Kloning Gen dan Konstruksinya pada Binary vectorRikno HarmokoLembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia

PendahuluanDNA sebagai materi genetik

DNA sebagai Material Genetik

3 8/4/2020 Erich Grotewold, Joseph Chappell, Elizabeth Kellogg,2015, Plant genes, genomes, and genetics, Wiley Blackwell

DNA ke Kromosom

4 8/4/2020 Add a footer

Chromosome Padi

Tipe-tipe sekuen pada genom

5 8/4/2020 Erich Grotewold, Joseph Chappell, Elizabeth Kellogg,2015, Plant genes, genomes, and genetics, Wiley Blackwell.

Gene sebagai seperangkat instruksi untuk membuatRNA dari DNA

6 8/4/2020 Erich Grotewold, Joseph Chappell, Elizabeth Kellogg,2015, Plant genes, genomes, and genetics, Wiley Blackwell

Gen dan regulatory sequences

7 8/4/2020 Erich Grotewold, Joseph Chappell, Elizabeth Kellogg,2015, Plant genes, genomes, and genetics, Wiley Blackwell

8 8/4/2020 Add a footer

Chalcone synthase expression to modify pigmentation

Wild-type petunia producing purple

anthocyanin pigments

Chalcone synthase (CHS) is the enzyme at the start of

the biosynthetic pathway for anthocyanins

Anthocyanins

Chalcone synthase (CHS)

Purple flowers

White flowers

Isolasi Gene

2. Mencari sekuen gen target

10 8/4/2020 Add a footer

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#

http://rice.plantbiology.msu.edu/

http://signal.salk.edu/ https://www.ebi.ac.uk/

http://shigen.nig.ac.jp/shigen/about/database.jsp

2. Isolasi total RNA

11 8/4/2020 Ido Keren et.al, 2012. An optimized method for the analysis of plant mitochondria RNAs by Northern-blotting. Journal of Endocytobiosis and Cell Research

❑ DNA / RNA dapat terikat pada silica

membrane pada kondisi buffer dengan

garam tinggi

❑ Interaksi antara DNA / RNA dengan silica

membrane dapat dipecah dengan dengan

melarutkan chaotropic salt dengan buffer

atau air.

❑ Centrifuge berpendingin (4oC) kecepatan

rotor diatas 10.000 rpm

❑ Enzim DNAase untuk mendegradasi DNA

2. Reaksi Reverse Transcriptase

12 8/4/2020 Add a footer

• Enzim yang berfungsi untuk mensintesiscomplementary DNA (cDNA) dari template RNA

2. Polymerase chain reaction (PCR)

13 8/4/2020 Add a footer

• PCR adalah teknik untuk memperbanyak copy sekuen DNA secaraenzimatis tanpa menggunakan organisme.

Komponen dalam Reaksi PCR:

• Template : DNA/cDNA

• DNA Polymerase : Enzim yang mengkatalisis reaksi polymerasi dalam proses sintesis DNA.

• Oligonucleotide primers : DNA rantai tunggal dengan panjang 18-30 bp yang complement dengan target sekuen.

• Deoxynucleotide triphosphates :

• Buffer system

Design primer

14 8/4/2020 Add a footer

5’UTR ORF 3’UTR AAAAAAAAAAAAAAA

Primer F

Primer RATG

STOP

1 Primer length 20 – 25 bp

2 TM 60 - 65 oC

3 Primer 3' clamp C/G

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

Jenis Jenis DNA Polymerase

15 8/4/2020 Add a footer

• Taq Polymerase

• KOD Polymerase

• Pfu Polymerase

Cloning Gen

1.DNA Endonuclease/Restriction Enzyme

Type II Endonuclease

• Restriction Enzyme adalah enzyme yang dapat memotong DNA pada specific sequen tertentu

17 8/4/2020 Add a footer

Bentuk titik potong

18 8/4/2020 Add a footer

Bagaimana mencari titik potong pada sequence DNA?http://nc2.neb.com/NEBcutter2/http://www.takara-bio.co.jp/enzyme/enzyme_search.php

Bagaimana mendapatkan enzyme?https://www.neb.com/products/restriction-endonucleaseshttps://www.takarabio.com/products/cloning/restriction-enzymes

2. Reaksi Ligasi : T4 DNA Ligase

19 8/4/2020 Add a footer

• T4 DNA ligase: mengkatalis reaksipembentukan ikatan phosphodiester pada sequence DNA

19 8/4/2020 Add a footer

2. Reaksi Ligasi : T4 DNA Ligase

20 8/4/2020 Add a footer

Vector/plasmid: DNA sirkuler pada cell yang terpisah dari DNA kromoson dan dapat bereplikasi secaraindependen

20 8/4/2020 Add a footer

DNA Ligation dan Tranformasi ke E. coli

21 8/4/2020 Add a footer

Reaksi Ligasi:- Plasmid : Insert DNA dg ratio 1:3- T4 DNA ligase + Buffer

Preparasi kompeten cell

22 8/4/2020 Add a footer

https://protocols.scienceexchange.com/protocols/preparation-of-competent-cells

Preparasi kompeten cell dan transformasi plasmid

23 8/4/2020 Add a footer