Zusammenfassung

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5 ZusammenfassungDie ADP-Ribosylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation von

Proteinen, die bei Viren, Prokaryonten und Eukaryonten auftritt und zur Regulation

diverser Stoffwechselprozesse eingesetzt wird. Obwohl die Familie der ADP-

Ribosyltransferasen kaum Homologien in der Aminosäuresequenz aufweisen, zeigen sie

doch eine gemeinsame Struktur, die das katalytische Zentrum bildet. Anhand der

Sekundärstruktur kann ein Alignment der bekannten ADP-Ribosyltransferasen angefertigt

werden. Das Alignment zeigt einige hoch konservierte Aminosäuren, die wahrscheinlich

für die Katalyse notwendig sind.

Vom Bakteriophagen T4 waren zwei, für ihn nicht essentielle, ADP-Ribosyltransferasen

bekannt, das gpAlt und das gpMod. Die Auswirkungen von Alt auf die frühen T4

Promotoren sind bereits bekannt, nun sollte die Auswirkung von Mod auf die

Transkription untersucht werden. Dazu mußte zuerst das Gen für Mod kloniert werden. Es

gab zwei potentielle Kandidaten, die das Gen mod sein konnten. Die Gene liegen in einem

Operon hinter dem frühen T4 Promotor P13.149. Bei den Klonierungsarbeiten stellte sich

heraus, daß beide Genprodukte toxisch für E. coli sind. Eine Klonierung konnte somit erst

in stringent kontrollierten Vektoren wie den pET-Vektoren oder dem Vektor pBAD

erfolgen.

Aktivitätstests mit beiden Genprodukten zeigten, daß es sich bei beiden Proteinen um

ADP-Ribosyltransferasen handelt. Somit besitzt der Bakteriophage T4 drei ADP-

Ribosyltransferasen, das gpAlt, das gpModA und das gpModB. Die drei Proteine zeigen

unterschiedliche Ribosylierungsmuster in SDS-Polyacrylamidgelen, wobei einige Proteine

von zwei der drei Transferasen ribosyliert werden. So z.B. die α-Untereinheit der E. coli

RNA-Polymerase. Sie wird durch Alt und ModA ADP-ribosyliert.

Die Proteine ModA und ModB werden als Einschlußkörper exprimiert. Es wurden keine

Anzuchtbedingungen gefunden, die lösliches Protein lieferten. Auch die Coexpression von

Chaperonen, der Versuch die exprimierten Proteine in das Kulturmedium zu bringen oder

die Fusion mit Thioredoxin änderten nichts an der Bildung der Einschlußkörper. Aber

durch die Isolierung der Einschlußkörper kann ModA bereits zu > 90 % sauber vorliegen.

Zu diesem Zeitpunkt ist es allerdings inaktiv und muß noch renaturiert werden.

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Die Renaturierung der mit 7 M GuHCl oder 8 M Harnstoff behandelten Einschlußkörper

von ModA ist nicht sehr effektiv. Werden diese Einschlußkörper aber bei einem pH 12 und

2 M Harnstoff aufgelöst, können sie leicht durch Dialyse renaturiert werden. Jedoch ist

ModA nicht sehr stabil und es fällt mit der Zeit aus.

Eine Reinigung von rekombinanten ModA bzw. ModB, die mit einem „His-Tag“ versehen

sind, ist unter denaturierenden Bedingungen nur bedingt möglich. Aus unbekannten

Gründen hat der „His-Tag“ unter denaturierenden Bedingungen eine schlechte Affinität zur

Ni-NTA Matrix. Ein „His-Tag“ am nativen Protein bindet besser an Ni-NTA, wodurch

ModA bzw. ModB weiter gereinigt werden können. Für das gereinigte ModA wurde ein

KM-Wert für NAD von 258 µM und für NBAG von 219 µM ermittelt. Die kkat-Werte

liegen für NAD bei 0,334 min-1 und für NBAG bei 0,089 min-1.

Der Austausch bestimmter Aminosäuren gibt Aufschluß über die Notwendigkeit dieser

Aminosäuren für die Katalyse. Als katalytisch wirksame Aminosäuren wurden die für

ModA postulierten Aminosäuren Arg72 und Glu165 und für ModB die Aminosäuren Arg73

und Glu173 durch ortsspezifische Mutagenese verifiziert. Der homologe Austausch je einer

der genannten Aminosäuren zeigte eine verminderte Aktivität der toxischen Proteine, was

für eine Beteiligung an der Reaktion oder für eine Beteiligung an der Bindung des

Substrats spricht. Für die erzeugten Mutanten müssen die Werte für KM und Vmax noch

bestimmt werden, um Anhaltspunkte zu erlangen ob die mutierten Aminosäuren an der

Katalyse oder der Substratbindung beteiligt sind.

Da ModA die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase modifiziert, liegt es nahe, eine

Auswirkung auf die Transkription zu vermuten. Untersuchungen zur Transkription mit

modifizierter RNA-Polymerase von genomischer T4 bzw. E. coli DNA zeigen, daß die

Transkription im Vergleich zu alterierter oder unveränderter RNAP, deutlich geringer ist.

Es ist somit zu vermuten, daß durch die modifizierte RNAP einige Promotoren nicht mehr

erkannt werden können. Während einer T4 Infektion liegt erst eine alterierte RNAP vor,

die gut von den frühen T4 Promotoren transkribieren kann. Durch eine Modifikation der

RNAP wird die Transkription von diesen frühen Promotoren teilweise unterbunden und

durch die Synthese von AsiA und MotA auf die mittleren Promotoren umgeschaltet.