•15/03/2010

•1

KLONOVÁNÍ a GENOVÉ KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍINŽENÝRSTVÍ

KLONOVÁNÍ a GENOVÉ KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍINŽENÝRSTVÍ

1) úvodní přednáška

2) PCR techniky2) PCR techniky

3) mutageneze in vitro

4) cDNA a genomové knihovny

5) sekvencování genomů

6) transgenoze rostlin

7) genové čipy7) genové čipy

8) transgenoze živočichů

9) genová terapie

10) klonovací strategie a expresní systémy

11) seminář – nástroje molekulární biologie v praxi

•15/03/2010

•2

Získávání bioinformací(dobrovolný seminář)

• NCBI (National Center for Biological Information)

• TIGR (The Institute for Genomic Research)

• SignalP, TargetP (predikce buněčné lokalizace proteinů)

• BIOEDIT (freeware pro manipulaci s DNA a proteiny)

• BLAST (basic local alighment and search tool)

• GENEVESTIGATOR (sledování exprese genů na úrovni celých genomů in silico)

LITERATURALITERATURAGlick R a Pasternak JJMolecular BiotechnologyMolecular Biotechnology3th edition, ASM Press Ltd, Washington, USA, 2003

Sambrook J a kol.Molecular Cloning 1,2,3Molecular Cloning 1,2,33th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA 2001

Rosypal SÚvod do Molekulární Biologie díl čtvrtýÚvod do Molekulární Biologie díl čtvrtýtřetí vydání, Prof.RNDr. Stanislav Rosypal, DrSc, Brno 2002

Brown TA; překlad Fellner M a kol.Klonování genů a analýza DNAKlonování genů a analýza DNA1 české vydání, Olomouc UP 2007

http://biologie.upol.cz/metody/

•15/03/2010

•3

CentralCentralníní dogmadogma

DNA RNA Protein

DNA DNA dodo DNA DNA REPLIREPLIKACEKACE

DNA DNA ddo RNA o RNA TRANSTRANSKRIPCEKRIPCE

RNA RNA ddo Protein o Protein TRANSLACTRANSLACEE

Fenotyp

RNA RNA dodo DNA DNA REVERREVERZNÍZNÍ TRANSTRANSKRIPCEKRIPCE

JJeedenden gen gen jedenjeden enzym (protein/polypeptid)enzym (protein/polypeptid)

CentralCentralníní dogmadogma

5’ 3’Gen 9,200 bp

AAGCTCGACTAGCGCTAGCCTACCTAGCTCTCCCCTTCC

(kodující sekvence ORF (open reading frame) a nepřekládané regiony – 5´-UTR, 3´-UTR)AAA 3’5’

zralá RNA 1,870 bp

CNProtein 386 aa CDS 1158 bp

(coding sequence)

•15/03/2010

•4

StrukturStrukturaa genugenu

• Introny a Exony• Promotor • Enhancer a Silencer• Počátek transkripce• Transkripční faktory• Transkripční faktory• Signální sekvence

IntronIntronyy aa ExonExonyy: Kodující sekvence (ORF) mnoha eukaryotických genů jepřerušená sekvencí známou jako introny. Introny jsou úseky DNA jejichžtranskripty nejsou přítomný ve zralé mRNA. Exony jsou části sekvencepřítomné ve zralé mRNA a kodují produkt eukaryotického genu.

Místo počátku transkripce: místo kde začíná syntéza mRNA (pozice 0, -30bp od TATA boxu) .Promotor: Oblast genu (5’-konec) upstream od místa počátku transkripcesloužící jako templát pro navázání transkripční jednotky a iniciacitranskripce. Inducibilní promotor – je závislý na přítomnosti induktoru(nízkomolekulární látka). Konstitutivní promotor – nezávislý (provozníh k i “ )„house keeping“ geny).

Enhancer: Část sekvence genu která interaguje s transkripčními faktory atak zvyšuje účinnost transkripce. Je umístěna upstream nebo downstreamod kódující sekvence a může být stovky bází daleko od kódující sekvencekterou kontroluje.Silencer: Opak enhanceru.Transkripční faktory: Proteiny interagující se specifickou sekvenci DNA,p y y g j p ,většinou ovlivňující terciální strukturu DNA a tak regulují transkripčníjednotku. Jsou buď aktivátory nebo represory viz výše.Koaktivátory: Proteiny interagující s transkripčními faktory (ale ne s DNA)regulující transkripci.Signální sekvence: kóduje signální peptid, který předurčuje zacíleníproteinu na buněčné úrovni a následně se odštěpuje.

•15/03/2010

•5

DNA polymerasy

DNA DNA DNADNA

blíže přednáška techniky PCR

DNA DNA RNARNATranskripce (RNA syntéza): přenos informace z DNA do RNA(nestabilní) prostřednictvím enzymu RNA Polymerasy (DNA-dependentníRNA Polymerasa).

Syntéza RNA je komplementární k templátovému DNA duplexu a jeidentická s netemplátovým vláknem duplexu (5´-3´). Netemplátovýřetězec je proto nazýván kódující řetězec a je identický s mRNA svýjimkou záměny U za T.TypyTypy RNARNA::messenger RNA (mRNA, polyA+ RNA). RNA která je přepisována dopolypeptidů ((11--55%%)).ribozomální RNA (rRNA). strukturní složka ribozómů. ((9090%%))transferová RNA (tRNA). přenašeč aminokyselin do místa syntézyproteinu. ((55--1010%%))málá jaderná, jadérková, cytoplazmatická RNA (snRNA/sno/scRNA).sestřih mRNA

•15/03/2010

•6

Postranskripční úpravy mRNAPostranskripční úpravy mRNA• Čepička (capping). modifikovaný guanozin (m7G) je

přidáván na 5'-konec většiny mRNA. Stabilita mRNA apodílí se na vazbě k ribozomu.

P l d l 100 200 b dl há k• Polyadenylace. 100-200 bp dlouhá sekvencepolyadenozinu je přidávána na 3'-konec většinyeukaryotické pre-mRNA. PolyA konec není kodován vDNA.

• Sestřih intronů a exonů. introny jsou vyštěpeny a exonyspojeny dohromady ve struktuře zvané spliceozom.

Y pyrimidinová báze

Postranskripční úpravy mRNAPostranskripční úpravy mRNA

•15/03/2010

•7

RRNA NA proteinprotein• Translace (syntéza proteinů): Translace je proces přeměny informace z RNA

do aminokyselinového řetězce (polypeptidu) probíhající v cytoplasmě. ZralámRNA je transportována do cytoplasmy k ribozomům (mnohdy vázané naendoplasmatickou retikulární síť).

• Ribozóm se skládá ze strukturní rRNA a 80 různých proteinů které tvoříRibozóm se skládá ze strukturní rRNA a 80 různých proteinů, které tvořímalou a velkou podjednotku.

• Iniciace: Zachycení mRNA a nalezení start kodonu AUG, který kodujemethionin.(M je odštěpen během postranslačních úprav nebo společně se signálnímpeptidem)

• Elongace: Přidávání různých AK v aktivované formě vázané na tRNA avytváření peptidové vazby mezi amino a karboxylovou skupinou.

• Terminace: STOP kodón (UAA, UAG nebo UGA)

Posttranslační úpravy:• Fosforylace, glykosylace, organelové cílení a odštěpení signálního peptidu, složení do aktivního stavu (vytvoření terciální a kvartérní struktury).

Reverzní transkripce: Proces vytvoření DNA z RNA templátu zapomocí RNA-dependentní DNA polymerasy – ReverReverznízníttransranskkriptriptasaasa (RT).RT je přítomná pouze v RNA virech avian myeloblastosis virus

RNA RNA DNADNA

RT je přítomná pouze v RNA virech avian myeloblastosis virus(AMVAMV), Moloney murine leukemia virus (MMLVMMLV), nebo humanimmunodeficiency virus (HIV).

ApliAplikacekace::tvorba cDNA (komplementární DNA): přesná DNA kopie mRNAtvorba cDNA (komplementární DNA): přesná DNA kopie mRNA.DNA sekvence proteinu bez přerušení introny.

• cDNA knihovny• RT PCR

•15/03/2010

•8

Hybridizace• Dva řetězce DNA mohou být k sobě komplementární.• mRNA syntetizována z genu je identická k jednomu vláknu svého

genu a komplementární k druhému vláknu.• Komplementární řetězce mohou být odděleny (denaturace) a znovup ý y ( )

spojeny (renaturace – hybridizace) na různém stupni specifity,mohou vznikat hybridní formace DNA-DNA, DNA-RNA, nebo RNA-RNA.

MethodMethodyy využívajícívyužívající těchtotěchto vlastnostivlastnosti::• Southern blot: Hybridizace DNA na DNA (v pevné fázi)• Northern blot: Hybridizace DNA na RNA (v pevné fázi)• RNAse protection assay: Hybridizace RNA na RNA (v roztoku)• RNAse protection assay: Hybridizace RNA na RNA (v roztoku)• In situ hybridizace DNA-DNA nebo DNA-RNA (ve tkání, či v buňce,

např. FISH)• izolace mRNA: vazba polyA konce na polyT sekvenci navázanou na

pevný matrix.

Stringence: podmínky zaručující stupeň specifity (komplementarity)

PG2

Strigence hybridizaceStrigence hybridizace

teplota ▲koncentrace soli ▼

Denaturační činidla (formamid) za snížené teploty udržují vysokou strigenci

PG1

Snímek 15

PG2 RNAse protection assay multi Northern blot ve zkumavce: pripravi se in vitro transcrpipcí proby proti cilové mRNA, necha se probehnout hybridizace, vsechny ssRNA se pak rozstipou, reakce se hodí na gel a sleduje se intenzita (pomocí značení sondy) a velikost získaných bandu.galuszka; 18/02/2008

Snímek 16

PG1 foramid narušuje vodíkové vazby mezi bázemi a tím snižuje melting temperature, muze byt nahrazen mene toxickou močovinougaluszka; 18/02/2008

•15/03/2010

•9

Princip Southern a Northern blotu

Hybridizační sondyHybridizační sondy jsou značené:• chemiluminiscenčně BIOTIN detekce AVIDIN-HRP, DIGOXYGENIN• fluorescenčně FLUORESCEIN, RHODAMIN • radioaktivně dAT32P, 3H

• Příprava sond:• 5´ a 3´koncové značení – nízká citlivost• pomocí RANDOM HEXAMERů a DNA polymerasy (Klenowův fragment)• PCR• nick translace – DNasa I a DNA polymerasa• in vitro transkripce (RNA próby) FISH fluorescent in situ hybridization

PG3

příklad nukleotidu značeného příklad nukleotidu značeného digoxygeninemdigoxygeninem

Snímek 17

PG3 rozdělit typy sond RNA a DNAgaluszka; 18/02/2008

•15/03/2010

•10

Příprava hybridizačních sondPříprava hybridizačních sondznačení pomocí náhodných hexameru značení pomocí nick translation

(posun jednořetězcového zlomu)

PG4PG1

RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY (restrikční enzymy II třídy)(restrikční enzymy II třídy)

• rozpoznávají specifické sekvence dsDNA a štípou jí ve stejném místě

• rozpoznávací místo je 4-8 bp dlouhé

• štípou dlouhé fragmenty dsDNA na• štípou dlouhé fragmenty dsDNA na kratší

• štípou vždy znovu opakovatelným způsobem

• pocházejí především z bakterií

• ochrana před cizorodou DNA především bakteriofágovou

• modifikačně-restrikční enzymový y ýsystém (RE + specifická modifikační metylasa)

• Přes 120 rozpoznávacích míst

• dodnes popsaných více než 800 RE

Snímek 19

PG4 Klenowuv fragment: postráda 5-3 exonukleasovou aktivitu, polymerasa nedegraduje jiz nasedly primer a zastavuje se polymerizace galuszka; 18/02/2008

PG1 Labeling principle The nick translation method (1) is based on the abilityof DNase I to introduce randomly distributed nicks intoDNA at low enzyme concentrations in the presence ofMg2+.E. coli DNA polymerase I synthesizes DNA complementaryto the intact strand in a 5' → 3' direction usingthe 3'-OH termini of the nick as a primer (2). The 5' → 3'exonucleolytic activity of DNA polymerase I simultaneouslyremoves nucleotides in the direction of synthesis(3). The polymerase activity sequentially replacesthe removed nucleotides with isotope-labeled or hapten-labeled deoxyribonucleoside triphosphates (1). Atlow temperature (15°C), the unlabeled DNA in thereaction is thus replaced by newly synthesized labeledDNA.DNA The DNA must be in low-salt concentration solution.Radioactive dNTPfor labeling[α-32P] dCTP is preferentially used due to its greaterstability in comparison to other labeled deoxyribonucleosidetriphosphates.[α-32P] deoxyribonucleoside triphosphates with a specificactivity of 3000 Ci/mmol give better incorporationand higher levels of labeling than those with a specificactivity of 400 Ci/mmol under identical reaction conditions.Specific activity The level of specific labeling and the incorporation rateare dependent on the ratio of substrate DNA to labeledPetr Galuszka; 11/02/2006

•15/03/2010

•11

• RE mohou na DNA vytvářet TUPÉ nebo LEPIVÉ konce

• restrikční sekvence jsou většinou symetrické.

RESTRIKČNÍ MíSTA MAJÍ BOD SYMETRIERESTRIKČNÍ MíSTA MAJÍ BOD SYMETRIE

y

• nukleotidy vytvářejí PALINDROM

• Palindrom: sekvence se čte stejně v obou směrech jak ve5’ → 3’ tak ve směru 5’ → 3’ na komplementárním řetězci.

EcoRI

TUPÉ KONCE – nespecifické spojeníLEPiVÉ KONCE –specifické spojení

EcoRI

Existují RE se stejnou restrikční sekvencí lišící se pouze typem vzniklých konců (5´- či 3´- lepivé) KpnI vs. Asp718 KpnI vs. Asp718 -- izoschizomeryizoschizomery

Lepivé konceLepivé konce::každý DNA fragment (jakéhokoli původu) tvoří štěpením stejnou RE dvě jednovláknové identické

sekvence (čtené ve směru 5’ - 3’).

Kompatibilní konceKompatibilní konce:: BamHI BamHI GGˇ̌GATCC BglII AˇGATCTGATCC BglII AˇGATCT

•15/03/2010

•12

• dvě odlišné DNA mající stejné rozpoznávací místo pro danou RE se mohou vzájemně spojit v rekombinantní DNA molekulu

•• rekrekombinantombinantníní DNA moleDNA molekulakula:: je nová kombinace nukleotidů v DNA která se nevyskytuje volně v přírodě

Počet nukleotidů v restrikčním místě dané RE determinuje průměrnou délku fragmentů DNA získaných naštípaním danou RE

Pravděpodobnost že dané restrikční místo bude nalezeno v genomu:

1) 44 = 256 bp

2) 46 = 4096 bp

3) 48 = 64 000 bp

GTACGTAC

Působení RE je velmi citlivé na

průměrná vzdálenost mezi restrikčními sekvencemi v DNA

= 4n

n = # bází v restrikčním místě

) p

jiontovou sílu roztoku a charakterpřítomných solí.Pokud nejsou zachovány specificképodmínky pro danou RE ta můžemít tzv. star aktivituSTARSTAR AKTIVITAAKTIVITA – nespecifickénáhodné štěpení

•15/03/2010

•13

T4 DNA ligasaT4 DNA ligasa• enzym izolovaný z T4 bakteriofága infikujícího E.coli,

katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi5´fosfátovou skupinou jednoho a 3´OH skupinousousedního nukleotidu.

• reakce vyžaduje energii jednoho ATP• používá se ke spojování lepivých i tupých konců

dvou restrikčních fragmentů DNA, připojovánírůzných adaptorových sekvencí k DNA a cirkulizaciDNA

• Reakce se provádí většinou za snížené teploty (15-16°C) aby se snížila kinetická energie molekul azabránilo se tak nekomplementárnímu spárovánílepivých konců.lepivých konců.

• zápor: nízká aktivita enzymu – dlouhý reakční čas.

Další enzymy používané v molekulární biologii: Alkalická fosfatasa

Mung Bean nukleasa

KLONOVÁNÍKLONOVÁNÍMolekulární klonováníMolekulární klonování::•• multi-krokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA pomocí restrikčních endonukleas

j í b ý h DNA f tů ( ětši j d h ) iál í• spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se speciálním nosičem – vektorvektor pomocí T4 DNA ligasy

• přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často baktérie)

• mnohonásobné namnožení vložených DNA fragmentů replikaci v živé buňce –DNA KLONYDNA KLONY

Buněčné klonováníBuněčné klonování::Buněčné klonováníBuněčné klonování::

• vytváření geneticky identických buněk (organismů)•• v živé přírodě přirozené: kolonie baktérii

řízkování rostlinjednovaječná dvojčata

umělé umělé ►►

•15/03/2010

•14

KLONOVACÍ VEKTORYKLONOVACÍ VEKTORYA) Bakteriální a kvasinkové – PLASMIDYPLASMIDY- přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě

dsDNA (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů…) 1-100kb- replikují se nezávisle na baktérii- vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených

„high copy“ plasmidy„high copy“ plasmidy1970 1970 -- pBR (Bolivar a Rodriguez)pBR (Bolivar a Rodriguez)- 4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli - oriori vlastní počátek replikace- rezistence k Amp a Tc- unikátní restrikční místa - kapacita pro inzertovou DNA 11--5 kb5 kb

100-1000 kopií v buńce

oriMCSMCS

multiple cloning site(polylinker)

KLONOVACÍ VEKTORYKLONOVACÍ VEKTORYB) Virové - BAKTERIOFÁGYBAKTERIOFÁGY- bakteriální viry s dvouřetězcovou lineární DNA- klonovací kapacita 22--25kb25kb inzertu- mnohonásobné množení v závislosti na hostitelské bakterii

BAKTERIOFÁG lambda 49kbBAKTERIOFÁG lambda 49kb

• Střední část genomu není důležitá pro lytický růst a lze ji nahradit inzertovou DNA

• snadná manipulace díky cos místům (lepivé konce) na koncích λ DNA, které umožňují její cirkulaci

coscos

• Zacirkuluje se pouze bakteriofág, který má vzdálenost mezi cos místy 37-52kb

• tvorba cDNA a genomových knihoven

•15/03/2010

•15

C) bakteriálně-virové - KOSMIDYKOSMIDY• odvozené z plasmidu do kterého byly naklonovány cos místa bakteriofága λ• Inzertová DNA je naklonována do lineárního kosmidu a sbalena in vitro

virovým mechanismem a infikována do bakterie

KLONOVACÍ VEKTORY

• v bakterii je pak cirkulována a replikuje se dál jako plasmid• malá velikost cca 5kb – není potřeba infekčních lytických λ proteinů, pouze

selekční marker k antibiotiku, velikost inzertové DNA se může pohybovat ažk 4747kbkb

D) bakteriálně-virové - FASMIDYFASMIDY (phagemid)(phagemid)• odvozené od bakteriofága M13 s malou ssDNA (6.4kb), který se po infekci do

bakterie replikuje jako kruhovitá dsDNA (plasmid, snadná manipulace, restrikce)• infekční fágové částice však opět obsahují pouze ssDNA (vhodný zdroj pro

izolaci ssDNA např. pro hybridizaci)• do infekčních částic mohou být sbaleny částice až dvakrát větší než je fágová

DNA

PG5

Snímek 29

PG5 KOSMIDY nemají lytické geny, replikují se jako bakteriofág ale nelýzují bakterii, s prazdnýma se manipuluje jako s plasmidy.Replikuji se pomaleji než plasmidyKONKATEMERY - cirkularní kosmid se naštípe jedním lepivým a jedním tupym aby nedochazelo k cirkulacigaluszka; 18/02/2008

•15/03/2010

•16

E) kvasinkové - YACYAC uměléumělé kvasinkovékvasinkové chromosomychromosomy(yeast artificial chromosomes)

KLONOVACÍ VEKTORY

•patří mezi kyvadlové vektory (shuttle vector)•v bakterii jako kruhová dsDNA (plasmid)•vedle sekvencí bakteriálního plasmidu obsahují části kvasinkového chromozomu (centromera, počátek ( , preplikace,dvě telomery)•linearizací se chromozom aktivuje (oddělení telomer od sebe) •obrovská klonovací kapacita až 2000kb2000kb•nestabilita a složitá manipulace (protoplasty)

KYVADLOVÉKYVADLOVÉ VEKTORYVEKTORY umožňující existenci a replikaci ve dvou rozdílných organismech:pYES bakterie – kvasinka - počátek replikace z přirozeného kvasinkového vektoru 2μTi-plazmid bakterie – rostlina viz přednáška transgenoze rostlin

KLONOVACÍ VEKTORYF) bakteriální - BACBAC uměléumělé bakteriálníbakteriální chromosomychromosomy

(bacterial artificial chromosomes)

Odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), „low copy“ 1-2 kopie na buńku

VÝHODY ti YACVÝHODY oproti YAC:

- stabilita (cirkulární)- snadná manipulace- potlačení rekombinace

Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligacijsou získány pulsní gelovou elektroforesou

VELKÝ VÝZNAM PŔI MANIPULACI S CELÝMI GENOMYINVITROGEN

•15/03/2010

•17

Obecný princip molekulárního Obecný princip molekulárního klonováníklonování

klonovací vector + DNA obsahující klonovací vector + DNA obsahující požadovaný gen (izolace)požadovaný gen (izolace)

t ikt ikrestrikcerestrikce

ligaceligace

transformacetransformace

selekce pomocí selekčních markerůselekce pomocí selekčních markerů

reprodukce a syntéza cílového proteinu reprodukce a syntéza cílového proteinu izolaceizolace

Využití molekulárního klonováníVyužití molekulárního klonování•• uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny)(cDNA a genomové knihovny)

•• produkce proteinů pro různorodé využitíprodukce proteinů pro různorodé využití•• vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)

farmaceutikafarmaceutika

zemědělstvízemědělství

medicínamedicínaprůmyslprůmysl

základní výzkumzákladní výzkum

•15/03/2010

•18

SELEKČNÍ MARKERYSELEKČNÍ MARKERYgeny nesené na klonovacím vektoru, exprimované geny nesené na klonovacím vektoru, exprimované

současně s transgenem, na jejichž fenotypovém současně s transgenem, na jejichž fenotypovém projevu lze transformované buňky snadno projevu lze transformované buňky snadno

selektovatselektovat

1) geny kódující degradaci ANTIBIOTIKAANTIBIOTIKA•• INHIBITORY SYNTÉZY BAKTERIÁLNÍ BUNĚČNÉ STĚNYINHIBITORY SYNTÉZY BAKTERIÁLNÍ BUNĚČNÉ STĚNY

AMPICILINAMPICILIN gen Amp koduje β-laktamasu která štěpí β-laktámový kruh penicilinových antibiotik

CEFOTAXIMCEFOTAXIM

•• INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů CHLORAMFENIKOLCHLORAMFENIKOL, , KANAMYCINKANAMYCIN(vážou se na ribozomální podjednotky)

gen Cml kóduje chloramfenikol acyltransferasug j y

gen Kan kóduje aminoglykosid fosfotransferasu

AMPICILIN

SELEKČNÍ MARKERYSELEKČNÍ MARKERY1) geny kódující degradaci ANTIBIOTIKAANTIBIOTIKA•• INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINůINHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů

TETRACYKLIN TETRACYKLIN (zabraňuje vazbě aminoacyl tRNA k ribozomu) gen Tet kóduje membránový protein, který aktivně transportuje TC ven z buňky

HYGROMYCIN B HYGROMYCIN B (interferuje s velkou ribozomální podjednotkou a zabraňuje elongaci syntetizovaného peptidu) gen způsobující rezistenci hgh kóduje fosforylasu inaktivující toto antibiotikum. PůSOBÍ I NA EUKARYOTICKÉ BUŇKY!!! (selekce transgenních rostlin)

•• INHIBITORY TRANSKRIPCE A REPLIKACEINHIBITORY TRANSKRIPCE A REPLIKACE

ACTINOMYCIN D ACTINOMYCIN D (inhibuje transkripci tím, že se váže na specifické úseky DNA)

RIFAMPICIN RIFAMPICIN (inhibuje prokaryotní RNA polymerasu, ale i chloroplastovou a mitochondriální, proto je toxicky i pro člověka)

ZEOCINZEOCIN – glykopeptid izolovaný ze Streptomyces, který štěpí po vstupu do buňky jakoukoliv DNA.Rezistentní gen Sh ble kóduje inhibiční protein (13.6 kDa) tohoto glykopeptidu.

koncentrace účinné pro selekci:Baktérie 25-50 μg/mLKvasinky 50-300 μg/mLSavčí buňky 50-1000 μg/mL ZEOCIN

•15/03/2010

•19

SELEKČNÍ MARKERYSELEKČNÍ MARKERY2) geny kódující enzymy narušující NUTRIČNÍ NEDOSTATEČNOST NUTRIČNÍ NEDOSTATEČNOST

(ztráta autotrofie)(ztráta autotrofie)- používají se především pro selekci transgenních kvasinek

•• Gen Gen URA3 URA3 kóduje enzym orotidin 5´-fosfát dekarboxylasu, enzym metabolické dráhy uracilu

•• LYS2 LYS2 kóduje aminoadipát reduktasu (bisyntéza lyzinu)

•• ADE2ADE2 (C1-tetrahydrofolát syntasa), LEU2 LEU2 (β- izopropylmalát dehydrogenasa), TRP1TRP1(fosforibozylanthranilát izomerasa)

Princip selekce: pro transformaci daného plasmidu se použijíspecifické kmeny kvasinek deficientní pro daný gen, selekce se pak provádí na minimálním médiu (bez živin).

Příklad: kmen kmen Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae INVSc1INVSc1genotyp: MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52

/MATλ his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura-

tzn. že tento kmen je autotrofní na histidin, leucin,tryptofan a uracil a na médiu bez těchto živinneporoste

kyvadlový vektor pro transformaci kvasinek →

SELEKČNÍ MARKERYSELEKČNÍ MARKERY3) blue/white screening testblue/white screening test- pomocný test pro selekci transformovaných bakterií či bakteriofágu- klonovací vektor nese gen lacZ+ který kóduje enzym ββ--galaktosidasu galaktosidasu (štěpí laktosu na

galaktosu a glukosu)- MCS je umístěn uvnitř tohoto genu, a po vložení inzertu se tento gen stává neaktivní

OO

OH

HOCH2

H

HOBr

Cl

X-GAL

AmpicilinAmpicilin (zabije netransformované bakterie) →XX--GALGAL (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl b-D-galactopyranoside) →

umělý substrátIPTG IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galaktopyranoside) →

induktor exprese lacZ genu

OHHO

NH

galaktosamodré barvivo

•15/03/2010

•20

lytický a lysogenní cyklus virů

struktura lambda bakteriofága

•15/03/2010

•21

SELEKČNÍ MARKERYSELEKČNÍ MARKERYLAMBDA FIX II VEKTORLAMBDA FIX II VEKTOR (λ bakteriofágový

vektor)

- selekce se provádí na speciálním kmeniE coli (lysogenní pro P2 bakteriofága tzn

4) lysogenní selekce bakteriofágových vektorulysogenní selekce bakteriofágových vektorured/gam+

E.coli (lysogenní pro P2 bakteriofága, tzn.že hostitelská buňka je již napadená jinýmbakteriofágem)

- Pokud má λ vektor genotyp red/gam+ nadaném kmeni neroste je tzv. Sensitivní kP2 interferenci (Spi+ fenotyp)

- red a gam geny se nacházejí ve středníčásti (stuffer) a jsou nahrazeny inzertem.Bakteriofág s inzertem je tudiž Spi- a

12 kb

red/gam-

g j pmůže být vyselektován na P2 lysogennímkmeni

inzert (genomová knihovna)

příliš malýnesbalí sedo kapsidy