KLİNİK MİKROBİYOLOJİDE SON YILLARDA YENİ NELER VAR

Mikroflora Dirençli bakterilerYeni teknolojiler

Dr Uğur ÇiftçiDüzen Laboratuvarlar GrubuWorkshop 2011

Bağırsak Flora Bakterileri

Bağırsak Mikroflorası

• Mikroflora = Flora = Mikrobiota

• Bağırsak mikroflorası insan ve hayvanların ince ve kalın bağırsaklarında (sindirim kanalında) yaşayan mikroorganizmaların tümüne verilen isimdir.

• Microbiome

Bağırsak Mikroflorası

• İnsan – Bağırsak mikroflorası ilişkisi

Kommensal ilişki???

Simbiyotik ilişki!!!

Unutulan Organ

Bağırsak mikroflorasını teşkil eden bakteriler tarafından meydana getirilen metabolik aktiviteler çoklu fonksiyon gören bir organın işlevini görmektedir ve bilim adamları yakın bir süre önce unutulan bu organı! hatırlamışlardır.

Niçin Bağırsak Mikroflorasına İlgi Başladı

• Fekal materyalden ekstrakte edilen bakteriyel nükleik asitlerdeki 16 S Ribozomal RNA (rRNA) genlerinin sekansı ile bakterilerin idantifikasyon ve sınıflandırılması kolaylaşmıştır.

• Metagenomik yaklaşımlarla bağırsak bakterilerinin idantifikasyonu ve yoğunluğu belirlenmiş ve daha önce

bilinmeyen ekosistemlerin yapısı ortaya çıkartılmıştır.

İnceleme Yöntemleri

Moleküler fingerprint

Ekolojik istatistik yaklaşımlar

Gnotobiotik farelerde yapılan çalışmalar

Bağırsak Mikroflorasının Rolü

• Bağırsak gelişimi ve fonksiyonunda

• Immun modülasyonda

• Gastrointestinal hareketde

• İlaç metabolizmasında

• Gıda toksinlerinin parçalanmasında

• Karsinojenlerin parçalanmasında

• Mikronutrientlerin sentezlenmesinde

• Hazmolmayan gıda maddelerinin fermantasyonunda

• Bazı elektrolitlerin ve eser minerallerin absorbsiyonunda

• Enterosit ve kolonisitlerin çoğalmasında

• Bağırsak lumenine patojen bakterilerin kolonizasyonunu önlemede

rol aldığı görülmüştür.

Bağırsak Mikroflorasının Rolü

Bağırsak mikroflorasının obezitede rolüJohn K. Dibaise ve and. Mayo Clinic Proceedings 2008 83 460-469

Bağırsak mikroflorasının obezitenin ve insülin

direncinin gelişimindeki rolüConi PD ve ark. Pathol Biol 2008 56:305-309

Obesite tedavisinde bağırsak mikroflorasıTsukumo DM ve ark. Arg.Bras.Endocrinol. Metabol. 2009 53:139-144

IBS (Irritable Bowel Syndrome) patogenezinde

bağırsak mikroflorası)Lee BJ, Bal YT J. Neurogastroenterology 2011 17:252-66

IBD (Inflamatory Bowel Disease) etiyolojisinde

bağırsak mikroflorasının rolü?Hugat J.P Best Proct. Res. Clin. Gastroenterol. 2008 18:451-62

Bağırsak Mikroflorası

• Yakın zamana değin sağlık üzerindeki rolü küçümsenmiştir.

• Yaşamsal öneme sahiptir. Sağlıklılık halini güçlendiren özelliklere sahiptir

• Sağlık üzerine henüz netleşmemiş bir çok rolü olduğu tahmin edilmektedir. Ve konu üzerinde daha bir çok araştırmaya gereksinim olduğu düşünülmektedir.

İlaca Dirençli Bakteriler

• Şayet önlem alınmazsa, Dünya, antibiyotik sonrası çağa doğru gitmektedir, birçok harcıalem enfeksiyon artık tedavi edilemeyecek ve halen antibiyotiklerle tedavi edilebilen enfeksiyon hastalıkları bir kez daha ölümcül hale gelecektir.

Dr. M. Chan

DSÖ Genel Müdürü

DSÖ Dirençle İlgili Son Durum Raporundan

• Geçen yıl Dünya genelinde 440.000 MDR tüberküloz belirlendi ve en az 150.000 i ölümle sonuçlandı.

• Sıtma paraziti en yeni kuşak ilaçlara bile direnç kazanmaktadır.

• Gonore ve dizanteriden sorumlu dirençli suşlar, tedavi alternatiflerini giderek sınırlandırmaktadır.

DSÖ Dirençle İlgili Son Durum Raporundan

• Hastane kökenli ciddi enfeksiyonların büyük bir kısmından MRSA gibi dirençli bakteriler sorumlu olmaktadır.

• İlaca dirençli suşlar uluslar arası yayılım göstermektedir.

• Hastaneler yüksek dirençli patojenlerin yuvası haline gelmiştir.

• MRSA (Metisilin Dirençli Staphylococcus aureus)

• VRE (Vankomisin Dirençli Enterokoklar)

• C. difficile (Clostridium difficile)

• CRKP (Karbapenem Dirençli Klebsiella pneumoniae)

• MDR TB/XDR TB (Çoklu İlaca Dirençli TB, Yaygın İlaca Dirençli TB)

• Bakteriyel direnç

-Yapısal (intrinsic)

- Sonradan kazanılmış direnç (acquired)

Kromozomal

Plazmide bağlı

Bakteriyel direncin plazmid ile transferi

MRSA kaynağı?

• HA – MRSA

• CA – MRSA

NDM-1 KP

NDM-1 New Delhi metallo-betalactamase -1

PCM (Plasmid encoding Carbapenem resistant

Metallobetalactamase)

Çoklu İlaca Dirençli TB

MDR-TB (Multi Drug Resistant Tuberculosis)

X DR-TB (Extensively Drug Resistant

Tuberculosis)

İlaç Dirençli TB halk sağlığını tehdit eden

global bir sorun haline gelmiştir.

İlaca Duyarlı TB, Nasıl İlaca Dirençli Hale Geliyor?

İlaca duyarlı TB hastalarının

uygunsuz / yetersiz ilaç kullanımı

MDR / XDR TB için Ne Yapılabilir?

• Erken teşhis için laboratuvarların güçlendirilmesi

• Hasta odaklı etkin tedavi

• Bulaşmayı önleyici politikalar

Laboratuvarın Rolü Ne Olabilir?

• Referans laboratuvarlar ağı içinde kalitesine güvenilen ilaç duyarlılık testlerinin ve diğer laboratuvar proseslerinin kullanılması

• Hızlı laboratuvar sonucu Hızlı ve etkin tedavi Sağlıklı toplum

Laboratuvar Testleri

Klasik Yöntemler• ARB

• Geleneksel yöntemlerle kültür/idantifikasyon/duyarlılık testi

• Otomatize sistemlerle kültür/idantifikasyon/duyarlılık testi

Doğrudan materyalden MTB-DNA tayini

Cobas Taqman MTBPCRNAA

• Real time nükleik ait amplifikasyonu teknolojisi ve reverse hibridizasyon ile direnç genlerinin belirlenmesi yoluyla doğrudan TB direncinin gösterilmesi

• X pert MTB/RIF Otomatize nükleik asit amplikasyonu ile eş zamanlı TB idantifikasyonu ve Rifampisin duyarlılığının belirlenmesi

TB İlaç Direnç Genleri Belirlenmesi

KLİNİK MİKROBİYOLOJİDE YENİ TEKNOLOJİLER

Geleneksel Kültür- Antibiyogramda

• Kültür ve idantifikasyon süresi uzun olduğundan klinisyenler tedavilerini klinik semptomlara göre başlıyor (non-spesifik tedavi)

• Geniş spektrumlu ilaçlar kullanılıyor

• Laboratuvar bulgusuna dayalı tedavi ancak 3-5 gün sonra başlayabiliyor

Geleneksel Uygulama Sonuçları

• Tedavi süresi uzuyor

• Dirençli suşlar çoğalıyor

• Mortalite artıyor

• Parasal kayıplar artıyor

Niçin Hızlı İdantifikasyon

• Etkili antibiyotiklerin hızla uygulanmasını sağlıyor

• Hedefe yönelik antibiyotik kullanımı ile etkin tedavi yapılabiliyor

• Mortalite azalıyor

• Hastanede kalış süresi kısalıyor

• Dirençli suşların ortaya çıkması azalıyor.

Hızlı İdantifikasyon Sağlayan Moleküler Metotlar

• PNA-FISH (Peptide Nucleic Acid Fluorencent in situ hybridization)

• Real-time PCR

Hızlı İdantifikasyon Sağlayan Moleküler Metotlar

• Avantajları

Hızlı sonuç

Laboratuvar iş akışına kolay adaptasyon

• Dezavantajları

Gram boyaya ihtiyaç göstermesi

Test edilen mikroorganizma menüsünün sınırlı olması

Geleneksel kültür-antibiyogram testlerinin paralel yürütülmesi zorunluluğu

MS (Mass spectrometry) Teknolojisi

• PCR/ESI-MS (PCR ile kombine electrospray ionizasyon-mass spectrometry)

• MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry)

PCR / ESI-MS

• Bakteri veya mantarların genomlarında multipleks PCR ile hedef bölgeleri çoğaltır.

• Ampliconların mass/charge oranını ölçer• Veri tabanındaki bilenen mikroorganizma

kompozisyonuna göre idantifiye eder.• Genetik idantifikasyon suşun tipini ve

antimikrobik direnç genlerini belirleyebilir.• Bu nedenle idantifikasyon yanında

epidemiyolojik sürveyans ve enfeksiyon kontrolünde de kullanılabilir.

MALDİ-TOF MS

• Protein biomarkerlarını mass spectrometry ile ölçer (Ribosomal, chaperone, transcription / translation factor proteinleri)

• Bakteri, mantar, mikobakterileri tür düzeyinde idantifiye eder.

• Doğrudan koloninin veya bakteriyel ekstresinin doğrudan ionizasyonu ile protein profilleri elde edilir. İdantifikasyon referans suşlardan elde edilen veri tabanı ile karşılaştırılarak yapılır.

• Mikroorganizma gruplarına göre ayrı işlem gerekmez.

MALDİ TOF MS PEAKS

MALDİ-TOF MS

• Doğru idantifikasyon yeteneği yüksek

• Sarf malzemelerinin bedeli düşük

• Hızlı sonuç

• İdantifiye edilecek mikroorganizma ile ilgili ön bilgi gerekmiyor

• Prefraksinasyon aşaması gerekmiyor.

• 2-20 kDa arasındaki bütün m/z değerini ölçer

Mikrobiyoloji Pratiği

Renal tüberküloz düşünülen bir hasta var hekim idrarda tbc tetkiki yaptırmak istiyor.

a) Teksifle ARB

b) Tbc PCR

c) Tbc kültürü LJ

d) Tbc kültürü Bactec / MGIT

e) İdrar mikroskobisi

En uygun tek yanıt verecek olursanız hangisini önerir siniz?

Renal tüberküloz düşünülen bir hasta var hekim otomatize sistemle tbc kültürü yaptırmak istiyor örnek olarak aşağıdakilerden hangisini önerir siniz?

a) Spot idrar (herhangi bir saatte)

b) 24 saatlik toplanmış idrar

c) Orta idrar

d) Sabah ilk idrarın tamamı

e) Ön idrar

Hekim hastadan Quantiferon gold testi istedi test pozitif çıktı bu test bize ne bilgi verir?

a) Hastada aktif tbc enfeksiyonu vardır.

b) Hastada latent tbc enfeksiyonu vardır.

c) Hasta tbc’ye karşı bağışıktır.

d) Hastada aktif/latent tbc enfeksiyonu vardır bu testle ayırt edilemez.

e) Hastada tbc hastalığı vardır

Quantiferon gold (gama interferon) testi için kan hangi tüpe/tüplere alınır?

a) Düz kan tüpü

b) EDTA’lı kan tüpü

c) Heparinli kan tüpü

d) Sitratlı kan tüpüe) TB antijenleri içeren tüp

Resimde görülen Balgam örneğinden hazırlanan Ziehl-Nelson boyalı preparatı nasıl rapor eder siniz?

a) Aside dirençli basil görüldü.

b) Tüberküloz basili görüldü.

c) Gram negatif basil görüldü.

d) Bakteri görülmedi artefaktlar görüldü.

e) Difteroid basil görüldü

Hastada çalışılan EBV serolojik test profilinde

aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir

• VCA IgG : Pozitif

• VCA IgM : Negatif

• EA : Negatif

• EBNA : Pozitif

a) Primer enfeksiyondur

b) Geçirilmiş enfeksiyondur

c) EBV enfeksiyonu yok

d) Belirsiz sonuç

e) Reaktivasyondur

Hastada çalışılan EBV serolojik test profili

• VCA IgG : Pozitif

• VCA IgM : Pozitif

• EA : Negatif

• EBNA : Negatif

a) Primer enfeksiyondur

b) Geçirilmiş enfeksiyondur

c) EBV enfeksiyonu yok

d) Belirsiz

e) Reaktivasyondur

Bir çocuk hastada EBV profili çalışılmış

• VCA IgM: Pozitif

• VCA IgG : Pozitif

• EA-D IgG : Pozitif

• EBNA IgG : Pozitif

bulunmuştur.

a) Erken dönem primer enfeksiyon

b) Geç dönem / geçirilmiş enfeksiyon

c) Reaktivasyon

d) Belirsiz sonuçtur

Yetişkin bir hastada yapılan serolojik testdeToksoplazma IgM : PozitifToksoplazma IgG : NegatifBir ay sonra testler tekrarlanmış aynı sonuç bulunmuştur.

a) Yeni başlayan (akut dönemde) bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

b) Geçirilmiş bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

c) Sub akut dönemde bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

d) Toksoplazma ile enfekte olmamıştır.

e) Reaktive olmuş toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

Yetişkin bir hastada yapılan serolojik testdeToksoplazma IgM : PozitifToksoplazma IgG : PozitifAltı ay ve bir yıl sonra testler tekrarlanmış aynı sonuçlar bulunmuştur.

a) Yeni başlayan (akut dönemde) bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

b) Geçirilmiş bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

c) Sub akut dönemde bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

d) Toksoplazma ile enfekte olmamıştır.

e) Reaktive olmuş toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.

1 aylık gebe kadından yapılan serolojik testdeRubella IgM : PozitifRubella IgG : PozitifRubella IgG Avidite Testi : Düşük avidite

a) Yeni başlayan (akut dönemde) bir rubella enfeksiyonu ile uyumludur.

b) Geçirilmiş bir rubella enfeksiyonu ile uyumludur. c) Sub akut dönemde bir rubella enfeksiyonu ile

uyumludur.d) Rubella ile enfekte olmamıştır.e) Reaktive olmuş rubella enfeksiyonu ile uyumludur.

Resimdeki yapıya dışkı örneğinde incelemede rastlanmıştır.

a) Kancalı kurt larvası

b) Strongiloides larvası

c) Pseodoparazit

d) Ascaris

Resimdeki yapı dışkıda görülmüştür, boyutu 25 μm dir.

a) Entamoeba histolytica kisti

b) Entamoeba hartmani kisti

c) Entamoeba coli kisti

d) Endolimax nana kisti

Erişkin Ascaris lumbricoidesler vücutta hangi bölgede bulunur?

a) Akciğer

b) Karaciğer

c) İnce bağırsak

d) Kalın bağırsak

e) Mide

İdrar kültür örneğinin hemen ekimi yapılamıyorsa

a) Oda ısısında 8 saate kadar bekletilebilir

b) Dondurarak 48 saat bekletilebilir

c) +4 °C (buzdolabında) 24 saat kadar bekletilebilir

d) 37 °C etüvde 8 saate kadar bekletilebilir.

e) Bekletilemez

Akut idrar yolu enfeksiyonlarında etken olarak en sık rastlanan mikroorganizma

a) Escherchia coli

b) Klebsiella pneumoniae

c) Proteus mirabilis

d) Staphylococcus

saprophyticus

e)Streptococcus pyogenes

Yetişkinlerde bakteriyel menenjit etkeni olarak en sık rastlanan bakteri

a) Streptococcus pneumoniae

b) Neisseria meningitidis

c) Haemophilus influenza

d) Escherichia coli

e) Klebsiella pneumonia

Endokarditlerle ilişkili olarak en sık rastlanan mikroorganizma

a) Viruslar

b) Neisseria

c) Stafilokoklar

d) Streptokoklar

e) Riketsiyalar

Aşağıdakilerden hangisi bağırsağın normal flora bakterileri arasında değildir?

a) Shigella

b) Clostridium

c) Peptostreptococcus

d) Laktobasil

e) Bifidobacterium

Bakteri kökenleri (suşları) en iyi hangi ısı derecesinde muhafaza edilebilir?

a) 37 °C

b) Oda sıcaklığı

c) + 4 °C

d) - 20 °C

e) - 70 °C

A grubu Streptokokların tip ayırımında hangisi kullanılır?

a) ASO (anti streptolizin O)

b) Bacitracin diski

c) T antijen

d) M antijen

e) C karbohidratı

Beta hemolitik Streptokoklarda A Grubu ayırımı için

a) Gram boya yapılır

b) Koagulaz testi yapılır

c) PYR testi yapılır

d) Beta hemolizin kuvvetli olmasına bakılır

e) Bacitracin duyarlılığına bakılır

(Birden fazla doğru yanıt olabilir)

Basitracin duyarlılığı aşağıdakilerden

hangisi için kullanılır.

a) Stafilokokların mikrokoklardan ayrılmasında

b) Streptokokların Stafilokoklardan ayrılmasında

c) Neisseriaların muhtemel teşhisinde

d) Hemophilus’ların muhtemel teşhisinde

e) Pnomokokların muhtemel teşhisinde

Aşağıdakilerden hangisi sifiliz için doğrulama testidir.

a) TPHA (Treponema pallidum hemaglütinasyon testi)

b) VDRL

c) RPR

d) Kolmer

e) CRP

Sifiliz tedavisinin takibinde kullanılır.

a) VDRL titresi

b) TPHA titresi

c) FTA-Abs titresi

d) CRP

e) Abbott architect syphilis assay