 1983 ; Lenzen et al., 1996].

1. 4. Hyperglycmie chronique et complications organiques

Lhyperglycmie chronique est associe des complications organiques spcifiques

touchant particulirement les yeux, les nerfs, les reins, le coeur et les vaisseaux [Raccah,

2004], qui provoquent un risque de mortalit trs lev. A titre dexemple la mortalit

cardiovasculaire en France chez les personnes atteintes dun diabte de type 2 est

approximativement le double de celle des sujets non diabtique [Drouin et al., 1999 ;

[Buysschaert et al., 1999].

Nom chimique : 2, 4, 5,6(1H, 3H)-pyrimidine ttraone monohydrate.

Structure chimique : C4H2N2O4

Masse molculaire : 160,09 g/mol.

Point fondant : 253C.

1. 5. Le diabte et le stress oxydatif

Les complications du diabte sont fortement lies certain nombre de facteurs. A cot de

lhyperglycmie chronique et la glycation non enzymatique des protines, un facteur trs

important impliqu dans la gense de ces complications est le stress oxydatif [Guerci et al.,

2001 ;Punitha et al ., 2005]. En effet, le mtabolisme cellulaire normal de loxygne produit

de manire continue de faibles quantits despces oxygnes actives dont font partie les

radicaux libres (O2., OH

.,, le peroxyde dhydrogne et loxygne singulet). Le patient

diabtique prsente une surproduction des ROS dune part et dautre part, une diminution des

antioxydants, ce qui gnre un tat de stress oxydatif lorigine des micro et des macro

angiopathies [Pincemail et al., 1999 ; Huang et al., 2004 ].

1. 6. Les antidiabtiques : de lefficacit la toxicit

Gnralement, tous ces agents antidiabtiques causent diffrents effets secondaires qui

varient selon la classe et la gnration du mdicament. Prcisment, les sulfamides,

insulinoscrtagogues, provoquent un tat d'hypoglycmie. Cet effet est considr comme

principal cot de l'hyponatrmie, l'hpatite, les atteintes hmatologiques, l'ventuelle

raction dermatologique ainsi qu'un gain de poids d l'hyperinsulinmie [Marles and

Farnsworth, 1994 ; Marles and Farnsworth, 1995 ; Dey lucey et al., 2002].

Suite leurs effets secondaires nfastes, certains Biguanides, inhibiteurs de la noglucognse

et labsorption intestinale du glucose, sont limins du march. La metformine, le biguanide

le plus commercialis dans le monde, n'est plus disponible quaux USA car il provoque une

acidose lactique, une fatigue, des nauses et une toxicit rnale [Dey lucey et al., 2002].

L'acarbose (C25H43NO18), un mdicament de la classe des inhibiteurs des alpha-glucosidases

prsente divers effets secondaires, comme les gaz, le ballonnement et la diarrhe [Marles and

Farnsworth, 1995 ; Dey lucey et al., 2002].

1. 7. Plantes antidiabtiques

Pour pallier aux effets secondaires des traitements antidiabtiques, les recherches

scientifiques portent sur 1123 plantes utilises traditionnellement contre le diabte [Raccah,

2004]. La minorit tudie concerne les plantes suivantes : Momordica charantia,

Catharanthus roseus, Trigonella foenum-greacum, Allium cepa, Allium sativum, et autres [Al-

Achi, 2005].

Les guanidines furent extraits la premire fois partir de Galega officinalis, qui constituent

une source naturelle pour la semi-synthse des Biguanides les moins toxiques que les

guanidines [Dey lucey et al., 2002]. Dautres composs vgtaux montrent une activit

biologique (voir tableau1).

Tableau 1. Composs vgtaux vertus antidiabtiques.

Compos Nature chimique Source Mcanisme daction possible

Polypeptide P Polypeptide Momordica charantia Insulinomimtique administr par voie

sous cutane chez des diabtiques de type1 [Marles and Farnsworth, 1995].

Charantine Htroside stroidique

Momordica charantia [Dey

lucey et al., 2002] Momordica foetida

[Marles and Farnsworth,

1995 ]

* Mcanisme daction exacte reste inconnu. Des tudes ont rapport que: * Le jus de M. charantia peut amliorer la tolrance au glucose chez les diabtiques de type 2 [Welihinda et al., 1986]. * Lextrait aqueux de M. charantia diminue la glycmie post prandial avec une rduction du taux de lhmoglobine glycosyle [Srivastava et al., 1993]. * Il augmente lutilisation hpatique du glucose et inhibe la noglucogense, il

rprime linsulinorsistance en augmentant le taux des transporteurs

membranaires de glucose [Al-Achi, 2005]

Trigonelline Alcaloide

Trigonella foenumgreacum

[ Marles and Farnsworth,

1995 ; Dey lucey et al., 2002]

Les extraits bruts ont montr les effets suivants :

* Diminution de la glycmie post prandial. * Diminution du taux de glucagon, somatostatine, insuline, cholestrol total et des triglycrides * Augmentation du taux dHDL-Cholestrol [ Ribes et al., 1984]. * Resensibilisation des cellules laction de linsuline [ Al-Achi, 2005]

Allyl propyl disulfide Allium cepa

Diallyl disulfide oxide

Drivs de la cystine

Allium sativum

Ces deux composs semblent agir par comptition avec linsuline sur son rcepteur [Marles and Farnsworth, 1995 ; Dey lucey et al., 2002 ; Al-Achi, 2005].

Ginsenosides Htroside stroidique Panax ginseng

* La plante provoque une augmentation du nombre des transporteurs de glucose * Stimulation de la synthse de linsuline [Al-Achi, 2005].

2. Les flavonodes-gnralits

2.1. Dfinitions et historique

Le nom flavonode est driv du mot Flavus en latin, qui signifie jaune. Lintrt

nutritionnel pour les flavonodes date de la dcouverte de la vitamine C par Szent Gyorgyi en

1938 [Szent-Grgyi, 1938 ; Bruneton, 1993].

Le scorbut exprimental cde lingestion de jus dagrumes mais rsiste la seule

administration dacide ascorbique. Plus pratiquement, les symptmes hmorragiques du

scorbut lis la fragilit des vaisseaux sont guris par des extraits de Paprika et du jus de

citron alors que lacide ascorbique seul est inefficace [Szent-Grgyi, 1938]. Les analyses

chimiques ont montr que la fraction active tait de nature flavonodique [Bruneton, 1993].

Cette action des flavonodes sur la permabilit vasculaire a t appele proprit vitaminique

P (P tant la premire lettre du mot permabilit). Cette notion de vitamine P nexiste plus

lheure actuelle puisquelle ne correspond pas la dfinition classique des vitamines ; par

contre, les flavonodes sont considrs comme des micronutriments importants puisqu.ils

peuvent jouer des rles antioxydants [Alan et Miller, 1996] ou possder des proprits

biologiques diverses qui seront dveloppes dans ce chapitre.

2.2. Les composs flavonodiques

Ce sont des composs phnoliques des vgtaux constituent un groupe dune extrme

diversit. Plusieurs milliers de molcules ont t identifies ce jour [Alan et Miller, 1996 ;

Rajnerayanama et al., 2001]. Ce sont des pigments quasi universels des vgtaux presque

toujours hydrosolubles. Ils sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois

des feuilles assurant ainsi la protection des tissus contre les agressions des ultraviolets

[Bruneton, 1993 ; Rajnerayanama et al., 2001].

Les flavonodes sont des drivs du noyau FLAVONE ou 2-PHENYL CHROMONE (figure

7) portant des fonctions phnols libres, thers ou glycosides. Le noyau FLAVONE est lui

mme un driv du noyau FLAVANE de base [Bruneton, 1993], (figure 8).

Figure 7 : Structure du FLAVONE [Bruneton, 1993 ; Elicoh-Middleton, 2000].

Figure 8 : Structrue du FLAVANE [Bruneton, 1993 ; Elicoh-Middleton, 2000].

Les flavonodes sont donc des polyphnols complexes dont la structure est constitue de deux

noyaux aromatiques (noyaux A et B) et dun htrocycle oxygn, cycle C [Bruneton, 1993 ;

Elicoh-Middleton, 2000].

2.2.1. Biosynthse des composs phnoliques

Les flavonodes sont synthtiss au niveau du chloroplaste et participent la phase lumineuse

de la photosynthse comme transporteurs dlectrons. Certains quittent le chloroplaste et

saccumulent dans les vacuoles [Elicoh-Middleton, 2000].

Les composs de dpart de la biosynthse des flavonoides sont le malonyl CoA et les drivs

CoA de lacide cinnamique, le cinnamoyl CoA [Gerhard, 1993]. Ces composs sont forms

suite deux voies complmentaires, voie actate malonate et voie shikimate [Hollman et al.,

1999 ; Elicoh-Middleton, 2000]. La voie shikimate conduit la synthse de lacide

cinnamique et donc au cycle B et la chane en C3 qui formera le cycle oxygn C de la

structure de base des flavonodes. Les prcurseurs de cette voie sont lrythrose 4-phosphate

de la voie des pentoses et le PEP rsultant de la glycolyse [Marfak, 2003]. La voie actate

malonate constitue la voie de synthse du noyau A. Ce systme aromatique est form par

condensation rpte dunits dactate [Gerhard, 1993]. Ces deux voies sont alors

condenses pour engendrer un prcurseur commun la 4, 2,4,6 ttrahydroxychalcone avec la

catalyse de la chalcone synthase [Elicoh-Middleton, 2000]. Ce pigment jaune est mtabolis

en diffrentes classes des flavonoides sous laction denzymes spcifiques (figure 9).

Des ractions post-biosynthtiques sont enfin effectues pour donner la structure finale aux

flavonoides telles que la glycosylation, lacylationformes natives sur lesquelles se trouvent

in vivo [Marfak, 2003]. Il existe cependant des flavonoides non glycosyls comme la

querctine [Bruneton, 1993 ; Remesy et al., 1996 ; Elicoh-Middleton, 2000 ;].

Figure 9 : Voie de biosynthse des flavonodes [Gerhard, 1993].

2.2.2. Structure et classification.

Les flavonodes se rpartissent en quinze familles de composs, dont les plus importantes sont

les suivantes : flavones, flavonols, flavanones, flavanonols, isoflavones, isoflavanones,

chalcones, aurones et anthocyanes [Harborne et Williama, 2000 ; Kuresh et al., 2002].

Les composs de chaque sous classe se distingue par le nombre, la position et la nature des

substituants sur les deux cycles aromatiques A et B et le cycle intermdiaire [Julies et

Christin, 2002].

Les flavonodes se rencontrent la fois sous forme libre ou sous forme dhtrosides qui

rsultent de la combinaison du groupe rducteur dun ose avec une substance non glucidique :

laglycone ou la gnine, avec limination deau. La partie osidique peut tre mono-, di- ou

trisaccharidique. La partie glycarique est forme soit dhexoses ( D-glucose , D-galactose , D-

allose ) ou de pentoses ( D-apiose , L-arabinose , L-ramnose ) ou avec des acides ( D-

glucuronique , D-galacturonique ). La partie osidique peut tre linaire ou ramifie

[Gerhard, 1993].

La liaison GENINE-OSE existe entre un hydroxyle phnolique ou dun hydroxyle de

lhtrocycle oxygn et un OH ou un -CH de la fonction hmiactalique du ou des ose(s).

On obtient alors des O-HETEROSIDES ou des C-HETEROSIDES (figure 10), [Milane,

2004].

Figure 10 : Structure chimique deux flavonodes : a : la rutine ; b : la saponarine

- Il existe diffrentes gnines :

Figure 11 : Exemple de deux structures de flavonodes : a : flavone ; b : isoflavone.

2.3. Pharmacocintique des flavonodes

2.3.1. Biodisponibilit

Les tudes de Vanessa et al. (2003) montrent que cette biodisponibilit dpend de trois

facteurs essentiels : La capacit de transport travers la bordure en brosse des anthrocytes,

lintensit de la scrtion intestinale des flavonodes conjugus vers la lumire intestinale et

vers le sang et de la capacit de la scrtion biliaire. Les flavonodes prsentent une faible

biodisponibilit avec une limination lente qui diffre dun flavonode lautre. En prenant

comme exemple, la querctine, le principal flavonode consomm par lhomme dans ses

aliments (persil, oignon, myrtilles, cerises) [Remesy et al., 1996], aprs 174 min, un temps de

demi-vie dabsorption de 52 min, de distribution de 228 min et dlimination de 1008 min

[Elicoh-Middeleton et al., 2000]. In vitro, le pouvoir antioxydant de nombreux flavonodes est

suprieur celui de la vitamine C et de la vitamine E [Elicoh-Middeleton et al., 2000].

2.3.2. Absorption intestinale et mtabolisme

Les flavonodes sont prsents dans notre alimentation sous plusieurs formes. Cette particularit

va leur confrer des mtabolismes diffrents. Les formes libres (aglycones) peuvent tre

directement absorbes au niveau de lintestin grle [Hollman et al., 1997 ; Hollman and Katan,

1998] tandis que les formes glycosyles doivent tre hydrolyses, sous linfluence des

glycosidases, par la flore intestinale au niveau du clon avant dtre absorbes [Manach et al.,

1995 ; Manach et al., 2004]. Cependant les formes libres issues de cette hydrolyse peuvent

galement tre dgrades par la microflore en acide phnolique, lui mme absorb ou limin

via les fces [Williams et al., 2004].

Les principaux sites de mtabolisme sont la flore intestinale et le foie [Haslam, 1998]. Les

mtabolites, glucuro- et sulfoconjugus des flavonodes absorbs sont limins principalement

par la bile, lexcrtion urinaire ne reprsentant que 3 6 % de llimination totale [Haslam,

1998]). En effet, les flavonodes sont transforms, dans lenthrocyte, en flavonodes

conjugus par mthylation, sulfatation, glucuronidation [Crespy et al., 2004]. Une partie de

ces flavonodes est dverse dans le sang tandis quune autre est destine vers la lumire

intestinale ce qui constitue lun des mcanismes de contrle de labsorption intestinale de ces

substances phnoliques [Gee et al., 2000 ; Crespy et al., 2004].

Dans le sang, les flavonodes ne sont pas prsents sous leur forme native car ils ont t

transforms, cause de leur transformation au niveau du foie et de la cellule intestinale. La

fraction des flavonodes conjugus destine finalement vers les tissus pourrait avoir un effet

biologique potentiel ou serait limine dans les urines. Cependant, dautres flavonodes

conjugus pourraient tre dverss dans lintestin via la bile et y tre hydrolyss par les

enzymes de la flore intestinale librant ainsi de nouveaux aglycones en constituant

probablement un recyclage entrohpatique des flavonodes qui permet le maintien dune

concentration non ngligeable dans le sang [Manach et al., 1995 ; Rechner et al., 2000].

2.4. Proprits pharmacologique des flavonodes

2.4.1. Proprits anti-inflammatoires et immunologiques

De nombreux travaux semblent indiquer que les flavonodes possdent des proprits anti-

inflammatoires et quils sont capables de moduler le fonctionnement du systme immunitaire

[Da Silva et al., 1994 ; Galati et al., 1994 ; Middleton, 1996]. Les flavonodes sont de

puissants inhibiteurs de la prolifration des lymphocytes B et T [Mookerjee et al., 1986 ;

Namgoong et al., 1994 ]. Leur effet sur les lymphocytes B ou T peut tre variable: en effet, les

flavones (apignine, lutoline et 7,3,4 hydroxyflavone) et les flavonols (kaempfrol,

querctine et myrictine) inhibent la prolifration des lymphocytes T alors que la myrictine

est active sur les lymphocytes B [ Mookerjee et al., 1986 ]. Leffet antiprolifratif des

flavonodes pourraient sexpliquer par leur capacit inhiber lactivit de certaines protines

kinases (protine Kinase C ou protine tyrosine kinase) [Mookerjee et al., 1986 ; Namgoong

et al., 1994 ]. Par ailleurs, les flavonodes sont susceptibles de diminuer la libration

dhistamine des basophiles et des mastocytes [Middleton and Drzewiecki, 1984]. La

querctine a un effet anti inflammatoire en inhibant les enzymes de synthse [la cyclo-

oxygnase (pour les postaglandines) et la li-oxygnase (pour les leucotrines) des principaux

mdiateurs de linflammation [Middleton and Drzewiecki, 1984].

2.4.2. Proprits antivirales et antibiotiques

La stratgie de recherche dun compos antiviral consiste mesurer la rduction de linfection

virale de cellules en culture. Une substance peut agir diffrents niveaux du cycle viral

[Milane, 2004]:

- au niveau de la pntration du virus dans la cellule hte,

- au niveau de la rplication du virus et la synthse des protines virales,

- au niveau de lassemblage et de la sortie du virus hors de la cellule hte.

Les flavonodes sont capables dagir au niveau de la synthse des protines virales permettant

ainsi une bonne protection des souris vis--vis dune infection virale la suite dune

administration journalire de 3-O-mthylquerctine raison de 20 mg/kg pendant 9 jours

[Vrijsen et al., 1987]. Dautres chercheurs [Muecsi and Pragai, 1985] ont galement montr une corrlation entre leffet inhibiteur de certains flavonodes sur divers virus de lherps et

leur capacit augmenter les taux intracellulaires en AMPc dans des cellules infectes.

Les travaux de Spedding et al. (1989) ont mis en vidence un impact des flavonodes sur le

rtrovirus HIV responsable du syndrome dimmunodficience acquise (SIDA). Ils ont

dmontr que les flavonodes sont de bons inhibiteurs de la reverse transcriptase. Cependant,

leur impact semble plus fort sur lADN et lARN polymrase de la cellule hte que sur la

reverse transcriptase virale [Ono et al., 1990a ; Ono et al., 1990b]. Certains travaux de

recherche [Mahmood et al., 1993] ont montr que les flavonodes pouvaient avoir une action

plus slective en interagissant avec une glycoprotine de surface du virus HIV (la gpl20), en

empchant ainsi la liaison du virus la cellule hte. Enfin, les flavonodes seraient

susceptibles dinhiber lintgrase rtrovirale du virus HIV-1 qui assure lintgration du

gnome viral celui de la cellule hte [Mahmood et al., 1993 ; Fesen et al., 1994].

Des tudes [Ohemeng et al., 1993 ; Sato et al., 1995] ont apport lvidence de leffet

bactricide de diffrentes flavanones sur lADN gyrase dune bactrie staphylococcus aureus.

Le mcanisme des effets antimicrobiens des polyphnols est sans doute trs complexe. Parmi

les hypothses avances, il faut citer: Linhibition des enzymes extracellulaires microbiennes ;

la squestration de substrat ncessaire la croissance microbienne ou la chlation de mtaux

tels que le fer ; linhibition du mtabolisme microbien [Mila and Scalbert, 1994].

2.4.3. Proprits antinoplasiques

Des tudes ralises chez la souris ont mis en vidences les effets protecteurs des flavonodes

vis--vis des promoteurs de tumeurs [Kato et al., 1983]. La querctine, par exemple, est lun

de ces phnoliques capables de diminuer, chez le rat, lincidence des tumeurs mammaires

induites par le DMBA (7,12 dimthylbenz(a)anthracne) ou la NMU (Nnitrosomthylure)

[Verma et al., 1988].

Les flavonodes peuvent galement interfrer avec le mtabolisme des xnobiotiques

notamment en stimulant les systmes de dtoxification [Wattenberg Lee, 1983 ; Bu-Abbas et

al., 1995]. En donnant des rats ou des souris une alimentation contenant de la flavone ou

de la querctine, des chercheurs [Nijhoff et al., 1995] ont observer des effets chimioprventifs

divers niveaux en particulier au niveau du foie par une stimulation de la glutathion-S-

transfrase. Enfin, les flavonodes peuvent inhiber les enzymes intervenant dans lactivation

des procarcinognes en intermdiaires mutagnes et carcinognes [Obermeier et al., 1995 ;

Lasker et al., 1984].

2.4.4. Proprits antioxydantes des flavonodes

Les polyphnols et surtout les flavonoides sont des antioxydants puissants susceptibles

dinhiber la formation des radicaux libres et de sopposer loxydation des macromolcules

[Van Acker et al., 1995]. En effet, les flavonodes sont des pigeurs efficaces des radicaux

libres les plus prooxydants, particulirement impliqus dans la peroxydation lipidique,

puisquils la prviennent comme l-tocophrol. Ils formeraient des espces radicalaires

intermdiaires peu ractives [ Laughton et al., 1989 ; Puppo,1992 ]. De plus, ils ont une

activit chlatrice des mtaux tels que cuivre et fer qui, ltat libre, peuvent tre lorigine

de la production de radicaux libres par les ractions de Fenton et dHaber-Weiss [Puppo,

1992 ; Van Acker et al., 1995]. Les flavonodes sont de puissants inhibiteurs de loxydation

des LDL [Laughton et al., 1989 ; De Whalley et al., 1990 ].

2.4.5. Proprits prooxydantes des flavonoides

Les flavonoides sont connus pour avoir des proprits antioxydantes mais ils sont sucseptibles

davoir un effet prooxydant [Kessler et al., 2002]. En effet, plusieurs dentre eux ont t

dcrits comme responsables dauto-oxydation et de la gnration de radicaux oxygns actifs,

comme le peroxyde dhydrogne [Laughton et al., 1989 ; Yen et al.,1997]. Lactivit pro-

oxydante de ces substances est le rsultat de leur capacit rduire les mtaux comme le

Fe+3 pour donner Fe+2 lequel ragira avec O2 ou H2O2 avec gnration dinitiateurs de loxydation [Kessler et al., 2002] . En dfinitive, certains flavonodes pourraient acclrer la

survenue de latteinte oxydative de lADN, des protines et des glucides in vitro [Yen et al.,

1997 ; Kessler et al., 2002]. Cependant, le potentiel pro-oxydant de ces composs ne doit pas

tre nglig dans le mcanisme daction des flavonodes.

2.5. Distribution des flavonodes

Les flavonodes se rpartissent dans les organes ariens jeunes (jeunes feuilles, boutons

floraux) o ils sont localiss dans les tissus superficiels (assise palissadique), et parfois dans

les racines [Milane, 2004]. Au niveau cellulaire, les flavonodes de type htrosides, sont

dissous dans le suc vacuolaire ou localiss dans les chloroplastes et les membranes des

vgtaux [Bruneton, 1993]. Chez les angiospermes la diversit structurale des flavonodes est

maximale avec une trentaine de flavonodes identifis chez les Astraces [Bruneton, 1993 ;

Milane, 2004]. En dfinitive, les flavonodes possdent une large rpartition dans le monde

vgtal. Le tableau 2 illustre la rpartition des 4-oxo-flavonodes dans quelques fruits et

lgumes.

Tableau 2 : Teneur en flavonodes dans quelques fruits et lgumes [Remesy et al., 1996].

Fruits et lgumes mg/kg poids Aglycones

Pamplemousse 2700/6000 Hesprtine

Orange 1700/2800 Naringnine

Persil 500 Apignine

Laitue 320 Querctine

Oignon 300 Querctine + Kaempfrol

Endives 290 Kaempfrol

Myrtilles cultives 165 Querctine

Chou fris 150 Querctine + Kaempfrol

Ciboulette 110 Querctine + Kaempfrol

Chou fris (serr) 105 Querctine + Kaempfrol

Poireau 100 Querctine + Kaempfrol

Cleri 100 Apignine + Lutoline

Cerises aigres 100 Querctine + Kaempfrol

Cassis 80 Querctine + Kaempfrol

Haricots verts 70 Querctine + Kaempfrol

Choux de Bruxelles 65 Querctine + Kaempfrol

Raisins 50/100 Querctine + Kaempfrol

Abricots 55 Querctine

Mres 50 Querctine + Kaempfrol

Brocolis 35 Querctine + Kaempfrol

Pommes 30 Querctine

Groseilles 30 Querctine + Kaempfrol

Framboises 30 Querctine + Kaempfrol

Prunes 30 Querctine + Kaempfrol

Cerises douces 12 Querctine + Kaempfrol

2.6. La plante Ranunculus repens L (RRL)

2.6.1. Systmatique de la plante

La plante RRL est une espce vivace herbace, gnralement duveteuse longs stolons

rampants, les feuilles triangulaires ont trois dents, celui du milieu tant ptiol. Les fleurs ont

cinq ptales jaunes, cinq spales dresss et beaucoup dtamines. Le rceptacle porte de

nombreux carpelles qui, maturit, donnent des aknes bec grle [Gerard and Camille,

2003], (Figure 12).

Systmatique [Gerard and Camille, 2003 ; Pierre, 2003]:

v Phylum: Dictotyldone.

v Famille : Ranunculaceae.

v Ordre : Ranale ou polycarpique.

v Genre: Ranunculus.

v Espce: Ranunculus repens L.

v Nom Arabe: Mergheris (El-houdane).

v Nom commun : Ranunculus rampante.

2.6.2. Biologie de Ranunculus repens L

La Ranunculus repens L est une herbe rampante avec des racines fibreuse, elle est commune

dans les pturages, champs et dans les zones humides aux climats temprs. Elle produit de

nouvelles plantes ou clones qui se dveloppe travers les stolons qui poussent dans les

aisselles des feuilles (Figure 12). Au printemps des stolons latraux sont produits dans les

feuilles et la production de stolons continue jusqu la fin de lt. Une deux stolons par

plante sont communes mais il y a des plantes qui peuvent avoir jusqu cinq ainsi que des

branches secondaires [Holm et al., 1997]. En automne, quand les rameaux sont tablis le

stolon devient ple et meurt laissant des rosettes physiologiquement indpendantes se

dvelopper et deviennent des fleurs. La saison prochaine pendant que la plante originale plit

et meurt, la nouvelle plante peut persister durant lhiver comme une petite rosette. Le court

caudex stocke les matires nutritives qui permettent lacclration de la croissance en

printemps (entre Avril et Juin) [Holm et al., 1997 ; Sarukhan, 1976]. Une enqute a rvle

que chaque fleur produisait une vingtaine de graines. En gnral, la saison de fleurs est entre

Avril Juillet [Alex, 2001]. Cette floraison est suivie de fruits en deux semaines. La

Ranunculus repens est rsistante la gele et survit la scheresse modre [Holm et al.,

1997].

Figure 12: La plante Ranunculus repens L dans son milieu systmatique (Chekfa, Jijel, Est

Algrie).

1.6.3. Ethnopharmacologie de la Ranunculus repens L

Ranunculus repens L est une plante appartient la famille Ranunculaceae, communment

appele EL-Faiha (Berbre). Dans la mdecine traditionnelle, les feuilles sches sont utilise

sous forme dinfusion pour traiter le diabte sucr et la jaunisse en petite Kabylie (Est

dAlgrie). Selon les rsultats dune tude non publies, cette plante parait riche en composs

polyphnoliques et contient une teneur importante en flavonodes. La consultation de la

littrature scientifique ne montre aucune recherche phytopharmacologique sur cette plante

[Holm et al., 1997 ; Sarukhan, 1976 ; Alex, 2001].

3. Matriel et mthodes

3.1 Prparation des extraits phnoliques

Les jeunes pousses de feuilles de Ranunculus repens L ont t rcoltes au mois d avril 2004

dans la rgion de Chekfa (Wilaya de Jijel, Est Algrie) au cours de la priode de floraison.

Aprs leur identification par le Laboratoire de phytopharmacologie, Universit de Jijel, les

chantillons de feuilles sont nettoys puis mis scher temprature ambiante dans un

endroit ar lombre pour mieux conserver les molcules sensibles la chaleurs et la

lumire. Le broyat va constituer la matire sche qui va servir lextraction des flavonodes.

3.1.1. Extraction des flavonodes

Lextraction des flavonodes est ralise selon la mthode de Markham (1982), avec

modification inspire selon la mthode de Bruneton (1993). Elle est base sur le degr de

solubilit des flavonodes dans les solvants organiques (Figure 13). Cette mthode comprend

deux grandes tapes : la premire phase dextraction se fait avec le mthanol pour solubiliser

les flavonodes et la deuxime est ralise avec lther dithylique ( extraction des gnines

libres) et lactate dthyle (extraction des monoglycosides) et le n-butanol( pour solubiliser

les di et les triglycosides).

Lextraction des flavonodes est effectue partir de la matire sche finement broye par

du mthanol 85% (10% W/v). Le macrt est filtr sur Bchner sous pression rduite puis

soumis une vaporation basse pression 35C (Rota Vapor, Bchi 461, Germany). La

phase aqueuse ainsi obtenue est conserve 48 heures 40C pour acclrer la diffusion des

molcules dans les solvants puis filtre. Le filtrat est dbarrass des cires, des lipides et de la

chlorophylle par trois lavages successifs avec lther de ptrole (v/v) pour donner une phase

aqueuse. Afin de sparer les flavonodes en fractions aglycones, monoglycosides et di et

triglycosides, la phase aqueuse est mlange avec lther dithylique (v/v) pour obtenir une

phase organique contenant les flavonodes aglycones et les aglycones mthoxyls. La phase

aqueuse restante subit son tour trois extractions avec lactate dthyle afin de rcuprer

dans la phase organique certains flavonodes aglycones mais surtout les monoglycosides. La

phase aqueuse restante est mlange avec le n-butanol pour rcuprer notamment les

flavonodes di et triglycosides. La phase aqueuse finale contient surtout les flavonodes

glycosyls plus polaires. Les quatre fractions rcoltes sont concentres par vaporation

basse pression 35C puis lyophilises pendant 24 heures (ALPHA 1-2 LD, Fisher

Bioblock). La lyophilisation permet dobtenir un produit facilement soluble dans leau et qui,

aprs addition deau, prsente les mmes caractristiques que le produit dorigine. Chaque

Lyophilisat est pes pour calculer le rendement de lextraction, exprim en gramme de

lyophilisat par 100 g de matire sche.

3.1.2. Dosage des polyphnols

Lvaluation des polyphnols totaux est ralise selon la mthode du bleu de Prusse de

Price et Butler, 1977 [Butler, 1989], modifie par Graham (1992) pour donner une meilleur

stabilit de la couleur. La diffrence entre la mthode originale et la mthode modifie rside

dans lutilisation du FeCl3 la place du FeNH4 (SO4)2 comme second ractif.

Une prise dessai de 0.1 ml de mthanol (contenant 0.02 mg de lextrait n-butanolique, 0.02

mg de lextrait dactate dthyle, 0.06 mg de lextrait dther thylique ou 0.04 mg de

lextrait aqueux) est mlange avec 3 ml deau distille. 15 min aprs laddition successive de

1 ml de K3Fe (CN) 6 0.016 M et de 1 ml de FeCl3 (0.02 M dans HCl 0.1 N), 5 ml de

stabilisant (mlange deau bi distille, de lacide phosphorique 85 % et de la gomme arabique

1% (dans les proportions 3 :1 :1 v/v/v) sont ajouts et labsorbance est lue 700 nm

(Shimadzu UV 1601, Japan).

Une gamme talon est tablie sparment avec lacide gallique (25-200 g/ml) (figure 1,

Annexe 1) pour calculer la concentration des polyphnols dans chaque extrait. Les rsultats du

dosage sont exprims en mg dquivalent dacide gallique par gramme de lyophilisat

- Extraction (mthanol 85%, 1 : 10 w/v) - Conservation 4C/72 - Filtration (mousseline) - Extraction (mthanol 85%, 2 fois, v /v) - Filtration (mousseline) - Extraction (mthanol 50%, 2 fois) - Filtration (mousseline) - Filtration (papier filtre) - Evaporation basse pression 35C - Conservation 4C /48 h - Filtration (papier filtre) - Lyophilisation Figure 13 : Protocole de fractionnement des flavonodes de RRL

Filtrat

Phase aqueuse

Phase organique

Evaporation basse pression 35C

Phase aqueuse

Phase organique

Phase organique

Sdiment

Phase aqueuse

Matire sche

Broyage

Filtrat Sdiment

Sdiment Filtrat

Filtrat Sdiment

Filtrat combin

Phase aqueuse

Extrait dther dithyl (Flavonoides aglycones)

Extrait dactate dthyle (Flavonoides mono

glycosides)

Extrait n-butanol (Flavonoides di et

triglycosides)

Extrait aqueux (Falvonodes trs polaires)

Phase organique (cires, lipides, chlorophylle)

Lavage avec lther de ptrole Lavage avec lther de ptrole Lavage avec lther de ptrole Lavage avec lther de ptrole

Extraction (ther di-thyl, 3 fois, v/v)

Extraction (actate dthyle, 3 fois, v/:v)

Phase aqueuse

Extraction (butanol, 3 fois, v/v)

3.1.3 Dosage des flavonodes

Lvaluation quantitative des flavonodes dans les diffrentes fractions est ralise selon la

mthode du trichlorure daluminium [Bahorun et al., 1996]. Brivement, les chantillons sont

prpars par la dissolution des lyophilisats obtenus lors de lextraction dans le mthanol :

extrait dther dithylique 0.14 mg/ml ; extrait dactate dthyle 0.06 mg /ml ; extrait de n-

butanol 0.02 mg/ml ; extrait aqueux 0.2 mg/ml. A 1 ml de chaque chantillon est ajout 1ml

de LAlCl3 2% dans le mthanol. Dix minutes aprs le dbut de la raction, labsorbance est

lue 430 nm.

Une gamme talon est tablie sparment avec la querctine (1-25 g/ml) (figure 2, Aannexe

1) pour calculer la concentration des flavonodes dans chaque extrait. Les rsultats du dosage

sont exprims en milligramme dquivalent de querctine par gramme de lyophilisat.

3.1.4. Evaluation du pouvoir oxydant des flavonoides

La capacit antiradicalaire des flavonodes di et triglycosydes (EB) est value in vitro par

la mthode de DPPH (2, 2 - Diphenyl-1-picrylhydrazyl) rapport par Wahllandir et al.

(1979). Brivement, 15l de diffrentes concentrations de flavonodes 0.1, 0.2 et 0.4 mg/ml,

(0.158, 0.079 et 0.039 mg dquivalent en querctine (en considrant leur pourcentage dans le

(lyophilisat), sont ajouts 1.5 ml de DPPH dans une solution thanol (100M). Un tube

standard est prpar avec la vitamine C (0.158 mg/ml). Labsorbance est lue chaque 30 s

durant 5 min 515 nm. Leffet boueur des flavonodes est exprim en pourcentage de

DPPH rduit en partant du 100% du tmoin (DPPH seul) selon la relation suivante:

% de rduction = [AT - AE/AT].100

AT: Absorbance du tmoin aprs 5min.

AE: Absorbance de l'essai aprs 5 min.

3.2. Exprimentation animale

3.2.1. Animaux et conditions dhbergement

Les animaux dexprience sont des rats males de varit Wistar (Institut Pasteur, Alger)

pesant entre 220-250 g. Tous les animaux de statut sanitaire EOPS (Exempts dorganismes

pathognes spcifiques).

Ds leur rception, les rats sont placs alatoirement en groupe de 6 dans des cages standard

pour une priode dacclimatation (2 semaines) avant dtre utiliss dans les diffrentes

expriences. Pendant cette priode les animaux ont un accs libre la nourriture et leau

(croquettes provenant de la socit de production des aliments danimaux, Bouzarat, Alger )

et sont maintenus dans une animalerie temprature constante (22 2) C soumis un cycle

de lumire/obscurit de 12/12h. La phase obscure de ce cycle commence 12h et les

diffrentes expriences ont toujours lieu de 13h 18h en raison de lactivit nocturne de

lanimal (phase active).

3.2.2. Recherche de la toxicit des flavonodes de RRL

La DL50 des extraits flavonodiques de Ranunuculus repens L nest pas connue dans la

littrature consulte ainsi la recherche dune ventuelle toxicit de la plante est ncessaire.

Pour ce faire, lextrait butanolique de RRL aux doses de : 25, 250, 500, 1000, 2000 mg/kg

dans une solution physiologique (Na Cl 0.9%) sont administrs par voie orale aux cinq

groupes de rats et la solution physiologique au sixime groupe servant de contrle. Les rats

sont mis lobservation continue durant 72h concernant les symptmes de toxicit, le

changement de comportement et la mortalit [Litchfield and Wilcoxon, 1949].

3.2.3. Test de tolrance au glucose

Le pouvoir hypoglycmiant est mesur afin de dterminer la dose la plus efficace des

diffrents extraits flavonodiques de RRL (extrait dther dithylique, extrait dactate

dthyle, extrait n-butanolique). Les trois extraits sont mis en suspension dans une solution de

srum physiologique (Na Cl 0.9%) puis administrs des rats par voie orale (100 mg de

lyophilisat/ kg) une heure avant le gavage gastrique dune solution de glucose la dose de 4

g/kg. Les animaux tmoins sont rpartis en groupe tmoin recevant une solution

physiologique, un groupe hyperglycmique recevant une solution de glucose (4 g/ kg) et un

troisime groupe standard recevant la glibenclamide (mdicament hypoglycmiant) la dose

de 2.5 mg/kg [Silva et al., 2002] une heure avant ladministration du glucose par voie orale.

Lvolution de la glycmie est suivie avant et chaque demi heure sur une dure de 2 heures de

traitement. Le dosage de glucose srique est ralis par une mthode colorimtrique utilisant

des Kits (Biomrieux, France) sur un automate multiparamtrique (TECHNICON, Germany).

Le pourcentage de la chute de la glycmie (PCG), est utilis comme index de lactivit

hypoglycmique des flavonodes [Puri, 2001].

3.2.4. Evaluation de leffet des flavonodes sur le stockage de glycogne

hpatique et linsulinoscrtion

3.2.4.1. Evaluation du stockage de glycogne hpatique

Lvaluation du taux de la teneur hpatique en glycogne chez les rats hyper

glycmiques est ralis selon le protocole suivant : 2 groupes de rats sont prpars : le

premier sert de contrle, reoit une solution de glucose la dose de 4g/kg dans une solution

physiologique par voie orale ; le second constitue le lot trait par les flavonodes la dose de

100 mg/kg, par voie orale, aprs une heure dadministration du glucose 4g/kg dans une

solution physiologique. 3 heures leffet des flavonodes, Les rats sont sacrifis par dislocation

cervicale et subissent une dissection abdominale. Les foies sont prlevs et fixs dans le

Bouin (formol/ acide picrique/ acide actique).

Lvaluation de glycogne est ralise par deux mthodes diffrentes, une mthode

colorimtrique et une mthode histochimique [Dedier, 1994] :

Mthode colorimtrique

5 grammes de foie frais sont coups en petits morceaux et bouillis ensuite dans 50 ml deau

distille pendant 2 minutes. Les fragments de foie sont goutts laide dune passoire et

broys avec le mortier. 25 ml deau distille sont jouts au broyat et la suspension obtenue est

bouillie pendant 5 minutes. Le bouillonnt est filtr sous vide sur Bchner puis le filtrat est

rcupr avec 3 gouttes dHCl (pour prcipiter les protines) et est filtr nouveau. Le filtrat

est trait par 4 fois son volume dalcool 95% puis filtr sous vide et le filtrat final est repris

avec 2 ml deau distille (figure 14).

Pour doser le glycogne, 3 ml deau distille et une goutte de Lugol sont ajouts 1 ml

dextrait de glycogne obtenu et la densit optique de la coloration brun acajou est lue 470

nm [Dedier, 1994].

La concentration de glycogne est dduite partir dune gamme talon tablie avec du

glycogne pure comme standard figure 1, (Annexe1,).

Mthode Histochimique

- Prparation des blocs: Aprs fixation dans le Bouin (on ralise une dissection de labdomen afin dextraire le foie. Le foie est bien lav et puis conserv dans un fixateur

[solution du Bouin (formol / acide picrique / acide actique)].

Les fragments des foies sont dshydrats par submersion dans des bains dthanol des

concentrations allant en ordre croissant : 60 %, 70% ,80%, et 100%.

Aprs dshydratation par lthanol, les chantillons subissent deux bains de xylne et deux

autres de paraffine fondue. Le xylne occupe la place de leau et donc facilite la pntration

de la paraffine puisque cette dernire est hydrophobe. La dure de chaque bain est de 24

heures. Les chantillons des foies sont placs dans des moules (barres de Leucart) et

recouverts de paraffine fondue. Aprs refroidissement, les blocs sont prts la coupe.

- Ralisation des coupes et coloration : les blocs sont placs dans le microtome afin de

raliser des coupes de 3m dpaisseur. A laide dune pince trs fine, les coupes sont

places sur des lames couvertes de glatine qui sont ensuite dparaffines par chauffage

ltuve pendant une heure.

Pour mettre en vidence les hpatocytes, les coupes sont dabord rhydrates par submersion

successivement dans les bains suivants : 2 bains de tolune (30 min), 5 bains dthanol des

concentrations dcroissantes : 100%, 90%, 80%,70%, 60% (5 min chacun). Aprs rinage

dans de leau distille, les coupes rhydrates sont places dans un bain dhmatoxyline (8

min) pour colorer les noyaux, lexcs de colorant est enlev par lacide chlorhydrique. Elles

sont mises ensuite dans un bain dosine (8 min) pour colorer le cytoplasme, lexcs de

colorant est enlev par lthanol.

Pour mettre en vidence les granules de glycogne hpatique, les lames ayant subi la

coloration de base, sont submerges dans un bain de Lugol (leau iod) pendant 15 min puis

dans un bain dthanol pour liminer lexcs du ractif. Les lames ainsi colores sont

couvertes de lamelles et prtent lobservation microscopique (objectif x 100).

Pour viter les interfrences de couleurs, une deuxime coloration de base est faite ensuite par

le bleu de mthylne qui remplace lhmatoxyline et losine dont le but est damliorer

lobservation des coupes et les granules de glycognes.

3.2.4.2. Evaluation de leffet des flavonodes sur linsulinoscrtion

Pour valuer leffet de lextrait butanolique sur la scrtion insulinique, un groupe de

rats normoglycmique est trait par une monoprise de flavonodes (EB) la dose de 100

mg/kg. Deux autres groupes tmoin et standard reoivent respectivement de la solution

physiologique et de glibenclamide (2,5 mg/kg). Linsulinmie est mesure avant gavage et

aprs 60 et 90 min par une mthode immuno-enzymatique de type ELISA [Monti et al.,

1995], (AxSYM Insulin reagent pack, Abbott Laboratory, USA). Ce dosage est effectu sur le

srum, aprs centrifugation en vitant lhmolyse qui gne le dosage immuno-enzymatique et

dans les plus brefs dlais afin dviter la destruction de lhormone par les insulinases

plasmatiques.

3.2.4.3. Effet des flavonodes sur la complexation du glucose in vitro : Test

de glycosylation

Le but de ce test est destimer la capacit des flavonodes complexer le glucose libre

in vitro, donc dmontrer leur rle de glucophage. Bien que les conditions in vivo et in vitro

soient diffrentes, ce test pourra nous renseigner sur un des mcanismes hypoglycmiants les

flavonodes. Pour cela, 10 l dune solution glucose (0. 61g/l) est mlang avec 10 l de

chaque extrait flavonodique (Aglycones, monoglycosides, di et triglycosides) diffrente

concentration : 1 mg, 2mg et 4 mg/ml. Le tmoin est constitu par 10l deau distille. Le

mlange ainsi obtenu est incub 37C pendant 15 min. Le dosage de glucose non li aux

extraits flavonoiques est mesur selon la mthode de Bertrand prcdemment dcrite.

Figure 14 : Protocole d'extraction du glycogne hpatique

Sacrifice des animaux

Peser et couper 5 g de foie frais

Bouillir dans 50 ml d'eau distille

Broyage

Ajouter 25 ml d'eau distille

Bouillir 5 mn

Filtration sous vide Filtrat

Rcupration avec 3 gouttes d'HCl

Filtration sous vide

Rcupration avec 4 fois son volume d'alcool

Filtration sous vide Filtrat

Reprendre avec 2 ml d'eau distille

Liquide hpatique contenant le glycogne

Filtrat

3.2.5. Evaluation de lactivit antidiabtique des composs phnoliques

3.2.5.1 Induction de diabte exprimental

Pour valuer lactivit antidiabtique des flavonodes, un modle de rat diabtique

induit par lalloxane est ralis. Linjection de lalloxane par voie intra pritonale (125

mg/Kg de poids) dclenche un diabte chez le rat [Diatewa et al., 2004], sachant que

lalloxane monohydrate est indicteur de diabte qui provoque une ncrose slective sur les

cellules bta du pancras donnant ainsi une dficience insulinique chronique [Dhanabal et al.,

2007].

Lalloxane monohydrate (Pharmacia, St.Quentin en Yvelines, France), reconstitu juste avant

ladministration dans une solution physiologique (Na Cl 0.9%) pour constituer la

concentration dcrite prcdemment pour tre inject au rat une semaine aprs linjection, une

valuation de glucose sanguin est effectue et les rats dont le glucose sanguin est suprieur 2

g/l sont considrs diabtiques et rpartis alatoirement en groupe de 5.

3.2.5.2. Effet aigu de lextrait butanolique sur les rats diabtiques

Le test de tolrance au glucose montre une meilleure amlioration de la tolrance des

animaux au glucose avec lextrait n-butanolique, (EB) (di et triglycosides)

Afin dvaluer leffet antidiabtique de lextrait n-butanolique, 5 groupes de 5 rats sont

utiliss: le groupe 1, contrle diabtique recevant 1 ml dune solution physiologique (Na Cl

0.9%) par voie orale ; les groupes 2, 3 et 4 reoivent respectivement lextrait EB de la RRL

par voie orale en une seule dose de 200, 400 mg/kg et 600 mg/kg dans une solution

physiologique ; le groupe 5, contrle standard, reoit la Glibenglamide la dose de 2,5mg/kg,

p.o. La glycmie des animaux est mesure avant gavage et 30, 60, 90 et 120 min aprs le

traitement.

3.2.5.3. Effet subchronique de lextrait butanolique (EB) sur les rats

diabtiques

Pour valuer leffet antidiabtique de lextrait butanolique sur les rats diabtique durant

28 jours, trois groupes de rats sont utiliss cet effet. Un groupe diabtique et un groupe

standard reoivent par gavage respectivement une dose quotidienne de 200 mg/kg de

flavonodes et de 2,5 mg/kg de glibenclamide ; un groupe tmoin diabtique reoit une

solution physiologique (Na Cl 0.9%). La glycmie des animaux est mesure J+7, J+14, J+21

et J+28.

3.2.5.4. Le prlvement du sang

2 ml de sang sur EDTA 8,5 % sont prlevs au besoin laide dune pipette pasteur

travers le sinus rtro-orbital au niveau de lil des rats. Le sang rcupr est immdiatement

centrifug 4000 t/min pendant 10 minutes 10C centrifugeuse (Bioblock Sscientifc

Centrifugeuse 55702), pour lanalyse des paramtres biochimiques.

3.2.6. Effet prventif des extraits de flavonodes et de la querctine sur le diabte

induit par lalloxane

Lactivit antioxydante des flavonodes est tudie in vivo 5 heures aprs linjection de

lalloxane. Deux groupes prtraits par les flavonodes ou la querctine sont compars un

groupe tmoin. Aprs le traitement, les rats sont sacrifis par dislocation cervicale et les

pancras sont prlevs.

Le 1er groupe reoit, par voie orale, deux doses de 200 mg de lyophilisat /kg (0.794 mg

quivalent de querctine) avant et aprs deux heures de linjection de lalloxane, le second est

trait par la querctine pure la mme dose (tmoin positif) en fin le 3eme groupe (tmoin

ngatif) a reu la solution physiologique en plus de linjection de lalloxane.

La glycmie et linsulinmie sont mesures avant et aprs dix jours de traitement (injection de

lalloxane et/ou de flavonodes).

3.2.7. Recherche des mcanismes de prvention des extraits butanoliques de RRL

3.2.7.1. Peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique dans le pancras est value par le dosage de

malondialdhyde (MDA) selon la mthode dOhkawa et al. (1979)]. Le MDA est lun des

produits terminaux de la dcomposition des acides gras polyinsaturs (PUFA) sous leffet des

radicaux libres librs au cours du stress. En milieu acide et chaud (pH 2 3, 100 C) une

molcule de MDA est condense avec deux molcules de thiobarbiturique (TBA) pour former

un complexe color en rose (lecture 530 nm). Le principe de cette mthode est rsum

ainsi (figure 15) :

Figue 15; Principe du dosage du malondialdhyde

Pour le dosage du MDA, 1 g de pancras est additionn 3 ml de solution de KCl (1,15 M)

puis broyage par un homogniseur de Dounce (Kontes, Glass companyan ISO-9001 steered

firm, New Jersey USA). 0,5 ml de lhomognat 0,5 ml dacide trichloractique 20 % et 1 ml

dacide thiobarbiturique (TBA) 0,67 % sont additionns. Le mlange est chauff 100 C

pendant 15 minutes, refroidi puis additionn de 4 ml de n-butanol. Aprs centrifugation de 15

minutes 3000 tours/minute, labsorbance est dtermine sur le surnageant au

spectrophotomtre (LKB II) 532 nm.

La concentration de MDA est dduite partir dune gamme talon tablie dans les mmes

conditions avec 1, 1, 3,3 ttratoxypropane qui donne le MDA aprs son hydrolyse en

solution figure 4, (Annexe1). Les rsultats du dosage sont exprims en nmol/gramme de

pancras.

3.2.7.2. Dosage de glutathion pancratique (GSH)

Le dosage du GSH est bas sur la mthode colorimtrique dEllman (1959). Le principe

est bas sur la raction doxydation du GSH par lacide 5, 5- Dithiobis 2-nitrobenzoque

(DTNB) librant ainsi lacide thionitrobenzoque (TNB) absorbant 412 nm, selon la raction

suivante (figure 16) :

Figure 16 : Principe de dosage du glutathion

Pour ce dosage, un gramme de pancras (frais ou congel) est homognis dans trois

volumes de TCA 5 % laide dun broyeur de Dounce puis centrifug 2000 rpm. 50 l de

surnageant sont dilus dans 10 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 8). 3 ml du mlange de

dilution, 20 l de DTNB (0,01 M) sont additionns.

Labsorbance est lue 412 nm contre un blanc prpar dans les mmes conditions avec le

TCA 5 %. Les concentrations sont exprimes en nmol/gramme de foie. Elles sont dduites

COOH

NO2

S

5

S

NO2

COOH

NO2

COOH

S S

G

+ GSH

SH

COOH

NO2

+

TNB absorbant

Acide glutathionyl-dithio-nitrobenzoque

DTNB

partir dune gamme talon tablie dans les mmes conditions avec le glutathion figure 4,

(Annexe 1).

3.2.7.3. Evaluation de lactivit enzymatique de la catalase (CAT)

Lactivit enzymatique de CAT est dtermine par la mthode de Clairborne (1985). Le

principe est bas sur la disparition de lH2O2 en prsence de la source enzymatique 25 C

selon la raction suivante :

2 H2O2 2 H2O + O2

Avant lvaluation de lactivit enzymatique de CAT, une fraction enzymatique est prpare

selon la mthode dIqbal et al. (2003) comme suit : 2 g de pancras sont coups et

homogniss dans 3 volumes de tampon phosphate (0.1M, pH 7.4) contenant du KCl

(1.17%) par un homognisateur de Dounce. Lhomognat est centrifug 2000 rpm durant

15 min 4 C. Le surnageant obtenu est centrifug 9600 rpm durant 30 minutes 4 C

(Centrifugeuse SIGMA 6k15) et le surnageant final reprsente la source utilise pour

lvaluation de lactivit des enzymes (catalase et superoxyde dismutase).

Pour cela, un mlange est constitu de 1 ml de tampon phosphate (KH2PO4, 0.1 M, pH 7.2),

0.975 ml de H2O2 frachement prpar (0.091 M) et de 0.025 ml de la source denzyme (le

cytosol). Labsorbance est lue 560nm chaque minute pendant 2 minutes et lactivit

enzymatique est calcule en terme dunit internationale par minute et par gramme de

protine (UI / min/g de protine), selon la formule :

UI/g= (2.3033/T) (logA1/A2) /g de protine.

A1 : Absorbance la premire minute.

A2 : Absorbance la deuxime minute.

T : Intervalle de temps en minute.

Catalase

La concentration cytosolique des protines est value par la mthode de Lowry (1951), dans

les mmes conditions, une gamme talon est tablie en utilisant le srum albumine bovine

(BSA) avec le ractif phnolique de Folin, figure 6 (annexe1). Labsorbance est lue 750 nm.

3.2.7.4. Evaluation de lactivit enzymatique du superoxyde dismutase

(SOD)

Lvaluation de la SOD est ralise sur le cytosol par la mthode de Beauchamp et

Fridovich (1971). Un mlange est constitu de 2 ml du milieu ractif (Cyanide de Sodium 10-

2 M, solution de NBT(nitroblue de tetrazolium) 1.76x 10-4 M, EDTA 66 mmol, Methionine

10-2 M, Riboflavine 2 mol, pH 7.8) et 5L de cytosol. Ce mlange est expos la lumire

dune lampe de 15 Watt pendant 10 min pour induire la photoraction de La riboflavine et de

lO2. La rduction de NBT par les anions superoxydes en formazan est suivie par le

spectrophotomtre 560 nm. Lactivit enzymatique est calcule en termes dUI/mg de

protines.

3.2.8. Evaluation statistique

Les rsultats sont donns sous forme de moyennes et cart-types. Lvaluation statistique est

effectue en utilisant le test t de Student. La valeur trouve par le calcul du t peut affirmer que

les populations sont diffrentes avec un risque derreur p tel que :

p > 0,05 = la diffrence nest pas significative ns ;

0,05 > p > 0,01 = la diffrence est significative* ;

0,05 > p > 0,001 = la diffrence est hautement significative**;

p < 0,001 = la diffrence est trs hautement significative***.

Le calcul statistique est realis par Statview 4.5 statistical package (Abacus Conceps, Int).

3.3. Rsultats et interprtation

3.3.1. Extraction et dosage des composs phnoliques

Lextraction des flavonodes par la mthode daffrontement par les solvants organiques

partir de la poudre des jeunes pousses de feuilles de la plante RRL, montre que lextrait

aqueux reprsente le rendement le plus lev (20%) suivi de lextrait butanolique (18%) puis

de lextrait dactate dthyle (6%). Le rendement le plus faible (1%) est obtenu par lextrait

dther thylique (Tableau. 3).

Tableau 3 ; Evaluation quantitative des polyphnols totaux et des flavondes

des extraits de Ranunculus repens L.

Extrait Rendement

moyen (%)

Polyphnols (mg quivalent

dacide gallique/g de

lyophilisat

Flavonodes (mg quivalent

de querctine/g de

Lyophilisat)

Ether dithylique 1 60 50

Actate dthyle 6 270 160

Butanol 18 516 397

Eau 20 150 25

Le dosage des polyphnols totaux par la mthode modifie de bleu de Prusse montre, en

plus de sa sensibilit, une reproductivit puisque labsorbance est troitement corrle la

concentration de lacide gallique utilis dans la gamme talon, r = 0.96 (figure 4, annexe1).

Les rsultats de dosage de polyphnols rvlent que les extraits butanolique/actate dthyle

continnent respectivement 516 mg et 270 mg dquivalent dacide gallique/g de lyophilisat.

Les extraits aqueux/ dther dithylique en contiennent moins avec des concentrations

successives de 150 et 60 mg /g (Tableau 4).

Lvaluation quantitative des flavonodes (la querctine sert de standard) montre une

corrlation positive entre la variation de ce flavonode (1 25 g/ml) et labsorbance avec un

coefficient de corrlation r = 0.96 (figure 5, Annexe 1).

Les teneurs en flavonodes varient dans les mmes proportions que celle des polyphnols:

lextrait butanolique est plus riche en flavonodes (397 mg/g) suivi de lextrait dactate

dthyle (160 mg/g). Les extraits dther dithylique et aqueux ont une teneur moindre (50

mg/g et 25 mg/g respectivement, ( Tableau 3).

2.2. Evaluation du pouvoir antiradicalaire des flavonodes

Lactivit antiradicalaire in vitro des flavonodes est value par la diminution du taux de

DPPH dos aprs laddition des flavonodes diffrentes concentrations (figure 17).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Temps X30S

Abs

orba

nce

du D

PPH

Tmoin+ ED

Tmoin+Vit.C(0,4mg/ml)Tmoin+flav.(0,4mg/ml)Tmoin+flav.(0.2mg/ml)Tmoin+flav.(0.1mg/ml)

Figure 17: Pouvoir antiradicalaire des flavonodes (moyenne de 3 essais).

La lecture de cette figure, montre que leffet antiradicalaire des extraits de flavonodes est

dose dpendant. Le pouvoir antioxydant des flavonodes vis vis du DPPH, le plus lev

(78, 24 %) est observ avec une dose de 0.4 mg /ml; pouvoir quivalent celui quexerce la

vitamine C (78 ,51%) la mme concentration.

3.3.3. Effet des flavonodes sur la tolrance au glucose

Les rsultats de lvaluation de la tolrance au glucose chez les animaux hyperglycmiques

traits par les diffrents flavonodes sont rassembls dans le tableau 1 (annexe2) et illustrs

dans la figure 18.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 30 60 90 120

Temps (min)

Gly

cm

ie [g

/l] Tmoin normalTmoin Hyp.Trait Agly.Trait Mono.Trait di. et tri.Standard Gli

Figure 18 : Evolution de la tolrance au glucose chez les rats hyperglycmiques

traits par les diffrents types de flavonodes.

Nous constatons un effet bnfique des flavonodes et de la glibenclamide lorsque les rats

sont prtraits par ces substances : lhyperglycmie est tardive chez cette catgorie de rats

prtraits par rapport aux rats non traits (90 min contre 60 min respectivement).

Cet effet est hautement significatif (p < 0.001) pour tous les ra