khảo sát điều kiện cố định amylase trên silica-chitosan và silica-alginate

Cố định amylase trên vật liệu phối hợp silica gel SVTH: Nguyễn Ngọc Trâm

GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh i

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên xin cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, các chị và em trai của

em, những người đã không ngừng đồng hành và động viên em trên từng chặng đường khó

khăn, gian khổ để em có động lực phấn đấu và đạt thành tựu như ngày hôm nay.

Xin chân thành cám ơn:

- Xin gửi lời tri ân đến PGS. TS. Nguyễn Đức Lượng, một cán bộ lão thành của

ngành đã dốc hết lòng, công sức gầy dựng cho chúng em một chương trình học tập thật

logic và giúp chúng em có cái nhìn bao quát về ngành Công nghệ Sinh học, cũng như tạo

cảm hứng cho chúng em, định hướng cho chúng em có được sự lựa chọn đúng đắn cho

hướng đi sau này của mình.

- Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh – Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp.

Hồ Chí Minh đã rất nhiệt tình hướng dẫn, trao đổi và giúp đỡ tận tình trong suốt ba tháng

làm luận văn.

- Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy và truyền

đạt những kiến thức quý báu cho chúng em.

- Các bạn cùng lớp HC07BSH – Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh đã cùng em

trao đổi, động viên nhau trong thời gian làm luận văn.

Do thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn còn hạn hẹp nên khó tránh khỏi nhiều

điều sơ sót. Em rất mong nhận được những lời khuyên và góp ý từ các Thầy, Cô trong Bộ

môn để đề tài này ngày càng hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh ii

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Ngày nay enzyme cố định được sử dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp

nhờ vào khả năng tái sử dụng và khả năng điều khiển quá trình sản xuất bằng enzyme.

Nghiên cứu này khảo sát khả năng cố định Termamyl 120L trên silica-chitosan và silica-

alginate. Enzyme cố định trên silica-chitosan có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 60oC,

pH 8 và 60oC, pH 5,5 đối với enzyme cố định trên silica-alginate. Khả năng tái sử dụng

của α-amylase cố định trên silica-alginate (42 lần) cao hơn khả năng tái sử dụng của α-

amylase cố định trên silica-chitosan (30 lần). Sự đồng cố định glucoamylase và α-amylase

mang lại hiệu quả cao và có thể tái sử dụng lên tới 44 lần ở 50oC, pH 5,5. Các phản ứng

được thực hiện trong 30 phút, ở điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp.


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh iii

ABSTRACT

Nowadays the immobilized enzyme used universally in industrials thanked to

capability re-use and industrial process control capability by enzyme. In this

research, a thermostable α-amylase was immobilized by covalent bond onto silica-

chitosan beads and entrapment in silica-alginate beads. The optimum temperature

and pH of the enzyme α-amylase, immobilized by covalent bond onto silica-

chitosan are 60oC, pH 8, respectively. For the immobilization enzyme α-amylase

entrapped in silica-alginate, the optimum temperature and pH are 50oC and pH 5,5,

respectively. The capability re-use of the immobilized enzyme α-amylase entrapped

into silica-alginate beads (42 times) was higher than the immobilized enzyme onto

silica-chitosan beads (30 times). Co-immobilization glucoamylase and α-amylase in

silica-alginate beads resulted in high yields and could re-use up to 44 times at 50oC

and pH 5,5. The reactions were performed within 30 minutes, at suitable

temperature and pH value.


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh iv

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i

TÓM TẮT ĐỀ TÀI ................................................................................................. ii

MỤC LỤC .............................................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ vi

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... viii

Chương 1: MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1

1.1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 1

1.3. Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2

Chương 2: TỔNG QUAN .................................................................................. 3

2.1. Khái niệm về cố định enzyme ..................................................................... 3

2.1.1. Lịch sử phát triển và tình hình nghiên cứu enzyme cố định trong và

ngoài nước ....................................................................................................... 3

2.1.2. Đặc điểm của enzyme cố định ........................................................... 4

2.1.3. Ưu, nhược điểm của enzyme cố định ................................................ 5

2.2. Vật liệu cố định .......................................................................................... 6

2.2.1. Silica gel ........................................................................................... 8

2.2.2. Chitosan.......................................................................................... 10

2.2.3. Alginate .......................................................................................... 12

2.3. Hoạt hóa vật liệu bằng glutaraldehyde ...................................................... 15

2.4. Enzyme amylase ....................................................................................... 16

2.4.1. α-amylase ....................................................................................... 16

2.4.2. Glucoamylase ................................................................................. 18

2.5. Điều kiện phản ứng khi tiến hành xác định hoạt độ enzyme ...................... 20

2.5.1. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme .................................... 20

2.5.2. Một số lưu ý khi xác định hoạt độ enzyme ...................................... 21

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 22

3.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 22

3.2. Thiết bị ..................................................................................................... 23

3.3. Các phương pháp phân tích ....................................................................... 23


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh v

3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 23

3.4.1. Tạo bột silica gel ............................................................................. 23

3.4.2. Chuẩn bị hạt chitosan ...................................................................... 24

3.4.3. Chuẩn bị hạt silica-chitosan ............................................................ 24

3.4.4. Hoạt hóa hạt silica-chitosan với glutaraldehyde .............................. 24

3.4.5. Cố định Termamyl lên các chất mang ............................................. 24

3.4.7. Khảo sát nhiệt độ và pH tối ưu ........................................................ 25

3.4.8. Sự tái sử dụng ................................................................................. 26

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN ............................................................. 27

4.1. Enzyme tự do............................................................................................ 27

4.2. Termamyl cố định trên silica gel ............................................................... 27

4.2.1. Hiệu suất cố định Termamyl trên silica gel ..................................... 27

4.2.3. Khảo sát pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica gel ................ 28

4.2.4. Tái sử dụng Termamyl cố định trên silica gel.................................. 29

4.3. Termamyl cố định trên silica-chitosan và silica-alginate ........................... 30

4.3.1. Điều kiện cố định ............................................................................ 30

4.3.2. Điều kiện phản ứng ......................................................................... 35

4.3.3. Khảo sát khả năng tái sử dụng của α-amylase cố định ..................... 38

4.4. Đồng cố định glucoamylase và Termamyl trên silica-alginate................... 44

4.4.1. Khảo sát nhiệt độ tối ưu .................................................................. 44

4.4.2. Khảo sát pH tối ưu .......................................................................... 45

4.4.3. Tái sử dụng hai enzyme đồng cố định trên silica-alginate ............... 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 51

PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .............................................. 54

PHỤ LỤC B: BẢNG TÍNH TOÁN ................................................................... 57


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Silica gel .................................................................................................. 8

Hình 2.2: Tổng hợp hạt silica gel ............................................................................. 9

Hình 2.3: Chitosan ................................................................................................. 10

Hình 2.4: Acid alginic ............................................................................................ 13

Hình 2.5: Cấu tạo của alginate ............................................................................... 13

Hình 2.6: Cấu trúc hạt gel alginate ......................................................................... 14

Hình 2.7: Glutaraldehyde hoạt hóa chitosan ........................................................... 15

Hình 2.8: Glucoamylase thủy phân amylose .......................................................... 19

Hình 3.1: Silica gel ................................................................................................ 23

Hình 4.1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của Termamyl cố định trên

silica gel ................................................................................................................ 28

Hình 4.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của Termamyl cố định trên

silica gel ................................................................................................................ 28

Hình 4.3: Khảo sát khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica gel ...... 29

Hình 4.4: Khảo sát lượng silica gel thêm vào chitosan ........................................... 30

Hình 4.5: Hạt silica-chitosan .................................................................................. 31

Hình 4.6: Khảo sát lượng silica gel thêm vào alginate ............................................ 32

Hình 4.7: Hạt silica-alginate .................................................................................. 33

Hình 4.8: Khảo sát lượng Termamyl cố định trên silica-chitosan ........................... 34

Hình 4.9: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của Termamyl cố định trên silica-chitosan ....... 35

Hình 4.10: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của Termamyl cố định trên silica-alginate ...... 36

Hình 4.11: Khảo sát pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-chitosan ............. 37

Hình 4.12: Khảo sát pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-alginate .............. 38

Hình 4.13: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica-chitosan ......... 40


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh vii

Hình 4.14: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica-alginate .......... 43

Hình 4.15: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của glucoamylase và Termamyl đồng cố định

trên silica-alginate .................................................................................................. 45

Hình 4.16: Khảo sát pH tối ưu của Termamyl và glucoamylase đồng cố định trên

silica-alginate......................................................................................................... 46

Hình 4.17: Khả năng tái sử dụng của glucoamylase và Termamyl đồng cố định trên

silica-alginate......................................................................................................... 47


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Các thông số kỹ thuật của amylase và glucoamylase .............................. 27

Bảng 4.2: Hiệu suất cố định α-amylase trên silica gel ............................................ 27

Bảng 4.3: Số lần tái sử dụng α-amylase cố định trên silica-chitosan ....................... 39

Bảng 4.4: Số lần tái sử dụng α-amylase cố định trên silica-alginate ....................... 41

Bảng 4.5: Số lần tái sử dụng enzyme đồng cố định trên silica-alginate................... 48


GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh 1

Chương 1: MỞ ĐẦU

1.1. Lý do chọn đề tài

Amylase xúc tác thủy phân các cơ chất lớn, nhỏ tại các liên kết α-1,4 glucoside

(α-amylase), liên kết α-1,4 và liên kết α-1,6 glucoside (glucoamylase) và tạo sản

phẩm đa dạng như: các oligosaccharide có gốc khử, các di-, tri- và tetrasaccharide,

glucose và isomaltose… Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme tự do gây nhiều khó khăn

trong việc ứng dụng lẫn việc tái sử dụng (sự rửa trôi, bị biến tính bởi nhiệt, pH…)

enzyme. Kết quả là làm tăng chi phí giá thành sản phẩm. Để tăng tính bền và ổn

định trong hoạt tính của enzyme khỏi những tác nhân lý hóa giúp việc ứng dụng

enzyme được thuận tiện và tiết kiệm được chi phí. Từ đó, ý tưởng cố định enzyme

trong chất mang đã được ra đời.

Hiệu quả cố định enzyme bằng cách sử dụng một số phương pháp, một trong

số đó là phương pháp bẫy trong gel, liên kết cộng hóa trị. Enzyme sẽ được cố định

vào mạng lưới các vi lỗ trong hạt chất mang (alginate) hoặc trên bề mặt các hạt

(silica gel, chitosan). Phương pháp bẫy trong alginate và phương pháp cố định

amylase trên bề mặt nhờ liên kết cộng hóa trị với chitosan, hấp phụ trên silica gel rất

dễ thực hiện, chi phí thấp và dễ sử dụng. Hơn nữa, bằng cách thay đổi điều kiện tạo

gel, nó có thể dễ dàng kiểm soát một số đặc tính, chẳng hạn như độ dày hoặc độ

thẩm thấu các chất nền khác nhau của hạt gel.

Ở những nghiên cứu trước đây, chất mang chitosan và alginate được dùng cố

định amylase đã được nghiên cứu và cho kết quả tốt [3, 4, 19, 20]. Tuy nhiên, đó chỉ

là vật liệu hữu cơ, không bền dưới các tác nhân lý hóa, trong khi đó, vật liệu vô cơ

(silica gel) có thể khắc phục được nhược điểm này. Từ yêu cầu trên, chúng tôi đã

tiến hành nghiên cứu thử nghiệm đề tài: “Khảo sát điều kiện cố định amylase trên

silica-chitosan và silica-alginate”.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện cố định Termamyl lên hạt silica-chitosan bằng liên kết

cộng hóa trị.



- Khảo sát điều kiện cố định Termamyl bằng phương pháp bẫy, nhốt trong gel

silica-alginate.

- Khảo sát nhiệt độ và pH tối ưu.

- Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định.

1.3. Giới hạn của đề tài

Vì thời gian có hạn nên đề tài chỉ dừng ở bước khảo sát khả năng tái sử dụng

của enzyme cố định, chưa khảo sát khả năng bảo quản của enzyme cố định theo thời

gian, cũng như thực hiện tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định (theo

phần mềm tối ưu Design Expert 8.0).



Chương 2: TỔNG QUAN

2.1. Khái niệm về cố định enzyme

Enzyme cố định (immobilized) hay enzyme không hòa tan (insoluble enzyme)

được gắn cố định vào một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các

điều kiện bình thường, vẫn giữ được hoạt động xúc tác [1].

Enzyme cố định có đầy đủ tính chất của một enzyme và có thể sử dụng được liên

tục và lặp lại nhiều lần. Các chất dùng để gắn hoặc giữ enzyme thường được gọi là

chất mang hay giá thể. Như vậy, nếu gắn enzyme xúc tác theo một dãy phản ứng theo

đúng trật tự (hệ thống nhiều enzyme, multi-enzyme) sẽ nhận được hệ thống enzyme

không tan xúc tác cho một dãy phản ứng chuyển hóa từ cơ chất đến sản phẩm cuối

cùng [1].

2.1.1. Lịch sử phát triển và tình hình nghiên cứu enzyme cố định trong và ngoài

nước

- Enzyme cố định được nghiên cứu đầu tiên vào năm 1916 bới Nelson và Griffin

khi hai ông này quan sát khả năng thủy phân đường saccharose của enzyme invertase

từ nấm men hấp phụ lên than hoạt tính.

- 1956, Mizt cố định enzyme catalase trên DEAE-cellulose bằng liên kết ion

(ionic binding).

- 1964, Quiciio và Richards đã mô tả phương pháp khâu mạch (cross-linking) các

enzyme carboxyl-peptidase với glutaraldehyde. Chang đã tiến hành tạo vi nang để nhốt

enzyme carbonic anhydrase (microcapsule).

- 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose

bằng glucoamylase cố định. Chibata là người đầu tiên thực hiện thành công công việc

sản xuất vào công nghiệp.

- 1973, Chibata và cộng sự lần đầu tiên cố định thành công tế bào vi sinh vật E.

coli để sản xuất L-aspartate từ amonium fumarate bằng gel acrylamide.

- Từ những thành tựu đạt được ở trên đã mở ra những ứng dụng to lớn của

enzyme và tế bào cố định trong công nghiệp. Một trong những bằng chứng thuyết



phục nhất là sử dụng glucoisomerase cố định trong sản xuất fructose từ glucose ở quy

mô công nghiệp.

- Trên thế giới hiện nay đã sử dụng rộng rãi công nghệ cố định enzyme vào trong

các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, y học, công nghiệp hóa chất, bảo vệ môi trường

và các lĩnh vực phân tích.

- Ở Việt Nam, nghiên cứu cố định enzyme mới chỉ bắt đầu vài năm gần đây và

thu được kết quả còn rất hạn chế.

- 1994 – 1995, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cộng tác với Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định enzyme glucoisomerase

trên các hạt cylochrom B, hoạt hóa bằng glutaraldehyde. Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định các enzyme thủy phân như protease,

amylase, urease, pectinase… Hiện nay, Viện Sinh học Nhiệt đới cũng đang nghiên cứu

sử dụng chế phẩm enzyme glucoisomerase (Novo, Đan Mạch) để sản xuất fructose

syrup, tuy nhiên mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm.

- Những năm gần đây, phòng thí nghiệm công nghệ bức xạ, Viện Hạt Nhân Đà

Lạt đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme và tế bào, các chất có hoạt tính

sinh học khác bằng kỹ thuật bức xạ như cố định enzyme glucoamylase protease vi

khuẩn tả (Vibrio cholerae), tế bào nấm men, vi khuẩn xử lý nước thải (Pseudomonas

maltophilla) và hormon ptrogesteron trên các giá thể polymer tổng hợp được chế tạo

bằng kỹ thuật bức xạ.

2.1.2. Đặc điểm của enzyme cố định

Enzyme cố định có những đặc điểm khác với enzyme hòa tan như:

- Enzyme cố định bền nhiệt hơn enzyme hòa tan do chúng được bảo vệ bởi chất

mang.

- Có khả năng bảo quản tốt hơn.

- Có sự di chuyển pH tối thích sang kiềm hay acid so với enzyme hòa tan.

- Có khả năng tái sử dụng được nhiều lần.



- Enzyme cố định tuân theo định luật Michaelis-menten, tuy nhiên cũng có sự sai

khác như:

Xảy ra hiện tượng cạnh tranh giữa cơ chất, enzyme và chất mang.

Hiện tượng cản trở sự khuếch tán cơ chất và sản phẩm của phản ứng dẫn

đến vận tốc phản ứng giảm.

- Hoạt tính của enzyme cố định thường thấp hơn enzyme hòa tan cùng loại

do 2 nguyên nhân sau:

Do ảnh hưởng điện tích của chất mang nên làm thay đổi cấu trúc không

gian của enzyme.

Do enzyme bị nhốt vào trong gel nên sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất

với tâm hoạt động khó khăn.

2.1.3. Ưu, nhược điểm của enzyme cố định

Enzyme cố định ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do những

ưu điểm sau:

- Hiệu quả kinh tế cao, do enzyme cố định là chế phẩm sinh học rất đắt tiền nếu

sử dụng dạng hòa tan thì chỉ sử dụng được một lần, khó thu hồi. Khi enzyme được cố

định trên giá thể thì sử dụng được nhiều lần, giá thành giảm, nâng cao hiệu quả kinh

tế.

- Sản phẩm thu được sau phản ứng được xúc tác bằng enzyme cố định khá tinh

sạch do enzyme được cố định trên những pha riêng rẽ nên không lẫn vào sản phẩm.

Điều này đặc biệt quan trọng trong sản xuất dược phẩm, trong công nghệ sản xuất hóa

chất tinh khiết và trong phân tích.

- Khi thực hiện bằng phản ứng, enzyme cố định có thể dừng phản ứng ở bất kỳ

giai đoạn nào cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất. Đối với những

trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là các sản phẩm trung gian thì điều này có ý nghĩa

quan trọng.

- Có thời gian bảo quản lâu hơn và bền vững hơn đối với các chất kìm hãm cũng

như các tác nhân gây biến tính so với dạng hòa tan.



- Vì được cố định trên giá thể nên enzyme có hoạt tính ổn định hơn so với

enzyme tự do khi có sự tác động của các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH…

- Enzyme cố định đặc biệt thích hợp với các quy trình công nghệ liên tục, tự

động hóa. Enzyme cố định được nạp vào các thiết bị phản ứng như cột, tháp với dòng

cơ chất đi vào liên tục và đầu ra là sản phẩm.

Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm thì enzyme cố định cũng có những nhược

điểm sau:

- Làm hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Vì vậy hoạt tính riêng

(specfic activity) của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme hòa tan. Đặc

biệt trong trường hợp cơ chất có trọng lượng phân tử lớn như: protein, tinh bột,

chitosan…

- Trường hợp enzyme cố định bằng phương pháp nhốt (entrapment method)

trong khuôn gel thì chỉ phần enzyme nằm ở lớp ngoài của gel là hoạt động.

Enzyme được cố định bằng phương pháp cộng hóa trị thì một lượng đáng kể

enzyme bị mất hoạt tính do chất hoạt hóa và do phản ứng gắn không đặc hiệu xảy ra ở

trung tâm hoạt động của enzyme.

2.2. Vật liệu cố định

Theo Trevan một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau:

- Giá thành rẻ là yêu cầu đầu tiên của một chất mang được sử dụng trong cố định

enzyme.

- Phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định thì mới chịu đựng được các điều kiện

của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất.

- Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản

ứng, chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme và không gây ra những hấp phụ

không đặc hiệu.

- Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh

vật..



- Chất mang phải có độ trương nở tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất

này của chất mang vừa tăng khả năng cố định enzyme, vừa tăng khả năng tiếp xúc của

cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố định và số lần tái sử dụng.

- Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng,

dạng phiến mỏng…

Chất mang polymer hữu cơ: tự nhiên và tổng hợp:

Nhóm các polymer tự nhiên:

Polysaccharide: cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng.

Cellulose và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose, diethylaminoethyl

cellulose. Agarose: ổn định, đắt tiền nên sử dụng chủ yếu trong y học. Alginate,

carragenan: tạo gel tốt nhưng không ổn định trong môi trường có photphat.

Tinh bột: phong phú, rẻ nhưng kém trương nở, khả năng cố định kém nên thường

được ghép với các copolymer làm tăng độ trương nở, cải thiện tính chất cơ lý, tăng khả

năng cố định vi sinh vật.

Chitin, chitosan: có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, bền cơ lý, ổn định. Tuy

nhiên kỵ nước, độ trương nở kém nên cải thiện ghép copolymer với các vinyl

monomer ưa nước.

Protein: thường sử dụng gelatin, keratin, albumin. Dễ tạo màng, tạo hạt. Tuy

nhiên kém bền, dễ nhiễm khuẩn hay gây các phản ứng miễn dịch.

Nhóm các polymer tổng hợp (synthetic polymer):

Polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic,

polystyren, polyethylen… ghép với các vinylmonomer.

Bền cơ lý, bền nhiệt, bền vi sinh vật, trơ hóa học, độ trương nở tốt, có thể điều

chỉnh kích thước siêu lỗ. Tuy nhiên, giá thành cao, quá bền vững nên gây ô nhiễm môi

trường khi khó phân hủy.

Chất mang vô cơ:

Gồm sợi bông thủy tinh, silicium oxide SiO2, alluminium oxide Al2O3, MgO…

có cấu trúc lỗ, có khả năng hấp phụ tốt.



Ngoài ra còn có ceramic, celite (diatomic).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vật liệu vô cơ là silica gel (SiO2) và vật

liệu hữu cơ là chitosan và alginate. Enzyme được dùng để cố định là Termamyl 120L

và AMG 300L của hãng Novozyme.

2.2.1. Silica gel

2.2.1.1. Tính chất của silica gel

Silica gel hay gel acid silicic là một chất sẵn có trong tự nhiên, cộng thêm với

tính năng ưu việt của nó trong các quá trình hóa học tạo nên cho silica gel một vị thế

đáng được trân trọng. Công thức hóa học đơn giản của nó là SiO2.nH2O (n < 2). Điều

chế bằng cách cho sodium silicate tác dụng với acid sunfuric kết quả tạo thành dạng

sol, rồi sol đông tụ lại thành gel, sau khi rửa, sấy khô và nung ta thu được silica gel.

Đó là chất rắn có lỗ xốp nhỏ, dạng cục hoặc viên hình cầu tuỳ thuộc phương pháp tạo

hạt khi điều chế, có loại trong suốt như thủy tinh, có loại đục. Độ xốp thay đổi trong

giới hạn 20 - 60%, đường kính lỗ xốp khoảng 3 - 10 nm, bề mặt riêng 200 - 800 m2/g.

Hình 2.1: Silica gel [38]

Silica gel là một chất vô cơ bền, không độc, dễ bảo quản và vận chuyển dễ dàng.

Hiện nay silica gel có vai trò rất quan trọng trong công nghệ hóa học từ đơn giản đến

phức tạp. Silica gel được dùng rất nhiều làm xúc tác trong tổng hợp hữu cơ hóa dầu,

lọc nước... Ngoài những ưu điểm về tính hút ẩm, chất phủ bề mặt… Những năm gần



đây, silica gel được chú ý đến như là một chất cố định enzyme lý tưởng. Với khả năng

có thể tạo gel hình thành cấu trúc mạng tinh thể với kích thước lỗ có thể điều chính

được nhờ pH và nhiệt độ.

Với tính chất đặc biệt này, chúng tôi tiến hành cố định enzyme trên bột silica gel

và khảo sát khả năng hấp phụ của nó, cũng như các điều kiện bền của enzyme được

hấp phụ.

2.2.1.2. Tổng hợp silica gel

Nguyên tắc tổng hợp:

(1) Phân tán các hạt silicium oxide

(2) Nhũ tương hóa các lớp dầu ở 65°C

(3) Làm lạnh hệ thống nhũ tương đến nhiệt độ phòng

(4) Khoáng hóa lớp vỏ silic oxide xung quanh các giọt dầu

Hình 2.2: Tổng hợp hạt silica gel [35]

Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng ở quy mô công nghiệp để sản xuất hạt

silica gel (hút ẩm). Mặc khác, ở quy mô thử nghiệm, silica gel được tạo ra sẽ được

đem đi cố định enzyme, lượng dầu bám trên hạt silica gel nếu không tách triệt để sẽ

ảnh hưởng đến hiệu suất cố định enzyme sau này.



2.2.1.3. Ứng dụng silica gel trong cố định enzyme

Silica gel được dùng để cố định GL-7-ACA acylase, chloroperoxidase,

lipoxygenase… bằng liên kết cộng hóa trị và hấp phụ [27] và cố định lipoxygenase

bằng phương pháp bẫy trong sol-gel [3].

2.2.2. Chitosan

Chitin (β(1-4)-N-acetyl-D-glucosamine), nguồn nguyên liệu phong phú thứ hai

sau cellulose, là thành phần chủ yếu trong cấu trúc của động vật không xương sống,

thành tế bào của nấm. Sản phẩm thừa của công nghệ sản xuất thủy sản như hải sản, vỏ

tôm, vỏ cua, tôm hùm, ốc, sò… đều có chứa chitin. Chitosan, được thu nhận bằng cách

deacetyl hóa 1 phần chitin, là một polycationic polysaccharide của 2-acetamido-2-

deoxy-β-D-glucopyranose (GlcNAc) và 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose (GlcN)

nối với nhau bằng liên kết 1,4 (hình 2.3) và có giá trị pKa trong khoảng 6,3 – 6,5.

Chitosan và chitin có tính thương mại hóa vì hàm lượng nito cao (6,89%) so với

cellulose thay thế (1,25%). Polysaccharide này tan trong dung dịch có tính acid (pH <

6), có tính sinh học và là polymer có thể phân hủy được. Hơn nữa, nó có khả năng bám

dính cao, chữa lành vết thương và có tính kháng khuẩn. Ngoài ra, chitosan được

chuyển hóa bởi enzyme trong cơ thể người như lysozyme, Termamyl, hyaluronidase,

và có thể phân hủy bởi vi sinh vật. Cuối cùng, chitosan có rất nhiều trong tự nhiên, nó

khá rẻ và có tính kinh tế cao.

Hình 2.3: Chitosan [24]

2.2.2.1. Nguồn gốc của chitosan

Chitosan là một dạng chitin đã bị khử acetyl, nhưng không giống chitin nó lại tan

được trong dung dịch acid. Chitin là polyme sinh học có nhiều trong thiên nhiên chỉ



đứng sau cellulose. Cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose. Cả chitin và

chitosan đều có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và cuộc sống, đặc biệt là trong chế

biến và bảo quản thực phẩm.

Chitin có gốc từ chữ "chiton", tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp. Chitin là thành

phần cấu trúc chính trong vỏ (bộ xương ngoài) của các động vật không xương sống

trong đó có loài giáp xác (tôm, cua).

2.2.2.2. Đặc tính của chitosan

- Là polysacharide có đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn.

- Là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau.

- Chitosan có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị.

- Không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid

loãng (pH6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy

309 - 311oC.

2.2.2.3. Tác dụng của chitosan

- Phân hủy sinh học dễ hơn chitin.

- Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng khuẩn, như ức chế hoạt

động của một số loại vi khuẩn như E.Coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà

rốt, đậu và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài.

- Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng không khí cho

thực phẩm (nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ bị

ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển).

- Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số

chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói.

- Màng chitosan làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả. Rau quả sau khi thu

hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị. Rau quả bị thâm là do quá

trình lên men tạo ra các sản phẩm polyme hóa của oquinon. Nhờ bao gói bằng màng

chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của



anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả

tươi lâu hơn.

2.2.2.4. Ưu điểm của chitosan

- Dễ phân huỷ sinh học.

- Vỏ tôm phế liệu là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh

năm, nên rất thuận tiện cho việc cung cấp chitin và chitosan.

- Tận dụng phế thải trong chế biến thủy sản để bảo quản thực phẩm ở nước ta.

Thành công này còn góp phần rất lớn trong việc giải quyết tình trạng ô nhiễm môi

trường do các chất thải từ vỏ tôm gây ra.

2.2.2.5. Ứng dụng chitosan trong cố định enzyme

Cố định lipase trên chitosan có phủ lớp Fe3O4 [15], cố định allinase trên chitosan

bằng liên kết cộng hóa trị để sản xuất allicin [20], cố định glucose oxidase trên silica-

chitosan [31]…

2.2.3. Alginate

2.2.3.1. Nguồn gốc của alginate

Alginate là thuật ngữ dùng cho các muối acid alginic. Alginate đôi khi còn được

gọi bằng thuật ngữ “algin”.

Alginate là một polymer sinh học có nguồn gốc từ tảo biển, có nhiều trong vách

tế bào tảo nâu (Paccophyceae) dưới dạng muối calci, magie, sodium của acid alginic.

Alginate có nguồn gốc từ biển nên nó rất linh động và bền. Tuy nhiên, dạng muối

calci và magie alginate không tan trong nước, phải qua quá trình tách chiết alginate để

thu alginate dạng bột khô, tan trong nước và loại bỏ những thành phần khác của tảo

biển qua quá trình kết tủa.

2.2.3.2. Cấu tạo của alginate

Công thức của acid Alginic là (C6H7O6)n từ đó công thức của sodium alginate là

(C6H7NaO6)n, calci alginate (C6H7Ca1/2O6)n.



Hình 2.4: Acid alginic [37]

Alginate là một polymer được cấu tạo từ hai monomer là acid β-D-Mannuronic

(M) và acid α-L-Gluconic (G), với các cầu nối là liên kết 1-4 glucoside, chỉ khác ở

nhóm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza. Chúng tham gia vào

cấu trúc thành và màng tế bào, chúng thường tồn tại ở dạng G-G-G-G…; M-M-M-

M…; M-G-M-G… Sự phân bố của thành phần M, G biến đổi nhiều theo loài, do đó có

nhiều loại alginate và có tính chất khác nhau.

Hình 2.5: Cấu tạo của alginate [37]



2.2.3.3. Tính chất của alginate

Việc sử dụng alginate dựa trên 3 tính chất chính:

- Khi tan trong nước, alginate tạo dung dịch nhớt. Các muối alginate (Na, K, Mg)

đều hòa tan trong nước, tạo cho dung dịch có độ nhớt cao. Độ nhớt alginate của rong

thay đổi nhiều tùy thuộc vào loài, vào giai đoạn sinh trưởng của rong và kỹ thuật tách

chiết alginate. Độ nhớt tăng khi mức độ polymer hóa tăng, nồng độ alginate tăng và

nhiệt độ giảm. Bênh cạnh đó, độ nhớt của alginate lại phụ thuộc rất lớn vào phương

pháp tách chiết. Để tăng độ nhớt, trong quá trình tách chiết alginate, ta có thể bổ sung

một số phụ gia cần thiết để thu được sản phẩm có độ nhớt mong muốn.

Ngoài ra, độ nhớt alginate phụ thuộc vào quá trình bảo quản. Khi ở dạng bột

thành phẩm, alginate vẫn tiếp tục bị cắt mạch, sau một thời gian, độ nhớt của nó giảm

đáng kể. Để khắc phục điều này, ta có thể cho vào alginate thành phẩm một lượng nhỏ

calci sao cho chưa đến ngưỡng tạo gel. Khi sử dụng kết hợp alginate với các dạng gum

khác như pectin sẽ làm tăng đáng kể độ nhớt của dung dịch.

Hình 2.6: Cấu trúc hạt gel alginate [37]

- Ở điều kiện bình thường, các gốc COO- của các phân tử guluronic sẽ hình thành

liên kết hydro với ion H3O+

có trong dung dịch. Khi ta đưa vào môi trường các ion kim

loại như Ca2+

, Ba2+

…, các cation này sẽ thay vào vị trí của H3O+, nối các chuỗi



guluronic lại với nhau, tạo thành một cấu trúc mạng lưới không tan trong nước, cấu

trúc này được gọi là gel.

Quá trình tạo gel của alginate được tiến hành ở các điều kiện bình thường về

nhiệt độ và áp suất. Cấu trúc gel tạo thành bền ở nhiệt độ trong khoảng 0 – 100oC. Vì

thế, sự gia nhiệt hầu như ít làm hư cấu trúc gel. Tuy vậy, gel có thể dễ dàng hòa tan trở

lại khi những vào dung dịch chứa hàm lượng Na+, K

+ hay Mg

2+ cao. Do vậy, nên duy

trì tỉ lệ Na+/Ca

+ 25:1 để giúp cấu trúc gel được ổn định.

Khả năng tạo gel của alginate với các cation là không giống nhau, độ bền gel tăng

dần theo thứ tự Ca2+

< Sr2+

< Ba2+

. Trong đó, Ca2+

là tác nhân tạo gel được sử dụng

nhiều nhất do tính phổ biến và không độc hại của nó.

- Alginate tạo dạng màng mỏng (films) của sodium hoặc calci alginate với dạng

sợi (fibres) của calci alginate. Tính chất này của alginate được ứng dụng trong việc tạo

nên các lớp phủ bên ngoài.

2.2.3.4. Ứng dụng alginate trong cố định enzyme

Đồng cố định dextransucrase và dextranase trên alginate để sản xuất

isomaltooligosaccharides từ sucrose [9], urease [6], invertase, α-amylase cố định trên

silica-alginate [34]…

2.3. Hoạt hóa vật liệu bằng glutaraldehyde

Hình 2.7: Glutaraldehyde hoạt hóa chitosan [28]



Các chất có mang nhóm –NH2 (polysaccharide, chitin, chitosan, cellulose…) đều

có thể sử dụng phương pháp này.

Glutaraldehyde là chất có chứa hai nhóm aldehyde (-CHO) hoạt hóa. Một nhóm

sẽ gắn vào –NH2 của enzyme.

2.4. Enzyme amylase

2.4.1. α-amylase

α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm phía trong phân

tử cơ chất một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả. Dưới tác dụng của α-

amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân

tử thấp.

2.4.1.1. Đặc tính

Trung tâm hoạt động của α-amylase có chứa nhóm [COOH] và [NH2]. α-amylase

dễ tan trong nước, trong các dung dịch muỗi và rượu loãng.

Protein của α-amylase có tính acid yếu và tính chất của globulin.

Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7. Phân tử lượng của α-amylase từ

các nguồn gốc khác nhau rất khác nhau (của nấm mốc 45,000 – 50,000, của malt

59,000) [32].

α-amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Các α-amylase đều chứa từ 1-

30 nguyên tử gam Ca/mol. Song không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách

hoàn toàn Calci ra khỏi protein của enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân

cơ chất. Và calci tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc ba của enzyme,

duy trì cấu hình hoạt động của enzyme [32]. Calci còn có tác dụng đảm bảo cho α-

amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tình và sự phân hủy bởi các

enzyme phân giải protein. α-amylase bền nhiệt hơn so với các loại amylase khác.

Người ta cho rằng đặc tình này của α-amylase có liên quan đến hàm lượng của Calci

trong phân tử của nó (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa Calci nhiều hơn

amylase của nấm mốc 3-4 lần nên nó bền nhiệt hơn). Tất cả những α-amylase đều bị

kìm hãm bởi những kim loại nặng như: Cu2+

, Li+, Mg

2+, Cr

3+, Mn

2+, Zn

2+, Co

2+, Sn

2+…



α-amylase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần amino acid khác nhau. Mỗi

loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng, song chúng đều khá giàu

tyrosine và tryptophan. Các glutamic acid và aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng

amino acicd cấu thành phân tử enzyme. Trong α-amylase rất ít methionine và chỉ có

khoảng 7-10 gốc cysteine, trừ amylase của Bacillus licheniformis không có các liên kết

sulfhydryl và disulfhydryl.

- Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau.

pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,5 – 4,8 (có thể hoạt động tốt

trong vùng pH 4,5 – 4,8) của đại mạch nẩy mầm là 5,3 và của vi khuẩn là 5,8 – 6,0

(hoạt động tốt trong vùng pH 5,5 – 6,8).

- Độ bền đối với tác dụng acid cũng khác nhau. α-amylase của nấm sợi bền vững

với acid tốt hơn là của malt và vi khuẩn. Ở pH 3,6 và 0oC α-amylase của malt bị vô

hoạt hoàn toàn sau 15 – 30 phút, α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt 50% trong khi đó

hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hầu như không giảm bao nhiêu [32].

- Ở pH < 4,0 α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt hoàn toàn α-amylase của nấm sợi

rất nhạy với nhiệt (nhiệt độ tối thích 50oC). α-amylase của thóc mầm và của malt bền

nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58 – 60oC, α-amylase của vi khuẩn có độ bền cao

hơn cả.

2.4.1.2. Giới thiệu về enzyme Termamyl

Termamyl là chế phẩm enzyme dạng lỏng chứa α-amylase chịu được nhiệt độ cao

và được sản xuất bởi chủng men Bacillus licheniformis (enzyme này là một α-amylase

– thủy phân liên kết 1,4 α-glucoside thành amylose và amylopectin.

Một số ứng dụng của Termamyl trong công nghiệp (thông tin do hãng Novo cung

cấp) [38]:

- Trong kỹ nghệ tinh bột: Termamyl được dùng cho việc dịch hóa liên tục tinh

bột trong nồi hơi hoặc trong những thiết bị tương tự hoạt động ở nhiệt độ từ 105 -

110oC và vì vậy lợi dụng được tính ổn định nhiệt độ cao của enzyme.



- Trong kỹ nghệ nấu cồn: Termamyl được dùng để phân tán tinh bột khi nghiên

cứu và chưng cất. Và ở giai đoạn này, cũng lợi dụng được độ ổn định nhiệt của

enzyme.

- Trong kỹ nghệ nấu bia: Termamyl được dùng để giúp cho việc dịch hóa được

dễ dàng. Do độ ổn định nhiệt độ cao của enzyme.

- Trong kỹ nghệ đường: Termamyl được sử dụng để phá vỡ lượng tinh bột hiện

diện trong mía.

- Trong kỹ nghệ dệt: Termamyl được sử dụng ở tốc độ cao, nhiệt độ cao để rủ hồ

trước khi nhuộm. Loại enzyme kỹ thuật được áp dụng cho công nghệ này.

2.4.1.3. Ứng dụng α-amylase trong cố định

α-amylase cố định trên một số vật liệu như silica-alginate [34], silica gel [23],

polyanilin [4], chitosan và Amberlite MB-150 [8]…

2.4.2. Glucoamylase

Glucoamylase là một enzyme quan trọng thuộc hệ enzyme amylase. Enzyme này

đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà sản xuất nhờ vào khả năng thủy phân liên kết

α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside thậm chí cả liên kết α-1,3 glycoside trong mạch

amylose và amylopectin để thu được sản phẩm triệt để là glucose. Nhờ vào đặc tính

này, glucoamylase được sử dụng trong công nghiệp sản xuất đường glucose và mật

tinh bột.

Glucoamylase (EC 3.2.1.3) được biết như là amyloglucosidase, glucamylase,

maltase, saccharogenic amylase và γ-amylase [29], là nhóm quan trọng của nhóm

enzyme thủy phân tinh bột. Nó được sử dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp các

loại đường syrup. Glucoamylase giải phóng β-D-glucose từ đầu không khử của hồ tinh

bột, bằng sự thủy phân liên kết α-1,4 và thủy phân liên kết α-1,6 ở mức độ thấp hơn.

Theo lý thuyết, nó có thể phân cắt tận gốc tinh bột thành glucose, nhưng sự thủy phân

hồ tinh bột là thuận nghịch và tạo ra lượng lớn các sản phẩm khác ngoài glucose như

di-, tri- và tetra-saccharide, hầu hết là isomaltose [25].



Hình 2.8: Glucoamylase thủy phân amylose [36]

Đã có nhiều nỗ lực để cải thiện hiệu suất của glucoamylase bằng cách gây đột

biến và thay đổi protein khác nhau để đạt được hai mục tiêu chính. Mục tiêu đầu tiên

là để sản xuất glucoamylase tinh khiết hơn. Một vấn đề với các enzyme truyền thống

được sử dụng là khi ở nồng độ cao, một số đường sản xuất sẽ ngưng tụ khác nhau bởi

các sản phẩm như isomaltose. Họ không mong muốn vị ngọt như đường và không thể

tiếp tục xử lý để tạo thành fructose. Mục tiêu thứ hai là để cải thiện tính chịu nhiệt cao

hơn. Điều này cho phép thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao hơn và có thể làm giảm

thời gian sản xuất và giảm nguy cơ ô nhiễm [25].

Các enzyme chịu nhiệt mới sẽ được tạo từ các sinh vật tự nhiên chịu nhiệt và ưa

nhiệt. Cách tiếp cận này hiện đang được áp dụng rộng rãi và những glucoamyase ưa

nhiệt khác nhau đã được nhân bản vô tính [26].

Một số loài chịu nhiệt như Thermomyces lanuginosus, được biết đến như

Humicola lanuginosa, Humicola grisea varindica, Acremoniella thermophila,

Monotospora lanuginose và Sepedonium lanuginosum, có glucoamylase tốt bằng α-

amylase và α-glucosidase [5]. Trong những nghiên cứu khác nhau về các đặc tính lý

hóa khác nhau của hoạt tính glucoamylase từ nấm chịu nhiệt T. lanuginosus, enzyme

đã được mô tả và đoạn gen mã hóa cho glucoamylase đã được phân lập và nhân dòng.



Hiệu quả mang lại khi xử lý bằng glucoamylase cao hơn so với α-amylase. Do

vậy, glucoamylase hiện đang được các nhà nghiên cứu hướng tới vì khả năng thủy

phân tinh bột của chúng. Một số nghiên cứu cố định glucoamylase trên các vật liệu

khác nhau như gelatin [9], ceramic [22], cellulose [21]…

2.5. Điều kiện phản ứng khi tiến hành xác định hoạt độ enzyme

- Trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme, cần sử dụng cơ chất và cofactor ở

mức dư thừa (nếu enzyme cần cofactor) và thời gian xác định càng ngắn càng tốt.

- Cần phải chọn lựa các điều kiện sao cho có được sự biến đổi tuyến tính giữa

nồng độ enzyme, thời gian phản ứng và mức độ chuyển hóa cơ chất (trong giới hạn

nồng độ cơ chất đã lựa chọn).

- Một số enzyme bị ức chế bởi cơ chất ở nồng độ quá cao; hoặc bị giảm hoạt độ

nhanh chóng theo thời gian ở nhiệt độ phân tích. Do đó phản ứng phân tích nên thực

hiện trong khoảng thời gian nhất định và nồng độ enzyme lẫn cơ chất thích hợp.

2.5.1. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

2.5.1.1. Phân tích liên tục: là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo

thành một cách liên tục theo thời gian. Tuy nhiên yêu cầu đối với thiết bị đo là phải có

bộ phận ổn định nhiệt. Đây là mặt hạn chế của phương pháp này. Đồng thời, do phải

theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó thực hiện phân tích

hoạt độ nhiều mẫu enzyme cùng lúc.

2.5.1.2. Phân tích gián đoạn: là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau

một khoảng thời gian nhất định thì ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và

sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Để ngừng phản ứng có thể

dung các tác nhân làm bất hoạt enzyme: nhiệt độ cao, thay đổi pH, dung chất tạo phức

hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp… Phương pháp này khắc phục những hạn chế của

phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể nhiệt ổn định,

có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu… tuy nhiên vấn đề đặt ra là phải tìm cách làm

ngưng phản ứng thích hợp nhất.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng phương pháp phân tích gián đoạn, cho

enzyme cố định phản ứng với cơ chất theo mẻ (gián đoạn), mỗi mẻ là 30 phút, sau đó



dùng phương pháp hóa học để xác định hoạt độ của enzyme cố định. Cụ thể là dùng

các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành.

Thông thường phải chọn phản ứng tạo nên các phức chất màu có độ hấp thu ánh sáng

cực đại ở vùng nào đó để từ đó định lượng hợp chất này.

Phương pháp định lượng cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành có thể đơn giản

là sự đo cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành một cách trực tiếp. Tuy nhiên trong

nhiều trường hợp, có thể đo một cách gián tiếp và do đó phép đo phức tạp hơn.

2.5.2. Một số lưu ý khi xác định hoạt độ enzyme

- Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở

vùng thích hợp. Với những enzyme lần đầu tiên nghiên cứu, nên chọn pH trung tính,

300C – 37

0C. Sau đó có những điều chỉnh sau nếu cần thiết.

- Bên cạnh pH và nhiệt độ, cần lưu ý cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng

độ muối, các chất làm bền.

- Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, nên phải

dùng một loại đệm hay một hệ thống đệm thích hợp nào đó. Nồng độ đệm thường

dùng là 20 – 50 nM. Tuy vậy các phản ứng sinh acid, base cần phải dùng đệm ở nồng

độ cao hơn tránh thay đổi pH trong quá trình thí nghiệm. Cần chọn loại đệm thích hợp

tránh làm kết tủa các yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+

, Zn2+

.

- Cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp xúc với

nhau để bắt đầu phản ứng. Nếu phân tích nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc

phản ứng phải duy trì như nhau.

- Luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai sót.

- Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp, tránh làm biến đổi

cơ chất hay sản phẩm cần đo; hay can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm

phản ứng enzyme (chất làm ngừng phản ứng có cùng bước song hấp thụ ánh sáng cần

đo với chất phản ứng, hay ức chế phản ứng tạo màu tiếp theo của phân tích…)

Việc xác định hoạt độ của enzyme chỉ cho số liệu tin cậy khi chọn được phương

pháp thích hợp và có các bước tiến hành đúng.



Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học,

Trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh.

3.1. Nguyên vật liệu

3.1.1. Nguyên liệu

Enzyme amylase được sử dụng trong nghiên cứu này là Termamyl 120L (α-

amylase) và AMG 300L (glucoamylase) của hãng Novozym.

3.1.2. Hóa chất

3.1.2.1. Vật liệu cố định

- Sodium alginate (Trung Quốc)

- Chitosan (đại học Nha Trang)

- Na2SiO3.9H2O

- (NH4)2SO4 khan

3.1.2.2. Dung dịch tạo gel

- Dung dịch CaCl2 3%

- Dung dịch NaOH 0,3M

3.1.2.3. Chất hoạt hóa

- Glutaraldehyde (Merck)

3.1.2.4. Chất chuẩn

- D-glucose

- Albumin

3.1.2.5. Hóa chất định lượng

- DNS (Dinitrosalicilic acid)

- Dung dịch Bradford



3.2. Thiết bị

Máy đo quang phổ, cân kỹ thuật, cân phân tích.

3.3. Các phương pháp phân tích

- Phương pháp xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (xem

phụ lục 1a).

- Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp xác định hàm lượng đường khử

DNS (xem cách tính tại phụ lục 2a).

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Tạo bột silica gel

Đầu tiên, dung dịch (NH4)2SO4 1M được cho vào cốc. Tiếp đến cho dung dịch

Na2SiO3 1M vào, vừa cho vừa khuấy đều trong 1 giờ. Sau đó dung dịch được để yên

qua đêm ở nhiệt độ phòng. Silica gel được rửa sạch với nước cất và sấy khô. Ta thu

được silica gel thô. Xem sơ đồ tạo bột silica gel tại phụ lục 3a.

Silica gel thô được xử lý với dung dịch HNO3 5% để trung hòa lượng base

trong gel. Sau đó, gel được hoạt hóa với glutaraldehyde 10% trong 3 giờ ở 4oC.

Tiếp theo, enzyme được cho vào gel để thực hiện quá trình cố định. Thời gian cố

định enzyme là 3 giờ và sau đó enzyme cố định được đem đi xác định hoạt tính

(phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng DNS) và hàm lượng protein

(phương pháp Bradford).

Hình 3.1: Silica gel



3.4.2. Chuẩn bị hạt chitosan

Hạt chitosan 3% được chuẩn bị bằng việc đun nhẹ trong acic acetic 1,5% và

khuấy đều. Dung dịch thu được được tạo hạt với đường kính 3mm trong dung dịch

NaOH 0,3M. Hạt vừa tạo được khuấy liên tục 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi đã ổn

định kích thước, hạt được thu hồi bằng cách lọc và rửa nhiều lần bằng nước cất.

Cuối cùng, hạt được đem đi trữ lạnh ở 4oC cho đến khi sử dụng.

3.4.3. Chuẩn bị hạt silica-chitosan

Xác định hàm lượng silica gel thêm vào chitosan 3% nhằm tạo hạt gel silica-

chitosan có cấu trúc bền, khả năng hoạt động ổn định và tối ưu nhất. Việc khảo sát

được tiến hành như sau:

Bột silica gel cho vào trong dung dịch chitosan 3% lần lượt với lượng là 1%,

2%, 3%, 4%, 5% (w/v). Hỗn hợp được trộn đều trước khi tạo hạt với đường kính

3mm trong dung dịch NaOH 0,3M. Hạt vừa tạo được khuấy liên tục 2 giờ ở nhiệt độ

phòng. Sau khi hạt đã ổn định kích thước, được thu hồi bằng cách lọc và được rửa

nhiều lần bằng nước cất. Cuối cùng, hạt được đem đi trữ lạnh ở 4oC cho đến khi sử

dụng.

3.4.4. Hoạt hóa hạt silica-chitosan với glutaraldehyde

Nhằm giúp silica-chitosan có khả năng cố định enzyme được tốt hơn,

glutaraldehyde đã được sử dụng. Theo đó, gốc –CHO của glutaraldehyde sẽ liên kết

với gốc –NH2 của enzyme và chitosan. Phương pháp được tiến hành như sau:

Hạt silica-chitosan được hoạt hóa với dung dịch glutaraldehyde 2,5% và ủ ở

4oC trong 3 giờ. Sau đó, hạt silica-chitosan được rửa sạch với nước cất nhiều lần để

loại bỏ glutaraldehyde tự do. Sau đó hạt được bảo quản khô ở 4oC.

3.4.5. Cố định Termamyl lên các chất mang

3.4.5.1. Silica gel

Cho 5ml Termamyl vào 1g silica gel và ủ ở 4oC trong 3 giờ. Sau đó tiến hành

rửa với nước cất. Nước rửa thu được định mức lên 50ml để xác định hàm lượng

protein không bị hấp phụ.



3.4.5.2. Silica-chitosan

Cho vào 1g silica-chitosan tương ứng là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5ml Termamyl và

ủ ở 4oC trong 3 giờ. Sau đó tiến hành rửa với nước cất. Nước rửa thu được định mức

lên 10ml để xác định hàm lượng protein không bị hấp phụ.

3.4.5.3. Silica-alginate

0,2ml Termamyl được trộn chung với 2g hỗn hợp silica gel-alginate có nồng

độ tương ứng là 0; 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5%. Hỗn hợp được trộn đều và để yên trong 1

giờ. Sau đó, những hạt gel cố định được tạo bằng cách nhỏ hỗn hợp trên vào dung

dịch CaCl2 3%. Hạt được ngâm trong dung dịch CaCl2 trong 2 giờ để ổn định cấu

trúc. Cuối cùng, tiến hành lọc và rửa sạch CaCl2 với nước cất. Hạt cố định được trữ

ở 4oC cho đến khi sử dụng.

3.4.6. Đồng cố định Termamyl và AMG trên silica-alginate

0,2ml Termamyl:AMG (1:1) được trộn chung với 2g hỗn hợp silica-alginate có

nồng độ tương ứng là 0; 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5%. Hỗn hợp được trộn đều và để yên

trong 1 giờ. Sau đó, những hạt gel cố định được tạo bằng cách nhỏ hỗn hợp trên vào

dung dịch CaCl2 3%. Hạt được ngâm trong dung dịch CaCl2 trong 2 giờ để ổn định

cấu trúc. Cuối cùng, tiến hành lọc và rửa sạch CaCl2 với nước cất. Hạt cố định được

trữ ở 4oC cho đến khi sử dụng.

3.4.7. Khảo sát nhiệt độ và pH tối ưu

Theo nghiên cứu của Dilek Kılıç Apar (2004), nhiệt độ và pH ảnh hưởng đáng

kể đến hoạt tính của enzyme cố định [18]. Vì vậy, việc xác định nhiệt độ và pH tối

ưu của enzyme cố định trên từng loại vật liệu là rất cần thiết. Nó quyết định đến

hiệu suất và khả năng ứng dụng của enzyme cố định.

3.4.7.1. Khảo sát nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định trên các vật liệu

a) Silica gel

- Bột silica gel sau khi được hoạt hóa bởi glutaraldehyde và cố định Termamyl

được tiến hành khảo sát nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ được khảo sát tương ứng là nhiệt

độ phòng, 70, 85 và 100oC.



- Sau khi đã xác định được nhiệt độ tối ưu, enzyme cố định trên bột silica gel

được tiến hành khảo sát pH tối ưu. Những giá trị pH được khảo sát là 6,0; 6,5; 7,0;

7,5.

b) Silica-chitosan

- Hạt silica-chitosan được tiến hành khảo sát ở các nhiệt độ tương ứng là 40,

50, 60, 70, 80oC.

- Tiếp theo, enzyme cố định được khảo sát pH. Những giá trị pH được khảo

sát là pH 7,0; 7,5; 8; 8,5.

c) Silica-alginate

- Hạt silica-alginate sau khi cố định Termamyl được tiến hành khảo sát nhiệt

độ tối ưu. Những mức nhiệt độ khảo sát là 40, 50, 60, 70, 80oC. Và tương tự đối với

đồng cố định Termamyl và AMG trên silica-alginate.

3.4.7.2. Khảo sát pH tối ưu của enzyme cố định trên các vật liệu

a) Silica gel

- Sau khi đã xác định được nhiệt độ tối ưu, enzyme cố định trên bột silica gel

được tiến hành khảo sát pH tối ưu. Những giá trị pH được khảo sát là 6,0; 6,5; 7,0;

7,5.

b) Silica-chitosan

- Tương tự với enzyme cố định trên silica gel, enzyme cố định trên silica-

chitosan được khảo sát pH. Những giá trị pH được khảo sát là pH 7,0; 7,5; 8; 8,5.

c) Silica-alginate

- Enzyme cố định trên silica-alginate được khảo sát ở các giá trị pH là pH 5,0;

5,5; 6,0; 6,5.

3.4.8. Sự tái sử dụng

Mỗi loại hạt sẽ được tiến hành khảo sát khả năng tái sử dụng của chúng ở điều

kiện nhiệt độ và pH tối ưu. Phản ứng được diễn ra liên tục (cứ 30 phút lại thay cơ

chất mới và phản ứng).



Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN

4.1. Enzyme tự do

Bảng 4.1: Các thông số kỹ thuật của amylase và glucoamylase

Các thông số Termamyl glucoamylase

Hoạt tính (UI) 11.657 13.663

Hàm lượng protein 12.829 199.489

Nhiệt độ tối ưu* (oC) 80-90 55-60

pH tối ưu* 5,5 – 6,8 4,5

* Theo tài liệu được cung cấp từ hãng Novozym [36].

(Chi tiết xem phụ lục 1b)

4.2. Termamyl cố định trên silica gel

4.2.1. Hiệu suất cố định Termamyl trên silica gel

Bảng 4.2: Hiệu suất cố định Termamyl trên silica gel

Hiệu suất cố định Termamyl cố định trên silica gel

- Hàm lượng protein

- Hoạt tính

66,66 %

5,12%

(Chi tiết xem phụ lục 2b)

Hiệu suất cố định hàm lượng protein trên silica gel là khá cao. Tuy nhiên, hoạt

tính của enzyme sau khi cố định lại khá thấp.

4.2.2. Khảo sát nhiệt độ tối ưu của Termamyl cố định trên silica gel

Theo hình 4.1, nhiệt độ càng tăng thì hoạt tính của enzyme cố định càng tăng.

Tuy nhiên, do điều kiện thiết bị phòng thí nghiệm không cho phép nên nhiệt độ



khảo sát chỉ dừng ở 100oC. Mặt khác, enzyme cố định trên silica gel còn có thể chịu

được nhiệt độ cao hơn mà vẫn giữ được hoạt tính xúc tác.

Hình 4.1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của Termamyl cố định trên

silica gel

4.2.3. Khảo sát pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica gel

Hình 4.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của Termamyl cố định trên

silica gel

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

nhiệt độ phòng 70 85 100 Nhiệt độ (oC)

Hoạt tính (UI)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

5 5.5 6 6.5 7 pH

Hoạt tính (UI)



Hình 4.2 biểu diễn hoạt tính của Termamyl cố định trên silica gel. Theo đó,

hoạt tính của enzyme cố định đạt đỉnh tại pH 5,5 và khi pH tăng dần từ pH 5,5 – 7

thì hoạt tính của enzyme cố định có xu hướng giảm dần. Điều này chứng tỏ pH của

enzyme cố định có đỉnh hoạt động tại pH 5,5 so với enzyme tự do có khoảng hoạt

động pH hiệu quả là pH 5,5 – 7.

4.2.4. Tái sử dụng Termamyl cố định trên silica gel

Hình 4.3 biểu diễn hoạt tính còn lại của Termamyl cố định theo số lần tái sử

dụng. Ở đây, ta tiến hành so sánh giữa hai mẫu silica gel. Một mẫu có hoạt hóa

glutaraldehyde sau đó đem đi cố định enzyme và một mẫu không hoạt hóa

glutaraldehyde rồi đem đi cố định enzyme.

Hình 4.3: Khảo sát khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica gel

Theo nghiên cứu của M. Vezir Kahraman và cộng sự (2007), Termamyl được

cố định trên silica gel bằng liên kết cộng hóa trị, có hoạt tính là 98% sau 6 lần tái sử

dụng và 81,4% sau 25 lần tái sử dụng [23]. Từ đó, có thể kết luận rằng cố định

Termamyl trên silica gel bằng phương pháp cộng hóa trị cho kết quả cao hơn hẳn

phương pháp hấp phụ.

Glutaraldehyde là chất hoạt hóa chúng tôi thử nghiệm xem có hiệu quả trong

việc cố định Termamyl trên silica gel có hiệu quả hay không. Và kết quả là hoạt tính

100 100

75.01

87.29

60.48 66.84

22.66 23.43

0

20

40

60

80

100

120

không hoạt hóa glutaraldehyde có hoạt hóa glutaraldehyde

ban đầu

lần 1

lần 2

lần 3

Hiệu suất phản ứng (%)

Mẫu silica gel



còn lại của cả hai mẫu enzyme cố định trên silica gel đều có khả năng tái sử dụng

không tốt (chỉ tái sử dụng được 2 lần), tốc độ rửa trôi khá cao và không có sự khác

biệt rõ lắm trong hoạt tính của enzyme cố định trên silica gel có và không có hoạt

hóa với glutaraldehyde. Qua đó cho thấy, glutaraldehyde không cải thiện nhiều

trong việc làm tăng khả năng cố định enzyme lên silica gel.

Như ta biết, silica gel là một chất mang vô cơ, tương đối trơ với nhiệt độ và

các điều kiện lý hóa khác. Nhờ vậy, nó có khả năng giúp cho enzyme cố định trên

nó chịu được các điều kiện lý hóa của môi trường sản xuất công nghiệp. Tuy nhiên,

vì liên kết trong nội bộ enzyme là liên kết mạng tinh thể, nên không thể giữ được

enzyme ở bên trong mạng của chúng. Từ vấn đề đó, chúng tôi đã quyết định phối

hợp silica gel với một số chất mang hữu cơ nhằm cải thiện tình trạng rửa trôi này.

Chất mang hữu cơ chúng tôi chọn đó là chitosan và alginate.

4.3. Termamyl cố định trên silica-chitosan và silica-alginate

4.3.1. Điều kiện cố định

4.3.1.1. Khảo sát lượng silica gel thêm vào chitosan và alginate

a) Khảo sát lượng silica gel thêm vào chitosan

Hình 4.4: Khảo sát lượng silica gel thêm vào chitosan

42

43

44

45

46

47

48

49

50

0 1 2 3 4 5 silica gel/chitosan (%)

Hiệu suất cố định (%)



Trong đó, silica/chitosan là tỉ lệ khối lượng silica gel thêm vào trong 3g dung

dịch chitosan. Với giá trị 0% tương ứng với dung dịch chitosan nguyên chất, không

bổ sung silica gel.

Theo hình 4.4, hoạt tính của Termamyl tăng dần khi lượng silica gel thêm vào

tăng từ 1 – 4% và đạt đỉnh ở 4%. Tuy nhiên, khi tỉ lệ silica gel thêm vào lên đến 5%

thì hạt chitosan không bền, bị phá vỡ cấu trúc (hình 4.5 g) và vì nguyên nhân đó nên

hoạt tính của Termamyl có phần giảm hơn so với tỉ lệ 4% silica.

(a)

(d)

(b)

(e)

(c)

(g)

Hình 4.5: Hạt silica-chitosan

Trong đó, a, b, c, d, e, g tương ứng lần lượt với tỉ lệ silica/chitosan là 0%, 1%, 2%, 3%, 4%,

5%.

Ở giá trị 0%, hoạt tính của Termamyl tương đối cao, tuy nhiên khi thêm silica

gel vào thì hoạt tính của Termamyl có phần giảm đi. Điều này có thể giải thích rằng

chính sự có mặt của silica gel trong cấu trúc gel của chitosan đã làm tăng trở lực

làm cản trở cơ chất đi vào và sản phẩm đi ra, làm cho hoạt tính của Termamyl bị

giảm đi. Mặt khác, sự có mặt của silica gel cũng làm giảm tính bền vững trong cấu

trúc của chitosan (điều này được biểu hiện rõ nhất ở giá trị 5% silica). Tuy nhiên,

nếu lượng silica gel cho vào phù hợp, nó sẽ hỗ trợ trong cấu trúc mạng lưới của

chitosan, sẽ giúp cho hạt gel silica-chitosan có tính bền vững với nhiệt độ, pH hơn



so với hạt chitosan thường (giá trị 4% silica). Silica gel làm cho cấu trúc lỗ tăng lên

nên cơ chất có thể vào ra dễ dàng (giá trị 4% silica) và kết quả hoạt tính của enzyme

tăng hơn so với hạt chitosan không bổ sung silica gel (giá trị 0% silica).

a) Khảo sát lượng silica thêm vào alginate

Hình 4.6: Khảo sát lượng silica gel thêm vào alginate

Trong đó, silica/alginate là tỉ lệ khối lượng silica gel thêm vào trong 2g dung

dịch alginate 3%. Với 0% tương ứng với dung dịch alginate 3% nguyên chất, không

bổ sung silica gel.

Hiệu suất enzyme cố định, silica-chitosan cao nhất chỉ đạt 48.77%, trong khi

đó là 53,48% đối với silica-alginate.

Tại giá trị silica/alginate 7,5%, sự hiệu diện của silica gel càng nhiều thì sẽ làm

cho kích thước lỗ hạt bị hẹp lại và trở lực gây ra lớn. Tại giá trị silica/alginate 6%,

hiệu suất enzyme cố định đạt cực đại, cao hơn cả enzyme được cố định trên hạt

alginate 3%. Điều này có thể do sự liên kết giữa hạt silica trong mạng lưới của

alginate nên làm tăng kích thước lỗ giữa silica và các phần tử polymer tại vùng tiếp

giáp với silica.

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

0 1.5 3 4.5 6 7.5silica/alginate (%)

Hiệu suất cố định (%)



(a)

(d)

(b)

(e)

(c)

(g)

Hình 4.7: Hạt silica-alginate

Trong đó, a, b, c, d, e, g tương ứng lần lượt với tỉ lệ silica/alginate là 0%, 1,5%, 3%, 4,5%,

6%, 7,5%.

Từ đây ta có thể kết luận, silica gel bổ sung vào trong dung dịch chitosan và

alginate với một lượng thích hợp sẽ gây ra hiệu ứng khá tốt, giúp nới rộng kích

thước lỗ hạt, làm giảm trở lực của dòng trao đổi chất mà vẫn có thể giữ enzyme bên

trong không bị rửa trôi ra ngoài. Và lượng silica gel thích hợp bổ sung vào trong

dung dịch chitosan 3% và alginate 3% lần lượt là 4% và 6%. Tức 0,12g silica/3g

chitosan và 0,12g silica/2g alginate. Ta sẽ dùng kết quả này để tiếp tục tiến hành các

bước nghiên cứu tiếp theo.

4.3.1.2. Khảo sát lượng Termamyl cố định

a) Khảo sát lượng Termamyl cố định silica-chitosan

Hình 4.8 biểu diễn mối tương quan giữa hiệu suất cố định protein và hiệu suất

hoạt tính với lượng enzyme cho vào cố định trên silica-chitosan. Theo đó, hàm

lượng protein đã được cố định tăng dần khi tăng lượng enzyme từ 0,1 – 0,5ml và

còn tiếp tục tăng cho đến khi hạt gel đạt trạng thái bão hòa enzyme (lượng enzyme

tối đa mà hạt gel có thể cố định được). Tuy nhiên, hoạt tính enzyme lại không tỉ lệ



thuận với hàm lượng protein được cố định. Cụ thể, hoạt tính của enzyme cố định đạt

tối đa ở giá trị 0,2ml (enzyme) và giảm dần ở các giá trị 0,3 - 0,5ml. Theo như định

nghĩa ở mục 3.3.3. thì hiệu suất cố định enzyme được xác định theo công thức:

Hiệu suất cố định enzyme =

Về mặt toán học, nếu lượng enzyme ban đầu càng lớn thì mẫu số càng lớn sẽ

làm cho hiệu suất cố định enzyme giảm mặc dù hoạt tính của enzyme cố định tăng

theo lượng enzyme cho vào (tử số tăng). Vì vậy, có thể kết luận rằng, hàm lượng

protein được cố định càng cao thì hoạt tính của enzyme cố định càng tăng, tuy nhiên

hiệu suất cố định enzyme có thể giảm.

Hình 4.8: Khảo sát lượng Termamyl cố định trên silica-chitosan

Giải thích về mặt sinh học, lượng enzyme cho vào tăng, tức phần trăm protein

được cố định tăng, tuy nhiên hiệu suất cố định enzyme giảm. Vì enzyme được liên

kết chằng chịt trên bề mặt hạt silica-chitosan dẫn đến không gian cho cơ chất chen

vào trung tâm hoạt động của enzyme bị hạn chế. Bên cạnh đó, vì trên bề mặt hạt gel

có sự liên kết chằng chịt của các enzyme với hạt gel silica-chitosan nên xảy ra hiện

tượng cạnh tranh về cơ chất. Ngoài ra, enzyme còn thẩm thấu vào bên trong mạng

lưới của hạt silica-chitosan và được tạo liên kết. Ở đó, khả năng tiếp xúc với cơ chất

0

25

50

75

100

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Hiệu suất cố

định protein

(%)

Hiệu suất

hoạt tính

(%)

Lượng enzyme

(ml)

%



bị hạn chế so với bề mặt bên ngoài nên tuy lượng protein được cố định tương đối

cao nhưng hiệu suất cố định giảm.

Vì vậy, để tiết kiệm chi phí về enzyme, ta chọn giá trị 0,2 ml là lượng enzyme

thích hợp, vừa tiết kiệm chi phí về enzyme, vừa mang lại hiệu suất cố định cao hơn

hẳn những giá trị khác.

b) Lượng Termamyl cố định trên silica-alginate

Lượng Termamyl được chọn là 0,2ml cho vào cố định trong 2g dung dịch

alginate 3% và được tạo hạt trong CaCl2 3%. Phương pháp bẫy nhốt enzyme trong

gel silica-alginate, enzyme bị rửa trôi không đáng kể nên xem như hiệu suất cố định

protein là 100%.

4.3.2. Điều kiện phản ứng

4.3.2.1. Khảo sát nhiệt độ tối ưu

a) Khảo sát nhiệt độ tối ưu của Termamyl cố định trên silica-chitosan

Hình 4.9: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của Termamyl cố định trên silica-chitosan

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

40 50 60 70

Hoạt tính (UI)

Nhiệt độ (oC)



Theo hình 4.9, khi nhiệt độ tăng từ 40 – 60oC thì hoạt tính của enzyme cố định

tăng và đạt đỉnh tại 60oC. So với enzyme tự do, enzyme cố định hoạt động tương

đối ổn định từ 50 – 70oC. Vùng hoạt động tối ưu của enzyme cố định là 50 – 70

oC

trong khi đó enzyme tự do có khoảng nhiệt độ hoạt động là 80 – 90oC.

b) Khảo sát nhiệt độ tối ưu của Termamyl cố định trên silica-alginate

Hình 4.10: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của Termamyl cố định trên silica-alginate

Hình 4.10, có một sự tăng nhẹ về hoạt tính của enzyme cố định khi nhiệt độ

tăng từ 40 – 70oC và cao nhất ở 70

oC. Mặt khác, hạt silica-alginate khi cố định ở

điểm nhiệt độ 70oC bị trương nở nhiều hơn so với ở điểm nhiệt độ 50

oC. Điều này

cho thấy ở nhiệt độ 70oC tuy có hoạt tính của enzyme cố định cao hơn, nhưng cấu

trúc hạt lại không bền. Nó làm ảnh hưởng tiêu cực đến việc tái sử dụng hạt gel cố

định sau này.

4.3.2.2. Khảo sát pH tối ưu

a) Khảo sát pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-chitosan

Hình 4.11, hoạt tính của enzyme cố định có xu hướng tăng dần theo giá trị pH

từ 7 – 8 và giảm ở pH 8,5. Vì chitosan bền trong môi trường có pH kiềm và không

1.4

1.45

1.5

1.55

1.6

1.65

1.7

1.75

1.8

40 50 60 70 Nhiệt độ (oC)

Hoạt tính (UI)



bền trong môi trường có pH thấp. Khả năng chịu đựng của enzyme cố định phụ

thuộc nhiều vào chất mang cố định chúng. Mặt khác, enzyme Termamyl 120L là

enzyme thương mại có khả năng chịu nhiệt và pH trong phạm vi rộng hơn vùng

hoạt động tối ưu của chúng nên tại pH 8, enzyme vẫn còn hoạt động tốt. Tuy nhiên,

ở điều kiện pH 8,5 (quá kiềm) làm ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme và enzyme

bắt đầu bị bất hoạt.

Hình 4.11: Khảo sát pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-chitosan

Mặc dù hoạt tính của enzyme tự do giảm theo pH, nhưng khi được cố định

trong chất mang silica-chitosan, khả năng chịu đựng của nó được tăng lên và có thể

chịu được ở pH khá cao (pH 8). Có thể nói, silica-chitosan đã làm cải thiện đáng kể

khả năng chịu pH của Termamyl.

b) Khảo sát pH tối ứu của Termamyl cố định trên silica-alginate

Hình 4.12, hoạt tính của enyzme cố định khá ổn định, hầu như không khác biệt

nhau lắm ở các giá trị pH. Trong đó có hai giá trị có hoạt tính cao hơn hẳn đó là giá

trị pH 7 và pH 5,5. Khi quan sát hình thái hạt và màu của dung dịch khi cho dung

dịch đệm vào thì ta thấy có một hiện tượng như sau. Ở mẫu chứa dung dịch 5; 5,5; 6

dung dịch vẫn trong. Tuy nhiên, ở dung dịch 6,5 và 7 thì dung dịch bị đục. Đây là

một hiện tượng báo hiệu hạt alginate không bền trong môi trường có pH kiềm. Vì

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

7 7.5 8 8.5

pH

Hoạt tính (UI)



vậy, để đảm bảo việc tái sử dụng được nhiều lần và hạt gel ít bị ảnh hưởng thì ta

chọn pH 5,5 là pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-alginate.

Hình 4.12: Khảo sát pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-alginate

Vậy, ta chọn pH 8 là pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-chitosan và

pH 5,5 là pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica-alginate để tiếp tục thực hiện

các nghiên cứu tiếp theo.

4.3.3. Khảo sát khả năng tái sử dụng của α-amylase cố định

4.3.3.1. Khảo sát khả năng tái sử dụng của Termamyl trên silica-chitosan

Trong quá trình tái sử dụng, vì phản ứng được thực hiện theo mẻ nên lượng

đường khử tạo ra ở mỗi mẻ sau mỗi lần tái sử dụng là không ổn định. Thỉnh thoảng

có xuất hiện một vài giá trị dưới 50%. Tuy nhiên, ở lần tái sử dụng sau đó hoạt tính

lại tăng vượt trên 50%. Nguyên nhân là do việc thực hiện phản ứng trong điều kiện

tĩnh (không lắc) nên xung quanh bề mặt hạt gel hàm lượng đường khử bao quanh là

khá cao. Nó cản trở không cho cơ chất mới thẩm thấu vào trong và tiếp tục phản

ứng. Mặc khác, lượng đường khử được tạo ra chưa kịp thoát ra ngoài cũng gây ra

hiện tượng này.

0.4

0.42

0.44

0.46

0.48

0.5

0.52

0.54

0.56

0.58

0.6

5 5.5 6 6.5 7

pH

Hoạt tính (UI)



Bảng 4.3: Số lần tái sử dụng Termamyl cố định trên silica-chitosan

Số lần Ban

đầu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

X (%) 100 92.81 67.05 61.01 67.63 62.16 59.86 58.56 69.92 60.43 65.46

Số lần 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

X (%) 73.66 61.72 65.32 66.04 72.80 62.15 59.13 43.74 64.31 46.47 60.71

Số lần 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

X (%) 56.83 41.29 63.45 69.49 61.86 56.69 54.82 59.27 53.38 47.62 38.71

Trong đó, X là hiệu suất phản ứng của lần tái sử dụng thứ n so với ban đầu.

Trong đó X được tính theo công thức sau:

Hạt silica-chitosan cố định Termamyl hoạt động khá ổn định. Phần trăm hoạt

tính ở những lần tái sử dụng so với ban đầu tuy không cao, chỉ nằm trong khoảng từ

50 đến 70%, nhưng nó khá ổn định và hạt gel silica-chitosan cố định Termamyl có

khả năng tái sử dụng lên đến 30 lần. Sau khi tái sử dụng, hạt gel vẫn không có dấu

hiệu của sự tan hoặc bị phá vỡ cấu trúc do môi trường và điều kiện phản ứng (nhiệt

độ, pH).

Nhìn chung, silica-chitosan có khả năng cố định tốt Termamyl và hoạt động

một cách hiệu quả và ổn định ở điều kiện nhiệt độ 60oC và pH 8. Mặt khác, chitosan

cũng là một chất mang khá rẻ, dễ kiếm và phương pháp cố định enzyme cũng dễ

dàng được thực hiện, cộng thêm số lần tái sử dụng có thể lên tới 30 lần đã biến

silica-chitosan có một tiềm năng lớn trong việc ứng dụng trong quy mô công

nghiệp.

X (%) =

Hoạt tính của enzyme cố định lần thứ n

Hoạt tính của enzyme cố định ban đầu


Hình 4.13: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica-chitosan

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 16 17 21 22 24 26 27 28 30 31

Số lần




Sau hàng loạt các thí nghiệm khảo sát về khả năng cố định Termamyl trên hạt

silica-chitosan đã thu được những kết quả như sau: lượng silica gel trong vào 3g

chitosan là 0.12g hay 4% (w/w), lượng enzyme thích hợp để cố định là 0.2ml, nhiệt

độ thích hợp là 60oC, pH tối thích là pH 8, số lần tái sử dụng liên tục ở điều kiện tối

ưu là 30 lần.

4.3.3.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica-

alginate ở điều kiện nhiệt độ 50oC và pH 5,5

Alginate là một chất mang có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn các chất mang

khác. Nó có cấu trúc liên kết khá bền, tan trong điều kiện pH thường, bền trong

khoảng pH từ 4,5 đến 6,5. Mặt khác, nhờ vào ưu điểm có thể tan ở điều kiện thường

và dễ dàng tạo gel khi gặp môi trường có ion calci, nó đã được xem là một chất

mang thích hợp để bẫy, nhốt enzyme tránh tổn thất, thất thoát enzyme trong quá

trình phản ứng so với các phương pháp bề mặt khác. Cũng vì lý do đó mà khả năng

tái sử dụng của nó cũng cao hơn hẳn. Cụ thể trong nghiên cứu này, Termamyl cố

định trên gel silica-alginate 6% có khả năng tái sử dụng đến 42 lần, mỗi lần phản

ứng là 30 phút.

Nhìn chung, hoạt tính của Termamyl cố định trên silica-alginate tương đối ổn

định. Tuy hiệu suất phản ứng ở những lần tái sử dụng thấp hơn ban đầu khá nhiều

nhưng hoạt tính của nó dao động trong khoảng từ 50% - 80%. Cũng giống như

enzyme cố định trên hạt silica-chitosan, ở đây cũng xuất hiện một vài điểm có hiệu

suất phản ứng thấp hơn 50% (lần tái sử dụng thứ 6, 8, 44). Tuy nhiên, ở điểm tái sử

dụng tiếp theo thì hiệu suất phản ứng lại tăng trở lại trên 50% và có khi còn lên tới

70%.

Bảng 4.4: Số lần tái sử dụng Termamyl cố định trên silica-alginate ở 50oC, pH 5,5

Số lần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

X (%) 64.87 62.09 67.65 61.16 63.63 59.45 73.35 62.70 71.80 73.04 69.95

Số lần 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22



X (%) 70.11 66.71 77.98 70.57 64.70 42.47 74.74 49.26 65.78 64.24 57.29

Số lần 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

X (%) 75.51 70.26 71.03 74.58 69.03 78.75 73.97 76.90 71.34 84.46 58.53

Số lần 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

X (%) 58.68 71.19 73.81 72.27 71.19 58.22 68.10 55.44 68.41 43.42 34.81

Điều kiện tối ưu được chọn đối với phương pháp nhốt Termamyl trong sodium

alginate 3%, CaCl2 3% và 0,2ml enzyme giúp giữ được enzyme cố định có thể tái

sử dụng 42 lần và cấu trúc hạt gel vẫn nguyên vẹn. Hạt silica-alginate được đặt ra

trong nghiên cứu này là một kỹ thuật tương đối đơn giản và rẻ cho enzyme cố định

so với việc phủ calcium alginate bên ngoài hạt chitosan trong những nghiên cứu

khác [12, 30].

Theo nghiên cứu của Zoe Konsoula (2006) hạt silica-alginate của họ có điều

kiện tối ưu là 2% silica gel được bổ sung vào dung dịch alginate 2%, tạo hạt trong

dung dịch CaCl2 5% và nhiệt độ phản ứng từ 50 – 70oC trong đệm phosphate 7,0

[34]. Phản ứng được thực hiện trong 8 giờ và sau đó hạt gel được rửa sạch bằng

đệm và đem đi bảo quản lạnh cho gel phục hồi. Kết quả hạt silica-alginate của họ có

khả năng tái sử dụng được 20 lần với tổng lượng thời gian phản ứng là 160 giờ. Một

vài nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau giữa nghiên cứu của Zoe Konsoula (2006)

và nghiên cứu này.


Hình 4.14: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica-alginate

0

25

50

75

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44


Số lần



- Một là nguồn nguyên liệu. Nguyên liệu họ dùng đều từ các nhà sản xuất hàng

đầu tại Anh cung cấp, đạt chất lượng tốt hơn nhiều so với nguồn nguyên liệu ta sử

dụng (hầu hết từ Trung Quốc).

- Hai là, sau mỗi mẻ phản ứng, họ bảo quản lạnh cho hạt gel có thời gian phục

hồi sau một quãng thời gian dài phản ứng. Điều này mang lại hệ quả tốt hơn ở

những lần phản ứng tiếp theo.

Đối với nghiên cứu này, phản ứng được tiến hành liên tục không ngừng nghỉ,

đưa điều kiện thí nghiệm tiến gần đến điều kiện sản xuất theo quy mô công nghiệp

để khảo sát khả năng tái sử dụng của hạt silica-alginate đến đâu. Và kết quả 42 lần

tái sử dụng là đạt yêu cầu.

4.4. Đồng cố định glucoamylase và Termamyl trên silica-alginate

Theo nghiên cứu trước của TS. Huỳnh Ngọc Oanh (2010) và từ khảo sát thực

nghiệm cho thấy khả năng tạo đường khử của glucoamylase khá tốt. Nó có thể phân

cắt các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside của chuỗi oligosaccharide thành những gốc

đường khử với kích thước ngắn, chủ yếu là isomaltose và glucose. Những sản phẩm

này được ứng dụng rất nhiều trong thực phẩm. Tuy nhiên, việc cố định

glucoamylase trên silica gel cũng cho kết quả không khả quan lắm. Tình trạng rửa

trôi của glucoamylase cố định cũng tương tự với Termamyl (xem phụ lục 3b). Mặt

khác, theo những nghiên cứu về enzyme đồng cố định, sự đồng cố định

glucoamylase và Termamyl mang lại hiệu quả khá cao, cao hơn hẳn việc chỉ sử

dụng một trong hai loại enzyme [11, 16, 32]. Bên cạnh đó, ở hai chất mang silica-

chitosan và silica-alginate, kết quả cho thấy việc cố định enzyme trên silica-alginate

tốt hơn trên silica-chitosan. Vì thế, chúng tôi đã thực hiện đồng cố định

glucoamylase và Termamyl trên vật liệu silica-alginate.

4.4.1. Khảo sát nhiệt độ tối ưu

Hình 4.15 cho thấy hoạt tính của enzyme đồng cố định ở các mức nhiệt độ khá

ổn định. Khi tăng nhiệt độ từ 50 – 70oC, hoạt tính của enzyme đồng cố định có xu

hướng giảm dần. Nguyên nhân do glucoamylase khá nhạy cảm với nhiệt độ. Theo

phụ lục 3b, glucoamylase hoạt động mạnh ở nhiệt độ phòng. Khi nhiệt độ tăng dần



từ 50oC trở lên thì hoạt tính của glucoamylase bắt dầu giảm. Vì thế tác dụng hỗ trợ

Termamyl trong việc thủy phân hồ tinh bột giảm.

Hình 4.15: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của glucoamylase và Termamyl đồng cố định

trên silica-alginate

4.4.2. Khảo sát pH tối ưu

Tương tự như Termamyl cố định trên silica-alginate, ở đây enzyme đồng cố

định trên silica-alginate hoạt động tốt nhất ở pH 5,5 là pH mà silica-alginate hoạt

động ổn định nhất. Giá trị pH càng tăng thì cấu trúc của silica-alginate không bền và

làm ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính của hai enzyme đồng cố định.

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

40 50 60 70 Nhiệt độ (oC)

Hoạt tính (UI)



Hình 4.16: Khảo sát pH tối ưu của Termamyl và glucoamylase đồng cố định trên

silica-alginate

4.4.3. Tái sử dụng hai enzyme đồng cố định trên silica-alginate

Nhìn chung, hoạt tính của enzyme đồng cố định trên silica-alginate khá ổn

định và duy trì được hoạt tính trong khoảng thời gian dài. Do thời gian thí nghiệm

có hạn, không cho phép thực hiện phản ứng liên tục nên số lần tái sử dụng được tiến

hành khảo sát trong 4 ngày. Những lần phản ứng đầu tiên của một ngày mới cho

hiệu suất phản ứng cao hơn những lền tiếp theo trong ngày (cụ thể là lần tái sử dụng

thứ 10, 25, 34 và 44). Nguyên nhân vì hạt silica-alginate khi phản ứng lâu ở 50oC có

xu hướng bị trương nở bởi nhiệt. Sau một ngày phản ứng, mẫu được rửa sạch bằng

nước cất và bảo quản ở 4oC. Trong khoảng thời gian bảo quản, dưới tác dụng của

nhiệt độ thấp, những vi lỗ bên trong cấu trúc hạt gel có xu hướng co lại, hồi phục về

trạng thái ban đầu. Những cơ chất còn bên trong sẽ tiếp tục được enzyme phân cắt.

Điều này gây nên sự dao động (tăng đột ngột) trong hiệu suất phản ứng của enzyme

khi phản ứng lần đầu tiên của ngày kế tiếp. Tuy nhiên, những lần phản ứng ngay sau

đó, hiệu suất phản ứng của enzyme đồng cố định lại trở lại ổn định và ít dao động.

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

5 5.5 6 6.5pH

Hoạt tính (UI)


Hình 4.17: Khả năng tái sử dụng của glucoamylase và Termamyl đồng cố định trên silica-alginate

0

25

50

75

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

Số lần




Bảng 4.5: Số lần tái sử dụng enzyme đồng cố định trên silica-alginate ở 50oC, pH

5,5

Số lần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

X (%) 88.20 95.28 92.33 67.56 75.82 69.15 69.15 74.34 64.90 73.63

Số lần 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

X (%) 58.05 64.65 63.48 65.36 66.07 64.18 66.42 53.45 59.23 42.24

Số lần 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

X (%) 57.81 42.48 54.04 51.09 59.35 60.17 54.16 56.16 56.28 59.35

Số lần 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

X (%) 54.16 60.41 53.21 62.53 50.97 53.80 54.86 55.45 56.28 54.86

Số lần 41 42 43 44 45 46

X (%) 49.44 57.46 56.28 61.12 48.73 36.34

Enzyme đồng cố định có khả năng tái sử dụng (44 lần) nhiều hơn so với việc

cố định chỉ Termamyl (42 lần). Nó cho thấy khả năng hỗ trợ xúc tác của hai enzyme

glucoamylase và Termamyl khi đồng cố định trên silica-alginate.



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

- Termamyl cố định trên silica gel có hoạt hóa glutaraldehyde có hiệu quả hơn

không hoạt hóa với glutaraldehyde. Tuy nhiên sự cải thiện không đáng kể, tỉ lệ

enzyme bị rửa trôi khá cao. Nhiệt độ và pH tối ưu của Termamyl cố định trên silica

gel lần lượt là 100oC và 5,5. Số lần tái sử dụng tương đối thấp, chỉ được 2 lần.

- Hàm lượng silica gel thích hợp bổ sung vào 3g dung dịch chitosan 3% là

0,12g, tương ứng với tỉ lệ silica/chitosan là 4% (w/w). Lượng Termamyl cho vào cố

định là 0,2ml. Termamyl cố định trên silica-chitosan có nhiệt độ tối ưu là 60oC, pH

tối ưu là pH 8 và tái sử dụng được 30 lần.

- Hàm lượng silica gel thích hợp bổ sung vào 2g dung dịch alginate 3% là

0,12g, tương ứng với tỉ lệ silica/chitosan là 6% (w/w). Lượng Termamyl cho vào cố

định là 0,2ml. Silica-alginate cố định Termamyl có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là

là 60oC và pH 8. Khả năng tái sử dụng 42 lần.

- Việc đồng cố định co-enzyme glucoamylase và Termamyl trên silica-alginate

cho kết quả rất khả quan, 44 lần tái sử dụng ở nhiệt độ 50oC và pH 5,5.

Việc cố định đồng thời hai enzyme Termamyl và glucoamyase trên silica-

alginate sẽ giúp ích cho việc thực hiện một dây chuyền phản ứng liên tục bởi nhiều

enzyme trong quá trình chuyển hóa. Mặt khác, ta hoàn toàn có thể điều khiển được

các yếu tố như thời gian phản ứng, nhiệt độ và pH… trong quá trình sản xuất.

Kiến nghị

Việc cố định amylase trên vật liệu phối hợp silica gel và alginate đạt hiệu quả

khá cao. Tuy nhiên, do thời gian thực hiện nghiên cứu có hạn nên cần nghiên cứu

sâu hơn một số yếu tố như:

- Khảo sát các điều kiện đồng cố định glucoamylase và Termamyl theo điều

kiện lắc.

- Khảo sát điều kiện đồng cố định glucoamylase và Termamyl ở một cột và hai

cột phản ứng cũng như tối ưu các điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu, số lần tái sử dụng,



điều khiển sản phẩm tạo thành và thực hiện tối ưu hóa bằng phần mềm Design

Expert với các giá trị đơn biến đã được khảo sát ở nghiên cứu này.

- Khảo sát cố định các enzyme khác trên vật liệu phối hợp với silica gel.

- Phương pháp cố định amylase trên silica gel được thực hiện trong nghiên cứu

này không thành công (phương pháp hấp phụ). Ta có thể khắc phục bằng cách cố

định enzyme bằng phương pháp cộng hóa trị bằng cách: silan hóa với 3-APTES (3-

amino propyl triethoxysilane) và glutaraldehyde hoặc đồng hoạt hóa với 2 chất hoạt

hóa là PEI (poly ethylen imine) và glutaraldehyde. (xem thêm phụ lục 7b)


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phạm Thị Thanh Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007. Công Nghệ Sinh Học, tập 3,

Enzyme Và Ứng dụng, trang 143. NXB giáo dục.

2. Huỳnh Ngọc Oanh, 2010. Nghiên cứu quá trình cố định enzyme thủy phân

carbonhydrate. Luận án tiến sĩ. Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành

phố Hồ Chí Minh.

3. Ali Karout et al. (2007). Immobilization of a lipoxygenase in silica gels for

application in aqueous media. Molecular Catalysis B: Enzymatic 44 , 117–127.

4. Aline M. Pascoal, Sydnei Mitidieri, Kátia F. Fernandes. (2011). Food and

bioproducts processing 89, 300-306.

5. Aliya Riaz at al. (2009). Immobilization of a thermostable α-amylase on calcium

alginate beads from Bacillus subtilis KIBGE-HAR. Basic and Applied Sciences 3

(3), 2883-2887. ISSN 1991-8178.

6. Alper Akkaya, Arif Hikmet Uslan. (2010). Sequential immobilization of urease to

glycidyl methacrylate grafted sodium alginate. Molecular Catalysis B: Enzymatic

67, 195-201.

7. Antonella Petri et al. (2004). Covalent immobilization of chloroperoxidase on silica

gel and properties of the immobilized biocatalyst. Molecular Catalysis B:

Enzymatic 27, 103–106.

8. Arpana Kumari, Arvind M. Kayastha. (2011). Immobilization of soybean (Glycine

max) α-amylase onto Chitosan and Amberlite MB-150 beads: Optimization and

characterization. Molecular Catalysis B: Enzymatic 69, 8-14.

9. Aziz Tanriseven, Zehra Olcer. (2008). A novel method for the immobilization of

glucoamylase onto polyglutaraldehyde-activated gelatin. Biochemical Engineering

Journal 39, 430-434.

10. Aziz Tanriseven, Zehra Olcer. (2010). Co-immobilization of dextransucrase and

dextranase in alginate. Process Biochemistry 45, 1645-1651.

11. Bent W. Sigurskjold et al. (2000). Glucoamylase: structure/function relationships,

and protein engineering. Biophysica Acta 1543, 275-293.

12. Bladino A, Macias M, Cantero D. (2002). Glucose oxidase release from calcium

alginate gel capsules. Enzyme Microb Technol 27, 319-324.

13. Boadi DK, Neufeld RJ (2001). Encapsulation of tannase for the hydrolysis of tea

tannins. Enzyme Microb Technol 28, 590-595.


14. C. Vieille, G.J. Zeikus (2001). Hyperthermophilic enzymes: sources, uses and

molecular mechanisms for thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65, 1-43.

15. Chia-Hung Kuo et al. (2012). Optimum conditions for lipase immobilization on

chitosan-coated Fe3O4 nanoparticles. Carbohydrate Polymers 87, 2538– 2545.

16. Cristina López et al. (2006). Enzymatic inhibition and thermal inactivation in the

hydrolysis of chestnut pureé with an amylases mixture. Enzyme and Microbial

Technology 39, 252-258.

17. Daewon Park et al. (2005). Immobilization of starch-converting enzymes on

surface-modified carriers using single and co-immobilized systems: properties and

application to starch hydrolysis. Process Biochemistry 40, 53–61.

18. Dilek Kılıç Apar, Belma Özbek. (2004). Process Biochemistry 39, 1137–1144.

19. Hertzberg S et al. (1992). Alginate as immobilization matrix and stabilizing agent

in two-phase liquid system: application in lipase-catalyzed reactions. Enzyme

Microb Technol 14, 42-47..

20. Jian Qin Zhou, Jian Wen Wang. (2009). Immobilization of alliinase with a water

soluble–insoluble reversible N-succinyl-chitosan for allicin production. Enzyme

and Microbial Technology 45, 299-304.

21. Jolanta Bryjak et al. (2007). Evaluation of man-tailored cellulose-based carriers in

glucoamylase immobilization. Carbohydrate Research 342, 1105–1109.

22. Jun-ichi Ida, Tatsushi Matsuyama, Hideo Yamamoto (2000). Immobilization of

glucoamylase on ceramic membrane surfaces modified with a new method of

treatment utilizing SPCP–CVD. Biochemical Engineering Journal 5, 179-184.

23. M. Vezir Kahraman et al. (2007). α-amylase immobilization on functionalized glass

beads by covalent attachment. Food Chemistry 104, 1385-1392.

24. Mayur G. Sankalia et al. (2007). Reversed chitosan–alginate polyelectrolyte

complex for stability improvement of alpha-amylase: Optimization and

physicochemical characterization. Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65, 215-

232.

25. P. Nigam, D. Singh (1995). Enzyme and microbial systems involved in starch

processing. Enzyme Microb. Technol. 17, 770-778.

26. Roy I, Gupta MN. (2004). Hydrolysis of starch by a mixture of glycoamylase and

pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb

Technol 34, 26-32.

27. Seung Won Park et al. (2002). Covalent immobilization of GL-7-ACA acylase on

silica gel through silanization. Reactive & Functional Polymers 51 , 79–92.


28. Thayyath Screenivasan Anirudhan, Sreenivasan Rijith (2009). Glutaraldehyde

cross-linked epoxyaminated chitosan as an adsorbent for the removal and recovery

of copper (II) from aqueous media, Physicochem. Physicochem. Eng. Aspects 351,

52-59.

29. The amylase research society of Japan. (1988). Handbook of amylases and related

enzymes. Pergamon Press, Oxford, United Kingdom.

30. Tiourina OP, Sukhorukov GB. (2002). Multilayer alginate/protamine micro- sized

capsules: encapsulation of α-chymotrypsin and controlled release study. Int J

Pharm 242, 155-161.

31. Y.M. Yang, J.W. Wang, R.X. Tan. (2004). Immobilization of glucose oxidase on

chitosan–SiO2 gel. Enzyme and Microbial Technology 34, 126-131.

32. W. Gerhartz, 1990. Enzyme in industry

33. Z. Findrik. (2009). Starch hydrolysis by the synergistic action of amylase and

glucoamylase. New Biotechnology 25S. Doi: 10.1016/j.nbt.2009.06.1003

34. Zoe Konsoula, Maria Liakopoulou, Kyriakides. (2006). Starch hydrolysis by the

action of an entrapped in alginate caps ules α-amylase from Bacillus subtilis.

Biochemistry 41, 343-349.

35. http://www.cyberchemvn.com/cyberchemvn/index.php?option=com_content

&view=article&id=67:lp-v-thong-minh-cho-phep-phong-thich-cht-cha-ben-

trong-nhit-tuy-chn&catid=39:theorical&Itemid=2

36. www.novozymes.com

37. http://www.sbu.ac.uk/water/hydro.html

38. http://vi.wikipedia.org/wiki/Silica_gel

http://www.sbu.ac.uk/water/hydro.html

http://vi.wikipedia.org/wiki/Silica_gel

54

PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Định nghĩa hoạt tính của enzyme

Một đơn vị hoạt độ (UI) của Termamyl là số mg glucose sinh ra khi cho 1ml enzyme

thủy phân tinh bột trong 1 phút ở điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp.

Sự thủy phân tinh bột.

1ml tinh bột 1% cùng với 2ml đệm pH thích hợp được cho vào 1g mẫu enzyme cố định

và 0,2ml enzyme tự do. Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm, để yên trong 30 phút ở

nhiệt độ khảo sát. Sau đó dung dịch sau phản ứng sẽ được đem đi tiến hành xác định hàm

lượng đường khử. Hạt sau khi phản ứng được rửa sạch bằng nước cất và được bảo quản lạnh.

Phụ lục 1a: Phương pháp xác định hoạt tính

DNS (dinitro saliclic acid) là phương pháp xác định hoạt tính của enzyme α-amylase

dựa vào hàm lượng đường khử. Dung dịch đường được pha loãng và cho tương ứng 3ml mẫu

và 1ml DNS. Tiếp đến mẫu được đun trong nước sôi trong 5 phút, để nguội và tiến hành đo

quang ở bước sóng 540nm. Lượng đường khử được suy trực tiếp từ phương trình đường

chuẩn với D-glucose là chất chuẩn.

Phương trình đường chuẩn DNS: a = 0.407 ∆OD + 0.033 với r2 = 0.988

Hàm lượng đường khử được xác định theo công thức sau:

H =

(UI) (1)

Trong đó:

a: hàm lượng đường khử theo đường chuẩn (mg/ml); n: hệ số pha loãng; H: hoạt tính

enzyme (UI); V: thể tích dung dịch thủy phân (cơ chất, đệm và enzyme) (ml); l: lượng

enzyme tham gia phản ứng (ml) đối với enzyme tự do và khối lượng gel cố định enzyme (g)

đối với enzyme cố định; t: thời gian phản ứng (30 phút).

Phụ lục 2a: Phương pháp xác định hàm lượng protein

Bradford là phương pháp xác định hàm lượng protein của enzyme Termamyl dựa vào

khả năng bắt màu của protein với dung dịch Bradford. Với mỗi 1ml mẫu cho tương ứng 2ml

dung dịch Bradford và lắc đều, để yên trong 2 phút và tiến hành đo quang ở bước sóng

Hiệu suất cố định

enzyme (%)

Hoạt tính của enzyme cố định

Hoạt tính của enzyme tự do =

55

595nm. Lượng protein được suy trực tiếp từ phương trình đường chuẩn với albumin là chất

chuẩn.

Phương trình đường chuẩn Bradford: a = 1993 ∆OD – 1.253 với r2 = 0.997

Lượng protein (C) có trong 1g hoặc 1ml nguyên liệu được tính theo công thức:

C = a x n (mg)/1 (g hoặc ml)

Tổng lượng protein trong mẫu (M)

M = a x n x m (mg)

Với a: hàm lượng protein theo đường chuẩn (mg/ml); n: hệ số pha loãng; m: khối lượng

hoặc thể tích nguyên liệu (g hoặc ml)

Tổng lượng protein ban đầu = nồng độ protein trong dung dịch ban đầu x lượng chế

phẩm enzyme ban đầu đem sử dụng (ml)

Hàm lượng protein cố định = hàm lượng protein ban đầu - hàm lượng protein còn lại.

Phụ lục 3a: Tạo bột silica gel

Đầu tiên, cho dung dịch (NH4)2SO4 1M vào cốc. Tiếp đến cho dung dịch Na2SiO3 1M

vào cốc trên, vừa cho vừa khuấy đều trong 1 giờ. Sau đó dung dịch được để yên qua đêm ở

nhiệt độ phòng. Dung dịch được rửa sạch với nước cất và được sấy khô. Ta thu được silica gel

thô.

Silica gel thô được xử lý với dung dịch HNO3 5% để trung hòa lượng base trong gel.

Sau đó, gel được hoạt hóa với glutaraldehyde 10% trong 3 giờ ở 4oC. Tiếp theo, enzyme được

cho vào gel để thực hiện quá trình cố định. Thời gian cố định enzyme là 3 giờ

Hiệu suất cố định

protein (%)

Hàm lượng protein của enzyme cố định

Hàm lượng protein của enzyme tự do =

56

Hình 1: Quy trình tạo bột silica gel

Dung dịch (NH4)2SO4

1M

Tạo sol Dung dịch Na2SiO3 1M

Na2SiO3(NH4)2SO4

= 1

1 về thể t ch

Khuấy ở nhiệt độ phòng

Tạo gel Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ

phòng trong 30 phút

Để yên qua đêm ở nhiệt độ

phòng

Lọc, rửa Nước cất

Bỏ nước rửa

Silica gel thô

Sấy khô

Phần trên phễu

Trung hòa Dung dịch HNO3 5%

Đun sôi trong 1giờ

Sấy khô

Bột silica gel

Hoạt hóa Dung dịch glutaraldehyde

10%

Ngâm trong 3 giờ ở 4

oC

57

PHỤ LỤC B: BẢNG TÍNH TOÁN

Phụ lục 1b: Các thông số của Termamyl và glucoamylase tự do

Bảng 1: Hoạt tính của Termamyl và glucoamylase tự do


∆OD

1.003 0.566

0.994 0.559

0.981 0.581

∆OD trung bình 0.993 0.569

Lượng glucose sinh ra (mg) 0.437 0.264

Hệ số pha loãng 50 50

Thể tích dung dịch (ml) 3.2 6.2

Thời gian phản ứng (phút) 30 30

Lượng enzyme tham gia (ml) 0.2 0.2

Hoạt tính (UI) 11.657 13.663

Đối với Termamyl, thể tích dung dịch gồm có 3ml hồ tinh bột 1% và 0.2ml enzyme. Đối

với glucoamylase, thể tích dung dịch gồm 1ml hồ tinh bột 3%, 5ml nước cất và 0.2ml

enzyme.

Bảng 2: Hàm lượng protein của Termamyl và glucoamylase tự do


∆OD

0.046 0.043

0.045 0.040

0.045 0.039


Hàm lượng protein (mg) 0.051 0.080


Lượng protein có trong 1ml 12.829 199.489

Phụ lục 2b: Các thông số của Termamyl cố định trên silica gel

Bảng 3: Hàm lượng protein

Các thông số Termamyl cố định Termamyl tự do

∆OD

0.028 0.032

0.02 0.028

0.024 0.026


Hàm lượng protein (mg) 0.047 0.056


Lượng protein có trong 1ml (1g

silica) 46.579 139.7

58

Tổng lượng protein có trong 5ml

enzyme* 232.9 698.5

Hiệu suất cố định protein (%) 66.66

* Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng 5ml Termamyl cho cố định trên 1g silica gel. Để tính

hiệu suất cố định, chúng tôi quy về hàm lượng protein tổng.

Bảng 4: Hoạt tính của Termamyl cố định

Các thông số Termamyl cố định Termamyl tự do

∆OD

0.400 0.199

0.381 0.196

0.404 0.186


Lượng glucose sinh ra (mg) 0.194 0.112


Thể tích dung dịch (ml) 6 6.2

Thời gian phản ứng (phút) 30 30

Lượng enzyme tham gia (ml) 0.2

Hoạt tính (UI) 1.183 4.622

Hiệu suất cố định enzyme (%) 5.12

Bảng 5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Các thông số Termamyl cố định

Nhiệt độ (oC) Nhiệt độ phòng 70 85 100

∆OD

0.400 0.176 0.224 0.427

0.381 0.146 0.243 0.431

0.404 0.180 0.231 0.420

∆OD trung bình 0.395 0.167 0.233 0.426

Lượng glucose sinh ra (mg) 0.194 0.101 0.128 0.206

Hệ số pha loãng 10 20 20 20

Thể tích dung dịch (ml) 6 6 6 6

Thời gian phản ứng (phút) 30 25 25 25

Hoạt tính (UI) 0.388 0.485 0.613 0.991

Bảng 6: Khảo sát ảnh hưởng của pH


pH 5 5.5 6 6.5 7

∆OD

0.179 0.297 0.25 0.2 0.214

0.197 0.301 0.24 0.208 0.218

0.192 0.269 0.234 0.216 0.218

∆OD trung bình 0.189 0.289 0.241 0.208 0.217

Lượng glucose sinh ra 0.110 0.151 0.131 0.118 0.121

59

(mg)

Hệ số pha loãng 20 20 20 20 20

Thể tích dung dịch (ml) 6 6 6 6 6

Thời gian phản ứng (phút) 30 30 30 30 30

Hoạt tính (UI) 0.440 0.602 0.525 0.471 0.485

Phụ lục 3b: Các thông số của glucoamylase cố định trên silica gel

Bảng 7: Hàm lượng protein

Các thông số Enzyme cố định Enzyme

tự do

Thể tích enzyme cho vào

cố định (ml) 4 5 6 7 8 0.2

∆OD

0.027 0.031 0.025 0.033 0.042 0.043

0.025 0.026 0.029 0.03 0.046 0.040

0.028 0.027 0.03 0.034 0.042 0.039

∆OD trung bình 0.027 0.028 0.028 0.0323 0.0433 0.041

Hàm lượng protein (mg) 0.052 0.055 0.055 0.063 0.085 0.056

Hệ số pha loãng 1250 1000 833 714 625 500

Lượng protein có trong

1ml (1g silica) 64.87 54.55 45.46 45.13 53.19 199.489

Tổng lượng protein (mg) 259.47 272.76 272.76 315.94 425.55

Hiệu suất cố định protein

(%) 67.48 72.65 77.21 77.38 73.33

Bảng 8: Hoạt tính glucoamylase cố định trên silica gel

Các thông số Enzyme cố định Enzyme

tự do

Thể tích enzyme (ml) 4 5 6 7 8 0.2

∆OD

0.841 0.593 0.781 0.615 0.649 0.566

0.868 0.525 0.736 0.543 0.737 0.559

0.838 0.585 0.761 0.625 0.683 0.581

∆OD trung bình 0.849 0.568 0.759 0.594 0.690 0.569

Lượng glucose sinh ra (mg) 0.379 0.264 0.342 0.275 0.314 0.264

Hệ số pha loãng 10 20 20 20 20 50

Thể tích dung dịch (ml) 6 6 6 6 6 6.2

Thời gian phản ứng (phút) 30 30 30 30 30 30

Hoạt tính (UI) 1.39 1.55 1.67 1.15 1.15 13.663

Hiệu suất cố định enzyme

(%) 0.757 1.056 1.368 1.100 1.255

60

Bảng 9: Nhiệt độ và pH tối ưu khảo sát theo Design Expert

Các thông số Glucoamylase cố định trên silica gel

mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

nhiệt độ (độ C) 80 80 70 80 90 80 80 80 65 80 90 70 94

pH 5 6.5 6 5 3.8 5 3.34 5 5 5 6 3.8 5

∆OD

0.094 0.036 0.211 0.095 0.986 0.228 0.268 0.377 0.454 0.412 0.57 0.286 0.484

0.086 0.046 0.224 0.126 1.058 0.209 0.182 0.427 0.456 0.379 0.563 0.271 0.484

0.12 0.03 0.215 0.136 0.954 0.273 0.205 0.415 0.444 0.331 0.584 0.294 0.491

∆OD trung bình 0.100 0.037 0.217 0.119 0.999 0.237 0.218 0.406 0.451 0.374 0.572 0.284 0.486

Lượng glucose sinh ra (mg) 0.074 0.048 0.121 0.081 0.440 0.129 0.122 0.198 0.217 0.185 0.266 0.148 0.231

Hệ số pha loãng 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

Thể tích dung dịch (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

Thời gian phản ứng (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Hoạt tính (UI) 0.590 0.386 0.969 0.651 3.518 1.035 0.975 1.587 1.734 1.482 2.128 1.188 1.848

61

Phụ lục 4b: Termamyl cố định trên silica-chitosan

Bảng 10: Khảo sát lượng silica thêm vào chitosan

Mẫu

Enzyme cố định

Enzyme

tự do

0 1 2 3 4 5

Khối lượng silica

gel (g) 0 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15

Khối lượng

alginate 3% (g) 3 3 3 3 3 3

OD

0.214 0.207 0.203 0.232 0.239 0.219 0.509

0.203 0.189 0.229 0.221 0.248 0.212 0.517

0.213 0.213 0.196 0.213 0.232 0.221 0.511

∆OD TB 0.210 0.203 0.209 0.222 0.240 0.217 0.512

Lượng đường khử 0.118 0.115 0.118 0.123 0.131 0.121 0.241

Hệ số pha loãng 25 25 25 25 25 25 25

Thể tích dung

dịch (ml) 3 3 3 3 3 3 3.2

Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu

(g) 1 1.01 1.03 1.05 1.04 1.02

Lượng enzyme tự

do 0.2

Hoạt tính (UI) 0.296 0.286 0.286 0.294 0.314 0.297 0.643

Hiệu suất (%) 45.97 44.42 44.48 45.67 48.77 46.16

Bảng 11: Hiệu suất cố định protein

Các thông số Termamyl cố định Enzyme

tự do

Thể tích enzyme (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2

∆OD

-0.031 0.031 0.041 0.043 0.043 0.046

-0.037 0.037 0.035 0.047 0.04 0.045

-0.035 0.033 0.036 0.046 0.041 0.045

∆OD trung bình -0.034 0.034 0.037 0.045 0.041 0.045

Hàm lượng protein (mg) 0.020 0.047 0.048 0.051 0.050 0.051

Hệ số pha loãng 60 50 33.33 25 20 50

Lượng protein có trong 1ml (1g

silica) 11.990 11.368 5.235 3.144 1.911 12.829

Khối lượng mẫu (g) 1.02 1.03 1.02 1.02 1.04

Hiệu suất cố định protein (%) 6.538 11.383 59.192 75.490 85.103

62

Bảng 12: Hoạt tính Termamyl cố định trên silica-chitosan

Các thông số Termamyl cố định Enzyme

tự do

Thể tích enzyme (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2

∆OD

0.357 0.819 0.997 1.228 1.305 1.012

0.346 0.841 1.106 1.154 1.243 0.993

0.308 0.796 1.196 1.042 1.16 0.973

∆OD trung bình 0.337 0.819 1.100 1.141 1.236 0.993

Lượng glucose sinh ra (mg) 0.170 0.366 0.481 0.497 0.536 0.437

Hệ số pha loãng 25 25 25 25 25 50

Thể tích dung dịch (ml) 3 3 3 3 3 3.2


Khối lượng mẫu (g) 1.02 1.02 1 1 1.01

Hoạt tính (UI) 0.417 0.898 1.202 1.244 1.327 0.417

Hiệu suất cố định enzyme

(%) 35.78 38.51 34.36 26.67 22.76 35.78

Bảng 13: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên Termamyl cố định trên silica-chitosan


Nhiệt độ (oC) 40 50 60 70

∆OD

0.271 0.426 0.421 0.375

0.237 0.411 0.382 0.386

0.245 0.433 0.405 0.363

∆OD trung bình 0.251 0.423 0.403 0.375





Khối lượng mẫu (g) 0.98 1.02 1.06 1.06

Hoạt tính (UI) 0.69 0.86 0.93 0.88

Bảng 14: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên Termamyl cố định trên silica-chitosan


pH 7 7.5 8 8.5

∆OD

0.278 0.299 0.271 0.251

0.263 0.283 0.283 0.248

0.274 0.291 0.285 0.237

∆OD trung bình 0.272 0.291 0.280 0.245


63




Khối lượng mẫu (g) 1 1.02 1.01 1.04

Hoạt tính (UI) 0.359 0.371 0.728 0.638

Phụ lục 5b: Các thông số của Termamyl cố định trên silica-alginate

Bảng 15: Khảo sát lượng silica thêm vào alginate

Mẫu

Enzyme cố định

Enzyme

tự do

0 1 2 3 4 5

Khối lượng silica

gel (g) 0 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15

Khối lượng

alginate 3% (g) 2 2 2 2 2 2

OD

0.506 0.501 0.547 0.541 0.563 0.461 0.99

0.489 0.505 0.504 0.55 0.572 0.488 1.03

0.494 0.462 0.516 0.489 0.461

∆OD TB 0.496 0.489 0.526 0.536 0.541 0.475 1.01

Lượng đường khử 0.235 0.232 0.247 0.251 0.253 0.226 0.444

Hệ số pha loãng 25 25 25 25 25 25 50

Thể tích dung

dịch (ml) 3 3 3 3 3 3 3.2

Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu

(g) 1.01 1.02 1.02 1 1 1.01

Lượng enzyme tự

do 0.2

Hoạt tính (UI) 1.163 1.138 1.210 1.255 1.267 1.119 2.368

Hiệu suất (%) 49.123 48.051 51.098 52.993 53.48 47.265

Bảng 16: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên Termamyl cố định trên silica-alginate


Nhiệt độ (oC) 40 50 60 70

∆OD

0.690 0.207 0.184 0.193

0.684 0.181 0.176 0.172

0.678 0.183 0.183 0.176

∆OD trung bình 0.684 0.190 0.181 0.180





64

Khối lượng mẫu (g) 1 1.01 0.99 1.01

Hoạt tính (UI) 1.557 1.673 1.638 1.775

Bảng 17: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên Termamyl cố định trên silica-alginate


pH 5 5.5 6 6.5 7

∆OD

0.250 0.207 0.184 0.193 0.192

0.250 0.181 0.176 0.172 0.176

0.245 0.183 0.183 0.176 0.201

∆OD trung bình 0.248 0.190 0.181 0.180 0.190

Lượng glucose sinh ra (mg) 0.103 0.110 0.107 0.106 0.110

Hệ số pha loãng 25 25 25 25 25

Thể tích dung dịch (ml) 3 3 3 3 3

Thời gian phản ứng (phút) 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 1 1.04 1.03 1.03 1.01

Hoạt tính (UI) 0.515 0.530 0.518 0.516 0.546

Phụ lục 6b: Đồng cố định Termamyl và glucoamylase trên silica-alginate

Bảng 18: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên enzyme đồng cố định trên silica-alginate

Các thông số Enzyme cố định

Nhiệt độ (oC) 40 50 60 70

∆OD 1.114 0.994 1.023 0.874

1.037 1.121 1.042 0.784

1.026 1.147 0.993 0.894

∆OD trung bình 1.059 1.087 1.019 0.851





Khối lượng mẫu (g) 1 1 1.01 0.99

Hoạt tính (UI) 2.320 2.377 2.217 1.916

Bảng 19: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên enzyme đồng cố định trên silica-alginate

Các thông số Enzyme cố định

pH 5 5.5 6 6.5

∆OD 0.309 0.341 0.301 0.279

0.328 0.359 0.322 0.284

0.313 0.327 0.277 0.259

∆OD trung bình 0.317 0.342 0.300 0.274



65



Khối lượng mẫu (g) 1 0.97 1.01 0.99

Hoạt tính (UI) 0.810 0.888 0.768 0.730

Phụ lục 7b: Hoạt hóa silica gel với PEI và glutaraldehyde

Hình 2: Hoạt hóa silica gel

66

Phụ lục 8b: Tái sử dụng

Bảng 20: Khảo sát khả năng tái sử dụng Termamyl cố định trên silica gel


Hoạt hóa glutaraldehyde Không hoạt hóa Có hoạt hóa

Số lần tái sử dụng 1 2 3 4 1 2 3 4

∆OD

0.217 0.145 0.087 0.837 0.467 0.431 0.312 0.869

0.23 0.143 0.098 0.839 0.521 0.428 0.319 0.873

0.198 0.136 0.11 0.831 0.516 0.423 0.293 0.858

∆OD trung bình 0.215 0.141 0.098 0.836 0.501 0.427 0.308 0.867

Lượng glucose sinh ra

(mg) 0.121 0.090 0.073 0.373 0.237 0.207 0.158 0.386

Hệ số pha loãng 20 20 20 3 20 20 20 3

Thể tích dung dịch (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6

Thời gian phản ứng (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30

Hoạt tính (UI) 0.482 0.362 0.292 0.224 0.948 0.827 0.633 0.232

Hiệu suất phản ứng (%) 100 75.007 60.484 22.660 100 87.287 66.843 23.426

Bảng 21: Khảo sát khả năng tái sử dụng glucoamylase cố định trên silica gel

Các thông số Glucoamylase cố định

Hoạt hóa glutaraldehyde Không hoạt hóa Có hoạt hóa

Số lần tái sử dụng 1 2 3 1 2 3

∆OD

0.511 0.354 0.443 0.523 0.443 0.513

0.521 0.353 0.45 0.534 0.453 0.514

0.523 0.378 0.451 0.521 0.439 0.521

67

∆OD trung bình 0.5183 0.362 0.448 0.526 0.445 0.516

Lượng glucose sinh ra

(mg) 0.244 0.180 0.215 0.247 0.214 0.243

Hệ số pha loãng 20 20 10 20 20 10

Thể tích dung dịch (ml) 6 6 6 6 6 6


Hoạt tính (UI) 0.975 0.721 0.431 0.988 0.856 0.486

Hiệu suất phản ứng (%) 100 73.960 44.158 100 86.657 49.176

Bảng 22: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica-chitosan

Termamyl cố định trên silica-chitosan

Số lần tái sử dụng 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

∆OD TB 0.197 0.177 0.152 0.131 0.154 0.135 0.127 0.326 0.405 0.339 0.374 0.431

lượng đường khử 0.113 0.105 0.095 0.086 0.096 0.088 0.085 0.166 0.198 0.171 0.185 0.208

hệ số pha loãng 25 25 20 20 20 20 20 10 10 10 10 10

Thể tích dung dịch (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.292 0.271 0.196 0.178 0.197 0.181 0.175 0.171 0.204 0.176 0.191 0.215

Hiệu suất phản ứng 100 92.81 67.05 61.01 67.63 62.16 59.86 58.56 69.92 60.43 65.46 73.66


Số lần tái sử dụng 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

∆OD TB 0.348 0.373 0.378 0.425 0.351 0.33 0.223 0.366 0.242 0.341 0.314 0.206

lượng đường khử 0.175 0.185 0.187 0.206 0.176 0.167 0.124 0.182 0.131 0.172 0.161 0.117

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

68

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.180 0.191 0.193 0.212 0.181 0.172 0.128 0.188 0.136 0.177 0.166 0.120

Hiệu suất phản ứng 61.72 65.32 66.04 72.80 62.15 59.13 43.74 64.31 46.47 60.71 56.83 41.29


Số lần tái sử dụng 24 25 26 27 28 29 30 31 32

∆OD TB 0.36 0.402 0.349 0.313 0.3 0.331 0.29 0.25 0.188

lượng đường khử 0.180 0.197 0.175 0.160 0.155 0.168 0.151 0.135 0.110

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Thể tích dung dịch (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.185 0.203 0.180 0.165 0.160 0.173 0.156 0.139 0.113

Hiệu suất phản ứng 63.45 69.49 61.86 56.69 54.82 59.27 53.38 47.62 38.71

Bảng 23: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên silica-alginate

Termamyl cố định trên silica-alginate

Số lần tái sử dụng 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

∆OD TB 0.178 0.129 0.12 0.138 0.117 0.125 0.304 0.394 0.325 0.384 0.392 0.372

lượng đường khử 0.105 0.086 0.082 0.089 0.081 0.084 0.157 0.193 0.165 0.189 0.193 0.184

hệ số pha loãng 25 20 20 20 20 20 10 10 10 10 10 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.272 0.176 0.169 0.184 0.166 0.173 0.162 0.199 0.170 0.195 0.198 0.190



Số lần tái sử dụng 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

∆OD TB 0.373 0.351 0.424 0.376 0.338 0.194 0.403 0.238 0.345 0.335 0.29 0.408

69

lượng đường khử 0.185 0.176 0.206 0.186 0.171 0.112 0.197 0.130 0.173 0.169 0.151 0.199

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.191 0.181 0.212 0.192 0.176 0.115 0.203 0.134 0.179 0.175 0.156 0.205



Số lần tái sử dụng 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 ∆OD TB 0.374 0.379 0.402 0.366 0.429 0.398 0.417 0.381 0.466 0.298 0.299 0.374

lượng đường khử 0.185 0.187 0.197 0.182 0.208 0.195 0.203 0.188 0.223 0.154 0.155 0.185

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.191 0.193 0.203 0.188 0.214 0.201 0.209 0.194 0.230 0.159 0.159 0.191



Số lần tái sử dụng 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 ∆OD TB 0.38 0.397 0.387 0.38 0.296 0.36 0.278 0.362 0.287 0.214

lượng đường khử 0.188 0.195 0.191 0.188 0.153 0.180 0.146 0.180 0.150 0.120

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Thể tích dung dịch (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.193 0.201 0.196 0.193 0.158 0.185 0.151 0.186 0.154 0.124

Hiệu suất phản ứng 71.19 73.81 72.27 71.19 58.22 68.10 55.44 68.41 43.42 34.81

70

Bảng 24: Khả năng tái sử dụng của Termamyl và glucoamylase đồng cố định trên silica-alginate

Enzyme đồng cố định trên silica-alginate

Số lần tái sử dụng 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

∆OD TB 0.258 0.218 0.242 0.232 0.148 0.176 0.212 0.212 0.234 0.194 0.231 0.411

lượng đường khử 0.138 0.122 0.131 0.127 0.093 0.105 0.119 0.119 0.128 0.112 0.127 0.200

hệ số pha loãng 25 25 25 25 25 25 20 20 20 20 20 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.356 0.314 0.339 0.328 0.240 0.270 0.246 0.246 0.264 0.231 0.262 0.206



Số lần tái sử dụng 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

∆OD TB 0.467 0.457 0.473 0.479 0.463 0.482 0.372 0.421 0.277 0.409 0.279 0.377

lượng đường khử 0.223 0.219 0.226 0.228 0.221 0.229 0.184 0.204 0.146 0.199 0.147 0.186

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.230 0.226 0.232 0.235 0.228 0.236 0.190 0.211 0.150 0.206 0.151 0.192




lượng đường khử 0.176 0.205 0.208 0.187 0.194 0.194 0.205 0.187 0.208 0.184 0.216 0.176

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

71

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.182 0.211 0.214 0.193 0.200 0.200 0.211 0.193 0.215 0.189 0.222 0.182




lượng đường khử 0.176 0.186 0.189 0.191 0.194 0.189 0.171 0.198 0.194 0.211 0.168 0.125

hệ số pha loãng 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10


Thời gian (phút) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Khối lượng mẫu (g) 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

Hoạt tính (UI) 0.181 0.191 0.195 0.197 0.200 0.195 0.176 0.204 0.200 0.217 0.173 0.129


Documents

khảo sát điều kiện cố định amylase trên silica-chitosan và silica-alginate