18.12.2013

1

Klonen

Klonierung beim Rind

Definition:Verfahren der Erstellung genetisch identischerIndividuen

Techniken der Klonierung von Säugern:

Isolierung und Proliferation einzelner embryonalerZellen (Blastomeren mit Totipotenz)

Mikrochirurgische Teilung von Embryonen imMorula- bzw. Blastozystenstadium

Kerntransfer (embryonale/somatische Zellen)

18.12.2013

2

Ziele der Verfahrensanwendung

• Erstellung und Klonierung transgener Tiere(gene pharming, Xenotransplantation)

• Klonierung von Tieren mit bestimmtenLeistungseigenschaften (Zuchtwert, Gesund-heit, Langlebigkeit)

• Erstellung von Klonen für Forschungszwecke(Zelldifferenzierung, Genotyp-Umwelt-Wechsel-wirkungen)

• Arterhaltung

• Therapeutisches Klonen (tissue engineering)

Xenotransplantation

Verfahren, bei denen Zellen,Gewebe oder parenchymatöseOrgane auf den Menschendurch Transplantation oderInfusion übertragen werde

18.12.2013

3

Bedarf an Organen

• USA 1 : 3,5

• Nieren in 99: 12500:46000

• Lebern: 4700:15700

• Herz: 2200:4200

• BRD in 2005 (OZ 09/05)

• Nieren 10 000

• Herz: 600

• Leber: 1500

18.12.2013

4

Verfahrensschritte bei der Erzeugung von Klonen mittels Kerntransfer

Entkernung einer reifen Eizelle

Transfer eines diploiden Zellkerns bzw.einer diploiden Zelle

Fusion und/oder Aktivierung desKonstruktes

Kultivierung der Teilungsstadien

Schema der Klonierung mittels Kerntransfer

Prinzip

Klon

Elektrofusion

In-vitro-Kultur

EnukleationTransfer der Donorzelle

Oozyte somatische Zellen

18.12.2013

5

Entkernung einer Oozyte

Donorzellen und subzonaler Transfer

18.12.2013

6

Manual bisection and

cytoplast selection * *

Attachment, first and

second fusion

Activation, culture andtransfer

Cumulus and zona removal * **

Hand Made Cloning (HMC)

18.12.2013

7

525068Teilungsrate (%)

949669Effizienz (%)

3464661018Fusionierte Produkte (n)

7409722962COKs gesamt (n)

GranulosazellenFibroblasten (7. Passage)

Fibroblasten (11. Passage)

Parameter

4019Blastozysten (n)

311928> 8-Zell-Embryonen (%)

5242448-Zell-Embyonen (%)

981002828-Zell-Embyonen (n)

Granulosa- zellenFibroblasten (7. Passage)

Fibroblasten (11. Passage)

Parameter

HMC im FBN

HMC beim Rind im FBN

erster geklonter ZW-Bulle nach zonafreiem Kerntransfer in Europa 04/2003

18.12.2013

8

Angaben zur Effizienz des somatischen Klonierens (Kato et al., 2000)

Parameter Ergebnisse

Anzahl Kerntransfers (1) ( n ) 3721

Anzahl Fusionsprodukte ( n ) 2705

Fusionsrate ( % ) 72,7

Anzahl kultivierter Fusionsprodukte (2) ( n ) 2529

Anzahl geteilter Fusionsprodukte ( n ) 2160

Teilungsrate ( % ) 85,4

Anzahl Blastozysten ( n ) 998

Blastozystenrate bezogen auf (2) ( % ) 39,5

Blastozystenrate bezogen auf (1) ( % ) 26,8

Ergebnisse nach dem Transfer von Klonen (Kato et al., 2000)

Parameter Ergebnisse

Anzahl Transfers ( n) 134

Anzahl übertragene Embryonen ( n ) 172

Anzahl tragende Tiere ( n ) 50

Trächtigkeitsrate ( % ) 37,3

Abortrate ( % ) 54

Abkalbungen ( n ) 23

Überlebensrate bezogen auf transferierte Embryonen

( % ) 14

18.12.2013

9

Schlussfolgerungen

• Das somatische Klonieren hat das Klonenvon Embryonen abgelöst.

• Die Effizienz des Verfahrens ist relativgering und gestattet aktuell die praktischeNutzung nur für spezielle Indikationen.

AusblickZukünftige Forschungsarbeiten werden vor allem auf folgende Aspekte der Technologie

fokussiert sein:

Aufklärung von Prozessen der Reprogrammierungder frühen Embryonalentwicklung

Verbesserung der Vitalität der Embryonen

Vermeidung des large calf syndroms

Untersuchung genetischer und phänotypischerLeistungen bei den Nachkommen

18.12.2013

10

Klonierung beim Rind

Definition:Verfahren der Erstellung genetisch identischerIndividuen

Techniken der Klonierung von Säugern:

Isolierung und Proliferation einzelner embryonalerZellen (Blastomeren mit Totipotenz)

Mikrochirurgische Teilung von Embryonen imMorula- bzw. Blastozystenstadium

Kerntransfer (embryonale/somatische Zellen)

a) Der zu teilende Embryo wird an Haltepipette durch vorsich-tiges Ansaugen in geeignete Position gebracht. Eröffnung Z.p. Öffnung offen halten mit Mikrohaken Teilung des Embryos mit Mikroklinge eine Hälfte verbleibt in Z.p. andere Hälfte kommt in vorbereitete Empfänger-Zona

b) Embryo wird vor Teilung aus Z.p. entfernt. Teilung außerhalb der Z.p.

c) Teilung durch Einstechen einer Mikronadel durch Z.p. Durch vorsichtiges Schieben der Mikronadel Teilung des Embryos

18.12.2013

11

18.12.2013

12

Ein wirtschaftlich und züchterisch sehr interessanter Aspekt des Klonens ist die Erstellung von identischen Zwillingen zur Leistungsprüfung für den Probanden. Das verspricht sehr hohe Sicherheiten in der Aussage zur Leistungsveranlagung. Klonen stellt einen hohen Innovationswert für die Leistungsprüfung, Zuchtwertschätzung, ja für die gesamte Züchtung dar.

18.12.2013

13

Schlussfolgerungen

• Das somatische Klonieren hat das Klonenvon Embryonen abgelöst.

• Die Effizienz des Verfahrens ist relativgering und gestattet aktuell die praktischeNutzung nur für spezielle Indikationen.

18.12.2013

14

Mögliche Technikfolgen

Large calf syndrom

Parameter

Trächtigkeitsdauer

GeburtsmasseKälber

Kälber > 60 kg

Kalbeprobleme

perinataler Tod

Abweichungen im Vergleich zur KB

+ 2,3 d

+ 4,8 kg+ 15 - 20 %

+ 6 -13 %

+ 25 %

+ 11,6 %

Ergebnisse einer Technikfolgenabschätzung: Parameter nach Transfer in vitro erzeugter Rinderembryonen (Kruip und Den Daas, 1997)