[Klercker - msu.ruplantphys.bio.msu.ru/education/protoplasts.pdf · Изолированный протопласт- растительная клетка без клеточной

МГУ им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

кафедра Физиологии растений

«Физиология растительной клетки»

Малый практикум по Физиологии растений

автор задачи В.В. Чуб составитель разработки М.А. Глазунова

Building a plant cell wall at a glance

© 2018. Published by The Company of Biologists Ltd | Journal of Cell Science (2018) 131, jcs207373. doi:10.1242/jcs.207373

- это сложная упорядоченная структура, состоящая из двух или трех структурно-независимых погруженных друг в друга сетей:

целлюлозной, пектиновой и белковой или фенилпропаноидной.

Целлюлозная сеть: образует каркас из микрофибрилл целлюлозы и связующих или сшивочных гликанов (гемицеллюлоз).

Пектиновая сеть: полисахариды разного состава и степени разветвленности, образующие замковые зоны (пектиновые мостики), в пектиновую сеть погружена целлюлозная сеть.

Белковая или фенилпропаноидная сеть.

Для разрушения первичной клеточной стенки достаточно разрушить ее углеводные компоненты.

целлюлоза

сшивочные гликаны

пектины

BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY OF PLANTS (2015) Bob B. Buchanan, Wilhelm Gruissem, and Russell L. Jones

в построении всех углеводных компонентов клеточной стенки обычно участвует 10-11 моносахаридов

большинство моносахаридов находятся в пиранозной форме, исключение составляют арабиноза и апиоза (фуранозная форма)

в большей части природных сахаров преобладает конформация «кресло»

большинство сахаров в клеточной стенке находятся в D конфигурации

в образовании связи между мономерами могут участвовать как α-, так и β-связи.

линейные молекулы β -(1-4)-D-глюкана степень полимеризации порядка 10000

(300-15000), длина 2-3 мкм Основной повторяющейся единицей

целлюлозы является целлобиоза, представляющая собой β- (1,4) -связанный дисахарид D-глюкопиранозы.

36 молекул целлюлозы связаны между собой водородными связями в микрофибриллу толщиной 5-10 нм длиной 2-3 см

целлюлозные цепи соединены антипараллельно (целлюлоза II)

в микрофибрилле высокоупорядоченные участки целлюлозы чередуются с аморфными

«Физиология растений» под ред. И.П. Ермакова. - Учеб. для студ. вузов. М.: Изд. центр "Академия", 2005.

целлобиоза

целлюлоза – каркас клеточной стенки целлюлозная сеть ограничивает увеличение клеток в размере и поступление в них воды

сшивочные (связующие) гликаны – связывают микрофибриллы целлюлозы, ограничивая их движение друг относительно друга

разнообразие гликанов связано с видом растения и особенностями ткани, к которой принадлежат клетки.

лекции по «Физиологии растений» для 3 курса проф. А.М. Носов

ксилоглюканы - β -(1-4)-D-глюкан с ответвлениями из: ксилозы, галактозы, фукозы,

гликаны со смешанной связью - β -(1-4)- и β -(1-3)-D-глюканы, в результате формируются изгибы линейной молекулы, при этом невозможно формирование водородных связей с другими полимерами

глюкуронарабиноксиланы - β -(1-4)-D-ксилан с ответвлениями из арабинозы, глюкуроновой кислоты

ксилоглюкан

гетероксилан

разнообразие пектинов связано с видом растения и типом ткани, к которой принадлежит клетка

пектиновая сеть образует поры, заряд и размер которых регулирует транспорт молекул и ионов сквозь клеточную стенку

рамногалактуронан I - основной компонент срединной пластинки, с помощью которого она «склеивает» клетки друг с другом

основной компонент пектинов -полигалактуроновая кислота - гомополимер из остатков D-галактуроновой кислоты,

галактуронаны• гомогалактуронаны – состоят из

минимум 200 D-галактуроновых фрагментов с β -(1-4)-связью

• рамногалактуронаны II - содержат 12 различных полисахаридов, обладают исключительно консервативной структурой (похож у многих организмов и разных тканей)

• ксилогалактоуронаны – встречаются не у всех организмов, боковые цепочки из ксилозы

рамногалактуронаны I - остов из рамнозы и галактуроновой кислоты с боковыми цепями из арабинанов, галактанов и арабиногалактанов, с β - (1,4) связями.

лекции по «Физиологии растений» для 3 курса проф. А.М. Носов

гомогалактуронан

рамногалактуронан I

рамногалактуронан II

структурные

пролин-обогащенные

гидроксипролин-обогащенные

арабиногалактаны

ферменты

гидролазы

лиазы

трансферазы

оксидоредуктазы

глицин-обогащенные

BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY OF PLANTSBob B. Buchanan, Wilhelm Gruissem, and Russell L. Jones

Тип I характерен для большинства двудольных и

«некоммелиноидных» однодольных микрофибриллы целлюлозы соединены

ксилоглюканами пектины: гомогалактуронаны и рамногалактуронаны I,

обогащенный арабинаном, галактаном и арабиногалактаном.

цепи гомогалактуронанов могут конденсироваться за счет сшивки с Ca2+ с образованием «замковых зон»

Тип II характерен для «коммелиноидных» однодольных микрофибриллы целлюлозы соединяются между

собой глюкуронарабиноксиланами стенки типа II бедны пектином, но дополнительный

вклад в плотность заряда стенки вносят единицы α-d-GlcA на глюкуронарабиноксиланах

клеточные стенки имеют очень мало структурного белка, но могут формировать обширные сети фенилпропаноидов

целлюлоза целлюлозаα - экспансинβ - экспансин

ксилоглюканыглюкуронарабиноксиланы

глюканы со смешанной связью

пектины

www.nature.com/scientificreports

Kozlova LV, Nazipova AR, Gorshkov OV, Petrova AA, Gorshkova TA. Elongating maize root: zone-specific combinations of polysaccharides from type I and type II primary cell walls. Sci Rep. 2020;10(1):10956. Published 2020 Jul 2. doi:10.1038/s41598-020-67782-0

цепи ксилоглюкана связываются с неполярной поверхностью микрофибрилл. Места сшивок –биомеханические горячие точки («biomechanical hotspots»)

в «биомеханических горячих точках» происходит формирование соединений микрофибрилл и интеграция их в одну сеть

biomechanical hotspots являются мишенями для специфических грибковых эндоглюканаз и эндогенных экспансинов

biomechanical hotspots

β-экспансины взаимодействуют с сильно замещенными глюкуронарабиноксиланами и рамногалактуронанами I, но не с целлюлозой, не действуют на ее связи с низкозамещенными арабиноксиланами

http://www.nature.com/scientificreports

Растительная клеточная стенка как динамичная система. Т.А. Горшкова ; [отв. ред. И.А. Тарчевский] ; Казанский ин-т биохимии и биофизики КазНЦ РАН. -М. : Наука, 2007.

Первичные клеточные стенки могут различаться:

количественным соотношением компонентов

составом связующих гликанов, пектинов и белков.

эти различия влекут за собой формирование клеточных стенок с разной архитектурой.Различия архитектуры клеточных стенок обусловлены:

- видом растения, - функциями клеток, - возрастом клеток, - стадией жизненного цикла растения, - условиями окружающей среды, в которой произрастает растение (температурой, инсоляцией,

водоснабжением, условиями минерального питания).

Методыполучения изолированных протопластов.

Механический метод. Получение протопластов с помощью нарезания ткани мезокарпа огурцаи других мясистых частей растений. [Klercker, 1892]

Помещение мелко нарезаннойрастительной ткани в среду,содержащей осмотическиактивное вещество (для созданияизо- или слегка гипертоничногораствора).

Энзиматический метод. В 1960 году проф. Э. Коккинг впервые получил изолированные протопластывысших растений энзиматическим способом. В дальнейшем именноэнзиматический способ стал основным методом выделения протопластов.

Помещение мелко-нарезанной растительной ткани всреду с осмотически-активным веществом иферментом или смесью ферментов (целлюлаз ипектиназ).

Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе.Бутенко Р.Г М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

При выделении протопластов энзиматическим методом в среду выделениядобавляют ферменты, которые разрушают компоненты клеточной стенки. Необходимо не только подобрать оптимальные концентрации осмотически

активных веществ, которые вызовут обезвоживание клеток и плазмолиз, но иподобрать ферменты, их концентрацию и время действия для данной ткани. Температуру и pH буфера подбирают, зная их оптимальные значения для работы

ферментов, используемых в эксперименте. Длительность эксперимента зависит от особенностей тканей, из которых

выделяют протопласты, среды выделения и от способа инкубации препаратов. Количество жизнеспособных протопластов зависит от правильности подбора

компонентов среды.

При выделении протопластов механическим методом, необходимо подобратьоптимальную концентрацию осмотика, которая будет комфортна (изотонична илинемного гипертонична) для конкретной ткани. В качестве осмотиков, как правилоиспользуют маннит или сорбит. При подборе температуры и pH буфера учитываются лишь особенности ткани, из

которой проводится выделение протопластов. Длительность эксперимента зависит от скорости манипуляций. Выделение протопластов происходит случайно и с неопределенной

вероятностью.

В дальнейшем именно энзиматический метод стал основным методом выделения протопластов, так как, приразрушении ферментами компонентов клеточной стенки вероятность разрушения протопластов крайне низка.

клеткаклетка

o ВИД РАСТЕНИЯ

o ФУНКЦИИ КЛЕТКИ

o СТАДИЯ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА РАСТЕНИЯ

o ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТКИ и РАСТЕНИЯ (в зависимости от возраста и внешних условий)

осмотик

фермент

Клеточная стенка (КС)

Цель работы –получение большого количества

жизнеспособных протопластов.

На выделение и сохранность протопластов влияют:

факторы среды инкубации - все компоненты среды инкубации (буфер, осмотик и фермент или смесь ферментов).

особенности растительной ткани, которая используется в эксперименте.

условия эксперимента (время, температура, характер механического воздействия).

эндоглюканазы (EC 3.2.1.4) расщепляют целлюлозные цепи внутри и случайным образом по всей длине

экзоглюканазы (экзо-β- (1,4) - глюканазы или целлобиогидролазы, EC 3.2.1.91 разлагают целлюлозу, начиная со свободных концов цепи, с образованием целлобиозы (существует два типа экзоглюканаз)

β-глюкозидазы (EC 3.2.1.21) гидролизуют растворимые целлодекстрины и целлобиозу до глюкозы и действуют в первую очередь, если не исключительно, на растворимые целлоолигомеры, снижая удельную активность по мере увеличения длины цепи.

Jorge Welti-Chanes, Sergio O. Serna Saldívar, Osvaldo H. Campanella, Viridiana Tejada-Ortigoza. 2020. Editors Science and Technology of Fibers in Food Systems. © Springer Nature Switzerland AG 2020

зарегистрировано более 100 целлюлолитических грибов, и это число постоянно увеличивается. В эту группу также входят аэробные грибы (гифомицеты, аскомицеты и базидиомицеты).

бактериальные целлюлазные системы включают те, которые продуцируются аэробными и анаэробными бактериями и актиномицетами, такими как Bacillus spp., Trichoderma reesei, Cellulomonas carte, Bacillus megaterium, Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescence, A. niger и др.

эндоксиланазаацетилксиланэстераза

α-L-арабинофуранозидаза

α-D-глюкуронидазаэстераза феруловой кислоты

ацетилэстераза β-ксилозидаза

эндоксиланаза

эстераза феруловой кислоты

α-L-арабинофуранозидаза

ацетилксиланэстераза


Структура представляет собой обобщенную диаграмму арабиноглюкуроноксилана. По материалам Wyman et al. (2005).

Ферменты, деполимеризующие гемицеллюлозу, делятся на три класса: эндо-действующие ферменты, экзо-действующие ферменты ферменты, гидролизующие олигомеры

Некоторые часто используемые гемицеллюлазы: ксилоглюканазы маннаназы, глюко- и галактоманнаназы глюканазы ксилоглюканазы

деградацию остова (гомогалактуронан) осуществляют деэтерифицирующие ферменты:

• пектинметилэстеразы (EC 3.1.1.11)• пектинацетилэстераза (EC 3.1.1.6), которая удаляет

метоксильные и ацетильные остатки пектина, • деполимеразы, которые гидролизуют α- (1,4)-связи

(полигалактуроназы (E.C. 3.2.1.15)) или через механизм транс-элиминации (пектатлиазы (E.C. 4.2.2.2) и пектинлиазы (E.C. 4.2.2.10)).

полигалактураназа

эндопектинлиаза пектинэстераза


деградацию боковых цепей осуществляют: рамногалактуронангидролаза, рамногалактуронанлиаза, рамногалактуронан рамногидролаза, рамногалактуронангалакто-гидролаза, α-арабинофуранозидаза (EC 3.2.1.55), эндоарабиназа (EC 3.2.1.99), β-галактозидаза (EC 3.2.1.23), эндогалактаназа (EC 3.2.1.55). 1.89) и ферулоил- и п-кумароилэстеразы.

• Генетические модификации растительных клетокИзолированный протопласт может быть реципиентом для:• ядерного, митохондриального или хлоропластного геномов других, в том числе и

таксономически удаленных растений (соматическая гибридизация и цибридизация)• отдельных генов или фрагментов чужеродной ДНК (плазмиды, синтетические генные векторы).• изолированных клеточных органелл.

• Изучение свойств плазмалеммы• изучение структуры плазмалеммы, • использование в качестве модели для изучения транспорта различных веществ через

плазмалемму.• изучение электрических свойств мембраны и воздействий на нее химических и физических

факторов.

• Изучения синтеза клеточной стенки de novo• биосинтез веществ клеточной стенки и их транспорта; построения стенки de novo.• изучение работы целлюлозосинтазного комплекса

подбор количества осмотикадобавление пектиназ

В данном эксперименте используются разные растения и реакционные смеси, содержащие только один фермент – целлюлазу и разные количества осмотика.

По наблюдаемым результатам микроскопии необходимо сделать выводы: об особенностях строения клеточной стенки

используемых клеток об условиях выделения протопластов для

данного растения/ткани/органа (оптимальные или нет).

в таблице описаны результаты микроскопических наблюдений, по которым можно сделать выводы о среде выделения:

если получен результат №4 – условия выделения оптимальны; если получены результаты 5,6 – в смесь необходимо добавить дополнительный фермент; при результатах 1, 7 - необходимо изменить количество осмотика; результаты 2,3,8,9 говорят о необходимости дополнительного фермента и изменении

количества осмотика в реакционной смеси.

Лист1

фермент (целлюлаза)

разрушает КСчастично разрушает КСне разрушает КС

осмотикколичествонедостатокразрушенные клетки из-за осмотического шокаконгломераты клеток или одиночные клетки НЕшарообразной формыисх.ткань

оптимумпротопластплазмолиз

избытокразрушенные клетки в результате обезвоживанияразрушенные клетки в результате обезвоживанияразрушенные клетки в результате обезвоживания

подбор количества осмотика

добавление пектиназ

Лист1 (3)



осмотикколичествонедостаток

оптимум

избыток



Лист1 (5)


разрушает Клеточную Стенку (КС)частично разрушает КСне разрушает КС

осмотикнедостаток

оптимум

избыток



Лист1 (4)

Лист3

Лист1 (2)



осмотикколичествонедостатокразрушенные клетки из-за осмотического шокаконгломераты клеток или одиночные клетки НЕшарообразной формыисх.ткань

оптимумпротопластплазмолиз

избытокразрушенные клетки в результате обезвоживанияразрушенные клетки в результате обезвоживаниясильный плазмолиз



Приготовление реакционных

смесей.

Приготовление препаратов

Инкубация

Результаты

? мл

? мл 2-4 мл

буферМаннит 70 г/л

Маннит 90 г/л

2,5%-ная целлюлаза

2,5%-ная целлюлаза

Реакционная смесь №1

Реакционная смесь №2

370С 2,5 ч

Цель задачи: выделить протопласты, изучить влияние среды выделения, вида растения, тканевой принадлежности клеток на выделение и сохранность протопластов.

Объекты исследования: Crassula arborea, Kalanchoe manginii, Kalanchoe diagremontiana, Kalanchoe tubiflora, Sedum sp. Реактивы и оборудование: Калий-фосфатный буфер (рН 7.5), маннит две навески по 2,0-5,0 г, фермент (целлюлаза ) две навески по 0,2-1

г, цилиндры на 50 мл, 2 колбы по 100 мл, стаканчики, стеклянные палочки, маленькие чашки Петри (d=3 см), препаровальные иглы, лезвие, микроскопы.

Ход работы: 1. Проведение расчетов (расчет объемов буфера, необходимых для приготовления растворов маннита 70 и 90 г/л, 2,5 %-ного

фермента по массе).2. Приготовление реакционных смесей (маннит с ферментом на К-фосфатном буфере):

2.1. Растворы маннита на К-фосфатном буфере: раствор №1 с=70 г/л, раствор №2 с=90г/л. (навески маннита растворяют в необходимых объемах буфера).2.2. 2,5% растворы фермента: навески фермента растворяют в необходимом объеме раствора №1 или №2 (сначала растворяют фермент в небольшом объеме раствора, затем, после его растворения, доливают оставшийся объем раствора).2.3. Небольшое количество (1-3 мл) получившихся реакционных смесей №1 и №2 помещают в чашки Петри, маркируют их №1 и №2.

3. Приготовление препаратов:3.1. Отрезают небольшой кусочек листа у выбранного объекта.3.2. Вырезают 4-6 кусочков мезофилла (≈3*3*2мм) из отрезанного кусочка листа. 3.3. Сразу помещают по 2-3 кусочка мезофилла в чашки №1 и №2.

4. Инкубация: чашки с кусочками ткани оставляют в термостате на 2,5 часа при 370С.5. Под микроскопом (объектив х10) исследуют раствор в чашках Петри. Зарисовывают найденные протопласты. Оценивают их

примерное количество в поле зрения. Результаты: Обсуждение результатов:

В зависимости от "степени выделенности" протопластов (количество и целостность) оценивают влияние среды выделения и особенностей объекта на процесс и результат.

Выводы:

Оформление работы. Отчет о работе:

название задачи, цель работы, объект, реактивы и оборудование, ход работы, результаты, обсуждение результатов:

• влияние фермента на выделение протопластов. • влияние количества маннита на сохранность протопластов, определение оптимальной

концентрации.• влияние особенностей объекта на выделение протопластов

выводы: (по тем же пунктам, что и обсуждение результатов).

К зачету:1) особенности растительной клетки; 2) строение первичной клеточной стенки, функции составляющих клеточной стенки, типы клеточной

стенки, вакуоль, тонопласт; 3) плазмолиз; 4) индивидуальный отчет.

Рекомендованная литература:«Физиология растений» под ред. И.П. Ермакова. - Учеб. для студ. вузов. М.: Изд. центр "Академия", 2005.

Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе.Бутенко Р.Г М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

Растительная клеточная стенка как динамичная система. Т.А. Горшкова ; [отв. ред. И.А. Тарчевский] ; Казанский ин-т биохимии и биофизики КазНЦ РАН. -М. : Наука, 2007.

Дополнительная литература:Biochemistry & molecular biology of plants. Bob B. Buchanan, Wilhelm Gruissem, and Russell L. Jones. 2015

Editors Science and Technology of Fibers in Food Systems. Jorge Welti-Chanes, Sergio O. Serna Saldívar, Osvaldo H. Campanella, Viridiana Tejada Ortigoza. © Springer Nature Switzerland AG 2020

Kozlova LV, Nazipova AR, Gorshkov OV, Petrova AA, Gorshkova TA. Elongating maize root: zone-specific combinations of polysaccharides from type I and type II primary cell walls. Sci Rep. 2020;10(1):10956. Published 2020 Jul 2. doi:10.1038/s41598-020-67782-0

Lampugnani ER, Khan GA, Somssich M, Persson S. 2018. Building a plant cell wall at a glance. Journal of Cell Science 131: jcs207373.

Ogden, M.; Hoefgen, R.; Roessner, U.; Persson, S.; Khan, G.A. Feeding the walls: How does nutrient availability regulate cell wall composition? Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2691.

Zamil M.S., Geitmann A. The middle lamella—more than a glue. Phys. Biol. 14 (2017) 015004

Слайд номер 1Слайд номер 2Слайд номер 3Слайд номер 4Слайд номер 5Слайд номер 6Слайд номер 7Слайд номер 8Слайд номер 9Слайд номер 10Слайд номер 11Слайд номер 12Слайд номер 13Слайд номер 14Слайд номер 15Слайд номер 16Слайд номер 17Слайд номер 18Слайд номер 19Слайд номер 20Слайд номер 21Слайд номер 22Слайд номер 23Слайд номер 24Отчетность.Слайд номер 26

Documents

[Klercker - msu.ruplantphys.bio.msu.ru/education/protoplasts.pdf · Изолированный протопласт- растительная клетка без клеточной