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Miltenyi Biotec: 免疫磁珠分选技术及应用

德国美天旎生物技术有限公司北方区技术支持

王卉

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内容

• MACS 技术原理 • MACS 技术设备及分选策略 • 几种特殊的 MACS 分选 分选和分析 DC 细胞

分选各种 T 细胞 分选和分析细胞因子分泌细胞

分选造血干细胞 分选人类肿瘤细胞 分选和分析凋亡和死亡细胞 分选转染细胞 分子生物学和蛋白生化的分选

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MACS 技术原理

MACS(Magnetic Activated Cell Sorting) ：= 免疫学 + 细胞生物学 + 磁力学

• 基于抗体对抗原的特异性识别

• 磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连

• 在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的

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MACS® 磁性分选

MACS 微珠进行磁性标记

未标记的细胞先行流出

洗脱阳性分选的细胞

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分选前标本制备：过滤

MACS 预选滤器：30m

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MACS 技术

设备与试剂

» MACS 微珠

» MACS 分选柱

» MACS 分选器

» 详细分选方案 *

MACS 技术设备与试剂

• MACS 微珠： MACS 微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁

化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。

• 特性： 50nm 大小 对细胞没有毒性 可生物降解 不影响细胞特性

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MACS 技术分选的 CD8+ T 细胞

微珠

MACS 微珠直标微珠

多选微珠

间标微珠

MACS 技术设备与试剂

• MACS 分选柱： 》填充有不同规格的铁珠。

》铁珠表面有亲水包被，不损伤细胞。 》无菌包装。 》可用于分选多种细胞及亚细胞物质、 细菌、病毒、 mRNA 和蛋白质。• 专利产品• 将磁场扩大 1000 － 10000 倍——高纯度，高回收率

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在 MS 柱中产生的强大磁场

• MACS 分选柱：

MACS 技术设备与试剂

• MACS 分选器：从手动到自动，从实验室到临床

MACS 技术设备与试剂

• MACS 分选器

MACS 技术设备与试剂

autoMACS 分选仪• 9 种程序，一机完成所有细胞分选• 成本低，两个可重复使用的分选柱（ 2 周内 100 次）• 快速（ 3 － 10 分钟）•重复性好• 全自动分选，仪器操作简单• 适用范围广：从少量标本（ 105

）到大量标本（ 4X109 ），进样量0.5ml-50ml• 8 种全血微珠，可以做常见细胞的全血分选，省去了费时的提取单个核细胞过程

MACS 技术主要优势 • 小磁珠 : 50 nm （快速、不活化细胞、不沉淀）

• 保留细胞功能（直接进行后续实验；无毒性；氧化 铁和多聚糖组成，可生物降解） • 与流式细胞仪兼容（不影响细胞光学特性、不影响荧 光抗体标记、与流式细胞仪分选联合使用可以缩短流 式分选时间）

• 快速、简便、无菌

• 适用范围广（磁珠种类多、从少量到大量、适用于分 选各种细胞、亚细胞物质）

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MACS® 细胞分选策略

• 阳性分选

• 去除分选

• 去除分选后再阳性分选

• 多重分选

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MACS 细胞分选策略1、阳性分选：

• 根据特异性标志分选细胞 : 阳性分选是指目的细胞磁性标记 后，作为阳性的标记组分直接分选出来。 • 优点：     》高纯度，尤其是富集稀有的细胞 》高回收率 》操作简便、迅速

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阳性分选策略

MACS® 微珠磁性标记

未标记细胞先行流出

将分选柱移出磁场，洗脱阳性分选

细胞

MACS 细胞分选策略2、去除分选：

• 去除分选是磁性标记非目的细胞，并将其从细胞混合物中去 除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。 • 去除分选策略适用范围：》去除不需要的细胞 》缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞） 》不需要抗体和目的细胞结合 》需进一步通过阳性选择分选细胞亚群

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去除分选

磁性标记 分选未磁性标记细胞

MACS 细胞分选策略3、去除分选后再阳性分选：

• 即先去除非目的细胞，再进行阳性分选。 • 适用范围：

》非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原。

》要分选非常稀有细胞，先去除非目的细胞再行阳性分选， 可获得高纯度的目的细胞。

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1. 去除非 CD4+ T 细胞。 用生物素化抗体混合物和抗生物素微珠间接磁性标记非 CD4+ T 细胞

磁性分选去除标记细胞

先行流出为 CD4+ T 细胞

2. CD25 微珠直接磁性标记 CD25+ 细胞

阳性分选靶细胞

CD4+ CD25+ 调节性 T滞留在分选柱上，离开磁场后洗脱下来

去除后再阳性分选 CD4+CD25+ 双阳性细胞

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多选微珠标记

MACS 分选

磁性颗粒的酶解离

终止解离反应

根据第二标志进行磁珠标记

MACS 分选

MACS 细胞分选策略4、多选微珠：

MACS畅销机器与分选柱 • MiniMACS starting kit ： 1 个分选架、 1 个 MiniMACS 分选器、 1 盒MS 分选柱、 1 支价值 7500元试剂（ 15088元）：可做阳性分选、小量标本、间标去除分选、分子生物学分选

• Mini&MidiMACS starting kit ： 1 个分选架、 1 个 MiniMACS 分选器、 1 个 MidiMACS 分选器、 1 盒 MS 分选柱、 1 盒 LS/LD 分选柱、 1 支价值7500元试剂（ 27838元）：可做阳性分选和去除分选 • MS 分选柱： 1盒 25 个， 2763元

• LS 分选柱： 1盒 25 个， 4356元

• LD 分选柱： 1盒 25 个， 5100元

• uMACS 与 u 或者 M 分选柱：分子生物学分选

• VarioMACS 分选仪

• autoMACS 自动分选仪、 CliniMACS 分选仪

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MACS 几种畅销磁珠与抗体 • 专利产品： CD133 、 CD303 、 CD304

• 特殊产品：人类 DC系列： BDCA-1(CD1c) 、 BDCA-2(CD303) 、 BDCA-3(CD141) 、 BDCA-4(CD304) 小鼠 DC系列： mPDCA 微珠与抗体 干细胞产品： CD133 、 CD271 微珠与抗体 细胞因子分泌细胞： CSA 分选与分析 TH2 细胞： CD294(CRTH) 微珠与抗体 分选人类肿瘤细胞：上皮肿瘤： CK 、 HEA 非血液肿瘤： CD45 去除 死亡细胞去除试剂盒 分选转染细胞 分选 HIV 病毒、 mRNA 、 cDNA • top ten ： CD133 、 CD34 、人 CD4+CD25+ 、小鼠 CD4+CD25+ CD303/CD304 、人类 NK 、小鼠 CD11c 、 anti-PE 微珠 小鼠干细胞试剂盒（系别阴性＋ CD117 ）、 CD4/CD8

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主要竞争对手分析

Dynal ：大磁珠 主要市场： CD4 、 CD8等高频细胞， 优势：价格 劣势：回收率低（不能做低频细胞、弱表达细胞分选） 磁珠必需剪切（耗时——细胞状态不佳） 大磁珠（活化细胞）

我们的优势：纯度高、回收率高、细胞活性好 不活化细胞，不改变细胞功能 省时、省细胞 产品品种最多，有专利产品 有手动、自动、临床级产品 有强大的技术支持队伍 很好的声誉，市场占有率最高

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主要卖点 干细胞产品：人类： CD133 、 CD34 、 MSC 试剂盒（ CD271 ） 小鼠：系别阴性试剂盒、 CD117 微珠 定向分化培养基 DC 产品： 人类： BDCA-1 、 BDCA-2/4 小鼠： CD11c NK 产品： 人类： NK 细胞阴选试剂盒、 CD3/CD56 T 细胞产品： CD4+CD25+调节性 T 细胞（人和小鼠） CSA系列 CD4 、 CD8 微珠及阴选试剂盒 B 细胞产品： CD19 微珠及阴选试剂盒 肿瘤细胞分选：癌细胞富集试剂盒、 HEA 微珠、 CD45阴选 单核细胞分选： CD14 微珠及阴选试剂盒 间标微珠 死细胞去除试剂盒 预选滤器、 FCR阻断剂、 T 细胞活化与扩增试剂盒 流式细胞仪抗体（价廉、包装量大、优质）

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识别 DC 和 DC 亚群 New

LineageLineage-- (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56)

HLA-DRHLA-DR++

PDCPDC

CD11cCD11c- - CD123CD123++

BDCA-2BDCA-2(CD303)(CD303)++ BDCA-4BDCA-4(CD304)(CD304)++

CD123CD123lowlow CD123CD123--

CD11cCD11c+ + CD123CD123low/-low/-

MDCMDC

MDC1MDC1 MDC2MDC2

BDCA-1(CD1c)BDCA-1(CD1c)++ BDCA-3(CD141)BDCA-3(CD141)+ ++ +

DC 亚群特异性标志 : Blood Dendritic Cell Antigens

BDCA-2/4BDCA-2/4++ BDCA-1BDCA-1++

BDCA-3BDCA-3++

CD11cCD11c++ DC DC

CD8CD8++ DC DC CD4CD4+ + DCDC

CD11cCD11c+ + B220B220+ + Gr-1 (Ly-6C/G)Gr-1 (Ly-6C/G)++ DC DCCD11cCD11c+ + B220B220-- DCDC

Conventional DCConventional DC

(“lymphoid“ DC)(“lymphoid“ DC) (“myeloid“ DC)(“myeloid“ DC)

CD11c CD8aCD11c CD8a CD11c CD4CD11c CD4

PE FITCAPC

CD11cCD11c

CD11c B220 Gr-1 CD11c B220 Gr-1

Plasmacytoid DC (PDC)Plasmacytoid DC (PDC)

mPDCA-1mPDCA-1

MACS® 技术分选与分析小鼠 DC 细胞 New

MACS® 技术分选与分析大鼠 DC 细胞 New

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Anti-DC(OX62) 微珠• 用于从大鼠外周血、淋巴和非淋巴组织中分选或者去除 OX62+DC 。• 单克隆抗体 OX62 识别表达于大部分大鼠 DC 上的整合素 αE2 亚单位（分子量 150kDa ）。• 两个主要的树突状细胞亚群： CD4/OX41 双阳性和CD4/OX41 双阴性亚群。 • 该抗原也表达于表皮 TCRα/β+ 或 γ/δ+ 的 T 细胞亚群和垂体前叶星状滤泡样（ S100+ ）细胞的一个亚群，但在朗格罕氏细胞和巨噬细胞上不表达。

MACS® 技术分选与分析功能性 T 细胞

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ThÏ °̧ û£ C̈D4£ ©

TcÏ °̧ û£ C̈D8£ ©

µ ÷½ ÚÐ ÔTÏ °̧ û(CD4+CD25+)

TCRr/d Ï °̧ û(TCRr/dÎ ¢Ö é)

NK/TÏ °̧ û(CD56¶ àÑ ¡Î ¢Ö é£ «CD3Î ¢Ö é)

T细 胞 亚 群

NaiveTÏ °̧ û(CD45ROÒ õÑ ¡)

» î» T̄Ï °̧ û£ C̈D69¡ ¢CD25¡ ¢CD30£ ©

Ð §Ó ¦TÏ °̧ û£ C̈D27£ ©

¼ ÇÒ äTÏ °̧ û£ C̈D45RAÒ õÑ ¡¡ ¢CD45ROÑ ôÑ ¡£ ©

Th2Ï °̧ û(anti-CRTH2)

T细 胞 功 能 亚 群

IFN-r

IL-2

IL-4

IL-10

TNF-a

¿ ¹Ô Ì ØÒ ìÐ ÔTÏ °̧ û

T细 胞 分 选

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MACS® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New

抗原特异性再刺激

细胞因子分泌阶段

捕获试剂标记

荧光标记和磁性分选

• •••

Catch Reagent

Detection Antibody

Anti-PE MicroBeads

cytokine secreting cell

secreted cytokine

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MACS® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New

分选前

刺激组

分选后

未刺激组

*百分比均为占 CD4 ＋细胞百分比

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MACS® 细胞因子分泌细胞分析 New

刺激组

未刺激组

                                                                                                   

                                                                                                   

                                                                                                   

使用 PE- CMVpp65/HLA/A2- tetramers 和 IFN- Secretion Assay - Detection Kit (APC) or IL-2 Secretion Assay - Detection Kit (APC) 检测 HLA/A2 CMV+ 患者 PBMC 。 * 百分比均为占 CD8 ＋细胞百分比

人类细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒

• IFN- 分泌细胞• IL-2 分泌细胞• IL-4 分泌细胞• IL-10 分泌细胞• TNF- 分泌细胞

MACS® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New

小鼠细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒

• IFN- 分泌细胞• IL-2 分泌细胞• IL-4 分泌细胞• IL-5 分泌细胞• IL-10 分泌细胞

人类干细胞分选微珠与试剂盒

• CD34 微珠及多选微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞 • CD133 微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞、多能成体干细胞（ MAPC ） • CD117 微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、骨髓间充质细胞

• CD45/GlyA 去除分选试剂盒：用于从骨髓中阴选分选 多能成体干细胞（ MAPC ）

• CD105 微珠：用于从骨髓中分选间充质细胞 • 抗成纤维细胞微珠：用于从骨髓中分选间充质细胞 多能成体干细胞（ MAPC ） • MSC 分选工具（ CD271 ） new ：用于从骨髓中分选间充质细胞

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MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR)new

成分 :

分选 :•CD271 (LNGFR)-APC•Anti-APC MicroBeads•FcR Blocking

培养 :•NH Expansion Medium (2x500 mL)•CytoMix - CD271 (LNGFR)

质量控制 :•NH AdipoDiff Medium (12x8 mL)•NH OsteoDiff Medium (12x5 mL)

Intr

odu

ctor

y of

fer

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MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR)人类 MSC 的标准化研究

CD271又叫做低亲和力神经生长因子受体 (LNGFR), 是迄今为止发现的最佳 MSC 分选标志，可用于直接从人类骨髓中分选 MSC 。

分选后 CD271 (LNGFR)+ MSCs是一群均一的 MSC 细胞群，而CD271阴性细胞成分中没有成纤维细胞克隆形成单位 (CFU-F) 活性。

与贴壁培养的 MSC 相比， CD271 分选的 MSC增殖能力增强 10－ 1000倍。 CD271 分选和扩增的 MSC 保留了多系分化潜能，具有分化为脂肪细胞和成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞的可塑性。

cumulative population doubling (CPD)

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MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR)人类 MSC 的标准化研究

Nadia Quirici等， Experimental Hematology 30 (2002) 783–791

MACS 小鼠干细胞分选试剂盒：Lineage Cell Depletion Kit: 去除成熟和分化的造血细胞，预富集造血干祖细胞。

CD117 MicroBeads ：分选早期和晚期干祖细胞 。

Anti-Sca-1 MicroBeads ：分选造血干细胞和早期造血祖细胞。

CD117+Sca-1+lin– 细胞也有非造血分化潜能，如分化为肌细胞、内皮细胞、肝细胞、神经系统细胞。

CD45/Ter119 微珠去除分选骨髓细胞，可以得到 MAPCs,也有体外分化为多种细胞的潜能。

小鼠骨髓造血干细胞 (HSC) 定义为 Sca-1+ 、 CD117+(c-kit) 、 Thy-1low 和 lin- 细胞 .

MACS® 技术分选人类肿瘤细胞 New

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•上皮肿瘤细胞 根据表面抗原进行分选与分析： Anti-HEA (EpCAM) MicroBeads Anti-ErbB-2 (HER-2/neu) MicroBeads根据细胞内细胞角蛋白分选与分析： cytokeratin

•黑色素瘤细胞分选： Anti-melanoma MicroBeads

•其它非造血系统肿瘤细胞 : CD45 MicroBeads 去除白细胞

•骨髓瘤细胞： CD138 MicroBeads

•霍奇金氏淋巴瘤 /RS 细胞： CD30 MicroBeads

MACS® 技术分选凋亡细胞 New

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刺激、分化、凋亡、脱颗粒、坏死

PS暴露

PS暴露细胞被 AnnexinV 微珠磁性标记

磁性标记细胞滞留在分选柱上

PS暴露细胞被洗脱下来

MACS® 技术分选转染细胞 New

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应用于功能基因、信号转导研究、药物筛选和标记技术。

MACSelect4转染细胞分选试剂盒使用pMACS4.1 和自己的质粒

转染细胞 用MACSelect4微珠标记转染细胞

MACS 分选转染细胞

分选后细胞可用于培养或者分析

MACS® 技术分选转染细胞 New

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优点： 省时：只需 2-3 小时（建立一个稳定的细胞系需数周）  纯度高，背景低 不影响转染细胞功能和活力  分选的细胞可直接用于培养或功能检测

可用于：原代细胞 & 细胞系 贴壁 &悬浮细胞 稳定 &短暂转染

MACS® 分子生物学和蛋白生化的分选

• 表位蛋白分选： µMACS 抗 His-, HA-, c-myc-, GFP- , GST- 蛋白分选 .

• 生物素化分子及其靶位分选： µMACS 链霉亲和素微珠

• µMACS 免疫沉淀： µMACS 蛋白 A 、蛋白 G 微珠

• mRNA 分选： 从细胞、组织、外周血、 总 RNA 中分选 mRNA

一步法 cDNA合成 new

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MACS® 分子生物学和蛋白生化的分选

优点：

• 分选柱上固定：高纯度利于灵敏的后续实验 作用温和，可获得理想的分子复合物 分选柱上分子修饰，可以减少细胞损失

• MACS 微珠： 敏感，可用于极少量的目的分子 快速：分选 mRNA仅需 15 分钟 免疫沉淀只需 1-2 小时 一步法 cDNA合成仅需 90分钟

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Miltenyi Biotec GmbH (headquarter)